JP2014519313A - 活性ポリペプチドの結合親和力及び結合特異性を増強させる蛋白質骨格モジュール - Google Patents
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Abstract
本発明は活性ポリペプチドの結合親和力又は結合特異性を増強させる新規の蛋白質骨格モジュールに関するものであって、詳しくは配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；活性ポリペプチドを含むポリペプチド；及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする蛋白質骨格モジュール及びこれの製造方法に関するものである。本発明の蛋白質骨格モジュールは内蔵された活性ポリペプチドの結合親和力又は結合特異性を増強させることにより疾病の診断及び治療に効果的である。
Description
本出願は2011年04月18日に出願された大韓民国特許出願第10-2011-0035613号に基づく優先権を主張するものであり、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
本発明は活性ポリペプチドの結合親和力又は結合特異性を増強される新規の蛋白質骨格モジュールに関する。より詳細には配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；活性ポリペプチドを含むポリペプチド；及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする蛋白質骨格モジュール及びその製造方法に関するものである。
蛋白質のアミノ酸配列と２次、３次構造を分析すれば多くの蛋白質が独立的なドメイン(domain、又はmodule)で構成されている。ドメインは構造的、機能的、独立的な単位である。同一なドメインはさまざまな蛋白質に一つ以上分布されることがあり、一つの蛋白質はさまざまなドメインで構成される。ドメインの具体的な情報はProsite(Hulo N等、Nucleic Acids Res,36:D245-249,2008;Website:http://kr.expasy.org/prosite/),SMART(Letunic I 等、Nucleic Acids Res,34:D257-D260,2006;Website:uttp://smart.embl-heidelberg.de/)等の生物情報学ウェブサイトで探索することができる。
生体分子間の相好作用（例えば、蛋白質―蛋白質、蛋白質―核酸、等）は細胞の成長、分化、発達、細胞間／内でのシグナル伝達、物質移動などのさまざまな生命現象を起こす重要な機能をする。既存の標的分子に特異的に結合して生物学的活性を調節する分子であって、抗体（全体又は切片）が主導的に開発されてきた。しかしながら、抗体の問題点は発現量が少なく、溶解度が低く、動物細胞の発現細胞株を使わなければならず、精製費用が高く、還元的細胞内の環境で安定性が落ちるなど多くの問題があった。従って、抗体の問題点を克服しながら抗体のように標的分子(targeted molecules)に特異的に結合する特性を有する抗体の他に蛋白質の開発が急がれる実情がある。
癌や動脈硬化の診断及び治療に使用するために、ページディスプレーなどの方法で発掘されたペプチドは低い結合力、非安定性、高免疫性などの限界がある。このような問題点を克服して活性ペプチドを人体内で結合力と安定性を高めながら免疫性を低められる新たな技術の開発が必要である。
本発明者等は人体由来の蛋白質の内、一部分を選択、最適に変形し、活性ペプチドを挿入する場合、活性ポリペプチドの結合親和力又は結合特異性が増強されるなど、従来のペプチド製剤及び抗体製剤を代替できる優れた性質を示すことを見出だして本発明を完成した。
本発明の他の目的は
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）活性ポリペプチドを含むポリペプチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とする活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを提供することである。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）活性ポリペプチドを含むポリペプチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とする活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを符号化（コーディング）するポリヌクレオチドを提供することである。
本発明の他の目的は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することである。 本発明の他の目的は前記発現ベクターに形質転換された宿主細胞を提供することである。
本発明の他の目的は前記宿主細胞を培養する段階を含む活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを製造する方法を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む診断方法を提供することである。
本発明の他の目的は診断用製剤の製造のための前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールの用途を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む薬学的組成物を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用キットを提供することである。
本発明の他の目的は
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号３で示されるAP-1(activator protein 1)のアミノ酸配列を含むポリペプチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とする活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチドを提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌又は動脈硬化診断用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む癌又は動脈硬化診断方法を提供することである。 本発明の他の目的は癌又は動脈硬化診断用製剤の製造のための前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールの用途を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌又は動脈硬化診断用キットを提供することである。
本発明の他の目的は前記宿主細胞を培養する段階を含む活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを製造する方法を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む診断方法を提供することである。
本発明の他の目的は診断用製剤の製造のための前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールの用途を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む薬学的組成物を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用キットを提供することである。
本発明の他の目的は
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号３で示されるAP-1(activator protein 1)のアミノ酸配列を含むポリペプチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とする活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチドを提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌又は動脈硬化診断用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む癌又は動脈硬化診断方法を提供することである。 本発明の他の目的は癌又は動脈硬化診断用製剤の製造のための前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールの用途を提供することである。
