JPH104962A - モノクローナル抗体及びその産生細胞 - Google Patents
モノクローナル抗体及びその産生細胞Info
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- JPH104962A JPH104962A JP16451496A JP16451496A JPH104962A JP H104962 A JPH104962 A JP H104962A JP 16451496 A JP16451496 A JP 16451496A JP 16451496 A JP16451496 A JP 16451496A JP H104962 A JPH104962 A JP H104962A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ｒａｆ−１キナーゼのリン酸化酵素活性を測
定する際に必要な試薬として有用なモノクローナル抗
体、及びその抗体を産生する産生細胞を提供すること。 【解決手段】 リン酸化ＭＥＫ−１ペプチド（Gly Gln
Leu Ile Asp Ser* MetAla Asn Ser* Phe Val Gly Thr A
rg Cys（*はリン酸化部位））と特異的に結合するモノ
クローナル抗体は、例えば、融合細胞クローン１Ｅ９
（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５５９３）又は融合細胞
クローン２Ｆ１１（受託番号：ＦＥＲＭＰ−１５５９
４）により産生される。
定する際に必要な試薬として有用なモノクローナル抗
体、及びその抗体を産生する産生細胞を提供すること。 【解決手段】 リン酸化ＭＥＫ−１ペプチド（Gly Gln
Leu Ile Asp Ser* MetAla Asn Ser* Phe Val Gly Thr A
rg Cys（*はリン酸化部位））と特異的に結合するモノ
クローナル抗体は、例えば、融合細胞クローン１Ｅ９
（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５５９３）又は融合細胞
クローン２Ｆ１１（受託番号：ＦＥＲＭＰ−１５５９
４）により産生される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リン酸化ＭＥＫ−
１ペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体、及
びその産生細胞に関する。
１ペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体、及
びその産生細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】多細胞生物であれ、単細胞生物であれ、
すべての細胞は外部からの必要な情報を取り込み応答す
る。多細胞生物ではそれぞれの細胞が適切な情報を取り
込み適切な応答を行うがゆえに、発生という過程を通じ
て極めて複雑な個体が作られ、その恒常性が維持されて
いる。細胞外からの情報は、他の細胞が分泌する液性の
因子や細胞同士の接触を介してやり取りされるが、これ
らの情報は細胞が持つ受容体で感知され、そのシグナル
は細胞の中で複雑な経路を伝わり遺伝子の発現を伴って
種々の応答を引き起こす。増殖や分化の開始は最も著し
い細胞応答である。このように細胞外の情報が細胞膜を
通って細胞内へ伝達され、さらに細胞核に伝えられる過
程を細胞内情報伝達と呼び、その過程には多くの蛋白質
のリン酸化カスケードが関与していることが知られてい
る。
すべての細胞は外部からの必要な情報を取り込み応答す
る。多細胞生物ではそれぞれの細胞が適切な情報を取り
込み適切な応答を行うがゆえに、発生という過程を通じ
て極めて複雑な個体が作られ、その恒常性が維持されて
いる。細胞外からの情報は、他の細胞が分泌する液性の
因子や細胞同士の接触を介してやり取りされるが、これ
らの情報は細胞が持つ受容体で感知され、そのシグナル
は細胞の中で複雑な経路を伝わり遺伝子の発現を伴って
種々の応答を引き起こす。増殖や分化の開始は最も著し
い細胞応答である。このように細胞外の情報が細胞膜を
通って細胞内へ伝達され、さらに細胞核に伝えられる過
程を細胞内情報伝達と呼び、その過程には多くの蛋白質
のリン酸化カスケードが関与していることが知られてい
る。
【０００３】細胞内蛋白質のリン酸化は、蛋白質リン酸
化酵素（プロテインキナーゼ）によって行われ、このよ
うなプロテインキナーゼとしては、プロテインキナーゼ
Ｃ（ＰＫＣ）、サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキ
ナーゼ（ＰＫＡ）、ＰＩ３キナーゼ、ｃｄｃ２キナー
