JP2002528120A - 細胞透過媒介性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、物質の細胞透過を媒介しうる細胞透過ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡおよび該ポリペプチドの製造方法に関する。また、本発明は、該ポリペプチドに対する抗体、および物質の細胞透過の媒介における該ポリペプチドの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、細胞透過性であり物質の細胞透過を媒介しうるポリペプチド、その
ようなポリペプチドをコードするＤＮＡ、およびそのようなポリペプチドの製造
方法に関する。また、本発明は、該ポリペプチドに対する抗体、および物質の細
胞透過の媒介における該ポリペプチドの使用に関する。

【０００２】 細胞に浸透する物質の性質を細胞透過性という。しかしながら、この性質は、
ごくわずかの物質においてしか見られない。たいていの物質は、細胞に浸透する
ための補助的手段および／または方法を必要とする。その例はマイクロインジェ
クション、エレクトロポレーション、カチオン性脂質との会合、リポソーム形成
、レセプター媒介性エンドサイトーシスおよびウイルス感染である。しかしなが
ら、これらの補助的手段または方法には大きな欠点がある。特に、それらは、高
価で複雑な実験設備を必要とし、限られた程度までしか使用することができない
。また、その有効性の程度は低く、しばしば毒性である。

【０００３】 したがって、本発明の目的は、上記の欠点を回避する、物質が細胞に挿入され
うる産物を提供することである。

【０００４】 本発明によれば、これは特許請求の範囲に規定された主題により達成される。

【０００５】 本発明は、好ましくは図１のアミノ酸配列またはそれとは１個もしくはそれ以
上のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが細胞に浸透しうる
、すなわち、細胞透過性を有するという出願人の見識に基づく。出願人は、この
ようなポリペプチドをＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面タンパク質のＰｒｅＳ２
領域に見出した。以下、このポリペプチドをＺＰＰ、細胞透過媒介性ポリペプチ
ドと称する。ＺＰＰは両親媒性α−ヘリックス構造を有する。出願人はまた、Ｚ
ＰＰの性質の１つが物質の細胞透過を媒介することであることを検出した。物質
は、次いで細胞に浸透し得、物質の細胞透過はある特定の細胞に限定されない。
また、物質はその活性を保持する（図２参照）。図３は、図１の配列とは１個も
しくはそれ以上のアミノ酸が異なる、種々のＨＢＶサブタイプに由来する本発明
のＺＰＰのバリアントを示す。図１のアミノ酸配列（＝ＰｒｅＳ２−ＴＬＭ）は
、アミノ酸レベルで例えばサブタイプａｙｗ（１）に完全に対応するが、これと
比較すると、その他のサブタイプは１個もしくはそれ以上の置換を有する。しか
しながら、種々のＨＢＶサブタイプ間に、ある特定のアミノ酸の保存が見られる
。それは、特に疎水性値の図示表示により確認することができる。このことから
、１個もしくはそれ以上のアミノ酸が置き換わった場合でも、分子全体における
疎水性親水性指標分布は保持されるはずであるという結論を導くことができる。
この知見により、配列そのものでなく分子全体における疎水性親水性指標プロフ
ィールが決定要素であるため、当業者は容易に図１の配列のバリアントを決定す
ることが可能である。同じことが種々のトリヘパドナウイルス（図４参照）また
は齧歯類のヘパドナウイルス（図５参照）にも相応して当てはまる。それらの各
々を本発明の図１のＺＰＰ（＝ＰｒｅＳ２−ＴＬＭ）と比較し、疎水性親水性指
標プロフィールを調製する。それらは、アミノ酸をほぼ完全に置き換えても（例
えば、ＨＨＢＶ＜−−＞ＰｒｅＳ２−ＴＬＭ）、疎水性親水性指標プロフィール
は実質的に保持される。これは、配列そのものでなくα−ヘリックスモチーフ内
の親水性アミノ酸および疎水性アミノ酸の順序が決定要素であることを意味する
。１２個のアミノ酸を含有するペプチドでは、好ましくは、２、５および９位が
疎水性アミノ酸で占められ、３、４、８、１１が親水性アミノ酸で占められる。
疎水性アミノ酸には、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェ
ニルアラニンおよびメチオニンが含まれる。親水性アミノ酸には、グリシン、セ
リン、チロシン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが含
まれる。したがって、本発明のＺＰＰは下記の一般式： ＸｏｉｉｏＸＸｉｏＸｉＸ 〔式中、Ｘ＝可変性アミノ酸（親水性、疎水性または荷電性の側鎖を有する） ｏ＝疎水性アミノ酸 ｉ＝親水性アミノ酸〕 で表される。

