JP7156980B2 - 植物病原菌に対する抗菌活性を有する機能性ペプチド - Google Patents
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(1)アミノ酸配列:MRTKKEALVKVLGETKLLKKLLRKLEEEISRSL(配列番号1)からなる又は当該アミノ酸配列に対して85%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、若しくは配列番号1に示したアミノ酸配列における連続する5以上のアミノ酸配列からなる、機能性ペプチド。
(2)上記連続する5以上のアミノ酸配列は、配列番号1に示したアミノ酸配列におけるN末端から数えて14~33アミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列であることを特徴とする(1)記載の機能性ペプチド。
(3)ETKLLKKLLRKLEEEISRSL(配列番号2)からなることを特徴とする(1)記載の機能性ペプチド。
(4)上記(1)~(3)いずれかに記載の機能性ペプチドをコードする核酸。
(5)上記(4)記載の核酸を有する組換えベクター。
(6)上記(5)記載の組換えベクターを有する形質転換体。
(7)上記組換えベクターにより形質転換された植物細胞又は植物体であることを特徴とする(6)記載の形質転換体。
(8)上記(1)~(3)いずれかに記載の機能性ペプチドを含む、植物病原菌に対する殺菌作用又は抗菌作用を示す組成物。
(9)上記(1)~(3)いずれかに記載の機能性ペプチドを含む農薬。
(10)植物病原菌に対する殺菌用又は抗菌用である(9)記載の農薬。
(11)上記植物病原菌は、灰色かび病菌 (Botrytis cinerea)、アブラナ科炭そ病菌 (Colletotrichum destructivum)、ウリ類炭素病菌(Colletotrichum orbiculare)、萎凋病菌 (Fusarium oxysporum)及びいもち病菌(Pyricularia oryzae)からなる群から選ばれる1以上の植物病原糸状菌であることを特徴とする(10)記載の農薬。
(12)上記植物病原菌は、イネ白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)又はトマト斑葉細菌病菌(Pseudomonas syringae pv. tomato)であることを特徴とする(10)記載の農薬。
本発明に係る機能性ペプチドは、配列番号1に示したアミノ酸配列MRTKKEALVKVLGETKLLKKLLRKLEEEISRSLからなる、又は当該アミノ酸配列に対して85%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。ここで、配列番号1に示したアミノ酸配列は、萎凋病に感染したトマトから採取した道管液及び非感染のトマトから採取した導管液に含まれるペプチドを網羅的に解析し、幅広い種類の植物病原菌に対して抗菌活性を有するペプチドとして同定されたものである。すなわち、本発明に係る機能性ペプチドは、少なくとも、植物病原菌に対して抗菌活性を有するといった機能を有している。よって、本発明に係る機能性ペプチドは、植物病原菌に対する抗菌活性に基づいて農薬或いは農薬用組成物として使用することができる。
本発明に係る機能性ペプチドは、幅広い種類の植物病原菌に対して抗菌活性を有する。ここで抗菌活性とは、植物病原菌の感染防止活性及び感染した植物病原菌に対する殺菌活性の両者を含む意味である。本発明に係る機能性ペプチドが抗菌活性を示す植物病原菌としては、植物病原糸状菌を広く例示することができる。より具体的に、植物病原菌としては、Botrytis属に属する植物病原糸状菌、Colletotrichum属に属する植物病原糸状菌、Fusarium属に属する植物病原糸状菌及びPyricularia属に属する植物病原糸状菌を挙げることができる。
本発明に係る機能性ペプチドは、幅広い種類の植物病原菌に対して抗菌作用を有するため、農薬或いは農薬用組成物として使用することができる。ここで、農薬用組成物とは、農薬を製造する際に使用することができる組成物を意味する。例えば、本発明に係る機能性ペプチドは、植物病原菌、特に植物病原糸状菌に対する殺菌作用を有する殺菌剤として利用することができる。より具体的に、機能性ペプチド化合物は、そのまま農薬として用いても良いが、通常は適当な固体担体、液体担体等、界面活性剤及びその他の製剤用補助剤と混合して乳剤、EW剤、液剤、懸濁剤、水和剤、顆粒水和剤、粉剤、DL粉剤、微粒剤、微粒剤F、粒剤、錠剤、油剤、エアゾル、フロアブル剤、ドライフロアブル、マイクロカプセル剤等の任意の剤型にして使用することができる。
本発明に係る機能性ペプチドは、上述のように、幅広い種類の植物病原菌に対して抗菌作用を有する。このため、当該機能性ペプチドを高発現する形質転換植物は、上述した植物病害に対して抵抗性を示すといった特徴を備える。形質転換植物は、所定の植物細胞に上述した機能性ペプチドをコードする核酸を発現可能に導入した形質転換植物細胞と、当該形質転換植物細胞を植物体に再生した形質転換植物体の両者を含む意味である。本発明に係る形質転換植物は、上述した機能性ペプチドを発現することで、上述した植物病原菌に対する抵抗性が向上したものとなる。
1.萎凋病に感染/非感染トマトの導管液採取
2.プロテオーム解析
3.導管液中のペプチド同定
4.機能性ペプチドの合成
5.植物病原糸状菌に対する抗菌活性の評価
以下、上記1.~5.を順に説明する
トマト品種ポンテローザをくみあいニッピ園芸培土で育成した。本葉が2枚展開したトマト苗を掘り取り、根を水道水で洗浄した。根をトマト萎凋病菌(Fusarium oxysporum CK3-1株)のbud cell懸濁液(1×106細胞/ml)に約30秒間浸漬した後、くみあいニッピ園芸培土を入れたビニールポットに移植し、人口気象器(25℃、明14時間、暗10時間)で育成した。対照区として、非接種苗を同様に育成した。移植7、9、11、13日後に、接種苗と非接種苗の第1本葉直下を切断し、ポットを横に倒し、茎の切断面を2.0mlプラスチックチューブに入れた。室温下で12時間静置し、切断面から流出する導管液を回収した。回収液量を測定した後、セルロースフィルター(MinisartRC15、Sartrium Stedim)でろ過し、-80℃で保存した。
導管液のタンパク質濃度の測定には、Bio-Rad DC Protein Assay Kit(Bio-Rad)を用いた。検量線の作成には牛血清アルブミン(BSA)を用いた。
導管液タンパク質のゲル内トリプシン消化
トマト萎凋病菌接種及び非接種苗から採取した導管液サンプル(12μl、約10μg)に4μlの4×サンプル緩衝液(和光純薬)を加え、SDS-PAGEにより約2.5cm泳動後、ゲルを6分割し、さらに1mm角のみじん切りにした。ゲル内消化はRosefeld et al.(1992)の方法(Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J.C. and Ferrara, P. (1992). In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203: 173-179)を参考に行った。
nano-LC-MS/MS解析には、Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer(サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製)にDionex U3000 gradient pump(サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製)を組み合わせたシステムを用いた。トラップカラム(L-column ODS、300μmI.D.×5mm、5μm粒径、化学物質評価研究機構)及び分析カラム(NTCC-360、100μmI.D.×125mm、3μm粒径、日京テクノス)を用いて、移動相A(0.5%酢酸)、移動相B(0.5%酢酸含有80%アセトニトリル)を用いた。流速は0.5μl/分で行い、グラディエントはアセトニトリル濃度を100分間で5%Bから35%B、1分間で35%Bから100%B、3分間100%B、1分間で100%Bから5%B、最後に10分間5%Bで行った。
nano LC-MS/MS解析で検出されたタンパク質の解析には、Proteome Discoverer 2.0.0.802 (サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製)を用いた。データベースには、トマトsORFデータベース(ITAG2.4_gene_models_sORF)、トマトタンパク質データベース(ITAG2.4_protein)、トマト萎凋病菌タンパク質データベース(fusarium_oxysporum_f._sp._lycopersici_4827_2_protein)を用いた。その結果、非接種トマト特異的に発現が確認された4ペプチド(TsORF6、11、19、29と命名)、接種トマト特異的に発現している4ペプチド(TsORF8、15、18、30と命名)、非接種及び接種トマトに共通して発現している6ペプチド(TsORF10、16、17、21、24、25と命名)を見出した。
本実施例では、同定したペプチドの内、TsORF11と命名した33アミノ酸残基のペプチド(MRTKKEALVKVLGETKLLKKLLRKLEEEISRSL:配列番号1)を解析対象とした。本実施例では、TsORF11と、TsORF11を以下の2つの領域に分けた部分ペプチド(TsORF11-1及びTsORF11-2)とをそれぞれ化学的に合成した。
TsORF11-1:MRTKKEALVKVLGETKLLKK(配列番号3)
TsORF11-2:ETKLLKKLLRKLEEEISRSL(配列番号2)
5-1.プレート抗菌試験
本実施例では、灰色かび病菌 (Botrytis cinerea)、アブラナ科炭そ病菌 (Colletotrichum destructivum)、ウリ類炭素病菌(Colletotrichum orbiculare)、萎凋病菌 (Fusarium oxysporum)及びいもち病菌(Pyricularia oryzae)に対する抗菌活性を胞子の発芽を観察することで評価した。本実施例では、まず、これら糸状菌の胞子懸濁液100μl(約104個)を96穴マイクロプレートに分注した。
本実施例では、灰色かび病菌 (Botrytis cinerea)及び供試ペプチドを含む懸濁液を植物の葉に滴下し、病斑を目視により観察することで、供試ペプチドの抗菌活性を評価した。
本実施例では、アブラナ科炭そ病菌 (Colletotrichum destructivum)及び供試ペプチドを含む懸濁液を植物の葉に滴下し、病斑を目視により観察することで、供試ペプチドの抗菌活性を評価した。
本実施例では、ナス科植物青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、軟腐病菌(Erwinia carotovora subsp. carotovora)、イネ白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)及びトマト斑葉細菌病菌(Pseudomonas syringae pv. tomato)に対する抗菌活性を評価した。本実施例では、まず、これら微生物を培養し、培養液(OD600=0.1)100μlを96穴マイクロプレートに分注した。
[増殖率(%)]=(1-OD600[ペプチド添加])/OD600[水添加]×100
上記5-1、5-2及び5-3の実験結果をまとめて表1に示した。
Claims (10)
- アミノ酸配列:MRTKKEALVKVLGETKLLKKLLRKLEEEISRSL(配列番号1)からなる、アミノ酸配列:ETKLLKKLLRKLEEEISRSL(配列番号2)からなる、又はアミノ酸配列:MRTKKEALVKVLGETKLLKK(配列番号3)からなり、植物病原菌に対する殺菌作用又は抗菌作用を示すペプチド。
- 請求項1記載のペプチドをコードする核酸。
- 請求項2記載の核酸を有する組換えベクター。
- 請求項3記載の組換えベクターを有する形質転換体。
- 上記組換えベクターにより形質転換された植物細胞又は植物体であることを特徴とする請求項4記載の形質転換体。
- 請求項1記載のペプチドを含む、植物病原菌に対する殺菌作用又は抗菌作用を示す組成物。
- 請求項1記載のペプチドを含む農薬。
- 植物病原菌に対する殺菌用又は抗菌用である請求項7記載の農薬。
- 上記植物病原菌は、灰色かび病菌 (Botrytis cinerea)、アブラナ科炭そ病菌 (Colletotrichum destructivum)、ウリ類炭素病菌(Colletotrichum orbiculare)、萎凋病菌 (Fusarium oxysporum)及びいもち病菌(Pyricularia oryzae)からなる群から選ばれる1以上の植物病原糸状菌であることを特徴とする請求項8記載の農薬。
- 上記植物病原菌は、イネ白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)又はトマト斑葉細菌病菌(Pseudomonas syringae pv. tomato)であることを特徴とする請求項8記載の農薬。
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