ES2931001A1 - Peptidos con actividad antimicrobiana y sus usos - Google Patents

Abstract

Péptidos con actividad antimicrobiana y sus usos. La presente invención se refiere a péptidos, tanto aislados como formando parte de otras secuencias polipeptídicas y de estructuras supramoleculares, y a los usos de los mismos como agentes antimicrobianos, tanto como medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades e infecciones provocadas por bacterias, tanto grampositivas como gram-negativas, virus, levaduras u hongos en un sujeto, como para la desinfección ex vivo de cualquier tipo de superficie inerte. La invención también se refiere a composiciones y medicamentos que comprenden dichos péptidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos con actividad antimicrobiana y sus usos

La presente invención se refiere a péptidos antimicrobianos (PAMs), tanto aislados como formando parte de otras secuencias polipeptídicas y de estructuras supramoleculares, y a sus usos para el tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por bacterias, virus, levaduras u hongos en seres vivos, así como para la desinfección ex vivo de cualquier tipo de superficie. Por tanto, la invención se encuadra dentro del campo de la medicina y la microbiología.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La imparable aparición de bacterias resistentes a los antibióticos convencionales supone una grave amenaza para la salud pública, y actualmente se presenta como un problema clínico que requiere de aproximaciones conjuntas para lograr un beneficio global. Sólo en Estados Unidos, cada año se diagnostican más de 2,8 millones de infecciones que no responden a los antibióticos convencionales, y de ellos se derivan más de 35.000 muertes (Centers for Disease Control and Prevention Antibiotic resistance threats in the United States; U.S. Department of Health, 2019). Algunas estimaciones apuntan a que, a medio plazo, se podría alcanzar a nivel global una era post-antibiótica, en la que la mortalidad achacable a enfermedades infecciosas superará a las producidas por cáncer. En este contexto, tanto la Organización Mundial de la Salud como los Centros de Control de Enfermedades de Estados Unidos destacan la imperiosa necesidad de la investigación y desarrollo de nuevos antimicrobianos.

Entre las terapias antimicrobianas no tradicionales que actualmente se investigan se encuentran los péptidos antimicrobianos (PAMs) (Datta, S.; Roy, 2021, Int. J. Pept. Res. Ther., 27, 555-577). Se trata de péptidos de origen natural, presentes en prácticamente todas las formas de vida, y que forman parte de las defensas del huésped ya que presentan propiedades antimicrobianas y participan en la defensa inmune innata. Los PAMs representan un grupo amplio y diverso y son capaces de matar o disminuir el crecimiento de microorganismos invasivos, así como de potenciar los mecanismos de la inmunidad innata y adquirida.

Los PAMs pueden producir la muerte celular mediante la modulación del sistema inmune o bien de manera directa, mediante mecanismos disruptivos o no disruptivos de la membrana plasmática (Raheem, N.; Straus, S.K., 2019, Front. Microbiol., 10, 2866). La actividad antimicrobiana de estos péptidos puede deberse por tanto a dos mecanismos de acción diferentes: a) mecanismo disruptivo de membrana, por el cual el péptido interactúa y se inserta en dicha membrana formando poros, según los modelos de "barril-bastón”, "alfombra”, "poros toroidales”, "electroporación molecular” o "balsa de hundimiento”, y b) mecanismo no disruptivo de membrana, por el cual el péptido interactúa con dianas intracelulares como el DNA, RNA y proteínas.

En los últimos tiempos los PAMs se presentan como candidatos prometedores para combatir a los microorganismos resistentes a múltiples fármacos, debido a su rápida acción y amplio espectro de actividad (Di Somma, A.; et al., 2020, Biomolecules, 10, 652). Los PAMs pueden presentarse en un amplio abanico de pesos moleculares, conformación de estructura, sitio de acción y mecanismo biológico. Sin embargo, a pesar de ser buenos candidatos terapéuticos, a día de hoy solo unos pocos PAMs están aprobados para su uso clínico, siendo las polimixinas los mejor caracterizados (Zavascki, A., Goldani, L., Li, J. and Nation, R., 2007, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 60(6), pp.1206-1215).

