JPH11504316A - 進行性グリコシル化終末産物に結合する薬剤及びその使用方法 - Google Patents

進行性グリコシル化終末産物に結合する薬剤及びその使用方法

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JPH11504316A JP8529784A JP52978496A JPH11504316A JP H11504316 A JPH11504316 A JP H11504316A JP 8529784 A JP8529784 A JP 8529784A JP 52978496 A JP52978496 A JP 52978496A JP H11504316 A JPH11504316 A JP H11504316A
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ヨン ミン リー
ヘレン ヴラッサラ
アンソニー セラミ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ある種の抗菌タンパク質、特に、リゾチーム及びラクトフェリンが高親和性で進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）に結合し、その結合活性が細菌炭水化物の該抗菌タンパク質への結合と実質的に非競合的であるという予想できない発見に基づく診断及び治療法に関する。従って、本発明は、リゾチーム及びラクトフェリンのドメインがＡＧＥ結合活性と関連がある親水性ループドメインを有する分子及びそのドメインを含む組成物を投与することにより高レベルのＡＧＥと関連がある疾患及び障害を治療する方法に関する。本発明は、更に、ＡＧＥを試料から分離する方法及び組成物に関する。本発明は、また、被検者からの生物試料中のリゾチーム及びラクトフェリンのような抗菌タンパク質の活性レベルを測定することによりＡＧＥ関連疾患又は障害に罹っている患者におけるＡＧＥ合併症の予後を決定する方法に関する。低レベルの抗菌タンパク質殺菌活性は、高レベルのＡＧＥ及び細菌感染症に対して罹病性の高い予後指標を表すことができる。他の態様においては、本発明は、生物試料中のＡＧＥの検出に関する。個々の実施態様においては、ＡＧＥはリゾチーム及びラクトフェリンの殺菌活性を阻害し、システインで挟まれた１７又は１８アミノ酸親水性ループペプチド（最初と最後のアミノ酸がジスルフィド結合を形成するシステインである）はＡＧＥ−ウシ血清アルブミンに結合する。

Description

【発明の詳細な説明】 進行性グリコシル化終末産物に結合する薬剤及びその使用方法 発明の技術分野 本発明は、一般的には、タンパク質の非酵素的グリコシル化に関し、特に、グ リコシル化タンパク質と相互作用することができかつそのタンパク質の場所と活 性に働きかけることができる薬剤に関する。本発明は、更に、その薬剤の利点を 用いる組成物、装置を含む材料、及び対応する診断及び治療法に関する。 発明の背景 進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）は、グルコースとタンパク質の非酵素 的反応から生体内で自然に生じる異種の反応生成物を表すものである(Monnierら ，1981，Science 211:491; Bucalaら，1992，Advanced glycosylation endprodu cts，Harding & Crabbe，eds.，Post-Translational Modifications of Protein s，CRC Press Inc．2:53-79)。グルコース及び他の還元糖は、濃度依存的にタン パク質のアミノ基と非酵素的に反応する。時間が経つにつれて、それらの最初の アマドリ産物は更に転位、脱水及び他のタンパク質と架橋して進行性グリコシル 化終末産物（ＡＧＥ）と呼ばれる複合体構造のファミリーとして蓄積する。その 化学は長い間食品化学者によって研究されてきたが、過去１０年間には生きた組 織内でのＡＧＥの存在が確かめられた。ＡＧＥインヒビター、アミノグアニジン による組織病変の有効な予防の証明と共に用いられた老齢及び高グルコース濃度 の関数として構造タンパク質に関するそれらの産物の過剰沈着により、ＡＧＥの 形成が老化及び糖尿病の長期合併症に役割を果たしているという仮説が支持され た。 ＡＧＥ−タンパク質の生体内形成は、正常なグルコース周囲濃度のもとではゆ っくりと進行するが、ＡＧＥ蓄積の速度は糖尿病で生じる高血糖が共存するとき には著しく加速される(Monnier & Cerami，1983，Biochim，Biophys．Acta．760 :97-103; Monnierら，1984，Proc．Natl.Acad．Sci．USA 81:583-87)。多くの研 究からＡＧＥが老化及び長期糖尿病で生じる構造上及び機能上の変化に重要な役 割を果たすことが示された（Brownleeら，1988，N．Engl．J．Med．318:1315-13 21）。 高血糖の患者の組織及び血清における高レベルのＡＧＥは、血管損傷及びネフ ロパシーのような多くの糖尿病合併症の発病に関連している(Vlassaraら，1994 ，Lab．Invest．70:138)。糖尿病の患者は、また、細菌感染症に対する罹病性が 高い。しかしながら、初期の研究からは防御系機能又は細菌増殖に対する糖尿病 関連代謝障害、例えば、高血糖の有意な悪影響が証明されなかった(Moutshenら ，1992，Diabetes and Metabolisme 18:187)。我々は、高レベルのＡＧＥが糖尿 病患者の正常な防御を抑制する伝達物質として働くことができると仮定する。 一般的には、ＡＧＥ修飾タンパク質の結合特性及びレセプターに関する研究は これまでＡＧＥの認識、接触又は結合に関与する特定の結合ドメイン又はモチー フを同定していない。その発見は観察及び詳細に報告された不利な余病を扱う診 断法及び治療法の双方に有効な戦略の開発に大いに役立つことが理解される。従 って、本発明はそのような発見を目的とする。 発明の要約 本発明によれば、進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）の特定の結合モチー フは、内因性抗菌タンパク質、即ち、よりわかりやすく表すと考えられるＡＧＥ 結合活性の分子制御の中心に対して決定された。そのようなものとして、本発明 は、その結合活性を利用する薬剤、それを含む組成物及びさまざまな使用の開発 を企図する。 更に詳細には、保存結合モチーフは、抗菌タンパク質リゾチームとラクトフェ リンにおいて最初に発見及び同定された共通１７〜１８アミノ酸システイン結合 親水性ペプチドループドメインを含んでいる。これらのシステインループドメイ ンは、本明細書に記載されたように合成で調製されており、ＡＧＥ結合活性を示 す。個々のシステイン結合ループドメインは、共通１７〜１８残基親水性ループ （ＣＸ15-16Ｃ）であり、本明細書ではＡＧＥ結合システイン結合ループドメイ ン又は“ＡＢＣＤ”モチーフと名付けられた。この構造の直接の用途は、組織及 び体液中のＡＧＥレベルの測定及び一般的には及び詳細には細菌感染症に関して 異常なＡＧＥの存在と活性を特徴とする病態の治療である。 結合モチーフ、その活性断片及び同族分子の治療上の使用は、リゾチーム及び ラクトフェリンのような抗菌タンパク質の作用を援助することにより細菌感染症 を克服する患者の直接治療に関する。同じ薬剤が体外方式、例えば、選択的に透 過可能な“透析”膜等を用いる適切な装置で血液又は血清からＡＧＥペプチド及 びＡＧＥタンパク質を分離及び除去するために用いられる。その方式で血液供給 が処理されてＡＧＥレベルを低下させ、生体内タンパク質／組織老化の進行を弱 めることにより感染症の確度を低下させる。本発明の薬剤は、ＡＧＥペプチドを オプソニン作用させるために機能することができ、そのようにして体内機構によ る生体内クリアランスを援助することができる。 腹膜透析の実施と共に便利に用いられる特定の装置及び対応する使用方法が含 まれる。かかる装置とその使用は、血液から望ましくない進行性グリケーション 産物を間接的に除去するのに特に有利である。該装置は、グルコース溶液のよう な透析物を腹腔に導入及び送達する患者の腹膜内に移植するためのカテーテル器 具を含む。進行性グリケーション終末産物（又はＡＧＥ）として既知の物質を含 む、グルコースとタンパク質の自然反応経路の産物と関連がある又はそれを含む 有害な分子の分離及び除去用手段は、カテーテル器具と共に含まれ、腹膜隙登録 に対して配置される。 本発明のＡＧＥ結合モチーフ、その断片及び同族分子は、また、ＡＧＥ活性及 び存在のモジュレーターとして作用することができる他の活性物質を同定するた めに薬剤発見分析を含む診断分析に用いられる。かかる物質を含み、それに結合 してＡＧＥタンパク質とペプチドを分離して体内から除去することができる装置 が企図される。他の診断使用は、アルツハイマー病又はアテローム性動脈硬化症 に罹っている患者に見られるようなＡＧＥ含有プラークの画像分析の補助剤とし てＡＧＥ修飾タンパク質、ペプチド及び他の生物分子を捕捉するために、抗ＡＧ Ｅ抗体と同様の方法での結合パートナーとして結合モチーフの使用を企図する。 その後者の用途においては、結合モチーフ又はその活性断片をもつ分子はアミロ イド及び類似のプラーク及び同様にＡＧＥ蓄積の他の領域に局在してその測定を 援助することができる。それらの適用は、ＡＢＣＤペプチド、その活性断片又は 分子の類似性によってＡＧＥ結合活性をＡＢＣＤペプチドと共有する同族 (cognate)分子又は同族体(congener)のＡＧＥ標的機能がＡＧＥ標的結合体の検 出を容易にする標識又はタグに結合される場合に最もよく実現される。 本発明の薬剤の結合親和性は、局所的に内在するＡＧＥに対する結合に利用す るパーソナルケア用品及び化粧品に組込むものを含むさまざまな非治療使用に加 えられる。従って、適切な視覚指示薬又は着色剤の本発明の薬剤への結合に基づ く皮膚着色剤、マスカラ及び白くする歯磨き剤が調製される。 従って、本発明の主な目的は、進行性グリコシル化を受けたタンパク質又は他 の生物分子に特異的な結合モチーフを提供することである。 更に、本発明の目的は、診断、治療及び化粧品用を含む広範囲の用途を示す上 記の結合モチーフを含む薬剤を提供することである。 更に、本発明の目的は、抗菌タンパク質のＡＧＥ仲介阻害を逆転する方法を提 供することである。 更に、本発明の目的は、進行性グリコシル化終末産物に対するリゾチーム及び ラクトフェリンの結合親和性の発見と使用を特徴とする上記の方法を提供するこ とである。 更に、本発明の目的は、ＡＧＥを不活性化するためにリゾチーム及びラクトフ ェリンに見られるような親水性システインループの構造を有する分子を投与する ことによるＡＧＥ合併症の治療方法を提供することである。 更に、本発明の目的は、リゾチーム又はラクトフェリンを含む、リゾチーム及 びラクトフェリンに見られるような親水性システインループの構造を有する分子 又はその活性断片を投与してＡＧＥの除去を援助することによりＡＧＥの存在及 び活性が関係している病変を治療する方法を提供することである。 更に、本発明の目的は、リゾチーム及びラクトフェリンに見られるような親水 性システインループの構造を有する分子を含む医薬組成物を提供することである 。 更に、本発明の目的は、体内及び体外操作及び実施のどちらも可能な、血液の ような生物学的液体からＡＧＥ修飾分子を除去するための方法及び関連装置を提 供することである。 他の目的及び利点は、下記の図面に関して行われる次の説明の概説から当業者 に明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、ＡＧＥ−ＢＳＡのリゾチーム及びラクトフェリンへの結合を示すグラ フである。ＡＧＥ−ＢＳＡは、以前に記載されているように調製及び放射能標識 した(Vlassareら，1986，J．Exp．Med．164:1301)。メンドリ卵白リゾチーム及 び精製したヒトラクトフェリン(Sigma)をニトロセルロース膜上に３μg/ドット で固定化した。その膜を結合及び洗浄バッファー（０.０５％トゥイーン20，１ ×ＰＢＳ）中１％ＢＳＡで阻止し、１,０００,０００cpm 125I−ＡＧＥ−ＢＳＡ ／ドット(NEN，特異性; ２０００cpm/ngＢＳＡ)でブロットした。洗浄後、結合 した125I−ＡＧＥ−ＢＳＡをγ−カウンターで求めた。Ａ．リゾチーム及びラク トフェリンへのＡＧＥ−ＢＳＡ結合の飽和曲線。リゾチーム及びラクトフェリン のスキャッチャード分析により求めたＫdは、各々５及び３０×１０8 M である 。結果は、少なくとも３回の独立した実験の代表である。Ｂ．ＢＳＡ、ＡＧＥ− ＢＳＡ、ＡＧＥ−オボアルブミン、ＦＦＩ−Ｂ、グルコサミン、ヘパリン、フコ イダン、ケラタン、コンドロイチン及びポリグルタミン酸（約５０倍濃度）との ＬＺ及びＬＦへのＡＧＥ結合の競合。 図２は、ＡＧＥ−ＢＳＡがリゾチーム及びラクトフェリンの抗菌活性を阻害す ることを示すグラフである。Ａ．ＡＧＥ−ＢＳＡによるリゾチーム酵素活性の阻 害。異なる量のＡＧＥ−ＢＳＡによる組換えヒトリゾチーム(Sigma)の酵素活性 を、凍結乾燥したミクロコッカス・リソデイクチカス(Micrococcus lysodeiktic us)(ＡＴＣＣ 4698)の溶解物を推奨された条件(Sigma)下の比濁分析で測定する ことにより求めた。リゾチーム（４μg/ml）を指定した濃度のＡＧＥ−ＢＳＡ又 はＢＳＡを加えて又は加えずに１mlの基質（６６mMＫ2ＳＯ4バッファー、ｐＨ６ .２４中０.０１５％ミクロコッカス浮遊液）を加え、Ａ420を速度論的分析で求 めた。対数期（３分）のデータをここに示す。同様の結果が他の時点でも見られ た。Ｂ．ＡＧＥ−ＢＳＡは、ラクトフェリンによって誘導された細菌の凝集を阻 止する。