【０００６】 荷電性の側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸（ともに負
に荷電した側鎖を有する）、リジン、アスパラギン、グルタミン、アルギニンお
よびヒスチジン（すべて正に荷電した側鎖を有する）である。

【０００７】 本発明によれば、物質の細胞透過を媒介しうるポリペプチド（ＺＰＰ）を提供
するために出願人の見識を使用する。ＺＰＰは、上記の配列、あるいは好ましく
は図１の配列またはそれとは１個もしくはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸
配列を含有し、非天然のＨＢＶ表面タンパク質であり、かつ後者のアミノ酸配列
のＤＮＡは図１のＤＮＡとハイブリダイズする。

【０００８】 「物質の細胞透過を媒介する」という用語は、ＺＰＰが、任意の種類および起
源の物質の細胞透過を媒介しうることをいう。該物質は、例えば、ポリペプチド
（タンパク質）、核酸または化学物質でありうる。ポリペプチドの例は、構造ポ
リペプチド、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイ
ン、成長因子、血漿タンパク質、例えば血液凝固因子および代謝酵素、ならびに
レセプターである。特に、ポリペプチドは、細胞の免疫原性を増大しうるもので
あってもよい。これらは、腫瘍細胞に存在しないポリペプチド、例えば、ＩＬ−
２およびＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン、Ｂ７−１などの同時刺激分子、腫瘍
関連抗原、例えばＭＡＧＥ１、チロシナーゼ、ならびにウイルス性ポリペプチド
、例えばヒト乳頭腫ウイルスのＥ７およびエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ
−Ｂａｒｒ）ウイルスのＥＢＮＡ−３ポリペプチドであってもよい。また、ポリ
ペプチドは、アダプターポリペプチド、ポリペプチドのオリゴマー化モチーフ、
ウイルスのコートポリペプチドのポリペプチド断片、ホルモンおよびリボザイム
であってもよい。核酸の例は上記のポリペプチドをコードしうるものである。ま
た、それらは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド−核酸、転写因子の
コンセンサス配列であってもよい。化学物質の例は、ポリペプチド構造を有しな
い薬物である。これらは、細胞成長抑止薬、麻酔薬、抗ヒスタミン薬、抗生物質
および抗菌薬であってもよい。細胞透過を媒介するには、化学結合、例えば共有
結合または非共有結合が形成されるようにＺＰＰを物質とともにインキュベート
するので十分でありうる。ＺＰＰをリンカーを介して物質と結合させることが好
ましく、これは、例えば、ビオチン／ストレプトアビジンを介して行われる。リ
ンカーは、ＺＰＰのＮ−末端でもＣ−末端でも利用可能でありうる。物質が、融
合ポリペプチド内でＺＰＰとともにポリペプチドとして存在することが特に有利
である。この場合、ＺＰＰは、物質のポリペプチド構造のＮ−末端またはＣ−末
端に、または構造内に存在しうる。したがって、「ＺＰＰ」という用語は、ＺＰ
Ｐが物質とともに存在する融合ポリペプチドも包含する。物質の細胞透過の媒介
は、通常の方法によって検出しうる。細胞をＺＰＰが結合した物質とともにイン
キュベートし、細胞内でのＺＰＰおよび／または物質の浸透または存在を検出す
ることが好ましい。これは、例えば、特異的抗体、またはＺＰＰおよび／または
物質と直接または関節的に反応する試薬により行いうる。

