JP2018529689A - グラム陰性菌に対する抗菌活性を示す切断または折り畳まれたヘリックスペプチドまたはペプチド類似体およびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
i)前記αヘリックス両面性ペプチドまたはペプチド類似体の疎水性アミノ酸の一部が、プロリン(P)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、そのD‐型アミノ酸、およびその誘導体から構成された群から選択される一つ以上で置換され折り畳まれたαヘリックス構造を有し、または
ii)前記αヘリックス両面性ペプチドを構成する少なくとも2個以上のアミノ酸が、i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10およびi+11(iは、整数)からなる群から選択される一つ以上の位置でジスルフィド結合、炭素‐炭素結合、マレイミド結合またはアミド結合により連結され折り畳まれたαヘリックス構造を有することを特徴とするペプチドまたはペプチド類似体を提供する。
i)宿主細胞に対する溶血活性やグラム‐陽性菌に対する活性が全くなく、且つグラム‐陰性菌に対する活性を有する。
ii)グラム‐陰性菌の外膜の表面にあるLPS層と結合することができる性質を有する。
iii)グラム‐陰性菌の外膜の表面にあるLPS層と結合することができる性質を有し、且つ外膜に入って外膜にのみ存在する。
iv)グラム‐陰性菌の外膜を貫通して入り、外膜にのみ存在する性質を有し、且つグラム‐陰性菌の外膜または内膜を崩壊する能力はない。
v)同じアミノ酸組成を有するペプチド、例えば、親水性アミノ酸および疎水性アミノ酸を含み、且つ一部のアミノ酸が、プロリン(P)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、そのD‐型アミノ酸、およびその誘導体で置換されたペプチドと比較して、本発明に係る両面性ペプチドのうち特定の位置、例えば、αヘリックス両面性ペプチドでN末端からC末端の方向に6番、7番、8番、9番、11番および12番位置から構成された群から選択される一つ以上の位置に、疎水性アミノ酸が、プロリン(P)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、そのD‐型アミノ酸、およびその誘導体で置換されたペプチドが、相対的に親水性が強い。
vi)Proによってαヘリックスが折り畳まれた構造をしており、折り畳まれた部分は疎水性を帯びている。
vii)カチオン荷電されたアミノ酸が全体的に35%(6/16)、またはそれ以上であるか、疎水性アミノ酸が全体的に35%(6/16)またはそれ以上である。
viii)宿主細胞に対する溶血活性およびグラム‐陽性菌に対する活性はない。
ix)グラム‐陰性菌に対する活性が弱く残っている(MIC=10〜20μM)。
XYZYY(1‐1)
YXYZYYX(2‐1)
YYXYZYYXY(3‐1)
YYYXYZYYXYX(4‐1)
YXZZXX(5)
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈しないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
自然には多種の抗菌ペプチド(antimicrobial peptide、AMP)がある。これらは、主に、高等動物の免疫系のうち1次的な免疫反応のために作り出すペプチドであり、その種類および形状も非常に様々である。近年、かかる抗菌ペプチドの生体内の新たな機能が判明されるに伴い、かかる抗菌ペプチドに対する関心は高まりつつある。しかし、これらの抗菌ペプチドを実際に抗菌剤として使用した例は、今までただ一件もない。これらが病源菌を殺す能力が他の低分子抗菌物質に比べて劣りすぎ、ペプチドの生産コストが低分子抗菌物質に比べて経済的でははく、抗菌ペプチドが宿主細胞である真核細胞を損傷し得るという副作用などが、AMPを薬として使用できなかった主な理由である。
(1)固体状ペプチド合成法を用いたPro突然変異LK、KLペプチドライブラリーの製造