ゼ、ｒａｆ−１キナーゼ等が知られているが、これらプ
ロテインキナーゼは細胞内の情報伝達を介して細胞の増
殖と分化の調節に関わっており、プロテインキナーゼ及
び細胞情報伝達に関与する分子の発現異常は癌や糖尿病
等の疾患として表現される。従ってこれらプロテインキ
ナーゼや細胞内情報伝達に関与する分子の機能異常の検
出は細胞増殖や細胞分化、ひいては癌などの疾患の解明
に不可欠である。プロテインキナーゼの機能異常の検出
の手段としては、プロテインキナーゼの酵素活性の測定
が行われるが、測定方法としては放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）や酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が知られていた。
化酵素（プロテインキナーゼ）によって行われ、このよ
うなプロテインキナーゼとしては、プロテインキナーゼ
Ｃ（ＰＫＣ）、サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキ
ナーゼ（ＰＫＡ）、ＰＩ３キナーゼ、ｃｄｃ２キナー
ゼ、ｒａｆ−１キナーゼ等が知られているが、これらプ
ロテインキナーゼは細胞内の情報伝達を介して細胞の増
殖と分化の調節に関わっており、プロテインキナーゼ及
び細胞情報伝達に関与する分子の発現異常は癌や糖尿病
等の疾患として表現される。従ってこれらプロテインキ
ナーゼや細胞内情報伝達に関与する分子の機能異常の検
出は細胞増殖や細胞分化、ひいては癌などの疾患の解明
に不可欠である。プロテインキナーゼの機能異常の検出
の手段としては、プロテインキナーゼの酵素活性の測定
が行われるが、測定方法としては放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）や酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が知られていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ｒａｆ
−１キナーゼのリン酸化酵素活性を測定する際に必要な
試薬などは未だ開発されていなかった。かかるｒａｆ−
１キナーゼはプロテインキナーゼの一種であり、そのリ
ン酸化酵素活性を測定することは癌などの疾患を早期に
発見するのに有用である。
−１キナーゼのリン酸化酵素活性を測定する際に必要な
試薬などは未だ開発されていなかった。かかるｒａｆ−
１キナーゼはプロテインキナーゼの一種であり、そのリ
ン酸化酵素活性を測定することは癌などの疾患を早期に
発見するのに有用である。
【０００５】本発明者らは、ｒａｆ−１キナーゼのリン
酸化酵素活性を測定する際に必要な試薬として有用なモ
ノクローナル抗体を提供し、またその抗体を産生する産
生細胞を提供することを目的とする。
酸化酵素活性を測定する際に必要な試薬として有用なモ
ノクローナル抗体を提供し、またその抗体を産生する産
生細胞を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明の第１であるモノクローナル抗体は、リン酸
化ＭＥＫ−１ペプチド（配列番号１で表されるＭＥＫ−
１ペプチドのアミノ酸番号６及び１０のセリンがリン酸
化されたもの）と特異的に結合する。
め、本発明の第１であるモノクローナル抗体は、リン酸
化ＭＥＫ−１ペプチド（配列番号１で表されるＭＥＫ−
１ペプチドのアミノ酸番号６及び１０のセリンがリン酸
化されたもの）と特異的に結合する。
【０００７】本発明の第２である産生細胞は、リン酸化
ＭＥＫ−１ペプチドと特異的に結合するモノクローナル
抗体を産生する。かかる産生細胞としては、リン酸化Ｍ
ＥＫ−１ペプチドを免疫感作させた哺乳動物から取得さ
れる抗体産生細胞と哺乳動物骨髄腫系細胞との融合によ
り得られるものが好ましい。具体的には、融合細胞クロ
ーン１Ｅ９（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５５９３）又
は融合細胞クローン２Ｆ１１（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
−１５５９４）であることが好ましい。
ＭＥＫ−１ペプチドと特異的に結合するモノクローナル
抗体を産生する。かかる産生細胞としては、リン酸化Ｍ
ＥＫ−１ペプチドを免疫感作させた哺乳動物から取得さ
れる抗体産生細胞と哺乳動物骨髄腫系細胞との融合によ
り得られるものが好ましい。具体的には、融合細胞クロ
ーン１Ｅ９（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５５９３）又
は融合細胞クローン２Ｆ１１（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