【０００９】 「１個もしくはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸配列」という用語は、非
天然のＨＢＶ表面タンパク質である任意のＺＰＰ産生アミノ酸配列を包含する。
「１個もしくはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸配列」をコードする配列は
、好ましくは図１のＤＮＡ配列とハイブリダイズする。該ＤＮＡ配列は、１また
はそれ以上の塩基対の付加、欠失、置換および／または逆位によって図１のＤＮ
Ａと異なりうる。「ハイブリダイゼーション」という用語は、通常の条件下、特
に配列の融点より２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションをいう。

【００１０】 本発明の別の主題は、ＺＰＰをコードする核酸である。該核酸は、ＲＮＡであ
ってもＤＮＡであってもよい。以下のもの： （ａ） 図１のＤＮＡまたはそれとは１もしくはそれ以上の塩基対が異なるＤ
ＮＡ、ここで後者のＤＮＡは図１のＤＮＡとハイブリダイズし、かつ天然のＨＢ
Ｖ表面タンパク質をコードしない、または （ｂ） 縮重遺伝コードにより（ａ）のＤＮＡと関連するＤＮＡ を含有するＤＮＡが好ましい。

【００１１】 「１もしくはそれ以上の塩基対が異なるＤＮＡ」という表現は、図１のＤＮＡ
とハイブリダイズし、かつ天然のＨＢＶ表面タンパク質をコードしない、ＺＰＰ
をコードする任意のＤＮＡ配列を包含する。該ＤＮＡ配列は、１またはそれ以上
の塩基対の付加、欠失、置換および／または逆位によって図１のＤＮＡと異なり
うる。「ハイブリダイゼーション」という表現については、上記の説明が相応し
て参照される。

【００１２】 本発明のＤＮＡは、そのまま存在してもよく、ベクター内に存在してもよい。
特に、本発明のＤＮＡは発現ベクターに存在してもよい。その例は、当業者に公
知である。大腸菌用の発現ベクターの場合、これらは、例えばｐＧＥＭＥＸ、ｐ
ＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴ３ｂおよびｐＱＥ−８である。酵母におけ
る発現には、例えばｐＹ１００およびＹｃｐａｄ１を挙げなければならないが、
動物細胞における発現には、例えばｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥ
Ｖ４、ｐＣＤＮＡ３、ｐＫＳＶ１０、ｐＲＣＭＶおよびｐＲＫ５を示さなければ
ならない。バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａは、昆虫細
胞における発現に特に好適である。

【００１３】 当業者は、発現ベクターに存在する本発明のＤＮＡを発現させるために好適な
細胞を知っている。かかる細胞の例には、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ１、ｘ１７
７６、ＪＭ１０１、ＪＭ １０９、ＢＬ２１、ＳＧ１３００９およびＭ１５ｐＲ
ｅｐ４、酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、動物細胞
Ｌ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、Ｈｅｐ
６２、ＣＣＬ１３および２９３、昆虫細胞Ｓｆ９およびＳｆ２１、ならびに植物
細胞ルピナス アルブル（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）が含まれる。

【００１４】 当業者は、本発明のＤＮＡを含有してなる発現ベクターにより細胞を形質転換
またはトランスフェクトし、該細胞を培養するする方法および条件について精通
している。また、当業者は、本発明のＤＮＡにより発現されたＺＰＰを単離、精
製する方法も知っている。

【００１５】 本発明の別の主題はＺＰＰに対する抗体である。このような抗体は、通常の方
法により調製しうる。それは、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗
体であってもよい。その調製のために、動物を、特に、ポリクローナル抗体には
ウサギまたはニワトリを、モノクローナル抗体にはマウスを、ＺＰＰで免疫する
ことが好ましい。また、ＺＰＰで動物のさらなる追加免疫を行ってもよい。次い
で、動物血清または卵黄からポリクローナル抗体が得られうる。モノクローナル
抗体の調製のために、動物の脾臓細胞をミエローマ細胞に融合する。

【００１６】 本発明の別の主題はキットである。かかるキットは以下の構成要素： （ａ） 本発明の細胞透過媒介性ポリペプチド（ＺＰＰ）、 （ｂ） 本発明のＤＮＡ、 （ｃ） 本発明の抗体、および （ｄ） 担体、バッファー、溶剤、対象物などの通常の補助剤 の１またはそれ以上を含む。