本発明の他の目的は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌又は動脈硬化診断用キットを提供することである。
前記の目的を達成するために、本発明は
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列１番目乃至29番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）活性ポリペプチドを含むポリペプチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とする活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを提供する。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列１番目乃至29番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）活性ポリペプチドを含むポリペプチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とする活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチドを提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記発現ベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記宿主細胞を培養する段階を含む活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを製造する方法を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用組成物を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む診断方法を提供する。 本発明の他の目的を達成するために、本発明は診断用製剤の製造のための前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールの用途を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む薬学的組成物を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用キットを提供する
本発明の他の目的を達成するために、本発明は
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号３で示されるAP-1(activator protein 1)のアミノ酸配列を含むポリペプチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とする活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチドを提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌又は動脈硬化診断用組成物を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを要とする個体に有効量で投与する段階を含む癌又は動脈硬化の診断方法を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は癌又は動脈硬化診断用製剤の製造のための前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールの用途を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌又は動脈硬化診断用キットを提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記発現ベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記宿主細胞を培養する段階を含む活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを製造する方法を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用組成物を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む診断方法を提供する。 本発明の他の目的を達成するために、本発明は診断用製剤の製造のための前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールの用途を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む薬学的組成物を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用キットを提供する
本発明の他の目的を達成するために、本発明は
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号３で示されるAP-1(activator protein 1)のアミノ酸配列を含むポリペプチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とする活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチドを提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌又は動脈硬化診断用組成物を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを要とする個体に有効量で投与する段階を含む癌又は動脈硬化の診断方法を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は癌又は動脈硬化診断用製剤の製造のための前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールの用途を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌又は動脈硬化診断用キットを提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；ｂ）活性ポリペプチドを含むポリペプチド及びｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とする活性ポリペプチドが内蔵された(包含された)蛋白質骨格モジュール及び前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュール(protein scaffold, modularized protein scaffold)を符号化するポリヌクレオチドを提供する。
本発明の蛋白質骨格モジュールは内蔵された活性ポリペプチドの結合親和力又は結合特異性を増強させる特徴がある。
活性ポリペプチドは対象蛋白質との接触を通じてシグナル伝達、対象蛋白質の活性化(activation),不活化(deactivation),リン酸化(phosphorylation)などさまざまな作用をするポリペプチドを意味する。本発明の蛋白質骨格モジュールは内蔵された活性ポリペプチドの結合親和力又は結合特異性を増加させる方法で活性ポリペプチドの活性を増加させる。
結合親和力(binding affinity)とは、生体分子間を結合しようとする性質の強度を意味する。
結合特異性(binding specificity)とは、特定生体分子が結合対象分子とのみ特異的に結合しようとする性質を意味する。
