KR102059948B1 - 식생적 aba 반응을 위한 합성 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ABA 수용체를 활성화시키는 작용물질 화합물, 및 작용물질 화합물을 포함하는 농업용 제형을 제공한다. 농업용 제형은 식물 식생적 조직에서 ABA 반응을 유발하고, 식물에서 무생물적 스트레스를 감소시키며, 식물 종자의 발아를 저해하는데 유용하다. 화합물은 또한 내인성 또는 이종성 ABA 수용체를 발현시키는 세포에서 ABA-반응성 유전자의 발현을 유발하는데 유용하다.

Description

식생적 ABA 반응을 위한 합성 화합물{SYNTHETIC COMPOUNDS FOR VEGETATIVE ABA RESPONSES}
관련 출원과의 상호참조
본 출원은 2012년 3월 30일 출원된 미국 특허 가출원 제61/618,386호의 우선권의 이익을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다.
연방정부 지원된 연구 및 개발 하에서 이루어진 발명에 대한 권리에 관한 진술
본 발명은 미국국립과학재단(National Science Foundation)에 의해 부여된 등록번호 DGE0504249 및 IOS0820508 하의 정부 지원에 의해 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
엡시스산(Abscisic acid: ABA)은 무생물적 스트레스 반응과 관련된 신호를 조절하는 식물 호르몬이다(Cutler et al ., 2010, Abscisic Acid: Emergence of a Core Signaling Network. Annual Review of Plant Biology 61:651-679). ABA 신호처리 경로는 식물 스트레스 반응을 개선시키기 위해 이용되었고, 수많은 접근을 통해 수확량 특성과 관련된다(Yang et al ., 2010). 식물에 ABA의 직접적 적용은 그것의 수분 이용 효율을 개선시키며(Raedmacher et al ., 1987); 이런 이유로, ABA 작용물질의 발견은(Park et al ., 2009; Melcher et al ., 2010, Identification and mechanism of ABA receptor antagonism. Nature Structural & Molecular Biology 17(9): 1102-1110) 증가된 관심을 받게 되었는데, 이러한 분자는 곡물 수확량을 개선시키는데 유리할 수 있기 때문이다(Notman et al., 2009). 확인된 제1 합성 ABA 작용물질은 파라박틴으로 칭해지는 나프탈렌 설폰아마이드였는데(Park et al., 2009), 이는 종자에서 ABA 신호처리를 효율적으로 활성화시키지만, 식물성 조직에서 제한된 활성을 가지고, 여기서 무생물적 스트레스 내성의 가장 중요한 양태가 일어난다. 파라박틴과 고도로 유사한 설폰아마이드는 ABA 작용물질(미국특허 공개 제20130045952호 참조) 및 무생물적 스트레스 조절 화합물(미국특허 공개 제20110230350호 참조)로서 개시되었고; 비설폰아마이드 ABA 작용물질이 또한 기재되어 있다(미국특허 공개 제20130045952호 및 제20110271408호 참조). ABA 경로를 활성화시키는 상보적 접근은 유전적 방법을 통해 ABA에 대해 식물의 민감성을 증가시키는 것을 수반한다. 예를 들어, 식물의 ABA 민감성을 증가시키는 파네실 트랜스퍼라제 베타 서브유닛 유전자의 조건적 안티센스는 카놀라와 애기장대(Arabidopsis) 둘 다에서 중간 정도의 가뭄 하에서 수확량을 개선시킨다(Wang et al ., 2005). 따라서, 수확량에 기인하는 특성을 개선시키는 ABA 신호의 조작은 이제 잘 확립되어 있다.
ABA는 PYR/PYL 단백질로 불리는 수용체의 가용성 패밀리에 결합에 의해 그것의 다수의 세포 반응을 유발하는 것이 최근에 발견되었다. PYR/PYL 단백질은 START 슈퍼패밀리로 칭해진 리간드-결합 단백질의 거대 패밀리에 속한다(Iyer et al ., 2001); Ponting et al ., 1999). 이들 단백질은 7개의 역평행 베타 시트로 이루어진보존된 3차원 구조를 함유하는데, 이 베타 시트는 중앙의 알파 나선을 둘러싸서 "헬릭스-그립(helix-grip)" 모티프를 형성하고; 함께 이들 구조적 구성요소는 결합 ABA 또는 다른 작용물질에 대한 리간드-결합 포켓을 형성한다.
본 발명은 소분자 ABA 작용물질, 즉, PYR/PYL 단백질을 활성화시키는 화합물을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 ABA 작용물질을 포함하는 농업용 제형을 제공한다. 일부 실시형태에서, 농업용 제형은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 이성질체를 포함한다:
[화학식 I]
Figure 112014097732748-pct00001
상기 식에서
R1은 H, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R2는 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되며, 각각은 1 내지 4개의 R2a 기로 선택적으로 치환되고,
각각의 R2a는 H, 할로겐, C1 -6 알킬, C1 -6 알콕시, C1 -6 할로알킬, C1 -6 할로알콕시, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, -OH, C1 -6 알킬하이드록시, -CN, -NO2, -C(O)R2b, -C(O)OR2b, -OC(O)R2b, -C(O)NR2bR2c, -NR2bC(O)R2c, -SO2R2b, -SO2OR2b, -SO2NR2bR2c, 및 -NR2bSO2R2c로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며,
각각의 R2b 및 R2c는 H 및 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
각각의 R3, R4 및 R5는 H 및 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며,
L은 결합 및 C1 -6 알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이고,
아래첨자 m은 0 내지 4의 정수이며,
아래첨자 n은 0 내지 3의 정수이다.
일부 실시형태에서, 농업용 제형은 식물 생장을 촉진하거나, 잡초를 감소시키거나, 또는 해충을 감소시키는데 유용한 농업 화학물질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 농업용 제형은 살진균제, 제초제, 농약, 살선충제, 살충제, 식물 활성제, 상승제, 제초제 약해경감제, 식물 생장 조절제, 곤충 퇴치제, 살비제, 연체동물 구충제, 또는 비료 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 농업용 제형은 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 농업용 제형은 담체를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 식물에서 무생물적 스트레스 내성을 증가시키기 위한 방법을 제공하되, 상기 방법은 제형과 접촉되지 않을 때 식물에서 무생물적 스트레스 내성에 비해 식물에서 무생물적 스트레스 내성(stress tolerance)을 증가시키기 위한 충분한 양의 상기 제형과 식물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 식물은 단자엽식물이다. 일부 실시형태에서, 식물은 쌍자엽식물이다. 일부 실시형태에서, 무생물적 스트레스 내성은 내건성(drought tolerance)을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 식물에서 종자발아를 저해하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 식물, 식물 부분, 식물 종자를 충분한 양의 상기 제형과 접촉시켜 발아를 저해하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 제형과 접촉된 식물 또는 식물 부분을 제공한다. 일부 실시형태에서, 식물은 종자이다.
다른 양태에서, 본 발명은 PYR/PYL 단백질을 활성화시키는 방법을 제공한다. 해당 방법의 일부 실시형태에서, PYR/PYL 단백질은 PYR/PYL 단백질이 작용물질 화합물 LC66C6(또한 본 명세서에서 퀴나박틴으로서 지칭됨)에 결합될 때 2형 단백질 포스파타제(PP2C) 폴리펩타이드에 결합된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 PYR/PYL 단백질을 본 명세서에 기재된 화합물 중 어떤 것과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화된 PYR/PYL 단백질은 서열번호 1 내지 119 중 어느 하나와 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, PYR/PYL 단백질은 세포에 의해 발현된다. 일부 실시형태에서, PYR/PYL 단백질은 식물 세포에 의해 발현된다. 일부 실시형태에서, PYR/PYL 단백질은 내인성 단백질이다. 일부 실시형태에서, PYR/PYL 단백질은 이종성 단백질이다. 일부 실시형태에서, 세포는 2형 단백질 포스파타제(PP2C)를 추가로 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 2형 단백질 포스파타제는 HAB1(ABI1에 대해 상동성), ABI1(엡시스산 무감각 1) 또는 ABI2(엡시스산 무감각 2)이다.
도 1. 신규한 ABA 작용물질은 다수의 PYR / PYL 에 결합된다 . (A) 자연적으로 생기는 (+)-ABA, 그의 (-)유사체 및 선택된 ABA 작용물질의 화학적 구조를 도시한 도면. (B) 5μM의 시험 화학물질에 대한 PYR/PYL 수용체 민감성의 효모 2-혼성체 작용물질 분석을 도시한 도면. 특이적 PYR/PYL 수용체 및 PP2C HAB1은 본 내용에서 기재되는 바와 같이 각각 Gal4 BD 또는 AD 융합 단백질로서 발현된다.
도 2. 신규한 ABA 작용물질은 다수의 PYR / PYL 을 통해 PPC2 활성을 저해한다. (a) 자연적으로 생기는 (+)-ABA 및 선택된 ABA 작용물질의 화학적 구조를 도시한 도면. (b) 및 (c) 10μM 각각의 시험 화학물질의 존재 또는 부재에서 다양한 수용체에 대한 HAB1, ABI1, 및 ABI2 PP2C 효소 활성 기반 ABA-작용물질 분석을 도시한 도면.
도 3. (A) ABA 작용물질 및 유사체에 의한 PP2C 효소 활성의 수용체-매개 용량 의존적 저해를 도시한 도면. (B) 효소적 HAB1 PP2C-기반 ABA-작용물질 분석에서 관찰된 화합물 IC50 값을 도시한 도면.
도 4. 퀴나박틴은 다양한 ABA 수용체를 활성화시킨다 . (A) ABA, 파라박틴 및 퀴나박틴의 화학적 구조를 도시한 도면. (B) ABA 수용체에 의한 HAB1의 화학물질-의존적 저해를 도시한 도면. IC50 값(nM)을 50㎚ HAB1, 50㎚ 및 화합물의 다양한 농도를 사용하는 방법에서 기재한 바와 같이 결정하였고; 전체 용량 반응 곡선을 도 3에서와 같이 제공한다. (nd)는 활성 단백질로서 생성되지 않은 수용체에 대응된다. 계통수(phylogenetic tree)는 MEGA5에서 JTT 거리 매트릭스를 사용하여 만들어진 근연접합도(Neighbor-Joining tree)이다(Tamura K, et al. (2011) MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28(10):2731-2739).
도 5. 신규한 ABA 작용물질은 파라박틴보다 더 강하게 애기장대 종자의 발아를 저해한다. (A) 및 (B)는 ABA 작용물질에 의한 종자발아 저해의 비교를 도시한 도면. (C) 및 (D)는 발아에 대한 애기장대 ABA 신호처리- 및 생합성-결함 돌연변이체 상에서 ABA 및 LC66C6(또한 퀴나박틴으로 불림)의 효과 (C) 및 입모 (D)를 도시한 도면. 종자를 화학물질을 함유하는 1/2X MS 한천 플레이트 상에서 파종하였고, 4℃에서 4일 동안 저장한 다음, 22±2℃에서 옮겼다. 사진(A 및 C) 및 발아 (B) 또는 녹색자엽 (D) 스코어를 계속조명 하에서 4일 인큐베이션 후 평가하였다. 패널 C는 5μM의 ABA 또는 LC66C6에 대한 발아 분석을 나타낸다.
도 6. LC66C6 은 식물 생장을 저해한다. (A) 야생형, abi1 -1 및 PYR/PYL 4중(quadruple) 돌연변이체 애기장대 유전자형에 대한 ABA, 파라박틴 및 LC66C6의 효과를 나타내는 사진을 도시한 도면. (B) 뿌리 생장 저해 및 (C) ABA, LC66C6 및 파라박틴에 의한 식물 생장 저해를 도시한 도면. 2일령의 종자를 화학물질을 함유하는 1/2X MS 플레이트 상에 옮겼고, 표현형을 스코어링하거나 또는 시험 화합물에 대한 5일 인큐베이션 후, 촬영하였다.
도 7. LC66C6 은 가뭄 스트레스 내성을 향상시킨다. LC66C6은 야생형 (A) 및 aba2 돌연변이체 유전자형 (B)에서의 떨어진 잎의 증발되는 수분 손실량을 나타낸 도면. (C) LC66C6은 ABA-무감각 유전자형 abi1 -1의 표현형을 구할 수 없음을 도시한 도면. (D) LC66C6은 야생형 및 aba2에서의 기공 차단을 유발하지만, abi1 -1 유전자형은 그렇지 않음을 도시한 도면. (E) 대두에서 가뭄 처리 동안 토양 수분 함량에 대한 화합물의 효과를 도시한 도면. 토양 수분 함량을 실시예에 기재한 바와 같이 측정하였다.
도 8. 퀴나박틴은 야생형 식물에 대한 가뭄 스트레스 내성을 부여한다. (A) 애기장대 내건성에 대한 퀴나박틴의 효과를 도시한 도면. 2주령 식물에 물을 저지함으로써 가뭄 스트레스를 실시하였고, 12주 후 촬영하였다. 가뭄 기간 동안, 식물을 25μM 화합물로 3일마다 처리하였다. 2주 가뭄 처리 후, 식물을 재수화시켰고; 각 처리에 대해 살아있는 식물의 수(시험한 전체 수 중에서)를 각 이미지 옆에 나타낸다. (B) 대두에 대한 퀴나박틴의 효과를 도시한 도면. 2주령 식물에 물을 저지함으로써 가뭄 스트레스를 실시하였고, 가뭄 처리의 8주 후 촬영하였다. 모든 가뭄 스트레스에 대해, 화합물(애기장대에 대해 25μM 및 대두에 대해 50μM에서 시험함)을 0.05% 트윈(Tween)-20을 함유하는 용액 중에서 적용하였고, 가뭄 요법에 걸쳐 3일마다 에어로졸로서 적용하였다. 모든 실험에 대한 값은 평균 ± SEM이다(n = 6, 3 실험 당 사용한 식물).
도 9. LC66C6 은 수많은 ABA -반응 유전자를 포함한다. (A)는 비히클(DMSO), 파라박틴, LC66C6, 또는 (+)-ABA 중 하나로 처리된 애기장대 묘목의 야생형, abi1-1, pyr1/pyl1/pyl2/pyl4 4중 수용체 돌연변이체 유전자형에서 ABA-반응성 리포터 유전자 RD29B 및 MAPKKK18의 화학물질 유발 mRNA 발현 수준을 도시한 도면. (B) LC66C6은 애기장대 묘목에서 ABA-반응성 유전자를 효율적으로 유발하는 한편, 파라박틴은 그렇지 않다는 것을 도시한 도면. 10일령 묘목을 담체 용매(DMSO)로 또는 25μM ABA, 파라박틴 또는 LC66C6 중 하나로 8시간 동안 처리하였다. 그 다음에 전체 RNA를 준비하였고, 표지하였으며, ATH1 마이크로어레이에 대해 혼성화시켰다. 플롯팅한 데이터는 모든 실험에 걸쳐 검출가능한 ~13K 프로브에 대한 log2 형질전환 평균 발현 값이다. 나타낸 데이터는 3중의 생물학적 복제물로부터 결정된 평균이다. (C) 및 (D)는 비히클(DMSO), 파라박틴, LC66C6 또는 (+)-ABA로 처리 후, 상이한 식물 조직에서 리포터 유전자의 발현을 도시한 도면.
도 10. PYR / PYL 단일 돌연변이체에서 ABA -반응성 유전자 발현을 도시한 도면. LC66C6, ABA 및 파라박틴에 대한 ABA-반응성 MAPKKK18, RD29A, 및 RD29B mRNA의 반응은 Col 및 Ler 생태형 및 pyr1, pyl1, ply2, pyl3 및 pyl4 단일 돌연변이체 유전자형에서 특성규명된다.
도 11. LC66C6 은 야생형 식물, abi1 -1 및 PYR / PYL 4중 돌연변이체에서 ABA -반응성 유전자 발현을 유발한다. LC66C6 및 (+)-ABA는 Col 야생형 식물에서 용량 의존적 방식으로 ABF3, GBF3, NCED3 및 RD29A의 발현을 유발한 반면, 파라박틴은 그렇지 않다.