【００１７】 個々の構成要素の１またはそれ以上の代表物がそれぞれに示されうる。個々の
用語については、上記の説明が参照される。

【００１８】 本発明は、細胞透過が媒介されることを可能にする。本発明のＺＰＰにより、
任意の種類または起源の物質の細胞透過が媒介されうる。細胞透過は普遍的、す
なわち、ある特定の細胞に限定されない。また、細胞はエクスビボまたはインビ
ボで存在しうる。また、細胞透過はいかなる毒性効果をも引き起こさない。

【００１９】 したがって、本発明は診断および治療に完全に適する。後者は、遺伝子の発現
および代謝プロセスへの影響を包含する。特に、本発明は最も重篤な疾患、例え
ば腫瘍の診断および治療に適する。本発明は、特に、従来の治療法および遺伝子
治療法の両方に使用できるという点において、自身を差別化する。

【００２０】 本発明を以下の実施例により説明する。

【００２１】 実施例１：本発明のポリペプチド（ＺＰＰ）により媒介される細胞透過性の検出 ＺＰＰにより媒介される細胞透過性の検出を、ｃ−Ｒａｆ１キナーゼのＴＮＦ
α依存性活性化の阻害により示す。ｃ−Ｒａｆ１キナーゼの活性化は、ＴＮＦレ
セプターＩ（ＴＮＲ−ＲＩ）とアダプター分子Ｇｒｂ２との間の相互作用に基づ
く。この目的のために、Ｇｒｂ２のＳＨ３ドメインは、ＴＮＦ−ＲＩの細胞質ド
メインに由来するＰＬＡＰモチーフと相互作用する。

【００２２】 ＺＰＰは融合ポリペプチドの形態で提供される。ＺＰＰ−ＰＬＡＰ ＺＰＰと
呼ばれるこの融合ポリペプチドにおいて、図１のアミノ酸配列は、Ｎ末端パート
ナーとして存在し、ＴＮＦ−ＲＩの細胞質ドメインに由来するＰＬＡＰモチーフ
は、Ｃ末端パートナーとして存在する。変異したＰＬＡＰモチーフを有する、Ｚ
ＰＰ−ＫＬＡＰと呼ばれる融合ポリペプチドもまた提供される。

【００２３】 ＨｅＬａ細胞を、２μＭのＺＰＰ−ＰＬＡＰまたはＺＰＰ−ＫＬＡＰ（対照）
とともに２時間インキュベートし、１００μ／ｍｌのＴＮＦαで１５分間刺激す
る。ｃ−Ｒａｆ１キナーゼの活性化を、ＭＥＫ（サンタクルーズ、バイオテク（
Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ））および基質としてγ³²Ｐ−ＡＴＰを
用いて免疫複合体試験により測定する（図２を参照のこと）。

【００２４】 ＺＰＰ−ＰＬＡＰが上記細胞に到達し、Ｃ−Ｒａｆ１キナーゼの活性化を完全
に阻害することを示す（図２、レーン４および５を参照のこと）。ＺＰＰ−ＫＬ
ＡＰが阻害を達成しないこともわかる（図２、レーン６および７を参照のこと）
。

【００２５】 実施例２：本発明の細胞透過媒介性ポリペプチド（ＺＰＰ）の調製および精製 図１のＤＮＡを、５’末端にＢｇｌＩＩリンカーを伴い、３’末端にＢａｍＨ
Ｉリンカーを伴うように提供し、引き続いて対応する制限酵素で切断する。得ら
れるＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ切断発現ベクターｐＱ
ｅ８に挿入し、発現プラスミドｐＱｅ８／ＺＰＰを得る。