リンクアミドレジン(0.52g/mmol)50mgを合成用プラスチックカラムに入れてDMFで10分間膨張させた後、20%ピペリジンを3mL入れてマイクロ波で脱保護反応を行った。脱保護が終了してからDMF3回、DCM5回、DMF3回洗浄し、6当量のアミノ酸とパイバブを電子計りで測量した後、DMFに溶解した。それぞれ6当量に相当するアミノ酸、パイバブ、DIPEAを合成用カラムに入れ、マイクロ波を用いてアミド結合を作製した。カップリングが終了してから、DMF3回、DCM3回、DMF3回洗浄した。1%TNBSテスト溶液と10%DIPEA溶液をそれぞれ1滴ずつレジンに滴下し、反応が完了したか否かを確認した。当該アミノ酸配列をいずれもカップリングさせた後、6当量HOBtと6当量無水酢酸を用いてペプチドのN末端をアセチル化した。レジンで合成されたペプチドは、95%v/v TFA、2.5%v/v蒸留水、2.5%v/v TIS溶液をカラムに入れて2時間800〜1000rpmで回転させることでレジンから取り除いた。15mLのFalconチューブに切断されたペプチド溶液を移した後、窒素ガスでTFAを除去した。−20℃で保管した結晶溶液(n‐ヘキサン50%v/v、ジエチルエーテル50%v/v)を15mLのFalconチューブに総体積が10mLになるように注ぎ、1分間ボルテックスして結晶を形成した。ボルテックスした後、重量を合わせた15mLのFalconチューブをもう一つ準備し、遠心分離機機械に入れた後、20分、4℃、4500rpmの条件で遠心分離した。結晶を除き結晶溶液を注ぎ出した後、ボルテックスをまた行って遠心分離機で同じ条件で遠心分離した。ペプチド結晶が形成された上澄み液を除去し残った結晶溶液は窒素ガスで除去した後、DMSOでまた結晶を溶解し、0.45μmフィルターで濾過した後、高性能液体クロマトグラフィーで分離した。高性能液体クロマトグラフィーのカラムとしてはC‐18カラムを使用しており、使用した溶媒はアセトニトリル(0.1%v/v TFA)と蒸留水(0.1%v/v TFA)である。高性能液体クロマトグラフィーで分離したペプチドは、MALDI TOFFを用いてm/z値を測定し、確認した。高性能液体クロマトグラフィーで分離したペプチドは、−80℃の冷蔵庫で2時間冷却した後、1次凍結乾燥した。1次凍結乾燥が終了して残っているTFAを除去するために、ペプチドを蒸留水に溶解した後、e‐tubeに移し、−80℃の冷蔵庫で2時間冷却して2次凍結乾燥し、ペプチド粉末を得た。
実施例1に記述したように、Pro‐突然変異を用いて折り曲げられたαヘリックスペプチドを製造すると、グラム‐陰性菌膜‐特異的なペプチドになる可能性を示した。本発明では、14個のアミノ酸から構成されたLKペプチド(アミノ酸配列、LKKLLKLLKKLLKL;配列番号5、すべてのペプチドは、N‐末端はアセチル化しており、C‐末端はアミド化している)およびKLペプチド(アミノ酸配列、KLLKLLKKLLKLLK、配列番号6)のN‐末端またはC‐末端の外に位置するすべてのLysおよびLeuをProで置換したペプチドを作製し、折り畳まれた構造を有するペプチドライブラリーを製造し、このうちいずれの突然変異が、最もグラム‐陰性菌膜特異的な性質を有するかを調査した。折り畳まれた構造は、αヘリックスを急激に減少させ、宿主細胞に対する毒性を大幅に減少させる可能性がある。また、グラム‐陰性菌膜特異性を示す可能性のため、Pro‐突然変異を位置特異的に製造した。製造されたペプチドを用いてグラム‐陰性菌であるE.coliおよびグラム‐陽性菌であるS.aureusなどに対するMICおよび宿主細胞に対する溶血現象を調べた(表1)。
先ず、三つの選択されたペプチドがグラム‐陰性菌の膜に活性を有することができるか否かを調査した。このために、三つのペプチドのN‐末端にTAMRAという蛍光標識子をつけて大腸菌に膜‐活性があるか否かを調査した。幸いなことに、2.5〜5μM程度の濃度で三つのペプチドがいずれも大腸菌の内側へ入ることが観測(図4)され、三つのペプチドがいずれも特異的にグラム‐陰性菌の膜を活性化させる可能性を確認した。
溶血現状が極小化しており、グラム‐陰性菌の膜を活性化させることができる三つのペプチドを用いた次の実験は、コリスチンとシナジー効果があるか否かを調査するものであった。コリスチンは、グラム‐陰性菌の外膜を刺激する効果があるため、ペプチドのいずれでもE.coliの外膜を刺激するコリスチンの抗菌力を向上させるものであれば、E.coli膜特異的活性を有する可能性があるという推論から始まった。すでにグラム‐陰性菌によく入る性質として選択された三つのペプチド(LK‐L8P、KL‐L6P、KL‐L9P)および特に、MIC値が良好なLK‐L11Pなどの四つのペプチドがコリスチンとシナジーがあるか否かを調査した。実験方法は、それぞれのペプチドにコリスチンを単純に混合してグラム‐陰性菌の代表格である大腸菌に処理することで、単独でペプチドやコリスチンを打った時に比べて、大腸菌を殺す能力が向上することができることを調査する実験であった。特に、コリスチンがグラム‐陰性菌を殺す能力が大幅に向上すると、これは、ペプチドがコリスチンとのシナジーが良いと(FICI<1.0)判断可能である。シナジーが良いということは、結局、二つの化合物(ここでは、コリスチンとペプチド)が互いに助け合って二つの効果が単純に合算された(FICI=1.0)場合よりもはるかに少ない濃度でも菌を殺すことができるということを意味する。