도 12. LC66C6 민감성은 CYP707A ABA - 하이드록실화 효소에 의해 영향받지 않는다. (A)는 사진을 나타내며 (B) 야생형 식물, CYP707A를 과발현시키는 식물(CYP707AOX), 및 DMSO로 처리된 cyp707a에 대한 이중 돌연변이체인 식물, 40μM (+)-ABA, 및 40μM LC66C6에서 주근(primary root) 길이의 정량화를 나타내는 도면. (C)는 생중량을 나타내며, (D)는 (A)에서와 같이 처리한 식물에서 녹색자엽을 지니는 식물의 백분율을 나타낸 도면.
도 13. LC66C6 은 다양한 종에서의 ABA 반응을 조절한다. 나타낸 화합물에 대한 반응에서 발아 저해 (a) 및 잎이 떨어진 후 2시간에 떨어진 잎에서 증발된 수분 손실량 (b)을 도시한 도면. 화학물질의 적용 후 대두 (C), 보리 (D) 및 메이즈(Maize) (E)에서 ABA-반응성 마커 유전자의 발현을 도시한 도면. D, P, L 및 A는 각각 DMSO, 파라박틴, LC66C6 및 (+)-ABA를 나타낸다.
도 14. ABA 및 작용물질의 화학적 구조를 도시한 도면.
도 15. 효모 분석 및 종자발아에서 ABA 및 작용물질의 효과를 도시한 도면. (A)는 도 14에 나타낸 각각의 작용물질 에 대한 반응을 시험하기 위해 PYR/PYL 수용체 PYR1, PYL1, PYL2, PYL3, 및 PYL4를 사용하는 효모 2-혼성체 분석 결과를 도시한 도면. (B)는 야생형 종자의 발아에 대해 도 14에서 작용물질을 시험하는 결과를 도시한 도면. (C)는 ABA-유발성 애기장대 유전자 MAPKKK18의 대조군 하에서 글루쿠로니다제를 발현시키는 유전자이식 계통에서 글루쿠로니다제 분석을 사용하여 측정한 바와 같은 ABA-리포터 계통에 대한 화합물의 효과를 도시한 도면.
도 16. LC66C6 의 적용은 ABA -결함 돌연변이체 aba2 에서 관찰된 생장 결함을 구할 수 있다. 화학적 용액(25μM)을 14일-식물 상에 2주 동안 1일 2회 분무하였다. 이미지 (A) 및 생중량 (B)을 4주 식물로부터 얻었다.
도 17. 피스코미트렐라 파텐스 ( Physcomitrella patens ) 및 클라미도모나스( Chlamydomonas )에서 ABA 및 그의 작용물질의 효과. 원사체의 생장 이미지 (A) 및 피스코미트렐라 파텐스에 대한 ABA 및 작용물질의 정량적 분석 (B)을 도시한 도면. 원사체를 10일 동안 200μM의 특이적 시험 화학물질 상에서 생장시켰다. LC66C6의 효과는 약하였지만, 원사체 생장을 유의하게 생장시켰다. 파라박틴은 원사체를 표백시켰다. (C) 피스코미트렐라 파텐스의 ABA-반응성 유전자의 발현. 원사체를 3시간 동안 200μM 화학물질 용액으로 처리하였다. (D) 염분 스트레스 및 삼투 스트레스를 이용하는 화학물질 상에서 클라미도모나스의 콜로니 생장. 스트레스를 지니는 그리고 스트레가 없는 클라미도모나스에 대한 ABA 및 LC66C6의 효과는 없었다. 파라박틴 표백된 피스코미트렐라 파텐스 및 클라미도모나스는 이 화합물이 그의 ABA 작용물질 활성과 관련되지 않은 이들 종에서 독성을 가질 수 있다는 것을 시사한다.
도 18은 발아 및 pMAPKK18:Gus 리포터 발현의 저해에 대한 작용물질 화합물의 효과를 시험한 작용물질 화합물의 요약을 도시한 도면. ++++++는 강한 활성을 나타낸 반면, 단일 +는 약한 활성을 나타내고, 파선 (-)은 활성이 없음을 나타내며, n.d.는 결정되지 않았음을 나타낸다.
"작용물질은", 예를 들어 기재된 표적 단백질의 발현을 유발하거나 또는 활성화하거나, 또는 결합되어 하나 이상의 식물 PYR/PYL 단백질의 활성을 자극하거나, 증가시키거나, 개방하거나, 활성화시키거나, 가능하게 하거나, 활성을 향상시키거나, 민감하게 하거나 또는 상향조절하는(또는 폴리뉴클레오타이드를 암호화) 작용제이다. 작용물질은 자연적으로 생기는 분자 및 합성 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용물질은 농화학물과 조합되어 농업용 제형을 생성한다. 적합한 농화학물의 예는 살진균제, 제초제, 농약, 비료, 및/또는 계면활성제를 포함한다. 작용물질이 PYR/PYL 단백질을 "작용화하거나"(agonize) 또는 "작용화하지 않는지"의 여부를 결정하기 위한 분석은, 예를 들어 추정적 작용물질을 정제된 PYR/PYL 단백질(들)과 접촉시키는 단계 및 그 다음에 본 명세서에 기재된 바와 같이, PYR/PYL 단백질 활성에 대한 기능적 효과를 결정하는 단계, 또는 추정적 작용물질을 세포 발현 PYR/PYL 단백질(들)과 접촉시키는 단계, 및 그 다음에 본 명세서에 기재된 바와 같이, 기재된 표적 단백질 활성에 대해 기능적 효과를 결정하는 단계를 포함한다. 당업자는 작용물질이 PYR/PYL 단백질을 작용화하는지 아닌지의 여부를 결정하는데 분석이 적합한지의 여부를 결정할 수 있다. 추정적 작용물질로 처리한 PYR/PYL 단백질을 포함하는 샘플 또는 분석을 작용물질이 없는 대조군 샘플과 비교한다. 대조군 샘플(작용물질로 미처리)은 100%의 상대적 활성값을 부여한다. PYR/PYL 단백질의 작용은 대조군에 대한 활성 값이 110%, 선택적으로 150%, 선택적으로 200, 300%, 400%, 500% 또는 1000 내지 3000% 이상 더 높을 때 달성된다.
용어 "PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드"는 폴리케타이드 사이클라제 도메인 2(PF10604), 폴리케타이드 사이클라제 도메인 1(PF03364), 및 Bet VI 도메인(PF03364) 중 하나 이상 또는 모두의 존재에 의해 부분적으로 특성규명된 단백질을 지칭하는데, 이는 야생형 형태에서 엡시스산(ABA) 및 ABA 유사체 신호처리를 매개한다. 매우 다수의 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드 서열은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 119 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, PCT 출원 공개 WO 2011/139798호 참조.
용어 "활성 분석"은 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드의 활성을 측정하거나 또는 검출하는 어떤 분석을 지칭한다. PYR/PYL 수용체 활성을 측정하는 예시적인 분석은 실시예에 기재된 바와 같이 2형 단백질 포스파타제(PP2C) 폴리펩타이드에 대한 PYR/PYL 폴리펩타이드의 결합을 검출하는 효소 2-혼성체 분석이다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드는 이하에 기재된 바와 같은 최대 대응도로 정렬될 때, 2개의 서열에서 뉴클레오타이드의 서열 또는 아미노산 잔기가 각각 동일하다면, "동일한" 것으로 언급된다. 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 내용에서 용어 "동일한" 또는 백분율 "동일성"은 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이 또는 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해, 비교창에 걸쳐 최대 대응도로 비교되고 정렬될 때, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 구체화된 백분율을 가지거나 또는 동일한 2 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질 또는 펩타이드에 대해 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종 보존적 아미노산 치환과 상이한 것으로 인식되며, 여기서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 지니는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 따라서 분자의 기능적 특성을 변경시키지 않는다. 서열이 보존적 치환에 대해 다른 경우, 서열 동일성 백분율은 치환의 보존적 특성을 수정하기 위해 위쪽으로 조절될 수 있다. 이 조절을 만들기 위한 수단은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 이는 전체 미스매치보다는 부분적으로서 보존적 치환을 스코어링하는 것을 수반하며, 이에 의해 서열 동일성 백분율을 증가시킨다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산이 스코어 1로 주어지고, 비보존적 치환이 스코어 0으로 주어지는 경우, 보존적 치환은 0과 1 사이의 스코어로 주어진다. 보존적 치환의 스코어링은, 예를 들어 프로그램 PC/GENE(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰에 소재한 인텔리젠틱스(Intelligenetics))에 의해 실행되는 바와 같이, 예를 들어 문헌[Meyers & Miller, Computer Applic . Biol . Sci . 4: 11-17 (1988)]의 알고리즘에 따라 계산된다
2개의 핵산 또는 폴리펩타이드의 내용에서 사용되는 어구 "실질적으로 동일한"은 기준 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 서열을 나타낸다. 대안적으로, 동일성 백분율은 60% 내지 100% 중 임의의 정수일 수 있다. 일부 실시형태는 본 명세서에 기재된 프로그램; 바람직하게는 이하에 기재된 바와 같은 표준 파라미터를 사용하는 BLAST를 사용하여 기준 서열과 비교하여, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 본 발명의 실시형태는 서열번호 1 내지 119 중 어떤 것과 실질적으로 동일한 폴리펩타이드, 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요하다면 하위 서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 변수가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 그 다음에 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기반하여 기준 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 백분율을 계산한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "비교창"은 20 내지 600, 보통으로는 약 50 내지 약 200, 더 보통으로는 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 연속적 위치의 수 중 어느 하나의 세그먼트에 대한 기준을 포함하며, 이때 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 연속적 위치의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 예를 들어 문헌[Smith & Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l . Acad . Sci . USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법을 위한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해(위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이브 575에 소재한 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)에서의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘은 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol . 215: 403-410 및 Altschul et al . (1977) Nucleic Acids Res . 25: 3389-3402]에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI) 웹 사이트를 통해 공공연하게 입수가능하다. 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드로 정렬될 때 일부 양의 값 역치 스코어를 매칭하거나 또는 만족시키는 질의 서열에서 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 스코어링 서열쌍(high scoring sequence pair: HSP)을 우선 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃한 워드 스코어 역치로서 지칭된다(Altschul et al ., 상기 참조). 이들 초기의 이웃한 워드 히트(hit)는 이를 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하기 위한 시드(seed)로서 작용한다. 그 다음에 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한까지 각 서열을 따라 양 방향으로 신장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M(매치하는 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 0 초과) 및 N(미스매치 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 0 미만)을 이용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 누적 스코어를 계산하기 위해 스코어링 매트릭스가 사용된다. 각 방향의 워드 적중의 신장은 누적 정렬 스코어가 이의 최대 달성 값으로부터 양(quantity) X까지 떨어지는 경우; 누적 스코어가 하나 이상의 음의 스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하로 가는 경우; 또는 서열 중 어느 하나의 말단에 도달하는 경우에 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열에 대함)은 28의 워드 크기(W), 10의 기대값(E), M=1, N=-2, 및 양 가닥의 비교를 디폴트로 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 크기(W) 3, 예상치(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 89: 10915 (1989)]).
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin & Altschul, Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 일 측정은 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭이 우연히 발생할 확률의 표시를 제공하는 가장 작은 합계 확률(smallest sum probability)(P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서의 가장 작은 합계 확률이 약 0.01 미만, 더욱 바람직하게는 약 10-5 미만, 가장 바람직하게는 약 10-20 미만인 경우에 핵산은 기준 서열에 대해 유사한 것으로 고려된다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산과 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열에 대하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 서열을 암호화하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전적 암호의 축중(degeneracy) 때문에, 매우 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 모든 위치에서, 알라닌이 코돈에 의해 구체화되는 경우, 코돈은 암호화된 폴리펩타이드를 변경시키는 일 없이 기재된 대응되는 코돈 중 어떤 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이"인데, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종이다. 폴리펩타이드를 암호화하는 본 명세서의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 당업자는 핵산 내 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG를 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 수득할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 각 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포된다.
아미노산 서열에 관해, 당업자는 암호화된 서열에서 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변경시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열에서의 개개 치환이 변성이 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 치환을 초래하는 경우 "보존적으로 변형된 변이체"가 된다는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있다.
다음의 6개 그룹은 각각 서로 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);
2) 아스팔트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 알기닌(R), 리신(K);
5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).
(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조).
용어 "식물"은 전체 식물, 새싹 식생 기관(shoot vegetative organ) 및/또는 구조(예를 들어, 잎, 줄기 및 괴경), 뿌리, 꽃 및 꽃 기관(예를 들어, 포엽, 꽃받침, 꽃잎, 수술, 암술잎, 꽃밥), 밑씨(난모세포 및 중심체 세포를 포함함), 종자(접합체, 배, 내배유, 및 종피를 포함함), 열매(예를 들어, 성숙 씨방), 묘목, 식물 조직(예를 들어, 관다발 조직, 기본 조직 등), 세포(예를 들어, 공변 세포, 난세포, 모용(trichome) 등), 및 이들의 후손(progeny)을 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 식물의 부류는 일반적으로 피자식물(단자엽 및 쌍자엽 식물), 나자식물, 양치류, 및 다세포 조류를 포함하는 형질전환 기술에 적용가능한 보다 고등한 식물 및 보다 저등한 식물의 부류만큼 광범위하다. 이는 이수체, 다배수체, 2배체, 반수체, 및 반접합체를 포함하는 다양한 배수성 수준의 식물을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 이식"은 인간에 의해 변형된 게놈을 함유하는 비자연적으로 생기는 식물을 기재하되, 식물은 그것의 게놈 내에 동일 또는 상이한 식물 종으로부터 유래될 수 있는 외인성 핵산 분자를 포함한다. 외인성 핵산 분자는 유전자 조절 구성요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 또는 다른 조절 구성요소일 수 있거나, 또는 이종성 유전자 조절 구성요소에 연결될 수 있는 암호 서열을 함유할 수 있다. 유성교배 또는 자가교배에 의해 생기는 유전자 이식 식물은 이러한 식물의 자손이며, 또한 "유전자 이식"으로 고려된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "가뭄 저항성" 또는 "내건성"은 그것의 변형 중 어떤 것을 포함하여, 가뭄 스트레스의 기간(즉, 며칠의 기간 동안 물이 거의 또는 전혀 없음)으로부터 식물이 회복되는 능력을 지칭한다. 전형적으로, 가뭄 스트레스는 적어도 5일일 것이고, 예를 들어 식물 종에 따라서, 예를 들어 18일 내지 20일 이상(예를 들어, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일)만큼 길 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "무생물적 스트레스", "스트레스" 또는 "스트레스 조건"은 식물의 대사, 생장, 발생, 번식 또는 생존(종합적으로, "생장")에 해로운 효과를 갖는 비생명("무생물적") 물리적 또는 화학적 작용제에 대한 식물, 식물 세포 등의 노출을 지칭한다. 스트레스는, 예를 들어 환경적 인자, 예컨대 물(예를 들어, 홍수, 가뭄, 또는 탈수), 혐기 조건(예를 들어, 더 저수준의 산소 또는 고수준의 CO2), 비정상 삼투 조건, 염분, 또는 온도(예를 들어, 열/가열, 냉각, 냉동, 또는 결빙), 영양분 결핍 또는 오염물질에 대한 노출에 기인하는, 또는 호르몬, 제2 메신저 또는 다른 분자에 의해 식물에 부과될 수 있다. 혐기성 스트레스는, 예를 들어, 스트레스 반응을 생산하기에 충분한 산소 수준의 감소(저산소증 또는 산소결핍증)에 기인한다. 홍수 스트레스는 예컨대 우기, 풍수기, 또는 과도한 식물 자극 등 동안에 일어나는 액체 배지 내에서 식물, 식물 부분, 조직 또는 단리된 세포의 장기간 또는 일시적 침지에 기인할 수 있다. 냉각 스트레스 또는 가열 스트레스는 특정 식물 종에 대한 생장 온도의 최적 범위로부터의 온도에서의 감소 또는 증가에 각각 기인하여 일어날 수 있다. 이러한 최적의 생장 온도 범위는 당업자에게 용이하게 결정되거나 또는 공지되어 있다. 탈수 스트레스는 세포, 조직, 기관 또는 전체 식물의 수분 손실, 감소된 팽압 또는 감소된 수분 함량에 의해 유발될 수 있다. 가뭄 스트레스는 세포, 조직, 기관 또는 유기체에 대한 물의 박탈 또는 물의 감소된 공급에 의해 유발되거나 또는 관련될 수 있다. 염분-유발 스트레스(염-스트레스)는 세포의 세포내 또는 세포밖 환경의 삼투 퍼텐셜에서의 동요과 관련되거나 또는 동요에 의해 유발될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "무생물적 스트레스 내성" 또는 "스트레스 내성"은 정상 조건 하에서의 식물에 비해 무생물적 스트레스에 대한 식물의 증가된 저항성 또는 내성 및 무생물적 스트레스 조건 하에 있을 때 상대적으로 우수한 방식으로 수행되는 능력을 지칭한다.