【００２６】 ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）をコードする１つの配列もまた
、発現プラスミドｐＧｅｘ−１から単離する。これは、その５’末端にＢａｍＨ
Ｉ制限部位、続いてトロンビン制限部位をコードする配列を有する。この配列は
、その３’末端にＢａｍＨＩ制限部位を有する。この配列を、ＢａｍＨＩ切断発
現プラスミドｐＱｅ８／ＺＰＰに挿入し、発現プラスミドｐＱｅ８／ＺＰＰ−Ｇ
ＳＴを得る。これは、融合ポリペプチドＺＰＰ−ＧＳＴをコードし、ｐＱｅ４８
／ＺＰＰ−ＧＳＴを大腸菌ＳＧ１３００９の形質転換に使用する（ゴッテスマン
（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ），Ｓ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８（１９８１
）、２６５−２７３参照）。上記細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび
２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢブロス中で培養し、６０μＭイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導する。誘導
後、沈降させ、洗浄した細菌の溶解を超音波により行う。ＺＰＰ−ＧＳＴ融合ポ
リペプチドを、グルタチオンカラム上でアフィニティークロマトグラフィーによ
り単離する。結合したＺＰＰ−ＧＳＴ融合ポリペプチドを、グルタチオン濃度の
線状漸増により０〜１０ｍＭで溶出する。溶出したＺＰＰ−ＧＳＴ融合タンパク
質をトロンビン切断に供する。このようにして放出されるｈｅｘａ−Ｈｉｓ−Ｚ
ＰＰ（融合ポリペプチド）を、続いてＮｉ−ＮＴＡアガロースにより変性条件を
用いてアフィニティークロマトグラフィーにより単離する。これは、製造業者（
キアジェン社）の説明書に従って６Ｍ尿素の存在下で行う。結合したｈｅｘａ−
Ｈｉｓ−ＺＰＰを、２５０ｍＭイミダゾールを含有する、ｐＨ６．３を有する緩
衝液中で溶出させる。ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−ＺＰＰを１８％ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に供し、クーマシーブルーを用いて染色する（トーマス（Ｔｈ
ｏｍａｓ），Ｊ．Ｏ．およびコーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ），Ｒ．Ｄ．、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４９（１９７５）、７０９〜７３３参照）。

【００２７】 本発明の（融合）ポリペプチドを高度に精製した形態で調製しうることが示さ
れる。

【００２８】 実施例３：本発明の抗体の調製および検出 本発明の実施例２の融合ポリペプチドを、１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に供する。４Ｍ酢酸ナトリウムでゲルを染色した後、約３ｋＤバンド
を、ゲルから切り出し、リン酸緩衝化通常塩溶液中でインキュベートする。ゲル
切片を沈降させた後、上清のタンパク質濃度を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動、それに続くクーマシーブルー染色により測定する。動物を、ゲル精製
した融合ポリペプチドを用いて以下のように免疫する。

【００２９】 ウサギにおけるポリクローナル抗体に関する免疫プロトコル ０．７ｍｌのＰＢＳ中３５μｇのゲル精製した融合ポリペプチドと０．７ｍｌ
の完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントとを免疫毎
に使用する： ０日目：１回目の免疫（完全フロイントアジュバント） １４日目：２回目の免疫（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ） ２８日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ） ５６日目：４回目の免疫（ｉｃＦＡ） ８０日目：放血させ屠殺。

【００３０】 ウサギ血清を、イムノブロットにおいて試験する。この目的のために、本発明
の実施例２の融合ポリペプチドを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
し、ニトロセルロースフィルターに移す（キース−アンダーセン（Ｋｈｙｓｅ−
Ａｎｄｅｒｓｅｎ），Ｊ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．
１０（１９８４）、２０３−２０９）。ウエスタンブロット分析を、ボック（Ｂ
ｏｃｋ），Ｃ．−Ｔ．ら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ８，（１９９４），２１５
−２２９に記載されるように行った。この目的のために、ニトロセルロースフィ
ルターを、一次抗体とともに３７℃で１時間インキュベートする。この抗体はウ
サギ血清である（ＰＢＳ中に１：１００００）。ＰＢＳを使用する数回の洗浄工
程の後に、ニトロセルロースフィルターを、二次抗体とともにインキュベートす
る。この抗体は、アルカリホスファターゼを結合させたモノクローナルヤギ抗ウ
サギＩｇＧ抗体（ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ）社）である（ＰＢＳ中に１：５
０００）。３７℃で３０分間のインキュベーションの後に、ＰＢＳを用いる数回
の洗浄工程を行い、それに続いて発色液（３６μＭの５’−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリルホスフェート、４００μＭのニトロブルーテトラゾリウム、１
００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭ
ｇＣｌ₂ ）を用いて室温で、バンドが見えるようになるまでアルカリホスファタ
ーゼ検出反応を行う。