ラクトフェリン（１５０μg）、ラクトフェリン＋ＡＧＥ−ＢＳＡ（１ ５０μg）又はラクトフェリン＋ＢＳＡ（１５０μg）を１mlのミクロコッカス浮 遊液（０.０１５％）に加え、ＯＤ700の濁度変化を直接測定することにより凝集 を求めた。凝集の逆反応を見るためにラクトフェリン凝集細菌浮 遊液にＡＧＥ−ＢＳＡを加えた。Ｃ及びＤ．リゾチーム及びラクトフェリンの細 菌活性のＡＧＥ−ＢＳＡ阻害。栄養ブイヨン(DIFCO)中２.５×１０5 CFU/mlの生 菌ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)(ＡＴＣＣ 9341)を指定した 濃度のリゾチーム又はラクトフェリン＋ＡＧＥ−ＢＳＡ、ＡＧＥ−オボアルブミ ン又はＢＳＡとインキュベートした。それらの条件の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を 、３０℃で１８時間インキュベートした後に可視化した細菌増殖で求めた。 図３は、リゾチームＡＧＥ結合ドメインの地図を示す図である。リゾチームを 以前に記載されたように臭化シアン（ＣｎＢｒ）又はヨードソ安息香酸塩（ＩＢ ｚｏ）で消化した(Mahoneyら，1979，Biochemistry 18:38100)。消化したペプチ ド及び無傷タンパク質を還元試料バッファーで希釈し、１５又は２５％ゲルによ るＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ニトロセルロース膜上に移し、１％ＢＳＡで阻止 し、125I−ＡＧＥ−ＢＳＡでプローブした。アミドブラック染色ニトロセルロー ス膜、リガンドブロットのオートラジオグラフ及び予想される消化地図を示す。 Ａ．ＣｎＢｒで消化したリゾチーム。Ｂ．ＩＢｚｏで消化したリゾチーム。Ｃ． 予想された消化地図及びＡＧＥ結合ドメイン。 図４は、ラクトフェリンＡＧＥ結合ドメインの地図を示す図である。ラクトフ ェリンの消化は、リゾチームについて図３に記載されるように行った（上記Maho ney ら）。アミドブラック染色ニトロセルロース膜、リガンドブロットのオート ラジオグラフ及び予想される消化地図を示す。Ａ．ＣｎＢｒで消化したラクトフ ェリン。Ｂ．Ｖ８プロテアーゼで消化したラクトフェリン。Ｃ．予想された消化 地図及びＡＧＥ結合ドメイン。 図５は、ＡＧＥ結合ドメイン内の共通ＡＧＥ結合システイン結合ループ（ＡＢ ＣＤモチーフ）の証明を示す図である。Ａ．リゾチーム及びラクトフェリンのＡ ＧＥ結合ドメイン内の共通ＣＸ15-16Ｃシステインループのタンパク質配列であ る。Ｂ．ホップ・ウッズ法（マックベクター４.０ソフトウェア，IBI,コネチカ ット州ニューヘブンで分析）を用いるそのペプチドの親水性分析。Ｃ．125I−Ａ ＧＥ−ＢＳＡリガンドドットブロット。リゾチーム（ＬＺ−Ｃｌ、配列番号７） 及びラクトフェリン（ＬＦ−Ｃｌ、配列番号８）のシステインループに対応する ペプチドを商業的に合成した(Bio-Synthesis，Inc.テキサス州ルイスビル）。Ｌ Ｚ、 ＬＺ−Ｃｌ、ＬＦ−Ｃｌ、関係のない２８アミノ酸ペプチド及びインスリンを還 元条件下で３０μg/ドットでニトロセルロース膜上に固定化した。その膜をＰＢ Ｓバッファー中１％ＢＳＡで阻止し、５０倍過剰量のＡＧＥ−ＢＳＡの存在（右 の欄）又は不在（左の欄）下で１時間１,０００,０００cpm 125I−ＡＧＥ−ＢＳ Ａでブロットした。オートラジオグラフを示す。 図６は、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡ系分析を用いるＡＧＥ−ＢＳＡの検出を示 す図である。分析プレート上に固定化したリゾチームは試料からのＡＧＥ−ＢＳ Ａを捕捉し、検出レベルは試料中のＡＧＥ−ＢＳＡ濃度に関係した。ニワトリリ ゾチームを２−メルカプトエタノールを加えて還元した。リゾチームをプレート に付着させ、ＡＧＥ−ＢＳＡを単独で或いは２％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、２％ ＢＳＡ又は０.２％ＢＳＡと共に加え、インキュベートした。２％ＮＧＳを含む バッファーで希釈した抗ＡＧＥモノクローナル抗体を加え、インキュベートした 。アルカリ性ホスファターゼ結合抗マウス抗体及びp-ニトロフェニルホスフェー トを用いてリゾチームに結合したＡＧＥの存在を検出した。 図７は、ＡＧＥ−ＢＳＡが結合しかつリゾチーム又はＢＳＡ誘導ビーズのクロ マトグラフィーカラムから溶離された量をU/ml（１単位をＡＧＥ−ＢＳＡ被覆プ レートに結合するα−ＡＧＥ抗体に対する正常ヒト血清の１：５希釈液の競合活 性として定義する）で示すグラフである。臭化シアン活性化セファローズ4Bビー ズをリゾチームで誘導し、対照カラムをＢＳＡ誘導ビーズを用いて設定した。カ ラムにＡＧＥ−ＢＳＡを充填し、十分に洗浄した。ＡＧＥ−ＢＳＡはカラムに結 合したままであった。リゾチームカラムからのＡＧＥ−ＢＳＡの個々の溶離は０ .１N ＮａＯＨを添加することにより達成された。 図８は、マクロファージによるＡＧＥ修飾分子の取込みを示すグラフであり、 リゾチームを標識ＡＧＥ−ＢＳＡを含む培養液に加えるとマクロファージによる ＡＧＥ−ＢＳＡの取込みの亢進がもたらされる。マウスマクロファージ細胞を、125 I標識リゾチーム、−ＢＳＡ又は−ＡＧＥ−ＢＳＡ及び５０倍過剰量の非標識 リゾチーム、ＡＧＥ−ＢＳＡ又は非標識リゾチームとＡＧＥ−ＢＳＡの両者と共 に培養した。細胞を３７℃で２時間インキュベートした後、洗浄した。細胞によ って取込まれた125I量をγ−カウンターで測定した。 発明の詳細な説明 本発明は、進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）に特異的な結合モチーフが 存在するという発見に関する。従って、その発見が加えられる診断及び治療使用 に関する。更に詳しくは、そのドメイン等を含むある種の抗菌タンパク質、特に リゾチーム及びラクトフェリンは、高親和性で進行性グリコシル化終末産物（Ａ ＧＥ）に結合し、その結合はそれらのタンパク質の抗菌性とかなり矛盾すると見 られてきた。従って、本発明は、高レベルのＡＧＥと関連がある疾患及び障害を 治療する方法及び関連材料と装置及び組成物に関する。本発明は、また、被検者 からの生物試料において直接にはＡＧＥを測定するか又は間接にはリゾチーム及 びラクトフェリンのような抗菌タンパク質の活性レベルを測定することによりＡ ＧＥ関連疾患又は障害に罹っている患者のＡＧＥ合併症の予後を決定する方法及 び関連材料と装置に関する。特定の理論又は仮定に制限されるものではないが、 高レベルのＡＧＥはかかる抗菌タンパク質の活性を阻害して個体が細菌感染症に 罹りやすくすると考えられる。 下記の用語は、本明細書に出現することができるという点で定義される。 “親水性システイン結合ループドメインをもつ分子”、“親水性ループドメイ ン”又は“モチーフ”という語又は他の構成上の変形は、２個以上のサブユニッ トアミノ酸、アミノ酸類縁体又はペプチド模擬体の化合物を意味する。サブユニ ットは、ペプチド結合で結合される。他の実施態様においては、サブユニットは 他の結合、例えば、エステル、エーテル等で結合される。本明細書で用いられる “アミノ酸”という語は、グリシン及びＤ又はＬ光学異性体の双方を含む天然及 び／又は非天然又は合成アミノ酸、及びアミノ酸類縁体及びペプチド模擬体を意 味する。本発明の分子は、Ｒ1Ｘａａ1ＸａａnＸａａ2Ｒ2に対応する構造を有す るように構築される。Ｘａａ1及びＸａａ2は、システイン又はグルタミン酸又は アスパラギン酸とリシンのような架橋結合を形成することができるアミノ酸であ る。特に、Ｘａａ1及びＸａａ2が各々システインである場合、システイン残基は ジスルフィド結合を形成するか又はそれを形成することができる。Ｒ1及びＲ2は 、独立してポリペプチド、Ｃ1〜Ｃ12アルキル基、アリール基、ヘテロアルキル 基、ヘテロアリール基又はハロゲンである。ＸａａnはＬ−又はＤ− アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である。下記の個々の実施態様においては、本 分子は１７又は１８Ｌ−アミノ酸を有するポリペプチド（Ｘａａ及びＸａａ2と 称するシステイン残基を含む）である。 本明細書で用いられる“抗菌タンパク質”は、殺菌活性、例えば、リゾチーム 及びラクトフェリンを有しかつシスチンを形成し他の１３〜１８残基を挟むシス テインを含む約１５〜約２０アミノ酸残基の親水性システインループを含むタン パク質を意味する。本発明の抗菌タンパク質の他の例としては、デフェンシン、 アズロシジン、好中球抗生物質及びセロプロシジンが含まれるがこれらに限定さ れない。かかるタンパク質は動物種、例えば、哺乳動物（ヒト、ウシ、ヒツジ、 ウマ、ヤギ、ブタ、ネコ、マウス、ラット等）、鳥類（ニワトリ等）又は他の供 給源由来とすることができる。 上記で定義された分子と関連して“親水性”という語は、分子全体の性質が極 性であることを意味し、分子は水溶性である。これは、分子のサブユニット、例 えば、極性官能基を含むアミノ酸残基に起因する。例えば、分子がポリペプチド である場合には、アミノ酸残基の選択はカチオン側鎖（アルギニン及びリシン） 、アニオン側鎖（アスパラギン酸及びグルタミン酸）及び中性極性側鎖（アスパ ラギン、グルタミン、セリン及びトレオニン）を含むものが挙げられる（例えば 、Cantor & Schimmel，BIOPHYSICAL CHEMISTRY PART I: The Conformation of B iological Macromolecules，W.H．Freeman & Company:サンフランシスコ，1980 ，pp.41-53参照）。 本明細書で用いられる“ＡＧＥ−”という語は、進行性グリコシル化終末産物 或いはＡＧＥを形成する化合物及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような修飾 された化合物の反応生成物として修飾する化合物を意味する。従って、ＡＧＥと しては、ＡＧＥ−タンパク質（例えば、ＢＳＡ−ＡＧＥ）、ＡＧＥ−脂質、ＡＧ Ｅ−ペプチド及びＡＧＥ−ＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。ＡＧＥ −ポリペプチド又はＡＧＥ−ペプチドは、ポリペプチド又はタンパク質をＡＧＥ と、例えば、ＡＧＥ−ペプチドか還元糖のような化合物、例えば、グルコースと ポリペプチド又はタンパク質が修飾されてＡＧＥ−ポリペプチド又はＡＧＥ−タ ンパク質を形成するまで反応させることにより生体外又は生体内で形成される。 本明細書で用いられる“グリコシレーション(グリコシル化)”という語は、Ａ ＧＥの形成をもたらす還元糖とヘモグロビン、脂質又はＤＮＡのようなポリペプ チド又はタンパク質上の求核基、特にアミン基との非酵素的反応を意味する。こ れらのプロセスは上記のように当該技術において周知である。最近、好まれてき た“グリケーション”という語は、非酵素的グリコシル化プロセスを意味する。 従って、本発明で特に定義された“グリコシレーション”と“グリケーション” いう語は等価である。 “Ａ”（“Ａ”は単ータンパク質、細胞等である）を含む組成物は、組成物中 少なくとも約７５重量％のタンパク質（ＡとＢが属する種の部門に左右される） が“Ａ”である場合に実質的に“Ｂ”（”Ｂ”は１個以上の混入タンパク質、細 胞等を含む）を含まない。“Ａ”は、組成物中に好ましくは少なくとも約９０重 量％のＡ＋Ｂの物質、最も好ましくは少なくとも約９９重量％を含む。また、実 質的に混入のない組成物は問題の物質の活性又は特性をもつ単一の分子量物質の み含むことが好ましい。 “薬学的に許容しうる”という語は、ヒトに投与される場合に生理的に許容で きかつ胃の不調、めまい等のアレルギー又は類似の都合の悪い反応を典型的には 生じない分子の物質及び組成物を意味する。好ましくは、“薬学的に許容しうる ”という語は、連邦政府又は州政府の調整機関によって認可されたか又は米国薬 局方又は動物、詳しくはヒトに有用な他の一般に認知された薬物に挙げられてい ることを意味する。“薬学的に許容しうる担体”という語は、化合物が投与され る希釈剤、アジュバント、賦形剤又は伝達体を意味する。かかる医薬担体は、水 のような滅菌液体及び落花生油、大豆油、鉱油、ごま油等の石油、動物、植物又 は合成起原のものを含む油であることができる。水又は食塩水及びデキストロー ス及びグリセロール水溶液を担体として、特に注射液として用いることが好まし い。適切な医薬担体は、E.W．Martinによる“Remington's Pharmaceutical Scie nces”に記載されている。 本明細書で用いられる“治療上有効な量”という語は、宿主の活性、機能及び 応答の臨床上有意な損失を少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも５０％、 更に好ましくは少なくとも９０％減少させるのに十分な量、最も好ましくは予防 するのに十分な量を意味する。また、治療上有効な量は、宿主において臨床上有 意な病態の改善を引き起こすのに十分な量である。 上述したように、本発明は、主要な内在性抗菌タンパク質のリゾチーム及びラ クトフェリンがグルコース修飾タンパク質（ＡＧＥ）に高親和性で結合するとい う発見に一部基づくものである。本発明は、更に、ＡＧＥ結合がリゾチームの酵 素活性及び殺菌活性を阻害しかつラクトフェリンにより誘導された細菌凝集及び 細菌死滅を阻止又は逆転するという所見に基づくものである。 本発明は、更に、リゾチーム及びラクトフェリンの双方並びに他の抗菌タンパ ク質に存在する保存ドメインがＡＧＥへの結合を仲介するという発見に基づくも のである。そのドメインは、共通１７〜１８アミノ酸親水性システインループ構 造を有する。