本発明の蛋白質骨格モジュールは生体内免疫体系に影響を与えず、活性ポリペプチドを内蔵できる蛋白質の構造体を意味する。本発明の蛋白質骨格モジュールは分子量が小さく生体内活動性が優れていて、内蔵される活性ポリペプチドの活性に影響を与えず、生体内免疫体系に影響を与えず、生体内に豊富に存在する蛋白質から由来して個体別効果の差が個体特異的効果の発生があってはならない。活性ポリペプチドを内蔵して活性ポリペプチドの安定性及び特性を向上させる蛋白質骨格モジュールは本発明者らにより最初に開発されたものであり、DMID(Designed Modular Immuno Diagnostics)と命名した。
本発明の活性ポリペプチドは薬理活性を有することができ、活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールは活性ポリペプチドの作用により、内在された薬理活性を示すことができる。活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールは活性ポリペプチドの薬理活性、特に増強された効果の薬理活性を有することもある。
本発明の蛋白質骨格モジュールは好ましくは、Stabilin-2由来のポリペプチド断片を基にデザインすることができ、より好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸配列の内、骨格に影響を与えない部分に活性ポリペプチドが置換又は挿入された蛋白質骨格モジュールでもある。
本発明の一実施例の蛋白質骨格モジュールはヒトに豊富に存在する、Stabilin-2由来のポリペプチド断片を基にデザインされた。Stabilin-2は膜貫通（transmembrane）レセプタでリンパ球誘導、細胞付着、レセプタスカベンジング、血管生成に関与する。この蛋白質は7 fasciclin,16 epidermal growth factor(EGF)-like,2 laminin-type EGF-like domaine,a C-type lectin-like hyaluronan-binding Like moduleなどの多様なドメインを有している。一方、本発明は前記蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは活性ポリペプチドの結合親和力又は結合特異性を増強させる蛋白質骨格モジュールを符号化する特徴がある。
本発明のポリヌクレオチドは配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するか又は、前記アミノ酸配列と少なくとも70%以上の相同性(homology)があるアミノ酸配列を有する蛋白質骨格モジュールを符号化する物質を意味し、前記ポリヌクレオチドはDNA又はRNAでもあって、好ましくは配列番号２で示されるDNAでもある。
本発明は前記本発明のポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターを提供することを特徴とする。
前記発現ベクターは、当業者らが当業界に知られたある方法により本発明のポリヌクレオチドをベクターに挿入して適切な転写／解読調節配列を利用して本発明の蛋白質骨格モジュールを発現するように製造された発現ベクターを意味する。
本発明の“発現ベクター”とは、本発明の蛋白質をコーティングするポリヌクレオチド配列が挿入又は導入可能な当業界に知られたプラスミド、ウィルス又はその他の媒介体を意味する。本発明によるポリヌクレオチド配列は発現調節配列に作動可能に連結することができ、前記作動可能に連結された遺伝子配列と発現調節配列は選択マーカー及び複製開始点(replication origin)をともに含む一つの発現ベクター内に含まれ得る。“作動可能に連結(operably linked)”されるということは適切な分子が発現調節配列に結合される際、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び発現調節配列でもある。“発現調節配列(expression control sequence)”とは、特定した宿主細胞で作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列発現を調節するDNA配列を意味する。そのような調節配列は転写を実施するためのプロモータ、転写を調節するための任意のオペレータ配列、適したmRNAリボーソム結合部位をコーティングする配列及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。
前記本発明の蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチドを挿入できる発現ベクターには大腸菌由来のプラスミド(pBR322,pBR325,pUC118,pUC119,pET30a,pET30c及びpGEX-GST)、バシラスサブチリス由来のプラスミド(pUB110及びpTP5)、酵母由来のプラスミド(YEp13,YEp24及びYCp50)及びTiプラスミドなどがあり、レトロウィルス、アデノウィルス又はワクシニアウィルスのような動物ウィルス、バキュロウィルスのような昆虫ウィルス及び植物ウィルスを使用することができ、pPZP,pGA及びpCAMBIA系のようなバイナリベクターを使用することができる。当業者であれば本発明のポリヌクレオチド配列導入に適したベクターを選択することができ、本発明では本発明のポリヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入することができるベクターであれば、どんなベクターであっても全て使用することができる。しかしながら、好ましくは蛋白質発現誘導及び発現された蛋白質の分離が容易になるようにデザインされたベクターを使用することができ、より好ましくは本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであるpET32aベクターを使用することができる。
本発明は前記本発明の組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。
前記形質転換された宿主細胞は当業者らが当業界に知られた方法により、本発明の再組換えベクターを利用して形質転換させた微生物でもあって、前記微生物はこれに限定はされないが、好ましくは大腸菌(E.coli)でもあり、最も好ましくは大腸菌BL21又は大腸菌MC1061でもある。
前記本発明による組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換する方法には、これに限定はされないが、塩化カルシウム(CaCl2)及び熱ショック(heat shock)方法、粒子銃衝撃法(particle gun bobardment)、シリコン炭化物ウィスキー(Silicon carbire whiskers)、超音波処理(sonication)、電気穿孔法(electroporation)及びPEG(Polyethlenglycol)による沈殿法などを使用することができる。
多様な宿主―発現ベクターシステムを活用して本発明の蛋白質骨格モジュール発現させることができる。このような宿主―発現ベクターシステムは目的とするコーティング配列を生成させ、以降精製できるビヒクルと、さらに、適切なヌクレオチドコーティング配列で形質転換又は形質感染時に、本発明の蛋白質骨格モジュールを発生部位から(in situ)発現させることができる細胞を意味する。このようなシステムはこれに制限されるものではなく、微生物、例えば、本発明の蛋白質骨格モジュールコーティング配列を含有する組替えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNA発現ベクターに形質転換されたバクテリア（例えば、E.coli、及び B.subtilis）；蛋白質骨格モジュールコーティング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで感染された酵母（例えば、サカロマイセス(Saccharomyces)、ピキア(Pichia));蛋白質骨格モジュールコーティング配列を含有する組換えウィルス発現ベクター（例えば、ベクロウィルス）で感染された昆虫細胞システム；蛋白質骨格モジュールコーティング配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換されるかまたは、組換え発現ベクター（例えば、カリフラワモザイクウィルス、CaMV;煙草モザイクウィルス、TMV)で感染された植物細胞システム；または哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウィルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウィルス後期プロモーター；ワクシニアウィルス7.5Kプロモーター）を含有する組換え発現構成体を保有する哺乳動物細胞システム（例えば、COS,CHO,BHK,293,NS0及び3T3細胞）を含む。
