ES2322228T3 - Metodos de preparacion de peptidos. - Google Patents

Abstract

Un método para producir un péptido bioactivo, en el que dicho péptido tiene una longitud de 12 a 25 aminoácidos, tiene al menos 3 aminoácidos catiónicos y es capaz de formar una hélice alpha anfipática, método que comprende la identificación de un sector catiónico y la división de la parte restante del péptido en otros tres sectores que son sustancialmente del mismo tamaño, la incorporación al sector opuesto al sector catiónico de no más de 1 aminoácido voluminoso y lipofílicos y la incorporación a los dos sectores que flanquean al sector catiónico de 2 ó más aminoácidos voluminosos y lipofílicos.

Description

Métodos de preparación de péptidos.

La presente invención se refiere a métodos para producir péptidos bioactivos y moléculas generados mediante estas técnicas. Más particularmente, la invención se refiere a péptidos bioactivos que son capaces de formar una estructura de hélice \alpha in vivo en la que las posiciones relativas de residuos catiónicos y voluminosos y lipofílicos dentro de la estructura tridimensional del péptido son aquellas que proporcionan una buena selectividad, y a la producción de dichos péptidos. La selectividad, o en otras palabras una ventana terapéutica explotable, puede generarse o agrandarse aumentando la actividad terapéutica y/o reduciendo la toxicidad.

La invención describe métodos para potenciar la actividad (antimicrobiana y antitumoral) de péptidos y para potenciar la selectividad (ensanchar la ventana terapéutica); esto puede lograrse aumentando la actividad pero sin aumentar la toxicidad, o aumentándola en una cantidad mucho más pequeña. Alternativamente, se puede lograr una selectividad potenciada reduciendo la toxicidad pero manteniendo, o reduciendo sólo ligeramente, la actividad contra células diana.

Los péptidos, sus derivados y mímicos no peptídicos (peptidomiméticos) son clases de compuestos terapéuticamente relevantes. Se están desarrollando péptidos, típicamente fragmentos de proteínas y péptidos que existen en la naturaleza, como agentes antimicrobianos y en particular antibacterianos. Un amplio abanico de organismos usa péptidos como parte de su mecanismo de defensa anfitrión. Se han aislado péptidos antimicrobianos procedentes de especies tan diversas como bacterias y mamíferos [Lehrer, R.I., Lichtenstein, A.K. y Ganz, T. (1993) Ann. Rev. Immunol. 11, 105-128]. Generalmente, estos péptidos antibióticos presentan una carga neta positiva y tienen propensión a formar estructuras anfifílicas de hélice \alpha ó de lámina \beta al interaccionar con la bicapa de fosfolípidos exterior de las membranas celulares bacterianas [Besalle, R., Gorea, A., Shalit, J., Metger, J.W., Dass, C. Desiderio, D.M. y Fridkin, M. (1993) J. Med. Chem. 36 1203-1209]. En la mayoría de los casos se desconocen los mecanismos moleculares detallados de la acción antibiótica, aunque se cree que algunos péptidos clasificados como péptidos de clase L (líticos) interactúan con membranas celulares bacterianas, probablemente formando canales de iones o poros [Ludtke, S.J., He, K., Heller, W.T., Harroun, T.A., Yang, L. y Huang, H.W. (1996) Biochemistry 35 13723-13728] que conducen a cambios de permeabilidad y a la consiguiente lisis celular.

Las magaininas son péptidos antibacterianos procedentes de la piel de la rana Xenopus laevis y están clasificadas como antibióticos de clase L debido a que producen específicamente la lisis de bacterias; otros péptidos tales como mastroparanos, un veneno de abeja, carecen de dicha especificidad ya que producen la lisis tanto de células eucarióticas como de células procarióticas y se denominan venenos de Clase L [Tytler, E.M., Anantharamaiah, G.M., Walker, D.E., Mishra, V.K., Palgunachari, M.N. y Segrest, J.P. (1995) Biochemistry 34 4393-4401].

Al igual que con las magaininas y los mastroparanos, se han aislado péptidos de defensa de anfitrión a partir de polillas y moscas (cecropinas) y a partir de cangrejo de herradura. La acción directa de estos péptidos de defensa de anfitrión para repeler depredadores, por ejemplo venenos, es evidente. La búsqueda de péptidos que exhiban efectos antibióticos ha conducido a la identificación de otras proteínas/péptidos de los que se esperaría tuvieran propiedades citotóxicas. Uno de ellos es la lactoferrina, un transportador de hierro que también muestra un débil efecto antibacteriano.

Igual que se han buscado nuevos péptidos antimicrobianos, más recientemente se ha tratado de potenciar la actividad de proteínas o péptidos con propiedades antimicrobianas conocidas. Esto se ha hecho para el caso de la lactoferrina bovina mediante digestión de la proteína nativa con pepsina gástrica para producir un péptido, lactoferrina B (LFB), que es mucho más activo que la lactoferrina bovina nativa. La LFB es un péptido de 25 residuos que corresponden a los residuos 17-41 de la lactoferrina bovina [Bellamy y col. (1992) Biochem. Biophys. Acta. 1121 página 130 y siguientes]. Se han llevado a cabo estudios de actividad de estructura con magaininas y se ha demostrado, por ejemplo, que un aumento del grado de hélice y de la carga catiónica conduce a una mayor actividad antibacteriana [Chen, Y.H., Brown, J.H., Morell, J.L. y Huang, C.M. (1988) FEBS Letters 236, 462-466]. Sin embargo, dichas modificaciones de secuencia a menudo resultan en una mayor actividad hemolítica. Por tanto, un objetivo de la presente invención es preparar péptidos y/o derivados de péptidos que tengan una actividad antimicrobiana significativa pero que preferiblemente presenten una baja toxicidad, es decir, tengan poco efecto sobre las células eucarióticas normales, por ejemplo una baja actividad hemolítica. Aunque las células sanguíneas rojas pueden no ser células eucarióticas típicas, proporcionan un modo apropiado para ensayar la toxicidad y en cualquier evento son un tipo de célula que no debería sufrir lisis en una extensión significativa por efecto de péptidos bioactivos terapéuticos.

Los estudios de actividad de estructura de magaininas y otros péptidos antimicrobianos han revelado la importancia de una carga neta positiva, de la anfipatía y de la estructura de hélice \alpha como principales factores estructurales que determinan su capacidad para alterar membranas (Blondelle 1992, Chen 1988). Se han realizado intentos para mejorar la actividad y la selectividad antimicrobiana de dichos péptidos, y el momento hidrofóbico medio, una medida de la anfifilicidad, y se ha investigado la hidrofobicidad (Pathak 1995, Dathe 1997, Wieprecht 1997). Generalmente, los péptidos con hidrofobicidad y momentos hidrofóbicos elevados muestran un aumento de actividad antibacteriana, pero en la mayoría de los casos también presentan un aumento de la actividad hemolítica. También se ha investigado el ángulo generado por la hélice cargada positivamente (Wieprecht 1997) y se ha descubierto que un ángulo grande conduce a una mayor actividad antibacteriana, pero al mismo tiempo a una selectividad reducida.

Más recientemente (por ejemplo, Risso y col. Cell. Immunol. [1998] 107), se ha identificado un papel como fármacos anticancerígenos para los péptidos, en particular a través de su capacidad para lisar células tumorales. Esto presenta mayores problemas de selectividad ya que tanto la célula diana como las células sanas de los alrededores son eucarióticas. La identificación y el ensanchamiento de la ventana terapéutica en dichas circunstancias son difíciles puesto que hay menos diferencias entre las membranas celulares o las superficies celulares de las células diana y de las células que no son diana. Las células tumorales pueden variar ligeramente respecto a sus equivalentes sanas o frente a las células eucarióticas de diferentes tipos que las rodean, pero sufren cambios no comprendidos del todo y por tanto no se han descrito mecanismos para explotar cualquier diferencia. Por lo tanto, es un objetivo particular de la presente invención proporcionar un mecanismo mediante el cual se puedan identificar o desarrollar péptidos terapéuticos que tengan una buena actividad antitumoral, pero que presenten niveles fisiológicamente aceptables de toxicidad, es decir que no lisen o afecten en modo alguno o destruyan células eucarióticas sanas en un número significativo.

Los tumores pueden desarrollar resistencia a un amplio abanico de agentes quimioterapéuticos disponibles y por tanto sería especialmente deseable desarrollar un agente anticancerígeno que sea activo contra las células que han desarrollado dicha tolerancia.

Sorprendentemente se ha descubierto que la relación espacial entre el sector catiónico de un péptido y sus residuos voluminosos y lipofílicos desempeña una función significativa en la actividad y/o selectividad del péptido terapéutico.

La presente invención está relacionada con péptidos bioactivos que ejercen su efecto terapéutico mediante interacción con la membrana celular de las células diana. A este respecto dos tipos de interacción son relevantes, en primer lugar la carga positiva del péptido que hace que sea atraído por determinados fosfolípidos de membrana cargados negativamente, y en segundo lugar la presencia de grupos voluminosos y lipofílicos, los cuales se cree que interaccionan con las partes hidrofóbicas de los fosfolípidos. Por tanto, los péptidos son de naturaleza anfipática, presentan una región cargada positivamente con afinidad por el agua, y una región lipofílica que repele el agua.

Las diferentes cadenas laterales de los aminoácidos que constituyen el péptido pueden proporcionar grupos con un carácter catiónico o lipofílico. De los aminoácidos codificados genéticamente, la lisina, la arginina y la histidina proporcionan funciones catiónicas, es decir restos que están cargados positivamente a pH 7,0 y que por tanto se denominan convenientemente en la presente memoria aminoácidos catiónicos. De los aminoácidos codificados genéticamente, la valina, la leucina, la isoleucina, la metionina, la fenilalanina, la tirosina y el triptófano tienen cadenas laterales lipofílicas y voluminosas y se denominan convenientemente en la presente memoria aminoácidos voluminosos y lipofílicos.