リゾチーム及びラクトフェリンに対応するシステイン結合ループは 、合成で調製され、それらのペプチドはＡＧＥ結合活性を示した。 それらのデータから親水性システイン結合ループ、好ましくは１７〜１８アミ ノ酸の構造を含む分子がその親水性システインループを含む抗菌タンパク質のＡ ＧＥ仲介不活性化を阻害するために用いられることが示される。。更に、かかる 分子は、試料中のＡＧＥの存在を検出するために、ＡＧＥ修飾分子又は組織に対 する種々の標識を標的にするために、試料からＡＧＥを分離するために（例えば 、透析で）及びＡＧＥの架橋活性を阻止するために用いられる。 特に、リゾチームがグルコース修飾タンパク質、即ち、進行性グリコシル化終 末産物（ＡＧＥ）をもつものに高親和性で結合することがわかった。ＡＧＥ−Ｂ ＳＡは、リゾチームの酵素活性及び殺菌活性を阻害し、ＡＧＥ結合ラクトフェリ ンによって誘導された細菌凝集及び細菌死滅を阻止又は逆転する。タンパク質分 解消化によるマッピングからリゾチーム内の単一ＡＧＥ結合ドメイン及びラクト フェリン内の２つのＡＧＥ結合ドメインがわかった。これらのドメイン内に共通 １７〜１８アミノ酸親水性システインループ（ＣＸ15-16Ｃ）が見られ、ＡＧＥ 結合システイン結合ドメイン又は“ＡＢＣＤ”モチーフと名付けられた。リゾチ ーム及びラクトフェリンの合成システイン結合ループドメインはＡＧＥ結合活性 を示した。同様のループも殺菌タンパク質の他の一部に存在する。本明細書で後 に述べられるように、糖尿病患者の組織及び血清中高レベルのＡＧＥがその保存 モチーフに結合することにより内在性抗菌タンパク質を阻害して細菌感染症に対 する罹病性を亢進すると想定される。 本発明をより完全に理解するために、明細書を本発明の種々の態様、及び治療 及び診断に関する項に分ける。 親水性ループドメインを含む分子 本発明によれば、ＡＧＥに結合する、親水性ループ構造ドメインを有する分子 が調製及び使用される。下記の個々の実施態様においては、図５Ａに示されたア ミノ酸配列を有するポリペプチド（配列番号７、配列番号８及び配列番号９）が 調製される。それらのポリペプチドは、ＡＧＥに結合することが実験的に見られ る。ペプチド又はペプチド類縁体（即ち、非ペプチジル結合を含む分子、天然に 存在しないアミノ酸等であるが、ペプチドの類似構造、物理的性質及び化学的性 質をもつもの）は、例えば、周知の及び高度に開発された固相縮合化学を用いて 合成で調製される。従って、本分子はＬ−又はＤ−アミノ酸、ポリエステル及び ポリエーテル、アミノ酸類縁体、非古典的なアミノ酸、ペプチド模擬体等から調 製される(Lamら，国際出願第92/00252号参照、この明細書の記載は本願明細書に 含まれるものとする)。 本発明は、他の親水性ポリペプチドループドメイン、例えば、ジスルフィド、 ラクタム、ラクトン又は他の閉環部分で形成されたループに関する。即ち、かか る分子のスペーサー親水性サブユニットは架橋することができる化学官能基を与 えるサブユニット、例えば、アミノ酸で挟まれ、架橋を形成する処理後にペプチ ドを環化する。環化は、回転誘導アミノ酸が組込まれる場合に容易になる。ペプ チドを架橋することができるアミノ酸の例は、ジスルフィドを形成するシステイ ン、ラクトン又はラクタムを形成するアスパラギン酸、ε−アミノ／γ−（又は β−）酸アミドを形成するリシンとグルタミン酸又はアスパラギン酸、及び遷移 金属をキレート化し架橋を形成するγ−カルボキシルグルタミン酸（Ｇｌａ）(B achem)のようなキレート剤である。保護γ- カルボキシルグルタミン酸は、Zee- Cheng & Olson(1980，Biophys．Biochem．Res．Commun．94:1128-1132)に記載さ れた合成を変更することによって調製される。ペプチド配列が架橋することがで きる２つのアミノ酸を含むペプチドは、例えば、ジスルフィド（システイン） を形成するためにシステイン残基を酸化するか又はキレートを形成するために金 属イオンを添加することにより処理され、ペプチドを架橋及び環化して親水性ル ープを形成する。 ＡＧＥに結合することが本明細書で同定されたペプチドに基づいて本発明の分 子の一般構造モチーフが求められる。タンパク質の構造上の特徴を、例えば、Ｘ 線結晶学、中性子回折、核磁気共鳴分光測定及び構造決定用の他の手法を用いて 求めることにより拮抗剤の同定及びスクリーニングが容易になる。本発明の親水 性システインループドメインの構造は、当該技術において既知のさまざまな方法 によって分析される。構造分析は、一部には、他の既知のタンパク質との配列類 似性を同定することにより行われる。類似性（又は相同性）の程度は、ループの 構造及び機能を予想する基準を与えることができる。 例えば、配列の比較は、FAST &FASTP プログラム(Pearson & Lipman，1988，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 85:2444-48)を用いて遺伝子バンクに見られる配列 で行われる。本明細書で行われたように、親水性システインループ構造の候補ポ リペプチドは親水性分析により更に確認されなければならない（例えば、Hopp & Woods，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78:3824）。親水性プロファイル は、候補ポリペプチドの配列が親水性であることを確認するために用いられる。 また、操作、翻訳及び二次構造の予想並びにオープンリーディングフレームの予 想及びプロッティングは、当該技術において利用できるコンピュータソフトウェ アプログラムを用いて達成される。本発明は、更に、親水性ループドメインの定 量的構造決定を企図する。詳しくは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、赤外線（ＩＲ）、 ラマン及び紫外線（ＵＶ）、特に円（偏光）二色性（ＣＤ）分光分析は、親水性 ループの構造も確認するために用いられる。特に、ＮＭＲは溶液中の分子の極め て有力な構造分析を与え、未変性環境に更に密接に近似する(Marionら，1983，B iochem．Biophys．Res．Comm．113:967-974; Bar ら，1985，J．Magn．Reson.65 :355-360; Kimuraら，1980，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．77:1681-1685)。 他の構造分析方法も用いられる。それらは、Ｘ線結晶学が含まれるがそれに限定 されない(Engstom，A.，1974，Biochem．Exp．Biol．11:7-13)。更に好ましくは 、親水性ループとＡＧＥの共結晶が実験される。共結晶の分析は、結合について 詳 細な情報を与え、リゾチーム及びラクトフェリン等に見られる親水性システイン ループの類縁体の合理的設計を可能にする。コンピュータモデル化も特にＮＭＲ 又はＸ線の方法に関連して用いられる(Fletterick，R．& Zoller，M．(eds.)，1 986，Computer Graphics and Molecular Modeling，Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory,コールドスプリングハー バー，ニューヨーク)。 また、リゾチーム及びラクトフェリンを含む本発明のペプチド又はポリペプチ ド分子は、組換えで作製される。ポリペプチド又はタンパク質は、適合する細胞 コロニーで発現される。従って、本発明のその態様によれば、当該技術の範囲内 で慣用の分子生物学及び組換えＤＮＡ技術が用いられる。かかる技術は、文献に 詳細に説明されている。例えば、Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cl oning: A Laborarory Manual，Sec．eds．（1989）Cold Spring Harbor Laborat ory Press，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク(本明細書では“Sambro okら，1989”); DNA Cloning: A Practical Approach，vol．I & II(D.N.Glover ed．1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J．Gait ed．1984); Nucleic Acid Hybridization[B.D．Harnes & S.J．Higgins eds．(1985)]; Transcription And Translation[B.D．Harnes & S.J．Higgins，eds．(1984)]; Animal Cell Cultu re[R.I．Freshney，ed．(1986)]; Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press， (1986)]; B．Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)参照。 ＤＮＡ“コード配列”は、適切な調節配列の制御下に置かれると生体外又は生 体内の細胞内でポリペプチドに転写及び翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コ ード配列の境界は、５′（アミノ）末端の出発コドン及び３′（カルボキシル） 末端の翻訳停止コドンで求められる。コード配列としては、原核配列、真核ｍＲ ＮＡからのｃＤＮＡ、真核（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列 及び合成ＤＮＡ配列さえも含まれるがこれらに限定されない。コード配列が真核 細胞内で発現するものである場合には、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配 列は、通常、コード配列までの３′に位置する。抗菌タンパク質、特に、リゾチ ーム、ラクトフェリン、デフェンシン、アズロシジン、好中球抗生物質及びセロ プロシジンの多くのコード配列が当該技術において既知である(Gabayら，1993， Opin．Immunol．5:97; Leherら，Annu．Rev．Immunol．11:105)。 転写及び翻訳制御配列は、宿主細胞内でコード配列を発現するプロモーター、 エンハンサー、ターミネーターらのＤＮＡ調節配列である。真核細胞では、ポリ アデニル化シグナルが制御配列である。 治療法及び組成物 親水性システインループドメインは生体内進行性グリコシル化終末産物の認識 に役割を果たしていると考えられかつその除去とも関係することができるので、 本発明は活性断片、その模擬体及び同族分子又は同族体分子を含む親水性システ インループドメインの構造を有する分子の治療上の適用を企図する。従って、親 水性システインループ構造を含む本発明の分子は、たいていの場合、生体内ＡＧ Ｅの抗生物質タンパク質阻害活性、架橋活性及び濃度さえも低下させるのに援助 するために治療のためのさまざまな場面での投与に調製される。 多くの治療製剤が可能であり、本発明はその範囲内でそのような態様を全て企 図する。さまざまな投与法が用いられ、特に、軟膏、クリーム、ゲル及びローシ ョンでのような局所適用は創傷又はびらんに直接又は外科用スポンジ、包帯、ガ ーゼパッド等の手術用及び他の局所用品に塗布される。かかる局所用医薬組成物 は、ＡＧＥの抗菌タンパク質阻害活性が治療過程を遅らせるのに関係している糖 尿病性潰瘍の治療に特に使用される。また、かかる組成物は皮下、静脈内及び腹 腔内注射、カテーテル挿入等の非経口方法によって投与される。 対応する治療効用は、親水性ループ構造を含む本分子、その活性断片、模擬体 、同族体及び同族分子の進行性グリコシル化終末産物に対して証明された活性を 利用する。従って、ＡＧＥの生体内認識及び除去が過剰濃度での存在に起因する 病気を治療するのに役立つ程度まで本分子の投与は有効な治療法を含んでいる。 特に、本分子はＡＧＥ蓄積の濃縮物を局在しかつその検出及び除去を高めるのに 役立つことができる。糖尿病を合併した又はしないアテローム性動脈硬化症、糖 尿病性ネフロパシー、腎不全等の病態は本発明の治療法の実施により治療及び／ 又は嫌忌される。個々の戦略は、ＡＧＥペプチドをオプソニン作用させて生体内 クリアランス及び除去を促進する能力を必要とする。 確実な治療成果に効果的な活性剤の平均量は、個体間で異なってよく、特に、 資格のある医師又は獣医師の推奨及び処方によらなければない。具体的な投薬用 量は約２５mg/kg/日までである。 親水性ループドメインを有する分子、その断片、模擬体、同族体及び同族分子 は上記で定義された薬学的に許容しうる担体との医薬組成物として治療上有効な 濃度で調製される。好ましくは、上記の担体は局所投与に適切である。他の適合 する医薬剤もおそらく含まれるので、例えば、ある種の薬剤が同時に投与される 。好ましい態様においては、ＡＧＥ形成阻害剤が該分子と投与されて同時にＡＧ Ｅの除去を誘導し新たなＡＧＥの形成を阻害する。 従って、本発明は、親水性ループドメイン及びグリコシル化後工程、即ち、そ の存在がグリコシル化の不利な続発症と関連がありかつそれをまねく蛍光又は架 橋発色団の形成を阻止する薬剤を投与することを提供する。理想的な薬剤は、発 色団の形成並びにタンパク質のタンパク質への会合架橋及びタンパク質の他のタ ンパク質上への捕捉を防止する。理想的な薬剤は、ＡＧＥ関連病変の直接原因で ある末期進行性グリコシル化終末産物の形成をまねく長期グリコシル化反応を予 防又は阻害する。 ＡＧＥの形成のインヒビターとしては、初期グリコシル化産物のカルボニル部 分と反応する化合物が含まれる。代表的な進行性グリコシル化インヒビターは、 アミノグアニジン、リシン及びα−ヒドラジノヒスチジンである。