次に、選択されたKL‐L9Pペプチドがいかなるメカニズムによって膜を活性化させるかを確認した。微生物外部膜透過は、NPN処理されたE.coli蛍光強度(λex=355nm、λem=405nm)で測定した。E.coli懸濁液(8×107cells/mL)を10min、25℃、13000rpmの条件で遠心分離し、5mM HEPESバッファー(pH7.2)で懸濁した。NPNをE.coli懸濁液に追加し、NPN最終濃度は5μMであった。E.coli懸濁液の蛍光強度をFL‐55蛍光測定装置で測定した。ペプチドを5μM NPNとともにE.coli懸濁液に追加した。蛍光強度F.I=E.coli懸濁液に追加されたペプチドのF.I.‐5μM NPNを含むE.coli懸濁液のF.I.で計算される。
KL‐L9Pペプチドの存在下でグラム‐陰性菌で他の化合物の抗菌能力が向上することができるかを立証する。このために、二つの抗生剤であるリネゾリドおよびクロキサシリンを選別した。この二つの化合物は、いずれもグラム‐陽性菌にのみ使用される抗生剤であって、特に、グラム‐陰性菌の外膜を通過する能力に欠けており、グラム‐陰性菌にはほぼ薬効がないと調査された抗菌物質であることが共通している。仮に、KL‐L9Pがリネゾリドおよびクロキサシリン二つの化合物に対してE.coliに抗菌力にシナジー効果を有した場合に、希望していたグラム‐陰性菌特異的膜活性ペプチドがリネゾリドおよびクロキサシリンの化合物の細胞透過を容易にしたと予想される。
コリスチンは、既存の抗生剤または新たに抗生剤として糾明されたリポジショニング薬物と併行投与してシナジー効果を(KL‐L9Pに比べて)大きく示すことができなかったものの、本発明で発明した膜活性ペプチドと異なるMOAで膜を活性化させることができる。コリスチンは、依然として膜を緩くする黄金標準(golden standard)試薬として使用されているため、外膜特異的活性ペプチドとして使用することができる。また、コリスチンとKL‐L9Pとの間には高いシナジーがあるということをすでに本発明者らが見出したため、この二つの膜活性ペプチドが同時に存在する時に、KL‐K9Pとシナジーを示したリネゾリドおよびクルクミンなどのシナジーがどのように示されるかを確認した。このために、本発明では、膜活性ペプチドであるKL‐L9Pとコリスチンが同時に存在する時に、リポジショニング薬物のシナジー効果を調査した。三つの化合物をグラム‐陰性菌の撲滅のために混合して併行投与し、その二つは膜活性ペプチドであるKL‐L9Pとコリスチンとして入れ、他の一つは既存の抗生剤やリポジショニング薬物とした。
A)膜活性ペプチドの一般的な条件
KL‐L9Pは、他のある突然変異ペプチドに比べて大きなシナジー効果を与えており、この化合物の一般的な性質を把握する必要がある。先ず、このペプチドは、100%水の条件下にある時に備えて、膜条件で高いαヘリックス度を有する。このペプチドがProによって正確な円筒状の正確なヘリックス形状から離れているが、ヘリックス形状による親水面/疎水面の分離した形状が、膜活性を強力に与えることが確実である。PyMolプログラムによって予測してみたKL‐L9Pの構造も折り曲げられいるαヘリックスを示している。一般的に、Proが突然変異された部分がαヘリックスが折り畳まれた頂点をなすと考えられるが、PyMolによって予測された形状は、折り畳まれた部分が親水性と疎水性の境界部分であると考えられる。この部分は、詳細な形状に対する研究が行われたときに正確な形状が導き出されると考えられるが、折り畳まれた形状によってペプチドが膜にとどまる時間が増えるという事実は、様々な化学物質学的実験により知ることができる。この際、長すぎるαヘリックスを形成し得る突然変異ペプチドは、すでに第一のスクリーニングから除かれた状態である。第一のスクリーニングの条件として宿主細胞に対する溶血現象が最もないペプチドを選択したが、この際、長すぎるαヘリックスを形成し得る突然変異ペプチドはもうすべて除去されたと考えられる。
そうすると、LKまたはKLの可能なすべての突然変異のうちKL‐L9Pのみかかるグラム‐陰性菌の外膜を活性化させることができるのか。先ず、LKペプチドとKL‐ペプチドのProによる突然変異を1ヶ所から2ヶ所に増加させた。Pro‐突然変異が折り畳まれた構造を演出することができるため、一つよりは二つのProをペプチドに添加した場合にペプチドがさらに折り畳まれた形状をすることができるためであった。複数個の可能な位のうち2つの位をProで突然変異させたペプチドを作製しており、これを以下の表6に示した。