폴리펩타이드 서열은 그것이 외래 종으로부터 유래되거나, 또는 동일 종으로부터 유래된다면 유기체 또는 제2 폴리펩타이드 서열에 대해 "이종성"이며, 그것의 본래 형태로부터 변형된다.
발명의 상세한 설명
I. 도입
본 발명은 선택적 엡시스산(ABA) 작용물질의 발견에 부분적으로 기반한다. 이전의 ABA 작용물질과 달리, 본 명세서에 기재된 작용물질은 식물 식생적 조직에서 ABA 경로를 강력하게 활성화시키고, 무생물적 스트레스 내성을 유발하였다. 새로운 작용물질은 식물의 작물종에서의 스트레스 내성을 유발하기 위해 사용될 수 있다. 작용물질은 브로콜리, 무, 알팔파, 대두, 보리 및 옥수수(메이즈)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 단자엽식물 및 쌍자엽식물 종에서의 스트레스 내성을 유발하기 위해 사용될 수 있다.
엡시스산은 눈 휴면, 종자휴면 및/또는 성숙, 잎 및 열매의 탈리, 및 매우 다양한 생물학적 스트레스(예를 들어, 냉각, 가열, 염분 및 가뭄)에 대한 반응을 포함하는, 다양한 식물-보호 기능에 연루된 다기능성 식물 호르몬이다. ABA는 또한 CO2 농도와 독립적인 메커니즘에 의해 기공 차단을 조절하는 것을 초래한다. ABA 수용체 단백질의 PYR/PYL 패밀리는 ABA 신호처리를 매개한다. 지금까지 시험된 식물은 하나 이상의 PYR/PYL 수용체 단백질 패밀리 구성원을 발현시키는데, 이는 적어도 다소 불필요한 활성을 가진다. PYR/PYL 수용체 단백질은, 예를 들어, 종자발아, 발아 후 생장, 기공 움직임 및 가뭄을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 스트레스에 대한 식물 내성에서 포지티브 조절제로서 ABA 신호처리를 매개한다.
매우 다양한 야생형(자연적으로 생기는) PYR/PYL 폴리펩타이드 서열이 당업계에 공지되어 있다. PYR1은 본래 애기장대에서 엡시스산(ABA) 수용체로서 확인되었지만, 사실 PYR1은 또한 ABA 신호처리를 매개하는 애기장대에서의 동일한 단백질 패밀리에서 적어도 14종 단백질(PYR/PYL 단백질) 군의 구성원이다. 이 단백질 패밀리는 또한 다른 식물에서 존재하며(예를 들어, 서열목록 참조), 폴리케타이드 사이클라제 도메인 2(PF10604), 폴리케타이드 사이클라제 도메인 1(PF03364), 및 Bet VI 도메인(PF03364) 중 하나 이상 또는 모두의 존재를 부분적으로 특징으로 한다. START/Bet v1 슈퍼패밀리 도메인은, 예를 들어 문헌[Radauer, BMC Evol . Biol . 8:286 (2008)]에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 야생형 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 119 중 어떤 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 119 중 어떤 것에 실질적으로 동일하다(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일함). 일부 실시형태에서, PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 또는 119 중 어떤 것에 실질적으로 동일하다(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일함).
II . ABA 작용물질
본 발명은 소분자 ABA 작용물질, 즉, PYR/PYL 단백질을 활성화시키는 화합물을 제공한다. 예시적인 ABA 작용물질은, 예를 들어, 다음으로부터 선택된 화합물을 포함한다:
하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 이성질체:
[화학식 I]
Figure 112014097732748-pct00002
상기 식에서,
R1은 H, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R2는 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되며, 각각은 1 내지 4개의 R2a 기로 선택적으로 치환되고,
각각의 R2a는 H, 할로겐, C1 -6 알킬, C1 -6 알콕시, C1 -6 할로알킬, C1 -6 할로알콕시, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, -OH, C1 -6 알킬하이드록시, -CN, -NO2, -C(O)R2b, -C(O)OR2b, -OC(O)R2b, -C(O)NR2bR2c, -NR2bC(O)R2c, -SO2R2b, -SO2OR2b, -SO2NR2bR2c, 및 -NR2bSO2R2c로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며,
각각의 R2b 및 R2c는 H 및 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
각각의 R3, R4 및 R5는 H 및 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며,
L은 결합 및 C1 -6 알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이고,
아래첨자 m은 0 내지 4의 정수이며,
아래첨자 n은 0 내지 3의 정수이다.
일부 실시형태에서, 화합물은 하기 화학식 II를 가진다:
[화학식 II]
Figure 112014097732748-pct00003
일부 실시형태에서, 화합물은 하기 화학식 III을 가진다:
[화학식 III]
Figure 112014097732748-pct00004
일부 실시형태에서, R1은 C1 -6 알킬이고, R2는 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되며, 각각은 1 내지 4개의 R2a 기로 선택적으로 치환된다.
일부 실시형태에서, 각각의 R2a는 H, 할로겐 및 C1 -6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, R2는 페닐, 나프틸, 티오펜, 퓨란, 피롤 및 피리딜로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, R1은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 뷰틸, 아이소-뷰틸, sec-뷰틸, tert-뷰틸, 펜틸, 아이소펜틸, 네오-펜틸 및 헥실로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 페닐 및 티오펜으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 각각은 1개의 R2a 기로 선택적으로 치환되고; 각각의 R2a는 H, F, Cl, 메틸, 및 에틸로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; L은 결합 및 메틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 화합물은 하기 화학식 IV를 가진다:
[화학식 IV]
Figure 112014097732748-pct00005
.
일부 실시형태에서, 화합물은 하기 화학식 V를 가진다:
[화학식 V]
Figure 112014097732748-pct00006
.
일부 실시형태에서, 화합물은 도 8에 나타낸 화합물 중 하나이다.
일부 실시형태에서, 화합물은 하기 화학식 VI을 가진다:
[화학식 VI]
Figure 112014097732748-pct00007
.
화학식 VI을 갖는 화합물은 또한 LC66C6 또는 퀴나박틴(1-(4-메틸페닐)-N-(2-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀린-6-일)메탄설폰아마이드)로서 지칭된다. 상기 기재된 화합물은 라이프 케미컬스(Life Chemicals)(코네티컷주 오렌지에 소재)로부터 구입한 구조적으로 다양한 화합물의 라이브러리를 선별함으로써 확인되었다.
일부 실시형태에서, 화합물은 화학식 VII을 가진다:
[화학식 VII]
Figure 112014097732748-pct00008
.
상기 기재한 화합물은 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 동일한 화학적 스캐폴드에 기반한 화합물은 미국특허 제5,498,755호 및 미국특허 제6,127,382호에 기재된 바와 같이 합성되었고, 이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다.
III . ABA 작용물질 제형
본 발명은 식물에 접촉하기 위해 제형화된 농업적 화학 제형을 제공하되, 제형은 본 발명의 ABA 작용물질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용물질과 접촉되는 식물은 내인성 PYR/PYL 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 작용물질과 접촉되는 식물은 이종성 PYR/PYL 폴리펩타이드를 포함하지 않거나 또는 발현시키지 않는다(예를 들어, 식물은 유전자이식되지 않거나 또는 유전자이식되지만, 이종성 PYR/PYL 단백질 이외의 이종성 단백질을 발현시킨다). 일부 실시형태에서, 작용물질과 접촉되는 식물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 이종성 PYR/PYL 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 발현시킨다.
제형은, 예를 들어 담체에서 본 발명에 따른 식물 또는 식물 번식 물질, 예컨대 종자에 적합할 수 있다. 적합한 첨가제는 완충제, 습윤제, 코팅제, 다당류 및 연마재를 포함한다. 예시적인 담체는 물, 수용액, 슬러리, 고체 및 건조 분말(예를 들어, 토탄, 밀, 겨, 질석, 점토, 저온살균된 흙, 다양한 형태의 탄산칼슘, 돌로마이트, 다양한 등급의 석고, 벤토나이트 및 다른 점토 무기질, 인광석 및 다른 인 화합물, 이산화티타늄, 부엽토, 탈크, 알지네이트 및 활성탄을 포함한다. 당업자에게 공지된 임의의 농업적으로 적합한 담체는 허용가능하며, 본 발명에서 사용을 위해 고려된다. 선택적으로 제형은 또한 적어도 하나 계면활성제, 제초제, 살진균제, 농약 또는 비료를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 농업적 화학 제형은 계면활성제, 제초제, 농약, 예컨대, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 살진균제, 살균제, 살충제, 살비제, 및 살선충제, 식물 활성제, 상승제, 제초제 약해경감제, 식물 생장 조절제, 곤충 퇴치제, 또는 비료 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, 농업적 화학 제형은 파라콰트(592), 메소트리온(500), 술코트리온(710), 클로마존(159), 펜트라자마이드(340), 메페나셋트(491), 옥사지클로메폰(583), 인다노판(450), 글라이포세이트(407), 프로설포카브(656), 몰리네이트(542), 트라이아술퓨론(773), 할로설퓨론-메틸(414) 및 프레틸라클로르(632)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제초제의 유효량을 포함한다. 상기 제초 활성 성분은, 예를 들어, 문헌["The Pesticide Manual", Editor C. D. S. Tomlin, 12th Edition, British Crop Protection Council, 2000, under the entry numbers added in parentheses]에 기재되어 있으며; 예를 들어, 메소트리온(500)은 참조번호(500) 하에 기재된다. 상기 화합물은, 예를 들어 본 명세서에 전문이 참조로서 포함되는 미국특허 제7,338,920호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 농업적 화학 제형은 세닥산, 플루다이옥소닐, 펜티오피라드, 프로티오코나졸, 플루트라이아폴, 디페노코나졸, 아족시스트로빈, 캡탄, 사이프로코나졸, 사이프로디닐, 보스칼리드, 디니코나졸, 에폭시코나졸, 플루옥사스트로빈, 트라이플록시스트로빈, 메탈락실, 메탈락실-M(메페녹삼), 플루퀸코나졸, 페나리몰, 누아리몰, 피리페녹스, 피라클로스트로빈, 티아벤다졸, 테뷰코나졸, 트라이아디메놀, 베날락실, 베날락실-M, 베노밀, 카벤다짐, 카복신, 플루토라닐, 푸베리자돌, 구아자틴, 마이클로뷰타닐, 테트라코나졸, 이마자릴, 메트코나졸, 비테르타놀, 사이목사닐, 이프코나졸, 이프로디온, 프로클로라즈, 펜사이쿠론, 프로파모카브, 실티오팜, 티람, 트라이아족사이드, 트라이티코나졸, 톨릴플루아니드 및 망간 화합물(예컨대 만코젭, 만넵)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 살진균제의 유효량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 농업적 화학 제형은 티아메톡삼, 이미다클로프리드, 클로티아니딘, 람다-사이할로트린, 테플류트린, 베타-사이플류트린, 퍼메트린, 아바멕틴, 피프로닐 및 스피로사드로 이루어진 군으로부터 선택된 살충제, 살비제 및/또는 살선충제 중 하나 이상의 유효량을 포함한다. 일반명을 지니는 상기 농약의 각각의 상세한 설명(예를 들어, 구조, 화학적 명칭, 상업적 명칭 등)은 문헌[e-Pesticide Manual, version 3.1, 13th Edition, Ed. CDC Tomlin, British Crop Protection Council, 2004-05]에서 찾을 수 있다. 상기 화합물은, 예를 들어 미국특허 제8,124,565호에 기재되어 있으며, 이는 그의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.
일부 실시형태에서, 농업적 화학 제형은 사이프로디닐 ((4-사이클로프로필-6-메틸-피리미딘-2-일)-페닐-아민)(208), 도딘(289); 클로로타로닐(142); 폴펫(400); 프로티오코나졸(685); 보스칼리드(88); 프로퀴나지드(682); 디티아논(279); 플루아지남(363); 입코나졸(468); 및 메트라페논으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 살진균제의 유효량을 포함한다. 상기 화합물 중 일부는, 삽입어구에 첨가된 참조 번호 하에서, 예를 들어, 문헌["The Pesticide Manual" [The Pesticide Manual-- A World Compendium; Thirteenth Edition; Editor: C. D. S. Tomlin; The British Crop Protection Council, 2003]에 기재되어 있다. 상기 화합물은, 예를 들어 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 미국특허 제8,349,345호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 농업적 화학 제형은 플루다이옥소닐, 메타락실 및 스트로비루린 살진균제, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 살진균제의 유효량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스트로비루린 살진균제는 아족시스트로빈, 피콕시스트로빈, 크레속심-메틸, 또는 트라이플록시스토빈이다. 일부 실시형태에서, 농업적 화학 제형은 페닐피라졸 및 네오니코티노이드로부터 선택된 살충제 중 하나 이상의 유효량을 포함한다. 일부 실시형태에서,페닐피라졸은 피프로닐이고, 네오니코티노이드는 티아메톡삼, 이미다클로프리드, 티아클로프리드, 클로티아니딘, 니텐피람 및 아세타미프리드로부터 선택된다. 상기 화합물은, 예를 들어 미국특허 제7,071,188호에 기재되어 있으며, 이것은 본 명세서에 그의 전문이 참조로서 포함된다. 일부 실시형태에서, 농업적 화학 제형은 파스토리아 종(Pasteuria spp .), 파에실리오마이세스(Paeciliomyces), 포코니아 클라미도스포리아(Pochonia chlamydosporia), 마이로테슘(Myrothecium) 대사물질, 무스코도르(Muscodor) 휘발물, 타게트 종(Tagetes spp .), 바실러스 퍼뮤스(bacillus flrmus) CNCM I-1582를 포함하는 바실러스 퍼뮤스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 생물학적 농약의 유효량을 포함한다.
IV . 식물에 대한 적용
ABA 작용물질 제형 및 조성물은 다양한 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 번식 물질에 걸쳐 조성물을 분무, 원자화, 딥핑, 주입, 관개, 더스팅 또는 분산시킴으로써, 또는 식물에 걸쳐 조성물과 브러싱 또는 주입 또는 다른 접촉에 의해, 또는 종자의 경우에는 코팅, 캡슐화, 분무, 딥핑, 액체 조성물 중에 종자를 침지시키거나 도는 달리 종자를 처리함으로써 식물에 적용될 수 있다. 식재 전 식물 또는 종자를 직접적으로 처리하는 것에 대한 대안에서, 본 발명의 제형은 또한 종자가 식재되는 토양 또는 다른 배지에 도입될 수 있다. 예를 들어, 제형은 토양을 분무, 분산, 주입, 관개 또는 다른 처리에 의해 토양 내로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체는 또한 본 실시형태에서 사용된다. 담체는 상기 주목한 바와 같이 고체 또는 액체일 수 있다. 일부 실시형태에서 토탄은 ABA 작용물질의 담체로서 수 중에서 현탁되며, 이 혼합물은 토양 또는 식재 배지에 및/또는 종자 위로, 그것이 식재됨에 따라 분무된다.
본 명세서에 기재된 ABA 작용물질에 의해 처리될 수 있는 식물 유형은 곡물, 예컨대 보리, 호밀, 수수, 라이밀, 귀리, 벼, 밀, 대두 및 옥수수; 비트(예를 들어 사탕무 및 사료무); 오이, 머스크멜론, 켄탈롭, 애호박 및 수박을 포함하는 표주박; 브로콜리, 양배추, 콜리플라워, 복초이, 및 다른 잎 채소를 포함하는 케일 작물, 토마토, 후추, 상추, 콩류, 완두콩, 양파, 마늘 및 땅콩을 포함하는 다른 채소류; 카놀라, 땅콩, 해바라기, 유채 및 대두를 포함하는 오일 작물; 담배를 포함하는 가지과 식물; 감자, 참마, 래디시, 비트, 당근 및 고구마를 포함하는 괴경 및 근채류; 딸기를 포함하는 과실; 목화 및 대마를 포함하는 식물 섬유; 커피, 화단용 식물, 다년생 식물, 화목, 잔디 및 카네이션 및 장미를 포함하는 절화를 포함하는 다른 식물; 사탕수수; 용기 임목(containerized tree crop); 전나무 및 소나무를 포함하는 상록수; 단풍나무 및 참나무를 포함하는 낙엽수; 및 체리, 사과, 배, 아몬드, 복숭아, 호두 및 감귤류를 포함하는 과실 및 견과 나무를 포함하는 단자엽 및 쌍자엽 식물 종을 둘 다 포함한다.