個々の実施態 様においては、インヒビターはアミノグアニジン（ＡＧ）及びその誘導体である 。ＡＧ及びその誘導体を含む医薬組成物及び方法は周知であり、1988年７月19日 発行の米国特許第 4,758,583号；1990年３月13日発行の同第 4,908,446号；1991 年１月８日発行の同第 4,983,604号；1992年３月31日発行の同第 5,100,919号； 1992年４月21日発行の同第 5,106,877号；1992年５月19日発行の同第 5,114,943 号；1992年７月７日発行の同第 5,128,360号；1992年７月14日発行の同第5,130, 324号；1992年７月14日発行の同第 5,130,337号；1992年８月11日発行の同第 5, 137,916号；1992年８月18日発行の同第 5,140,048号；1992年12月29日発行の同 第 5,175,192号；1993年６月８日発行の同第 5,218,001号；1993年６月22日発行 の同第 5,221,683号；1993年８月24日発行の同第 5,238,963号；1993年９ 月７日発行の同第 5,243,071号及び1993年10月19日発行の同第 5,254,593号に記 載されている。他のＡＧＥ形成インヒビターは、1991年２月８日に出願された米 国出願第07/652,575号；1991年５月27日に出願された同第07/889,141号；1992年 ５月15日に出願された同第07/896,854号；1992年12月８日に出願された同第07/9 86,661号；1992年12月８日に出願された同第07/986,662号；1993年３月５日に出 願された同第08/027,086号及び1993年７月20日に出願された同第08/095,095号に 記載されている。上記特許と特許出願の明細書の各々の記載は本願明細書に含ま れるものとする。 本発明の他の重要な態様は、生体内試料からのＡＧＥを分離して毒性ＡＧＥを 除去するための親水性ループドメインを有する分子、その断片、模擬体、同族体 及び同族分子の使用である。即ち、本発明の分子は血液からＡＧＥを取り除くた めに、例えば、透析に用いられる。本発明の個々の利点は、かかる分子が抗菌性 、例えばリゾチーム又はラクトフェリンをもつ場合に防腐剤特性を透析手順に本 質的に寄与することである。従って、１実施態様においては、本発明の分子は血 液からのＡＧＥに結合しかつそれを除去するために膜、例えば、透析膜上に固定 化される。 他の実施態様においては、本発明は生物試料からＡＧＥを吸着する装置を提供 する。該装置は、ＡＧＥ透過性膜から作られる密閉構造を含んでいる。本発明の 分子が不可逆的に結合又は固定化される粒子がかかる装置内に配置される。個々 の実施態様においては、装置はティーバッグを形成すると共にＡＧＥに結合する ことができる粒子が入っている“ティーバッグ”配置が企図される。ポリプロピ レンメッシュで作られた同様の装置が Houghten，1985，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 82:5131-5135及び米国特許第 4,631,211号に記載されている。かかる装置 は、ＡＧＥの除去が所望される被検者に生体外で用いられるか又は生体内に移植 される。 本発明に従って調製される個々の装置は、血液からＡＧＥを間接的に除去する 腹膜透析の実施と共に用いられる。背景として、腹膜透析は末期腎疾患（ＥＳＲ Ｄ）のような腎不全の合併症に罹っている患者に投与される１つの治療形態であ る。詳しくは、腹膜透析はグルコース（デキストロース）を含む透析物溶液を腹 腔に導入して毒性廃物と過剰液を血液からかかる溶液に腹膜前後の拡散によって 移動させることを進めることにより進行する。浸透限外ろ過は、増加濃度のグル コースを透析物溶液に加えて血液及び組織からの水を透析物に引き出すことによ り達成される。腹膜透析は、血液透析の場合のように膜孔サイズ制限によって妨 げられず、しばしばタンパク質のような大きな分子が輸送される。 持続的外来腹膜透析（ＣＡＰＤ）として既知の個々の種類の腹膜透析は、最近 、ＥＳＲＤをもつ患者を治療するように開発された。ＣＡＰＤでは、透析物溶液 が折りたたみ式プラスチックバッグから腹腔に注入され、排出される前のある期 間残留するものである。 腹腔透析、ＥＳＲＤによって治療される基礎病態は特に糖尿病の進行に起因す る続発症及び合併症である。また、糖尿病は、最近、非酵素的反応がグルコース と構造タンパク質間に生じ（グリケーション又は非酵素的グリコシル化）、血糖 及び／又はインスリンの不調に対して二次的な合併症の罹患及び程度の促進に劇 的に作用するという仮説の見地から探究されてきた。更に詳しくは、過去１０年 間に進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）が広範囲に研究され、ＡＧＥの形成 が種々の糖尿病性病態及び続発症の進行及び程度の主な要因であるという仮説を 生じた。 腹膜透析の実施に有用な装置としては、グルコース溶液のような透析物を腹腔 に導入及び送達するために患者の腹膜に移植するためのカテーテル器具が含まれ る。ＡＧＥを含むグルコースとタンパク質の自発的反応経路と関連がある又はそ の産物を含む有害な分子の分離と除去の手段は、カテーテル器具と共に含まれ、 腹腔隙登録に配置される。かかる手段としては、ＡＧＥ修飾分子、特に、ＡＧＥ −ペプチド及びＡＧＥ−タンパク質のような低分子量分子に特異性をもつ１種以 上の吸着剤又は結合パートナー、特に、追加治療として患者からＡＧＥ調節剤又 はＡＧＥ修飾分子を除去することを容易にする複合体を形成することができるか かる薬剤及びパートナーを提示又は表示するように修飾されたマトリックスが含 まれる。腎臓によるクリアランス機序が急性又は慢性に妥協する場合には血液中 に蓄積する他の毒性と同様に循環低分子量ＡＧＥが正常な生理過程によって腹腔 隙に移るために、かかるＡＧＥを腹腔隙から除去する手段は患者に有益な結果を もって循環ＡＧＥの濃度を“間接に”低下させる。 “結合パートナー”という語は、一般的には、特定の吸着剤、抗原に対する吸 着剤又は結合拮抗剤、例えば、抗体及び他の細胞結合タンパク質又は抗原のレセ プターであることを意味する。上記の拮抗剤は組成物で異なってもよい。ＡＧＥ 結合パートナーの場合には、抗原はＡＧＥ及び同様に所望されない初期グリケー ション産物であり、かかる反応性グリケーション中間体、グリケーション付加物 及び架橋物は見られないか又はペプチド、分子及び細胞上に見られる。結合パー トナーとしては、ＡＧＥのレセプターとして機能するか又はかかる分子のＡＧＥ 認識ドメインを含む材料及びＡＧＥ−タンパク質及び−ペプチドを結合すること ができる抗ＡＧＥ抗体（無傷又は高濃度でＡＧＥ認識ドメインを与えるために切 断及び／又は精製した）、活性木炭、ホウ酸のような特定の荷電基等の材料が含 まれる。 結合パートナーは、結合したリガンドを除去して反復使用の分離手段を回復さ せるために腹腔から回収した後に処理することができるものである。適切な結合 パートナーとしては上記の材料が含まれ、更に限定しない例として本明細書の発 明者の一人による同時係属出願第08/418,642号に示されたような薬剤が含まれ、 従って、親水性ループドメインを有する分子、その断片、模擬体、同族体及び同 族分子のような１種以上の材料の使用が含まれる。更に、かかる分子が抗菌性、 例えば、リゾチーム又はラクトフェリンをもつ場合には透析手順に対して防腐剤 特性を本質的に寄与するので有利である。 更に詳しくは、本発明の透析装置は、カテーテル器具が含まれ、分離及び除去 の手段が該カテーテル内に配置される分離フィラメント又はチューブを含み、腹 膜登録の中に望遠鏡で移動及び拡張すると共に該カテーテルが移植されている間 に吸引するのに用いられる。フィラメント又はチューブは結合パートナーで被覆 又は含浸される。分離手段は透析中の取り替え及び／又は回復のために伸長及び 回収され、生体内ＡＧＥの濃度を低下させることを求めることにより患者に対し て補助治療を与える。 適切な薬剤としては、抗体を含むＡＧＥに対する結合パートナーの全ての方法 及び他の拮抗剤も含まれる。分離手段は、結合パートナーをもつか又は含むビー ズ又はペレットのようなペレット化媒体又は微粒子媒体を用いることができる。 かかる場合には、微粒子材料は半透性のチューブ又は袋のような容器に入れられ るか又は“じゅずつなぎのビーズ”列の１以上のフィラメントによって相互に連 結される。チューブ、袋又は列は、腹膜の周囲の液体にカテーテルの末端を超え て挿入することができる。かかる実施態様においては、容器、列及び微粒子材料 は、標的リガンドのサイズに適合する大きさにされて容器が後に腹腔から回収さ れる場合にリガンドの結合と容器内での保持が確かめられる。 他の実施態様においては、分離手段は非毒性非生分解性半透性材料から調製さ れた複数の小胞及びその中にコーティング及び／又は液体形態で供給された結合 パートナーの量を含むか又は用いることができる。小胞は、種々の分子量のＡＧ Ｅ、ＡＧＥ−タンパク質及びＡＧＥ−ペプチドの進入を可能にするために多孔性 である。 本発明の小胞又はペレットの調製方法は、有機層分離法が好ましい数種の手法 によって達成される。その方法では、非生分解性小胞を形成するポリマーを適切 な溶媒に溶解して溶液を形成する。結合パートナーが同様に適切な溶媒で調製さ れ、得られた溶液を攪拌しながらポリマー溶液に加えて分散液を生成する。その 後、溶媒をポリマー溶媒と混ざるがポリマーの溶媒ではなくかつ同様に結合パー トナー溶液又は分散液と混ざらない分散液に加える。これによりポリマーが結合 パートナーを含む小胞を形成する間に相分離が生じる。また、小胞を溶液に浸漬 した後に乾燥するるようなコーティングによって結合パートナーが小胞内に取込 まれる。また、結合パートナーがまず半透性中空ファイバー内に配置される場合 には加熱密閉処理が用いられる。ファイバーは、小さなＡＧＥ修飾ペプチドは入 るが大きなＡＧＥ結合パートナーは中空コアを出ることができないことを行わせ る方法で、例えば、ポリカーボネート樹脂から調製される。その手順は、結合パ ートナーが木炭の場合のように固体微粒子形である場合に有効である。 別の実施態様においては、分離手段は、ロッド又はファイバーを腹腔に押し込 んで用いられると外へ放射状に拡張するために用いられる複数の小繊維を末端に 配置した可撓性ロッド、テープ又はファイバーのようなフィラメント構造を含む ことができる。かかるファイバー及びその付随した小繊維は本発明の結合パート ナーで被覆されるか又はそれと結合されて最大表面積及び付随する分離効率が達 成される。従って、カテーテル器具は、透析中に液体を通さない相互適合を得る ために隣接の体組織又は内在カテーテルにつなぎ止めるカフス又は支持体を用い ることができる。かかるカフスは、本発明の結合パートナーで被覆されてその面 に存在することができる望ましくないＡＧＥ分子を固定化する。 本発明の利点は、腎臓以外の組織及び臓器系に対する二次的な合併症及び腎疾 患及び／又は妥協した腎不全と共に生じる病理生理学的応答を含むがこれらに限 定されない腎疾患の程度を悪化及び促進するＡＧＥ分子を除去するために病態の 管理において患者を援助しつつ治療を施す能力にある。本発明の概念は、進行中 に維持される装置及び周期的に及び間欠的に施される装置を含む透析装置の全て の方法で包含することを企図する。 診断法 １態様においては、本発明は、高レベルのＡＧＥ及びその合併症誘導体に罹っ ていると考えられる被検者、好ましくはヒトにおける内在性抗菌タンパク質の殺 菌活性のレベルの検出に関する。特に、かかる個体からの試料はリゾチーム又は ラクトフェリン又はその両者が試験される。初期の個体又は正常な個体に比べた 抗菌活性のレベルの低下は、ＡＧＥによる抗菌タンパク質の阻害を表すことがで きる。かかる診断は、高レベルのＡＧＥを検出することにより間接に確認される 。内在性抗菌タンパク質殺菌活性のレベルの低下は、細菌感染症に対する罹病性 の大きい予後となる。 抗菌タンパク質の殺菌活性レベルの検出に適切な試料は、唾液、粘膜（例えば 、鼻及び肺）、粘液質、創傷滲出液及び感染したびらん滲出液並びに血液、血漿 、尿、脳脊髄液、リンパ液及び組織より選ばれる。 本発明の抗菌タンパク質に結合することができるリガンドとしては、下記のよ うに調製されたＡＧＥ−ＢＳＡ及びＯＶＡ−ＡＧＥ及び配合物ＦＦＩとＡＦＧＰ 、別個のもの及びタンパク質アルブミンのようなキャリヤータンパク質に結合さ れたものが挙げられるがこれらに限定されない。キャリヤーは、炭水化物、タン パク質、合成ポリペプチド、脂質、生物適合性天然及び合成樹脂、抗原及びその 混合物からなる群より選ばれる。 本発明は、ＡＧＥ関連続発症の予後を診断又は決定すること、ＡＧＥ関連疾患 又は障害の進行又は治療の過程を監視すること、又はＡＧＥ関連疾患又は障害の 治療を監視するためのものである。動物における動脈の老齢関連又は糖尿病関連 の硬化、皮膚のしわ、動脈閉塞、及び糖尿病性網膜及び腎損傷のような病態は全 て進行性グリコシル化終末産物の量の増加として生じる過度の蓄積又は捕捉に起 因する。従って、本発明の診断法は、抗菌タンパク質の殺菌活性の量レベルを監 視することにより体内の進行性グリコシル化終末産物の蓄積によって少なくとも 部分的に引き起こされた病変を予防するためのものである。 他の実施態様においては、本発明の分子は、例えば、Bucalaの“生体内進行性 グリコシル化終末産物の免疫学的検出法”と称する1992年10月１日に出願された 米国特許出願第07/956,849号に記載された抗ＡＧＥ抗体の補助剤として又はその 代わりに試料中のＡＧＥの存在又はレベルを検出するために用いられ、その明細 書の記載は本願明細書に含まれるものとする。 