本発明の蛋白質骨格モジュールは内蔵された活性ポリペプチドの結合親和力または結合特異性を増強させる特徴があって、このような活性ポリペプチドの内蔵は前記蛋白質骨格モジュールに内蔵させる活性ポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドの特定部位に活性ポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを挿入させて発現する方法ですることができる。
本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
前記発現ベクター及び宿主細胞は前述した通りである。
前記宿主細胞は好ましくはE.coliである。
一方、本発明は前記宿主細胞を培養する段階を含む活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを製造する方法を提供する。
本発明の方法によれば、結合親和力または結合特異性が増強された活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを効率的に生産することができる。
本発明の方法により、製造された活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールは蛋白質精製のために当分野に公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、金属―キレートクロマトグラフィー、イオン交換、親和性及び大きさコラムクロマトグラフィーなど）、遠心分離、差等可溶性または蛋白質精製のための任意の別の標準方法で精製することができる。
本発明の結合親和力または結合特異性が増強された活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールは、活性ポリペプチド単独の時よりターゲット物質に対する結合親和力または結合特異性が高い。
一方、本発明の蛋白質骨格モジュールには公知の検出方法に使用される標識物質などを追加して付着することができる。
本発明の蛋白質骨格モジュールには活性ポリペプチドの結合対象ターゲットに有効な物質などを追加して付着することができる。
例えば、本発明の蛋白質骨格モジュールには、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒトの血清アルブミン(HSA)、抗体のFc域、IgG分子、細胞毒性薬物、放射性同位元素、造影剤、His-タグ、ビオチン、Flag-タグ、核酸またはサイトカインなどを追加して付着することができる。
本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用組成物を提供する。
本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む診断方法を提供する。
本発明は診断用製剤の製造のための第１項の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールの用途を提供する。
本発明で“有効量”とは、本発明の組成物または製剤が投与対象である個体内で疾患を診断または診断に必要な情報を提供する効果を示す量を意味し、前記“個体”とは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物でもあって、動物から由来した細胞、組織、器官などである。前記個体は診断が必要な患者である。
本発明の組成物は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュール0.001乃至99.999重量％及び残量の担体を含む組成を有することができる。
本発明の診断用組成物は本発明の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含むことを特徴とする。
本発明で診断は活性ポリペプチドのターゲット物質の有無、分布、量などを見出だすことができて、これを基に関連した疾病の有無、進行状態を判断することを意味する。
例えば、IL-4 レセプタ（receptor）はさまざまなヒトの癌（大腸癌、肺癌、子宮癌及び乳房癌）から過発現する。本発明のAP-1が内蔵された蛋白質骨格モジュールの場合、IL-4 レセプタと結合力を有するので前記癌の診断及び治療に応用が可能である。
蛋白質の存在の可否とその量及び／又はパターンを測定する方法には、ウェスタンブロット、ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)、放射線免疫分析(Radioimmunoassay)、放射免疫拡散法(radioimmunodiffusion)、オークテルロニ(Ouchterlony)免疫拡散法、ロケット(rocket)免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法(Immunoprecipitation Assay)、補体固定分析法(Complement Fixation Assay)、FACS、蛋白質チップ(protein chip)などがあるがこれに制限されるものではない。
前記蛋白質の可否とその量及び／又はパターンを測定するために、通常２次抗体に連係された検出ラベル(detection label)のシグナルの大きさ及びパターンを検出することにより測定が可能である。
このような検出ラベルは酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微粒子、レドックス分子、放射線同位元素などを例に挙げているが、必ずしもこれに制限されるものではない。検出ラベルとして酵素が使用される場合、利用可能な酵素にはβーグルクロニダーゼ、β-D-グルコシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ファオキシダーゼまたはアルカラインホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとGDPase、RNase、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ホスホプラクトキナーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスファルテートアミノトランスフェラーゼ、ホスフェノールピルベートデカボキシラーゼ、βーラタマーゼなどがあるがこれに制限されるものではない。
検出ラベルとして蛍光物が使用される場合、利用可能な蛍光物にはフルオレシン、イソチオシアネート、ローダミン、ピコエリテリン、ピコシアニン、アルロピコシアニン、o-プタレート、フルオレスカミンなどがあるが、これに制限はされない。検出ラベルとしてリガンドが使用される場合、利用可能なリガンドにはビオチン誘導体などがあるが、これに制限されない。検出ラベルとして発光物が使用される場合、利用可能な発光物にはアクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシファラーゼなどがあるが、これに制限されない。検出ラベルとして微粒子が使用される場合、利用可能な微粒子にはコロイド金、着色されたラテックスなどがあるがこれに制限されない。
検出ラベルとしてレドックス分子が使用される場合、利用可能なレドックス分子にはフェロセン、ルテニウム錯化合物、バイオロゲン、キノン、Tiイオン、Csイオン、ジイミド、1,4-ベンゾキノン、ヒドロキノン、K4W(CN)8、［Os(bpy)3］2+、［RU(bpy)3］2+、［MO(CN)8］4-などがあるがこれに制限されない。
検出ラベルとして放射性同位元素が使用される場合、利用可能な放射性同位元素には、3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、または186Reなどがあるがこれに制限はされない。