KL‐L9Pペプチドのすべてのアミノ酸をD‐アミノ酸で置換したKL‐L9P‐D型も作製し、コリスチンおよびリネゾリドとのシナジー効果を観察した。KL‐L9P‐D型ペプチドを作製した目的は、自然に存在するL‐アミノ酸からなるペプチドに比べて化学的安定性および自然酵素であるプロテアーゼに対する安定性が著しいと考えられる上に、ペプチドと膜との認識がキラルな構造に影響を受けない可能性が高く、D‐formもL‐formに劣らないシナジー効果を有することができると考えたためである。ただし、D‐formは、シナジー効果がL‐formに比べて大きくないことが分かった。コリスチンの場合、FICI=0.38、リネゾリドの場合、FICI=0.66と部分的なシナジーを示していた。これは、ペプチドの認識する箇所が膜のキラルな部分と関係がない部分もかなり多く認識するが、キラルと関係がある部分(例えば、ホスフェートのアニオンなど)も可能であるという結論を導出する。しかし、D型も全般的なシナジー効果があることから、膜に存在するキラルでない箇所の認識が主になるため、グラム‐陰性菌を退治するためのシナジー効果を奏することができるペプチドとしては遜色がない。
Proではなくても両面性ペプチドの疎水面に親水性アミノ酸を入れると、αヘリックスの全体的な両面性は壊れることがあり、折り曲げられいる形状を部分的に演出し得る。かかる両面性の崩壊とともにαヘリックスの減少による宿主細胞に対する副作用も少なくなり得るため、Proが入っているものと同じ効果を有することができる。したがって、すでにシナジー効果を有しているKL‐L9PでProの代わりに他の親水性アミノ酸を入れた(G、S、N、Q、DおよびE)突然変異ペプチドを作製し、これらのシナジー効果を観察した。
Ala‐scanning方法は、14個のペプチドのうちいかなるアミノ酸が化学的または生物学的効果を示すのに重要な位置の残基であるかを導き出せる良い手段であるため、様々なペプチドの研究に使用されている方法である。本発明でも同じ方法を使用すると、いかなるアミノ酸が膜活性を起こし、小分子と大きいシナジー効果を奏することができるかを判断することができる。したがって、本発明では、このAla‐scanningされたライブラリーをなすそれぞれのペプチドに対して、コリスチンとのシナジーを先ず確認する実験を行った。ペプチドのシナジー効果に最も大きな影響を与えるアミノ酸位置を見つけるために、KL‐L9Pとコリスチンとのシナジーを基準としてその値が最も大きく変化したペプチドを選択する。当該ペプチドのAla置換位置が膜活性に最も大きな影響を与えるアミノ酸残基位置であると言える。しかし、Ala‐scanningされたペプチドがLK‐L9PK14A以外には、2倍以上の大きい変化がなかった。LK‐L9PK14Aは、LK‐L9PよりもむしろMIC値が良好になったため、この部分のリシンが膜‐活性のために重要ではないと考えられる結果である。次に、それぞれペプチドの1/2MIC濃度でコリスチンとのシナジーを観察し、KL‐L9Pを基準としてその値が最も大きく変化したアミノ酸残基位置から、シナジーの変化が少ない位置を並べることができた(表13)。
作製された84個のペプチドのうち膜に活性を与えて化合物と抗生剤のシナジー効果を奏するペプチドは4個しかなかった。したがって、この4個のペプチドの構造的特徴を観察すると、膜活性の一般的な性質を知ることができる方法になり得る。ペプチド構造を把握するためにCDおよび分子予測プログラムを導入した。先ず、CDを見ると、KL‐L9P(70%)、KL‐L9D(50%)、LK‐L8D(50%)、LK‐L7PL8P(60%)比較的高いαヘリックスが膜条件で発見された。これとは対照的に、水条件ではαヘリックスがほとんどなかった(10%未満)。したがって、菌の外膜条件でも高いαヘリックスを有していると予想される。しかし、図15と同様、分子モデル予測プログラムによるαヘリックス形状は、完全な円筒(A)ではなく、B‐1、B‐2、B‐3の形状のように常に折り畳まれたまたは折り曲げられたαヘリックス構造をしていた。かかる事実から推測すると、αヘリックス度が高くて両面性が維持され、且つ折り畳まれた構造を有するペプチドは、膜に存在する親水性および疎水性分子との認識を極大化できると考えられる。かかる認識力の極大化は、膜を崩壊させず且つ膜を緩くし、ペプチドがないと通過することができなかった疎水性低分子が膜を貫通して菌の中に入るのに大きい役割をしていると考えられる。ペプチドがこのように折り畳まれた形状をしているとしてもどれほど折り畳まれたかについて定義することは容易でない。ペプチド形状予測プログラムを動員しても、様々な一つのペプチドで様々な形状が大きいエネルギー差を示しながら同時に存在する可能性があるためである。