본 명세서에 기재된 ABA 작용물질은 세포 상에서 ABA의 기능을 모방하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 세포를 ABA와 접촉시킴으로써 촉발되는 하나 이상의 세포 반응은 또한 세포를 본 명세서에 기재된 ABA 작용물질과 접촉시킴으로써 촉발될 것으로 예상된다. 본 명세서에 기재된 ABA 작용물질은 ABA의 기능을 모방하며, 유용한 제형에서 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ABA 작용물질의 적용은 식물의 무생물적 스트레스 저항성을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 종자에 본 명세서에 기재된 ABA 작용물질의 적용은 종자의 발아를 저해한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 ABA 제형과 접촉되는 식물을 제공한다. ABA 제형과 접촉되는 식물은 식물 부분 및/또는 종자를 포함할 수 있다.
V. 새로운 ABA 작용물질 및 길항물질에 대한 선별
본 발명의 실시형태는 또한 추정적 작용물질이 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드에 접촉될 때, 추정적 작용물질이 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드를 작용화하는지의 여부를 결정하기 위해 추정적 화학 작용물질을 선별하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 예를 들어 PYR/PYL 수용체로부터 하류의 신호처리를 증가시키기 위해, 작용제가 수용체의 활성의 활성화 또는 상향조절을 초래한다면, 작용제는 PYR/PYL 수용체 단백질을 "작용화한다". 본 발명에 대해, 작용제가 200μM 이하의 농도에서 존재할 때, 작용제가 PYR/PYL 수용체와 접촉하는 것이 PYR/PYL 수용체의 활성의 활성화 또는 상향조절을 초래한다면, 작용제는 PYR/PYL 수용체를 작용화한다. 작용제가 200μM 이하의 농도에서 존재할 때, 작용제가 PYR/PYL 수용체 단백질의 활성의 활성화 또는 상향조절을 유발하지 않는다면, 작용제는 PYR/PYL 수용체를 유의하게 작용화하지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "활성화"는 작용제에 의해 유발되는 활성의 최소 역치를 필요로 한다. 활성의 이런 최소 역치가 충족되는지의 여부를 결정하는 것은, 예를 들어 유발되어야 하는 효소적 활성 수준에 대해 최소값을 설정하는 효소적 포스파타제 분석을 사용함으로써, 또는 비색 검출 시약(예를 들어, 파라-나이트로페닐포스페이트)의 존재에서 효소적 포스파타제 분석을 사용함으로써 수행될 수 있되, 색변화가 관찰된다면, 활성의 최소 역치는 충족되었다.
본 발명은 또한 작용물질의 경우에 PYR/PYL-PP2C 결합을 유발하는 분자의 능력 또는 길항물질의 경우에 PYR/PYL-PP2C 결합을 촉진하는 ABA 및 다른 작용물질의 능력을 방해하는 분자의 능력에 대해 선별함으로써 ABA 작용물질 및 길항물질에 대한 선별 방법을 제공한다. 다수의 상이한 선별 프로토콜은 PYR/PYL 폴리펩타이드를 작용화하거나 또는 길항하는 작용제를 확인하는데 이용될 수 있다.
선별은 단리되거나, 정제되거나 또는 부분적으로 정제된 시약을 사용하여 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 정제되거나 또는 부분적으로 정제된 PYR/PYL 폴리펩타이드가 사용될 수 있다.
대안적으로, 세포기반 선별 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, PYR/PYL 폴리펩타이드를 자연적으로 발현시키거나, 또는 PYR/PYL 폴리펩타이드를 재조합적으로 발현시키는 세포가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 사용되는 세포는 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 식물 세포, 동물 세포, 박테리아 세포, 진균 세포이다. 일반적 용어에서, 선별 방법은, 예를 들어, PYR/PYL 폴리펩타이드에 결합함으로써, 또는 PYR/PYL 폴리펩타이드를 활성화시키거나 또는 PYR/PYL 폴리펩타이드의 발현, 또는 PYR/PYL 폴리펩타이드를 암호화하는 전사체의 발현을 증가시킴으로써 PYR/PYL 폴리펩타이드의 활성을 조절하는 작용제를 확인하기 위한 다수의 작용제를 선별하는 단계를 수반한다.
1. PYR / PYL 폴리펩타이드 결합 분석
선택적으로, 예비적 선별은 PYR/PRL 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 작용제를 선별함으로써 수행될 수 있는데, 이렇게 확인된 작용제의 적어도 일부는 PYR/PYL 폴리펩타이드 조절제일 가능성이 있기 때문이다.
결합 분석은 하나 이상의 시험 작용제와 접촉시키는 단계 및 충분한 시간 동안 단백질 및 시험 작용제가 결합 복합체를 형성하게 하는 단계를 수반할 수 있다. 형성된 임의의 결합 복합체는 다수의 확립된 분석적 기법 중 어떤 것을 사용하여 검출될 수 있다. 단백질 결합 분석은 미변성 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 대한 공침 또는 공동 이동, 및 웨스턴 블롯에 대한 공동 이동을 측정하는 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[Bennet, J.P. and Yamamura, H.I. (1985) "Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods", Neurotransmitter Receptor Binding (Yamamura, H. I., et al., eds.), pp. 61-89] 참조). 다른 결합 분석은 PYR/PYL 폴리펩타이드에 결합된 분자 또는 표지된 기질(예를 들어 표지된 ABA)의 이동을 확인하기 위한 질량 분석법 또는 NMR 기법의 사용을 수반한다. 이러한 분석에서 이용된 PYR/PYL 폴리펩타이드 단백질은 자연적으로 발현되거나, 클로닝되거나 또는 합성될 수 있다.
2. 활성
PYR/PYL 폴리펩타이드 작용물질은 PYR/PYL 폴리펩타이드의 활성을 활성화시키거나 또는 증가시키는 작용제에 대한 선별에 의해 확인될 수 있다. 길항물질은 활성을 감소시킴으로써 확인될 수 있다.
일 활성 분석은 후보 작용물질이 작용물질-특이적 방식에서 2형 단백질 포스파타제(PP2C) 폴리펩타이드에 PYR/PYL 단백질의 결합을 유발할 수 있는지의 여부를 시험하는 것을 수반한다. 포유류 또는 효모 2-혼성체 접근(예를 들어, 문헌[Bartel, P.L. et . al. Methods Enzymol, 254:241 (1995)] 참조)은 세포에서 함께 발현될 때 상호작용하거나 또는 결합되는 폴리펩타이드 또는 다른 분자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, PYR/PYL 폴리펩타이드를 작용화하는 작용제는 PYR/PYL 폴리펩타이드와 2형 단백질 포스파타제(PP2C) 폴리펩타이드(예를 들어, PP2C의 그룹 A 서브패밀리로부터의, 예를 들어, ABI1 또는 2 또는 이의 오솔로그) 간의 2-혼성체 분석에서 확인되되, ABA 작용물질은 PYR/PYL 폴리펩타이드 및 PP2C 폴리펩타이드의 결합을 활성화시키거나 또는 가능하게 하는 작용제로서 확인된다. 따라서, 2개의 폴리펩타이드는 작용제의 존재에서 결합되지만, 작용제의 부재 시 결합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 효모 세포가 효모 2 혼성체 분석에서 청색으로 바뀐다면, 화학적 화합물 또는 작용제는 PYR/PYL 단백질의 작용물질로서 확인된다.
일반적으로 PYR1, 및 PYR/PYL 단백질의 생화학적 기능은 PP2C 활성을 저해하는 것이다. 이는 효모 2 혼성체 또는 다른 세포 기반 방법을 사용하여 살아있는 세포에서 측정될 수 있다. 또한 비색적 검출 시약(예를 들어, 파라-나이트로페닐 포스페이트)의 존재에서 효소적 포스파타제 분석을 사용하여 시험관내에서 측정될 수 있다. 상기 사용된 효소-기반 분석은 리간드 결합의 간접적 지표를 제공한다. 이 잠재적인 제한을 처리하기 위해, 약한 결합 표적 화합물을 확인하기 위한 대안의 접근으로서 시험관내 경쟁 분석 또는 다른 유기체를 사용하는 세포 기반 분석을 사용할 수 있다.
3. 발현 분석
PYR/PYL 폴리펩타이드의 발현을 증가시키는 화합물에 대한 선별이 또한 제공된다. 선별 방법은 일반적으로 세포기반 또는 식물기반 분석을 수행하는 단계(이때 시험 화합물은 PYR/PYL 폴리펩타이드를 발현시키는 하나 이상의 세포와 접촉됨), 그 다음에, PYR/PYL 발현(전사체 또는 번역 산물 중 하나)에서의 증가를 검출하는 단계를 수반한다. 분석은 PYR/PYL을 자연적으로 발현시키는 세포에 의해 또는 PYR/PYL을 발현시키도록 재조합적으로 변경된 세포에서, 또는 PYR/PYL 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자를 발현시키도록 재조합적으로 변경된 세포에서 수행될 수 있다.
리포터 작제물이 없는 세포와 동시 반응을 실행하는 것을 포함하거나, 또는 리포터 작제물을 은닉하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키지 않음으로써 관찰된 활성이 믿을 만하다는 것을 보장하기 위해 다양한 대조군이 수행될 수 있다.
4. 타당성 검증
앞서 언급한 선별 방법 중 어떤 것에 의해 처음으로 확인된 작용제는 명확한 활성을 입증하기 위해 및/또는 작용제의 다른 생물학적 효과를 결정하기 위해 추가로 시험될 수 있다. 일부 경우에, 확인된 작용제는 식물 스트레스(예를 들어, 내건성)를 달성하는 능력, 종자발아, 또는 ABA에 의해 영향받는 다른 표현형에 대해 시험된다. 다수의 이러한 분석 및 표현형은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.
5. 고체상 및 가용성 고처리량 분석
본 발명의 고처리량 분석에서, 하루에 상이한 조절자 또는 리간드를 수천개까지 선별할 수 있다. 특히, 마이크로타이터 플레이트의 각 웰은 선택된 잠재적 조절인자에 대해 별개의 분석을 실행하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 농도 또는 인큐베이션 시간 효과가 관찰된다면, 모두 5 내지 10개의 웰이 단일 조절인자를 시험할 수 있다. 따라서, 단일 표준 마이크로타이터 플레이트가 약 100(예를 들어, 96) 조절인자를 분석할 수 있다. 1536 웰 플레이트가 사용된다면, 단일 플레이트는 약 100 내지 약 1500의 상이한 화합물로부터 용이하게 분석할 수 있다. 1일 당 몇몇 상이한 플레이트를 분석하는 것이 가능하며; 약 6,000 내지 20,000개 이상까지의 상이한 화합물에 대한 분석 선별이 본 발명의 통합된 시스템을 사용하여 분석이 가능하다. 추가로, 시약 조작에 대한 마이크로 유동 접근이 사용될 수 있다.
관심 대상의 분자(예를 들어, PYR/PYL 또는 PYR/PYL 폴리펩타이드를 발현시키는 세포)는 공유적 또는 비공유적 결합을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 고체 상태 성분에 결합될 수 있다.
본 발명은 고처리량 방식에서 PYR/PYL의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하기 위한 시험관내 분석을 제공한다.
무생물적 스트레스 저항성은 다수의 잘 공지된 기법 중 어떤 것에 따라 분석될 수 있다. 예를 들어, 내건성에 대해, 식물은 최적 미만의 물이 식물에 제공되는 조건 하에서 생장될 수 있다. 가뭄 저항성은 팽압, 생장, 수확량 등을 포함하는 다수의 표준 측정 중 어떤 것에 의해 결정될 수 있다.
VI . 식물에서 무생물적 스트레스 내성을 증가시키는 방법
본 발명은 또한 식물에서 무생물적 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 식물은 본 명세서에 기재된 ABA 작용물질 또는 ABA 작용물질 제형과 식물에서 무생물적 스트레스 내성을 증가시키기에 충분한 양으로 접촉된다. 식물에 적용된 ABA 작용물질 제형의 양은 ABA 작용물질 제형과 식물을 접촉하지 않는 것에 비해 무생물적 스트레스 내성을 증가시키는데 충분할 수 있다. 식물은 본 명세서에 기재된 방법 중 어떤 것을 사용하여 ABA 제형과 접촉될 수 있다. 무생물적 스트레스 내성에서의 증가는 식물의 생장 또는 생존에 유해하게 영향을 미치는 무생물적 스트레스 조건에 대해 식물 생장 및/또는 생존을 개선시킬 수 있다. 무생물적 스트레스는 본 명세서에 기재된 물리적 또는 화학적 조건을 포함한다.
VII . 식물에서 종자발아의 저해방법
본 발명은 또한 종자발아를 저해하는 방법을 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 식물, 식물 부분 또는 종자는 종자발아를 저해하기에 충분한 양으로 ABA 작용물질 제형과 접촉된다. 종자는 본 명세서에 기재된 방법 중 어떤 것을 사용하여 ABA 제형과 접촉될 수 있다. 일부 실시형태에서, 종자는 ABA 작용물질 제형과 직접적으로 접촉된다. 일부 실시형태에서, 땅 또는 토양은 종자를 식재 또는 파종하기 전에 또는 후에 ABA 작용물질 제형과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 식물은 이후에 식물로부터 발생되는 종자의 발아를 저해하는 충분한 ABA 작용물질 제형과 접촉된다.
VIII . PYR / PYL 수용체 폴리펩타이드를 활성화시키는 방법
본 발명은 또한 PYR/PYL 수용체 폴리펩타이드를 활성화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, PYR/PYL 폴리펩타이드는 상기 기재된 화합물과 접촉되고, 활성화된 PYR/PYL 폴리펩타이드는 PP2C 폴리펩타이드에 결합된다. 일부 실시형태에서, PYR/PYL 폴리펩타이드는 작용물질 화합물 LC66C6에 의해 활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화된 PYR/PYL 단백질은 서열번호 1 내지 119 중 어느 하나와 실질적으로 동일하다. 다양한 식물로부터의 ABA 수용체의 예는 미국특허 공개 제2011/0271408호에서 제공되며, 이는 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다.
일부 실시형태에서, 해당 방법은 세포가 없는 시험관내 분석에서 PYR/PYL 수용체를 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 해당 방법은 세포에서 발현된 PYR/PYL 수용체를 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 세포는 또한 PP2C 폴리펩타이드를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 세포는 식물 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 동물 또는 포유류 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 내인성 PYR/PYL 단백질을 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 세포는 이종성 PYR/PYL 폴리펩타이드를 발현시키도록 유전자조작된다. 일부 실시형태에서, 세포는 이종성 PP2C 폴리펩타이드를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 세포는 HAB1(AMI1에 대한 상동체), AMI1 또는 ABI2로부터 선택된 PP2C 폴리펩타이드를 발현시킨다.
일부 실시형태에서, 활성화된 PYR/PYL 폴리펩타이드는 이종성 유전자의 발현을 유발한다. 일부 실시형태에서, 이종성 유전자는 ABA 반응성 유전자이다. 일부 실시형태에서, 유발된 유전자 발현은 내인성 PYR/PYL 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 유발된 유전자 발현은 이종성 PYR/PYL 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에서 일어난다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 신규한 본 명세서에 기재된 ABA 작용물질이 다수의 PYR/PYL 수용체에 결합하고 활성화시키는 것을 보여준다.