本発明の診断用組成物は活性ポリペプチドのターゲット物質の有無、分布、量などを見出だすことができ、これと関連された疾病の有無、進行状態を判断できる情報を提供する。本発明の組成物は本発明の蛋白質骨格モジュールに内蔵されていない活性ポリペプチドが含まれた診断用組成物に比べて診断の感度、精度、正確度が優れていて診断能力が優れる。
本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用キットを提供する。
前記診断用キットは支持体、適当な緩衝溶液、発色酵素または蛍光物質で示された２次抗体、発色基質液などをさらに含むことができる。前記支持体はニトロセルロース膜、ポリピニル樹脂で合成された96ウェルプレート(96well plate)、ポリスチレン樹脂で合成された96ウェルプレート、またはガラスからなるスライドグラスなどでもあり、前記発色酵素はペルオキダーゼ(peroxidase)、またはアルカラインホスファターゼ(alkaline phosphatase)などでもあって、前記蛍光物質はFITC、またはRITCなどでもあり、前記発色基質液はABTS(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))、OPD(o-Phenylenediamine)、またはTMB(Tetramethyl Benzidine)などでもある。
本発明は前記活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む薬学的組成物を提供する。
本発明の薬学的組成物は活性ポリペプチドの結合ターゲットに有効な治療物質、細胞毒性薬物などを運搬することができる。
薬学的組成物は活性ポリペプチドの種類によってその対象疾病が異なることがある。例えば、本発明の活性ポリペプチドとしてAP-1が内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分とする薬学的組成物の場合、さまざまなヒトの癌（大腸癌、肺癌、子宮癌及び乳房癌）から過発現するIL-4 レセプタに結合することにより、これをターゲットにする治療物質または細胞毒性薬物などの運搬が可能である。
本発明は
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号３で示されるAP-1(activator protein 1)のアミノ酸配列を含むポリペプチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とするAP-1が内蔵された蛋白質骨格モジュール、及び
前記AP-1が内蔵された蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチドを提供する。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号３で示されるAP-1(activator protein 1)のアミノ酸配列を含むポリペプチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とするAP-1が内蔵された蛋白質骨格モジュール、及び
前記AP-1が内蔵された蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチドを提供する。
前記ポリヌクレオチドは好ましくは配列番号４乃至配列番号６からなる群より選ばれたいずれか１つでもある。
活性ポリペプチドは対象蛋白質との接触を通じてシグナル伝達、対象蛋白質のactivation、deactivation、phosphorhlationなどさまざまな作用をするポリペプチドを意味する。AP-1はcytokine IL-4 レセプタに結合するアミノ酸配列を有するので、みずからIL-4レセプタに結合力を有する。IL-4レセプタはさまざまなヒトの癌（大腸癌、肺癌、子宮癌及び乳房癌）から過発現が知られているのでIL-4レセプタに選択的に結合する活性ポリペプチドの開発は癌の診断及び治療に応用することができる。IL-4は細胞付着を増加させるサイトカインで動脈硬化を誘発させる作用をするので、AP-1ペプチドは動脈硬化の診断及び治療剤に開発することができる。
本発明はAP-1が内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌または動脈硬化診断用組成物及びAP-1が内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌または動脈硬化診断用キットを提供する。
本発明はAP-1が内蔵された蛋白質骨格モジュールを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む癌または動脈硬化診断方法を提供する。
本発明は癌または動脈硬化診断用製剤の製造のためのAP-1が内蔵された蛋白質骨格モジュールの用途を提供する。
前記癌はその発生、進行、退化または消滅によりAP-1が親和力を有する構造を有した生体物質の水準を変化させる癌であれば、いかなる癌でも可能であり、好ましくは大腸癌、肺癌、子宮癌または乳房癌でもある。
本発明に係る薬学的組成物は本発明の蛋白質骨格モジュールを単独で含有するかまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を追加して含有することができる。
薬学的に許容される担体には例えば、経口投与用担体または非経口投与用担体を追加して含むことができる。経口投与用担体はラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸などを含むことができる。ペプチド製剤に対する経口投与用に使用されるさまざまな薬物伝達物質を含むことができる。さらに、非経口投与用担体は水、適したオイル、食塩水、水性グルコースなどを含むことができ、安定化剤及び保存剤を追加して含むことができる。適した安定化剤には亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような硫酸化剤がある。適した保存剤にはベンズアルコニウムクロライド、メチルまたはプロフィールパラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体には、下記の文献に記載されていることを参考にすることができる(Remington's Pharmaceutical Sciences,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA,1995)。
本発明の組成物はヒトを始めとする哺乳動物にいかなる方法でも投与することができる。例えば、経口または非経口的に投与することができる。非経口的投与方法には、これに限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、隔膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸内に投与することができる。
本発明の薬学的組成物は上述した通り、投与経路により経口投与用または非経口投与用製剤に剤形化することができる。
経口投与用製剤の場合に本発明の組成物は粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液などで当業界に公知の方法を利用して剤形化することができる。例えば、経口用製剤は活性成分を固体賦形剤と配合してこれを粉砕し、適した補助剤を添加して顆粒混合物として加工することにより、錠剤、または糖衣錠剤を収得することができる。適した賦形剤の例にはラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール及びマルチトールなどを含む糖類とトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、お米澱粉及び馬鈴薯澱粉などを含む澱粉類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロフィールメチルセルロースなどを含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどのような充填剤が含まれる。さらに、場合によっては架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはナトリウムアルキネートなどを崩解剤として添加することができる。本発明の薬学的組成物は抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などを追加して含むことができる。