そうすると、折り畳まれたαヘリックス構造のためにProの含有が必須であるか。これを調べるために、本発明者らは、ジスルフィド結合により人為的に折り畳まれた構造を有するペプチドを作製してみた。すなわち、以下の表16のようにKLペプチドと同様のアミノ酸配列を有し、αヘリックスの上と下でのiおよびi+4(またはi+3)位置にシスチンを置換してαヘリックスの上と下を結ぶか、iおよびi+8位置に炭化水素ステープルリンカー(hydrocarbon staple linker)を連結して折り畳まれた形状を誘導した。この二つのペプチドを製造した後、これとコリスチンのシナジー効果を観察した(表17)。二つのペプチドはいずれもProを含有するペプチドよりは弱いが、コリスチンと部分的なシナジー効果を有しており、ペプチド/コリスチン/リネゾリドなど三つの化合物を混合した混合物でもシナジー効果が示された(表18)。シナジー効果は、KL‐L9Pよりは少なく示されたものの、ジスルフィド結合によって折り畳まれた構造をしているペプチドで明白なシナジー効果を示したことは好ましいことである。また、コリスチンおよびリネゾリドの濃度は、KL‐L9P存在下で得られたMIC濃度と比較して、類似するか少し高い濃度であり依然として意味があり、折り畳まれたペプチド自体のMICがKL‐L9Pより相当進歩した結果を示し、ペプチドの使用濃度を低減することができる特徴がある。この折り畳まれた構造により、αヘリックス構造が宿主細胞に与える毒性を緩和できることも、このペプチドの利点と言える。両面性ペプチドがProを入れて折り畳まなくても、人為的に折り畳まれた構造にすると、グラム‐陰性菌の膜を活性化し、様々な化合物との併行投与により菌を制御することができる。
本発明者らは、LKまたはKLペプチドのように両面性が確実に100%であるモデルペプチドだけでなく、適切な水準の両面性ペプチドまたは自然に存在する各種の抗菌活性ペプチドおよび細胞透過ペプチドがかかるグラム‐陰性菌特異的膜活性ペプチドの性質を有することができるかについて研究した。その理由は、本発明者らが見出した現象は、植物で作製した有効成分であるクルクミンレスベラトロールなどが、植物に浸入したグラム‐陰性菌を殺す非常に合理的な方法であり得るためである。すなわち、クルクミンは、グラム‐陰性菌を殺す能力があるが、かかる膜活性ペプチドがない条件では非常に高い濃度を有したときに菌を殺す。しかし、発明者らが発明したものと同じKLまたはLKのような膜活性ペプチドが自然に存在すると、これを用いてクルクミンは、菌の中に入るはずであり、シナジー効果によって非常に低い濃度範囲でも菌を殺すことができるためである。
膜活性ペプチドとのシナジー効果がある低分子化合物を既存の抗生剤および薬理原子団化合物を用いて調査した。低分子化合物としては、既存にグラム‐陽性菌に使用されているリネゾリドを含む抗生剤をはじめ、抗炎症反応および解熱剤として多く使用されているNSAID系の低分子化合物、高脂血症治療剤であるスタチン系の低分子化合物、また薬効がよく知られているがまだ薬として許可を受けていないnutraceutical化合物など、各種の低分子化合物種類を網羅した。
本発明では、グラム‐陰性菌膜を特異的に活性化させるKL‐L9Pを用いてグラム‐陰性菌に効く新たな抗生剤を見出す方法およびこれを用いたグラム‐陰性菌の制御のための併行治療剤に関する。すなわち、膜活性ペプチドは、65%に達する多種の他の目的のための治療剤とシナジーがあり、これらの治療剤をグラム‐陰性菌の治療剤にリパーパシング(repurposing)することに役立つ役割を示している。これらのうち最もシナジーが大きい化合物は、NSAIDの中には(S)‐ibuprofen、スタチン系の中にはsimvastatin、天然物の中にはcurcuminが挙げられる。グラム‐陰性菌の外膜を刺激するすでに存在する薬物のうち一つがコリスチンもKL‐L9Pペプチドとシナジーがあったが、これは、両方とも外膜に触れるが若干の官能基上に差があると調査された。外膜活性を有する二つのペプチドの存在下で、リポジショニング薬物(repositioning drug)は、さらにシナジー効果が大きくなってFICI値では0.3より少ない値を有する。これは、三つの化合物(LK‐L9P、コリスチン、repositioning drug)それぞれ単独で存在する時のMICに比べて少なくとも10倍以上低い濃度でグラム‐陰性菌を殺す効果を有しているということである。これをよく用いると、三つの化合物の毒性および細胞毒性を避けて非常に軟らかで弱い濃度でもグラム‐陰性菌を殺すことができるため、今すぐ耐性を有するグラム‐陰性菌に適用することができる新たな抗菌剤になると考えられる。リポジショニング薬物のうち、リネゾリド(表19)、クロキサシリン(表20)、クルクミン(表21)、およびイブプロフェン(表22)をそれぞれKL‐L9Pとコリスチンと二重に混合した時、また三重に混合した時にE.coliを殺すMICを表に示した(表23)。
Claims (27)
- 疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸から構成されたαヘリックス両面性ペプチドが折り畳まれた構造を有するグラム陰性菌膜透過性ペプチドまたはペプチド類似体であって、
