ES2237194T3 - Polipeptido mediador de permeabilidad celular. - Google Patents
Polipeptido mediador de permeabilidad celular.Info
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- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
Polipéptido mediador de permeabilidad celular (ZPP) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que se ha unido a una molécula a transportar a una célula a través de enlaces covalentes o no covalentes, a condición de que el ZPP no sea una proteína de superficie HBV nativa.
Description
Polipéptidos mediador de permeabilidad
celular.
La presente invención se refiere a un polipéptido
con permeabilidad celular y que puede conferir permeabilidad celular
a sustancias, y a un ADN que codifica para un polipéptido de este
tipo. La invención se refiere a la utilización asimismo de dicho
polipéptido para conferir permeabilidad celular a sustancias.
Por permeabilidad celular se denomina la
propiedad de sustancias de penetrar en células. Sin embargo, dicha
propiedad existe únicamente en unas pocas sustancias. La mayoría de
sustancias necesitan sustancias auxiliares o métodos para penetrar
en células. Entre los ejemplos de éstos se incluyen la
microinyección, electroporación, asociación con lípidos catiónicos,
formación de liposomas, endocitosis mediada por receptores y
infección por virus. Sin embargo, dichas sustancias auxiliares o
procedimientos adolecen de graves inconvenientes. En particular,
son caros, requieren disposiciones de ensayo complejos y pueden
utilizarse sólo de forma limitada. Además, su eficacia es baja y a
menudo resultan tóxicos.
Por tanto, el objetivo de la presente invención
es proporcionar un agente que permita introducir sustancias en
células, evitando los inconvenientes citados anteriormente.
Según la invención, dicho objetivo se consigue
por medio de lo previsto en las reivindicaciones.
Por el documento "HILDT E. et al.:
'Characterization of essential domains for the functionality of the
MHBs' transcriptional activator and identification of a minimal
MBHs' activator' ONCOGENE, Vol. 11, nº 10, 16 de noviembre de 1995,
páginas 2055-2066" se conoce un péptido que
presenta la secuencia de aminoácidos
"Pro-Ile-Ser-Ser-Ile-Phe-Ser-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro"
(D4; Figura 7).
La presente invención se basa en los
conocimientos del solicitante de que un polipéptido que
preferentemente comprende la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1
puede penetrar en células, es decir, presenta permeabilidad celular.
Él ha encontrado un polipéptido de este tipo en la región PreS2 de
una proteína de superficie del virus de hepatitis B (HBV). A
continuación, dicho polipéptido se denominará ZPP "polipétido
mediador de permeabilidad celular". ZPP presenta la estructura de
una \alpha-hélix anfofílica. Además, el
solicitante ha hallado que ZPP presenta la propiedad de mediar
permeabilidad celular a sustancias. Como resultado de esto, las
mismas pueden penetrar en células, estando la permeabilidad celular
de dichas sustancias no limitada a células determinadas. Dichas
sustancias también conservan sus actividades (ver la Fig. 2).
Variaciones del ZPP según la invención procedentes de diferentes
subtipos HBV que se distinguen de la secuencia de la Fig. 1 en uno o
varios aminoácidos se han representado en la Fig. 3. Por ejemplo, la
secuencia de aminoácidos de la Fig. 1 (= PreS2-TLM)
corresponde completamente al subtipo ayw (1) a nivel de aminoácidos,
mientras que los demás subtipos HBV presentan en cambio varios
intercambios. No obstante, puede apreciarse que se conservan
aminoácidos determinados entre los diferentes subtipos HBV. Una
confirmación de esto es ofrecida en particular por la representación
gráfica de los valores de hidrofobia. De esto puede concluirse que
incluso en caso de intercambiar uno o más aminoácidos debería
mantenerse la distribución de hidropatía en la molécula global. Este
hallazgo lo hace muy fácil para los expertos en la materia de
determinar variaciones de la secuencia de la Fig. 1, puesto que lo
esencial no es tanto la secuencia como tal, sino más bien el perfil
de hidropatía de la molécula global. Esto es aplicable de forma
análoga a varios hepadnavirus aviares (ver la Fig. 4) o hepadnavirus
de los roedores (ver la Fig. 5). Cada uno de los mismos se compara
con el ZPP según la invención según la Fig. 1 (=
PreS2-TLM), elaborándose perfiles de hidropatía. Por
los mismos puede apreciarse que incluso en caso de un intercambio
casi total de los aminácidos (por ejemplo HHBV <->
PreS2-TLM) se mantiene sustancialmente el perfil de
hidropatía. Esto significa que no es la secuencia en sí que es
decisiva, sino más bien la secuencia de aminoácidos hidrófilos y
hidrófobos en un motivo de \alpha-hélix.