非経口投与用製剤の場合には注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟膏剤、オイル剤、保湿剤、ゲル剤、エアロゾル及び鼻腔吸入れ剤の形態で当業界に公知の方法で剤形化することができる。これらの剤形はすべての製薬化学に一般的に公知の処方箋である文献(Remington's Pharmaceutical Science,15th Edition,1975,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania 18042,Chapter 87:Blaug,Seymour)に記載されている。
本発明の組成物の蛋白質骨格モジュールの総有効量は単一投与量(single dose)で患者に投与することができ、多重投与量(multiple dose)で長期間投与される分割治療方法(fractionated treatment protocol)により投与できる。本発明の薬学的組成物は疾患の程度により有効成分の含量を異にすることができる。好ましくは本発明の組成物の蛋白質骨格モジュールの用量は１日当り患者の体重１kg当り約0.01ug乃至1,000mg最も好ましくは0.1ug乃至100mgでもある。しかしながら、前記蛋白質骨格モジュールの用量は薬学的組成物の投与経路及び治療回数ばかりでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率など、さまざまな要因などを考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、このような点を考慮するにおいて当分野の通常的な知識を有する者であれば前記蛋白質骨格モジュールを特定した用途による適切な有効投与量を決定することができる。本発明による薬学的組成物は本発明の効果を示す限りその剤形、投与経路及び投与方法に特に制限はされない。
本発明のこのような効果は本発明の明細書の実施例に示されている。
本発明の実施例では多くのmodularドメインの内、親和力が高く分子量及び免疫原性が低く、ヒトに豊富に存在して３次元構造の検証が可能なmodularドメインをスクリーニングして最適のドメインでStamiin-2のEGFLドメインを選定した。選定された配列を３次元モデリングし、in silico上で突然変異を誘発して最適のモデルを確立した。
本発明の他の一実施例では選定された蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチド配列を製作して、これを発現可能な発現ベクターに導入し、これを利用して大腸菌を形質転換した。形質転換された菌株を培養して本発明の蛋白質骨格モジュールを発現させた後これを抽出精製した。
本発明の他の一実施例では表面プラスモン共鳴分析により本発明の活性ポリペプチドとしてAP-1が内蔵された蛋白質骨格モジュールの結合能力を測定した。測定した結果、本発明の蛋白質骨格モジュールにAP-1が内蔵された場合、親和力がnaked AP-1ペプチドに比べて174倍高くなることを確認した。
本発明の他の一実施例では本発明の蛋白質骨格モジュールによる活性ポリペプチドのdetection敏感度の変化を測定した。その結果、本発明の蛋白質骨格モジュールにAP-1が内蔵された場合、naked AP-1ペプチドに比べて10倍以上IL-4の活性を阻害することを確認した。
本発明の他の一実施例では本発明の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールによる診断敏感度を測定した。細胞影像（Cellular imaging）または動物影像（Animal imaging）実験の結果、本発明の蛋白質骨格モジュールにAP-1が内蔵された場合、naked AP-1ペプチドに比べて腫瘍ターゲッティング機能が向上されたことを確認した。
以上説明した通り、本発明は活性ポリペプチドの結合親和力または結合特異性を増強させる新規の蛋白質骨格モジュールに関するもので、詳細には配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；活性ポリペプチドを含むポリペプチド；及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする蛋白質骨格モジュール及びこれの製造方法を提供する。本発明の蛋白質骨格モジュールは内蔵された活性ポリペプチドの結合親和力または結合特異性を増強させることにより疾病の診断及び治療に効果的である。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみ、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
実施例 １．
DMID(Designed Modular Immunodiagnosties)候補郡スクリーニング及びモデリング
１−１．スクリーニング
ヒトから発現される蛋白質ドメイン内に多量に存在するmodularドメインをヒトの遺伝子データベースを比較分析するポストジノミックスクリーニングを通じて20個の候補郡に選定した後、ａ）高い親和力、ｂ）低い分子量、ｃ）低い免疫原性(low immunogenicity)、ｄ）ヒトに豊富に存在、及びｅ）３次元構造検証可能な条件を基準にEGFL(EGF-like)ドメインを選定した。
DMID(Designed Modular Immunodiagnosties)候補郡スクリーニング及びモデリング
１−１．スクリーニング
ヒトから発現される蛋白質ドメイン内に多量に存在するmodularドメインをヒトの遺伝子データベースを比較分析するポストジノミックスクリーニングを通じて20個の候補郡に選定した後、ａ）高い親和力、ｂ）低い分子量、ｃ）低い免疫原性(low immunogenicity)、ｄ）ヒトに豊富に存在、及びｅ）３次元構造検証可能な条件を基準にEGFL(EGF-like)ドメインを選定した。
EGFLは多数の血漿蛋白質に存在する40個のアミノ酸からなるモジュールであって、低分子、高安全性、低免疫性の特性を有する。２個のbeta-sheetと３個のdi-sullfide結合からなる単純な構造であり、３次元構造検証が可能で構造に影響を与えないloopが存在して活性ポリペプチド挿入が容易なためDMID候補として適している。
１−２．３次元モデリング
EGFLドメインの３次元モデリングのためにBLASTとAlignMasterプログラムが使用された。ヒトのEGFLドメインの構造はProtein DataBankから提供された。
EGFLドメインの３次元モデリングのためにBLASTとAlignMasterプログラムが使用された。ヒトのEGFLドメインの構造はProtein DataBankから提供された。
理論的基盤の突然変異と２次元モデリングはnnPredic((www.cmpharm.ucsf. edu/〜 nomi/nnpredict.html)及びjppred(http://www.copmbio.dundee.ac.uk/〜 www-jpred/submit.html)を利用して行った。理論的基盤の３次元モデリング(Knowledge based 3-dimensional models)はSwiss Model(http://www.expasy.ch/)から提供され、これを追加してin silico突然変異誘発後 Chimera/Modeller 6で検証した。最後にDMIDモデルはPyMOLで分析されて視覚化した。
実施例 ２．
組換えDMID-AP1発現及び精製
２−１．形質転換菌株製作-DMID-SalI-HindIII cassetteの製作
本発明の蛋白質骨格モジュール(DMID)を製作するためにスタビリン２蛋白質が存在するEGFLドメイン(4621-4869)をE-coli発現ベクターであるpET32a(Novagen)のBamH1とXhol siteにクローニングして発現蛋白質を製造した。EGFLドメインのGCTGAC(4639-4644)をGTCGACで遺伝子変異を起こし、制限酵素Sall siteを製造してAAAGCA(4703-4708)をAAGCTTで変異を起こして制限酵素HindIIIsiteを製造し、活性ポリペプチドを挿入できるDMID-Sall-HindIII casseteを製造した。
