WO2007013487A1 - コリスチン原末の製造法 - Google Patents

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WO2007013487A1
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colistin
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Kazuyuki Sakamoto
Takashi Miyashita
Toshiaki Nagasato
Masataka Kawahigashi
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Meiji Seika Kaisha Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/60—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation occurring through the 4-amino group of 2,4-diamino-butanoic acid
    • C07K7/62—Polymyxins; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention is to obtain a novel strain in which the color of the culture solution is greatly reduced as compared with a production strain used for conventional colistin fermentation production, and to use this as a colistin-producing strain.
  • the present invention relates to a production method for obtaining colistin powder having a high whiteness without performing a decolorization step.
  • Colistin is a peptide antibiotic that acts broadly on bactericidal activity against gram-negative bacteria.
  • the color standard for colistin powder is It is defined as “white or almost white”.
  • a decolorization step such as using carbon for the purification step was necessary.
  • the time required for the production increases, and the recovery rate of the colistin powder, which is the target substance, is reduced.
  • Patent Document 1 JP-A-58-47493
  • Patent Document 2 JP-A-58-129993
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a colistin bulk powder having a high whiteness level that is capable of performing a decoloring step that is necessary in a conventional method for producing a colistin bulk powder.
  • the present invention is as follows.
  • Bacillus polymixer bar 'Collisteus which can produce bulk bulk powder with an absorbance of 0.15 or less of 5% concentration (WZV) aqueous solution at 400 nm.
  • a novel production strain useful in a method for producing colistin bulk powder can be provided. Furthermore, by using the strain of the present invention as a production strain, it is possible to provide a method for producing colistin powder having a high degree of whiteness without performing a decolorization step that is essential in the conventional method for producing colistin powder.
  • FIG. 1 shows the absorbance at 300 to 600 nm of the culture filtrate derived from 202-71 strain and the culture filtrate derived from M50 strain obtained in Example 1.
  • FIG. 2 shows a chart obtained by analyzing a solution of colistin powder derived from M50 strain obtained in Example 3 in deionized water by liquid chromatography (HPLC).
  • Bacillus polymixer 'Bar Collistinius (Bacillus polvmvxa var. Colistinus) M50 is an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Deposited as of May 31, 2005 under the deposit number FERM ⁇ -20 553.
  • the production strain used in conventional colistin fermentation production was subjected to artificial mutation treatment to obtain the desired production strain.
  • the artificial mutation treatment method is not particularly limited as long as it is an artificial mutation treatment.
  • ⁇ -methinole ⁇ one-trow ⁇ --trosoguanidine (NTG), ethyl methanesulfonate, etc.
  • Mutation treatment methods such as chemical methods using mutagens; physical methods such as ultraviolet irradiation and X-ray irradiation; biological methods such as genetic recombination and transposon can be used.
  • the fungal group obtained by the mutation treatment was subjected to liquid culture using a flask and screened using the coloration degree of the culture and the ability to produce colistin as indicators.
  • the degree of coloring is based on the value obtained by measuring the absorbance at 400 nm of the filter paper filtrate of the culture solution.
  • the colistin production ability is based on the value obtained by analyzing the filter paper filtrate of the culture with HPLC. In this way, the degree of coloration is greatly reduced compared to conventional production strains and 7 strains of Bacillus spolvmvxa var. Colistinus that produce the same or better production capacity of Bacillus.
  • a strain having a clearly high whiteness of the colistin bulk obtained by producing colistin from Bacillus' polymixer 'Baichi' colistus can be used.
  • a colistin powder having an absorbance of a 5% concentration (WZV) aqueous solution at 400 nm of 0.15 or less, preferably 0.087 or less, more preferably 0.070 or more and 0.087 or less is obtained.
  • Any polymixer 'bar' colistius can be used in the present invention.
  • production strains that can be used in the present invention include subcultured strains, mutant strains, and genetically modified strains of these strains.
  • the color of colistin powder produced from a culture solution produced by fermentation using M50 strain which is an example of the production strain of the present invention, without performing a decolorization step using carbon or the like is a culture derived from a conventional production strain.
  • M50 strain obtained in the present invention as a production strain, it is possible to obtain a colistin powder having a high degree of whiteness without performing a decolorization step that was essential in the conventional method for producing a colistin powder. It becomes.
  • a decolorization step is performed by culturing Bacillus polymixer 'Bar' colisius, adsorbing the culture to ion exchange resin, elution, concentrating and drying. It is possible to produce a colistin bulk powder in which the absorbance of a 5% concentration (WZV) aqueous solution at 400 nm is 0.15 or less. This makes it possible to produce a colistin powder that passes the color standard “generally white” of the European Pharmacopoeia, which is the quality standard for colistin powder used in pharmaceuticals in Europe (including veterinary drugs). In addition, the power that usually required a decoloring step such as adding carbon such as activated carbon, stirring and filtering, and the like.
  • the colistin powder in the present invention contains colistin generally known as a polymyxin peptide antibiotic.
  • Colistin is similar to colistin A, which has the following structure: Colistin B having an amino acid structure is known.
  • the colistin bulk powder of the present invention is a crude extract containing colistin to the extent that it can be used as a pharmaceutical product, and is obtained without going through a decolorization step as described above.
  • the method for using the colistin powder is not particularly limited, and can be used as it is, or further processed and used as a colistin preparation.
  • the cells were inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 30 mL of liquid medium consisting of 0.05% ferrous iron, 0.05% calcium carbonate and 1.5% elutriate. After shaking culture at 28 ° C for about 120 hours, the culture broth was filtered using filter paper and obtained The filtrate color and colistin productivity were compared.
  • the M50 strain was selected as a strain that was equivalent to or superior to the colistin-producing ability of 202-71 strain and the color of the filtrate was clearly lighter than that of 202-71 strain.
  • Absorbance at 300-600 nm was measured for the culture filtrates of 202-71 and M50 strains using a spectrophotometer, and the results are shown in FIG.
  • the absorbance at 400 nm was 3.61 for the culture filtrate from 202-71 strains and 1.42 for the culture filtrate from M50 strains (Table 1).
  • Example 1 strain M50 and conventional strength used in colistin fermentation production 202-71 strain with a highly colored culture medium, normal bouillon 2%, yeast 28. Inoculate liquid seed medium with 2% and 0.3% sodium chloride. After culturing for about 24 hours at C, about 15 mL each of corn flour 4.5%, corn meal 1.5%, barley germ 0.2%, defatted soybean 0.2%, ammonium sulfate 1%, Monopotassium phosphate 0.05%, Ferrous sulfate 0.005%, Calcium carbonate 0.05% and Minamata 1.5% Potent liquid medium 4L in 5L jar fermenter was inoculated.
  • Example 3 The 5L jar fermenter culture solution of strains M50 and 202-71 obtained in Example 2 was filtered with a Nutsche with a filter aid (body mix), and then ion-exchanged resin packed in the column ( Amberlite IRC-50 (Na + type), made by Rohm and Haas, 300 mL). The ion-exchange resin power is also about 0.4 molZL sulfuric acid, and then elution of colistin is performed with 600 mL of deionized water. The resulting eluent and washing liquid mixture is concentrated to about 5% concentration (WZV). A containing liquid was obtained.
  • ion-exchanged resin packed in the column Amberlite IRC-50 (Na + type), made by Rohm and Haas, 300 mL.
  • the ion-exchange resin power is also about 0.4 molZL sulfuric acid, and then elution of colistin is performed with 600 mL of deionized water.
  • the absorbance at 400nm of the high colistin solution is 0.035 for the high colistin solution from 202-71, compared to 0.035 for the high colistin solution from the M50 strain, clearly from the M50 strain.
  • the coloration of the high colistin solution was light (Table 3).
  • each colistin-rich solution was spray-dried to obtain the desired colistin bulk powder.
  • the colistin powder from 202-71 was brownish in color.
  • the colistin powder derived from the M50 strain is slightly yellowish white with a slight yellow taste, and the coloration of the colistin powder derived from the M50 strain is clearly lighter than that of the colistin powder derived from the 202-71 strain. It was more white.
  • Each colistin bulk powder was dissolved in deionized water to a concentration of 5% (WZV) to obtain a 5% concentration (WZV) aqueous solution.
  • HPLC mouth matography
  • Mobile phase 4. Dissolve 46 g of anhydrous sodium sulfate in 900 ml of pure water, add 2.5 ml of phosphoric acid, and make up to 100 ml (pH 2.3 to 2.5). This solution 78 is mixed with acetonitrile at a ratio of 22.
  • the liquid containing high colistin derived from 202-71 obtained in Example 3 was tested for the amount of decolorized carbon necessary to make the color tone of the liquid containing high colistin derived from M50 obtained in Example 3. .
  • a novel production strain useful for a method for producing a colistin bulk powder can be provided. Furthermore, by using the strain of the present invention, it is possible to provide an efficient method for producing a colistin powder without going through the decoloring step, which is essential for the conventional method for producing a colistin powder.

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Abstract

　脱色工程による製造時間の増加、コリスチン主成分の収量低下によるコストアップ、さらにカーボン廃棄物の発生による環境負荷などの従来の製造法の問題点を解決する、脱色工程を行わないコリスチン原末の製造法を提供する。 　白色度の高いコリスチン原末を生産することができる、バチルス・ポリミキサ・バー・コリスチニウス、白色度の高いコリスチン原末、および白色度の高いコリスチン原末を製造する方法。

Description

明 細 書
コリスチン原末の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、従来のコリスチン発酵生産に使用される生産菌株と比較して、培養液の 着色が大幅に減少した新規な菌株を取得し、これをコリスチン生産菌株として使用す ることを特徴とする、脱色工程を行うことなぐ白色度の高いコリスチン原末を得る製 造法に関する。
背景技術
[0002] コリスチンは、グラム陰性菌に広く殺菌的に作用するペプチド系抗生物質である。
その作用機序は、細菌の細胞質膜のホスホリパーゼを活性ィ匕することによってリン脂 質の分解を引き起こし、溶菌させることによる。コリスチンの選択毒性は低ぐ腸管か ら吸収されな 、ことから飼料用添加物として広く用いられて 、る。
[0003] 微生物の発酵生産によるコリスチンの製造法としては、安価に入手できるでんぷん 質などを多く含む天然原料を主原料とした、バチルス (Bacillus)属細菌、特にバチル ス ·ポリミキサ (Bacilluspolvmvxa)による発酵生産の方法が知られて!/ヽる（特許文献 1、 2参照)。
[0004] 安価な天然原料を主原料とした、バチルス属細菌、特にバチルス ·ポリミキサにより コリスチンの発酵製造を行う場合、発酵が進行するにつれ培養液の着色も濃くなり、 目的物であるコリスチンの生産量が最高値に達する発酵終了時まで着色は増す。そ の為、コリスチンを含有する培養液から、培地栄養源成分や発酵生成したコリスチン 以外の代謝物などを除去し、コリスチンの純度を高める目的で精製工程を実施して いる。しかし、発酵工程で増加した培養液の着色物質については、上記精製工程で 完全に除去できず、製品であるコリスチン原末に残存し、結果として着色の濃いコリス チン原末となる。特に欧州における医薬品 (動物用医薬品を含む)に用いられる品質 規格である欧州薬局方 5版（2004年 6月 15日発行、 2005年 1月 1日施行）において 、コリスチン原末の色の規格は「白色もしくは概ね白色」と規定されている。この規格 に合格するコリスチン原末を製造するためには、従来のコリスチン原末の製造法では 、精製工程にカーボンを使用するなどの脱色工程が必要であった。カーボンによる 脱色工程を行う従来のコリスチン原末の製造法では、製造に要する時間が増し、しか も、 目的物質であるコリスチン原末の回収率が低下するなどの問題があった。
[0005] 特許文献 1 :特開昭 58— 47493号公報
特許文献 2：特開昭 58— 129993号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、従来のコリスチン原末の製造法において必要であった脱色工程を行うこ となぐ白色度の高いコリスチン原末の製造法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、従来の生産菌株を変 異処理することにより、着色度の減少した菌株を取得し、本菌株を使用することにより
、脱色工程を行うことなぐ白色度の高いコリスチン原末が得られることを見出し、本 発明を完成させるに至った。
[0008] すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
(1) 400nmにおける 5%濃度 (WZV)水溶液の吸光度が 0. 15以下であるコリスチ ン原末を生産することができる、バチルス ·ポリミキサ ·バー 'コリスチ-ウス、
(2) 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号 FE RM AP— 20553として寄託された、バチルス'ポリミキサ 'バ一'コリスチ-ウス M5 0株、
(3) 上記（ 1)または（2)記載のバチルス ·ポリミキサ ·バー 'コリスチ-ウスを培養し、 培養物をイオン交換樹脂に吸着させ、溶出した後、濃縮して、乾燥することを特徴と する、 400nmにおける 5%濃度 (WZV)水溶液の吸光度が 0. 15以下であるコリス チン原末の製造法、
(4) 上記（3)記載の製造法によって得られる、 400nmにおける 5%濃度 (WZV)水 溶液の吸光度が 0. 15以下であるコリスチン原末。
発明の効果 [0009] 本発明により、コリスチン原末の製造法に有用な新規な生産菌株を提供できる。さ らに本発明の菌株を生産菌株として用いることにより、従来のコリスチン原末の製造 方法に必須であった脱色工程を行うことなぐ白色度の高いコリスチン原末の製造法 を提供できる。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]実施例 1で得られた 202— 71株由来の培養濾液および M50株由来の培養濾 液の 300〜600nmにおける吸光度を示す。
[図 2]実施例 3で得られた M50株由来のコリスチン原末を脱イオン水に溶解した液を 液体クロマトグラフィー (HPLC)にて分析したチャートを示す。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 微生物の寄託
バチルス ·ポリミキサ 'バー ·コリスチニウス（Bacillus polvmvxa var. colistinus) M50 株は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 305— 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に、受託番号 FERM ΑΡ- 20 553として平成 17年 5月 31日付けにて寄託された。
[0012] 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、従来のコリスチン発酵生産に使用される生産菌株に対し、人工的な 突然変異処理を行い、目的とする生産菌株を取得した。
人工的な突然変異処理方法としては、人工的な変異処理であれば特に限定されな いが、例えば、 Ν—メチノレー Ν，一-トロー Ν— -トロソグァ-ジン（NTG)、ェチルメタ ンスルホネートなどの変異剤による化学的方法;紫外線照射、 X線照射などの物理的 方法;遺伝子組換え、トランスポゾンなどによる生物学的方法などの変異処理方法を 用!/、ることができる。
突然変異処理を行い得られた菌群は、フラスコを用いて液体培養し、培養液の着 色度およびコリスチンの生産能を指標にしてスクリーニングした。ここで、着色度は、 培養液の濾紙濾過液の 400nmにおける吸光度を測定した値を指標とする。また、コ リスチン生産能は、培養液の濾紙濾過液を HPLCにより分析した値を指標とする。 このようにして、当該着色度が従来の生産菌株に比べて大幅に減少し、且つコリス チン生産能が同等以上の生産菌株バチルス ·ポリミキサ ·バー 'コリスチ-ウス (Bacillu spolvmvxa var. colistinus)を取ネ守し 7こ。
[0013] 本発明においては、バチルス 'ポリミキサ 'バ一'コリスチュウスのコリスチンの生産で 得られるコリスチン原末の白色度が明らかに高い株を用いることができる。具体的に は、 400nmにおける 5%濃度 (WZV)水溶液の吸光度が 0. 15以下、好ましくは 0. 087以下、更に好ましくは 0. 070以上 0. 087以下であるコリスチン原末が得られる バチルス ·ポリミキサ'バー'コリスチュウスであれば、本発明に用いることができる。さ らに、本発明に使用できる生産菌株としては、これらの菌株の継代培養株、変異株、 遺伝子組み替え株などが挙げられる。
[0014] 本発明の生産菌株の一例である M50株を生産菌株として発酵生産した培養液か らカーボンなどによる脱色工程を行うことなく製造したコリスチン原末の色調は、従来 の生産菌株由来の培養液力 脱色工程を行い製造したコリスチン原末の色調と比較 して、明らかに白色度が高いものである。すなわち、本発明で得られた M50株を生 産菌株として用いることで、従来のコリスチン原末の製造法に必須であった脱色工程 を行うことなぐ白色度の高いコリスチン原末を得ることが可能となる。
[0015] 本発明においては、バチルス ·ポリミキサ'バー'コリスチ-ウスを培養し、培養物をィ オン交換樹脂に吸着させ、溶出した後、濃縮して、乾燥することで、脱色工程を行うこ となぐ 400nmにおける 5%濃度 (WZV)水溶液の吸光度が 0. 15以下であるコリス チン原末を製造することができる。これにより、欧州における医薬品 (動物用医薬品を 含む)に用いられるコリスチン原末の品質規格である欧州薬局方の色規格「概ね白色 」に合格するコリスチン原末を製造することが可能となる。また、通常、活性炭などの カーボンを添加して攪拌し濾過するなどの脱色工程が必要であった力 本発明の製 造法では、脱色工程を省略できるため、コリスチン原末の製造に要する時間を約半 日間短縮することが可能である。さらに、脱色に使用するカーボンなどによるコリスチ ン原末の損失を低減できるとともに、従来のコリスチン原末の製造法の脱色工程で使 用していたカーボンなどの廃棄をも回避することができる。
[0016] 尚、本発明におけるコリスチン原末は、ポリミキシン系ペプチド抗生物質として一般 に知られているコリスチンを含有する。コリスチンは、下記構造のコリスチン A、同様の アミノ酸構成を有するコリスチン Bが知られて 、る。
[化 1]
MOA→い Dia→し -Thr
Figure imgf000006_0001
OA： 6- methyloctanoic acia
Dia ： a、 j^-diaminobutyric acid
eolistin A
[0018] 本発明のコリスチン原末とは、コリスチンを医薬品として使用できる程度に含有する 粗抽出物であり、上述したように脱色工程を経ることなく得られるものである。コリスチ ン原末の使用方法は特に制限されず、そのまま使用することもできるし、更に処理し てコリスチン製剤として使用してもよい。
[0019] 以下実施例および試験例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれ らの実施例および試験例に限定されるものではない。また、各実施例および試験例 における吸光度の測定は、 日本分光社製の分光高度計 V— 560を用いて行った。ま た、特に定義の無い場合、％は重量対容量百分率 (WZV)を表す。
実施例
[0020] <実施例 1 >
従来からコリスチン原末の製造に使用して 、るバチルス ·ポリミキサ ·バー 'コリスチ -ウス 202— 71株に対して、濃度 10〜： LOOO /z gZmgの NTGで、温度 25〜30。C、 1分〜 24時間静置もしくは振盪して突然変異処理を行い、トリプトン 2%、イーストェ キス 0. 2%、グルコース 1%力 なる寒天培地プレート上にコロニーを生育させた。各 々のコロニー（菌株）を普通ブイヨン 2%、イーストエキス 0. 2%および塩化ナトリウム 0 . 3%力もなる液体シード培地へ植菌し、 28°Cで約 24時間培養後、約 0. lmLをコー ンフラワー 4. 5%、コーンミール 1. 5%、小麦胚芽 0. 2%、脱脂大豆 0. 2%、硫酸ァ ンモ -ゥム 1%、リン酸一カリウム 0. 05%、硫酸第一鉄 0. 005%、炭酸カルシウム 0 . 05%および水飴 1. 5%からなる液体培地 30mL入の 250mL容三角フラスコへ植 菌した。 28°Cで約 120時間振とう培養後、培養液を濾紙を用いて濾過し、得られた 濾液の色調およびコリスチンの生産性を比較した。これら菌群から 202— 71株のコリ スチン生産能と同等以上で、且つ濾液の色調が明らかに 202— 71株のそれより薄い 菌株として、 M50株を選択した。 202— 71株と M50株の培養濾液について、分光光 度計で 300〜600nmの吸光度を測定し、結果を図 1に示した。 400nmの吸光度は 202— 71株由来の培養濾液で 3.61に対して、 M50株由来の培養濾液では 1.42で あり、明らかな差が認められた (表 1)。
[0021] [表 1]
Figure imgf000007_0001
[0022] <実施例 2 >
実施例 1で得られた培養液の着色が薄い M50株および従来力 コリスチン発酵生 産に使用してレ、る培養液の着色が濃い 202— 71株を、普通ブイヨン 2%、イーストェ キス 0. 2%および塩ィ匕ナトリウム 0. 3%力 なる液体シード培地へ植菌し、 28。Cで約 24時間培養した後、各々約 15mLをコーンフラワー 4. 5%、コーンミール 1. 5%、小 麦胚芽 0. 2%、脱脂大豆 0. 2%、硫酸アンモ-ゥム 1%、リン酸一カリウム 0. 05%、 硫酸第一鉄 0. 005%、炭酸カルシウム 0. 05%および水飴 1. 5%力 なる液体培地 4L入の 5L容ジャーファメンターに植菌した。各々、通気'攪拌しながら PH5.0〜7.0 で 30°Cにて約 120〜： 144時間培養した。得られた培養液を濾紙を用いて濾過し 40 Onmの吸光度を測定したところ、 202— 71株由来の培養濾液では 4.50に対して、 M50株由来の培養濾液では 1.39であり、実施例 1のフラスコでの試験結果と同様に 明らかな差が認められた (表 2)。
[0023] [表 2]
Figure imgf000007_0002
[0024] <実施例 3 > 実施例 2で得られた M50株および 202— 71株の 5L容ジャーファメンター培養液を 、濾過助剤 (ボディミックス)を敷いたヌッチェで濾過した後、カラムに充填したイオン交 換榭脂（アンバーライト IRC— 50 (Na+型）ロームアンドハース社製、 300mL)へ吸着 させた。イオン交換樹脂力も約 0. 4molZL硫酸でコリスチンを溶離させた後 600mL の脱イオン水で洗浄し、得られた溶離液、洗浄液の混合液を約 5%濃度 (WZV)ま で濃縮させ、コリスチン高含有液を得た。コリスチン高含有液の 400nmにおける吸光 度は、 202— 71株由来のコリスチン高含有液が 0. 359に対して、 M50株由来のコリ スチン高含有液が 0. 07であり、明らかに M50株由来のコリスチン高含有液の着色 は薄かった (表 3)。
[表 3]
Figure imgf000008_0001
[0026] さらに、各コリスチン高含有液をスプレードライして、 目的とするコリスチン原末を得 た。 202— 71株由来のコリスチン原末は、茶色を帯びた色調であった。これに対し、 M50株由来のコリスチン原末はやや黄色味力 Sかった白色であり、明らかに M50株由 来コリスチン原末の着色は、 202— 71株由来のコリスチン原末と比較して薄ぐより白 色であった。各々コリスチン原末を 5%濃度 (WZV)となるよう脱イオン水に溶解し、 5 %濃度 (WZV)水溶液を得た。 400nmにおける 5%濃度 (W/V)水溶液の吸光度 を測定したところ、 202— 71株由来のコリスチン原末では 0. 479に対して、 M50株 由来のコリスチン原末では 0. 087であり、明らかな差が認められた (表 4)。
[0027] [表 4]
Figure imgf000008_0002
<試験例 1 >
実施例 3で得られた M50株由来コリスチン原末を脱イオン水に溶解した液を液体ク 口マトグラフィー（HPLC)にて分析し、その結果を図 2に示した。 HPLCの測定条件 は下記のとおりである。
測定条件
検出器：吸光度検出器 (測定波長： 215nm)
カラム： YMC— Pack ODS— AM (AM— 312) (ヮイエムシ一社製）
150mm X Φ4. 6mm
カラム温度： 30°C
移動相： 4. 46gの無水硫酸ナトリウムを 900mlの純水に溶解し、 2. 5mlのリン酸を 加え、 100mlにメスアップする（pH2. 3〜2. 5)。この溶液 78にァセトニトリルを 22の 割合で混合する。
流量： 1. Oml/ mm
[0029] <試験例 2>
実施例 3で得られた 202— 71株由来のコリスチン高含有液を、実施例 3で得られた M50株由来のコリスチン高含有液の色調にするために必要な脱色カーボン量につ いて試験した。 202— 71株由来のコリスチン高含有液の固形分換算量に対し、 2%、 5%、 10% (それぞれ WZV)に相当するカーボン (精製白鷺、武田薬品工業社製)を 添加して 30分間撹拌した後、桐山ロートで濾過し、得られた濾液をスプレードライし た。各スプレードライ粉末を脱イオン水に溶解し、 5%濃度 (WZV)水溶液を得た。 4 OOnmにおける 5%濃度 (WZV)水溶液の吸光度を測定した結果、最も脱色カーボ ン量が多い 10% (WZV)カーボン添加水溶液でも吸光度は 0. 135であり、実施例 3で得られた脱色カーボン処理を行っていない M50株由来のコリスチン高含有液の 吸光度 0. 087に達しな力つた (表 5)。
[0030] [表 5] 添加カ ホ"ン量（W/V) 吸光度 （400mn) コリスチン 苗: fct
収率ロ ス （％) 50 0% 0. 087 0
202-71 0% 0. 479 0
2% 0. 246
5%
10% 26. 7
[0031] また、 10% (wZv)カーボン添カ卩における、脱色工程によるコリスチンの収率ロス は約 27%であり（表 5)、脱色工程を含むコリスチンの製造法におけるコリスチンの収 率は明らかに低下していた。従来の生産菌株 o oで白色度の高いコリスチン原末を得る ためには、多量の脱イオン水でイオン交換榭脂をO C洗0 0浄するか、イオン交換榭脂から の溶離液を多量のカーボンで処理する脱色工程を経なければならな力つたが、培養 液の着色が薄くカーボンによる脱色工程を必要としな ヽ M50株を用いたコリスチン原 末の製造法は非常にメリットが大きレ、。
産業上の利用可能性
[0032] 本発明により、コリスチン原末の製造法に有用な新規な生産菌株を提供できる。さ らに本発明の菌株を用いることにより、従来のコリスチン原末の製造法に必須であつ た脱色工程を経ることなぐ効率的なコリスチン原末の製造法を提供できる。

Claims

請求の範囲
[1] 400nmにおける 5%濃度 (WZV)水溶液の吸光度が 0. 15以下であるコリスチン 原末を生産することができる、バチルス ·ポリミキサ ·バー 'コリスチニウス。
[2] 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号 FERM
AP— 20553として寄託された、バチルス 'ポリミキサ 'バ一'コリスチ-ウス M50株
[3] 請求項 1または 2に記載のバチルス 'ポリミキサ'バー'コリスチ-ウスを培養し、培養 物をイオン交換樹脂に吸着させ、溶出した後、濃縮して、乾燥することを特徴とする、 400nmにおける 5%濃度 (WZV)水溶液の吸光度が 0. 15以下であるコリスチン原 末の製造法。
[4] 請求項 3に記載の製造法によって得られる、 400nmにおける 5%濃度 (WZV)水 溶液の吸光度が 0. 15以下であるコリスチン原末。
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