−１５５９４）であることが好ましい。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体の作
製及びこの抗体を産生する細胞の作製について以下に説
明する。 Ａ．抗原 抗原としてはリン酸化ＭＥＫ−１ペプチド（配列番号１
で表されるＭＥＫ−１ペプチドのアミノ酸番号６及び１
０のセリンがリン酸化されたもの）を合成し、免疫原と
して使用する。当該ペプチドは比較的低分子であり、こ
のものをそのまま免疫しても抗体ができにくいため、通
常、ＫＬＨ（スカシガイヘモシアニン）やアルブミンの
ようなキャリアー蛋白質と結合させることにより免疫原
として使用する。
製及びこの抗体を産生する細胞の作製について以下に説
明する。 Ａ．抗原 抗原としてはリン酸化ＭＥＫ−１ペプチド（配列番号１
で表されるＭＥＫ−１ペプチドのアミノ酸番号６及び１
０のセリンがリン酸化されたもの）を合成し、免疫原と
して使用する。当該ペプチドは比較的低分子であり、こ
のものをそのまま免疫しても抗体ができにくいため、通
常、ＫＬＨ（スカシガイヘモシアニン）やアルブミンの
ようなキャリアー蛋白質と結合させることにより免疫原
として使用する。
【０００９】Ｂ．上記抗原による免疫 免疫動物としては哺乳動物であるマウスのほかラット、
ハムスターなども用いることができる。通常マウスが最
も汎用され、ＢＡＬＢ／ｃマウス、その他の系（ｓｔｒ
ａｉｎ）のマウスを用いることができる。この際、免疫
計画及び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリン
パ球が形成されるよう選ばれるべきである。例えばマウ
ス１匹に２５μｇの抗原を２週間間隔で腹腔に３回免疫
後、さらに２５μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日
後に融合のための脾臓細胞を取り出す。
ハムスターなども用いることができる。通常マウスが最
も汎用され、ＢＡＬＢ／ｃマウス、その他の系（ｓｔｒ
ａｉｎ）のマウスを用いることができる。この際、免疫
計画及び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリン
パ球が形成されるよう選ばれるべきである。例えばマウ
ス１匹に２５μｇの抗原を２週間間隔で腹腔に３回免疫
後、さらに２５μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日
後に融合のための脾臓細胞を取り出す。
【００１０】Ｃ．細胞融合 上記のごとく免疫した哺乳動物の個体から脾臓を無菌的
に取り出し、そこから単細胞懸濁液を調製する。この脾
臓細胞（抗体産生細胞）を適当な骨髄腫細胞と適当な融
合促進剤の使用により細胞融合させる。骨髄腫細胞とし
ては免疫動物と同種の哺乳動物に由来するものが望まし
いが、ラット、ハムスター等の脾臓細胞とマウスの骨髄
腫細胞を融合させることもできる。脾臓細胞と骨髄腫細
胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０8 個の脾細胞について０．５〜１．５ｍｌの
融合媒体の使用が適当である。好ましい融合促進剤とし
ては、例えば平均分子量１０００〜４０００のポリエチ
レングリコールを有利に使用できるが、この分野で知ら
れている他の融合促進剤（例えばセンダイウイルス（別
名ＨＶＪ））を用いることもできる。また、これら融合
促進剤を用いた方法以外に電気ショックを用いる方法に
より細胞融合を行ってもよい。
に取り出し、そこから単細胞懸濁液を調製する。この脾
臓細胞（抗体産生細胞）を適当な骨髄腫細胞と適当な融
合促進剤の使用により細胞融合させる。骨髄腫細胞とし
ては免疫動物と同種の哺乳動物に由来するものが望まし
いが、ラット、ハムスター等の脾臓細胞とマウスの骨髄
腫細胞を融合させることもできる。脾臓細胞と骨髄腫細
胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０8 個の脾細胞について０．５〜１．５ｍｌの
融合媒体の使用が適当である。好ましい融合促進剤とし
ては、例えば平均分子量１０００〜４０００のポリエチ
レングリコールを有利に使用できるが、この分野で知ら
れている他の融合促進剤（例えばセンダイウイルス（別
名ＨＶＪ））を用いることもできる。また、これら融合
促進剤を用いた方法以外に電気ショックを用いる方法に
より細胞融合を行ってもよい。
【００１１】Ｄ．目的とするモノクローナル抗体を産生
する融合細胞の選択 別の容器（例えばマイクロタイタープレート）で未融合
の脾細胞、未融合の骨髄腫細胞及び融合した融合細胞の
混合物を未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地で希
釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１
時間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−アザグ
アニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しないもの
（例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジンを含む培地））が使用される。この選択培
地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。また、未融合
の脾細胞は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間（例えば
１週間）後に死滅する。これに対して融合した細胞は、
骨髄腫の親細胞の腫瘍性と親脾細胞の性質を合わせ持つ
ため、選択培地中で生存できる。
する融合細胞の選択 別の容器（例えばマイクロタイタープレート）で未融合
の脾細胞、未融合の骨髄腫細胞及び融合した融合細胞の
混合物を未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地で希
釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１
時間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−アザグ
アニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しないもの
（例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジンを含む培地））が使用される。この選択培
地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。また、未融合
の脾細胞は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間（例えば
１週間）後に死滅する。これに対して融合した細胞は、
骨髄腫の親細胞の腫瘍性と親脾細胞の性質を合わせ持つ
ため、選択培地中で生存できる。
【００１２】かくして、融合細胞が検出された後、前記
のリン酸化ＭＥＫ−１ペプチドに対する抗体について酵
素免疫測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)に
よりスクリーニングを行い、リン酸化ＭＥＫ−１ペプチ
ドと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する融
合細胞だけを選択する。このような融合細胞として、例
えば融合細胞クローン１Ｅ９（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
−１５５９３）又は融合細胞クローン２Ｆ１１（受託番
号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５５９４）が挙げられる。
のリン酸化ＭＥＫ−１ペプチドに対する抗体について酵
素免疫測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)に
よりスクリーニングを行い、リン酸化ＭＥＫ−１ペプチ
ドと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する融
合細胞だけを選択する。このような融合細胞として、例
えば融合細胞クローン１Ｅ９（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
−１５５９３）又は融合細胞クローン２Ｆ１１（受託番
号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５５９４）が挙げられる。
【００１３】Ｆ．目的とするモノクローナル抗体の取得 目的とするモノクローナル抗体を産生する融合細胞を適
当な方法（例えば限界希釈法）でクローン化した後、抗
体は２つの異なった方法で産生することができる。その
第１の方法によれば、融合細胞を一定期間、適当な培地
で培養することにより、その培養上清からその融合細胞
の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第
２の方法によれば、融合細胞は同質遺伝子、または半同
質遺伝子を持つ免疫動物の腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中より、
その融合細胞の産生するモノクローナル抗体を得ること