Según la invención, se aprovechan los
conocimientos del solicitante para proporcionar un polipéptido (ZPP)
que puede mediar la permeabilidad celular a sustancias,
comprendiendo el ZPP una secuencia de aminoácidos seleccionada de
entre el grupo constituido por
y que se ha unido a una molécula a
transportar a una célula a través de enlaces covalentes o no
covalentes, a condición de que el ZPP no sea una proteína de
superficie HBV
nativa.
Además, según la invención, puede utilizarse un
polipéptido mediador de permeabilidad celular (ZPP) in vitro
para mediar permeabilidad celular a una sustancia a transportar a
una célula, siendo ZPP una secuencia de aminoácidos, seleccionada de
entre el grupo constituido por
y que se ha unido a la sustancia a
través de enlaces covalentes o no
covalentes.
La expresión "mediación de permeabilidad
celular a sustancias" indica que el ZPP puede mediar
permeabilidad celular a sustancias de cualquier tipo y procedencia.
Dichas sustancias pueden ser por ejemplo polipéptidos (proteínas),
ácidos nucleicos o compuestos químicos. Entre los ejemplos de
polipéptidos se incluyen polipéptidos estructurales, el factor
tumomecroso, interferones, interleucinas, linfoquinas, factores de
crecimiento, plasmaproteínas, por ejemeplo factores de coagulación y
enzimas del metabolismo, y receptores, y en particular los
polipéptidos pueden ser los que son capaces de aumentar la
inmunogenidad de células. Pueden ser polipétidos que son ausentes de
células de tumores, por ejemplo citoquinas, tales como
IL-2, y GM-CSF, y moléculas
co-estimulatorias, tales como B7-1,
antígenos asociados a tumores, por ejemplo MAGE1, tirosinasas y
polipéptidos virales, por ejemplo E7 del virus de papiloma humano y
el polipéptido EBNA-3 del virus de
Epstein-Barr. Además, los polipéptidos pueden ser
polipéptidos adaptadores, motivos de oligomerización de un
polipéptido, fragmentos de polipéptidos de polipéptidos de envoltura
virales, hormonas y ribozimas. Entre los ejemplos de ácidos
nucleicos se incluyen los que codifican para los polipéptidos
citados anteriormente. Además, puede tratarse de oligonucleótidos
"antisense", ácidos nucleicos de péptidos y secuencias
"consensus" para factores de transcripción. Entre los ejemplos
de compuestos químicos se incluyen medicamentos que no presentan una
estructura de polipéptido. Estos pueden ser citoéstaticos,
anestésicos, antihistamínicos, antibióticos y antimicóticos. Para la
mediación de permeabilidad celular puede ser suficiente si el ZPP se
incuba junto con una sustancia, permitiendo la formación de enlaces
químicos, por ejemplo enlaces covalentes o no covalentes. Es
favorable si el ZPP se ha unido a la sustancia a través de un enlace
("linker"), lo cual puede efectuarse por ejemplo a través de
biotina/estreptavidina. El enlace puede estar presente en el N o C
terminal del ZPP. Es particularmente ventajoso si la sustancia está
presente como polipéptido junto con ZPP en un polipéptido de fusión.
El ZPP puede estar presente en el N o C terminal o dentro de la
estructura de polipéptido de la sustancia. Por tanto, el término
"ZPP" comprende también un polipéptido de fusión en el que el
ZPP está presente junto con una sustancia. La mediación de
permeabilidad celular a sustancias puede detectarse por medio de
métodos convencionales. Resulta ventajoso incubar las células juntas
con las sustancias unidas al ZPP y detectar la penetración o la
presencia de ZPP y/o de las sustancias en las células. Esto puede
efectuarse por ejemplo por medio de anticuerpos específicos o
reactivos que reaccionan directamente o indirectamente con ZPP o con
las sustancias.