従って、親水性ループドメインを有する分子、その断片、模擬体、同族体及び 同族分子と調製される結合パートナーの両者は、例えば、標識されないか又は標 識される場合には放射能付加、水素化ホウ素ナトリウムによる還元或いは125Iで 標識されるＡＧＥに対するレセプター又は他のリガンドを用いてラジオイムノア ッセイのような免疫分析を含む種々の診断法と関連して使用することができる。 それらの一般的手順及び応用は全て、当業者によく知られており、本発明の範囲 内で用いられる手順を説明し限定しないものとして本明細書に示される。“競合 的”法、手順Ａは米国特許第 3,654,090号及び同第 3,850,752号に記載されてい る。任意の手順Ｃ、“サンドイッチ”法は米国特許第RE31,006号及び同第4,016, 043 号に記載されており、任意の手順Ｄは“二重抗体”又は“ＤＡＳＰ”法とし て既知である。 本発明の分子を用いてＡＧＥの存在及び場合によっては量を検出する種々の分 析方式も本発明によって企図される。例えば、直接“サンドイッチ”型ＥＬＩＳ Ａが行われる。ＡＧＥの存在及び場合によっては量を検出するニトロセルロース のような固体支持体に試料からのタンパク質全てを、例えば、エレクトロブロッ ティングによってブロットされるブロット方式も本発明によって企図される。下 記の個々の実施態様においては、試料中の親水性ループ含有ペプチドをニトロセ ルロースにブロッティンク化た後に標識ＡＧＥを用いてＡＧＥが検出される。 本発明は、進行性グリコシル化終末産物の程度の定量的分析用試験キットの形 で調製される分析系を包含する。その系又は試験キットは、本明細書に示される 抗体又はリガンドのような本明細書に述べられる放射性及び／又は酵素的手法の １種によって調製された標識成分；及び少なくとも１種が標識成分、その結合パ ートナー、１つの求められるべき成分或いはその結合パートナーと結合すること ができる１種以上の追加の免疫化学試薬を含む。 本発明の他の実施態様においては、ＡＧＥの有無を求めるために医療の専門家 に適切な市販の試験キットが調製される。かかるキットは、試料中のＡＧＥの量 を求めるために用いられる。上記試験法によれば、かかるキットの１種類は親水 性ループドメインを有する少なくとも標識された分子、その断片、模擬体、同族 体又は同族分子を含み、“競合的”、“サンドイッチ型”、“ＤＡＳＰ”等の使 用方法によって説明書が含まれる。キットは、バッファー、安定剤等の周辺的試 薬も含むことができる。 従って、試験キットは、下記の成分を含むＡＧＥの存在及び活性を証明するた めに調製される。 （ａ）親水性ループドメインを有する分子、その断片、模擬体及び同族分子を検 出可能な標識に直接又は間接に結合させることにより得られた少なくとも１種の 標識した化学的反応性成分の所定量； （ｂ）他の試薬；及び （ｃ）前記キットの使用説明書。 本明細書に記載されたプロトコールの全てがＡＧＥの定性的及び定量的分析及 び進行性グリコシル化終末産物の付着が関係している病変の付随する診断及び監 視に用いられる。糖尿病のような症状及びアテローム性動脈硬化及び皮膚のしわ のような老化に関連がある症状は限定されない例を表し、従って、それらの症状 を診断及び監視する方法は本発明の範囲内に包含される。 本発明の分子の診断使用は、同様の能力で働くことができる物質を同定する薬 剤発見分析の一部としての使用に関する。 例えば、本分子は、ＡＧＥ修飾タンパク質及びペプチドを捕捉するための抗Ａ ＧＥ抗体と同様の方法の結合パートナーとして及びアルツハイマー病及びスクラ ピーに罹っている患者に見られるようなＡＧＥ含有プラークの画像分析の補助剤 として用いられる。 本発明は、厳密でない診断又は治療のためのさまざまな使用を企図する。例え ば、本分子のＡＧＥに対する親和性から、着色剤等に結合された本分子を含むパ ーソナルケア用品及び化粧品の製剤での使用が推奨される。かかる製品は、フェ イシャル及びアイメーキャップ、顔又は体を日焼け色にする溶液及び白くする歯 磨き剤として用いられる。 本発明は、下記の実施例及びデータを考慮することからより理解されるであろ う。 実施例１ 感染症の糖尿病関連の罹病性が高いという機序は、不明である。リゾチーム及 びラクトフェリンは、唾液、鼻の分泌物、粘液並びに好中球及びマクロファージ のリソソームに存在する２つの主要な非相同内在性抗菌タンパク質である(Phili ps，Sci．Am．215:78; Anderson ら，1992，Nature 344:784; Reiterら，1969， Nature 216:643; Tenovuら，1991，Proc．Finn．Dent．Sco．87:197)。我々は、 高レベルのＡＧＥが糖尿病患者におけるある種の正常な宿主の防御機序の抑制を 仲介することができると仮定する。下記の実施例は、時間依存方式でＢＳＡ−Ａ ＧＥに結合して抗菌タンパク質のＡＧＥ仲介阻害を逆転する有望な手段を与える リゾチーム及びラクトフェリンの能力を示すものである。 プローブとして125I標識グルコース修飾ウシ血清アルブミン（ＡＧＥ−ＢＳＡ ）を用いて、ニワトリリゾチームと組換えヒトリゾチームがウェスタンリガンド ブロットによりＡＧＥ特異的結合活性を示すことがわかった（図１）。以前に示 されたウシラクトフェリンと同様に(Shmidら，1992，J．Bio．Chem．267:14987) 、ヒトラクトフェリンもＡＧＥ−ＢＳＡに結合する。４℃におけるＡＧＥ−ＢＳ Ａのリゾチーム及びラクトフェリン両者への結合は、明らかに時間依存性であり 、３０分でプラトーに達する（図１Ａ）。結合は、増加濃度の125I−ＡＧＥ−Ｂ ＳＡリガンドで飽和可能である（図１Ａ）。解離定数（Ｋd）計算値はリゾチー ム について５×１０-8M、ラクトフェリンについて２５×１０-8M である。ＡＧＥ −ＢＳＡとリゾチーム又はラクトフェリン間の結合は、結合が他のＡＧＥ修飾タ ンパク質で拮抗されるが非グリコシル化担体タンパク質、グルコース、アマドリ 産物、グルコサミン又はポリアニオン／ポリカチオン分子によって拮抗されない のでＡＧＥ特異的非共有相互作用である（図１Ｂ）。 リゾチームは、細菌細胞壁のペプチドグリカン骨格を含むＮ−アセチルグルコ サミンとＮ−アセチルムリメート間の１〜４β結合の特異的切断によってグラム 陽性菌及び多少のグラム陰性菌を溶解する(Philips，Sci．Am．215:78)。基質と して凍結乾燥ミクロコッカス・リソデイクチカス(Micrococcus lysodeikticus) を用いることにより、ＡＧＥ−ＢＳＡは組換えヒト及びニワトリリゾチームの酵 素活性を用量依存方式で阻害する（図２Ａ）が非ＡＧＥ修飾ＢＳＡ対照はリゾチ ームの活性を変えないことがわかった。しかしながら、その阻害は、増加用量の ＡＧＥ−ＢＳＡで１００％に達することがなく、ＡＧＥがリゾチーム基質に対し て間接的拮抗剤であることを示した。同様に、ミクロコッカス・リソデイクチカ スのヒトラクトフェリン誘導凝集(Soukkaら，1993，Archs Oral Biol．38:227) は、ＡＧＥ−ＢＳＡの添加によって完全に遮断又は逆転されたがＢＳＡによって されなかった（図２Ｂ）。リゾチームとラクトフェリン両者の殺菌活性も、ＡＧ Ｅ修飾タンパク質の存在下両タンパク質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）の変化によっ て示されるようにＡＧＥ−ＢＳＡによって阻害された（図２Ｃ、Ｄ）。ＡＧＥ− ＢＳＡ又はＡＧＥ−オボアルブミンを添加するとミクロコッカスのリゾチームＭ ＩＣを１２５倍だけ高めた。ＡＧＥ−オボアルブミンとリゾチーム濃度の滴定に よって、リゾチームを用いたＡＧＥ−オボアルブミンの最少阻害モル比は３：１ として求めた。上記のデータから、ＡＧＥの上昇がＡＧＥ関連症状のリスクが高 いことと相関し、かかる上昇がリゾチームとラクトフェリンの対応する阻害又は 不活性化によるものでありそれによって測定されるので本発明の予後能力が示さ れる。 リゾチームとラクトフェリンは殺菌活性とＡＧＥ結合活性を共有するが、明ら かな一次配列の相同性はそれらの２つのタンパク質間に存在しない。臭化シアン （ＣｎＢｒ）、Ｖ８プロテアーゼ又はヨードーソ安息香酸塩（ＩＢｚｏ）を用い てタンパク質分解消化によりそれらの２つのタンパク質中のＡＧＥ結合ドメイン をマッピングした。消化ペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動し、ニト ロセルロース膜に移し、125I−ＡＧＥ−ＢＳＡでブロットした。ニワトリリゾチ ームを部分的にＣｎＢｒ消化するとＮ末端の最初の１２残基もＣ末端の最後の２ ５残基もＡＧＥ結合に必要としないことが示された（図３Ａ）。ＩＢｚｏで部分 的に消化すると〜３ｋＤａの最も小さい断片はＡＧＥ結合活性をもたないが〜５ ｋＤａの２番目に小さい断片は完全なＡＧＥ特異的結合活性をなお保持すること がわかった（図３Ｂ）。ＣｎＢｒ及びＩＢｚｏによるリゾチームの特異的消化地 図に基づき、ＡＧＥ結合ドメインはアミノ酸６２〜１０５の４.６ｋＤａ断片に 局在する（図３Ｃ）。 対照的に、ヒトラクトフェリンをＣｎＢｒで消化すると４０ｋＤａと１０ｋＤ ａの双方のＡＧＥ結合断片を生じた（図４Ａ）。ラクトフェリンをＶ８プロテア ーゼで部分的に消化すると２２ｋＤａ、８ｋＤａ及び６ｋＤａの３種類の異なる ＡＧＥ結合断片が現れた（図４Ｂ）。我々はこれら３種類のＡＧＥ結合ペプチド のＮ末端２０アミノ酸を配列決定し、８ｋＤａペプチドがヒトラクトフェリンの Ｎ突出部分(約#1-20)に、６ｋＤａ断片がＣ突出部分（約#605-625）に局在する 。更に、２２ｋＤａペプチドが８ｋＤａ断片と同じＮ末端を共有する。ＣｎＢｒ 及びＶ８プロテアーゼ消化地図及びＡＧＥ結合結果が図３Ａ〜Ｃに纏められ、Ａ ＧＥ結合活性を示すラクトフェリン中に少なくとも２つのドメインがある（８ｋ Ｄａ、約#1-80;５ｋＤａ、約#603-653）と結論された（図４Ｃ）。 リゾチーム及びラクトフェリン中のこれらのＡＧＥ結合ドメインは一次配列に 相同性を共有しないが、我々はこれらのＡＧＥ結合ペプチド中に共通１７〜１８ アミノ酸親水性システインループ（ＣＸ15-16Ｃ）を同定した（図５Ａ）。親水 性分析からこれらのループが全て親水性であることが示された（図５Ｂ）。我々 はこの推定ＡＧＥ結合システイン結合ループドメインを“ＡＢＣＤ”モチーフと 名付けた。リゾチーム(CNDGRIPGSRNLCNIPC、約#62-78、配列番号７)及びラクト フェリン(CFQWQRNMRKVRGPPVSC、約#8-25、配列番号８及び CLQ、約#613-630)の ＡＢＣＤループに対応する合成ペプチドを構築した。これらの合成ＡＢＣＤルー プペプチドは、不適当な対照ペプチドでなくリガンドブロット分析において125 I−ＡＧＥ−ＢＳＡに結合することができる（図５Ｃ）。 おもしろいことに、最近、ヒト及びウシラクトフェリン（３９％相同性）のＮ 末端システインループが殺菌ドメインであることが報告され(Bellamyら，Bioche m．Biophys．Acta．1121:130)、なぜこのループへのＡＧＥ結合がラクトフェリ ンの殺菌活性を阻害したかを説明することができる。我々は、更に、このモチー フがデフェンシン、アズロシジン、好中球抗生物質及びセロプロシジンのような 殺菌タンパク質の他の一部にも存在することを同定している(Gabayら，1993，Op in．Immunol．5:97; Leherら，Annu．Rev．Immunol．11:105)。また、ほとんど の殺菌タンパク質が少なくともある種のドメインにわたって親水性であることが 知られている。機構によって限定するものではないが、このＡＧＥ結合システイ ンループが全ての種に及び特に防御タンパク質に明らかに保存されるという事実 は、これらの防御タンパク質の細菌結合性に関与するものである。ＡＧＥのよう にグルコース修飾タンパク質は、細菌壁の分子構造に似ており、リゾチーム及び ラクトフェリンのような抗菌タンパク質に結合することができる。組織及び体液 内の高ＡＧＥレベルは、抗菌タンパク質と相互作用を生じ、正常な防御機能を妨 害することができる。 実施例２ ＡＧＥを含む又は含まないリゾチームによる細菌増殖の阻害 下記の実施例から、細菌増殖のリゾチーム仲介阻害がＡＧＥ複合体によって妥 協すること、更に、リゾチーム活性についてＡＧＥの有害な作用がリゾチーム又 はそれに由来するペプチドを添加することにより克服することができることは明 らかである。本発明のペプチド又はリゾチームの類似の誘導体を投与することに よりＡＧＥ複合体によるリゾチーム活性の阻害が追加リゾチーム又はその誘導体 によるＡＧＥの滴定によって最少にされる。更に、ＡＧＥの滴定は、高レベルの ＡＧＥの疑いがある個体を治療するという一般法を与え、ＡＧＥによるリゾチー ム活性の阻害を克服するだけでなく活性が生体内ＡＧＥ複合体によって減少する 他の細胞成分を救助する。 材料及び方法 栄養ブイヨン(DIFCO)中２.５×１０-5CFU/mlの生菌ミクロコッカス・ルテウス (Micrococcus luteus)（ＡＴＣＣ9341）を０、２、１０、５０、２５０、１２５ ０及び３０００μg/ml＋１.５ mg/mlＡＧＥ−ＢＳＡ、ＡＧＥ−オボアルブミン 又はＢＳＡとインキュベートした。種々の培養物の細菌増殖を求め、３０℃で１ ８時間インキュベートした後の目にみえる細菌増殖に基づいた。 結果 細菌培養物へのリゾチームの添加は、細菌増殖を防止するために培養液がＢＳ Ａ、ＡＧＥ−ＢＳＡ又はＡＧＥ−オボアルブミンで補足されたかが要求され、下 記の表１に示す。 培養物にＡＧＥ−ＢＳＡ及びＡＧＥ−オボアルブミンを添加するとリゾチーム の殺菌作用のＡＧＥ仲介阻害を克服するために多量のリゾチームが添加されるこ とが必要であった。非修飾ＢＳＡは、リゾチームの殺菌活性に拮抗作用を示さな かった。約１０μg/mlより大きいリゾチーム濃度はＡＧＥ−ＢＳＡで補足した培 養物中の細菌を死滅するのにリゾチーム活性を再確立するのに有効であったが、 ＡＧＥ−オボアルブミン補足培養物では同じ効果を得るために５０μg/mlを超え る濃度が必要であった。 検討 本実施例は、ＡＧＥ修飾化合物がリゾチームの正常な殺菌活性を阻害すること ができることをＡＧＥ修飾化合物の存在しないときに作用を生じることができる 濃度でその活性をリゾチームが示すことができないことで示したものである。更 に、その阻害はリゾチーム又はそのＡＧＥ結合ペプチド誘導体を用量依存方式で 更に添加することにより克服することができる。従って、高レベルのＡＧＥ修飾 化合物の疑いがある個体にリゾチーム又はそのＡＧＥ結合ペプチドドメインを投 与するとＡＧＥレベルの低下及び／又はＡＧＥによって働きかけられたリゾチー ム又は他の細胞成分について有害な作用の逆転を得ることができる。 実施例３ リゾチームを用いるＥＬＩＳＡ型結合によるＡＧＥ修飾化合物の検出 試料中のＡＧＥ複合体の検出は、被検者の血液もしくは組織又は生物試料中の 病状レベルのＡＧＥを求めるのに非常に重要である。本実施例は、リゾチーム又 はそのＡＧＥ結合ドメインを含むペプチドであるが同じ領域のＡＧＥ結合能力を 与える相同ペプチドが用いられるペプチドを表面に付着させかつインキュベート するか又は試料を該ペプチドに通過させて試料のＡＧＥ修飾分子を捕捉すること による検出法を示すものである。次に、付着リゾチームに特異的に結合したＡＧ Ｅ修飾成分又はそのＡＧＥ結合ペプチドドメインの存在を検出するためにＡＧＥ に対して高められた検出抗体が用いられる。下記の詳細は、更に、除去、例えば 、血液及び血清からのＡＧＥ−ペプチドの除去を容易にするＡＧＥ結合活性の治 療適用に関する。 材料及び方法 一連の最初の実験においては、ニワトリリゾチームを、まず３０ mg/mlの濃度 のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に調製し、最終濃度２％(v/v)の２−メルカプ トエタノールを加えることにより還元した。リゾチームをＥＬＩＳＡに付着する ために、リゾチームの還元標品をコーティングバッファー（ＣＢ；０.１M Ｎａ ＨＣＯ3ｐＨ９.６、０.０２％ＮａＮ3w/vを含む）で最終濃度１００μg/mlまで 希釈した。次に、１００μl のその標品の分割量を９６ウェルＥＬＩＳＡプ レートの各ウェルに４℃において加え、一晩インキュベートしてリゾチームをプ レートに付着させた。次に、そのプレートを洗浄バッファー（ＷＢ；ＰＢＳ、０ .０５％トゥイーン20、１mMＮａＮ3を含む）で３回洗浄し、１５０μl/ウェルス ーパーブロック(Pierce，cat.#37515)で室温において１時間阻止した。再び、プ レートをＷＳで３回洗浄し、希釈バッファー（ＤＢ；ｐＨ７.４のＰＢＳ中０.２ ％トゥイーン）で希釈したＡＧＥ−ＢＳＡを単独で又は２％正常ヤギ血清（ＮＧ Ｓ）、２％ＢＳＡ或いは０.２％ＢＳＡと加え、室温で２時間シェーカーでイン キュベートした。一連のＡＧＥ−ＢＳＡの標準標品の希釈液を３回の実験でウェ ルに加え、濃度を１０×の増加分で０.０１μg/ml〜１０００μg/mlに変えた。 そのＡＧＥ−ＢＳＡの比活性は２.２１μgのＡＧＥ−ＢＳＡあたり約１単位であ り、抗ＡＧＥモノクローナル抗体を用いて標準ＥＬＩＳＡ分析で評価した。プレ ートをＷＢで洗浄した後、ＤＢ中２％ＮＧＳで希釈した抗ＡＧＥモノクローナル 抗体を加え、弱く振盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートをＷ Ｂで３×洗浄し、ＤＢ＋１％ＮＧＳで１：３０００に希釈したヤギ又はウサギで 高めたアルカリ性ホスファターゼ結合抗マウス抗体(例えば Cappel，cat.#59296 )をウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄 し、基質バッファー（ＳＢ；９.７mlジエタノールアミン、０.１ｇＭｇＣｌ2・ ６Ｈ2Ｏ、８００mlddＨ2Ｏ中０.２ｇＮａＮ3、ｐＨ９.８、ddＨ2Ｏで１リットル に希釈した）中１ mg/mlのp-ニトロフェニルホスフェートを加えた。基質添加後 に４０５nmのＯＤを測定し、一旦最大ＯＤに達した（約６０分）。 結果 そのサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ系分析によるＡＧＥ−ＢＳＡの検出は、試料希 釈バッファー中に過剰量の精製タンパク質が含まれているか否かにかかわらず試 料中のＡＧＥ−ＢＳＡの濃度に関係した（図６参照）。おもしろいことに、リゾ チームが検出抗体に対して試料中のＡＧＥ−ＢＳＡを捕捉及び提示した見掛け効 率はＢＳＡ又はＮＧＳを希釈バッファーに加えることによって異なった。非修飾 ＢＳＡが２％又は０.２％の濃度で試料希釈バッファーに含まれる場合、リゾチ ームのＡＧＥ−ＢＳＡを検出する能力はＤＢ中２％ＮＧＳを用いる平行分析又は 試料希釈バッファーを単独で用いる分析に比べて改善された。全ての場合におい て、 リゾチームはＡＧＥ−ＢＳＡ濃度に比例して試料からのＡＧＥ−ＢＳＡを捕捉し 、検出抗体が複合体、即ち、測定レベルの試料中のＡＧＥ化合物に結合すること を可能にする。 一連の第２の実験においては、本発明の薬剤の結合活性を確認する非共有相互 作用を評価するために高レベルのＡＧＥを含むことが既知の末期腎疾患（ＥＳＲ Ｄ）をもつ糖尿病及び非糖尿病患者の血清を試験した。従って、ＡＧＥ結合カラ ムをリゾチーム結合セファロースビーズでつくった。次に、そのリゾチーム−マ トリックスの能力についてＥＳＲＤをもつ糖尿病患者（ｎ＝１０）の血清又は腹 膜透析液から単離した試験管内生成ＡＧＥ−リシン或いは生体内生成ＡＧＥの特 異的除去を調べた。ＡＧＥ−リシンをリゾチーム−セファロース又はＢＳＡ−セ ファロース（対照）カラムを通過し、通過（非結合）及び溶離（結合）画分につ いてタンパク質架橋活性、ＡＧＥ免疫反応性、蛍光及び褐色着色密度を分析した 。約６０〜７０％のＡＧＥ−リシンの架橋、免疫反応及び褐色着色物質が結合画 分としてリゾチーム−セファロースマトリックスによって保持され、ＮａＯＨ（ ０.１N）で容易に溶離することができた。対照的に、ＡＧＥ−リシンの蛍光物質 はその画分と結合しなかった。更に、ＡＧＥ−リシンはＢＳＡ−セファロース（ 対照）カラムに保持されなかった。同様に、リゾチーム−セファロースマトリッ クスは、糖尿病血清又は透析液中で生体内で生成した架橋ＡＧＥ含有物質を捕捉 することができることがわかった。ＮａＯＨで溶離する際、これらは架橋及びＡ ＧＥ活性の双方を保持した。 腎不全をもつ患者の血清からＡＧＥを除去する本発明の適用性を試験するため に別の実験を行った。従って、ニワトリリゾチームをセファローズマトリックス （リゾチーム−マトリックス）に結合して血清に存在するＡＧＥ（ｓＡＧＥ）及 び腎不全をもつ糖尿病患者からの透析液（ｄｆＡＧＥ）の捕捉を可能にした。最 初の実験から、＞８０％の125I−ＡＧＥ−アルブミンがリゾチーム−マトリック スに保持され、対照マトリックス（ＣＬ−マトリックス）では＜１０％であった 。６０％を超える脱塩ＡＧＥ−リシンがリゾチーム−マトリックスによって捕捉 され、０.１N ＮａＯＨで溶離した後、免疫反応性（ＥＬＩＳＡによる）及び架 橋活性を保持したが固有の蛍光（３７０／４４０nm）はなかった。同様に、リゾ チー ム−マトリックスは生体内で生成したｓＡＧＥとｄｆＡＧＥを結合及び保持した 。糖尿病血清中のリゾチーム−マトリックスを通過した後、ＡＧＥレベル（０. ３５＋０.０４U/mg）は正常なヒト血清レベル（０.１１＋０.０２U/mg；ｎ＝１ ０、ｐ＜０.０００１）まで顕著に低下したが、非特異的タンパク質吸収は＜３ ％であった。溶離後、リゾチーム結合ｓＡＧＥ−又はｄｆＡＧＥを多く含んだ画 分は、高レベルの架橋ＡＧＥを含有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで示されたように125I −ＢＳＡとインキュベートした際に時間依存方式で大きな複合体形成を促進した 。その複合体の形成は、アミノグアニジンと共インキュベートすることにより完 全に防止された。 検討 一連の最初の実験の分析結果を示すグラフから（図６参照）、リゾチームによ るＡＧＥ結合に基づくＥＬＩＳＡ方式でのＡＧＥ−ＢＳＡの検出が明らかに示さ れる。試料希釈バッファーにＢＳＡを添加すると試料中のＡＧＥ−ＢＳＡの検出 レベルが改善されたが、ＮＧＳが置換された場合又は過剰のタンパク質が含まれ ない場合にはＡＧＥ修飾ＢＳＡが検出され、該分析がかかる検出を可能にするこ とを示した。その方法で捕捉剤として還元リゾチームをリゾチームのＡＧＥ結合 ペプチドドメイン又はそれに相同なＡＧＥ結合ペプチドに置き換えることができ 、かかる変化は本発明の範囲内に包含されるものである。血液、血漿、尿及びさ まざまな種類の組織液又は組織エキスのようなこれらに限定されない本発明で企 図された種々の生物試料が本実施例のＡＧＥ−ＢＳＡに容易に置き換えられ、か かる試料中のＡＧＥのレベルを求める方法を与えることができる。 その方法で本発明を適用する能力は、上記で示された一連の第２の実験の結果 の評価から引き出される結論で説明及び確認される。詳しくは、データから、上 で例示されたリゾチーム−セファロースマトリックスのようなマトリックスが生 体外及び生体内で生成された反応性ＡＧＥを非共有相互作用で捕捉することがで きることが確認される。これにより、糖尿病尿毒症血清からの損傷物質の選択的 除去の新規な方法が提供され、尿毒症及び類似疾患の治療に対する本発明の適用 を支持する。 これに関連して、第３の実験の結果から、マトリックスが血清又は透析液に存 在する架橋ＡＧＥを選択的に及び非共有的に捕捉することができることが証明さ れ、腎不全をもつ患者においてＡＧＥ除去を高めるために用いられるのでリゾチ ームマトリックスの治療用途が確認される。更に重要なことには、本実施例は、 グループとしてリゾチームのＡＧＥ結合ドメインによって認識されたＡＧＥエピ トープが架橋に関して反応性でありかつアミノグアニジンによって阻害され、抗 ＡＧＥ抗体と免疫反応し及び非蛍光であり、発病に適切であるらしいことを証明 するものである。 本実験は、更に、広範囲の透析手順用の上記で示された対応する装置の調製及 び使用に対する技術の適用の価値と作用可能性の確認である。示されたように、 リゾチームカラムは糖尿病性腎不全と関連があることがわかった高血清ＡＧＥレ ベルを低下させることができる。従って、発病の生体内生成ＡＧＥは、透析液か らＡＧＥを除去することができる上記のリゾチーム系吸収剤及びリゾチーム誘導 ビーズによるクリアランスに感受性がある。 本実施例に記載された分析による生物試料中のＡＧＥの検出は、抗ＡＧＥ治療 の過程を監視しかつヒト使用又は消費についてのタンパク質に対するＡＧＥ修飾 の程度を評価するのに有用であると共に他の診断適用にも有用である。同様に、 リゾチーム又はそのＡＧＥ結合ペプチドドメインにＡＧＥ特異的抗体を置き換え る他の既知のＥＬＩＳＡ様分析方式は本実施例の範囲内に包含される。 実施例４ リゾチーム誘導原質へのＡＧＥ化合物の局在化及びＡＧＥ化合物の特異的溶離 リゾチーム又はそのＡＧＥ結合ペプチド部分、即ち、本発明のペプチドを親和 性クロマトグラフィーカラムに固定化することにより（例えば、カラムのビーズ をリゾチームで誘導することにより）、ＡＧＥがリゾチーム又は類似のＡＧＥ結 合ドメインを有する分子に結合することができ、引き続き適切な溶離液を添加し てそれから溶離されることが示される。本方法は、ＡＧＥ修飾分子を選択的に結 合するのに有効な方法を与えるばかりでなく生物学的液体、例えば、血液を含む 複合体混合物からかかるＡＧＥ修飾分子を除去及び分離する手段を与える。場合 によっては、分離したＡＧＥは使用又は分析用カラムから溶離される。 方法 臭化シアン活性化セファロース4Bビーズを製造業者の説明書に従ってリゾチー ムで誘導し、１.５mlの床容量カラムを調製した（Ｌカラム）。同様に、対照カ ラムをＢＳＡで誘導したビーズを用いてつくった（ＢＳＡカラム）。次に、カラ ムに５００μl の６ mg/mlＡＧＥ−ＢＳＡを充填し、引き続きＰＢＳで広範囲に 洗浄した。ＡＧＥ−ＢＳＡのカラムからの溶離は、０.１N ＮａＯＨを添加する ことにより達成され、２００μl 画分を集めた。溶離画分を１N ＨＣｌで中和し た。 結果 図７は、結合しかつリゾチームカラム又はＢＳＡカラムから溶離されたＡＧＥ −ＢＳＡの量を U/ml(１単位はＡＧＥ−ＢＳＡ被覆プレートに結合するα−ＡＧ Ｅ抗体に対する正常ヒト血清の１：５希釈液の競合活性として定義される)で示 すグラフである。ＡＧＥ−ＢＳＡはリゾチームカラムに結合することが見られ、 リゾチーム誘導ビーズと結合した黄褐色ＡＧＥ色素として目にみえて着色され、 ＡＧＥ色素とＡＧＥ免疫反応性は画分１２〜１８に集中したピークとして溶離し た。ＡＧＥ−ＢＳＡがＢＳＡカラムにほとんど又は全く結合しなかったことは明 らかであった（褐色の色素が目にみえるようにカラムに結合しなかった）。従っ て、溶離段階でＡＧＥ免疫反応性は実際に回収されなかった。 検討 リゾチームに対するＡＧＥ結合の特異性は、本実施例の実験で明らかである。 データから、ＡＧＥ−ＢＳＡがクロマトグラフィービーズに化学的に結合したリ ゾチームに結合することが示される。その結合ＡＧＥ−タンパク質は、適切な溶 離液が用いられる場合に可逆的に解離することがわかった。ＮａＯＨは本実施例 に用いられる溶離液であるが、ＡＧＥ修飾化合物を固定化リゾチームから除去さ せることができる溶液が用いられ、高張液、カオトロピック剤又は他のＡＧＥ標 品が挙げられる。リゾチームカラムを用いて得られたデータと対照的に、ＡＧＥ −ＢＳＡはＢＳＡカラムからほとんど又は全く溶離されず、ＡＧＥ結合がリゾチ ーム及びそのＡＧＥ結合ドメインの特定の性質であることが示された。 本実施例に記載されたカラムの使用は、ＡＧＥのカラムへの結合を可能にする ことができる条件下で試料をカラムに接触させることによりおそらくＡＧＥ修飾 化合物を含む試料を特異的にスクリーニングする能力を当業者に与える。かかる 手順の適用は、試料中のＡＧＥの量の定量、ＡＧＥの試料からの分離、例えば、 血液透析又はＡＧＥの試料からの回収を含めることができるが、これらに限定さ れるものではない。 更に、ＡＧＥに結合することができるリゾチーム又はそのペプチド部分は、ク ロマトグラフィー使用及び他の使用のビーズ以外の物質に架橋されてＡＧＥに対 する結合分子を局在する特定の標的物質を生成する。例えば、セファローズビー ズより染料又は顔料がリゾチーム又は本発明のペプチドに結合又は複合され、次 にＡＧＥに接触し、適切な条件下で結合する。結合分子のＡＧＥ修飾表面への局 在化が結果である。ＡＧＥで明らかにされる組織、例えば、皮膚又は歯のエナメ ル質がＡＧＥ結合ペプチド／染料結合体と接触して、例えば、ＡＧＥに対する結 合機能を局在することができる。更に、リゾチーム又はそのＡＧＥ結合ペプチド ドメインに結合した分子が高レベルのＡＧＥ修飾物又はＡＧＥ修飾化合物を含む 特定の組織を同定するためのマーカーとして用いられる。 本発明に有用である着色剤としては、二酸化チタンのような顔料及び、例えば 、食品、薬剤及び化粧品用途に適切でありＦＤ＆Ｃ染料等として既知の他の染料 が含まれる。具体例としては、５,５′−インジゴチンジスルホン酸の二ナトリ ウム塩であるＦＤ＆Ｃブルー No.２として既知のインジゴイド染料が含まれる。 同様に、ＦＤ＆Ｃグリーン No.１として既知の染料は、トリフェニルメタン染料 を含み、４−［４−Ｎ−エチル−ｐ−スルホベンジルアミノ）ジフェニルメチレ ン］−［１−（Ｎ−エチル−Ｎ−ｐ−スルホニウムベンジル）−２−５−シクロ ヘキサジエンエミン］である。全てのＦＤ＆Ｃ及びＤ＆Ｃ顔料及び染料の完全な 列挙及び対応する化学構造は、Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technol ogy, Vol.5，p.857-884に見られ、その本文の記載は本願明細書に含まれるものと する。 本発明の他の実施態様においては、上記化合物又は構築物は、哺乳動物と直接 接触してもしなくても感染、侵入等の部位に殺菌剤、抗真菌剤及び抗菌剤及び他 の治療剤のような活性剤又は成分を送達するのに使用するために調製される。従 って、このタイプの化合物は、粒子又はビーズ及び問題の有効成分と共に本発明 の親水性ループドメインを有する分子を含むことができる。個々の場合には、該 化合物は、ビーズの製剤又は溶解性が制限されるか又はこし取るように有効成分 の評価できる放出を可能にする小孔のある組成物での剤皮のように有効成分の長 時間にわたる又は遅延した放出を容易にするように調製される。適切な組成物と しては、酢酸フタル酸セルロース、ポリ酢酸フタル酸ビニル、フタル酸ヒドロキ シプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロー ス、メタクリル酸コポリマーのようなｐＨ感受性腸溶剤皮材料及びヒドロキシエ チルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、セラック、及び混合物のよう な他の剤皮材料が挙げられる。上記のものは、適切な長時間にわたる放出製剤の 調製に用いられる材料の代表例であり限定されないことは当然のことである。 実施例５ リゾチームによるＡＧＥ−タンパク質のオプソニン作用はマクロファージによる 取込みの亢進をもたらす 下記の実施例は、ＡＧＥ結合材料及び本発明の薬剤のオプソニン作用能力を示 すものであり、詳しくは、食作用によるＡＧＥの取込みを亢進することにより被 検者の血液又は他の組織からＡＧＥ化合物を除去する手段を具体例によって示す ものである。従って、ＡＧＥを適切なオプソニン、即ち、本発明のリゾチーム分 子又はリゾチームに見られる本発明のＡＧＥ結合ドメイン又は本発明のＡＧＥ結 合ドメインに関連したものと混合することにより、ＡＧＥ修飾化合物のオプソニ ン作用を達成し、かかる化合物を組織から、循環から又は体内から除去すること を亢進することが可能である。その能力は、下記に生体外及び生体内の双方で示 される。 材料及び方法 生体外マクロファージによるＡＧＥ修飾分子の取込みの速度及び程度を求める ために、１０6マウスマクロファージ細胞（例えば、ＲＡＷ２６４.７細胞）を１ mlのＲＰＭＩ培養液を含む２４ウェル組織培養プレートで培養した。次に、２〜 ３μg の125Iで標識されたリゾチーム、−ＢＳＡ又は−ＡＧＥ−ＢＳＡを５０倍 過剰量の非標識リゾチーム、ＡＧＥ−ＢＳＡ或いはリゾチームとＡＧＥ−ＢＳＡ の両者と共に加えた。細胞を３７℃で２時間インキュベートした後、ＲＰＭＩ培 養液で５回洗浄した。次に、細胞を穏やかに削ることによりプレートからミクロ フュージ管へ取り出し、４００×ｇで５分間遠心分離し、２回以上洗浄した。細 胞によって吸収された125Iのレベルを検出するためにγカウンターで洗浄したペ レットを調べた。同様のプロトコールを腹膜マクロファージで行った（１０6／ ウェル、２時間、３７℃）。 結果 リゾチーム（１２〜３００μg/ml）の存在下にＡＧＥ−ＢＳＡ（７.５μg/ml ）は２〜５倍だけ亢進されたが、リゾチームは非修飾ＢＳＡの取込みに影響しな かった。ＡＧＥ−ＢＳＡ取込みの亢進は、リゾチーム用量依存性及び時間依存性 であり、過剰量のＡＧＥ−ＢＳＡで阻害された。対照的に、リゾチームのみは同 様の条件下であまり取込まれなかった。また、血清ＡＧＥ−タンパク質及びＡＧ Ｅ−ペプチドは顕著な架橋活性を示すことがわかった。リゾチームは、生体外固 定化コラーゲンへのＡＧＥ−ペプチド結合を阻害した。 同様に、図８に示されるように、標識ＡＧＥ−ＢＳＡを培養液に添加するとそ の基質のマクロファージによるＡＧＥ仲介取込みを定量することが可能であり、 そのＡＧＥ−ＢＳＡは標識の他に非修飾ＢＳＡ又はリゾチームに比べて高くなっ た速度で吸収される。更に、標識ＢＳＡ或いは標識リゾチームをリゾチームで補 足するとマクロファージ培養物による標識分子の取込みが更に生じなかったが、 標識ＡＧＥ−ＢＳＡの溶液にリゾチームを添加するとマクロファージ培養物によ るＡＧＥ−ＢＳＡの取込みが２〜５倍に増加した。これにより、リゾチームがマ クロファージによるＡＧＥ修飾分子の取込みを援助すること、周囲の培養液のＡ ＧＥ下のレベルを低下させることができること、及びリゾチーム及びＡＧＥ取込 みを促進するオプソニン作用因子として及び循環反応性ＡＧＥの中和及び除去の 可溶性担体として働く本発明の他の薬剤の能力を更に確認することが示される。 更に、内在性血清ＡＧＥのマクロファージ認識に関するリゾチームの影響の試 験として、糖尿病血清がＡＧＥを多く含む血清画分とＡＧＥを除去した血清画分 に分離されるＡＧＥ親和性セファロースカラムを構築するためにリゾチームを用 いた。放射能標識後、各画分の分割量を添加リゾチーム（０.９ mg/ml）の存在 下又は不在下にマウスマクロファージに曝露した。マクロファージによる標識し たＡＧＥを多く含んだ血清タンパク質の取込み及び分解は、対照画分に比べてリ ゾ チームにより著しく高められた（＞３倍）。 ＡＧＥの生体内除去速度に関するリゾチームの影響を試験するために、ＡＧＥ −ＢＳＡ（３mg／日、腹腔内）を健常ラット（ｎ＝６）に７日間注射し、血清Ａ ＧＥの３倍の上昇が得られた（６±１U/mlから２０±４U/ml）のに続いてリゾチ ーム（１２mg／日、腹腔内）又はＢＳＡを１週間注射した。リゾチーム注射によ り、３日以内に正常値（８±２、Ｐ＜０.０１）まで血清ＡＧＥレベルの戻りが 得られたが、対照ＢＳＡ注射は効果がなかった。 検討 本実施例は、生体内に用いられた場合に有害なレベルのＡＧＥに罹っている個 体に顕著な治療価値がある重要で以前には予想されなかった態様を示すものであ る。リゾチームが添加又は試料から取り除かれる場合に標識ＡＧＥ−ＢＳＡのマ クロファージによる取込み量間の差により、リゾチーム又は類似のＡＧＥ結合及 びオプソニン作用活性を有する分子がそれらの化合物の食作用及び血液、組織又 は体内からの除去を増強するために用いられることが示される。正味の効果は、 例えば、健康に有害な量のＡＧＥに罹患した個体の組織又は血液中のＡＧＥ修飾 化合物のレベルの低下である。 上記の実験は、リゾチームのオプソニン作用活性に関する情報を追加するもの である。詳しくは、リゾチームは、ＡＧＥ修飾タンパク質による高分子量集合体 の形成に関与し、生体外マクロファージによるＡＧＥを多く含んだ血清画分の取 込みを亢進する。また、生体内リゾチーム投与は、ＡＧＥ−ＢＳＡを予め投与す ることにより実験的に上昇した循環ＡＧＥレベルを正常レベルに再び標準化する 。 纏めると、上記のことにより、２つの主要な天然に存在する抗菌タンパク質、 リゾチームとラクトフェリンにおける親水性システインループ結合（ＡＢＣＤモ チーフ）がＡＧＥタンパク質結合に関与し、ＡＧＥへの結合がリゾチーム仲介及 びラクトフェリン仲介の酵素及び殺菌活性を阻止することが証明される。糖尿病 患者における高レベルのＡＧＥがリゾチーム及びラクトフェリンのような内在性 抗菌タンパク質の殺菌活性を阻害することができることが想定される。更に、健 康に有害なレベルのＡＧＥをもつ疑いがある個体にリゾチーム又は類似のＡＧＥ 結合能力を有するペプチドを投与することにより、有害なレベルのＡＧＥを低下 させて宿主殺菌タンパク質の殺菌活性を再確立することが可能である。 本発明は、その真意又は本質的な特性から逸脱することなく他の形態で具体化 され或いは他の方法で実施される。従って、本説明は全ての点で例示としてみな されるべきで限定されるものではない。本発明の範囲は下記の請求の範囲で示さ れ、等価物の意味及び範囲内に入る全ての変化はその中に含まれることを意味す る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/16 ＡＣＶ Ｇ０１Ｎ 33/566 38/46 ＡＤＺ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＤＺ 49/00 37/14 ＡＣＶ Ｇ０１Ｎ 33/566 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｔ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヴラッサラ ヘレン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11964 シェルター アイランド ラム アイラ ンド ドライヴ（番地なし) (72)発明者 セラミ アンソニー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11964 シェルター アイランド ラム アイラ ンド ドライヴ（番地なし)

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．高レベルの進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）をもつ疑いがある被検者 において抗菌タンパク質のＡＧＥ仲介不活性化を阻害することにより感染症を治 療する方法であって、Ｒ1Ｚ1ＸａａnＺ2Ｒ2(配列番号１〜６)(Ｚ1及びＺ2は架橋 を形成することができる残基であり；Ｒ1及びＲ2は独立してポリペプチド、Ｃ1 〜Ｃ12アルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基又は水素 であり；ＸａａはＬ−又はＤ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である)に対応 する構造を有する親水性ループドメインを有する分子の治療上有効な量を投与す ることを特徴とする方法。 ２．前記Ｚ1及びＺ2残基が架橋を形成するために結合される請求項１記載の方法 。 ３．ｎ＝１５〜１６である請求項１記載の方法。 ４．該親水性ループドメインがＲ1ＣｙｓＸａａnＣｙｓＲ2(配列番号１〜６)（ ＸａａはＬ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である）である請求項１記載の方 法。 ５．ｎ＝１５〜１６である請求項４記載の方法。 ６．該親水性ループドメインが配列番号７〜９からなる群より選ばれる請求項４ 記載の方法。 ７．該抗菌タンパク質がリゾチーム及びラクトフェリンからなる群より選ばれる 請求項１記載の方法。 ８．該分子が創傷、びらん、発疹又は潰瘍に局所適用される請求項１記載の方法 。 ９．高レベルの進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）をもつ疑いがある被検者 において抗菌タンパク質のＡＧＥ仲介不活性化を阻害することにより感染症を治 療する組成物であって、Ｒ1Ｚ1ＸａａnＺ2Ｒ2(配列番号１〜６)(Ｚ1及びＺ2は架 橋を形成することができる残基であり；Ｒ1及びＲ2は独立してポリペプチド、Ｃ1 〜Ｃ12アルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基又は水 素であり；ＸａａはＬ−又はＤ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である)に対 応する構造を有する親水性ループドメインを有する分子の抗菌タンパク質のＡＧ Ｅ仲介不活性化を阻害するのに有効な量及び薬学的に許 容しうる担体を含む組成物。 10．前記Ｚ1及びＺ2残基が架橋を形成するために結合される請求項９記載の組成 物。 11．ｎ＝１５〜１６である請求項９記載の組成物。 12．該親水性ループドメインがＲ1ＣｙｓＸａａnＣｙｓＲ2(配列番号１〜６)（ ＸａａはＬ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である）である請求項９記載の組 成物。 