ができる。
当な方法（例えば限界希釈法）でクローン化した後、抗
体は２つの異なった方法で産生することができる。その
第１の方法によれば、融合細胞を一定期間、適当な培地
で培養することにより、その培養上清からその融合細胞
の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第
２の方法によれば、融合細胞は同質遺伝子、または半同
質遺伝子を持つ免疫動物の腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中より、
その融合細胞の産生するモノクローナル抗体を得ること
ができる。
【００１４】
【実施例】以下に、本発明の好適な実施例を説明する。
尚、本発明の実施の形態は、下記の実施例に何ら限定さ
れるものではなく、本発明の技術的範囲に属する限り種
々の形態を採り得ることはいうまでもない。
尚、本発明の実施の形態は、下記の実施例に何ら限定さ
れるものではなく、本発明の技術的範囲に属する限り種
々の形態を採り得ることはいうまでもない。
【００１５】［実施例１］ 免疫原の作製 リン酸化ＭＥＫ−１ペプチド（配列番号１で表されるＭ
ＥＫ−１ペプチドのアミノ酸番号６及び１０のセリンが
リン酸化されたもの）はミリポア社製９０５０全自動合
成装置を用いて、同装置の使用説明書に従いＦｍｏｃ法
を用いた固相法により作製した（合成法の詳細は秀潤社
刊、細胞工学別冊「抗ペプチド抗体実験プロトコール」
参照）。Ｃ末端にはキャリアー蛋白と結合させるための
システイン残基を導入した。合成したリン酸化ＭＥＫ−
１ペプチドは開裂しトリフルオロ酢酸で保護基を除いた
後、以下の条件で逆相高速液体クロマトグラフィーを行
い精製した。
ＥＫ−１ペプチドのアミノ酸番号６及び１０のセリンが
リン酸化されたもの）はミリポア社製９０５０全自動合
成装置を用いて、同装置の使用説明書に従いＦｍｏｃ法
を用いた固相法により作製した（合成法の詳細は秀潤社
刊、細胞工学別冊「抗ペプチド抗体実験プロトコール」
参照）。Ｃ末端にはキャリアー蛋白と結合させるための
システイン残基を導入した。合成したリン酸化ＭＥＫ−
１ペプチドは開裂しトリフルオロ酢酸で保護基を除いた
後、以下の条件で逆相高速液体クロマトグラフィーを行
い精製した。
【００１６】使用カラム：μBondasphere 5-μm C18
100A（3.9×150mm） 溶出条件：０．１％トリニトロ酢酸（アセトニトリル６
〜６０％直線グラジェント）
100A（3.9×150mm） 溶出条件：０．１％トリニトロ酢酸（アセトニトリル６
〜６０％直線グラジェント）
【００１７】リン酸化ＭＥＫ−１ペプチドはＭＢＳ法に
よりスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合させ免疫
原とした。即ち、４ｍｇのＫＬＨを０．２５ｍｌの１０
ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）に溶解し、この溶
液に２０μｌのジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）に溶
解した０．７ｍｇの３−マレイミドベンゾイックアシド
−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＳ）を加
え、室温で３０分間反応させた。反応後、セファデック
スＧ２５を充填したカラム（１．５×１０ｃｍ）を用い
てゲルろ過を行い、ＫＬＨ−ＭＢ複合体と遊離のＫＬＨ
を分離し、ＫＬＨ−ＭＢ複合体を集めた。そして、リン
酸化ＭＥＫ−１ペプチド５ｍｇを１ｍｌの０．１Ｍホウ
酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶解し、この液とＫＬＨ
−ＭＢ複合体溶液を混合し、ｐＨを７．０〜７．５に調
製して室温で３時間放置して反応させた。反応後、ＰＢ
Ｓ（生理的リン酸緩衝液）に十分透析した後、ＰＢＳで
０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、１００μｌずつ分注
して−２０℃に凍結して保存した。
よりスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合させ免疫
原とした。即ち、４ｍｇのＫＬＨを０．２５ｍｌの１０
ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）に溶解し、この溶
液に２０μｌのジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）に溶
解した０．７ｍｇの３−マレイミドベンゾイックアシド
−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＳ）を加