組換えDMID-AP1発現及び精製
２−１．形質転換菌株製作-DMID-SalI-HindIII cassetteの製作
本発明の蛋白質骨格モジュール(DMID)を製作するためにスタビリン２蛋白質が存在するEGFLドメイン(4621-4869)をE-coli発現ベクターであるpET32a(Novagen)のBamH1とXhol siteにクローニングして発現蛋白質を製造した。EGFLドメインのGCTGAC(4639-4644)をGTCGACで遺伝子変異を起こし、制限酵素Sall siteを製造してAAAGCA(4703-4708)をAAGCTTで変異を起こして制限酵素HindIIIsiteを製造し、活性ポリペプチドを挿入できるDMID-Sall-HindIII casseteを製造した。
２−２．形質転換菌株の培養
形質転換されたOrigami strainを50ug/mlのAmpicilinと25ug/mlのKanamycinが含まれた20mlのTryptone phosphate(TP)broth (2% bacto-tryptone,0.2% Na2 HPO4 ,0.1% KH2 PO4 ,0.8%NaCl,1.5% yeast extret and 0.2%glcose)夜通し培養した。
形質転換されたOrigami strainを50ug/mlのAmpicilinと25ug/mlのKanamycinが含まれた20mlのTryptone phosphate(TP)broth (2% bacto-tryptone,0.2% Na2 HPO4 ,0.1% KH2 PO4 ,0.8%NaCl,1.5% yeast extret and 0.2%glcose)夜通し培養した。
培養液を4000 Xgで５分間遠心分離してペレット回収し、50ug/mlのアンピシリンが含有された同一量のTPに再懸濁させた。これをTP brothに100倍に希釈して37℃でOD600値が0.5になるまで培養した。培養が終了した培養液を20℃に冷却した後、0.2mMのIPTG(IsopropyI-β-D-thiogalactoside)で12時間蛋白質発現を誘導後、培養細胞を回収して使用時まで−80℃に保管した。
２−３．蛋白質抽出及び分離精製
前記保管された細胞を1mM PMSF,0.5mM DTTが含まれた10ml of 2X PBSに再懸濁して、Duty cycle:30%,Output:2.5 for 5 minの条件で超音波粉砕した。粉砕された細胞を15,000gに10分間遠心分離して上澄液を採取した。
前記保管された細胞を1mM PMSF,0.5mM DTTが含まれた10ml of 2X PBSに再懸濁して、Duty cycle:30%,Output:2.5 for 5 minの条件で超音波粉砕した。粉砕された細胞を15,000gに10分間遠心分離して上澄液を採取した。
回収された上澄液を2X PBS 緩衝液で平衡化（equilibrate）したNi-NTNカラム(amersham pharmacia biotech AB,Vt=0.5ml)に製造社のマニュアルにより設定（setting）してローディングした。6(his)tagがついたDMIDは30mMイミダゾールが含まれた2X PBSではカラムについているので、30mMイミダゾールが含まれた2X PBSでカラムを水洗（カラムボリュームの10倍）した後、250mMイミダゾールが含まれた2X PBSバッファー（イリュージョンバッファー）でカラムについた蛋白質を回収した。
実施例３．
組換えDMID-AP1結合能力向上検証―表面プラズモン共鳴分析
本発明のAP1が内蔵された蛋白質骨格モジュール(DMID-AP1)の結合能力を調べるためにnaked AP1とDMID-AP1の結合定数をBiacore 2000を使用して表面プラズモン共鳴分析法で測定した。昆虫細胞(SF21)で発現及び精製したヒトのIL-4 レセプタのectodomain(IL-4Ra)をHBR 緩衝液(10 mM HEPES,pH7.4,150 mM NaCl,3.4mM EDTA,and 0.005% surfant P20)に希釈した後、Biacore CM5 chip表面に製造社の方法によりコーティングした(2500 RU)。同一緩衝液に希釈したAP-1ペプチド又はDMID-AP1を流して(50 ul/min)RU値の変化を測定した後、Biaevaluation2.0プログラムを使用して結合定数を求めた。
組換えDMID-AP1結合能力向上検証―表面プラズモン共鳴分析
本発明のAP1が内蔵された蛋白質骨格モジュール(DMID-AP1)の結合能力を調べるためにnaked AP1とDMID-AP1の結合定数をBiacore 2000を使用して表面プラズモン共鳴分析法で測定した。昆虫細胞(SF21)で発現及び精製したヒトのIL-4 レセプタのectodomain(IL-4Ra)をHBR 緩衝液(10 mM HEPES,pH7.4,150 mM NaCl,3.4mM EDTA,and 0.005% surfant P20)に希釈した後、Biacore CM5 chip表面に製造社の方法によりコーティングした(2500 RU)。同一緩衝液に希釈したAP-1ペプチド又はDMID-AP1を流して(50 ul/min)RU値の変化を測定した後、Biaevaluation2.0プログラムを使用して結合定数を求めた。
図２及び図３に示した通り、表面プラズモン共鳴分析（surface plasmon resonance analysis）をした結果、peptide imbedded DMIDがnaked peptideに比べて174倍高い親和力を示すことを確認した。
実施例 ４．
組換えDMID-API 検出能力向上検証1-IL-4によるIL-4 レセプタの活性阻害度の測定
5X105 のTHP1(NIH AIDS Research and Reagent Program,NCI9949)細胞を6-well plateに播種（seeding）後100ng/mlのPhorbol12-myristate13-acetate(PMA)(Sigma,P8139-1MG)を３日間処理して活性化（activate）させた。18時間血清（serum）がない条件で細胞を培養した後、0.67nM(1X)のIL-4単独又は多様な濃度［10n X (0.67NM)］のAP-1 peptide又は組換えDMID-AP1を共に処理した。IL-4とIL-4 レセプタ間の結合により誘導されたStat蛋白質のリン酸化はRabbit polyclonal antibody anti-STAT6(Cell Signaling,#9362)とRabbit polyclonal antibody anti-pTyr641-STAT6(Cell Signaling,#9361)を使用してウェスタンブット法で測定した。その結果、図４に示した通り、本発明のDMID-AP1がAP1に比べてStat蛋白質をリン酸化するIL-4活性を10倍以上阻害することを確認した。
組換えDMID-API 検出能力向上検証1-IL-4によるIL-4 レセプタの活性阻害度の測定
5X105 のTHP1(NIH AIDS Research and Reagent Program,NCI9949)細胞を6-well plateに播種（seeding）後100ng/mlのPhorbol12-myristate13-acetate(PMA)(Sigma,P8139-1MG)を３日間処理して活性化（activate）させた。18時間血清（serum）がない条件で細胞を培養した後、0.67nM(1X)のIL-4単独又は多様な濃度［10n X (0.67NM)］のAP-1 peptide又は組換えDMID-AP1を共に処理した。IL-4とIL-4 レセプタ間の結合により誘導されたStat蛋白質のリン酸化はRabbit polyclonal antibody anti-STAT6(Cell Signaling,#9362)とRabbit polyclonal antibody anti-pTyr641-STAT6(Cell Signaling,#9361)を使用してウェスタンブット法で測定した。その結果、図４に示した通り、本発明のDMID-AP1がAP1に比べてStat蛋白質をリン酸化するIL-4活性を10倍以上阻害することを確認した。
実施例 ５．
組換えDMID-AP1 検出能力向上検証2-細胞影像,動物影像