La terapia peptídica, en comparación con los fármacos de pequeño tamaño, presenta ventajas desde la perspectiva de la seguridad, ya que sus productos de degradación son aminoácidos naturales y, además, debido a su corta vida media, no tienden a acumularse en los tejidos. Además, los péptidos terapéuticos, incluso los sintéticos, son generalmente menos inmunogénicos que las proteínas y los anticuerpos recombinantes. Actualmente, un buen número de PAMs se encuentra en las últimas fases de desarrollo clínico (Nuti, R.; et al, 2017, Curr. Med. Chem., 24, 4303-4314).

Una interesante clase de PAMs la constituyen aquellos péptidos formados por una cadena de aminoácidos en estructura de a-hélice anfipática, tales como cecropina y magaína. Este tipo de estructuras poseen en general afinidad por membranas biológicas (Gagnon, M.C.; et al., 2017, Biochemistry, 56, 1680-1695). La patente US5847047, por ejemplo, describe el diseño de péptidos sintéticos consistentes en una héptada repetida de leucinas y lisinas diseñadas para adoptar una estructura de este tipo, y presentan una actividad antimicrobiana frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus en concentraciones del orden de 8-63 ^g/mL.

Por lo tanto, existe la necesidad de encontrar secuencias peptídicas o PAMs alternativos a los existentes cuyo mecanismo de acción permita reducir la viabilidad de los microorganismos patogénicos que producen infecciones en seres vivos, para poder desarrollar así nuevos y eficaces tratamientos antimicrobianos, preferiblemente antibacterianos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han diseñado dos péptidos antimicrobianos (PAMs) que, en presencia de membranas biológicas, se estructuran en conformación de hélice-a anfipática, y presentan actividad antimicrobiana. Así, la presente invención se refiere a los péptidos según se describen en las reivindicaciones y a los usos de los mismos como agentes antimicrobianos, en general, es decir, tanto como medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades e infecciones provocadas por bacterias, tanto grampositivas como gram-negativas, virus, levaduras u hongos en un sujeto, como para la desinfección ex vivo de cualquier tipo de superficie, material, etc.

Se describe por tanto en la presente invención, la secuencia aminoacídica de dos péptidos, el primero llamado Bio2-3A de SEQ ID NO: 1 (YSKIAQDAAKLFDSLVK) y el segundo llamado 2X-Bio2-3A de SEQ ID NO: 2 (YSKIAQDAAKLFDSLVKSYSKIAQDAAKLFDSLVK), donde el segundo es la duplicación en secuencia del primero, pero con un aminoácido intermedio adicional (S).

El mecanismo de acción de estos péptidos es la permeabilización de la membrana de los microorganismos, reduciendo así su viabilidad. Preferiblemente, los péptidos de la invención presentan actividad antibacteriana, más preferiblemente frente a bacterias gram-positivas, aún más preferiblemente pertenecientes al género Streptococcus, y aún más preferiblemente pertenecientes a la especie Streptococcus pneumoniae (neumococo).

Los péptidos de la invención han demostrado tener un importante efecto antimicrobiano, lo que les convierte en buenos candidatos a PAMs preferiblemente frente a bacterias y más particularmente frente a neumococo.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un péptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 1 (Bio2-3A), de ahora en adelante "el péptido de la invención”.

El péptido de la invención puede comprender una o más repeticiones de la SEQ ID NO: 1 en su secuencia, donde dichas repeticiones se encuentran separadas o no por aminoácidos adicionales.

En una realización preferida, el péptido de la invención comprende la SEQ ID NO: 2 (2X-Bio2-3A).

Además, el péptido de la invención puede estar fusionado a otras proteínas o péptidos con efecto antimicrobiano, ya sea en su extremo N- o C-terminal, o en el interior de la secuencia del péptido de la invención.

En una realización más preferida, el péptido de la invención consiste en la SEQ ID NO: 1 o en la SEQ ID NO: 2, preferiblemente en la SEQ ID NO: 2.