Los péptidos que pueden producirse de acuerdo con los métodos de la invención son capaces de formar una estructura anfipática de hélice \alpha in vivo y su composición de aminoácidos y su estructura 3-dimensional aproximada pueden representarse convenientemente mediante una rueda de hélice \alpha, véase la Figura 1 a modo de ejemplo. Una hélice \alpha puede ser "derecha" o "izquierda" dependiendo de si los aminoácidos están en forma D ó L. Ambas versiones quedan contempladas en la presente invención. La rueda de hélice es una representación en dos dimensiones de un péptido tridimensional, que resulta de una compresión teórica del péptido en su forma de helicoidal a un círculo. Por tanto, los sectores también se consideran en dos dimensiones, su tamaño se determina por el ángulo formado desde el centro del círculo. Cuando se representan de este modo, se pueden identificar uno o más sectores catiónicos, es decir, concentraciones de aminoácidos catiónicos. Típicamente, los péptidos que exhiben la actividad terapéutica deseada, generalmente lítica, tendrán un sector catiónico principal; presentándose el sector catiónico del péptido de la Figura 1 marcado a modo de ejemplo.

Sorprendentemente los inventores han descubierto que concentrar los aminoácidos voluminosos y lipofílicos en las regiones adyacentes al sector catiónico potencia tanto la actividad como la selectividad terapéuticas de los péptidos citotóxicos. Tal como se discute con más detalle a continuación, esto se da particularmente cuando se desea maximizar el efecto fisiológico de cada grupo voluminoso o lipofílico. Se ha descubierto que las regiones adyacentes al sector catiónico son las regiones más "activas", es decir se maximiza el área en la que el impacto de cada residuo voluminoso o lipofílico. Por tanto, si se desea reducir la toxicidad de un péptido que contiene un número grande de grupos voluminosos y lipofílicos a la vez que se acepta una actividad terapéutica ligeramente reducida, entonces podría ser ventajoso incorporar dichos residuos lejos del sector catiónico.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un péptido bioactivos, en el que dicho péptido tiene una longitud de 12 a 25 aminoácidos, que tiene al menos 3 aminoácidos catiónicos y es capaz de formar una hélice \alpha anfipática, método que comprende la identificación de un sector catiónico y la división de la parte restante del péptido en tres sectores adicionales que son sustancialmente del mismo tamaño, la incorporación al sector opuesto al sector catiónico de no más de 1 aminoácido voluminoso y lipofílico, y la incorporación a los dos sectores que flanquean al sector catiónico de 2 o más aminoácidos voluminosos y lipofílicos.

Se ha descrito un método que produce un péptido bioactivos, en el que dicho péptido tiene una longitud de 7 a 25 aminoácidos, preferiblemente de 12 a 25, que tiene al menos 3 aminoácidos catiónicos y es capaz de formar una hélice \alpha anfipática, método que comprende la identificación de un sector catiónico y la división de la parte restante del péptido en tres sectores adicionales que tienen sustancialmente el mismo tamaño, y la incorporación de al menos el 60%, preferiblemente de al menos el 70%, más preferiblemente de al menos el 80% de la voluminosidad y de la lipofilicidad proporcionada por los grupos R de los aminoácidos en los sectores que flanquean al sector catiónico.

De aquí en adelante, los sectores que flanquean al sector catiónico se denominan "sectores flanqueantes" y el sector opuesto al sector catiónico se denomina "sector opuesto".

De nuevo, tal como se discute con detalle a continuación, si un péptido tiene un elevado número de residuos voluminosos y lipofílicos, y/o un elevado número de grupos catiónicos, puede ser preferible incluir un porcentaje menor de residuos voluminosos y lipofílicos en los denominados sectores flanqueantes.

Cuando los grupos voluminosos y lipofílicos son todos iguales, el % de voluminosidad y de lipofilicidad simplemente se igualará a la proporción de dichos grupos voluminosos y lipofílicos incorporados en los sectores flanqueantes en comparación con el número total de dichos grupos en los péptidos. Asignando una unidad de voluminosidad y de lipofilicidad a los aminoácidos lipofílicos codificados genéticamente tal como se discute a continuación, es decir, valina contribuye con una unidad y triptófano en 2 unidades. De hecho, este sistema puede refinarse más considerando que los residuos de triptófano más voluminosos y lipofílicos contribuyen con 2,5 unidades debido a su estructura de dos anillos fusionados. Los grupos R que comprenden dos o más anillos que no están fusionados son más voluminosos, por ejemplo bifenilalanina, y dichos grupos puede considerarse que contribuyen con 3 unidades de voluminosidad y lipofilicidad. Estos principios pueden aplicarse a todos los grupos R de aminoácidos, tanto si son naturales (pero no codificados genéticamente) o modificados.

En general, los aminoácidos que tienen 3-6 átomos distintos a hidrógeno en sus grupos R y que no tienen grupos cíclicos tendrán una unidad de 1, a los aminoácidos que incorporan un único grupo cíclico y no más de 8 átomos distintos de hidrógeno en el grupo R se les asignarán 2 unidades. Dos anillos fusionados y un total de 9 a 12 átomos distintos de hidrógeno contribuirán con 2,5 unidades, y aquellos que comprenden 2 ó más anillos no fusionados con 3 unidades. Se considera que el triptófano y sus análogos proporcionan 2,5 unidades.

Debería entenderse que donde se hace referencia a la introducción de 2 ó más aminoácidos en los sectores flanqueantes se pretende indicar que 2 ó más aminoácidos voluminosos y lipofílicos son introducidos en los sectores flanqueantes entre ambos, no 2 ó más en cada sector flanqueante. Convenientemente, al menos 1 aminoácido voluminoso y lipofílico está presente en cada sector adyacente al sector catiónico.

La producción implicará la síntesis de un péptido tal como se ha definido antes, esto puede ser convenientemente mediante transcripción y traducción de la correspondiente secuencia de ácido nucleico, mediante síntesis desde cero o mediante modificación de un péptido existente. Los métodos sintéticos se discuten con más detalle más adelante.

Por "incorporación" se entiende la inclusión en el sentido de que la síntesis de péptido se lleva a cabo de un modo tal que los residuos particulares se encuentran en los sectores definidos en relación al péptido completo producido.

Debido a su mayor voluminosidad y lipofilicidad, el péptido preferiblemente tendrá al menos dos, por ejemplo 3 ó más, residuos seleccionados entre tirosina, fenilalanina y triptófano, prefiriéndose especialmente los residuos de triptófano. Aunque el péptido en global puede tener residuos voluminosos y lipofílicos seleccionados entre los 7 aminoácidos enumerados anteriormente, el sector opuesto preferiblemente no tendrá más de uno, preferiblemente ninguno de los residuos más voluminosos y lipofílicos, es decir, tirosina, fenilalanina y triptófano, o sus equivalentes no magnéticos.

Visto desde otra perspectiva, puede considerarse que los dos grupos de aminoácidos voluminosos y lipofílicos contribuyen en 1 ó 2 "unidades" arbitrarias de voluminosidad y lipofilicidad, respectivamente, es decir, la valina contribuye con 1 unidad y la fenilalanina con 2 unidades; la tirosina también contribuye con 2 unidades pero es mejor considerar que el triptófano contribuye con 2,5 unidades. Por tanto, el péptido completo tendrá al menos 2 unidades, preferiblemente al menos 3, más preferiblemente 4-8, por ejemplo 5 ó 6 unidades de voluminosidad y lipofilicidad. El sector opuesto no tendrá más de 1 unidad de voluminosidad y lipofilicidad. Generalmente, como sería de esperar, los péptidos de mayor longitud requerirán más unidades de voluminosidad y lipofilicidad. Asimismo, los péptidos que incorporan menos aminoácidos catiónicos requerirán más unidades de voluminosidad y lipofilicidad. Los aminoácidos equivalentes no codificados genéticamente pueden agruparse de forma similar; generalmente, los aminoácidos que tienen 5 o menos átomos distintos de hidrógeno en su grupo R contribuirán únicamente con 1 unidad, típicamente estos aminoácidos no contendrán un grupo cíclico, mientras que los grupos más grandes contribuyen con 2 unidades y típicamente contendrán un grupo cíclico. Las unidades contribuidas por los diferentes grupos se discuten con más detalle más adelante.

De los aminoácidos voluminosos y lipofílicos codificados genéticamente, el triptófano es particularmente adecuado para su uso en la preparación de péptidos de acuerdo con la presente invención. Los inventores han observado que los péptidos que incorporan triptófano presentan péptidos particularmente ventajosos, es decir, una buena actividad terapéutica y una buena selectividad. La toxicidad se mide a menudo en términos de la tendencia que presenta un péptido para lisar eritrocitos, pero un aspecto adicional importante de la selectividad es la capacidad para diferenciar entre células tumorales y células no tumorales de un modo similar, representado en la presente memoria a través del modelo de células Meth A y fibroblastos.

Por lo tanto, el triptófano y los análogos no codificados genéticamente, y los derivados de los mismos que presenten configuraciones 3-dimensionales y características hidrofóbicas similares, son aminoácidos voluminosos y lipofílicos preferidos de acuerdo con la presente invención. Los derivados de triptófano adecuados contendrán típicamente una estructura de dos anillos fusionados, que incorpore preferiblemente un anillo de 5 miembros y un anillo de 6 miembros, siendo el anillo de 6 miembros alquilo o arilo, preferiblemente arilo. Uno o ambos anillos pueden estar sustituidos moderadamente, por ejemplo con grupos alquilo C_{1-3}, preferiblemente C_{1-2}, opcionalmente en los que uno o más de los átomos de carbono han sido reemplazados por nitrógeno, oxígeno o azufre, estando sustituido el anillo por grupos hidroxilo o halógeno. El grupo imidazol del triptófano pueden ser reemplazado alternativamente por un grupo alquilo C_{2} a C_{5} lineal o ramificado, con uno o más átomos de carbono opcionalmente reemplazados como antes. Estos análogos de triptófano contribuirán todos con 2,5 unidades de voluminosidad y lipofilicidad.

Tal como se ha discutido anteriormente y como se muestra en la Figura 2, un punto fundamental de la presente invención es la división del péptido en 4 sectores, el sector catiónico, los 2 sectores adyacentes al sector catiónico, denominados aquí "sectores flanqueantes" y el sector opuesto al sector catiónico, denominado aquí "sector opuesto". Dicha división no ha sido propuesta previamente y sorprendentemente proporciona una herramienta útil para diseñar nuevos péptidos y para maximizar la eficacia y minimizar la toxicidad de péptidos conocidos.

Convenientemente, el péptido se representa primero en forma de una rueda de hélice \alpha para facilitar la identificación del sector catiónico. Esto puede llevarse a cabo simplemente a mano, lo que implica dibujar el péptido sobre el papel, mediante modelización, incluyendo modelización con ordenador, o de cualquier otra forma.

Por lo tanto, el método de producción generalmente implicará etapas de diseño y de síntesis. Las etapas de diseño pueden ser asistidas por ordenador, y los programas de ordenador para, por ejemplo, la construcción de una rueda de hélice \alpha, son bien conocidos en la técnica; un programa conveniente es "Protean and Edit sequence" de DNA Star Inc. Los métodos de síntesis de péptidos son bien conocidos en la técnica y se discuten con más detalle a continuación.

Las técnicas descritas en la presente memoria son aplicables tanto a la modificación de péptidos existentes, por ejemplo para reducir la toxicidad, potenciar la selectividad o la actividad de un péptido lítico conocido, o para diseñar y sintetizar un nuevo péptido para aplicaciones terapéuticas concretas. Por tanto, como resultado de sus sorprendentes resultados en relación al modo en que las posiciones relativas de aminoácidos catiónicos y voluminosos/lipofílicos afectan a la actividad y a la selectividad, los inventores han proporcionado una nueva estrategia para el diseño y la síntesis de péptidos con un amplio abanico de aplicaciones terapéuticas. En particular, la estrategia consiste en el uso durante el diseño y la síntesis de péptidos líticos dirigidos contra células microbianas o tumorales.

La sorprendente buena selectividad de estos péptidos los hace particularmente efectivos como péptidos antitumorales. La presente invención permite por tanto modificar un péptido helicoidal anfipático de baja toxicidad mediante la adición de aminoácidos voluminosos o lipofílicos, o reposicionando los residuos voluminosos y lipofílicos nativos para proporcionar una actividad y una selectividad antitumoral mejorada.

La presente invención se ocupa de la optimización del impacto terapéutico de los grupos voluminosos y lipofílicos que encuentran dentro del péptido. Generalmente se ha descubierto que cuanto mayor es la voluminosidad global de un péptido, por ejemplo cuando mayor es el número de grupos voluminosos y lipofílicos o mayor es el número de unidades de voluminosidad y lipofilicidad presentes, más activo es el péptido tanto en términos terapéuticos como de toxicidad. Por tanto existe la pretensión de hacer el mejor uso posible de los grupos voluminosos para maximizar la actividad terapéutica y minimizar los efectos tóxicos, y la presente invención aborda dicha necesidad.

Esta necesidad puede ser particularmente apremiante cuando es muy importante lograr un efecto terapéutico útil manteniendo a la vez una toxicidad in vivo muy baja, como suele ser el caso cuando se trata a niños o a pacientes con cáncer debilitados por su cáncer y/o por los tratamientos que han recibido. También puede ser importante maximizar el efecto de un pequeño número de grupos voluminosos y lipofílicos en determinados sistemas de administración de fármacos, por ejemplo cuando se desea minimizar el tamaño y/o la hidrofobicidad del péptido administrado. También puede ser beneficioso mantener el número de residuos lipofílicos en un valor mínimo, ya que un número más elevado puede hacer disminuir las características de hélice \alpha del péptido, por ejemplo, Ala presente un efecto estabilizador de hélice \alpha mucho mayor que los grupos lipofílicos grandes.

En la presente memoria se describen los péptidos preparados mediante métodos que incluyen el método de producción definido anteriormente. Debe entenderse que dichos péptidos pueden haber sido modificados adicionalmente después de que las etapas descritas antes hayan sido llevadas a cabo. Un método para la producción de una composición farmacéutica comprende el método de producción de péptidos definido en la presente memoria y, además, la mezcla del compuesto preparado de ese modo o de un derivado del mismo con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un proceso para la preparación de un agente antibacteriano o antitumoral comprende la identificación de un péptido con una longitud de entre 7 y 25 aminoácidos, que tiene al menos 3 aminoácidos catiónicos, que es capaz de formar una hélice \alpha anfipática, que no tiene más de 2 grupos voluminosos y lipofílicos en el sector opuesto y al menos dos grupos voluminosos y lipofílicos en los sectores que flanquean al sector catiónico, sintetizar dicho péptido o derivado o biomimético no peptídico del mismo, y opcionalmente formular dicho péptido, derivado o biomimético en un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. Visto de otro modo, el péptido identificado tiene una longitud de entre 7 y 25 aminoácidos, etc., y tiene al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80% de la voluminosidad y la lipofilicidad proporcionada por los grupos R de aminoácidos de los sectores flanqueantes.

El proceso de identificación puede implicar aspectos de diseño y de modificación de un péptido, tanto desde cero como basado en un péptido conocido donde el objetivo es potenciar la actividad y/o la selectividad de dicho péptido conocido. El proceso puede implicar la evaluación in vitro o in vivo del péptido, seguida cuando sea necesario o deseable de modificaciones adicionales dentro de los parámetros definidos en la presente memoria, y la síntesis y re-evaluación antes de una formulación opcional en una composición farmacéutica. El proceso puede implicar la identificación de un péptido, la evaluación de la bioactividad de dicho péptido y la síntesis de un derivado no peptídico o de un mimético del mismo para la formulación.

Una etapa importante es la identificación del sector catiónico. El sector catiónico comprenderá al menos dos aminoácidos catiónicos, preferiblemente 3 ó 4 ó más residuos catiónicos. No todos los aminoácidos del sector catiónico serán de naturaleza catiónica, pero el sector catiónico no contendrá más de dos aminoácidos no catiónicos, preferiblemente no más de un aminoácido no catiónico. Un aminoácido N-terminal no modificado se considera un "aminoácido catiónico" porque el extremo N está cargado positivamente a pH 7,0, a menos que tenga un grupo R aniónico en cuyo caso ya no se considera un aminoácido catiónico.

Por lo tanto el sector catiónico será aquel sector que incorpore el mayor número de aminoácidos catiónicos pero que tenga un máximo de 2 aminoácidos no catiónicos. La identificación de sectores catiónicos en péptidos, particularmente en aquellos que forman una hélice \alpha anfipática es una técnica bien conocida por el especialista.

El ángulo del sector catiónico generalmente variará entre 200 y 60º, preferiblemente entre 180 y 90º. Cuando se representa un péptido en formato de rueda de hélice \alpha (también denominado proyección de rueda helicoidal) puede presentar más de un agrupamiento de residuos catiónicos, es decir, más de un "sector catiónico". En este caso se considera al sector catiónico principal, es decir el sector con el mayor número de aminoácidos catiónicos, como sector catiónico para los propósitos de la presente invención.

El sector catiónico preferiblemente abarcará al menos la mitad de todos los aminoácidos catiónicos del péptido. Preferiblemente el 60%, más preferiblemente el 70%, por ejemplo el 80% o más de todos los residuos catiónicos estarán en el sector catiónico. El requisito de que el péptido pueda conformarse y clasificarse como una hélice \alpha anfipática en cualquier caso requiere que haya una determinada distribución y concentración de diferentes tipos de residuos, como puede apreciar el especialista en la técnica.

Si el sector catiónico tiene un ángulo de 180º, por ejemplo, los sectores flanqueantes y opuesto tendrán todos un ángulo de 60º. Por tanto, para un péptido con 12, 18 ó 24 aminoácidos, cada uno de estos tres sectores tendrá 2, 3 ó 4 residuos, respectivamente. (El sector catiónico tendrá 6, 9 ó 12 aminoácidos en cada caso). Evidentemente el número de aminoácidos de la parte no catiónica del péptido no siempre será fácilmente divisible por tres para delimitar los otros tres sectores. En ese caso, los dos sectores flanqueantes siempre tendrán el mismo número de residuos, mientras que el sector opuesto puede tener un residuo más o menos que los dos sectores flanqueantes. Por tanto, es apropiado referirse a los tres sectores distintos del sector catiónico como sustancialmente iguales en tamaño, ya que no siempre será posible que sea exactamente iguales en tamaño.

Los péptidos tendrán 12 o más aminoácidos, por ejemplo, tendrán una longitud de 12 a 21 aminoácidos.

Los inventores han demostrado que con el fin de presentar una actividad antimicrobiana y/o antitumoral deseable, lo importante es tanto la posición dentro de la estructura tridimensional de los aminoácidos voluminosos y lipofílicos como el número de dichos residuos. En particular, se ha demostrado que los péptidos preferidos son aquellos que no tienen un número significativo de residuos voluminosos y lipofílicos en la región opuesta al sector catiónico; esto parece ayudar a la selectividad tanto por potenciar la selectividad como por reducir la toxicidad. Considerado de otro modo, los péptidos preferidos son aquellos en los que la mayoría de los residuos voluminosos y lipofílicos se encuentran en las regiones adyacentes al sector catiónico.

Los péptidos que tienen actividad antibacteriana y/o antitumoral potenciada, y preferiblemente una toxicidad reducida, pueden prepararse moviendo un aminoácido voluminosos y lipofílico desde su posición en la secuencia original/nativa hasta una región adyacente al sector catiónico, dejando inalterada de este modo la composición global de aminoácidos del péptido. En la presente memoria se describen péptidos de 7-25 residuos que tienen 3 ó más residuos catiónicos y que son capaces de formar una hélice \alpha anfipática, y que tienen un aminoácido voluminoso y lipofílico extra adyacente al sector catiónico, siendo tomado dicho aminoácido voluminoso y lipofílico de otra posición no preferida de la secuencia. En el lugar del aminoácido voluminoso y lipofílico se puede colocar el residuo procedente de la posición adyacente al sector catiónico que es sustituido por el aminoácido voluminoso y lipofílico, o cualquier otro aminoácido menos voluminoso y lipofílico. Los aminoácidos voluminosos y lipofílicos en posiciones no preferidas que pueden ser trasladados a la región adyacente al sector catiónico (posición preferida) pueden identificarse, por ejemplo, mediante un escaneo de alanina que identifica aminoácidos no esenciales, o mediante el estudio de la disposición de rueda helicoidal, estando las posiciones no preferidas normalmente en posiciones opuestas al dominio catiónico.

En una variación de la modificación descrita anteriormente, se toma un aminoácido voluminoso y lipofílico de una posición preferida, preferiblemente en el sector opuesto, y algo que sea funcionalmente equivalente a él se coloca en una posición preferida, es decir, en un sector flanqueante. Por tanto, el residuo recién posicionado en el sector flanqueante será voluminoso y lipofílico, pero puede ser, por ejemplo, triptófano o un aminoácido modificado o no codificado genéticamente, mientras que el residuo reemplazado en el sector catiónico sea fenilalanina. El carácter voluminoso y lipofílico del residuo será por tanto más importante que su estructura precisa.

Aunque se requiere un número mínimo de aminoácidos voluminosos y lipofílicos para obtener una buena actividad, su posición respecto al sector catiónico puede determinar si el péptido tiene una buena actividad y si es selectivo para las células diana, es decir, si presenta una baja toxicidad. Para péptidos de 19 o más aminoácidos, generalmente se requieren 7,5 unidades de voluminosidad y lipofilicidad en total (por ejemplo, tres residuos Trp o equivalentes), los péptidos de 12 a 18 residuos de longitud pueden requerir menos unidades, típicamente 5 ó más. El número óptimo de unidades también dependerá de forma más importante del número de residuos catiónicos presentes, requiriéndose menos unidades cuando hay más residuos catiónicos presentes. Por ejemplo, 7,5 unidades en los sectores flanqueantes pueden ser el óptimo cuando el péptido tiene 8-10 residuos catiónicos, pero pueden ser preferibles 10 unidades para péptidos que tengan 6 ó 7 residuos catiónicos.

Por tanto, se proporciona un método para potenciar la actividad de un péptido conocido en el que los aminoácidos voluminosos y lipofílicos son reorganizados para estar en la posición que los inventores han demostrado que mejora el perfil de actividad del péptido global. Normalmente, esto implicará el cambio desde el sector opuesto a un sector flanqueante. Tal como se ha discutido anteriormente, esto puede significar que la composición de aminoácidos global del péptido permanece inalterada. Más particularmente, esto significa que el número total de residuos voluminosos y lipofílicos del péptido modificado puede ser el mismo que en la secuencia de partida. La secuencia de partida puede ser un péptido natural o un fragmento de péptido natural o un péptido diseñado o modificado para proporcionar actividad antimicrobiana u otra actividad.

Los aminoácidos del mismo tipo, catiónicos, voluminosos y lipofílicos (como se han definido anteriormente), aniónicos (ácido aspártico y ácido glutámico), o que se encuentran dentro de los siguientes grupos funcionales, glicina y alanina o serina, treonina, asparagina, glutamina y cisteína, pueden ser reemplazados por otros residuos de su misma clase sin alterar la composición funcional del péptido, la prolina puede considerarse que se encuentra en una clase propia y generalmente no es un componente preferido de los péptidos de la invención. Los aminoácidos no codificados genéticamente que entran dentro de estos grupos funcionales se encuentran fácilmente disponibles y son conocidos por los especialistas en la técnica.

En determinadas circunstancias, aparte de la eliminación de un aminoácido voluminoso y lipofílico del sector opuesto y la introducción de un aminoácido voluminoso y lipofílico en un sector adyacente, también se puede hacer una modificación que altere la composición funcional del péptido de partida. Por ejemplo, se puede aumentar el número de residuos catiónicos o voluminosos y lipofílicos.

Este aspecto de la invención se refiere a una "recolocación" de los residuos existentes en el péptido para optimizar la actividad, de tal modo que el número de residuos de cada categoría funcional permanece igual o prácticamente igual. Esto puede considerarse una homología funcional que es dependiente de la composición y no del orden específico de la secuencia y en la que los aminoácidos en las diferentes clases son funcionalmente los mismos. Por tanto, el tri-péptido Arg-Trp-Ala tiene una homología funcional del 100% con el Phe-Lys-Gly. En relación a este aspecto de la invención, los péptidos tendrán una homología funcional de al menos un 70%, preferiblemente un 80%, incluso un 90 o un 100%, con respecto a un péptido conocido o natural que exhiba alguna actividad antimicrobiana o antitumoral.

Por conveniencia, en la presente memoria se usan los bien conocidos códigos de tres letras y de una letra para designar aminoácidos.

Los péptidos adecuados que pueden ser modificados para proporcionar péptidos de acuerdo con la invención incluyen péptidos tales como las magaininas, análogos de PGLa, cecropinas, defensinas, melitina y lactoferrina, y los péptidos líticos de clase (L), etc., que son conocidos en su forma no modificada por exhibir actividad citotóxica, particularmente antimicrobiana. Otros péptidos adecuados incluyen aquellos que no existen de forma natural sino que han sido sintetizados y presentan actividad citotóxica, incluyendo dichos péptidos las modelinas. En este contexto, los péptidos pre-modificación incluyen fragmentos obtenidos por digestión de proteínas o péptidos naturales. Se siguen descubriendo nuevas proteínas y péptidos antibacterianos y se cree que las técnicas de la presente invención una aplicabilidad general y podrían aplicarse de forma sencilla, y con una probabilidad de éxito razonable, a péptidos aún no identificados pero que se caractericen en el futuro como citotóxicos, particularmente como antimicrobianos.

En el caso de los agentes antitumorales, una buena selectividad es a la vez importante y difícil de lograr debido a las similitudes entre las células diana y las células que no son objetivos. Se ha descubierto que los péptidos que tienen una toxicidad reducida pero aún así tienen una actividad antibacteriana o antitumoral razonable (es decir, que tienen una selectividad potenciada) pueden ser preparados reemplazando un aminoácidos no esencial altamente voluminoso y lipofílico, tal como triptófano o fenilalanina, por un aminoácidos menos voluminosos y lipofílicos, por ejemplo isoleucina o leucina o incluso alanina o lisina. Generalmente, se posicionará un aminoácido "no esencial" voluminoso y lipofílico en el lado opuesto de la hélice respecto al sector catiónico (es decir, en el sector opuesto), dichos aminoácidos no esenciales voluminosos y lipofílicos pueden identificarse usando un diagrama de rueda helicoidal o un escaneo de alanina. Sin embargo, estos péptidos deberían retener al menos 2, preferiblemente al menos 3, aminoácidos voluminosos y lipofílicos tal como se han definido en la presente memoria. En términos de unidades de voluminosidad y lipofilicidad, los péptidos preferiblemente tendrán al menos 5, preferiblemente al menos 7, por ejemplo 7,5 ó más unidades
de voluminosidad y lipofilicidad que se encuentren preferiblemente en los sectores adyacentes al sector catiónico.

Por tanto, se describen péptidos citotóxicos modificados que tienen de 7 a 25 aminoácidos, al menos tres residuos catiónicos y al menos dos aminoácidos voluminosos y lipofílicos, y que son capaces de formar una hélice \alpha anfipática, en donde un residuo no esencial de triptófano es sustituido por un residuo menos voluminoso y lipofílico, por ejemplo isoleucina o alanina. La indolici(di)na es un péptido natural rico en triptófano que puede modificarse convenientemente de este modo para reducir su actividad. La actividad hemolítica de un péptido puede reducirse así de forma conveniente. La toxicidad medida a través de la tendencia para inhibir o lisar células de fibroblasto puede reducirse sustituyendo un grupo voluminoso y lipofílico en un sector opuesto con un residuo que no es voluminoso y lipofílico, por ejemplo alanina.

Otras posiciones adecuadas para la incorporación de un aminoácido voluminoso y lipofílico son posiciones que están cerca, preferiblemente adyacentes, a un aminoácido lipofílico existente. La proximidad se juzga en términos de la estructura secundaria del péptido más que en términos de estructura primaria. Las técnicas implicadas en la realización de un escaneo de alanina y en la construcción de diagramas de rueda helicoidal son bien conocidas en la técnica.

Se han observado efectos particularmente interesantes respecto a la selectividad en péptidos que incorporan uno o más grupos voluminosos y lipofílicos con dos anillos fusionados, tales como el triptófano. Los grupos R de aminoácidos que consisten en dos anillos fusionados que tienen poca o ninguna sustitución generalmente contribuyen en 2,5 unidades de voluminosidad y lipofilicidad tal como se ha discutido anteriormente. Se han investigado los efectos con una serie de péptidos modelo basados en una secuencia (KAAKKAA)_{3}. Se ha demostrado que para péptidos que incorporan 3 residuos de triptófano, estos deberían posicionarse en los sectores adyacentes al sector catiónico. Si dicho péptido contiene 4 residuos de triptófano, éstos deberían colocarse en el sector opuesto o en las regiones de los sectores flanqueantes que no están directamente adyacentes al sector catiónico.

Esto indica que un péptido tendrá un valor medio de voluminosidad y lipofilicidad por encima del cual es deseable colocar los residuos voluminosos y lipofílicos lejos de las regiones más "activas" del péptido, es decir, aquellas que se encuentran adyacentes, en especial directamente adyacentes, al sector catiónico. Como apreciará el especialista en la técnica, este valor medio variará dependiendo de la longitud del péptido, pero más particularmente del número de residuos catiónicos y del grado de voluminosidad y lipofilicidad exhibido por los diversos grupos.

El triptófano es particularmente útil para el diseño de péptidos que incorporan una buena selectividad hacia células tumorales debido a que es natural y por tanto puede incorporarse en un proceso que se basa en la transcripción y traducción del péptido producto, por ejemplo mediante sistemas de fermentación bacteriana. También puede ser metabolizado fácilmente por el cuerpo sin dar lugar a un aumento de productos de descomposición tóxicos potencialmente peligrosos.

En cualquier caso, debe entenderse que los péptidos pueden prepararse mediante rutas "sintéticas" que no se basan en los mecanismos normales de transcripción y traducción, y en dichas moléculas se pueden incorporar aminoácidos no codificados genéticamente. Además, los péptidos producidos por ejemplo mediante bacterias pueden someterse a modificaciones post-traducción. Por tanto, los péptidos producidos de acuerdo con la presente invención preferiblemente incorporarán uno o más aminoácidos que tengan grupos R de dos anillos fusionados, tales como residuos triptófano o análogos.

Los análogos de triptófano son un grupo de moléculas que exhiben estructuras tridimensionales similares al triptófano, así como propiedades similares en términos de lipofilicidad y polaridad. La lipofilicidad puede medirse de diferentes modos conocidos en la técnica, en particular es la determinación experimental de un coeficiente de reparto en un sistema agua: octanol.