５−１．細胞影像(Cellular imaging)
本発明のAP1が内蔵された蛋白質骨格モジュール(DMID-AP1)の細胞に発現されたIL-4レセプタとの競争的結合能力を調べるために、H226 cell lineにおけるnaked AP1とDMID-AP1のIL-4 レセプタに対する結合能力を蛍光標識された蛋白質を使用して測定した。AP-1ペプチド又は精製されたDMID-AP1を透析緩衝液(50mM Boric acid,150mM NaCl,1mM EDTA,pH 9.0)で４℃で透析した後、蛍光物質Fluorescein Isothiocyanate(FITC)(sigma)と37℃で１時間反応させて標識した。50mM Glycineを37℃で５分間入れて反応を中止後、透析緩衝液(20mM Tris HCl,pH8.0)で４℃で透析した。H226 cellにそれぞれ同一な量の対照群ペプチド、AP-1、DMID-AP1を添加して結合、洗滌後 4%paraformaldehyde(PFA)で固定して細胞核は4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)で染色後、蛍光顕微鏡(Zeiss,Oberkochen,Germany)で観察した。
組換えDMID-AP1 検出能力向上検証2-細胞影像,動物影像
５−１．細胞影像(Cellular imaging)
本発明のAP1が内蔵された蛋白質骨格モジュール(DMID-AP1)の細胞に発現されたIL-4レセプタとの競争的結合能力を調べるために、H226 cell lineにおけるnaked AP1とDMID-AP1のIL-4 レセプタに対する結合能力を蛍光標識された蛋白質を使用して測定した。AP-1ペプチド又は精製されたDMID-AP1を透析緩衝液(50mM Boric acid,150mM NaCl,1mM EDTA,pH 9.0)で４℃で透析した後、蛍光物質Fluorescein Isothiocyanate(FITC)(sigma)と37℃で１時間反応させて標識した。50mM Glycineを37℃で５分間入れて反応を中止後、透析緩衝液(20mM Tris HCl,pH8.0)で４℃で透析した。H226 cellにそれぞれ同一な量の対照群ペプチド、AP-1、DMID-AP1を添加して結合、洗滌後 4%paraformaldehyde(PFA)で固定して細胞核は4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)で染色後、蛍光顕微鏡(Zeiss,Oberkochen,Germany)で観察した。
その結果、図５に示した通り、AP1-DMID-FITCが異なるAP-1又は対照群ペプチドに比べてIL-4 レセプタを発現する細胞標識能力が優れていることを確認した。
５−２．動物影像(Animal Imaging)
1X107個のH226細胞を培養培地に浮遊させて、５〜６週齢の雌BALB/c nudeマウスの右側大腿部に皮下注射して皮下腫瘍モデルを製造した。約３週後腫瘍の大きさが0.1〜1cmになった時実験に使用した。腫瘍異種移植マウスを麻酔させて蛍光物質が結合されたAP-1ペプチドとDMID-AP1 150 ugを尻尾部分の静脈に注射した。蛍光標識されたペプチドの腫瘍ターゲッティング機能をOpticsを利用して分析した。
1X107個のH226細胞を培養培地に浮遊させて、５〜６週齢の雌BALB/c nudeマウスの右側大腿部に皮下注射して皮下腫瘍モデルを製造した。約３週後腫瘍の大きさが0.1〜1cmになった時実験に使用した。腫瘍異種移植マウスを麻酔させて蛍光物質が結合されたAP-1ペプチドとDMID-AP1 150 ugを尻尾部分の静脈に注射した。蛍光標識されたペプチドの腫瘍ターゲッティング機能をOpticsを利用して分析した。
その結果、図６に示した通り、AP-1に比べてDMID-AP1の腫瘍ターゲッティング機能が向上されたことを確認した。
本発明は活性ポリペプチドの結合親和力又は結合特異性を増強させる新規の蛋白質骨格モジュールに関するものであって、詳しくは配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；活性ポリペプチドを含むポリペプチド；及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする蛋白質骨格モジュール及びこれの製造方法を提供する。本発明の蛋白質骨格モジュールは内蔵された活性ポリペプチドの結合親和力又は結合特異性を増強させるので疾病の診断及び治療に効果的であるので産業上の利用可能性が大きい。
Claims (17)
- ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）活性ポリペプチドを含むポリペプチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とする活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュール。 - 請求項１記載の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチド。
- 請求項２記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項３記載の発現ベクターに形質転換された宿主細胞。
- 請求項４記載の宿主細胞を培養する段階を含む活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを製造する方法。
- 請求項１記載の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用組成物。
- 請求項１記載の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む薬学的組成物。
- 請求項１記載の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む診断用キット。
- ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目乃至19番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号３で示されるAP-1(activator protein 1)のアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド及び
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の29番目乃至86番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが順次に連結されたポリペプチドを含むことを特徴とする活性ポリペプチド内蔵された蛋白質骨格モジュール。 - 請求項９記載の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを符号化するポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは配列番号４乃至配列番号６からなる郡より選ばれたいずれか一つであることを特徴とする第10項記載のポリヌクレオチド。
- 請求項９記載の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌又は動脈硬化診断用組成物。
- 請求項９記載の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを有効成分として含む癌又は動脈硬化診断用キット。
- 請求項１記載の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む診断方法。
- 診断用製剤の製造のための請求項１記載の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールの使用。
- 請求項９記載の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む癌又は動脈硬化診断方法。
- 癌又は動脈硬化診断用製剤の製造のための請求項９記載の活性ポリペプチドが内蔵された蛋白質骨格モジュールの使用。
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