【００３１】 本発明のポリクローナル抗体が調製されうることを示す。

【００３２】 ニワトリにおけるポリクローナル抗体に関する免疫プロトコル ０．８ｍｌのＰＢＳ中の４０μｇのゲル精製した融合ポリペプチドと０．８ｍ
ｌの完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントとを免疫
毎に使用する。

【００３３】 ０日目：１回目の免疫（完全フロイントアジュバント） ２８日目：２回目の免疫（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ） ５０日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ）

【００３４】 抗体を卵黄から抽出し、ウエスタンブロットで試験する。本発明のポリクロー
ナル抗体を検出する。

【００３５】 マウスにおけるモノクローナル抗体に関する免疫プロトコル ０．２５ｍｌのＰＢＳ中１２μｇのゲル精製した融合ポリペプチドと０．２５
ｍｌの完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントとを免
疫毎に使用する。上記融合タンパク質を、４回目の免疫において０．５ｍｌ（ア
ジュバントなし）に溶解させる。

【００３６】 ０日目：１回目の免疫（完全フロイントアジュバント） ２８日目：２回目の免疫（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ） ５６日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ） ８４日目：４回目の免疫（ＰＢＳ） ８７日目：融合

【００３７】 ハイブリドーマの上清を、ウエスタンブロットにおいて試験する。本発明のモ
ノクローナル抗体を検出する。

【００３８】 実施例４：ＤＨＢＶ−ＺＰＰにより媒介される細胞透過性の検出 ＤＨＢＶ（アヒルＢ型肝炎ウイルス）−ＺＰＰにより媒介される細胞透過性の
検出を以下のように行った：標準的な方法により、ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ（
６Ｈ）、ＤＨＢＶ−ＺＰＰおよびｅＧＦＰ（増強されたグリーン蛍光タンパク質
）からなる融合タンパク質を実施例１と同様に大腸菌発現系において調製した。
キアジェン社のｐＱＥベクター系を用いた。このタンパク質（ＤＨＢＶ４２−５
３ｅＧＦＰ）を単離した。ｗｔ６ＨｅＧＦＰ（６ＨｉｓおよびｅＧＦＰの融合タ
ンパク質）を対照実験に用いた。次いで、２９３細胞を、これらのタンパク質の
存在下で１０および２０分間インキュベートした。上記タンパク質を、１μＭの
濃度で培地に添加した。１０または２０分後、細胞を溶解させ、細胞のサイトゾ
ル画分を超遠心により単離した。

【００３９】 サイトゾル画分中のＤＨＢＶ４２−５３−ｅＧＦＰの存在を、ｈｅｘａ−Ｈｉ
ｓ−ｔａｇ特異的抗体（図６、レーン１〜４）（キアジェン社の抗ｈｅｘａ−ｈ
ｉｓ６）またはｅＧＦＰ特異的抗体（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社の抗
−ｅＧＦＰ）（図６、レーン５〜８）を用いてウエスタンブロットにより検出し
た。ペルオキシダーゼ結合二次抗体（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社の抗マ
ウスＨＲＰ、抗ウサギＨＲＰ）を検出に用いた。

【００４０】 ウエスタンブロットにより、ＤＨＢＶ４２−５３−ｅＧＦＰが添加された場合
、細胞（サイトゾル）へのタンパク質の内部移行が１０分後（レーン２、６）ま
たは２０分後（４、８）に観察され得、一方、細胞透過性を媒介する配列を欠失
した対照タンパク質ｗｔ６ＨｅＧＦＰの場合、それは１０分後（レーン１、５）
にも２０分後（レーン３、７）にも観察され得ないことが示される。

【００４１】 これらの結果は、ＤＨＢＶ−ＺＰＰが他のタンパク質のキャリアーとして作用
しうることを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明の細胞透過媒介性ポリペプチド（ＺＰＰ）のアミノ酸酸配列お
よびＤＮＡ配列を示す。