え、室温で３０分間反応させた。反応後、セファデック
スＧ２５を充填したカラム（１．５×１０ｃｍ）を用い
てゲルろ過を行い、ＫＬＨ−ＭＢ複合体と遊離のＫＬＨ
を分離し、ＫＬＨ−ＭＢ複合体を集めた。そして、リン
酸化ＭＥＫ−１ペプチド５ｍｇを１ｍｌの０．１Ｍホウ
酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶解し、この液とＫＬＨ
−ＭＢ複合体溶液を混合し、ｐＨを７．０〜７．５に調
製して室温で３時間放置して反応させた。反応後、ＰＢ
Ｓ（生理的リン酸緩衝液）に十分透析した後、ＰＢＳで
０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、１００μｌずつ分注
して−２０℃に凍結して保存した。
【００１８】［実施例２］ マウスの免疫 上記で作製した免疫原（リン酸化ＭＥＫ−１ペプチド−
ＫＬＨ）１００μｌと完全フロインドアジュバント１０
０μｌとをよく混合して懸濁液を作製し、この懸濁液を
ＢＤＦ１マウスの腹腔内に１匹当り抗原として２５μｇ
ずつ投与した。２週間後に再度同量の抗原を投与し、そ
の３日後に脾臓を取り出し、以下に示すように細胞融合
を行った。
ＫＬＨ）１００μｌと完全フロインドアジュバント１０
０μｌとをよく混合して懸濁液を作製し、この懸濁液を
ＢＤＦ１マウスの腹腔内に１匹当り抗原として２５μｇ
ずつ投与した。２週間後に再度同量の抗原を投与し、そ
の３日後に脾臓を取り出し、以下に示すように細胞融合
を行った。
【００１９】［実施例３］ 細胞融合及び目的とするモ
ノクローナル抗体を産生する融合細胞の選択と取得 摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）とを約１０：１の割合で混合
し、５０％ポリエチレングリコール４０００を融合促進
剤として細胞融合を行った。融合後の細胞は１×１０6
ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞濃度となるように１０％ウシ血
清を含むＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウエルのマイクロタ
イタープレート（ヌンク社製マキシソープ、以下同じ）
に１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。
ノクローナル抗体を産生する融合細胞の選択と取得 摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）とを約１０：１の割合で混合
し、５０％ポリエチレングリコール４０００を融合促進
剤として細胞融合を行った。融合後の細胞は１×１０6
ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞濃度となるように１０％ウシ血
清を含むＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウエルのマイクロタ
イタープレート（ヌンク社製マキシソープ、以下同じ）
に１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。
【００２０】融合細胞はＣＯ2 インキュベータ（５％Ｃ
Ｏ2 、３７℃）中で培養し、ＨＡＴ培地で培地交換を行
い増殖させて、脾臓細胞と骨髄腫細胞からなる融合細胞
のスクリーニングを行った。ついでＨＴ培地中で馴化
し、さらに１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）−ＲＰＭＩ１
６４０培地で馴化した。
Ｏ2 、３７℃）中で培養し、ＨＡＴ培地で培地交換を行
い増殖させて、脾臓細胞と骨髄腫細胞からなる融合細胞
のスクリーニングを行った。ついでＨＴ培地中で馴化
し、さらに１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）−ＲＰＭＩ１
６４０培地で馴化した。
【００２１】融合細胞培養上清中の抗体は、リン酸化Ｍ
ＥＫ−１ペプチドを感作したマイクロタイタープレート
を用いてＥＬＩＳＡ法により検出した。陽性となったウ
エルに対しては、限界希釈法によるクローニングを２回
繰り返し、リン酸化ＭＥＫ−１ペプチドに対する反応性
を有するクローン２種類を選出し、融合細胞クローン１
Ｅ９（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５５９３）、及び融
合細胞クローン２Ｆ１１（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１
５５９４）と名付けた。得られた各クローンの細胞はそ