i)前記αヘリックス両面性ペプチドの疎水性アミノ酸の一部が、プロリン(P)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、そのD‐型アミノ酸、およびその誘導体から構成された群から選択される一つ以上で置換され折り畳まれたαヘリックス構造を有するか、または
ii)前記αヘリックス両面性ペプチドを構成する少なくとも2個以上のアミノ酸が、i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10およびi+11(iは、整数)からなる群から選択される一つ以上の位置でジスルフィド結合、炭素‐炭素結合、マレイミド結合またはアミド結合により連結され折り畳まれたαヘリックス構造を有することを特徴とするペプチドまたはペプチド類似体。 - 以下の特性のいずれか一つを示すことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体:
i)宿主細胞に対する溶血活性やグラム‐陽性菌に対する活性が全くなく、且つグラム‐陰性菌に対する活性を有する;
ii)グラム‐陰性菌の外膜の表面にあるLPS層と結合することができる性質を有する;
iii)グラム‐陰性菌の外膜の表面にあるLPS層と結合することができる性質を有し、且つ外膜に入って外膜にのみ存在する;
iv)グラム‐陰性菌の外膜を貫通して入り、外膜にのみ存在する性質を有し、且つグラム‐陰性菌の外膜または内膜を崩壊する能力はない;
v)同じアミノ酸組成を有するペプチドの中、相対的に親水性が強い;
vi)Proによってαヘリックスが折り畳まれた構造をしており、折り畳まれた部分は疎水性を帯びている;及び
vii)カチオン荷電されたアミノ酸が総アミノ酸の数を基準として35%以上であるか、疎水性アミノ酸が総アミノ酸の数を基準として35%以上である。 - 前記αヘリックス両面性ペプチドは12〜20個の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸からなることを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
- 前記両面性ペプチドのアルギニン、リシン、ヒスチジンからなる正電荷を帯びるアミノ酸群から選択される一つ以上を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
- 前記疎水性アミノ酸は、ロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、タイロシン、イソロイシン、そのD‐型アミノ酸およびその誘導体から構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
- 前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式(1)または(1‐1)で表される5個のアミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体:
XXZYX(1)
XYZYY(1‐1)
前記式中、Xは親水性アミノ酸、
Yは疎水性アミノ酸、
Zは折り畳まれたまたは切断された構造のために置換されたアミノ酸であり、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、またはその誘導体である。 - 前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式(2)、または(2‐1)で表される7個のアミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体:
YXXZYXY(2)
YXYZYYX(2‐1)
前記式中、X、YおよびZは、請求項5に記載の定義と同様である。 - 前記両面性ペプチドは、以下の式(3)または(3‐1)で表される9個のアミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体:
YYXXZYXYY(3)
YYXYZYYXY(3‐1)
前記式中、X、YおよびZは、請求項5に記載の定義と同様である。 - 前記両面性ペプチドは、以下の式(4)または(4‐1)で表される11個のアミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体:。
XYYXXZYXYYX(4)
YYYXYZYYXYX(4‐1)
前記式中、X、YおよびZは、請求項5に記載の定義と同様である。 - 前記両面性ペプチドは、以下の式(5)で表される6個のアミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体:
YXZZXX(5)