El péptido de la presente invención puede ser sintetizado, por ejemplo, aunque sin limitarnos, in vitro. Por ejemplo, mediante la síntesis de péptidos en fase sólida o mediante aproximaciones de ADN recombinante. El péptido de la invención puede producirse recombinantemente, no sólo directamente sino también como un polipéptido de fusión junto con un péptido heterólogo, el cual puede contener, por ejemplo, aunque sin limitarnos, una secuencia señal u otro péptido que tenga un sitio de corte por una proteasa, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el extremo N-terminal de la proteína madura o del péptido.

Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido que codifica para el péptido de la invención, de ahora en adelante “polinucleótido de la invención”.

Los términos “secuencia nucleotídica”, “secuencia de nucleótidos”, “ácido nucleico”, “oligonucleótido” y “polinucleótido” se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados. Se refieren, por tanto, a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra. El polinucleótido de la invención puede obtenerse de manera artificial mediante métodos de clonación y selección convencionales, o mediante secuenciación. El polinucleótido, adicionalmente a la secuencia codificante, puede llevar otros elementos, como por ejemplo, aunque sin limitarse, intrones, secuencias no codificantes en los extremos 5’ o 3’, sitios de unión a ribosomas, o secuencias estabilizadoras. Estos polinucleótidos adicionalmente también pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que puedan ser útiles, por ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del péptido generado a partir de él o permitir una mejor purificación del mismo.

Otro aspecto de la invención se refiere a una construcción genética que comprende el polinucleótido de la invención, de ahora en adelante “construcción genética de la invención” . Dicha construcción puede comprender además todos los elementos necesarios para la expresión del polinucleótido de la invención en una célula hospedadora eucariota o procariota, tales como promotores, "potenciadores", terminadores, etc.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que comprende la construcción genética de la invención, de ahora en adelante “célula de la invención”. Esta célula expresa, preferiblemente de manera recombinante, el péptido de la invención. Más preferiblemente, esta célula de la invención es empleada en un biorreactor para la producción, en laboratorio o a gran escala, del péptido de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende el péptido de la invención, preferiblemente el péptido que consiste en la SEQ ID NO: 2, de ahora en adelante “composición de la invención”.

En otra realización preferida, la composición de la invención es una composición farmacéutica o veterinaria.

En una realización más preferida, la composición de la invención además comprende otro principio activo.

Como se emplea aquí, el término “principio activo”, “sustancia activa”, “sustancia farmacéuticamente activa”, “ingrediente activo” ó “ingrediente farmacéuticamente activo” significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica en la cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad o infección, preferiblemente bacteriana, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. Preferiblemente, el otro principio activo al que se refiere la invención es un agente antimicrobiano, preferiblemente antibacteriano, incluyendo, pero sin limitarnos, antibióticos o antifúngicos.

Se entiende por "agente antimicrobiano” cualquier compuesto químico (sintético o natural), péptido, polipéptido o ácido nucleico (naturales, recombinantes o sintéticos), que presenta y ejerce una actividad antibacteriana, antifúngica, antivírica y/o frente a levaduras. El agente antimicrobiano como principio activo adicional presente en la composición de la invención, es uno que no ejerce un efecto negativo sobre el péptido de la invención y sobre la actividad del mismo, es decir, dicho agente antimicrobiano es compatible con la actividad del péptido de la invención e incluso podría potenciar el efecto antimicrobiano de dicho péptido, o, viceversa, el péptido de la invención podría potenciar el efecto antimicrobiano del principio activo adicional presente en la composición de la invención, por ejemplo aumentando la accesibilidad de éste último gracias al poder permeabilizante de la membrana celular ejercido por el péptido de la invención.

La composición de la invención puede comprender, además, y como se ha indicado anteriormente, el péptido de la invención donde éste se encuentra fusionado a otra/s proteína/s o péptido/s con efecto antimicrobiano, ya sea en su extremo N- o C-terminal, o en el interior de la secuencia, con el objeto de que el péptido de invención favorezca el acceso de la otra proteína antimicrobiana a su diana bacteriana mediante la permeabilización de la membrana celular. Por ello, en otra realización preferida de la composición de la invención, el agente antimicrobiano es una proteína antimicrobiana que se encuentra fusionada al péptido de la invención formando una única cadena polipeptídica.

La composición de la invención puede comprender además otros elementos que ayuden a preservar la estructura y función del péptido de la invención comprendido en ella, como por ejemplo agentes para protegerlo de la degradación por proteasas o excipientes que mejoren su solubilidad.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso no terapéutico del péptido de la invención o de la composición de la invención como agente desinfectante, preferiblemente para la desinfección de superficies inertes, es decir, ex vivo.

Se entiende por superficies "ex vivo” cualquier superficie inerte que se encuentra fuera del cuerpo humano o animal.

Ejemplos de “superficie” son, pero sin limitarnos, cualquier soporte, incluyendo materiales y superficies industriales, domésticas, clínicas o de laboratorio, dispositivos médicos y veterinarios, implantes, catéteres y tubos endotraqueales, herramientas, lentes de contacto, alimentos, tubos de ventilación, ventiladores, etc.

Otro aspecto de la invención se refiere al péptido de la invención o a la composición de la invención, para su uso como medicamento, preferiblemente como medicamento para el tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por microorganismos seleccionados de la lista que consiste en: bacterias, hongos, levaduras y/o virus, más preferiblemente bacterias.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las bacterias son grampositivas, más preferiblemente las bacterias gram-positivas pertenecen al género Streptococcus, aún más preferiblemente las bacterias pertenecen a la especie S. pneumoniae (neumococo).

Preferiblemente, el patógeno S. pneumoniae al que se refiere la presente invención es resistente a los antibióticos convencionales.

En una realización particular, el medicamento al que se refiere la presente invención es para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad seleccionada de la lista que consiste en: meningitis, otitis media, sinusitis, septicemia o neumonía. Todas estas enfermedades son provocadas por la infección del patógeno S. pneumoniae.

Alternativamente, el medicamento de la invención es para el tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por bacterias pertenecientes a la especie S. pneumoniae y donde dichas infecciones han causado una enfermedad seleccionada de la lista que consiste en: meningitis, otitis media, sinusitis, septicemia o neumonía.

El término “medicamento”, tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, alivio, tratamiento o curación de infecciones o enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención se refiere a una composición que comprende el péptido o la composición de la invención.

El medicamento de la invención comprende el péptido o la composición de la invención en una cantidad terapéuticamente efectiva, que es capaz de reducir la viabilidad de los microorganismos inductores de la infección en el organismo al que le es administrado. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de péptido de la invención que produzca el efecto deseado y la dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva dependerá de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia del individuo al que le va a ser administrado el medicamento de la invención.

Los medicamentos de la invención pueden utilizarse tanto solos como en combinación con otros medicamentos o composiciones para el tratamiento o prevención de infecciones provocadas por bacterias, hongos, levaduras o virus. Las composiciones de la presente invención pueden ser empleadas junto a otros principios activos o terapias a modo de terapia combinada. Los otros principios activos pueden formar parte de la misma composición o bien pueden ser proporcionados mediante una composición distinta, siendo administrados al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

El término “prevención”, tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de daños cuya causa sean las infecciones provocadas por bacterias, hongos, levaduras o virus. El término “tratamiento” supone combatir los efectos causados como consecuencia de las infecciones provocadas por bacterias, hongos, levaduras o virus, para estabilizar el estado de los individuos o prevenir daños posteriores.

El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El “medicamento de uso humano” es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica.

El "medicamento de uso veterinario” es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica. Preferiblemente, el medicamento de la invención está destinado a su uso en mamíferos, más preferiblemente en humanos.

El medicamento de la invención puede comprender otros elementos, tales como excipientes, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

El término "excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza y/o solubiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, como por ejemplo, es el caso del fosfato de calcio dibásico, la función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El "vehículo”, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los componentes de la presente invención comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los elementos de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente. Los vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua, disolventes, aceites o surfactantes, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como por ejemplo, y sin sentido limitativo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, aceites de ricino, polisorbatos, ésteres de sorbitano, éter sulfatos, sulfatos, betaínas, glucósidos, maltósidos, alcoholes grasos, nonoxinoles, poloxámeros, polioxietilenos, polietilenglicoles, dextrosa, glicerol, digitonina y similares.

Las composiciones de la invención se pueden administrar junto con un vehículo de liberación sostenida. El término "liberación sostenida" se utiliza en sentido convencional refiriéndose a un sistema de vehiculización de un compuesto que proporciona la liberación gradual de dicho compuesto durante un período de tiempo y preferiblemente, aunque no necesariamente, con niveles de liberación del compuesto relativamente constantes a lo largo de un período de tiempo. Ejemplos ilustrativos de vehículos o sistemas de liberación sostenida incluyen, aunque no se limitan a, liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, ciclodextrinas, vesículas, micelas, micelas mixtas de tensioactivos, micelas mixtas de fosfolípidos tensioactivos, miliesferas, microesferas, nanoesferas, lipoesferas, hidrogeles, aerogeles, microemulsiones, nanoemulsiones, minipartículas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas, nanopartículas sólidas lipídicas y soportes lipídicos nanoestructurados.

Las composiciones de la invención se pueden presentar en forma de una formulación seleccionada del grupo formado por cremas, emulsiones múltiples, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, bálsamos, espumas, lociones, geles, geles crema, soluciones hidroalcohólicas, soluciones hidroglicólicas, hidrogeles, linimentos, sueros, jabones, champús, acondicionadores, serums, ungüentos, mousses, pomadas, polvos, barras, lápices, vaporizadores, aerosoles, cápsulas, cápsulas de gelatina, cápsulas blandas, cápsulas duras, comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar, formas granuladas, gomas de mascar, soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, films de polisacáridos, jaleas y gelatina.

Tales composiciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracardíaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos o vía rectal, mediante la administración de un supositorio, percutánea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Como ejemplos de preparaciones farmacéuticas se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, tópica, nasal, pulmonar, intravenosa o parenteral, preferiblemente administración oral, pulmonar, intravenosa, parenteral o combinaciones de las mismas. Las composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos de la presente invención también pueden ser formuladas en forma de liposomas o nanosferas, de formulaciones de liberación sostenida o de cualquier otro sistema convencional de liberación.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la desinfección de superficies inertes (ex vivo) que comprende poner en contacto el péptido de la invención o la composición de la invención con la superficie a desinfectar.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por microorganismos seleccionados de la lista que consiste en: bacterias, hongos, levaduras y/o virus, preferiblemente bacterias, en sujeto, que comprende administrar el péptido de la invención o la composición de la invención, en una cantidad terapéuticamente efectiva, a un sujeto que lo necesita. Preferiblemente, donde las bacterias son gram-positivas, más preferiblemente pertenecientes al género Streptococcus, aún más preferiblemente pertenecientes a la especie S. pneumoniae.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Muestra el resultado del programa HeliQuest de los péptidos Bio2-3A (A) y 2X-Bio2-3A (B). Se observa la tendencia de los péptidos a formar una hélice a anfipática. La flecha indica el momento hidrofóbico estimado.

Fig. 2. Muestra el espectro de dicroísmo circular de los péptidos Bio2-3A y 2X-Bio2-3A a 25 ^M en tampón glicina 20 mM pH 3.0 en ausencia o en presencia de 10 mM de DPC. Se representa la elipticidad molar de residuos frente a la longitud de onda. Se observa un cambio de conformación desde una estructura al azar a una hélice a, más pronunciada en el caso de péptido 2X-Bio2-3A.

Fig. 3. Muestra el espectro de CD de los péptidos Bio2-3A (A) y 2X-Bio-3A (B) en presencia de concentraciones crecientes de DPC en tampón glicina 20 mM pH 3.0. Se observa un cambio desde una conformación desplegada, con un pico centrado en 200 nm, a una conformación en hélice a en presencia de DPC, con picos característicos a 208 y 222 nm y un punto isodicroico en cada caso, que sugiere una transición entre dos estados sin especies intermedias.

Fig. 4. Muestra la titulación seguida por CD del péptido Bio2-3A y del péptido 2X-Bio2-3A en presencia de concentraciones crecientes de DPC en tampón glicina 20 mM pH 3.0. Se observa el cambio de conformación a concentraciones por encima de la cmc (1,25 mM) en el caso del péptido Bio2-3A mientras que en el caso de 2X-Bio2-3A ocurre a concentraciones inferiores.

Fig. 5. Muestra las curvas de crecimiento de un cultivo líquido de S. pneumoniae R6CIB17 en presencia y ausencia (el mismo volumen de tampón glicina 20 mM pH 3.0, pero sin péptido) del péptido Bio2-3A (A) y del péptido 2X-Bio2-3A (B). Cada punto representa la media de los duplicados.

Fig. 6. Muestra la viabilidad celular de S. pneumoniae en presencia y ausencia de los péptidos Bio2-3A y 2X-Bio-3A a los 210 min de la curva de crecimiento. Como control, se muestra la viabilidad celular en presencia del tampón en el que se encuentra el péptido (el mismo volumen de tampón glicina 20 mM pH 3.0, pero sin péptido). Se muestra la media de los triplicados del logaritmo del número de unidades formadoras de colonia por mililitro de cultivo.

Fig. 7. Muestra la permeabilidad de la membrana frente a la sonda Sytox-Green de un cultivo de S. pneumoniae R6CIB17 tras la adición del péptido 2X-Bio-3A. La muestra con Tritón X-100 (un detergente) sirve como control de máxima permeabilidad.

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de los péptidos de la invención.

Ejemplo 1: Diseño y estudio biofísico de los péptidos Bio2-3A y 2X-Bio2-3A.

El péptido Bio2-3A (SEQ ID NO: 1) se diseñó de forma teórica de tal manera que presenta una propensión a formar una estructura de hélice a anfipática, determinado según el programa HeliQuest (Gautier, R.; et al., 2008, Bioinformatics, 24, 2101-2102) (Fig.lA):

Bio2-3A: YSKIAQDAAKLFDSLVK (SEQ ID NO: 1)

El péptido 2X-Bio2-3A es una duplicación del Bio2-3A, con una serina intermedia y presenta también predisposición a formar estructura de hélice a anfipática (Fig.1B):

2X-Bio2-3A: YSKIAQDAAKLFDSLVKSYSKIAQDAAKLFDSLVK (SEQ ID NO: 2)

Ambos péptidos se resuspendieron en tampón glicina 20 mM pH 3.0, y su concentración se determinó espectroscópicamente, utilizando el coeficiente de extinción molar (£²⁸⁰) calculado con la utilidad ProtParam (ExPASy - ProtParam tool): 1490 M-1cm-1, en el caso de Bio2-3A y 2980 M-1cm-1 en el caso de 2X-Bio2-3A.

Con objeto de comprobar si ambos péptidos se encuentran plegados en solución, se realizó un espectro de dicroismo circular de ambas muestras. Las mediciones se llevaron a cabo en tampón glicina 20 mM pH 3,0, a 25 °C y empleando una cubeta de paso óptico de 0,1 cm. Los espectros de absorción se adquirieron a una velocidad de 50 nm min-1, con un tiempo de respuesta de 4 s y con una acumulación de 4 espectros. Los datos obtenidos fueron procesados inicialmente con el programa Jasco Spectra Analysis, y posteriormente con el programa SigmaPlot para expresar los resultados en elipticidad molar ([0]), en unidades de grad cm2 (dmol de residuos)-1, de acuerdo a la siguiente ecuación (Ecuación 1):

[9]Á = 9Á/ ( [ M ] - n - d - 10 ) (1)

Ecuación 1. 0^a representa la elipticidad a una longitud de onda determinada, [M] la concentración molar de proteína o péptido, n el número de aminoácidos menos uno, y d el paso óptico en centímetros.

El espectro de dicroismo circular muestra que ambos péptidos (Fig. 2, líneas continuas) presentan en tampón glicina 20 mM pH 3.0 un pico máximo en torno a 200 nm, indicativo de que se encuentran en conformación mayoritariamente desordenada.

Con objeto de comprobar si la presencia de micelas o semi-micelas, que mimeticen la estructura de una membrana biológica, posibilitaría la estructuración del péptido en conformación de hélice a, se analizó el espectro en presencia de dodecilfosfocolina (DPC), un detergente formador de micelas que ha demostrado ser efectivo en el caso de otros péptidos no relacionados (Zamora-Carreras, H.; et al., 2015, Chem. - A Eur. J., 21, 8076-8089). La Fig.2 (líneas discontinuas) muestra que a 10 mM de DPC, concentración muy por encima de la concentración micelar crítica (CMC) en estas condiciones (1,25 mM en 20 mM glicina, pH 3.0), aparecen los picos característicos de una estructura en hélice a (208 nm y 222 nm), lo que indica que ambos péptidos sufren un cambio conformacional de estructura al azar a hélice a, mucho más pronunciada en el caso del péptido 2X-Bio2-3A.

A continuación, se llevó a cabo una titulación a concentraciones crecientes de DPC (0­ 10 mM), como muestras independientes y a concentración fija de péptido de 25 ^j M. La Fig. 3 muestra que el péptido Bio2-3A adquiere la estructura de hélice-a a partir de 1,25 mM de DPC (Fig. 4), concentración que coincide con la CMC del detergente, mientras que el péptido de mayor tamaño (2X-Bio-3A) interacciona incluso antes de formarse las micelas, lo que indica que el péptido tiene una mayor propensión a formar hélice a y sugiere que acumula semimicelas de detergente en su superficie. Estos resultados sugieren que estos péptidos podrían interaccionar con la membrana bacteriana y afectar a su permeabilidad.

Ejemplo 2: Efecto del péptido Bio2-3A sobre cultivos planctónicos de Streptococcus pneumoniae.

Un cultivo de Streptococcus pneumoniae de la cepa R6CIB17a (cepa no floculante derivada de R6) se creció en medio líquido hasta una D.O.⁵⁵⁰nm de 0,1, lo cual corresponde al comienzo de la fase exponencial. En ese momento se añadió el péptido Bio2-3A a concentración final de 100 ^j M o el péptido 2X-Bio2-3A a concentraciones de 10 y 50 |^jM.

La Fig. 5A muestra que, en el caso del péptido Bio2-3A, una vez alcanzada la fase estacionaria, aproximadamente a los 160 min, se produce un acusado descenso de la D.O.^550nm para, posteriormente seguir un patrón similar al observado mucho más tarde en el control, resultado de la fase de autolisis. Por otro lado, el péptido 2X-Bio2-3A (Fig. 5B) a 10 pM induce tan sólo un retardo en el crecimiento del cultivo, pero a concentración de 50 pM no permite el crecimiento, e incluso induce la lisis del cultivo, ya que se obtienen datos de D.O.^550nm inferiores a los iniciales.

Con objeto de comprobar el estado de las células durante el descenso de D.O.^{550 nm} anteriormente descrito, se tomó una muestra del cultivo a los 210 min (fase estacionaria) que se empleó para la determinación del recuento de células viables. Los resultados obtenidos (Fig. 6) reflejan que el péptido Bio2-3A a 100 pM conlleva una reducción decimal completa del número de UFC/ml, es decir una actividad bactericida del 90%, mientras que el péptido 2X-Bio2-3A es más efectivo, produciendo a 50 pM una disminución de dos órdenes de magnitud en el recuento de viables, lo que indica una actividad bactericida del 99%. Por su parte, no se obtuvo variación significativa en la viabilidad en el caso del péptido 2X-Bio2-3A a 10 pM.

Ejemplo 3: Efecto del péptido 2X-Bio2-3A sobre la permeabilidad de la membrana de Streptococcus pneumoniae.

El hecho de que el péptido 2X-Bio2-3A induzca una disminución en la viabilidad bacteriana de dos órdenes de magnitud, y que presente una estructura secundaria en hélice a anfipática en presencia de micelas y semi-micelas de DPC, apunta a un posible efecto del péptido sobre la permeabilidad de la membrana bacteriana. Para comprobar esta hipótesis, se llevó a cabo un experimento en el que se analizó la entrada del fluorocromo Sytox Green en respuesta a la adición del péptido sobre un cultivo de S. pneumoniae R6. El experimento se realizó con un cultivo de células crecidas hasta una D.O.^550nm de 0.6 en medio C+Y, momento en el que se centrifugaron y se resuspendieron en un tampón de baja fuerza iónica (5 mM de fosfato sódico, pH 7,0), para evitar problemas de insolubilidad de los péptidos y al que se le añadió 280 mM de sorbitol para mantener el equilibrio osmótico con las células, junto con Sytox Green a concentración de 1 pM. En paralelo, se llevó a cabo un control negativo, conteniendo células, Sytox y tampón, y un control positivo conteniendo células, Sytox y el detergente Tritón X-100 al 1 % desde el principio, dado que su capacidad de permeabilización total de la membrana está ampliamente descrita (control de máxima permeabilidad). La emisión de fluorescencia se siguió en tiempo real (504 nm/524 nm, longitud de onda de excitación/emisión en un lector BMG POLARstar Galaxy (Offenburg, Alemania)). La Fig. 7 muestra los resultados, expresados en porcentaje de fluorescencia respecto al control de células completamente permeabilizadas, obtenido mediante la adición de Tritón X-100 al 1 %. Tras la adición del péptido, tanto a concentración de 10 ^M como a 50 ^M se detecta un cambio en la fluorescencia del 100 % con respecto al control, lo que indica la despolarización de la membrana, cambio que es más rápido a la concentración mayor de péptido, y que sugiere que este es el mecanismo de acción del péptido frente a las bacterias.

Ejemplo 4: Concentración mínima inhibitoria (CMI)

La concentración mínima inhibitoria (CMI) del péptido 2X-Bio2-3A se determinó utilizando los criterios del Instituto de Estándares del Laboratorio Clínico (CLSI) (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2009). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th informational supplement. CLSI documents M100-S19. CLSI, Wayne, PA.) mediante el sistema de microdilución, siguiendo las indicaciones descritas en la Norma Internacional ISO 20776 y empleando las cepas de neumococo R6 (no capsulada) y D39 (cepa capsulada, y por tanto infectiva). La CMI se calculó como la concentración más baja del agente a la cual se inhibe el crecimiento de forma visible. En paralelo se realizaron controles de crecimiento para cada cepa ensayada, y un control positivo (cepa tipo ATC49619+ ampicilina) y negativo (de esterilidad: medio de cultivo mismo volumen del péptido añadido al experimento). La CMI resultó ser 31 ^M en R6 y 62 ^m en D39.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 1.

2. El péptido según la reivindicación 1 que comprende la SEQ ID NO: 2.

3. El péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que consiste en la SEQ ID NO: 1 o en la SEQ ID NO: 2, preferiblemente en la SEQ ID NO: 2.

4. Un polinucleótido que codifica para el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una construcción genética que comprende el polinucleótido según la reivindicación 4.

6. Una célula que comprende la construcción genética según la reivindicación 5.

7. Una composición que comprende el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. La composición según la reivindicación 7, donde dicha composición es una composición farmacéutica o veterinaria.

9. La composición según la reivindicación 8 que además comprende otro principio activo.

10. La composición según la reivindicación 9, donde el otro principio activo es un agente antimicrobiano, preferiblemente antibacteriano.

11. La composición según la reivindicación 10, donde el agente antimicrobiano es una proteína antimicrobiana que se encuentra fusionada al péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. Uso no terapéutico del péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de la composición según la reivindicación 7 para la desinfección de superficies.

13. El péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, para su uso como medicamento.

14. El péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, para su uso como medicamento para el tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por microorganismos seleccionados de la lista que consiste en: bacterias, hongos, levaduras y/o virus, preferiblemente bacterias.

15. El péptido o la composición para su uso según la reivindicación 14, donde las bacterias son gram-positivas.

16. El péptido o la composición para su uso según la reivindicación 15, donde las bacterias gram-positivas pertenecen al género Streptococcus.

17. El péptido o la composición para su uso según la reivindicación 16, donde las bacterias pertenecen a la especie S. pneumoniae.

18. El péptido o la composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por bacterias pertenecientes a la especie S. pneumoniae y donde dichas infecciones han causado una enfermedad seleccionada de la lista que consiste en: meningitis, otitis media, sinusitis, septicemia o neumonía.