れぞれ１０％のＤＭＳＯを含む９０％ウシ血清中に懸濁
させ、液体窒素中に保存した。
ＥＫ−１ペプチドを感作したマイクロタイタープレート
を用いてＥＬＩＳＡ法により検出した。陽性となったウ
エルに対しては、限界希釈法によるクローニングを２回
繰り返し、リン酸化ＭＥＫ−１ペプチドに対する反応性
を有するクローン２種類を選出し、融合細胞クローン１
Ｅ９（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５５９３）、及び融
合細胞クローン２Ｆ１１（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１
５５９４）と名付けた。得られた各クローンの細胞はそ
れぞれ１０％のＤＭＳＯを含む９０％ウシ血清中に懸濁
させ、液体窒素中に保存した。
【００２２】［実施例４］ モノクローナル抗体の採取 各クローンの産生するモノクローナル抗体は、各クロー
ンの融合細胞をヌードマウスの腹腔内で増殖させ、その
腹水中からプロテイン−Ａセファロース４Ｂカラムを用
いてそれぞれを精製した。
ンの融合細胞をヌードマウスの腹腔内で増殖させ、その
腹水中からプロテイン−Ａセファロース４Ｂカラムを用
いてそれぞれを精製した。
【００２３】［実施例５］ 抗体の特異性の確認 実施例４で得た抗体につき、ＥＬＩＳＡ法によってリン
酸化ＭＥＫ−１ペプチドに対する反応性を確認した。即
ち、リン酸化ＭＥＫ−１ペプチドを結合したマイクロタ
イタープレート及び非リン酸化ＭＥＫ−１ペプチド（配
列番号１で表されるＭＥＫ−１ペプチド）を結合したマ
イクロタイタープレートのそれぞれに、実施例４で得た
抗リン酸化ＭＥＫ−１ペプチド抗体を加えて反応させた
後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウス
ＩｇＧ（（株）医学生物学研究所製）を反応させ、再度
洗浄し、過酸化水素とオルトフェニレンジアミンの溶液
を基質として反応させ、基質の吸光度を測定した。
酸化ＭＥＫ−１ペプチドに対する反応性を確認した。即
ち、リン酸化ＭＥＫ−１ペプチドを結合したマイクロタ
イタープレート及び非リン酸化ＭＥＫ−１ペプチド（配
列番号１で表されるＭＥＫ−１ペプチド）を結合したマ
イクロタイタープレートのそれぞれに、実施例４で得た
抗リン酸化ＭＥＫ−１ペプチド抗体を加えて反応させた
後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウス
ＩｇＧ（（株）医学生物学研究所製）を反応させ、再度
洗浄し、過酸化水素とオルトフェニレンジアミンの溶液
を基質として反応させ、基質の吸光度を測定した。
【００２４】その測定結果を図１及び図２に示す。図１
はリン酸化ＭＥＫ−１ペプチドを結合したマイクロタイ
タープレートと反応させた場合の吸光度を表すグラフで
あり、図２は非リン酸化ＭＥＫ−１ペプチドを結合した
マイクロタイタープレートと反応させた場合の吸光度を
表すグラフである。尚、図中、「精製ＩｇＧ」はモノク
ローナル抗体を表し、「１Ｅ９」はクローン１Ｅ９から
産生されるモノクローナル抗体を表し、「２Ｆ１１」は
クローン２Ｆ１１から産生されるモノクローナル抗体を
表す。
はリン酸化ＭＥＫ−１ペプチドを結合したマイクロタイ
タープレートと反応させた場合の吸光度を表すグラフで
あり、図２は非リン酸化ＭＥＫ−１ペプチドを結合した
マイクロタイタープレートと反応させた場合の吸光度を
表すグラフである。尚、図中、「精製ＩｇＧ」はモノク
ローナル抗体を表し、「１Ｅ９」はクローン１Ｅ９から
産生されるモノクローナル抗体を表し、「２Ｆ１１」は
クローン２Ｆ１１から産生されるモノクローナル抗体を
表す。
【００２５】この図１及び図２から明かなように、リン
酸化ＭＥＫ−１ペプチドを結合したマイクロタイタープ
レートでは、クローン１Ｅ９の産生した抗体、クローン
２Ｆ１１の産生した抗体のいずれも、抗体濃度の上昇に
伴って吸光度が上昇し、一方、非リン酸化ＭＥＫ−１ペ
プチドを結合したマイクロタイタープレートでは、いず
れの抗体も、抗体濃度の上昇にかかわらずほとんど吸光
度が上昇しなかった。このことから、クローン１Ｅ９及
びクローン２Ｆ１１から産生される抗体は、どちらもリ
ン酸化ＭＥＫ−１ペプチドと特異的に反応することが確
認された。
酸化ＭＥＫ−１ペプチドを結合したマイクロタイタープ
レートでは、クローン１Ｅ９の産生した抗体、クローン
２Ｆ１１の産生した抗体のいずれも、抗体濃度の上昇に
伴って吸光度が上昇し、一方、非リン酸化ＭＥＫ−１ペ
プチドを結合したマイクロタイタープレートでは、いず
れの抗体も、抗体濃度の上昇にかかわらずほとんど吸光
度が上昇しなかった。このことから、クローン１Ｅ９及
びクローン２Ｆ１１から産生される抗体は、どちらもリ
ン酸化ＭＥＫ−１ペプチドと特異的に反応することが確