방법
화학적 선별
이전에 기재된 효모 2-혼성체 시스템을 고처리량 선별(high throughput screen: HTS)에서 사용하여 ABA 작용물질을 확인하였다(문헌[Peterson FC, et al. (2010) Structural basis for selective activation of ABA receptors. Nature Structural & Molecular Biology 17(9): 1109-1111] 참조). 이 시스템에서, 작용물질 촉진된 수용체 - PP2C 상호작용은 URA3 또는 HIS3 리포터 유전자의 발현을 구동시키며, 모 균주의 유라실 또는 히스티딘 영양요구성을 구한다(Peterson FC, et al. (2010); Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, & Boeke JD (1996) Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(19): 10315-10320). PYR1, PYL1, PYL2, PYL3 또는 PYL4에 대한 결합 도메인(binding domain: BD) 융합을 발현시키는 5가지 상이한 리포터 균주를 사용하여 HTS를 수행하였고; 이들을 HAB1(pACT-HAB1)에 대한 활성화 도메인(activation domain: AD) 융합으로 공동발현시켰으며; 사용한 작제물은 앞에 설명되어 있다(Park et al. 2009). 본 발명자들은 2가지 별개의 선별에서 이들 균주를 이용하였다. 제1 선별에서, 켐브릿지(Chembridge)(미국 샌디에고에 소재)로부터 얻은 ~65,000 화합물을 할로 분석을 사용하여, 문헌[Gassner NC, et al. (2007)(Accelerating the discovery of biologically active small molecules using a high-throughput yeast halo assay. Journal of Natural Products 70(3):383-390)]에 의해 본질적으로 기재된 바와 같은, 작용물질 활성에 대해 분석하였다. 본 방법에서, 효모 균주를 선택적 한천에 함입시켰고, 화합물 핀을 10mM DMSO 저장액으로부터 분석 플레이트에 옮겼으며; 활성 화합물 부근의 증가된 세포 밀도에 의해 히트는 분명하다. 할로 분석을 사용하는 실험은 효모 균주 PJ69-4A를 이용하였고, 배지를 10mM 3-아미노트라이아졸로 보충하여 선택을 개선시켰다. 자동 마이크로플레이트 호텔(써모 사이토매트(Thermo Cytomat)) 및 분석 플레이트 상에 화합물을 스팟팅하기 위해 사용한 384-핀 툴(브이 앤 피 사이언티픽(V & P Scientific))을 구비한 바이오메크 FX(Biomek FX)를 사용하여 할로 선별을 설정하였다. 각각의 화합물을 옮기기 전에, 핀을 DMSO/물의 1:1 혼합물 중에서 세척한 다음, 95% 에탄올로 세척하였다. 화학적 이동 후, 플레이트를 28℃에서 인큐베이션시켰고, 수동 검사에 의해 후보 작용물질은 명확하였다.
처리량의 관점으로부터 할로 선별 방법이 강력하지만, 본 발명자들은 라이프 케미컬스(Life Chemicals)(우크라이나에 소재)로부터 얻은 12,000-구성원 라이브러리의 제2 선별을 위한 더 통상적인 선별 방법을 후속적으로 사용하였다. 이 변화는 분석 농도를 더 양호하게 제어하기 위한 바램에 의해 동기부여되었다. 본 발명자들의 제2 선별에서, 리포터 작제물을 효모 균주 MAV99에서 발현시켰는데, 이는 GAL1 프로모터 구동 URA3 이식유전자를 통해 유라실-기반 선택을 가능하게 한다(Peterson FC, et al. (2010)). 선별 화합물을 25M의 최종 농도에서 96 웰 플레이트 포맷에서의 리포터 균주를 씨딩한 "선택적 유라실" 배지에 첨가하였고; ~3일 후 수동으로 효모 생장을 조사하였다. 바이오메크 FK 액체 핸들러를 사용하여 2.5mM 저장액으로부터 선별 웰로 화합물을 옮겼다.
제3 선별 접근으로서, 0.5 X MS 염, 0.5% 수크로스 및 25μM 시험 화합물을 함유하는 고형화된 한천 배지 내 애기장대 발아 저해제에 대해 라이프 케미컬스 라이브러리를 또한 선별하였다. 발아 분석으로부터의 히트를 효모 2 혼성체 분석에서 후속적으로 시험하였다. 히트 화합물을 그것의 본래의 공급자로부터 재저장하였고, 2차 선별 및 화합물 특성규명에서 사용하였다. 퀴나박틴 및 그의 유사체를 라이프 케미컬스로부터 구입하였다.
PP2C 활성 분석
HAB1 및 PYL 단백질을 약간 변형하여 앞서 기재한 바와 같이 발현시키고 정제하였다(Park SY, et al. (2009) Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science 324(5930): 1068-1071). GST-HAB1, -ABI1 및 -ABI2 융합 단백질을 얻기 위해, HAB1 cDNA를 pGex-2T로 클로닝시킨 반면, ABI1 및 ABI2 cDNA를 벡터 pGex-4T-1로 클로닝시켰다. 발현을 BL21[DE3]pLysS 숙주 세포에서 수행하였다. 형질전환시킨 세포를 밤새 사전 배양시켰고, LB 배지에 옮겼으며, 30℃에서 배양시켜 ~0.5의 A600을 배양시켰다. 그 다음에 배양물을 얼음 상에서 냉각시켰고, MnCl2를 4mM로 첨가하였으며, IPTG를 0.3mM로 첨가하였다. 15℃에서 16시간 인큐베이션 후, 세포를 채취하였고, 재조합 단백질을 앞서 기재한 바와 같이 글루타티온 아가로스 상에서 정제하였다(Park SY, et al. (2009). 6XHis-PYL 수용체 융합 단백질을 얻기 위해, 모두 13개 ABA 수용체에 대한 수용체 cDNA를 벡터 pET28 내로 클로닝시켰고, 발현시켰으며, 앞서 기재한 바와 같이 정제하였고(Mosquna A, et al. (2011) Potent and selective activation of abscisic acid receptors in vivo by mutational stabilization of their gonist-bound conformation. PNAS 108(51):20838-20843); 이것으로 PYL7, PYL11 및 PYL12을 제외한 모든 수용체에 대해 가용성이고 기능성인 단백질을 수득하였다(수용체-매개 PP2C 저해 분석을 사용하여 평가함). 따라서 이들 3가지 수용체를 벡터 pMAL-c를 사용하여 말토스 결합(MBP) 융합 단백질로서 대안적으로 발현시켰고; 이들 작제물의 발현을 GST-HAB1에 대해 사용한 동일한 유도 조건으로 BL21 [DE3]pLysS 숙주 세포에서 수행하였다. 재조합 MBP-PYL 융합 단백질을 제조업자의 정제 지침을 사용하여 아밀로스 수지(뉴 잉글랜드 바이오랩, 인코포레이티드(New England Biolab, Inc.))를 사용하여 초음파 처리하고 맑아진 용해물로부터 정제하였다. 이 노력은 활성 MBP-PYL11 융합 단백질을 수득하였지만, PYL7 및 PYL12는 수득하지 못했다.
재조합 수용체 및 PP2C를 사용하는 PP2C 활성 분석을 다음과 같이 수행하였다: 정제한 단백질을 ABA 또는 ABA 작용물질과 함께 10mM MnCl2, 3㎍ 소 혈청 알부민 및 0.1% 2-머캅토에탄올을 함유하는 80㎕ 분석 완충제 중에서 30분 동안 22℃에서 사전 인큐베이션시켰다. 발락(Wallac) 플레이트 판독기 상에서 여기 필터 355㎚ 및 방출 필터 460㎚를 사용하여 형광 측정을 즉시 수집한 후, 156mM 트리스(Tris)-OAc, pH 7.9, 330mM KOAc 및 5mM 4-메틸움벨리페릴 포스페이트를 함유하는 20㎕ 반응 용액을 첨가함으로써 반응을 시작하였다. 반응물은 50㎚ PP2C 및 100㎚ PYR/PYL 단백질을 각각 함유하였다.
도 1A는 ABA 작용물질의 대표적인 그룹을 나타낸다. 도 1B에 나타낸 바와 같이, 다수의 PYR/PYL 수용체는 효모 2-혼성체 분석에서 LC66C6을 포함하는 몇몇 작용물질에 의해 활성화된다. 이 분석은 앞서 기재된 바와 같이(Park et al. 2009) 특이적 수용체 및 PP2C가 GAL4 활성화 및 DNA-결합 도메인에 각각 융합될 때 PYR/PYL 단백질 및 클레이드 A PP2C 단백질의 작용물질-촉진된 물리적 상호작용을 보고한다. 이들 효모-기반 분석은 ABA 또는 새로운 작용물질 LC66C6보다 훨씬 더 큰 수용체 선택성을 갖는 앞서 기재한 작용물질 파라박틴과 달리, LC66C6이 다수의 PYR/PYL 수용체의 작용물질이라는 것을 나타낸다. 앞서 기재한 바와 같이, 클레이드 A PP2C에 대한 수용체의 작용물질-촉진된 결합은 PP2C의 포스파타제 활성을 저해한다. 애기장대에서, 14가지의 PYR/PYL 수용체가 있으며, 이중 13가지는 원형질체-기반 분석 시스템에서의 ABA-반응을 매개할 수 있다(Fujii et al. 2009). LC66C6의 선택성을 더 엄밀히 시험하기 위해, 본 발명자들은 모두 14개 구성원에 대해 재조합 6X-His-PYR/PYL 단백질을 발현시키고 정제하는 것을 시도하였고, 기술적 이유로 활성 형태에서 생성될 수 없었던 PYL7, 12 및 13을 제외한 모든 수용체에 대해 ABA-반응성 수용체를 회수하였다. 재조합 수용체의 이런 패널은 애기장대 PYR/PYL 수용체 패밀리의 구성원에 대한 ABA-작용물질 활성의 거의 완전한 묘사를 가능하게 한다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, HBA1, ABI1, 및 ABI2의 PPC2 효소 활성은 시험한 모든 ABA 수용체의 존재에서 10μM ABA에 의해 90% 초과 만큼 저해된다(도 2b). LC66C6(퀴나박틴)에 대한 반응에서, HBA1, ABI1 및 ABI2의 70% 초과의 PP2C 저해가 수용체 PYR1, PYL1, PYL2, PYL3 및 PYL5에 의해 관찰되었다.
퀴나박틴의 활성을 추가로 특성규명하고, 그것의 수용체 선택성을 정의하기 위해, PP2C HAB1, ABI1 또는 ABI2와 조합으로 10가지의 재조합 수용체를 사용하여 수용체-매개 PP2C-저해 분석을 수행하였다. 이들 실험은 퀴나박틴이 서브마이크로몰 IC50 값으로 PYR1, PYL 1 내지 3 및 PYL5를 활성화하며, 다이머 수용체 부위에서 실질적으로 더 높은 활성을 나타낸다는 것을 나타내었다(도 2, 3 및 4). 결과는 또한 퀴나박틴이 ABA보다 더 강한 PYR1 또는 PYL1 작용물질이라는 것을 나타낸다(도 2 및 도 3). 추가로, 퀴나박틴에 의해 관찰된 최대 PP2C 저해는 시험한 모든 수용체을 이용하여 파라박틴으로 관찰한 것보다 더 높았다. 파라박틴은 0.90μM의 IC50으로 PYL5를 활성화시킬 수 있지만, 그것을 ~40% > PP2C 저해에서 포화시키는데, 이는 그것이 불완전/부분적 PYL5 작용물질이라는 것을 시사한다. 따라서, 이 실시예는 파라박틴에 대해 더 넓은 수용체 범위 활성 및 증가된 생활성을 지니는 새로운 설폰아마이드 작용물질의 확인을 입증한다.
실시예 2
본 실시예는 신규한 ABA 작용물질이 발아 및 식물 생장을 저해한다는 것을 입증한다.
애기장대 발아 및 배축 생장 저해 분석
애기장대 발아 및 배축 생장 저해 분석을 위해, 종자를 약 4주 숙성 시킨 후 5% NaClO 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 용액으로 10분 동안 표면 멸균시켰고, 물로 4회 린스하였다. 멸균시킨 종자를 0.1% 한천으로 현탁시켰고, 화학물질의 존재에서 0.8% 고형화된 1/2 무라시게 앤드 스쿠그(Murashige and Skoog)(MS) 염(시그마 알드리치(Sigma- Aldrich))을 함유하는 한천 한천 배지 상에 파종하였으며, 4℃에서 4일 동안 저장한 다음, 암실 또는 광 하에 22℃에서 옮겼다. 4일 인큐베이션 후 발아를 결정한 한편, 6일 인큐베이션 후 배축 생장을 촬영하였다.
식물 재료
다음의 대립유전자/돌연변이체 균주를 사용하였다: aba2 -1(Leon-Kloosterziel KM, et al. (1996) Isolation and characterization of abscisic acid-deficient Arabidopsis mutants at two new loci. Plant J 10(4):655-661), abi1-1(Umezawa T, et al . (2009) Type 2C protein phosphatases directly regulate abscisic acid-activated protein kinases in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(41): 17588-17593), abi3 -9, abi4 -11(Nambara E, et al. (2002) A screen for genes that function in abscisic acid signaling in Arabidopsis thaliana. Genetics 161(3): 1247-1255), 및 pry1pyl1pyl2ply4 4중(Park SY, et al. (2009) Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science 324(5930): 1068-1071); 이들 균주 모두는 콜롬비아(Columbia) 배경이다. 이용한 pry1pyl1pyl2ply4 4중 돌연변이체 균주는 콜롬비아에 3회 역교배시켰다. 보리 및 대두 종자를 리빙 홀 푸드 인코포레이티드(Living Whole Foods, Inc.)로부터 구입한 한편, 메이즈 종자를 W. Atlee Burpee & Co.로부터 얻었다. 이들 재료를 사용하는 생리학적 실험에 대해 사용한 상세한 방법을 뒷받침하는 정보로서 제공한다.
LC66C의 독특한 작용물질 특성의 생리학적 결과를 탐구하기 위해, 본 발명자들은 애기장대 종자, 묘목 및 성체 식물에 대한 그것의 효과를 특성규명하였다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, 본 명세서에 기재된 ABA 작용물질은 애기장대에서의 종자발아를 강하게 저해한다. 도 5A 및 5B는 LC66C6을 포함하는 몇몇 작용물질이 용량 의존적 방식으로 종자의 발아를 저해한다는 것을 나타낸다. 특히, LC66C6은 (+)-ABA로서 발아를 저해하는데 몰 당 기준으로 거의 효과적이었고, 시험한 다른 작용물질보다 더 효과적이었다.
도 5C 및 5D는 다양한 ABA-무감각 돌연변이체로부터 종자의 발아를 저해하는 것에 대한 작용물질 (+)-ABA 및 LC66C6의 효과를 나타낸다. 도 5C에서 나타내는 바와 같이, 5μM의 농도에서, LC66C6은 PYR/PYL 4중 돌연변이체를 제외하고 시험한 모든 돌연변이체(pyr1/pyl1/pyl2/pyl4) 및 pyr1 단일 돌연변이체에 대해 (+)-ABA가 저해한 것과 같이 발아를 저해하는 유사한 패턴을 나타내었다. 도 4에서 상기 제시한 IC50 데이터와 조합하면, 이 유전적 데이터는 LC66C6의 발아-저해 활성이 PYR1, PYL1 및 PYL2를 작용화하는 그것의 능력에 의해 대체로 설명된다. 4중 돌연변이체에서 발아를 저해하는 ABA의 능력은 다른 수용체에 대한 그것의 작용물질 활성에 의해 설명될 가능성이 있다. 본 발명자들의 유전적 데이터는 PYR1이 중요한 역할을 하지만 ABA에 대한 반응하여 종자발아에서 불필요한 역할을 한다는 가설과 일치되는데, PYR1 돌연변이체가 5μM LC66C6 또는 파라박틴의 존재에서 발아되기 때문이다(Park et al. 2009).
도 6에 나타내는 바와 같이, LC66C6은 또한 발아 후 식물 생장을 저해한다. 도 6A 및 6B는 LC66C6이 야생형, abi1, 및 4중 돌연변이체에서 뿌리 신장을 저해하며, 모든 시험 농도에서 그것의 저해효과에서 (+)-ABA와 비슷하거나 또는 약간 더 효과적이라는 것을 나타낸다. 추가로, 도 6C는 LC66C6이 농도 의존적 방식에서 야생형과 돌연변이 식물 둘 다의 생장을 저해한다는 것을 입증한다. LC66C6에 의한 식물 생장의 저해는 파라박틴에 의한 저해보다 유의하게 더 크며, (+)-ABA의 저해와 비슷하다.
이 실시예는 LC66C6이 야생형과 ABA-무감각 돌연변이 식물 둘 다의 종자발아와 생장의 강력한 저해제라는 것을 입증한다.
실시예 3
본 실시예는 작용물질 LC66C6이 가뭄 스트레스 내성을 유발한다는 것을 입증한다.
생리학적 분석
16/8-h 명/암 주기 하에 22 ± 2℃ 및 상대 습도(relative humidity: RH) 45 ± 10%에서 생장시킨 애기장대 식물에 대한 생리학적 분석을 수행하였다. 애기장대에서 증발된 수분 손실량 분석을 위해, 25μM 화합물 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 4㎖ 용액의 에어로졸 분무에 의해 식물을 사전처리하였다. 12개의 4주령 식물을 분석한 화합물 또는 대조군마다 분무하였다. 화합물로 밤새 사전처리 후, 뿌리로부터 기근을 분리시켰고, 그것의 생중량을 2시간의 시간 기간에 걸쳐 20분 간격으로 측정하였다. 기공 구멍을 측정하기 위해, 식물을 상기 기재한 바와 같은 화합물로 사전처리하였고, 플라스틱 뚜껑으로 덮어서 높은 RH를 유지하였으며, 밤새 사전처리한 후 잎 상피 인상을 SUMP B 플레이트(SUMP 레버러토리(SUMP Laboratory))와 함께 SUMP 인상 용액을 사용하는 스즈키 유니버셜 마이크로-프린팅(Suzuki's Universal Micro-Printing: SUMP) 방법을 사용하여 얻었다. 잎 인상을 광 현미경에 의해 분석하였고, 기공 구멍을 ImageJ 1.43v 소프트웨어(미국국립보건원)를 사용하여 구멍 폭으로부터 결정하였다. 애기장대 가뭄 스트레스 분석을 위해 대략 1.5㎖의 25μM 화학물질 용액을 에어로졸에 의해 식물에 3일의 기간에 걸쳐 매일의 간격으로 적용하였다. 식물을 포트 당 토양 100g을 수용하는 평방 6 X 6 X 5㎝ 포트에서 생장시켰다. 대두 가뭄 스트레스 분석을 16/8-h 명/암 주기 하에 25 ± 2℃, 65 ±10% RH에서 생장시킨 식물에 대해 수행하였다. 0.05% 트윈-20을 함유하는 대략 20㎖의 50μM 화학물질 용액을 각각 3일 동안 4회 포트마다(포트마다 3개의 식물) 분무하였다. 사용한 포트는 250㎖의 크기였고, 포트마다 토양 200g을 수용하였다. 포트를 파라필름으로 덮었고, 따라서 측정한 수분 손실은 매개된 증산작용이었다. 포트 중량을 측정함으로써 토양 수분 함량%를 결정하였고, 전체 중량으로부터 건조 토양 중량을 제거함으로써 계산하였다.
대두, 보리 및 메이즈에서 수분 손실 분석.
대두 보리 및 메이즈를 사용하는 수분 손실 분석을 위해, 0.05% 트윈-20을 함유하는 100μM 화학물질 용액을 식물의 기근에 부분에 분무하였다. 사용한 대두, 보리 및 메이즈 식물은 각각 대략 4-, 2- 및 2-주령이었다. 화합물을 16시간 적용한 후 수분 손실 분석을 수행하였다. 수분 손실을 측정하기 위해 전체 새싹을 분리시켰고, 그것의 생중량을 모니터링하였다.
도 7은 가뭄 스트레스와 관련된 다양한 파라미터에 대한 LC66C6의 효과를 나타낸다. 도 7A 및 도 7B에서 나타내는 바와 같이, LC66C6는 야생형 및 aba2(ABA-결함 돌연변이체 2) 돌연변이 식물로부터 분리된 잎에서의 증발된 수분 손실량이 감소되었다. 그러나, 도 7C에서 나타내는 바와 같이, LC66C6은 abi1 -1 돌연변이로부터 분리된 잎에서 증발된 수분 손실량이 감소되지 않았다. 도 7D는 LC66C6이 야생형 및 aba2 돌연변이체에서 기공 폐쇄를 유발하지만, abi1 -1 돌연변이체에서 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 도 7E는 대두 식물의 가뭄 처리 동안 토양 수분 함량에 대한 작용물질 화합물의 효과를 나타낸다.
도 8A는 퀴나박틴으로 식물의 처리가 (+)-ABA로 처리에 의해 부여된 것과 유사한 애기장대 식물에서의 가뭄 스트레스 내성을 부여한다는 것을 나타낸다. 본 실시예에서, 2주령 식물에 물을 주지 않음으로써 가뭄 스트레스를 받게 하였고, 12일 후 촬영하였다. 식물을 2주 가뭄 처리 후 재수화시켰다. 시험한 식물의 전체 수 당 살아있는 식물의 수는 사진에 옆에 나타낸다. 도 8B는 퀴나박틴으로 대두 식물의 처리가 (+)-ABA에 의한 처리에 의해 부여되는 것과 유사한 가뭄 스트레스 내성을 부여한다는 것을 나타낸다. 본 실시예에서, 2주령 식물에 물을 주지 않음으로써 가뭄 스트레스를 받게 하였고, 가뭄 처리의 8일 후 촬영하였다. 모든 가뭄 스트레스 처리에 대해, 화합물(애기장대에 대해 25μM 및 대두에 대해 50μM에서 처리함)을 0.05% 트윈-20을 함유하는 용액 중에서 적용하였고, 가뭄 요법을 거쳐서 3일마다 에어로졸로서 적용하였다. 모든 실험에 대한 값은 평균 ± SEM이다(n = 6, 3 실험 당 사용한 식물).
본 실시예는 LC66C6이 야생형 및 aba2 돌연변이 애기장대 식물에서 및 야생형 대두 식물에서 (+)-ABA에 의해 부여되는 것과 유사하게 가뭄 스트레스 내성을 유발한다는 것을 나타낸다.
실시예 4
본 실시예는 LC66C6이 (+)-ABA에 의해 유발되는 것과 유사한 방식으로 ABA-반응 유전자를 유발한다는 것을 입증한다.
마이크로어레이 분석
제조업자의 설명서에 따라 전체 RNA를 알앤에이이지 식물 미니 키트(RNAeasy Plant Mini Kit)(미국에 소재한 퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 단리시켰다. 애기장대 ATH1 칩(미국에 소재한 애피메트릭스(Affymetrix))에 대한 cDNA 합성, 표지 및 혼성화를 애피메트릭스 프로토콜을 사용하여 유니버시티 오브 캘리포니아 엣 리버사이드(University of California at Riverside)의 IIGB 코어 인스트루멘테이션 파실리티(Core Instrumentation Facility)에 의해 수행하였다. 생물학적 3중 샘플을 DMSO 대조군, ABA, 파라박틴 및 퀴나박틴 처리를 위해 혼성화시켰고; 화합물을 25μM 최종 농도에서 적용하였으며, 화합물 또는 대조군에 6시간 노출 후 냉동 조직으로부터 RNA를 제조하였다. 프로브 세트에 대한 발현 신호를 계산하였고, MAS5 통계 알고리즘(미국에 소재한 애피메트릭스)에 의해 정규화하였다. 정렬 대이터의 실험적 필터링을 모든 실험에서 신호의 존재에 대해 수행하였다. 각 화학물질 처리에서 평균 전사체 수준을 대조군 실험에서의 평균 전사체 수준과 비교하였고, 배수 변화 값을 계산하기 위해 사용하였다. Log2-형질전환된 배수-변화값을 사용하여 실험 조건 간의 피어슨 상관 계수(Person Correlation Coefficient)를 계산하였다.
정량적 RT-PCR 분석
전체 RNA를 제조업자의 설명서에 따라 식물 RNA 정제 시약(미국에 소재한 인비트로젠)을 사용하여 단리시켰다. 퀀티텍(QantiTec) 역전사 키트(미국에 소재한 퀴아젠)를 사용하여 1㎍의 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 맥시마(Maxima)(등록상표) SYBR 그린/형광 qPCR 마스터 믹스(퍼멘타스(Fermentas))를 사용하는 실시간 PCR을 iQ5 실시간 PCR 검출 시스템(캘리포니아주 허큘레스에 소재한 바이오-래드(Bio-Rad))을 이용하여 수행하였다. 상대적 표준 곡선 방법을 사용하여 표적 mRNA의 상대적 양을 결정하였고, 상대적 양의 내부 대조군 mRNA에 의해 정규화시켰다. 생물학적 3중 실험을 수행하였다. 이들 실험에서 사용한 프라이머 서열을 표 1에 나타낸다.
Figure 112014097732748-pct00009
ABA-반응성 리포터 유전자 분석
본 발명자들의 경험에서 기존의 ABA-반응성 프로모터-GUS 융합은 높은 배경 수준 또는 ABA에 반응하는 상대적으로 낮은 유발 수준 때문에 이상적이지 않다. 낮은 배경 수준을 지니는 고도-ABA 유발 유전자로서 MAPKKK18(Matsui A, et al., Plant Cell Physiol 49(8): 1135-1149 (2008)); MAPKKK18은 또한 가뭄 및 염 스트레스에 의해 강하게 유발된다. 따라서 본 발명자들은 MAPKKK18 프로모터::GUS 리포터 유전자이식 식물에 대한 작용물질의 효과를 특성규명하였다. 다음 조성의 반응 완충제 중에서 GUS 염색을 수행하였다: 50mM 인산 나트륨 완충제 pH 7.0, 0.05% 트윈-20, 2.5mM 페로시안화칼륨, 2.5mM 페리시안화칼륨, 1mM X-gluc. 반응 완충제를 10분 동안 2회 시험 샘플에 진공 침윤시킨 다음, 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 70% 에탄올로 샘플을 세척함으로써 반응을 중단시켰고, 엽록소 색소를 65℃에서 인큐베이션에 의해 표백하였다.
도 9는 파라박틴, LC66C6, 및 (+)-ABA에 반응하여 유발된 유전자 발현 변화를 나타낸다. 도 9A에서 나타내는 바와 같이, LC66C6은 야생형 식물에서 용량 의존적 방식으로 RD29B 및 MAPKKK18 mRNA의 발현을 유발한 반면, 해당 유발 수준은 abi1-1과 PYR/PYL 4중 돌연변이체 식물 둘 다에서 손상되었다. LC66C6에 의한 유전자 발현의 유발은 (+)-ABA에 의해 관찰된 것과 유사하다. (+)-ABA 및 LC66C6과 대조적으로, 파라박틴이 처리시 더 높은 농도로 이용될 때 묘목에서 보통의 ABA-관련 유전자 발현을 유발한다고 해도, 파라박틴은 야생형 식물에서 유전자 발현을 유발하지 않았다(Park et al., 2009).
도 9B는 ATH1 마이크로어레이에 표지된 RNA의 혼성화에 의해 측정되는 바와 같이, 야생형 묘목 상에서, 대조군 처리와 비교하여 ABA 및 LC66C 또는 파라박틴 효과의 게놈 와이드 비교를 나타낸다. 도 9B에 나타내는 바와 같이, LC66C6는 마이크로어레이 실험에서 ABA에 의해 유발되는 것과 유사한 설정의 유전자를 유발한다. 대조적으로, 파라박틴은 ABA의 발현 패턴과 유사한 발현 패턴을 유발하지 않았다.
도 9C 및 9D는 LC66C6이 (+)-ABA와 동일한 조직에서 리포터 유전자의 발현을 유발한다는 것을 나타낸다. 리포터 유전자의 발현을 공변 세포 및 잎 및 뿌리의 관다발 조직에서, 및 흡입된 종자의 어린뿌리 끝에서 관찰하였다.
도 10은 PYR/PYL 단일 돌연변이체에서 ABA-반응성 유전자 발현을 나타낸다. 도 10에서 나타내는 바와 같이, ABA-반응성 MAPKKK18, RD29A 및 RD29B mRNA를 Col 및 Ler 생태형 및 pyr1, pyl1, ply2, pyl3 및 pyl4 단일 돌연변이체 유전자형에서 LC66C6과 (+)-ABA 둘 다에 의해 유발하였다. 대조적으로, 파라박틴은 단일 돌연변이체 또는 야생형 생태형 중 어떤 것에서 분석한 유전자 중 어떤 것의 발현을 유의하게 유발하지 않았다.
도 11은 야생형 식물, abi1 -1 및 PYR/PYL 4중 돌연변이체에서의 ABA-반응성 유전자 발현을 나타낸다. 도 11에서 나타내는 바와 같이, LC66C6과 (+)-ABA는 둘 다 Col 야생형 식물에서 용량 의존적 방식에서 ABF3, GBF3, NCED3 및 RD29A의 발현을 유발한 반면, 유발 수준은 abi1 -1과 PYR/PYL 4중 돌연변이체 식물 둘 다에서 손상되었다. 상기 결과와 일치되게, 파라박틴은 야생형 식물에서 분석한 어떤 유전자의 유의한 발현을 유발하지 않았다.
실시예 5
이 실시예는 ABA 이화작용에 대해 중요한 효소가 LC66C6에 의해 유발된 반응에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
도 12에서 나타내는 바와 같이, ABA에 의한 식물 생장 및 발아의 저해는 ABA 이화작용에 대해 중요한 효소인 cyp707a에 대해 이중 돌연변이인 식물에서 향상되지만, CYP707A를 과발현시키는 식물에서 감소된다(CYP707AOX; 도 12A 내지 도 12D 참조). 대조적으로, LC66C6에 의한 식물 생장 및 발아에 대한 효과는 cyp707a, 야생형 식물에 대한 이중 돌연변이체인 식물에서, 또는 CYP707AOX를 과발현시키는 식물에서 유의하게 상이하지 않다(도 12A 내지 도 12D 참조).
본 실시예는 ABA의 파괴에 수반된 효소가 LC66C6에 의해 조절되는 표현형에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 6
본 실시예는 LC66C6은 단자엽식물 및 쌍자엽식물을 포함하는 다양한 식물 종에 대해 생활성이 있다는 것을 나타낸다.
도 13a는 LC66C6이 브로콜리, 무, 알팔파, 대두, 보리, 밀, 수수 및 메이즈 종자의 발아을 저해한다는 것을 나타낸다. LC66C6에 의한 발아의 저해 수준은 파라박틴보다 더 크다. 도 13b에서 나타내는 바와 같이, LC66C6은 상기 종의 분리된 잎에서 2시간의 기간에 걸쳐 증발된 수분 손실량을 감소시킨다. 추가로, LC66C6은 대두에서 ABA-반응성 유전자 GmNAC4 및 GmbZIP1의 발현을 강하게 유발하고(도 13C), 보리에서 ABA-반응성 유전자 HVA1 및 HvDRF1의 발현을 적당하게 유발하며(도 13D), 메이즈에서 ABA-반응성 유전자 ZmRab17 및 ZmLEA의 발현을 약하게 유발한다(도 13E).
본 실시예는 농업적으로 중요한 종의 다양한 그룹에서 LC66C6이 발아를 저해하고 증발된 수분 손실량을 감소시킨다는 것을 입증하는데, 이는 LC66C6이 다양한 종에서 가뭄 스트레스를 감소시키는데 유용하다는 것을 나타낸다.
실시예 7
본 실시예는 ABA 및 본 명세서에 기재된 작용물질의 화학적 구조, 및 시험관내 및 생체내 작용물질의 효과를 나타낸다.
도 14 및 도 18은 ABA 및 시험한 작용물질의 화학적 구조를 나타낸다. 도 15A는 도 14에 나타낸 각각의 작용물질에 대한 반응을 시험하기 위해 PYR/PYL 수용체 PYR1, PYL1, PYL2, PYL3 및 PYL4를 사용하는 효모 2 혼성체 분석의 결과를 나타낸다. 도 15B는 야생형 종자의 발아에 대한 도 14에서의 작용물질 시험 결과를 나타내며, LC66C6이 (+)-ABA 후 야생형 종자의 발아를 저해하는데 가장 효과적인 작용물질이라는 것을 입증한다. 도 15C는 ABA-유발성 애기장대 유전자 MAPKKK18의 제어 하에서 글루쿠로니다제를 발현시키는 유전자이식 계통에서 글루쿠로니다제 분석을 사용하여 측정한 바와 같은 ABA-리포터 계통에 대한 화합물의 효과를 나타낸다.