La presente invención se refiere asimismo a un
ácido nucleico que codifica para un polipéptido que representa ZPP y
que está presente como polipéptido de fusión junto con una sustancia
a transportar a una célula y comprende una secuencia de aminoácidos
que se ha seleccionado de entre las secuencias de aminoácidos
descritas anteriormente (II), (III) y (VI) a (X). El ácido nucleico
puede ser un ARN o un ADN. Se prefiere un ADN que comprende:
- (a)
- el ADN de la Fig. 1 o un ADN que se distingue del mismo en uno o varios pares de bases, estando este último hibridizado con el ADN de la Fig. 1 y no codificando para una proteína de superficie HBV nativa, o
- (b)
- un ADN relacionado con el ADN de (a) a través del código genético degenerado.
La expresión "un ADN que se distingue en uno o
varios pares de bases" comprende cualquier secuencia de ADN que
codifica para un ZPP y está hibridizada con el ADN de la Fig.1 y que
no codifica para una proteína de superficie HBV nativa. La secuencia
de ADN puede distinguirse del ADN de la Fig. 1 en uno o varios pares
de baes por medio de adiciones, deleciones, sustituciones y/o
inversiones. En cuanto a la expresión "hibridización", se hace
referencia de forma análoga a lo que se ha dicho anteriormente.
Un ADN según la invención puede estar presente
como tal o en un vector. En particular, un ADN según la invención
puede estar presente en un vector de expresión. Los ejemplos de
dichos vectores son conocidos por los expertos en la materia. En
caso de un vector de expresión para E. coli, se trata por
ejemplo de pGEMEX, derivados de pUC, pGEX-2T, pET3b
y pQE-8. Para la expresión en levadura pueden
mencionarse por ejemplo pY100 y Ycpad1, mientras que para la
expresión en células animales pueden citarse por ejemplo pKCR,
pEFBOS, cDM8, pCEV4, pCDNA3, pKSV10, pRCMV y pRK5. Para la expresión
en las células de insectos es particularmente apto el vector de
expresión del baculovirus pAcSGHisNT-A.
Los expertos en la materia conocen las células
que son aptas para exprimir el ADN según la invención presente en un
vector de expresión. Entre los ejemplos de dichas células se
incluyen las cepas de E. coli HB101, DH1, x1776, JM101,
JM109, BL21, SG 13009 y M15pRep4, la cepa de levadura
Saccharomyces cerevisiae, las células animales L, NIH 3T3,
FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa, Hep62, CCL13 y 293, las células de
insectos Sf9 y Sf21 y las células vegetales Lupinus
albus.
Los expertos en la materia conocen los métodos y
condiciones para transformar y/o transfectar células con un vector
de expresión que contiene el ADN según la invención y para cultivar
las células. Conocen también los métodos que permiten aislar y
purificar el ZPP exprimido por el ADN según la invención.
La presente invención permite mediar
permeabilidad celular. El ZPP según la invención permite mediar
permeabilidad celular a sustancias de cualquier tipo y procedencia.
La permeabilidad celular es universal, es decir, no es limitada a
células determinadas. También es posible que las células estén
presentes ex vivo. Además, la permeabilidad celular no inicia
ningún efecto tóxico.
Por tanto, la presente invención es apta de forma
óptima para la preparación de un medicamento destinado al
diagnóstico y a la terapia. Esta última comprende intervenir en la
expresión de genes y en procesos del metabolismo. La presente
invención es particularmente apta para la preparación de un
medicamento destinado al diagnóstico y a la terapia de enfermedades
muy graves, por ejemplo de tumores. La presente invención se
distingue en particular por el hecho de que los medicamentos puedan
utilizarse tanto para las medidas de tratamiento conservadoras como
para las de terapia génica.
La Fig. 1 muestra las secuencias de aminoácidos y
de ADN de un polipéptido mediador de permeabilidad celular
(ZPP).
La Fig. 2 muestra la detección de la
permeabilidad celular mediado por ZPP. Las trazas 2 y 3 muestran la
activación de c-Raf1-quinasa. Las
trazas 4 y 5 muestran su inhibición. Las trazas 6 y 7 muestran que
el ZPP-PLAP (ZPP-KLAP) mutado no
presenta un efecto inhibidor.
La Fig. 3 muestra la conservación de la secuencia
de aminácidos entre varios subtipos HBV así como el perfil de
hidropatía.
La Fig. 4 muestra motivos anfofílicos en la
región PreS de varios hepadnavirus aviares.
La Fig. 5 muestra motivos anfofílicos en la
región PreS2 de varios hepadnavirus de los roedores.
La Fig. 6 muestra que
DHBV42-53-EGFP es una proteína con
permeabilidad celular.
A continuación, la presente invención se
ilustrará haciendo referencia a los ejemplos siguientes.
La detección de la permeabilidad celular mediada
por ZPP se demuestra por medio de la inhibición de la activación
dependiente de TNF\alpha de
c-Raf1-quinasa. La activación de la
c-Raf1-quinasa se basa en la
interacción del receptor TNFI (TNF-RI) con la
molécula de adaptador Grb2. A tal fin, el dominio SH3 de Grb2
interacciona con el motivo PLAP del dominio citoplasmático de
TNF-RI.
Se prepara ZPP en forma de un polipéptido de
fusión. En dicho polipéptido de fusión denominado
ZPP-PLAP, el ZPP que presenta la secuencia de
aminoácidos de la Fig. 1 está presente como reactivo
N-terminal, y un motivo PLAP del dominio
citoplasmático de TNF-RI está presente como reactivo
C-terminal. Además, se prepara un polipéptido de
fusión denominado ZPP-KLAP en el que el motivo PLAP
está mutado.
Se incuban células HeLa durante dos horas en
ZPP-PLAP y ZPP-KLAP (control) 2
\muM y se estimulan durante 15 min. con 100 \mu/ml de
TNF\alpha. La activación de
c-Raf1-quinasa se determina por
medio de un ensayo con un complejo inmune utilizando MEK (Santa
Cruz, Biotech) y \gamma^{32}P-ATP como substrato
(ver la Fig. 2).
Resulta que ZPP-PLAP penetra en
las células e inhibe completamente la activación de
c-Raf1-quinasa (ver la Fig. 2,
trazas 4 y 5). Además, resulta que ZPP-KLAP no
consigue ninguna inhibición (ver la Fig. 2, trazas 6 y 7).
El ADN de la Fig. 1 se provee por el térmimo 5'
de un enlace BgIII y por el término 3' con un enlace BamHI y se
disocia utilizando las enzimas de restricción adecuadas. El
fragmento BgIII/BamHI obtenido se inserta en el vector de expresión
pQe8 disociado por BamHI, dando el plásmido de expresión
pQe8/ZPP.
Además, a partir del plásmido de expresión
pGex-1 se aísla una secuencia que codifica para GST
(glutationa-S-transferasa). Dicha
secuencia presenta por su término 5' un punto de corte de
restricción BamHI, seguido de una secuencia que codifica para un
punto de corte de trombina. Además, por su término 3', la secuencia
presenta un punto de corte de restricción BamHI. La secuencia se
inserta en el plásmido de expresión pQe8/ZPP disociado por BamHI,
dando el plásmido de expresión pQe8/ZPP-GST. Dicho
plásmido codifica para el polipéptido de fusión
ZPP-GST. pQe8/ZPP-GST se utiliza
para la transformación de E. coli SG 13009 (ver Gottesmann,
S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981),
265-273). Las bacterias se cultivan en un medio LB
con 100 \mug/ml de ampicilina y 25 \mug/ml de canamicina y se
inducen durante 4 h con
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) 60 \muM. Tras la inducción, se realiza la lisis por
ultrasonido de las bacterias sedimentadas y lavadas. El aislamiento
del polipéptido de fusión ZPP-GST se lleva a cabo
por medio de cromatografía de afinidad en una columna de glutationa.
El polipéptido de fusión ZPP-GST unido se eluye por
medio de un incremento lineal de la concentración de glutationa de 0
a 10 mM. La proteína de fusión ZPP-GST eluida se
somete a una escisión por trombina. El
Hexa-His-ZPP (polipéptido de fusión)
liberado se aísla a continuación por medio de cromatagrafía de
afinidad en condiciones desnaturalizantes utilizando una agarosa
Ni-NTA. Dicho proceso se realiza en presencia de
urea 6 M según las indicaciones del fabricante (Qiagen). El
Hexa-His-ZPP unido se eluye en un
tampón de un pH de 6,3 que contiene imidazola 250 mM. El
Hexa-His-ZPP se somete a una
electroforesis en gel con SDS-poliacrilamida al 18%
y se colora con azul de Coomassie (ver Thomas, J.O. y Kornberg,
R.D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
Resulta que un polipéptido (de fusión) según la
invención puede prepararse con alta pureza.
Un polipéptido de fusión según la invención del
Ejemplo 2 se somete a una electroforesis en gel con
SDS-poliacrilamida al 18%. Tras la coloración del
gel con acetato sódico 4 M, se corta del gel una banda de
aproximadamente 3 kD y se incuba en una solución de cloruro sódico
tamponado con fosfato. Las piezas de gel son sedimentadas, antes de
que se determine la concentración de proteína del sobrenadante por
medio de una electroforesis en gel con
SDS-poliacrilamida, a la que sigue una coloración
con azul de Coomassie. El polipéptido de fusión purificado por gel
se utiliza para inmunizar animales de la manera siguiente:
Por cada inmunización, se utilizan 35 \mug de
polipéptido de fusión purificado por gel en 0,7 ml de PBS y 0,7 ml
de adyuvantes de Freund completo o incompleto.
\newpage
| Día 0: | 1^{a}inmunización (adyuvantes de Freund completo) |
| Día 14: | 2^{a}inmunización (adyuvantes de Freund incompleto, IcFA) |
| Día 28: | 3^{a}inmunización (IcFA) |
| Día 56: | 4^{a}inmunización (IcFA) |
| Día 80: | Sangrado. |
El suero del conejo se ensaya por "blot"
inmune. A tal fin, un polipéptido de fusión según la invención del
Ejemplo 2 se somete a una electroforesis en gel con
SDS-poliacrilamida y se traslada a un filtro de
nitrocelulosa (ver Khyse-Andersen, J., J. Biochem.
Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). El análisis de
Transferencia Western se realizó tal como escrito en Bock, C.-T.
et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229. A tal
fin, el filtro de nitrocelulosa se incuba a 37ºC durante una hora
con un primer anticuerpo. Dicho anticuerpo es el suero del conejo
(1:10.000 en PBS). Tras varias etapas de lavado con PBS, se incuba
el filtro de nitrocelulosa con un segundo anticuerpo. Dicho
anticuerpo es un anticuerpo
cabra-anti-conejo-IgG
monoclonal acoplado a fosfatasa alcalina (Dianova) (1:5000) en PBS.
Tras una incubación de 30 minutos a 37ºC, siguen varias etapas de
lavado con PBS y a continuación la reacción de detección de
fosfatasa alcalina con una solución de revelador (fosfato de
5'-bromo-4-cloro-3-indolilo
36 \muM, azul de nitro-tetrazolio 400 \muM,
Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5
mM) a temperatura ambiente hasta que pueden verse bandas.
Resulta que es posible preparar anticuerpos
policlonales.
Por cada inmunización, se utilizaron 40 \mug de
polipéptido de fusión purificado por gel en 0,8 ml de PBS y 0,8 ml
de "Adyuvantes de Freund" completo o incompleto.
| Día 0: | 1^{a}inmunización (Adyuvantes de Freund completo) |
| Día 28: | 2^{a}inmunización (Adyuvantes de Freund incompleto; icFA) |
| Día 50: | 3^{a}inmunización (icFA). |
De la yema se extrajeron anticuerpos y se
ensayaron por Transfeencia Western. Se detectaron anticuerpos
policlonales.
Por cada inmunización, se utilizaron 12 \mug de
polipéptido de fusión purificado por gel en 0,25 ml de PBS y 0,25 ml
de "Adyuvantes de Freund" completo o incompleto; para la 4ª
inmunización, la proteína de fusión está disuelta en 0,5 ml (sin
adjuvans).
| Día 0: | 1^{a}inmunización (Adyuvantes de Freund completo) |
| Día 28: | 2^{a}inmunización (Adyuvantes de Freund incompleto, icFA) |
| Día 56: | 3^{a}inmunización (IcFA) |
| Día 84: | 4^{a}inmunización (PBS) |
| Día 87: | Fusión. |
Los sobrenadantes de hibridomas se ensayan por
Transferencia Western. Se detectan anticuerpos monoclonales.
La detección de la permeabilidad celular mediada
por DHBV (Duck Hepatitis B Virus = virus hepatitis B pato) se
realizó de la manera siguiente. Según los métodos estándares, se
preparó una proteína de fusión consistente en un
Hexa-His-Tag (6H), el
DHBV-ZPP y eGFP (enhanced green fluorescent protein)
de forma análoga al Ejemplo 1 en un sistema de expresión de E.
coli. Se aplicó el sistema de vectores pQE de la empresa Qiagen.
Dicha proteína (DHBV-42-53eGFP) se
aisló. Para los experimentos de control, se utilizó wt6HeGFP
(proteína de fusión constituida por 6 His y eGFP). A continuación,
se incubaron 293 células durante 10 y 20 min. en presencia de dichas
proteínas. Las proteínas se adicionaron al medio en una
concentración de 1 \muM. Tras 10 y 20 min. respectivamente, se
sometieron las células a una lisis, y la fracción citosólica de las
células se aisló por ultra-centrifugación.