【図２】 図２は、ＺＰＰ媒介性細胞透過の検出を示す。レーン２および３は、ｃ−Ｒａ
ｆ１キナーゼの活性化を示す。レーン４および５は、その阻害を示す。レーン６
および７は、ＺＰＰ−ＰＬＡＰ（ＺＰＰ−ＫＬＡＰ）変異体が阻害効果を有しな
いことを示す。

【図３】 図３は、種々のＨＢＶサブタイプ間のアミノ酸配列の保存、ならびに疎水性親
水性指標プロフィールを示す。

【図４】 図４は、種々のトリヘパドナウイルスのＰｒｅＳ領域における両親媒性モチー
フを示す。

【図５】 図５は、齧歯類の種々のヘパドナウイルスのＰｒｅＳ２領域における両親媒性
モチーフを示す。

【図６】 図６は、ＤＨＢＶ４２−５３−ＥＧＦＰが細胞透過性タンパク質であることを
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/02 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 35/00 16/08 ４Ｃ０８６ Ｃ０７Ｋ 14/02 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 16/08 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｓ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ， ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヒルト，エーベルハルト ドイツ連邦共和国 ミュンヒェン デー− 81675 イズマニンガー シュトラーセ 22，インスティチュート フュール エク スペリメンテレ ヒルルギー デル テヒ ニシェン ウニベルジテート ミュンヒェ ン (72)発明者 シュミット，シュテファニー ドイツ連邦共和国 ミュンヒェン デー− 81675 イズマニンガー シュトラーセ 22，インスティチュート フュール エク スペリメンテレ ヒルルギー デル テヒ ニシェン ウニベルジテート ミュンヒェ ン Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA51 BA80 CA04 CA07 DA02 DA05 DA11 EA02 EA04 GA11 HA01 HA11 HA15 HA17 4B063 QA01 QA08 QQ08 QQ13 QQ79 QR33 QR59 QR74 QS05 QS33 QS36 QX02 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA96Y AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA18 BA23 CA53 DC50 NA14 ZB262 4C085 AA13 AA14 BB11 CC04 CC05 DD22 DD23 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA02 DA50 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記のアミノ酸配列： ＸｏｉｉｏＸＸｉｏＸｉＸ 〔式中、Ｘ＝可変性アミノ酸（親水性、疎水性または荷電性の側鎖を有する） ｏ＝疎水性アミノ酸 ｉ＝親水性アミノ酸〕 を含有してなり、非天然のＨＢＶ表面タンパク質である、細胞透過媒介性ポリペ
   プチド（ＺＰＰ）。
2. 【請求項２】 図１のアミノ酸配列またはそれとは１個もしくはそれ以上の
   アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含有し、かつ非天然のＨＢＶ表面タンパク質で
   あり、ここで後者のアミノ酸配列のＤＮＡ配列は図１のＤＮＡとハイブリダイズ
   する、請求項１記載の細胞透過媒介性ポリペプチド（ＺＰＰ）。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載のＺＰＰをコードする核酸。
4. 【請求項４】 ＤＮＡである請求項３の記載の核酸。
5. 【請求項５】 （ａ） 図１のＤＮＡまたはそれとは１もしくはそれ以上の
   塩基対が異なるＤＮＡ、ここで後者のＤＮＡは図１のＤＮＡとハイブリダイズし
   、かつ天然のＨＢＶ表面タンパク質をコードしない、または （ｂ） 縮重遺伝コードにより（ａ）のＤＮＡと関連するＤＮＡ を含有してなる、請求項４記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項３、４または５記載の核酸を含有してなる発現プラス
   ミド。
7. 【請求項７】 請求項６記載の発現プラスミドを含んでなる形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７記載の形質転換体を適切な条件下で培養する工程を
   含む、ＺＰＰの調製方法。
9. 【請求項９】 請求項１または２記載のＺＰＰに対する抗体。
10. 【請求項１０】 物質の細胞透過を媒介するための請求項１または２記載の
    ＺＰＰの使用。
11. 【請求項１１】 物質がポリペプチド、核酸および化学物質を含む、請求項
    １０記載の使用。