본 실시예는 LC66C6이 시험관내와 생체내 둘 다에서 시험한 가장 효과적인 작용물질이라는 것을 입증한다.
실시예 8
본 실시예는 LC66C6이 ABA-결함 돌연변이체 식물의 크기를 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
본 실시예에서, 14일령 야생형 및 aba2 돌연변이체 식물을 2주 동안 1일 2회 25μM의 작용물질을 함유하는 용액으로 분무하였다. 이미지 및 생중량을 4주령 식물로부터 얻었다. 도 16에서 나타내는 바와 같이, aba2 돌연변이 식물에 대한 LC66C6의 적용은 담체 DMSO만으로 처리한 대조군 식물에 비해 돌연변이 식물의 크기를 유의하게 증가시켰다.
본 실시예는 LC66C6이 (+)-ABA와 유사한 방식으로 aba2 돌연변이에서 관찰한 생장 표현형을 보완할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 9
본 실시예는 LC66C6이 이끼에서 원사체 생장을 약하게 저해할 수 있지만, 단세포 녹조 클라미도모나스(Chlamydomonas)의 생장에 대해 효과가 없다는 것을 나타낸다.
도 17A 및 17B에서 나타낸 바와 같이, LC66C6은 이끼 피스코미트렐라 파텐스의 원사체 생장에 대해 약하지만 유의한 저해를 나타내었다. 파라박틴은 원사체를 표백하였는데, 이는 파라박틴이 이 종에 대해 독성이 있을 수 있다는 것을 시사한다.
도 17C는 LC66C6가 이끼에서 ABA-반응성 유전자의 발현을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 이들 유발 수준은 ABA의 유발수준보다 더 약하였다.
도 17D에서 나타내는 바와 같이, (+)-ABA와 LC66C6은 둘 다 염분 및 삼투 스트레스가 있고, 없는 클라미도모나스의 생장에 대해 효과가 없었다. 또한, 파라박틴은 클라미도모나스를 표백하였는데, 이는 마찬가지로 파라박틴이 이 종에 대해 독성이 있다는 것을 시사한다.
본 실시예는 LC66C6이 원사체 생장을 약하게 저해하고 이끼 피스코미트렐라 파텐스에서 ABA-반응성 유전자 발현을 약하게 유발할 수 있지만, 단세포 조류 클라미도모나스의 생장에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 실시예 및 실시형태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 이것에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시되고, 본 출원의 정신과 범위 및 첨부되는 특허청구범위의 범주 내에 포함된다는 것이 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 서열 등록번호, 특허 및 특허출원은 본 명세서에 그들의 전문이 모든 목적을 위하여 참조로서 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> Synthetic Compounds for Vegetative ABA Responses <130> WO/2013/148339 <140> PCT/US2013/032281 <141> 2013-03-15 <150> US 61/618,386 <151> 2012-03-30 <160> 149 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, Pyrabactin resistance 1, abscisic acid receptor PYR1 (PYR1), ABI1-binding protein 6 (ABIP6), regulatory components of ABA receptor 11 (RCAR11), At4g17870, T6K21.50 <400> 1 Met Pro Ser Glu Leu Thr Pro Glu Glu Arg Ser Glu Leu Lys Asn Ser 1 5 10 15 Ile Ala Glu Phe His Thr Tyr Gln Leu Asp Pro Gly Ser Cys Ser Ser 20 25 30 Leu His Ala Gln Arg Ile His Ala Pro Pro Glu Leu Val Trp Ser Ile 35 40 45 Val Arg Arg Phe Asp Lys Pro Gln Thr Tyr Lys His Phe Ile Lys Ser 50 55 60 Cys Ser Val Glu Gln Asn Phe Glu Met Arg Val Gly Cys Thr Arg Asp 65 70 75 80 Val Ile Val Ile Ser Gly Leu Pro Ala Asn Thr Ser Thr Glu Arg Leu 85 90 95 Asp Ile Leu Asp Asp Glu Arg Arg Val Thr Gly Phe Ser Ile Ile Gly 100 105 110 Gly Glu His Arg Leu Thr Asn Tyr Lys Ser Val Thr Thr Val His Arg 115 120 125 Phe Glu Lys Glu Asn Arg Ile Trp Thr Val Val Leu Glu Ser Tyr Val 130 135 140 Val Asp Met Pro Glu Gly Asn Ser Glu Asp Asp Thr Arg Met Phe Ala 145 150 155 160 Asp Thr Val Val Lys Leu Asn Leu Gln Lys Leu Ala Thr Val Ala Glu 165 170 175 Ala Met Ala Arg Asn Ser Gly Asp Gly Ser Gly Ser Gln Val Thr 180 185 190 <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL1, PYR1-like protein 1 (PYL1), ABI1-binding protein 6 (ABIP6), regulatory components of ABA receptor 9 (RCAR12), At5g46790, MZA15.21 <400> 2 Met Ala Asn Ser Glu Ser Ser Ser Ser Pro Val Asn Glu Glu Glu Asn 1 5 10 15 Ser Gln Arg Ile Ser Thr Leu His His Gln Thr Met Pro Ser Asp Leu 20 25 30 Thr Gln Asp Glu Phe Thr Gln Leu Ser Gln Ser Ile Ala Glu Phe His 35 40 45 Thr Tyr Gln Leu Gly Asn Gly Arg Cys Ser Ser Leu Leu Ala Gln Arg 50 55 60 Ile His Ala Pro Pro Glu Thr Val Trp Ser Val Val Arg Arg Phe Asp 65 70 75 80 Arg Pro Gln Ile Tyr Lys His Phe Ile Lys Ser Cys Asn Val Ser Glu 85 90 95 Asp Phe Glu Met Arg Val Gly Cys Thr Arg Asp Val Asn Val Ile Ser 100 105 110 Gly Leu Pro Ala Asn Thr Ser Arg Glu Arg Leu Asp Leu Leu Asp Asp 115 120 125 Asp Arg Arg Val Thr Gly Phe Ser Ile Thr Gly Gly Glu His Arg Leu 130 135 140 Arg Asn Tyr Lys Ser Val Thr Thr Val His Arg Phe Glu Lys Glu Glu 145 150 155 160 Glu Glu Glu Arg Ile Trp Thr Val Val Leu Glu Ser Tyr Val Val Asp 165 170 175 Val Pro Glu Gly Asn Ser Glu Glu Asp Thr Arg Leu Phe Ala Asp Thr 180 185 190 Val Ile Arg Leu Asn Leu Gln Lys Leu Ala Ser Ile Thr Glu Ala Met 195 200 205 Asn Arg Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Ser Gln Val Arg 210 215 220 <210> 3 <211> 190 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL2, PYR1-like protein 2 (PYL2), ABI1-binding protein 6 (ABIP6), regulatory components of ABA receptor 14 (RCAR14), Bet v I allergen family protein, At2g26040, T19L18.15 <400> 3 Met Ser Ser Ser Pro Ala Val Lys Gly Leu Thr Asp Glu Glu Gln Lys 1 5 10 15 Thr Leu Glu Pro Val Ile Lys Thr Tyr His Gln Phe Glu Pro Asp Pro 20 25 30 Thr Thr Cys Thr Ser Leu Ile Thr Gln Arg Ile His Ala Pro Ala Ser 35 40 45 Val Val Trp Pro Leu Ile Arg Arg Phe Asp Asn Pro Glu Arg Tyr Lys 50 55 60 His Phe Val Lys Arg Cys Arg Leu Ile Ser Gly Asp Gly Asp Val Gly 65 70 75 80 Ser Val Arg Glu Val Thr Val Ile Ser Gly Leu Pro Ala Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Glu Arg Leu Glu Phe Val Asp Asp Asp His Arg Val Leu Ser Phe 100 105 110 Arg Val Val Gly Gly Glu His Arg Leu Lys Asn Tyr Lys Ser Val Thr 115 120 125 Ser Val Asn Glu Phe Leu Asn Gln Asp Ser Gly Lys Val Tyr Thr Val 130 135 140 Val Leu Glu Ser Tyr Thr Val Asp Ile Pro Glu Gly Asn Thr Glu Glu 145 150 155 160 Asp Thr Lys Met Phe Val Asp Thr Val Val Lys Leu Asn Leu Gln Lys 165 170 175 Leu Gly Val Ala Ala Thr Ser Ala Pro Met His Asp Asp Glu 180 185 190 <210> 4 <211> 209 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL3, PYR1-like protein 3 (PYL3), regulatory components of ABA receptor 13 (RCAR13), At1g73000, F3N23.20 <400> 4 Met Asn Leu Ala Pro Ile His Asp Pro Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr 1 5 10 15 Thr Ser Ser Ser Thr Pro Tyr Gly Leu Thr Lys Asp Glu Phe Ser Thr 20 25 30 Leu Asp Ser Ile Ile Arg Thr His His Thr Phe Pro Arg Ser Pro Asn 35 40 45 Thr Cys Thr Ser Leu Ile Ala His Arg Val Asp Ala Pro Ala His Ala 50 55 60 Ile Trp Arg Phe Val Arg Asp Phe Ala Asn Pro Asn Lys Tyr Lys His 65 70 75 80 Phe Ile Lys Ser Cys Thr Ile Arg Val Asn Gly Asn Gly Ile Lys Glu 85 90 95 Ile Lys Val Gly Thr Ile Arg Glu Val Ser Val Val Ser Gly Leu Pro 100 105 110 Ala Ser Thr Ser Val Glu Ile Leu Glu Val Leu Asp Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Ile Leu Ser Phe Arg Val Leu Gly Gly Glu His Arg Leu Asn Asn Tyr 130 135 140 Arg Ser Val Thr Ser Val Asn Glu Phe Val Val Leu Glu Lys Asp Lys 145 150 155 160 Lys Lys Arg Val Tyr Ser Val Val Leu Glu Ser Tyr Ile Val Asp Ile 165 170 175 Pro Gln Gly Asn Thr Glu Glu Asp Thr Arg Met Phe Val Asp Thr Val 180 185 190 Val Lys Ser Asn Leu Gln Asn Leu Ala Val Ile Ser Thr Ala Ser Pro 195 200 205 Thr <210> 5 <211> 207 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL4, PYR1-like protein 4 (PYL4), ABI1-binding protein 2 (ABIP2), regulatory components of ABA receptor 10 (RCAR10), At2g38310, T19C21.20 <400> 5 Met Leu Ala Val His Arg Pro Ser Ser Ala Val Ser Asp Gly Asp Ser 1 5 10 15 Val Gln Ile Pro Met Met Ile Ala Ser Phe Gln Lys Arg Phe Pro Ser 20 25 30 Leu Ser Arg Asp Ser Thr Ala Ala Arg Phe His Thr His Glu Val Gly 35 40 45 Pro Asn Gln Cys Cys Ser Ala Val Ile Gln Glu Ile Ser Ala Pro Ile 50 55 60 Ser Thr Val Trp Ser Val Val Arg Arg Phe Asp Asn Pro Gln Ala Tyr 65 70 75 80 Lys His Phe Leu Lys Ser Cys Ser Val Ile Gly Gly Asp Gly Asp Asn 85 90 95 Val Gly Ser Leu Arg Gln Val His Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Ala 100 105 110 Ser Ser Thr Glu Arg Leu Asp Ile Leu Asp Asp Glu Arg His Val Ile 115 120 125 Ser Phe Ser Val Val Gly Gly Asp His Arg Leu Ser Asn Tyr Arg Ser 130 135 140 Val Thr Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Ser Gly Thr Val Val Val Glu 145 150 155 160 Ser Tyr Val Val Asp Val Pro Pro Gly Asn Thr Lys Glu Glu Thr Cys 165 170 175 Asp Phe Val Asp Val Ile Val Arg Cys Asn Leu Gln Ser Leu Ala Lys 180 185 190 Ile Ala Glu Asn Thr Ala Ala Glu Ser Lys Lys Lys Met Ser Leu 195 200 205 <210> 6 <211> 203 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL5, PYR1-like protein 5 (PYL5), ABI1-binding protein 3 (ABIP3), regulatory components of ABA receptor 8 (RCAR8), Bet v I allergen family protein, At5g05440, K18I23.25 <400> 6 Met Arg Ser Pro Val Gln Leu Gln His Gly Ser Asp Ala Thr Asn Gly 1 5 10 15 Phe His Thr Leu Gln Pro His Asp Gln Thr Asp Gly Pro Ile Lys Arg 20 25 30 Val Cys Leu Thr Arg Gly Met His Val Pro Glu His Val Ala Met His 35 40 45 His Thr His Asp Val Gly Pro Asp Gln Cys Cys Ser Ser Val Val Gln 50 55 60 Met Ile His Ala Pro Pro Glu Ser Val Trp Ala Leu Val Arg Arg Phe 65 70 75 80 Asp Asn Pro Lys Val Tyr Lys Asn Phe Ile Arg Gln Cys Arg Ile Val 85 90 95 Gln Gly Asp Gly Leu His Val Gly Asp Leu Arg Glu Val Met Val Val 100 105 110 Ser Gly Leu Pro Ala Val Ser Ser Thr Glu Arg Leu Glu Ile Leu Asp 115 120 125 Glu Glu Arg His Val Ile Ser Phe Ser Val Val Gly Gly Asp His Arg 130 135 140 Leu Lys Asn Tyr Arg Ser Val Thr Thr Leu His Ala Ser Asp Asp Glu 145 150 155 160 Gly Thr Val Val Val Glu Ser Tyr Ile Val Asp Val Pro Pro Gly Asn 165 170 175 Thr Glu Glu Glu Thr Leu Ser Phe Val Asp Thr Ile Val Arg Cys Asn 180 185 190 Leu Gln Ser Leu Ala Arg Ser Thr Asn Arg Gln 195 200 <210> 7 <211> 215 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL6, PYR1-like protein 6 (PYL6), ABI1-binding protein 5 (ABIP5), regulatory components of ABA receptor 9 (RCAR9), Bet v I allergen family protein, At2g40330, T7M7.15 <400> 7 Met Pro Thr Ser Ile Gln Phe Gln Arg Ser Ser Thr Ala Ala Glu Ala 1 5 10 15 Ala Asn Ala Thr Val Arg Asn Tyr Pro His His His Gln Lys Gln Val 20 25 30 Gln Lys Val Ser Leu Thr Arg Gly Met Ala Asp Val Pro Glu His Val 35 40 45 Glu Leu Ser His Thr His Val Val Gly Pro Ser Gln Cys Phe Ser Val 50 55 60 Val Val Gln Asp Val Glu Ala Pro Val Ser Thr Val Trp Ser Ile Leu 65 70 75 80 Ser Arg Phe Glu His Pro Gln Ala Tyr Lys His Phe Val Lys Ser Cys 85 90 95 His Val Val Ile Gly Asp Gly Arg Glu Val Gly Ser Val Arg Glu Val 100 105 110 Arg Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Ala Phe Ser Leu Glu Arg Leu Glu 115 120 125 Ile Met Asp Asp Asp Arg His Val Ile Ser Phe Ser Val Val Gly Gly 130 135 140 Asp His Arg Leu Met Asn Tyr Lys Ser Val Thr Thr Val His Glu Ser 145 150 155 160 Glu Glu Asp Ser Asp Gly Lys Lys Arg Thr Arg Val Val Glu Ser Tyr 165 170 175 Val Val Asp Val Pro Ala Gly Asn Asp Lys Glu Glu Thr Cys Ser Phe 180 185 190 Ala Asp Thr Ile Val Arg Cys Asn Leu Gln Ser Leu Ala Lys Leu Ala 195 200 205 Glu Asn Thr Ser Lys Phe Ser 210 215 <210> 8 <211> 211 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL7, PYR1-like protein 7 (PYL7), ABI1-binding protein 7 (ABIP7), regulatory components of ABA receptor 2 (RCAR2), At4g01026 <400> 8 Met Glu Met Ile Gly Gly Asp Asp Thr Asp Thr Glu Met Tyr Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Thr Ala Gln Ser Leu Arg Leu Arg His Leu His His Cys Arg 20 25 30 Glu Asn Gln Cys Thr Ser Val Leu Val Lys Tyr Ile Gln Ala Pro Val 35 40 45 His Leu Val Trp Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr 50 55 60 Lys Pro Phe Ile Ser Arg Cys Thr Val Asn Gly Asp Pro Glu Ile Gly 65 70 75 80 Cys Leu Arg Glu Val Asn Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser 85 90 95 Thr Glu Arg Leu Glu Gln Leu Asp Asp Glu Glu His Ile Leu Gly Ile 100 105 110 Asn Ile Ile Gly Gly Asp His Arg Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Ile Leu 115 120 125 Thr Val His Pro Glu Met Ile Asp Gly Arg Ser Gly Thr Met Val Met 130 135 140 Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro Gln Gly Asn