認された。
【００２６】
【発明の効果】本発明によれば、プロテインキナーゼの
一種であるｒａｆ−１キナーゼのリン酸化酵素活性を測
定するための試薬として有用なモノクローナル抗体が得
られ、しかもかかるモノクローナル抗体が産生細胞によ
り大量に生産できるという効果が得られる。このｒａｆ
−１キナーゼのリン酸化酵素活性を測定することが可能
になれば、細胞内における情報伝達のメカニズム解明の
ための手段が提供されると同時に、情報伝達機構の異常
として捉えられる疾患（癌や一部の糖尿病等）の原因解
明の手段が提供される。
一種であるｒａｆ−１キナーゼのリン酸化酵素活性を測
定するための試薬として有用なモノクローナル抗体が得
られ、しかもかかるモノクローナル抗体が産生細胞によ
り大量に生産できるという効果が得られる。このｒａｆ
−１キナーゼのリン酸化酵素活性を測定することが可能
になれば、細胞内における情報伝達のメカニズム解明の
ための手段が提供されると同時に、情報伝達機構の異常
として捉えられる疾患（癌や一部の糖尿病等）の原因解
明の手段が提供される。
【００２７】
配列番号：１ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Gln Leu Ile Asp Ser Met Ala Asn Ser Phe Val Gly Thr Arg Cys 1 5 10 15
【図１】 リン酸化ＭＥＫ−１ペプチドを結合したマイ
クロタイタープレートと反応させた場合の吸光度を表す
グラフである。
クロタイタープレートと反応させた場合の吸光度を表す
グラフである。
【図２】 非リン酸化ＭＥＫ−１ペプチドを結合したマ
イクロタイタープレートと反応させた場合の吸光度を表
すグラフである。
イクロタイタープレートと反応させた場合の吸光度を表
すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】 リン酸化ＭＥＫ−１ペプチド（配列番号
１で表されるＭＥＫ−１ペプチドのアミノ酸番号６及び
１０のセリンがリン酸化されたもの）と特異的に結合す
るモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 請求項１記載のモノクローナル抗体を産
生する産生細胞。 - 【請求項３】 リン酸化ＭＥＫ−１ペプチドを免疫感作
させた哺乳動物から取得される抗体産生細胞と哺乳動物
骨髄腫系細胞との融合により得られる請求項２記載の産
生細胞。 - 【請求項４】 融合細胞クローン１Ｅ９（受託番号：Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１５５９３）又は融合細胞クローン２Ｆ１
１（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５５９４）である請求
項２記載の産生細胞。 - 【請求項５】 請求項３又は請求項４記載の産生細胞に
より産生される請求項１記載のモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16451496A JPH104962A (ja) | 1996-06-25 | 1996-06-25 | モノクローナル抗体及びその産生細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16451496A JPH104962A (ja) | 1996-06-25 | 1996-06-25 | モノクローナル抗体及びその産生細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH104962A true JPH104962A (ja) | 1998-01-13 |
Family
ID=15794617
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16451496A Pending JPH104962A (ja) | 1996-06-25 | 1996-06-25 | モノクローナル抗体及びその産生細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH104962A (ja) |
-
1996
- 1996-06-25 JP JP16451496A patent/JPH104962A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050816 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20060110 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |