KR102141846B1

KR102141846B1 - 이퀄 생산능을 갖는 신규 락토바실러스 속 균주 및 이를 이용한 이퀄 생산 방법

Info

Publication number: KR102141846B1
Application number: KR1020180162473A
Authority: KR
Inventors: 박선민; 원항
Original assignee: 박선민
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2020-08-06
Also published as: KR20200073844A

Abstract

본 발명은 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주 및 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주, 상기 균주 또는 배양물을 포함하는 이퀄 생산용 조성물, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 이퀄 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주 및 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주는 청국장 발효의 첨가제 균주로서 안전하고, 신뢰할 수 있으며 광범위한 배양 조건을 가진 조건적 혐기성 박테리아이므로 이를 이용하여 산업적으로 이퀄을 쉽게 생산할 수 있다. 본 발명의 균주를 이용하여 청국장 및/또는 다이드제인으로부터 생산된 이퀄은 갱년기 질환에 사용할 수 있으며 항산화제, 항암제 또는 항돌연변이제 등으로 사용할 수 있다.

Description

이퀄 생산능을 갖는 신규 락토바실러스 속 균주 및 이를 이용한 이퀄 생산 방법{Novel Lactobacillus sp. Strains Having an ability to produce Equol and Method for Producing Equol Using the Same}

본 발명은 이퀄 생산능을 갖는 신규 락토바실러스 속 균주 및 이를 이용한 이퀄 생산 방법에 관한 것이다.

에스트로겐 결핍은 홍조, 수면 중 식은 땀 및 질 건조증을 포함하는 혈관 운동 증상과 같은 갱년기 증상을 유발한다. 에스트로겐 대체 요법은 이러한 증상을 예방한다. 그러나, 에스트로겐 대체 요법은 유방암 및 자궁 내막암의 위험을 증가시키기 때문에 폐경기 여성에게 권장하지 않는다. 서양에서도 폐경기 여성의 약 40-50%는 대체 의학으로 갱년기 증상을 치료하고 있다.

폐경기 여성이 식물성 에스트로겐을 함유한 식품을 섭취하면 폐경기 증상은 완화될 수 있다. 콩에는 일종의 식물성 에스트로겐인 이소플라본(isoflavone)이 많은 양 포함되어 있다.

콩의 기능성 성분인 이소플라본은 장내 세균에 의해 최종적으로 이퀄(equol)로 전환된다. 콩의 호르몬과 관련된 다양한 질환의 예방 및 치료에 대한 기능성은 이퀄에 의해 결정된다는 가능성이 제기되었다.

체내에서의 콩 이소플라본의 생리활성 여부는 이퀄 생산능에 의해 결정된다고 볼 수 있다. 콩에 포함된 이소플라보노이드(다이드제인, 제니스테인, 글리시테인 등)은 에스트라디올과 그 구조가 유사하여 에스트로겐 수용체의 결합에 의해 나타나는 에스트로겐 조절제(항에스트로겐 작용 및 에스트로겐 유사)의 작용을 나타낸다. Ken Setchell 등의 연구에 따르면, 콩 이소플라본의 건강상 긍정적인 효과는 이소플라본이 아닌 최종대사체인 이퀄의 체내 생산능 유/무에 의한다고 보고되었다(J Nutr. 2002 Dec;132(12):3577-84.).

콩 이소플라본 섭취 시, 최종적으로 체내에서 이퀄을 생산할 수 있는 능력을 가진 이퀄생산자(equol producer) 비율은 서구인의 25-30%, 한중일(韓中日) 인구의 약 50-60%로 추정된다.

일반적으로 천연물에 존재하는 이소플라본은 당이 결합된 배당체 형태로 존재하며, 식이로 섭취된 이소플라본은 흡수가 되기 전에 장내 미생물에 의해 대사되고(β-glucosidase, 가수분해과정), 이 대사경로는 다이드제인이 디하이드로다이드제인(dihydrodaidzein, DHD), 테트라하이드로다이드제인(tetrahydrodaidzein, THD)과 같은 중간대사산물을 거쳐 이퀄로 대사되거나 또 다른 대사산물인 디하이드로이퀄로부터 이퀄이 유도된다.

미생물을 이용한 이퀄 생합성에는 다양한 균주의 공동 배양이 요구되며, 배양 조건도 까다롭고 그 수율도 약 0.25%로 높지 않아 아직 산업적 생산이 어려운 상태이다. Sigma사에서 판매하는 이퀄의 가격은 약 $600/5 mg이다.

천연 이퀄을 경제적이고 효율적으로 그리고 지속적으로 생산될 수 있다면, 이퀄을 생산할 수 있는 장내세균이 없거나 또는 다른 요인에 의해 이퀄을 생산하지 못하는 사람에게 기능성 식품 또는 약학적으로 적용될 수 있다. 이러한 실정으로 현재 이퀄 생산을 위한 연구가 많이 진행되고 있으나, 그 생산량이 적고 이퀄 전환 수율에 대한 정확한 연구 결과 보고도 부족하며 콩 발효물로부터 효율적인 이퀄 생산을 위한 추출법 또한 정립되지 않은 실정이다.

또한, 발효법에 의해 얻어지는 이퀄 함유물에는 잠재적 알레르겐 성분이 포함될 수 있는 가능성이 존재하므로 이퀄이 안전한 식의약품으로 개발하기 위해서는 고순도 정제 기술 확립이 반드시 필요하며, 현재 이퀄의 정제방법에 대한 보고 역시 거의 없기 때문에 향후 공업적인 응용이 가능하고 고효율·저비용 정제 기술 확립이 필요하다.

본 발명자들은 이퀄을 효과적으로 생산할 수 있는 신규 균주를 발굴하고자 연구하였다. 그 결과, 랫트의 배설물로부터 신규한 락토바실러스 인테스티날리스(Lactobacillus intestinalis) LC096206 균주 및 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) NR117574 균주를 동정하고, 상기 균주가 청국장 및/또는 다이드제인으로부터 높은 수율로 이퀄을 생산할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이퀄 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이퀄 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 16S rRNA가 서열번호 1의 염기서열로 구성되고, 기탁번호 KCTC 13676BP인, 락토바실러스 인테스티날리스(Lactobacillus intestinalis) LC096206 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 16S rRNA가 서열번호 2의 염기서열로 구성되고, 기탁번호 KCTC 13677BP인, 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) NR117574 균주를 제공한다.

본 발명자들은 이퀄을 효과적으로 생산할 수 있는 신규 균주를 발굴하고자 연구하였다. 그 결과, 랫트의 배설물로부터 신규한 락토바실러스 인테스티날리스(Lactobacillus intestinalis) LC096206 균주 및 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) NR117574 균주를 동정하고, 상기 균주가 청국장 및/또는 다이드제인으로부터 높은 수율로 이퀄을 생산할 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주 및 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주는 청국장 발효의 첨가제 균주로서 안전하고, 신뢰할 수 있으며 광범위한 배양 조건을 가진 조건적 혐기성 박테리아이므로 이를 이용하여 산업적으로 이퀄을 쉽게 생산할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주 및 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주는 랫트의 배설물로부터 분리된 균주이다.

본 발명에 따른 미생물의 분리 및 동정은 다음 방법에 의해 수행되었다. 랫트의 대변을 수득하여 이퀄 합성 능력을 확인하고 혐기 배양한 다음, 고체 배지에서 배양하여 이퀄 합성 능력을 갖는 미생물을 스크리닝하였다. 고체 배지로부터 선별한 균주에 대하여 16S rRNA의 염기서열을 분석한 결과, 락토바실러스 인테스티날리스 및 락토바실러스 존소니이 균주로 동정되었으며, 이를 각각 LC096206 및 NR117574로 명명하였다. 동 미생물을 2018년 10월 24일자로 부다페스트조약하의 국제기탁기관인 한국미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁번호 KCTC 13676BP 및 KCTC 13677BP로 기탁하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주 및 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주는 이퀄 생산능을 갖는다.

본 명세서에서 용어 "이퀄(equol)"은 대장 및 기타 식물에서 발견되는 이소플라본의 일종인 다이드제인으로부터 대사되는 이소플라반디올 에스트로겐(isoflavandiol estrogen)으로 4',7-이소플라반디올(4',7-isoflavandiol)로 불리기도 한다. 에스트라디올과 같은 내인성 에스트로겐 호르몬은 스테로이드이지만 이퀄은 비스테로이드 에스트로겐이다. 그러나 인구의 약 30-50%만 이퀄을 생산하는 장내 박테리아를 가지고 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주는 청국장 또는 다이드제인을 이퀄로 대사할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주는 이퀄 생산에 관여하는 효소인 다이드제인 환원 효소(daidzein reductase), 디하이드로다이드제인 환원 효소(dihydrodaidzein reductase) 및 테트라하이드로다이드제인 환원 효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주는 청국장을 이퀄로 대사할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주는 이퀄 생산에 관여하는 효소인 다이드제인 환원 효소(daidzein reductase) 및 디하이드로다이드제인 환원 효소(dihydrodaidzein reductase)를 갖는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13676BP인 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는 이퀄 생산용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "배양물"은 본 발명의 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정 기간 배양하여 얻는, 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 배지를 의미한다. 상기 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주는 이퀄 생산능을 갖는 균주이므로, 상기 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주 또는 이의 배양물은 이퀄을 생산하기 위한 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13676BP인 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주를 배양하는 단계를 포함하는 이퀄 생산 방법에 관한 것이다.

상기 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주는 다이드제인, 콩 추출물 및 콩 발효물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 이용하여 이퀄을 생산할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주를 다이드제인, 콩 추출물 및 콩 발효물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 배지에 접종하여 혐기적 조건으로 배양한다.

상기 '콩 추출물'은 콩에 대한 용매 조추출물, 특정 용매 가용 추출물(용매 분획물) 및 용매 조추출물의 용매 분획물을 포함하며, 상기 콩 추출물은 용액, 농축물 및/또는 분말 상태일 수 있다.

구체적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다.

상기 '콩 발효물'은 콩을 원료로 미생물의 발효 작용을 이용하여 제조한 것을 의미하며, 예를 들어, 청국장일 수 있다.

상기에서 배지는 특별히 한정되지 않으며 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산 또는 비타민 등이 함유된 통상의 미생물 배양용 배지를 말한다. 상기 탄소원으로는 포도당(glucose), 당밀(molasses), 젖당(lactose), 설탕(sucrose), 말토스(maltose), 덱스트린(dextrin), 전분(starch), 만니톨(mannitol), 솔비톨 (sorbitol) 또는 글리세롤(glycerol)을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 포도당과 당밀을 사용한다. 상기 질소원으로는 암모니아(ammonia), 염화 암모늄(ammonium chloride), 황산암모늄(ammonium sulfate)과 같은 각종 무기 질소원이나 펩톤(peptone), NZ-아민(NZ-amine), 육류 추출물(beef extract), 효모 추출물 (yeast extract), 옥수수 침지액(corn steep liquor), 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해 생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물과 같은 유기 질소원을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 효모 추출물 또는 옥수수 침지액을 사용한다. 상기 무기 화합물로는 인산1수소칼륨(Kalium monohydrogen phosphate), 인산2수소칼륨(kalium dihydrogen phosphate), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 황산철(ferrous sulfate), 황산망간(manganese sulfate) 또는 탄산칼슘(calcium carbonate)등을 사용할 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 또는 영양 요구성 염기 등을 추가로 첨가할 수 있다. 예를 들면, 상업적으로 구입할 수 있는 TH(Thioglycollate) 배지를 이용할 수 있으며, 상기 배지에 다이드제인, 콩 추출물 및 콩 발효물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 첨가하여 균주 배양에 이용할 수 있다. 상기 콩 발효물은 청국장일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 균주의 배양이 완료된 후 당업계에 공지된 방법을 사용하여 배양물로부터 이퀄을 분리 및 정제할 수 있다. 예를 들면, 멤브레인 여과법, 분별 침전법, 결정화법 또는 컬럼 크로마토그래피법 등을 들 수 있다. 상기와 같이 분리 및 정제된 이퀄은 식품 형태 또는 의약품 형태로 가공될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13677BP인 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는 이퀄 생산용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "배양물"은 본 발명의 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정 기간 배양하여 얻는, 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 배지를 의미한다. 상기 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주는 이퀄 생산능을 갖는 균주이므로, 상기 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주 또는 이의 배양물은 이퀄을 생산하기 위한 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13677BP인 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주를 배양하는 단계를 포함하는 이퀄 생산 방법에 관한 것이다.

상기 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주는 콩 추출물 또는 콩 발효물, 예를 들어, 청국장을 이용하여 이퀄을 생산할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주를 콩 추출물 또는 콩 발효물을 포함하는 배지에 접종하여 혐기적 조건으로 배양한다.

도 1은 이퀄의 생합성 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 청국장 또는 다이드제인을 포함하는 배지에서 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주(211-C) 및 락토바실러스 존소니이 NR117574 균주(211-B)의 이퀄 합성 효율을 평가한 결과이다.
도 3a는 LC 분석을 통한 이퀄 표준물질에 대한 맵핑 결과를 나타낸다.
도 3b는 LC 분석을 통한 제니스테인 표준물질에 대한 맵핑 결과를 나타낸다.
도 3c는 LC 분석을 통한 다이드제인 표준물질에 대한 맵핑 결과를 나타낸다.
도 4는 배지 내 다이드제인 첨가 농도에 따른 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주(211-C)의 이퀄 생산 정도를 TLC로 확인한 결과이다.
도 5는 배지 내 다이드제인 첨가 농도에 따른 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주(211-C)의 이퀄 생산 정도를 LC로 확인한 결과이다.
도 6a는 다이드제인, 제니테인, 이퀄 및 청국장 각각에 대한 TLC 결과이다.
도 6b는 다이드진, 제니틴 및 이퀄, 그리고 청국장에 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주(211-C)를 접종하여 발효한 실험군에 대한 TLC 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1. 이퀄을 생산하는 미생물의 분리 및 동정

1-1. 미생물의 분리 및 정제

40 주령의 암컷 랫트(SD, DBL, Korea)를 희생시킨 후 신속하게 맹장을 제거하고 0.5 g의 대변을 시스테인 0.5 g을 함유한 9 ml 멸균 혐기성 링거 용액에 희석시켰다. 불용성 불순물은 원심 분리를 통해 제거하였고 박테리아는 3회 세척하였다. TSA 한천 플레이트(ASAN, 한국)에 박테리아를 접종하였다. 한천 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양기(JEIO TECH, FO-450M, Korea)에서 배양하였다. 균주는 TSA 한천 플레이트에서 분리하였고, 분리는 단일 종(single species)이 될 때까지 반복하였다.

1% 청국장(SCGB 1, 순창, 한국)을 첨가한 Thioglycollate 배지(TH, DifcoTM Fluid, USA)에 단일 콜로니를 접종하였다. 한천 플레이트에서 단일 세균을 선택하고 1% 청국장 또는 200 μM 다이드제인을 첨가한 thioglycollate 배지에 7 Х 10⁸ 박테리아를 접종하였다. 37℃ 배양기(JEIO TECH, IL-21a, Chesapeake)에서 120시간, 100 rpm 조건으로 혐기 배양하였다. 배양 후 시료를 15 mL 인산 완충액(pH = 7.0), 에틸 아세테이트(HPLC 등급) 25 mL와 20 초 동안 혼합하고 6000 * g에서 5 분간 원심 분리하였다. 상등액을 65℃, 0.04 MPa, 75 rpm/min 조건으로 회전 증발기(SB-1200, EYELA, CHINA)에서 증발시켰다. 배양액 추출물에 1 mL의 메탄올을 첨가하여 용해시키고 0.45 μm 여과막으로 여과시켰다. 여과한 시료는 이퀄 생산을 확인하기 위해 TLC에 사용하였다. 이퀄 함량은 UPLC-Mass를 이용하여 정량화하였다.

1-2. 균주 동정

고형 배지로부터 선별한 박테리아에 대하여 16S rRNA 서열을 분석하고, 동정하였다. 박테리아 DNA 추출하고 16S rRNA 유전자에 대하여 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 생성물을 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 겔 정제하였다. PCR 프라이머(27F 및 1492R) 및 1차 시퀀싱 반응(785F 및 907R, 표 1)의 시퀀싱 데이터로부터 디자인된 추가 프라이머를 사용하여 제조사(Perkin-Elmer, Foster City, California, USA)의 지시에 따라 ABI 310 자동 시퀀서로 PCR 생성물의 두 가닥을 두 번 시퀀싱 하였다. PCR 산물의 서열은 CLUSTAL W 프로그램을 사용하여 다중 서열 정렬에 의해 GenBank 데이터베이스 내의 공지된 16S rRNA 유전자 서열과 비교하였다.

분리된 균주는 16S rRNA 서열 분석을 통해 Lactobacillus 속 균주로 분류되었다. 상세하게는 211-B는 Lactobacillus johnsonii(NR117574.1, 99%)로, 211-C는 Lactobacillus intestinalis(LC096206.1, 99%)로 동정되었다. 이 균주들은 청국장에서 이퀄을 안정적으로 생산할 수 있었다. 그람 염색법을 통해 211-B와 211-C가 거의 둥근 콜로니 및 톱니 모양 가장자리를 나타내는 그람 양성 간균임을 확인하였다.

프라이머 이름	프라이머(5'-3')	서열번호
27F	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG	3
1492R	TACGGYTACCTTGTTACGACTT	4
785F	GGATTAGATACCCTGGTA	5
907R	CCGTCAATTCMTTTRAGTTT	6

실시예 2. 다이드제인으로부터 이퀄을 생산하는데 관여하는 효소에 대한 분석

분리된 미생물을 농축한 후, RNA Mini Kit(PureLinkTM, USA)의 지시에 따라 총 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. 실시간 PCR(CFD-3120, BIO RAD, Singapore)을 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 표 2와 같다.

프라이머 이름	프라이머(5'-3')		서열번호
테트라하이드로다이드제인 환원 효소	F	RTYAACGGCRAYATGCAGGT	7
테트라하이드로다이드제인 환원 효소	R	GGMAYYTCCATGTTGTAGGA	8
디하이드로다이드제인 환원 효소	F	CTCGAYCTSGTSTACAACGT	9
디하이드로다이드제인 환원 효소	R	GARTTGCAGCGRATKCCGAA	10
다이드제인 환원 효소	F	CTACATCGGTAACCTAGAGGTCG	11
다이드제인 환원 효소	R	CCGTGCTGCTTGATGGTCTTTGC	12
β-액틴	F	AGCGTGGCTACAGCTTCACC	13
β-액틴	R	AAGTCTAGGGCAACATAGCACAGC	14

다이드제인으로부터 이퀄을 생합성하는 과정은 도 1과 같다. 본 발명에서 분리한 211-C 균주는 다이드제인으로부터 이퀄을 생산하는데 있어서 다이드제인 환원 효소, 디하이드로 다이드제인 환원 효소 및 테트라하이드로 다이드제인 환원 효소, 세 가지 효소를 발현하였다. 211-B 균주는 다이드제인 환원 효소 및 디하이드로 다이드제인 환원 효소, 두 가지 효소를 발현하였다(표 3). 암컷 Sprague Dawley 랫트의 Cecum digesta에서 다른 효소의 함량은 디하이드로다이드제인 환원 효소를 제외하고는 매우 낮았다.

NAME	다이드제인 환원 효소	디하이드로다이드제인 환원 효소	테트라하이드로다이드제인 환원 효소	β-actin
211-B	31.63(6.24)	33.06(2.43)	N/A	31.94(0.55)
211-C	30.05(6.27)	33.53(2.09)	39.10(0.37)	32.52 (0.08)
Caecum　digesta	N/A	34.50(2.62)	N/A	31.19 (0.27)

*Average(Std Dev), n=3 ;* *No detection

실시예 3. 이퀄의 합성 수율 평가

3-1. 이퀄 전환율 측정

다이드제인으로부터 이퀄이 생합성되는 경로에 기초하여 다이드제인 농도별 이퀄 전환율을 TLC 및 LC로 결정하였다. PB-Thioglycollate 배지에 211-C 균주(7 *10⁸)와 0 μmol/L, 25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L 및 600 μmol/L의 다이드제인(98 %, HUILIN BIO, CHINA)을 각각 첨가하고, 최적 농도와 전환율을 조사하였다.

3-2. TLC(Thin-layer chromatography) 분석

이퀄(98%, HUILIN BIO, CHINA), 다이드제인(98%, HUILIN BIO, CHINA) 및 제니스테인(98%, HUILIN BIO, CHINA)을 표준물질로 사용하였다. 전개용매(developing agent)로 톨루엔/아세톤(2:1, v/v, HPLC grade) 및 아세트산(1%, HPLC grade)을 사용하였다. 요오드는 시각화를 위해 사용되었다.

3-3. LC(liquid chromatography) 분석

Acquity UPLC BEH C18 컬럼(2.1 mm Х 100 mm, 1.7 μm)을 Acquity UPLC 시스템(Waters, Miliford, MA, USA)에 적용하여 분석하였다. 0.1% 포름산 수용액(용매 A) 및 0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴(용매 B)을 포함하는 이동상을 이용하여 농도 구배 용출 프로그램을 수행하였다: 0-5분, 25-100% 용매 B; 5-7분, 100% 용매 B; 7-8분, 100-25% 용매 B. 유속은 0.4 mL/min으로 설정하고 컬럼 온도는 40℃로 유지하였다. 오토 샘플러는 4℃로 조절하였으며 주입량은 5 μL이었다. 질량 분광 분석은 ESI(electrospray ionization) 모드가 장착된 Waters Xevo TQ triple-quadrupole 질량 분광계를 사용하여 실시하였다. ESI 소스는 MRM(multiple reaction monitoring) 모드로 양이온과 음이온 모드 사이에서 전환되도록 작동되었다. 이퀄에 대해서는 m/z 241.1 → 119.1의 네거티브 모드를 사용하고, 다이드제인의 경우 m/z 255.01 → 136.99, 제니스테인의 경우 m/z 271.03 → 90.98의 포지티브 모드를 사용하여 정량화를 수행하였다. 검출기는 콘 전압 32 V, 모세관 전압 2.7 kV에서 작동되었다. 원료 온도는 150℃, 탈 용매 유량은 800 L/h, 탈 용매 가스 온도는 400℃로 설정하였다.

3-4. 다이드제인 및 청국장으로부터 이퀄 합성 효율 평가

분리 및 정제된 균주를 1% 청국장 및 200 μmol/L 다이드제인을 각각 함유한 PB-Thioglycollate 배지에 접종하고 37℃에서 120시간 동안 100 rpm으로 회전 배양기(JEIO TECH, IL-21A, 한국)에서 배양하였다. 대두 이소플라본인 다이드제인, 제니스테인 및 이퀄의 변화를 TLC 및 LC를 이용하여 정성적, 정량적으로 분석하였다.

211-B 및 211-C는 청국장으로부터 이퀄을 합성할 수 있었고, 211-C는 다이드제인을 이퀄로 바로 전환시킬 수 있었다(도 2).

3-5. 합성 이퀄의 수율 측정 결과

이퀄, 제니스테인 및 다이드제인의 표준 물질에 대한 맵은 각각 도 3a, 도 3b 및 도 3c에 표시하였다. TLC(도 4)와 LC(도 5)의 결과를 통해, 211-C 박테리아가 뛰어난 이퀄 합성능을 가지고 있음을 확인하였다. 배지 내 다이드제인 농도 400 μmol/L까지 이퀄 생성이 증가하였다(도 5). 다이드제인은 농도가 200 μmol/L 미만일 때, 다이드제인은 100% 이퀄로 전환되었다(도 5). 다이드제인 농도가 200-400 μmol/L 일 때, 다이드제인의 가수 분해능은 서서히 감소하였지만 이퀄의 합성에는 큰 변화가 없었다. 다이드제인의 농도가 400 μmol/L를 초과하면 이퀄 합성 양은 더 이상 증가하지 않았다. 즉, 이 농도가 도달 용량의 포화점이다.

도 5의 배지 내 다이드제인 첨가 농도에 따른 이퀄 전환율은 표 4 및 표 5와 같다. 표 4는 몰 질량(μmol/L), 표 5는 질량(mg/L)을 기준으로 전환율을 계산하였다.

다이드제인 첨가량(μmol/L)	이퀄 전환량(μmol/L)	전환율
25	3.797416	15.19%
50	12.8094	25.62%
100	29.20983	29.21%
200	59.06633	29.53%
400	109.2032	27.30%
600	98.3063	16.38%

다이드제인 첨가량(mg/L)	이퀄 전환량(mg/L)	전환율
10.4	0.92	8.85%
20.8	3.103333	14.92%
41.6	7.076667	17.01%
83.2	14.31	17.20%
166.4	26.45667	15.90%
249.6	23.81667	9.54%

3-6. 청국장 발효 후 대두 이소플라본의 함량 변화 분석

다이드제인, 제니스테인 및 이퀄의 RF(Retention Factor) Value는 각각 0.424, 0.506 및 0.576이다. 청국장 추출물에는 다이드제인(daidzein) 및 제니스테인(genistein)이 포함되어 있으나, 이퀄(equol)은 포함되어 있지 않다(도 6a).

청국장에 211-C(L. intestinalis)를 접종하여 48시간 배양한 후에 많은 양의 이퀄이 생산되었다(표 6). 박테리아를 접종하지 않은 청국장 추출물(대조군)은 이퀄을 생산하지 않았고 다이드제인과 제니스테인은 존재했다. 그러나 박테리아(실험군)를 접종한 청국장 추출물은 다이드제인 뿐만 아니라 제니스테인을 사용하여 이퀄을 충분히 생산하였다. 211-C로 발효된 청국장에서의 이퀄 생산량은 약 13 μmol/L이다.

	다이드제인(μmol/L)	제니스테인(μmol/L)	이퀄(μmol/L)
대조군-1	2.72(0.14)	2.94(0.14)	N/A
대조군-2	2.48(0.14)	2.62(0.14)	N/A
대조군-3	3.05(0.14)	3.40(0.14)	N/A
*L.intestinalis* -1	N/A	N/A	13.12(1.39)
*L.intestinalis* -2	N/A	N/A	13.43(1.83)
*L.intestinalis* -3	N/A	N/A	10.33(1.75）

Average (Std Dev), n=3 N/A No detection

한국미생물자원센터

KCTC13676BP

20181024

한국미생물자원센터

KCTC13677BP

20181024

<110> PARK, SUN MIN <120> Novel Lactobacillus sp. Strains Having an ability to produce Equol and Method for Producing Equol Using the Same <130> PN180361 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1500 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus intestinalis LC096206 16S rRNA <400> 1 aggacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcgagctgaa ccagcagatt 60 cacttcggtg atgacgctgg gaacgcgagc ggcggatggg tgagtaacac gtgggtaacc 120 tgccctaaag tctgggatac cacttggaaa caggtgctaa taccggataa caacaatagc 180 tgcatggcta ttgcttaaaa ggcggcgaaa gctgtcgcta aaggatggac ccgcggtgca 240 ttagctagtt ggtaaggtaa cggcttacca aggcgacgat gcatagccga gttgagagac 300 tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360 atcttccaca atgggcgaaa gcctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg 420 gatcgtaaag ctctgttgtt ggtgaagaag gatagaggta gtaactggcc cctatttgac 480 ggtaatcaac cagaaagtca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540 gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggaaaga taagtctgat 600 gtgaaagccc ccggcttaac cgaggaattg catcggaaac tgtgtttctt gagtgcagaa 660 gaggagagtg gaactccatg tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720 ggcgaaggcg gctctctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac 780 aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tgggaggttt 840 ccgcctctca gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag 900 gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960 gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatctagt gccatcctaa gagattagga 1020 gttcccttcg gggacactaa gacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080 tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgttatt agttgccagc attaagttgg 1140 gcactctaat gagactgccg gtgacaaatc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1200 atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggg cagtacaacg agaagcgagc 1260 ctgcgaaggc aagcggatct cttaaagctg ttctcagttc ggactgcagt ctgcaactcg 1320 actgcacgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc 1380 cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tggaagtctg caatgcccga agccggtggc 1440 ctaaccactt atgtggaagg agccgtctaa ggcagggcag atgactgggg tgaagtctaa 1500 1500 <210> 2 <211> 1518 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus johnsonii NR117574 16S rRNA <400> 2 tttttttccc tgccagacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcgagct 60 tgcctagatg attttagtgc ttgcactaaa tgaaactaga tacaagcgag cggcggacgg 120 gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccaaga gactgggata acacctggaa acagatgcta 180 ataccggata acaacactag acgcatgtct agagtttgaa agatggttct gctatcactc 240 ttggatggac ctgcggtgca ttagctagtt ggtaaggtaa cggcttacca aggcaatgat 300 gcatagccga gttgagagac tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 360 acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc 420 gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttggt agtgaagaaa gatagaggta 480 gtaactggcc tttatttgac ggtaattact tagaaagtca cggctaacta cgtgccagca 540 gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagtgca 600 ggcggttcaa taagtctgat gtgaaagcct tcggctcaac cggagaattg catcagaaac 660 tgttgaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaactccatg tgtagcggtg gaatgcgtag 720 atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctctctggt ctgcaactga cgctgaggct 780 cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgag 840 tgctaagtgt tgggaggttt ccgcctctca gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc 900 ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 960 tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatccagt 1020 gcaaacctaa gagattaggt gttcccttcg gggacgctga gacaggtggt gcatggctgt 1080 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcatt 1140 agttgccatc attaagttgg gcactctaat gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1200 ggggatgacg tcaagtcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1260 cggtacaacg agaagcgaac ctgcgaaggc aagcggatct cttaaagccg ttctcagttc 1320 ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1380 cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtctg 1440 taacacccaa agccggtggg ataaccttta taggagtcag ccgtctaagg taggacagat 1500 gattagggtg aagtctaa 1518 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F <400> 3 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R <400> 4 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 785F <400> 5 ggattagata ccctggta 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 907R <400> 6 ccgtcaattc mtttragttt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetrahydrodaidzein reductase F <400> 7 rtyaacggcr ayatgcaggt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetrahydrodaidzein reductase R <400> 8 ggmayytcca tgttgtagga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dihydrodaidzein reductase F <400> 9 ctcgayctsg tstacaacgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dihydrodaidzein reductase R <400> 10 garttgcagc gratkccgaa 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Daidzein reductase F <400> 11 ctacatcggt aacctagagg tcg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Daidzein reductase R <400> 12 ccgtgctgct tgatggtctt tgc 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin F <400> 13 agcgtggcta cagcttcacc 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin R <400> 14 aagtctaggg caacatagca cagc 24

Claims

16S rRNA가 서열번호 1의 염기서열로 구성되고, 기탁번호 KCTC 13676BP인, 락토바실러스 인테스티날리스(Lactobacillus intestinalis) LC096206 균주.

제 1 항에 있어서, 상기 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주는 이퀄(equol) 생산능을 갖는 것인, 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주.

기탁번호 KCTC 13676BP인 락토바실러스 인테스티날리스(Lactobacillus intestinalis) LC096206 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는 이퀄(equol) 생산용 조성물.

기탁번호 KCTC 13676BP인 락토바실러스 인테스티날리스(Lactobacillus intestinalis) LC096206 균주를 배양하는 단계를 포함하는 이퀄(equol) 생산 방법.

제 4 항에 있어서, 상기 배양은 락토바실러스 인테스티날리스 LC096206 균주를 다이드제인, 콩 추출물 및 콩 발효물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 배지에 접종하여 혐기적 조건으로 배양하는 것인, 이퀄 생산 방법.

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