13．ｎ＝１５〜１６である請求項12記載の組成物。 14．該親水性ループドメインが配列番号７〜９からなる群より選ばれる請求項12 記載の組成物。 15．該抗菌タンパク質がリゾチーム及びラクトフェリンからなる群より選ばれる 請求項９記載の組成物。 16．該医薬担体が局所適用に適したクリーム、ゲル、軟膏又はローションである 請求項９記載の組成物。 17．生物試料から進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）を分離する方法であっ て、該生物試料と、Ｒ1Ｚ1ＸａａnＺ2Ｒ2(配列番号１〜６)(Ｚ1及びＺ2は架橋を 形成することができる残基であり；Ｒ1及びＲ2は独立してポリペプチド、Ｃ1〜 Ｃ12アルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基又は水素で あり；ＸａａはＬ−又はＤ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である)に対応す る構造を有する親水性ループドメインを有する分子とを接触させることを特徴と する方法。 18．前記Ｚ1及びＺ2残基が架橋を形成するために結合される請求項17記載の方法 。 19．ｎ＝１５〜１６である請求項17記載の方法。 20．該親水性ループドメインがＲ1ＣｙｓＸａａnＣｙｓＲ2(配列番号１〜６)（ ＸａａはＬ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である）である請求項17記載の方 法。 21．ｎ＝１５〜１６である請求項20記載の方法。 22．該親水性ループドメインが配列番号３〜５及び７〜９からなる群より選ばれ る請求項20記載の方法。 23．該分子がヒトリゾチーム、ニワトリリゾチーム及びラクトフェリンからなる 群より選ばれる請求項17記載の方法。 24．該生物試料が血液である請求項17記載の方法。 25．生物試料から進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）を分離する組成物であ って、Ｒ1Ｚ1ＸａａnＺ2Ｒ2(配列番号１〜６)(Ｚ1及びＺ2は架橋を形成すること ができる残基であり；Ｒ1及びＲ2は独立してポリペプチド、Ｃ1〜Ｃ12アルキル 基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基又は水素であり；Ｘａａ はＬ−又はＤ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である)に対応する構造を有す る、生物試料中のＡＧＥを結合するのに有効な量の分子を含み、該ＡＧＥが該生 物試料から単離されることを特徴とする上記組成物。 26．前記Ｚ1及びＺ2残基が架橋を形成するために結合される請求項25記載の組成 物。 27．該分子が固相支持体と不可逆的に結合される請求項25記載の組成物。 28．該固相支持体が膜である請求項25記載の組成物。 29．該膜が透析膜である請求項28記載の組成物。 30．ｎ＝１５〜１６である請求項25記載の組成物。 31．該親水性ループドメインがＲ1ＣｙｓＸａａnＣｙｓＲ2(配列番号１〜６)（ ＸａａはＬ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である）である請求項25記載の組 成物。 32．ｎ＝１５〜１６である請求項31記載の組成物。 33．該親水性ループドメインが配列番号７〜９からなる群より選ばれる請求項31 記載の組成物。 34．該分子がヒトリゾチーム、ニワトリリゾチーム及びラクトフェリンからなる 群より選ばれる請求項25記載の組成物。 35．生物試料から進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）を分離する装置であっ て、Ｒ1Ｚ1ＸａａnＺ2Ｒ2(配列番号１〜６)(Ｚ1及びＺ2は架橋を形成することが できる残基であり；Ｒ1及びＲ2は独立してポリペプチド、Ｃ1〜Ｃ12アルキル基 、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基又は水素 であり；ＸａａはＬ−又はＤ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である)に対応 する構造を有する、生物試料中のＡＧＥを結合するのに有効な量の分子が不可逆 的に結合又は固定化される粒子を含む、ＡＧＥ透過性材料で作られた構造を含む 装置。 36．前記Ｚ1及びＺ2残基が架橋を形成するために結合される請求項35記載の装置 。 37．該ＡＧＥ透過性材料がポリプロピレンメッシュである請求項35記載の装置。 38．該粒子が樹脂、セファロースビーズ、ガラスビーズ、プラスチックビーズ及 びシリカゲルからなる群より選ばれる請求項35記載の装置。 39．末期腎疾患の治療方法であって、患者からの血液と請求項25記載の組成物と を接触させることを特徴とする方法。 40．末期腎疾患の治療方法であって、患者からの血液と請求項28記載の組成物と を接触させることを特徴とする方法。 41．試料中の進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）の存在を検出する方法であ って、 ａ）該試料と、Ｒ1Ｚ1ＸａａnＺ2Ｒ2(配列番号１〜６)(Ｚ1及びＺ2は架橋を形 成することができる残基であり；Ｒ1及びＲ2は独立してポリペプチド、Ｃ1〜Ｃ1 2 アルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基又は水素であ り；ＸａａはＬ−又はＤ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である)に対応する 構造を有する、生物試料中のＡＧＥを結合するのに有効な分子とを該分子とＡＧ Ｅの特異的結合が起こる条件下で接触させる工程；及び ｂ）該分子の該試料中の成分への結合を検出する工程； を含み、 該分子の該試料中の成分への結合の検出が該試料中のＡＧＥの存在を表す方法 。 42．前記Ｚ1及びＺ2残基が架橋を形成するために結合される請求項41記載の方法 。 43．該分子が固相支持体に結合される請求項41記載の方法。 44．該分子が標識される請求項41記載の方法。 45．ｎ＝１５〜１６である請求項41記載の方法。 46．該親水性ループドメインがＲ1ＣｙｓＸａａnＣｙｓＲ2(配列番号１〜６)（ ＸａａはＬ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である）である請求項41記載の方 法。 47．ｎ−１５〜１６である請求項46記載の方法。 48．該親水性ループドメインが配列番号５〜９からなる群より選ばれる請求項47 記載の組成物。 49．該分子がヒトリゾチーム、ニワトリリゾチーム及びラクトフェリンからなる 群より選ばれる請求項48記載の方法。 50．高レベルの進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）をもつ疑いがある被検者 においてＡＧＥの架橋を阻害する方法であって、Ｒ1Ｚ1ＸａａnＺ2Ｒ2(配列番号 １〜６)(Ｚ1及びＺ2は結合を形成することができる残基であり；Ｒ1及びＲ2は独 立してポリペプチド、Ｃ1〜Ｃ12アルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、 ヘテロアリール基又は水素であり；ＸａａはＬ−又はＤ−アミノ酸であり；ｎ＝ １３〜１８である)に対応する構造を有する親水性ループドメインを有する分子 のＡＧＥに結合しかつその架橋を阻害するのに有効な量を投与することを特徴と する方法。 51．前記Ｚ1及びＺ2残基が架橋を形成するために結合される請求項50記載の方法 。 52．ｎ＝１５〜１６である請求項50記載の方法。 53．該親水性ループドメインがＲ1ＣｙｓＸａａnＣｙｓＲ2(配列番号１〜６)（ ＸａａはＬ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である）である請求項50記載の方 法。 54．ｎ＝１５〜１６である請求項53記載の方法。 55．該親水性ループドメインが配列番号７〜９からなる群より選ばれる請求項53 記載の方法。 56．該抗菌タンパク質がリゾチーム及びラクトフェリンからなる群より選ばれる 請求項50記載の方法。 57．ａ）ＡＧＥに結合することができる、Ｒ1Ｚ1ＸａａnＺ2Ｒ2(配列番号１〜６ )(Ｚ1及びＺ2は架橋を形成することができる残基であり：Ｒ1及びＲ2 は独立してポリペプチド、Ｃ1〜Ｃ12アルキル基、アリール基、ヘテロアルキル 基、ヘテロアリール基又は水素であり；ＸａａはＬ−又はＤ−アミノ酸であり； ｎ＝１３〜１８である)に対応する構造を有する親水性ループドメインがある分 子；及び ｂ）ａ）に結合したマーカー： を含む化合物。 58．前記Ｚ1及びＺ2残基が架橋を形成するために結合される請求項57記載の化合 物。 59．ｎ＝１５〜１６である請求項57記載の化合物。 60．該親水性ループドメインがＲ1ＣｙｓＸａａnＣｙｓＲ2(配列番号１〜６)（ ＸａａはＬ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である）である請求項57記載の化 合物。 61．ｎ＝１５〜１６である請求項60記載の化合物。 62．該親水性ループドメインが配列番号７〜９からなる群より選ばれる請求項60 記載の化合物。 63．該マーカーが、放射性同位元素、酵素、発蛍光団、化学発光物質、常磁性分 子、核磁気共鳴シフト試薬、コロイド金、他の顔料及び染料並びにラテックス及 びポリスチレンビーズからなる群より選ばれる請求項57記載の化合物。 64．薬学的に許容しうる担体中に請求項57記載の化合物を含む生体内診断用組成 物。 65．前記化合物がビーズ又は粒子と処方され、有効成分を含み、長時間にわたる 前記有効成分の放出に用いられる請求項57記載の化合物。 66．試験管内診断分析に適した担体中に請求項57記載の化合物を含む試験管内診 断組成物。 67．試料中の進行性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）の存在を検出する方法であ って、 ａ）該試料と請求項57記載の化合物とを接触させる工程；及び ｂ）該化合物の該試料中の成分への結合を、該マーカー分子と該試料中の該成 分との結合を検出することにより検出する工程； を含み、該化合物の該試料中の成分への結合の検出が該試料中のＡＧＥの存在 を表す方法。 68．該マーカーが白色顔料である請求項63記載の化合物。 69．該マーカーが、インジゴイド染料、トリフェニルメタン染料、タンニン、メ ラニン及びその混合物からなる群より選ばれた顔料又は染料である請求項63記載 の化合物。 70．請求項67記載の化合物をゲル、ペースト、クリーム、溶液及び歯磨き剤より 選ばれた薬学的に許容しうる担体と混合して含む歯を白くする化粧用組成物。 71．請求項69記載の組成物を歯に適用することを特徴とする歯を白くする方法。 72．請求項68記載の化合物を薬学的に許容しうる局所用膜形成担体と混合して含 む日焼け色の外観を生じる化粧用組成物。 73．請求項71記載の組成物を皮膚に適用することを特徴とする日焼け色の外観を 生じる方法。 74．請求項57記載のマーカー分子結合体を含む組成物で被覆された表面からマー カー分子結合体を除去する方法であって、ＡＧＥを含む洗浄組成物を前記表面に 適用し、前記組成物中の該ＡＧＥが前記マーカー分子結合体と競合的に結合する ことができ、前記マーカー分子結合体を前記表面から除去することを可能にする ことを特徴とする方法。 75．前記洗浄組成物が液体である請求項73記載の方法。 76．前記洗浄組成物が粒状固体、ゲル、ペースト、溶液及び懸濁液より選ばれる 請求項73記載の方法。 77．ＡＧＥの存在及びレベルが関連する宿主における疾患、障害又は機能障害の 発症及び進行の可能性と重度を評価する方法であって、Ｒ1Ｚ1ＸａａnＺ2Ｒ2(配 列番号１〜６)(Ｚ1及びＺ2は架橋を形成することができる残基であり；Ｒ1及び Ｒ2は独立してポリペプチド、Ｃ1〜Ｃ12アルキル基、アリール基、ヘテロアルキ ル基、ヘテロアリール基又は水素であり；ＸａａはＬ−又はＤ−アミノ酸であり ；ｎ＝１３〜１８である)に対応する構造を有する親水性ループドメインを有す る分子の前記宿主から採取した生物試料中の存在と活性を測定することを特徴と する方法。 78．前記Ｚ1及びＺ2残基が架橋を形成するために結合される請求項76記載の方法 。 79．ｎ＝１５〜１６である請求項76記載の方法。 80．該親水性ループドメインがＲ1ＣｙｓＸａａnＣｙｓＲ2(配列番号１〜６)（ ＸａａはＬ−アミノ酸であり；ｎ＝１３〜１８である）である請求項76記載の方 法。 81．ｎ＝１５〜１６である請求項79記載の方法。 82．該親水性ループドメインが配列番号７〜９からなる群より選ばれる請求項76 記載の方法。 83．ＡＧＥ透過性材料で作られた構造を含む活性剤を送達する組成物であって、 その構造が、生物試料中のＡＧＥを結合するのに有効な量の分子が不可逆的に結 合又は固定化される粒子を含み、その分子が、Ｒ1Ｚ1ＸａａnＺ2Ｒ2(配列番号１ 〜６)(Ｚ1及びＺ2は架橋を形成することができる残基であり；Ｒ1及びＲ2は独立 してポリペプチド、Ｃ1〜Ｃ12アルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘ テロアリール基又は水素であり；ＸａａはＬ−又はＤ−アミノ酸であり；ｎ＝１ ３〜１８である)に対応する構造を有する親水性ループドメインを有する組成物 。
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