La detección de la presencia de
DHBV42-53eGFP en la fracción de citosol se realizó
por medio del análisis de Transferencia Western, utilizando un
anticuerpo específico del
Hexa-His-Tag (Fig. 6, trazas
1-4) (anti-Hexa-His6
de la empresa Qiagen) y de un anticuerpo específico de eGFP
(anti-eGFP de la empresa Clotech) (Fig. 6, trazas
5-8) (anti-Hexa-His6
de la empresa Qiagen), respectivamente. Para la detección, se
utilizó un anticuerpo secundario conyugado con peroxidasa
(anti-ratón-HRP,
anti-conejo-HRP de la empresa
Amersham).
La Transferencia Western muestra que en caso de
adicionar DHV42-53eGFP se observa una
internalización de la proteína en la célula (citosol) tras 10 min.
(trazas 2, 6) y 20 min. (trazas 4, 8), respectivamente, mientras que
en caso de la proteína de control wt6HeGFP, en la que falta la
secuencia mediadora de permeabilidad celular, no puede observarse
dicha internalización ni tras 10 min. (trazas 1, 5) ni tras 20
minutos (trazas 3, 7).
Dichos resultados muestran que el
DHBV-ZPP es capaz de actuar como portador para otras
proteínas.
<110> Eberhard Hildt, Stephanie Schmidt
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<120> Polipéptido mediador de permeabilidad
celular
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<130> F 1704
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/DE99/03506
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<141>
1999-11-03
\vskip1.000000\baselineskip
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<160> 20
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> Paciente mujer Exp. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 36
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:
\hskip1cmpolipéptido mediador de permeabilidad celular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (36)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccc tta tcg tca atc ttc tcg agg att ggg gag cct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:
\hskip1cmpolipéptido mediador de permeabilidad celular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (36)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccc tta tcg tca atc ttc tcg agg att ggg gac cct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (36)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccc ata tcg tca atc ttc tcg agg att ggg gac cct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (36)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccc ata tcg tca atc ttc tcg agg act ggg gac cct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
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<212> PRT
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<213> Hepadnavirus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp
Pro}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1) .. (36)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipcac atc tcg tca atc tcc gcg agg act ggg gac cct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp
Pro}
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<210> 10
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ile Asp His Val Leu Asp His Val Gln Thr
Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ile Gln His Val Met Asp His Ile Asp Ser
Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
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<212> PRT
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<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Ser Pro Val Val Pro Thr Val Ser Thr
Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Ser Pro Val Val Pro Thr Val Ser Thr
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepadnavirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp
Pro}
Claims (9)
1. Polipéptido mediador de permeabilidad celular
(ZPP) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de
entre el grupo constituido por
y que se ha unido a una molécula a
transportar a una célula a través de enlaces covalentes o no
covalentes, a condición de que el ZPP no sea una proteína de
superficie HBV
nativa.
2. Secuencia de ácidos nucleicos que codifica
para un polipéptido que representa ZPP, que está presente como un
polipéptido de fusión junto con una sustancia a transportar a una
célula y comprende una secuencia de aminoácidos según la
reivindicación 1.
3. Secuencia de ácidos nucleicos según la
reivindicación 2, siendo la secuencia de ácidos nucleicos una
secuencia de ADN.
4. Secuencia de ácidos nucleicos según la
reivindicación 3, que hibridiza con la secuencia de ADN CCC ATA TCG
TCA ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT a 20ºC por debajo del punto de
fusión de la secuencia de ADN.
5. Vector de expresión, que comprende una
secuencia de ácidos nucleicos según cualquiera de la
reivindicaciones 2 a 4.
6. Célula transformada o bacteria transformada,
que contiene un vector de expresión según la reivindicación 5.
7. Utilización de un polipéptido mediador de
permeabilidad celular (ZPP) in vitro para la mediación de
permeabilidad celular a una sustancia a transportar a una célula,
comprendiendo el ZPP una secuencia de aminoácidos seleccionada de
entre el grupo constituido por
y que se ha unido a la sustancia a
través de enlaces covalentes o no
covalentes.
8. Utilización según la reivindicación 7, en la
que la sustancia se ha seleccionado de entre el grupo constituido
por polipéptidos, ácidos nucleicos y compuestos químicos.
9. Utilización según la reivindicación 7 para la
preparación de un medicamento.
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