前記式中、X、YおよびZは、請求項5に記載の定義と同様である。 - 前記両面性ペプチドは、以下の式(6)で表される8個のアミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体:
YYXZZXXY(6)
前記式中、X、YおよびZは、請求項5に記載の定義と同様である。 - 前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式(7)で表される10個のアミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体:
XYYXZZXXYY(7)
前記式中、X、YおよびZは、請求項5に記載の定義と同様である。 - 前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式(8)で表される12個のアミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体:
XXYYXZZXXYYX(8)
前記式中、X、YおよびZは、請求項5に記載の定義と同様である。 - 前記αヘリックス両面性ペプチドは、正電荷を帯びるアルギニン、ロイシンおよびヒスチジンからなる群から選択される一つ以上の残基をペプチドを構成する総アミノ酸の35%以上含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
- 前記αヘリックス両面性ペプチドは、ロイシン、トリプトファン、バリン、フェニルアラニン、タイロシン、およびイソロイシンから構成された群から選択される一つ以上の疎水性アミノ酸残基をペプチドを構成する総アミノ酸の35% 以上含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
- 前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の配列番号1または2で表される配列、その逆配列またはこれを含む繰り返し配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体:
KLLKL(配列番号1)
LKKLL(配列番号2)。 - 前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の配列番号3または4で表される配列 、その逆配列またはこれを含む繰り返し配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体:
LKKLLKL(配列番号3)
KLLKLLK(配列番号4)。 - 前記αヘリックス両面性ペプチドのN末端からC末端の方向に6番、7番、8番、9番、11番および12番位置から構成された群から選択される一つ以上の位置に存在するアミノ酸が置換されることを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
- 前記αヘリックス両面性ペプチドからプロリン、アスパラギン酸またはその誘導体で置換されることを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
- 前記αヘリックス両面性ペプチドは、LKKLLKLLKKLLKL(配列番号5)またはKLLKLLKKLLKLLK(配列番号6)であることを特徴とするペプチドでり、配列番号5の7、8番ロイシン位置、または配列番号6の9番位置に折り畳まれた構造のために置換されたアミノ酸をを含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
- 請求項1〜20の中いずれか一項によるペプチドまたはペプチド類似体を含む併用投与用抗菌組成物。
- 前記ペプチドはlopP(partition coefficient)値が0.19以上の疎水性化合物、生理的pH条件でカチオンに荷電された化合物およびコリスチンから構成された群から選択される一つ以上と、併用投与することを特徴とする請求項21に記載の組成物。
- 請求項1〜20の中いずれか一項によるペプチドまたはペプチド類似体及び前記ペプチドまたはペプチド類似体に薬物が連結された接合体。
- 前記薬物はlopP(partition coefficient)値が0.19以上の疎水性化合物、生理的pH条件でカチオンに荷電された化合物およびコリスチンから構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項23に記載の接合体。
- 前記ペプチドまたはペプチド類似体と薬物は共有結合により連結されることを特徴とする請求項23に記載の接合体。
- 請求項21に記載の組成物を含む抗生剤。
- 請求項23に記載の接合体を含む抗生剤。
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