El coeficiente de reparto P (o Log P) se define como la concentración de un compuesto en la fase octanol dividida por la concentración en la fase agua. El grupo indol de Trp tiene un Log P de 2,14 y la cadena lateral de los análogos de Trp preferiblemente tendrá valores de Log P de 1,5 a 3,5, más preferiblemente de 1,8 a 2,5. Estos análogos incorporarán una estructura de dos anillos fusionados, siendo un anillo preferiblemente un anillo C_{6} aromático, por ejemplo como en una benzotienilalanina, el segundo anillo puede ser un anillo de 5 ó 6 miembros que también puede ser de forma conveniente aromático, por ejemplo como en 2 ó 1-naftilalanina, o un grupo no aromático de 5 ó 6 miembros en el que uno o más átomos de carbono son reemplazados opcionalmente por oxígeno, nitrógeno o azufre. Los dos anillos fusionados pueden estar sustituidos por grupos metilo, hidroxi o halógeno, pero preferiblemente estarán sin
sustituir.

Para los péptidos con sectores catiónicos más pequeños, por ejemplo el péptido de 15 KKWAKKAWKWAKKW que sólo tiene 7 residuos que formen el sector catiónico frente a los 9 residuos del péptido de 21 descrito anteriormente, es deseable un mayor grado de voluminosidad y lipofilicidad para tener una actividad y selectividad óptimas, y cuatro residuos de triptófano presentes en las regiones flanqueantes proporcionaron unos resultados excelentes. Por tanto, existe un equilibrio, si un péptido es altamente catiónico y por tanto tiene una atracción muy fuerte por los fosfolípidos cargados negativamente de las membranas celulares, es deseable un menor número global de grupos voluminosos y lipofílicos para una selectividad óptima, o puede ser necesario colocar algo de la voluminosidad y lipofilicidad en las regiones menos activas, es decir, en las regiones opuestas al sector catiónico, con el objetivo de reducir el impacto de los grupos voluminosos y lipofílicos, por ejemplo para reducir la toxicidad. Si una molécula tiene menos residuos catiónicos, entonces puede ser necesario colocar todos los residuos voluminosos y lipofílicos en las regiones más activas del péptido adyacente al sector catiónico. Los resultados y los principios discutidos aquí permiten al experto optimizar la actividad y la selectividad del sistema de péptidos elegido.

Se describe un método para producir un péptido bioactivo, en el que dicho péptido tiene de 7 a 25, preferiblemente de 12 a 25, aminoácidos de longitud y es capaz de formar una hélice \alpha anfipática, método que comprende la identificación de un sector catiónico y la división de la parte restante del péptido en otros tres sectores que son sustancialmente iguales en tamaño, y

(a) para un péptido que tiene de 4 a 8, por ejemplo de 5 a 7, residuos catiónicos, la incorporación en los sectores flanqueantes del sector catiónico de al menos 3, preferiblemente 4, aminoácidos que tengan grupos R de dos anillos fusionados (por ejemplo, residuos triptófano o análogos del mismo), ó

(b) para un péptido que tenga 8, normalmente 9 o más, residuos catiónicos (por ejemplo de 9 a 12 residuos catiónicos), la incorporación en los sectores flanqueantes del sector catiónico de 2 a 4, preferiblemente 3, aminoácidos que tenga dos grupos R de dos anillos fusionados (por ejemplo, residuos triptófano o análogos del mismo), ó

(c) para un péptido que tenga 8, normalmente 9 o más residuos catiónicos, la incorporación al sector opuesto al sector catiónico de 4 ó 5, preferiblemente 4, aminoácidos que tengan grupos R de dos anillos fusionados, o la incorporación de 2 aminoácidos que tengan grupos R de dos anillos fusionados en cada uno de los dos sectores flanqueantes del sector catiónico, en donde no más de uno, preferiblemente ninguno, de dichos aminoácidos está en una posición realmente adyacente al sector catiónico.

En el caso (b) descrito antes, cuando sólo se incorporan dos aminoácidos, se incorpora preferiblemente un aminoácido adicional que tenga un grupo R de dos anillos fusionados al sector opuesto al sector flanqueante.

Los péptidos de los ejemplos, particularmente aquellos que tienen una relación Fib IC_{50}/Meth A IC_{50} (véase el Ejemplo 3) superior a 10, preferiblemente superior a 15, son ejemplos de una clase de péptidos activos, es decir, un péptido citotóxico de 12 a 25 residuos, preferiblemente un péptido de 14 a 22 residuos que cuando se representa en forma de rueda helicoidal bidimensional tiene un sector catiónico que comprende al menos 5, preferiblemente al menos 6, más preferiblemente al menos 7 u 8, en particular preferiblemente 9 ó 10 residuos catiónicos, teniendo dicho péptido una relación Fib IC_{50}/Meth A IC_{50} superior a 10, preferiblemente superior a 15, más preferiblemente superior a 18, de forma especialmente preferible superior a 20. Cuando sea apropiado, esta relación particular de selectividad puede ser sustituida por una relación de IC50 de células no malignas/células tumorales equivalente correspondiente a las células
tumorales de interés, véase por ejemplo Johnstone, S.A. y col. en Anti-Cancer Drug Design (2000) 15, 151-160.

De forma conveniente, la parte restante del péptido se divide en otros tres sectores de tamaño sustancialmente igual, incorporando dicho péptido preferiblemente 2, más preferiblemente 3, residuos de triptófano o análogos del mismo en los sectores flanqueantes, estando al menos uno y preferiblemente 2 de dichos residuos inmediatamente adyacentes al sector catiónico; o que tenga 5 o preferiblemente 4 residuos de triptófano o análogos del mismo en el sector opuesto al sector catiónico; ó 4 ó 5 residuos divididos entre los tres sectores no catiónicos siempre que ninguno de dichos residuos estén en las posiciones exactamente adyacentes al sector catiónico. Preferiblemente no más de uno, más preferiblemente ninguno, de dichos residuos están únicamente a una posición de distancia del sector catiónico (suponiendo que el tamaño total del péptido lo permita). Los residuos restantes se seleccionan preferiblemente entre glicina, alanina y valina, preferiblemente glicina o alanina.

Además se ha observado que para aminoácidos muy voluminosos y lipofílicos, por ejemplo bifenilalanina, la posición dentro de la rueda helicoidal tiene menor importancia, los péptidos que tienen aminoácidos que contribuyen con 3 unidades de voluminosidad y lipofilicidad pueden exhibir una buena selectividad si están colocados en los sectores flanqueantes o en el sector opuesto. En la presente memoria se discuten dichos péptidos citotóxicos de 7-25, preferiblemente 12-25, residuos, que incorporan 5-11 residuos catiónicos y 2-4 aminoácidos que tienen dos grupos R sin anillos fusionados, pero con el grado de selectividad discutido antes, por ejemplo una relación de IC_{50} de células no malignas/células tumorales superior a 10. Los métodos para producir dichos péptidos se describen en la presente memoria. En lugar de 2-4 grupos R de dos anillos no fusionados se pueden encontrar de 4 a 8 grupos voluminosos y lipofílicos pequeños, es decir aquellos que no contribuyen con más de 2 unidades de voluminosidad y lipofilicidad, por ejemplo que tienen sólo un grupo cíclico en el grupo R de aminoácido tal como la fenilalanina.

En el caso de LFB(17-31), un fragmento de LFB de 15 aminoácidos que tiene la secuencia Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala, los aminoácidos no esenciales determinados usando un escaneo de alanina fueron Cys(3), Gln(7) y Gly(14), aquí la numeración se presenta en términos absolutos en relación al propio péptido. Los análogos de LFB(17-31) en los que dichos aminoácidos son reemplazados por aminoácidos voluminosos y lipofílicos no genéticos pueden ser particularmente efectivos. Para modificaciones de péptidos de magainina tales como magainina 2, la incorporación de aminoácidos voluminosos y lipofílicos no genéticos en las posiciones Phe(16) y Glu(19) puede ser particularmente efectiva.

Estas modificaciones ilustran los principios generales discutidos en la presente memoria, que puede considerarse que el péptido comprende diferentes sectores y, sorprendentemente, la región adyacente al sector catiónico es una región preferida para residuos voluminosos y lipofílicos, y además la región opuesta al sector catiónico debería contener pocos o ningún residuo voluminoso y lipofílico.

Las sustituciones de triptófano del Ejemplo 2 indican la importancia de tener un residuo voluminoso y lipofílico, aquí Trp, en las regiones adyacentes al sector catiónico tanto desde el punto de vista terapéutico (actividad cíclica contra células Meth A) como de la selectividad, es decir de la capacidad de atacar células tumorales en lugar de fibroblastos o células sanguíneas rojas. Como puede observarse en la Figura 1, la posición 3 se encuentra opuesta al sector catiónico, y las posiciones 9 y 11 están adyacentes al sector catiónico.

En una realización preferida de la presente invención, el sector opuesto incorporará un residuo hidrofílico, por ejemplo lisina, arginina o equivalente.

Debería entenderse que todos los péptidos preparados por el método de la invención descritos en la presente memoria pueden incorporar aminoácidos no codificados genéticamente y péptidos que han sido modificados, por ejemplo en los extremos N ó C, normalmente mediante amidación o esterificación del extremo C. Por tanto, se pueden proporcionar aminoácidos voluminosos y lipofílicos y catiónicos mediante aminoácidos no codificados genéticamente pero naturales, mediante aminoácidos no naturales o mediante aminoácidos que han sido modificados. Los ejemplos de aminoácidos voluminosos y lipofílicos no genéticos incluyen adantilalanina; 3-benzotienilalanina, 4,4'-bifenilalanina, 3,3-difenilalanina, homofenilalanina, 2,6-diclorobenciltirosina, ciclohexiltirosina, 7-benciloxitriptófano, tri-terc-butiltriptófano, homotriptófano, 3-(antracenil)-L-alanina, L-p-iso-propilfenilalanina, L-tiroxina, 3,3',5-triiodo-L-tiroxina. Los grupos modificantes que proporcionan aminoácidos voluminosos y lipofílicos incluyen Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcroma-6-sulfonilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo) y Pbf (2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuranosulfonilo), que pueden aumentar de forma conveniente la voluminosidad y la lipofilicidad de los aminoácidos aromáticos, por ejemplo Phe, Trp y Tyr. Asimismo, el grupo terc-butilo es un grupo protector común para un amplio abanico de aminoácidos y es capaz de proporcionar aminoácidos voluminosos y lipofílicos no genéticos, particularmente cuando modifica residuos aromáticos. El grupo Z (carboxibencilo) es otro grupo protector que puede usarse para aumentar la voluminosidad y la lipofilicidad de un aminoácido.

Adicionalmente, compuestos no peptídicos pueden mostrar la misma actividad citotóxica que sus contrapartidas proteínicas. Dichos peptidomiméticos o "pequeñas moléculas" capaces de emular la actividad de una proteína o de un péptido probablemente sean más adecuados para, por ejemplo, administración oral debido a su elevada estabilidad química. Dichos compuestos también tendrán una estructura sustancialmente helicoidal in vivo, o serán capaces de formar dicha estructura cuando entren en contacto con membranas celulares. Por tanto, también tendrán una parte catiónica y regiones correspondientes a los diferentes sectores discutidos anteriormente.

Hoy día es común en la técnica sustituir agentes activos basados en péptidos o en proteínas, por ejemplo péptidos terapéuticos, por dichos peptidomiméticos que tienen una actividad funcionalmente equivalente. Generalmente dichos compuestos simplemente sustituirán la cadena principal (-C(R)CONH)-_{n} del péptido por una cadena principal flexible alternativa, por ejemplo un (-C(R)NHCO)-_{n} ó (-C(R)CH_{2}CH_{2})-_{n}, o por una cadena principal no lineal (por ejemplo una basada en una cuerda de anillos de ciclohexano fusionados). A pesar del cambio en la cadena principal, los grupos funcionales colgantes (las cadenas laterales del péptido original) están presentes de un modo similar lo que permite que el compuesto posea actividades antibacterianas y antitumorales similares. Por lo tanto, normalmente es posible representar el peptidomimético de forma equivalente a una rueda de hélice \alpha, y presentará la conformación helicoidal/cilíndrica equivalente de grupos funcionales colgantes.

Existen varias bibliotecas moleculares y técnicas de química combinatoria que son capaces de facilitar la identificación, la selección y/o la síntesis de dichos compuestos usando técnicas estándares (Kieber-Emons, T. y col., Current Opinion in Biotechnology 1997 8: 435-441). Dichas técnicas estándares pueden usarse para obtener los compuestos peptidomiméticos descritos en la presente memoria, es decir los compuestos orgánicos peptidomiméticos que muestran una actividad citotóxica sustancialmente similar o igual a la de los péptidos descritos en la presente memoria, por ejemplo, como los descritos en los Ejemplos de la presente.

Se describe un compuesto orgánico biomimético basado en los péptidos descritos en la presente memoria, que se caracteriza porque dicho compuesto exhibe actividad citotóxica, por ejemplo antibacteriana o antitumoral, al menos al nivel exhibido por los péptidos definidos aquí anteriormente.

Se describe un método para producir una molécula biomimética que es equivalente a 3 aminoácidos catiónicos y que es capaz de formar una hélice \alpha anfipática, método que comprende la identificación de un sector catiónico y la división de la parte restante de la molécula en otros tres sectores que son esencialmente iguales en tamaño, la incorporación al sector opuesto al catiónico de no más de 2, preferiblemente no más de 1 grupo equivalente a un grupo R de aminoácido voluminoso y lipofílico, y la incorporación en los dos sectores flanqueantes al sector catiónico de al menos 2, preferiblemente 3 o más, de dichos grupos voluminosos y lipofílicos en total.

Visto de otra forma, se describe un método para producir una molécula biomimética que es equivalente a de 7 a 25 aminoácidos y que tiene grupos equivalentes a al menos 3 aminoácidos catiónicos y que es capaz de formar una hélice \alpha anfipática, método que comprende la identificación de un sector catiónico y la división de la parte restante de la molécula en otros tres sectores que son sustancialmente del mismo tamaño, y la incorporación de al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80% de la voluminosidad y la lipofilicidad proporcionada por los grupos R de los aminoácidos en los sectores que flanquean al sector catiónico.

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El término "citotóxico" pretender referirse no solo a una actividad contra células procarióticas sino también contra células eucarióticas. Aunque en determinadas circunstancias es deseable tener un péptido que tenga una buena actividad antibacteriana pero que no lise o destruya de otro modo las células del paciente, se ha demostrado que los péptidos que se encuentran dentro del alcance de la invención tienen una actividad antitumoral. La actividad antitumoral de estos péptidos y de los medicamentos que los contienen constituyen aspectos adicionales de la presente invención. La actividad antitumoral incluye la destrucción o la reducción en tamaño o en número de tumores benignos o malignos, y la prevención o la reducción de la metástasis.

Por tanto, los péptidos producidos mediante los métodos de la invención pueden usarse en terapia, particularmente en la destrucción o reducción en tamaño o en número de tumores benignos o malignos, o en la prevención o reducción de la metástasis. Asimismo, los péptidos producidos mediante los métodos de la invención pueden usarse en la fabricación de un medicamento para la destrucción o reducción en tamaño o en número de tumores benignos o malignos, o en la prevención o reducción de la metástasis.

La actividad antibacteriana de los péptidos preparados mediante los métodos de la invención se manifiesta a través de una serie de modos diferentes. Determinadas modificaciones pueden dar como resultado péptidos que son bacteriostáticos y otros péptidos que son bactericidas. De forma ventajosa, la mayoría de los péptidos preparados mediante el método de acuerdo con la invención son bactericidas. Por tanto, entre otros, se describe un método para inhibir el crecimiento de bacterias que comprende poner en contacto las bacterias con una cantidad inhibidora efectiva de un péptido bioactivo preparado mediante un método de acuerdo con la invención.

La expresión "poner en contacto" se refiere a exponer las bacterias a un péptido de tal modo que éste puede inhibir, matar o lisar bacterias de forma efectiva, unirse a endotoxina (LPS), ó, permeabilizar las membranas exteriores de bacterias gram negativas. El contacto puede ser in vitro, por ejemplo añadiendo el péptido a un cultivo bacteriano para evaluar la susceptibilidad de las bacterias frente al péptido. El contacto puede ser in vivo, por ejemplo administrando el péptido a un sujeto con un trastorno bacteriano, tal como un choque séptico. "Inhibidor" o "cantidad inhibidora efectiva" se refiere a la cantidad de péptido que se requiere para provocar un efecto bacteriostático o bactericida. Los ejemplos de bacterias que pueden ser inhibidas incluyen E. coli, P. aeruginosa, E. cloacae, S. typhimurium y S. aureus. El método para inhibir el crecimiento de bacterias puede incluir además la adición de antibióticos para terapias de combinación o sinérgicas. El antibiótico apropiado administrado normalmente dependerá de la susceptibilidad de las bacterias, por ejemplo si las bacterias son gram positivas o gram negativas, y el especialista en la técnica lo distinguirá fácilmente.

Los péptidos preparados mediante el método de la invención pueden sintetizarse directamente de cualquier modo apropiado. Generalmente los grupos reactivos presentes (por ejemplo amino, tiol y/o carboxilo) serán protegidos durante el proceso global de síntesis. La etapa final de la síntesis será, por tanto, la desprotección de un derivado protegido.

A la hora de construir el péptido, en principio se puede comenzar bien por el extremo C o bien por el extremo N, aunque se prefiere el procedimiento que comienza por el extremo C. El aminoácido no genético puede incorporarse en esta etapa según la secuencia se extiende, o como resultado de una modificación post-sintética.

Los métodos de síntesis de péptidos son bien conocidos en la técnica pero para la presente invención puede ser particularmente conveniente llevar a cabo la síntesis sobre un soporte de fase sólida, siendo bien conocidos dichos soportes en la técnica.

Se conoce una amplia selección de grupos protectores para aminoácidos, y los grupos protectores adecuados para aminas pueden incluir carbobenzoxi (también denominado Z), t-butoxicarbonilo (también denominado Boc), 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenceno sulfonilo (Mtr) y 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (también denominado Fmoc). Debe apreciarse que cuando el péptido se construye desde el extremo C-terminal, habrá un grupo protector de amina en el grupo \alpha-amino de cada nuevo residuo añadido y será necesario eliminarlo selectivamente antes de la siguiente etapa de acoplamiento.

Los grupos protectores de carboxilo que puede, por ejemplo, emplearse incluyen grupos éster fácilmente eliminables tales como grupos bencilo (Bzl), p-nitrobencilo (ONb), pentaclorofenol (OPClP), pentafluorofenilo (OPfp) o
t-butilo (OtBu), así como los grupos de acople a soportes sólidos, por ejemplo grupos metilo unidos a poliestireno.

Los grupos protectores de tioles incluyen p-metoxibencilo (Mob), tritilo (Trt) y acetamidometilo (Acm).

Existe un amplio abanico de procedimientos para eliminar grupos protectores de aminas y de carboxilos. Sin embargo, éstos deben ser consistentes con la estrategia sintética adoptada. Los grupos protectores de cadena lateral deben ser estables en las condiciones usadas para eliminar el grupo protector \alpha-amino temporal antes de la siguiente etapa de acoplamiento.

Los grupos amino-protectores tales como el Boc y los grupos carboxilo-protectores tales como el tBu pueden eliminarse simultáneamente mediante tratamiento con ácido, por ejemplo con ácido trifluoroacético. Los protectores de tioles tales como el Trt pueden eliminarse selectivamente usando un agente de oxidación tal como el yodo.

Un método particularmente preferido implica la síntesis mediante el uso de derivados de aminoácidos de la siguiente fórmula: Fmoc-aminoácido-Opfp.

Se describen composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos preparados mediante el método de la invención definido anteriormente junto con un diluyente, vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. Los diluyentes, excipientes y vehículos adecuados son conocidos por el especialista. Los péptidos preparados mediante el método de la invención pueden usarse en métodos de tratamiento, particularmente en el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas o como agentes antitumorales, tanto en la destrucción como en la reducción del tamaño o del número de tumores benignos o malignos que pueden ser ascites y en la prevención de la metástasis.

Las composiciones pueden presentarse, por ejemplo, en forma adecuada para administración oral, nasal, parenteral, intravenosa, intratumoral o rectal.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "farmacéutico" incluye aplicaciones veterinarias de la invención.

Los compuestos también pueden presentarse en las formas farmacológicas convencionales de administración, tal como comprimidos, comprimidos recubiertos, pulverizadores nasales, disoluciones, emulsiones, liposomas, polvos, cápsulas o formas de liberación sostenida. Los péptidos preparados mediante el método de la invención son particularmente adecuados para la administración tópica, por ejemplo en el tratamiento de úlceras diabéticas. Se pueden emplear excipientes farmacéuticos convencionales, así como métodos habituales de producción, para la preparación de dichas formas. Los comprimidos pueden ser producidos, por ejemplo, mezclando el ingrediente o ingredientes activos con excipientes conocidos, tal como por ejemplo con diluyentes, tales como carbonato cálcico, fosfato cálcico o lactosa, desintegrantes tales como almidón de maíz o ácido algínico, aglomerantes tales como almidón o gelatina, lubricantes tales como estearato de magnesio o talco, y/o agentes para obtener una liberación sostenida, tales como carboxipolimetileno, carboximetil celulosa, celulosa acetato ftalato, o polivinilacetato.

Los comprimidos pueden consistir, si se desea, en varias capas. Los comprimidos recubiertos pueden producirse recubriendo núcleos, obtenidos de forma similar a los comprimidos, con agentes usados comúnmente para el recubrimiento de comprimidos, por ejemplo, polivinil pirrolidona o shellac, goma arábiga, talco, dióxido de titanio o azúcar. Con el objetivo de obtener una liberación sostenida o de evitar incompatibilidades, el núcleo puede consistir también en varias capas. El recubrimiento del comprimido también puede consistir en varias capas a fin de obtener una liberación sostenida, en cuyo caso se pueden usar los excipientes mencionados anteriormente para
comprimidos.

También se pueden usar sistemas de vehículos para órganos específicos.

Se pueden producir disolución inyectables, por ejemplo, de un modo convencional, tal como mediante adición de agentes conservantes, tales como p-hidroxibenzoatos, o estabilizantes, tales como EDTA. A continuación las disoluciones son rellenadas en viales o ampollas de inyección.

Los pulverizadores nasales que son un método preferido de administración pueden formularse de forma similar en disolución acuosa y envasarse en recipientes pulverizadores con un aerosol que actúe de propelente o pueden suministrarse con un sistema de compresión manual. Pueden producirse cápsulas que contienen uno o varios ingredientes activos, por ejemplo, mezclando los ingredientes activos con vehículos inertes, tales como lactosa o sorbitol, y rellenando la mezcla en cápsulas de gelatina.

Los supositorios adecuados, por ejemplo, pueden producirse mezclando el ingrediente activo o las combinaciones de ingredientes activos con los vehículos convencionales destinados a este propósito, tales como grasas naturales o polietilenglicol o derivados de los mismos.

Las unidades de dosificación que contienen a los compuestos de esta invención preferiblemente contienen 0,1-10 mg, por ejemplo 1-5 mg de los péptidos de la invención. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente otros ingredientes activos, que incluyen otros agentes citotóxicos tales como otros péptidos antimicrobianos. Otros ingredientes activos pueden incluir diferentes tipos de antibióticos, citoquinas, por ejemplo IFN-\gamma, TNF, CSF y factores de crecimiento, inmunomodulares, quimioterapéuticos, por ejemplo, cisplatina o anticuerpos.

Se describe el uso terapéutico de los péptidos preparados mediante el método de la invención tal como se ha definido anteriormente, es decir los péptidos pueden usarse como medicamentos, por ejemplo como agentes antibacterianos o antitumorales. Se describe un método para tratar o prevenir infecciones bacterianas en un paciente que comprende la administración a dicho paciente de uno o más de los péptidos preparados mediante el método de la invención, y un método para tratar tumores en un paciente que comprende la administración de uno o más de los péptidos preparados mediante el método de la invención. El tratamiento de tumores incluye la destrucción o la reducción del tamaño o del número de tumores benignos o malignos que pueden ser ascites, y la prevención de la metástasis.

Uno o más de los péptidos preparados mediante el método de la invención pueden usarse en la fabricación de un medicamento para tratar infecciones bacterianas o tumores.

Los agentes antibacterianos tales como los péptidos preparados mediante el método de la presente invención tienen una amplia variedad de aplicaciones diferentes a la de compuestos farmacéuticos. Por ejemplo, pueden usarse como agentes esterilizantes para materiales susceptibles a contaminación microbiana. Los péptidos preparados mediante le método de la invención exhiben una amplia actividad antimicrobiana y antibiótica y por tanto también son adecuados como agentes antivíricos y antifúngicos que tendrán aplicaciones farmacéuticas y agrícolas, y como promotores de curación de lesiones o como espermicidas.

Los péptidos, cuando se usan en composiciones tópicas, se presentan generalmente en una cantidad de al menos un 0,1%, en peso. En la mayoría de los casos, no es necesario emplear el péptido en una cantidad superior al 1,0%, en peso.

Los péptidos antitumorales pueden administrarse en combinación, posiblemente en combinación sinérgica con otros agentes activos o formas de terapia, por ejemplo la administración de un péptido de acuerdo a la invención pueden combinarse con quimioterapia, inmunoterapia, cirugía, terapia de radiación o con la administración de otros péptidos antitumorales.

Al emplear dichas composiciones sistemáticamente (intramuscular, intravenosa, intraperitoneal), el péptido activo está presente en una cantidad para lograr un nivel en suero del péptido de al menos aproximadamente 5 \mug/mL. En general, el nivel en suero del péptido no necesita exceder los 500 \mug/mL. Un nivel en suero preferido es aproximadamente 100 \mug/mL. Dichos niveles de suero pueden lograrse incorporando el péptido en una composición que se va a administrar sistemáticamente en una dosis de entre 1 y aproximadamente 10 mg/kg. En general, el(los) péptido(s) no necesita(n) ser administrado(s) en una dosis que exceda los 100 mg/kg.

Ahora la invención será descrita en referencia a los siguientes ejemplos no limitantes en los que:

Figura 1: muestra una representación de rueda helicoidal del péptido LFB 14-31m.

Figura 2: muestra una representación helicoidal del péptido LFB 14-31m que ha sido dividido en los 4 sectores de acuerdo con la invención.

Figura 3: muestra las ruedas helicoidales de dos péptidos KA18 tri-sustituidos con triptófano.

Figura 4: (a) muestra proyecciones de rueda helicoidal del péptido (KAAKKAA)_{3} y (b) del mismo péptido sustituido con 3 residuos triptófano ó (c) 4 residuos triptófano.

Ejemplos

Los péptidos fueron sintetizados usando química basada en Fmoc en un sintetizador Milligen 9050 completamente automatizado, y la purificación y el análisis se llevó a cabo usando HPLC y espectrometría de masas por electropulverización (VG Quattro Quadropole).

Ensayos de CIM (Concentración Inhibidora Mínima)

Las cepas bacterianas usadas fueron: Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923. Todas las cepas fueron almacenadas a -70ºC. Las bacterias fueron cultivadas en agua al 2% en Bacto Peptona (Difco 1807-17-01). Todos los ensayos fueron llevados a cabo con bacterias en la fase de crecimiento logarítmico. La determinación de la concentración inhibidora mínima (CIM) de los péptidos correspondiente a las cepas se llevó a cabo en agua al 1% en Bacto Peptona. Se usó una técnica estándar de microdilución con un inóculo de 2 X 10^{6} CFU/mL. Todos los ensayos fueron llevados a cabo por triplicado. Puesto que los péptidos están cargados positivamente y por tanto podrían adherirse a los pocillos de plástico, se controló la concentración real de los péptidos en la disolución mediante HPLC. No se produjeron diferencias en la concentración de los péptidos antes o después de añadir la disolución a los pocillos de plástico.

Actividad antitumoral

Meth A es una línea celular de sarcoma murino no adhesiva [Sveinbjornsson y col., (1996) BBRC 223: 643-649] singénica en Balb/c y que se mantuvo in vitro en RPMI 1640 que contenía un 2% de suero fetal de ternero. Se aplicaron las células (4x10^{6}) en placas de cultivo de 96 pocillos (Costar) en un volumen de 0,1 mL de medio RPMI 1640. Se añadieron las disoluciones de péptidos (0,1 mL) y las placas fueron incubadas a 37ºC durante 30 minutos, 4 horas ó 24 horas. Se midió la citotoxicidad usando el método MTT (Mosmann y col., J. Immunol. (1986) 136, 2348-2357).

Ensayo de fibroblastos

Las células MRC-5 usadas en el ensayo fueron cultivadas hasta confluencia en MEM que contenía un 10% de FBS, un 1% de L-glutamina y un 0,1% de penicilina y estreptomicina. Las células fueron lavadas con PBS y a continuación fueron tripsinizadas usando 2 mL de tripsina (para un matraz de cultivo de 80 cm). Después de que las células se hubieran despegado de la pared, normalmente después de aproximadamente 3 minutos de incubación, se añadieron 5 mL de medio con FBS. Las células fueron resuspendidas y contabilizadas. Entonces fueron transferidas a un tubo de centrifugación y sometidas a una velocidad de giro de 1500 rpm durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y las células fueron resuspendidas hasta una concentración de 1 x 10^{5} células/mL. 100 \muL de suspensión celular fueron transferidos a cada pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas para permitir que las células se unieran.

Después de la incubación, el medio que contenía suero fue retirado mediante volcado de la placa sobre un trozo de tejido. Se añadió a cada pocillo 100 \muL de medio sin suero y L-glutamina (medio de ensayo), y a continuación se retiró como en el caso anterior. Las células fueron estimuladas añadiendo 100 \muL de diversas concentraciones de péptidos diluidos con medio de ensayo en cada pocillo. El resto del ensayo se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente para las methA, excepto en que después de las 2 horas de incubación tras la adición de MTT, en lugar de 130 \muL de medio se eliminaron 80 \muL.

Ensayo hemolítico

Las actividades hemolíticas de los péptidos fueron determinadas usando células sanguíneas rojas humanas frescas. Se extrajeron 8 mL de sangre de una persona sana. 4 mL de sangre fueron transferidos a un tubo de policarbonato que contenía heparina hasta una concentración final de 10 U/mL, y los otros 4 mL de sangre fueron transferidos a un tubo de vidrio que contenía EDTA con una concentración final del 15% de EDTA. Se aislaron los eritrocitos de la sangre tratada con heparina mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos, y se lavaron tres veces con disolución salina tamponada de fosfato (PBS) para eliminar el plasma y la capa superior. La partícula de células se resuspendió en PBS para obtener un volumen final de 4 mL. El péptido se diluyó hasta una concentración de 2 mg/mL y 0,1 mg/mL. El péptido fue diluido aún más hasta las concentraciones establecidas en la Tabla 1. En primer lugar se añadió PBS a cada tubo, y después RBCs y las disoluciones de péptidos. Se determinó el hematocrito de la sangre tratada con EDTA después de 30 minutos con Sysmex K-1000, y las RBCs resuspendidas fueron diluidas en hematocrito al 10%. Se incubaron RBCs en PBS (1%) con y sin péptidos (Tabla 18) en un agitador a 37ºC durante 1 hora, y entonces se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante fue transferido cuidadosamente a tubos de policarbonato nuevos y se midió la absorbancia del sobrenadante a 540 nm. La hemólisis de línea base fue la hemoglobina liberada en presencia de PBS, y un 100% de hemólisis fue la hemoglobina liberada en presencia de Triton X-100 al 0,1%.

Ejemplo 1

Los principios discutidos en la presente memoria fueron usados en el diseño, síntesis y evaluación de péptidos basados en una conformación helicoidal perfectamente anfipática que comprende sólo residuos de alanina y lisina. La secuencia del péptido de partida fue la siguiente, KAAKKAA KAAKKAA KAAK, denominada "KA18". Las modificaciones de este péptido para introducir uno o más residuos voluminosos y lipofílicos fueron llevadas a cabo sustituyendo Ala en las posiciones del sector flanqueante 7, 9 ó 16, o en las posiciones del sector opuesto 6, 10 ó 17. Las representaciones de rueda helicoidal de los dos péptidos KA18 trisustituidos se muestran en la Figura 3.

La actividad antitumoral se evaluó contra células Meth A y la toxicidad contra células sanguíneas rojas (RBC) y fibroblastos normales. Los resultados se muestran en la Tabla 1 presentada a continuación, que ilustra la importancia de los grupos voluminosos y lipofílicos en los sectores flanqueantes y no en los sectores opuestos.

1

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Ejemplo 2

Como péptido modelo se eligió un análogo de la lactoferricina B, un péptido antimicrobiano derivado de la lactoferrina bovina. En base a la secuencia 14-31 de la lactoferrina bovina, se modificó dicho péptido para proporcionar un estructura helicoidal anfipática ideal con un sector catiónico estrecho. LFB (14-31)m es LFB 14-31A_{2,6,10,17}F_{7}K_{16}L_{14}R_{4} (secuencia completa PAWRKAFRWAWRMLKKAA). En este estudio se sustituyeron uno, dos o los tres residuos Trp de la secuencia por otros aminoácidos, y se midieron las actividades antibacteriana, antitumoral y hemolítica, así como la capacidad para inhibir fibroblastos.

Resultados

Las secuencias de los péptidos sintetizados y los datos de actividad se resumen en la Tabla 2.

2

Los valores IC50/EC50 son la concentración de péptido necesaria para matar el 50% de las células.

Se descubrió que todos los péptidos son homogéneos, mediante HPLC analítico, y que tienen el peso molecular esperado, determinado mediante FAB-MS.

Modelización de los péptidos

Se eligió este péptido como secuencia de partida en este estudio debido a que tiene una elevada bioactividad contra MethA, células bacterianas, RBCs y fibroblastos. La Figura 1 muestra la presentación de rueda helicoidal de la secuencia de péptidos. Para comenzar, uno a uno los 3 Trps, en las posiciones 3, 9 u 11, fueron sustituidos por Ala e Ile, respectivamente. Después de las sustituciones de aminoácidos sencillas, dos de los Trps, en las posiciones 9 y 11, fueron sustituidos por Ala e Ile, respectivamente. Para los péptidos sustituidos con Ile se profundizó en la investigación de sustitución de Trps, y se sintetizaron tres péptidos adicionales con el objetivo de investigar todas las combinaciones de sustituciones posibles.

Actividad biológica de los péptidos Actividad antitumoral

Todos los péptidos con sustituciones de Ala mostraron una menor actividad que el LFB(14-31)m. El más activo, (14-31)mA11, con una IC_{50} de 11 \muM, tiene una actividad 1,5 veces inferior. El descenso en actividad fue más profundo cuando se sustituyeron dos de los 3 Trps, en la posición 9 y 11. El más activo de los péptidos de sustitución de Ile fue el (14-31)mI11, con una IC_{50} de 6 \muM. Por tanto, la actividad de este péptido se ve ligeramente incrementada en comparación con el LFB(14-31)m. También en los péptidos con sustitución de Ile la actividad parece disminuir, sin embargo ligeramente, con dos sustituciones, lo cual es similar a los resultados de los péptidos con sustitución de Ala.

Actividad antibacteriana

En comparación con el LFB(14-31)m todos los péptidos con sustitución de Ala presentaron un menor actividad contra E. coli, similar a los resultados obtenidos con MethA. El análogo con la menor actividad contra MethA,
(14-31)mA9,11, también presentó la menor actividad contra bacterias.

Los péptidos con sustitución de Ile muestran una actividad antibacteriana similar en comparación con LFB(14-31)m, no hay diferencias importantes en actividad entre los diferentes análogos de sustitución. Incluso el (14-31)mI3,9,11, que presentó una actividad de MethA reducida, no mostró una actividad antibacteriana reducida.

Actividad hemolítica

Idealmente, los péptidos antimicrobianos/antitumorales deberían tener una actividad hemolítica muy baja, o la ventana terapéutica entre la actividad antimicrobiana/antitumoral y la actividad hemolítica debería ser considerable para que los péptidos pudieran ser considerados como posibles agentes terapéuticos. Todos los análogos de LFB(14-31)m excepto uno, el (14-31)mI11, presentaron una menor actividad hemolítica que el LFB(14-31)m, lo que indica la importante contribución del Trp en la actividad sobre células sanguíneas rojas. De los péptidos con sustitución de Ala, el (14-31)mA9 y el (14-31)mA11 presentaron la mayor actividad, mientras que el (14-31)mA3 y el (14-31)mA9 presentaron la menor actividad.

Citotoxicidad

Se descubrió que el LFB(14-31)m es altamente tóxico para los fibroblastos, y por tanto no hay selectividad entre éstos y las células MethA. Los péptidos con sustitución de Ala varían considerablemente en actividad, aunque ninguno de ellos es más citotóxico que el LFB(14-31)m. Por tanto, el (14-31)mA9,11, aunque es sólo moderadamente activo contra MethA, no presenta actividad citotóxica contra células sanguíneas rojas y fibroblastos. El LFB(14-31)m A3 muestra una buena actividad contra células MethA y poca toxicidad contra fibroblastos. Por lo tanto, la eliminación de W3 en el sector opuesto condujo a la mayor selectividad.

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Ejemplo 3

Los péptidos descritos en la Tabla 3 mostrada a continuación fueron preparados y evaluados como se ha descrito en los Ejemplos previos.

El péptido modelo (KAAKKAA)_{3} tiene 9 residuos de lisina y 12 de alanina y su configuración de rueda helicoidal anfipática se muestra en la Figura 4a. Este péptido antimicrobiana diseñado desde cero con una toxicidad contra mamíferos baja fue seleccionado a partir de la bibliografía (Javadpour y col. J. Med. Chem. 1996, 39, 3107-3113). Las CIMs correspondientes a este péptido contra E. coli y S. aureus fueron 8 \muM, mientras que no presentó ninguna actividad mensurable contra fibroblastos o contra eritrocitos humanos.

3

4

O

= ornitina

Bip

= bifenilalanina

Y

= esto indica que los residuos, aunque están en los sectores flanqueantes, no están inmediatamente adya- {}\hskip0.2cm centes al sector catiónico.

La entrada de columna "Posic." indica el número y la posición de los residuos en el sector F = flanqueante u
O = opuesto. Una medida de la selectividad de cada péptido se muestra a través de la relación de IC_{50} de Fib/IC_{50} de MethA.

Estos resultados muestran que para los péptidos 21aa evaluados al menos se requieren 3 residuos de Trp con el objetivo de alcanzar un efecto lítico significativo contra las células tumorales. Tres residuos de Trp proporcionan una mejor selectividad que 4 residuos de Trp, aunque el efecto lítico contra células tumorales es mejor con 4 residuos de Trp, el efecto tóxico medido a través del efecto lítico contra fibroblastos también se ve disminuido significativamente. Evidentemente el número óptimo y mínimo de grupos voluminosos y lipofílicos en un péptido dado dependerá de la longitud del péptido y del tamaño de los grupos voluminosos y lipofílicos particulares. Dichas optimizaciones pueden ser llevadas a cabo fácilmente por el especialista en base a las guías proporcionadas en la presente memoria.

El grado de selectividad observado es sorprendente y muy esperanzador desde el punto de vista terapéutico.

La fenilalanina es menos voluminosa y lipofílica que el triptófano y aquí se requieren 4 residuos o más con el fin de lograr actividad citolítica en el péptido 21aa. Por el contrario, la bifenilalanina que es más voluminosa y lipofílica que el triptófano proporciona selectividad con tal solo 2 residuos.

También se han preparado los siguientes péptidos:

(KAAKKAA)_{3} F_{7,9,14,16}

(KAAKKAA)_{3} F_{6,10, \ 13,17}

(KAAKKAA)_{3} Bip_{10,17}

La presencia de residuos de lisina como suministradores de carácter catiónico claramente no es esencial, ya que un péptido en el que todos los residuos de lisina han sido sustituidos por ornitina muestra una buena actividad. De hecho, la cadena lateral más corta de los residuos de ornitina ha mejorado la selectividad en comparación con la lisina.

Claims (5)

1. Un método para producir un péptido bioactivo, en el que dicho péptido tiene una longitud de 12 a 25 aminoácidos, tiene al menos 3 aminoácidos catiónicos y es capaz de formar una hélice \alpha anfipática, método que comprende la identificación de un sector catiónico y la división de la parte restante del péptido en otros tres sectores que son sustancialmente del mismo tamaño, la incorporación al sector opuesto al sector catiónico de no más de 1 aminoácido voluminoso y lipofílicos y la incorporación a los dos sectores que flanquean al sector catiónico de 2 ó más aminoácidos voluminosos y lipofílicos.

2. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, en el que uno o más de los aminoácidos voluminosos y lipofílicos es triptófano o un análogo del mismo.

3. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1 ó 2, en el que todos los aminoácidos voluminosos y lipofílicos son triptófano o análogos del mismo.

4. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el péptido comprende al menos 5 residuos catiónicos.

5. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el péptido comprende al menos 7 residuos catiónicos.