Thr Lys Asp Asp Thr 145 150 155 160 Cys Tyr Phe Val Glu Ser Leu Ile Lys Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala 165 170 175 Cys Val Ser Glu Arg Leu Ala Ala Gln Asp Ile Thr Asn Ser Ile Ala 180 185 190 Thr Phe Cys Asn Ala Ser Asn Gly Tyr Arg Glu Lys Asn His Thr Glu 195 200 205 Thr Asn Leu 210 <210> 9 <211> 188 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL8, PYR1-like protein 8 (PYL8), ABI1-binding protein 1 (ABIP1), regulatory components of ABA receptor 3 (RCAR3), At5g53160, MFH8.10 <400> 9 Met Glu Ala Asn Gly Ile Glu Asn Leu Thr Asn Pro Asn Gln Glu Arg 1 5 10 15 Glu Phe Ile Arg Arg His His Lys His Glu Leu Val Asp Asn Gln Cys 20 25 30 Ser Ser Thr Leu Val Lys His Ile Asn Ala Pro Val His Ile Val Trp 35 40 45 Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Cys Val Val Lys Gly Asn Met Glu Ile Gly Thr Val Arg Glu 65 70 75 80 Val Asp Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Arg Ser Thr Glu Arg Leu 85 90 95 Glu Leu Leu Asp Asp Asn Glu His Ile Leu Ser Ile Arg Ile Val Gly 100 105 110 Gly Asp His Arg Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Ile Ile Ser Leu His Pro 115 120 125 Glu Thr Ile Glu Gly Arg Ile Gly Thr Leu Val Ile Glu Ser Phe Val 130 135 140 Val Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Lys Asp Glu Thr Cys Tyr Phe Val 145 150 155 160 Glu Ala Leu Ile Lys Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala Asp Ile Ser Glu 165 170 175 Arg Leu Ala Val Gln Asp Thr Thr Glu Ser Arg Val 180 185 <210> 10 <211> 187 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <223> thale cress PYR/PYL receptor, abscisic acid receptor PYL9, PYR1-like protein 9 (PYL9), ABI1-binding protein 4 (ABIP4), regulatory components of ABA receptor 1 (RCAR1), At1g01360, F6F3.16 <400> 10 Met Met Asp Gly Val Glu Gly Gly Thr Ala Met Tyr Gly Gly Leu Glu 1 5 10 15 Thr Val Gln Tyr Val Arg Thr His His Gln His Leu Cys Arg Glu Asn 20 25 30 Gln Cys Thr Ser Ala Leu Val Lys His Ile Lys Ala Pro Leu His Leu 35 40 45 Val Trp Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro 50 55 60 Phe Val Ser Arg Cys Thr Val Ile Gly Asp Pro Glu Ile Gly Ser Leu 65 70 75 80 Arg Glu Val Asn Val Lys Ser Gly 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sativa <220> <223> rice Japonica Group, cultivar Nipponbare, conserved hypothetical protein Os10g0573400, GenBank Accession No. NP_00106570.1 <400> 20 Met Glu Gln Gln Glu Glu Val Pro Pro Pro Pro Ala Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 Thr Ala Glu Glu Tyr Ala Gln Val Arg Ala Thr Val Glu Ala His His 20 25 30 Arg Tyr Ala Val Gly Pro Gly Gln Cys Ser Ser Leu Leu Ala Gln Arg 35 40 45 Ile His Ala Pro Pro Ala Ala Val Trp Ala Val Val Arg Arg Phe Asp 50 55 60 Cys Pro Gln Val Tyr Lys His Phe Ile Arg Ser Cys Val Leu Arg Pro 65 70 75 80 Asp Pro His His Asp Asp Asn Gly Asn Asp Leu Arg Pro Gly Arg Leu 85 90 95 Arg Glu Val Ser Val Ile Ser Gly Leu Pro Ala Ser Thr Ser Thr Glu 100 105 110 Arg Leu Asp Leu Leu Asp Asp Ala His Arg Val Phe Gly Phe Thr Ile 115 120 125 Thr Gly Gly Glu His Arg Leu Arg Asn Tyr Arg Ser Val Thr Thr Val 130 135 140 Ser Gln Leu Asp Glu Ile Cys Thr Leu Val Leu Glu Ser Tyr Ile Val 145 150 155 160 Asp Val Pro Asp Gly Asn Thr Glu Asp Asp Thr Arg Leu Phe Ala Asp 165 170 175 Thr Val Ile Arg Leu Asn 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moss, ecotype Gransden 2004, hypothetical protein, predicted protein, locus tag PHYPADRAFT_222359, GenBank Accession No. XP_001778048.1 <400> 36 Met Gln Thr Lys Gly Arg Gln Ala Asp Phe Gln Thr Leu Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Gln Asp Leu Ile Cys Arg Phe His Arg His Glu Leu Gln Pro His 20 25 30 Gln Cys Gly Ser Ile Leu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Pro Val Glu Thr 35 40 45 Val Trp Ser Val Ala Arg Ser Phe Asp Lys Pro Gln Val Tyr Lys Arg 50 55 60 Phe Ile Gln Thr Cys Glu Ile Ile Glu Gly Asp Gly Gly Val Gly Ser 65 70 75 80 Ile Arg Glu Val Arg Leu Val Ser Ser Ile Pro Ala Thr Ser Ser Ile 85 90 95 Glu Arg Leu Glu Ile Leu Asp Asp Glu Glu His Ile Ile Ser Phe Arg 100 105 110 Val Leu Gly Gly Gly His Arg Leu Gln Asn Tyr Trp Ser Val Thr Ser 115 120 125 Leu His Ser His Glu Ile Asp Gly Gln Met Gly Thr Leu Val Leu Glu 130 135 140 Ser Tyr Val Val Asp Ile Pro Glu Gly Asn Thr Arg Glu Glu Thr His 145 150 155 160 Met Phe Val Asp Thr Val Val Arg Cys Asn Leu Lys Ala Leu Ala Gln 165 170 175 Val Ser Glu <210> 37 <211> 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<222> (1)...(443) <223> Xaa = any amino acid <400> 86 Met Pro Ser Ala Xaa Lys Ser Ser Thr Val Pro Leu Ser Leu Xaa Gln 1 5 10 15 Phe Lys Leu Gly Leu Arg His Gly His Arg Val Ile Pro Trp Gly Asp 20 25 30 Leu Asp Ser Leu Ala Met Leu Gln Arg Gln Leu Asp Val Asp Ile Leu 35 40 45 Val Thr Gly His Thr His Arg Phe Thr Ala Tyr Lys His Glu Gly Gly 50 55 60 Val Val Ile Asn Pro Gly Ser Ala Thr Gly Ala Phe Gly Ser Ile Thr 65 70 75 80 Tyr Asp Val Asn Pro Ser Phe Val Leu Met Asp Ile Asp Gly Leu Arg 85 90 95 Val Val Val Cys Val Tyr Glu Leu Ile Asp Glu Thr Ala Asn Ile Ile 100 105 110 Lys Glu Leu His Ala Arg Lys Ile Ser Phe Gly Thr Lys Ser Met Ile 115 120 125 Xaa Cys Leu Leu Leu Lys Arg Arg Ser Thr Pro Lys Phe Arg Arg Lys 130 135 140 Lys Leu Phe Leu Phe Gln Cys Arg Val Gln Met Thr Leu Thr Leu Thr 145 150 155 160 Asn Leu Ala Val Ser Gly Ile Ala Gln Thr Leu Gln Val Asp Gln Trp 165 170 175 Thr Val Cys Ala Leu Ile Phe Met Thr Arg Arg Asp Ile His Leu Asp 180 185 190 Lys Ala Arg Phe Leu Asp Phe Lys Asp Met Gly 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165 <210> 107 <211> 210 <212> PRT <213> Glycine max <220> <223> soybean Glyma14g10730.1 protein <400> 107 Met Thr Ile Leu Pro His Ser Asn Asn Lys Ser Ser Asn His Lys Phe 1 5 10 15 Ile Ala His Gln Asn Tyr Met Ala Ser Glu Thr His His His Val Gln 20 25 30 Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Thr Lys Leu Glu Pro Ile Ile Lys Lys 35 40 45 Tyr His Leu Phe Glu Gln Ser Pro Asn Thr Cys Phe Ser Ile Ile Thr 50 55 60 Tyr Arg Ile Glu Ala Pro Ala Lys Ala Val Trp Pro Phe Val Arg Ser 65 70 75 80 Phe Asp Asn Pro Gln Lys Tyr Lys His Phe Ile Lys Gly Cys Asn Met 85 90 95 Arg Gly Asp Gly Gly Val Gly Ser Ile Arg Glu Val Thr Val Val Ser 100 105 110 Gly Leu Pro Ala Ser Thr Ser Thr Glu Arg Leu Glu Ile Leu Asp Asp 115 120 125 Asp Lys His Val Leu Ser Phe Arg Val Val Gly Gly Glu His Arg Leu 130 135 140 Lys Asn Tyr Arg Ser Val Thr Ser Val Asn Glu Phe Asn Lys Glu Gly 145 150 155 160 Lys Val Tyr Thr Ile Val Leu Glu Ser Tyr Ile Val Asp Ile Pro Glu 165 170 175 Gly Asn Thr Glu Glu Asp Thr Lys Met Phe Val Asp Thr Val Val Lys 180 185 190 Leu Asn Leu Gln Lys Leu Gly Val Val Ala Met Ala Ser Ser Met His 195 200 205 Gly Gln 210 <210> 108 <211> 193 <212> PRT <213> Glycine max <220> <223> soybean Glyma14g30260.1 protein <400> 108 Met Asn Arg Ile Gly Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ser Asn 1 5 10 15 Val Glu Met Glu Tyr Ile Arg Arg His His Arg His Glu Pro Gly Glu 20 25 30 Asn Gln Cys Gly Ser Ala Leu Val Lys His Ile Arg Ala Pro Val Pro 35 40 45 Gln Val Trp Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys 50 55 60 Pro Phe Ile Ser Arg Cys Val Val Arg Gly Asn Leu Glu Ile Gly Ser 65 70 75 80 Leu Arg Glu Val Asp Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser Thr 85 90 95 Glu Arg Leu Glu Leu Leu Asp Asp Asn Glu His Ile Leu Ser Ile Arg 100 105 110 Ile Ile Gly Gly Asp His Arg Leu Arg Asn Tyr Ser Ser Ile Met Ser 115 120 125 Leu His Pro Glu Ile Ile Asp Gly Arg Pro Gly Thr Leu Val Ile Glu 130 135 140 Ser Phe Val Val Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Lys Asp Glu Thr Cys 145 150 155 160 Tyr Phe Val Glu Ala Leu Ile Lys Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala Asp 165 170 175 Val Ser Glu Gly Leu Ala Val Gln Asp Cys Thr Glu Pro Ile Asp Arg 180 185 190 Ile <210> 109 <211> 188 <212> PRT <213> Glycine max <220> <223> soybean Glyma17g34800.1 protein <400> 109 Met Ala Ser Glu Thr His His His Val Gln Gly Leu Thr Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Thr Gln Leu Glu Pro Ile Ile Lys Lys Tyr His Leu Phe Glu Ala 20 25 30 Ser Ser Asn Lys Cys Phe Ser Ile Ile Thr His Arg Ile Glu Ala Pro 35 40 45 Ala Ser Ser Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Phe Asp Asn Pro Gln Lys 50 55 60 Tyr Lys His Phe Ile Lys Gly Cys Asn Met Lys Gly Asp Gly Ser Val 65 70 75 80 Gly Ser Ile Arg Glu Val Thr Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Ser Thr Glu Arg Leu Glu Ile Leu Asp Asp Asp Lys His Val Leu Ser 100 105 110 Phe Arg Val Val Gly Gly Glu His Arg Leu Gln Asn Tyr Arg Ser Val 115 120 125 Thr Ser Val Asn Glu Phe His Lys Glu Gly Lys Val Tyr Thr Ile Val 130 135 140 Leu Glu Ser Tyr Ile Val Asp Ile Pro Glu Gly Asn Thr Glu Glu Asp 145 150 155 160 Thr Lys Met Phe Val Asp Thr Val Val Lys Leu Asn Leu Gln Lys Leu 165 170 175 Gly Val Val Ala Met Ala Ser Ser Met Asn Gly Arg 180 185 <210> 110 <211> 177 <212> PRT <213> Glycine max <220> <223> soybean Glyma18g43680.1 protein <400> 110 Met Leu Pro Asn Asn Pro Ser Thr Ile Val Pro Asp Ala Val Ala Arg 1 5 10 15 His His Thr His Val Val Ser Pro Gln Gln Cys Cys Ser Ala Val Val 20 25 30 Gln Glu Ile Ala Ala Pro Val Ser Thr Val Trp Ser Val Val Arg Arg 35 40 45 Phe Asp Asn Pro Gln Ala Tyr Lys His Phe Val Lys Ser Cys His Val 50 55 60 Ile Leu Gly Asp Gly Asp Val Gly Thr Leu Arg Glu Val His Val Ile 65 70 75 80 Ser Gly Leu Pro Ala Ala Val Ser Thr Glu Arg Leu Asp Val Leu Asp 85 90 95 Asp Glu Arg His Val Ile Gly Phe Ser Met Val Gly Gly Asp His Arg 100 105 110 Leu Phe Asn Tyr Arg Ser Val Thr Thr Leu His Pro Arg Ser Ala Ala 115 120 125 Gly Thr Val Val Val Glu Ser Tyr Val Val Asp Val Pro Pro Gly Asn 130 135 140 Thr Thr Glu Asp Thr Arg Val Phe Val Asp Thr Ile Leu Arg Cys Asn 145 150 155 160 Leu Gln Ser Leu Ala Lys Phe Ala Glu Asn Leu Thr Lys Leu His Gln 165 170 175 Arg <210> 111 <211> 185 <212> PRT <213> Glycine max <220> <223> soybean Glyma07g06270.2 protein <400> 111 Met Asn Gly Gly Glu Ser Tyr Gly Ala Ile Glu Thr Gln Tyr Ile Arg 1 5 10 15 Arg His His Lys His Glu Pro Arg Glu Asn Gln Cys Thr Ser Ala Leu 20 25 30 Val Lys His Ile Arg Ala Pro Val His Leu Val Trp Ser Leu Val Arg 35 40 45 Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro Phe Val Ser Arg Cys Ile 50 55 60 Met Gln Gly Asp Leu Gly Ile Gly Ser Val Arg Glu Val Asn Val Lys 65 70 75 80 Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser Thr Glu Arg Leu Glu Gln Leu Asp 85 90 95 Asp Glu Glu His Ile Leu Gly Ile Arg Ile Val Gly Gly Asp His Arg 100 105 110 Leu Arg Asn Tyr Ser Ser Ile Ile Thr Val His Pro Glu Val Ile Asp 115 120 125 Gly Arg Pro Gly Thr Met Val Ile Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro 130 135 140 Asp Gly Asn Thr Arg Asp Glu Thr Cys Tyr Phe Val Glu Ala Leu Ile 145 150 155 160 Arg Cys Asn Leu Ser Ser Leu Ala Asp Val Ser Glu Arg Met Ala Val 165 170 175 Gln Gly Arg Thr Asn Pro Ile Asn His 180 185 <210> 112 <211> 191 <212> PRT <213> Glycine max <220> <223> soybean Glyma16g02910.1 protein <400> 112 Met Gly Ile Thr Ile Gly Ile Gln Cys Leu Glu Ile Glu Glu Ile Ser 1 5 10 15 Ile Cys Asp Gly Met Phe Cys Tyr Leu Val Asp Phe Val Asp Val Lys 20 25 30 Glu Lys Met Asn Tyr Cys Leu Met Trp Phe Gly Tyr Phe Pro Ser Gln 35 40 45 Val Trp Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro 50 55 60 Phe Val Ser Arg Cys Ile Met Gln Gly Asp Leu Gly Ile Gly Ser Val 65 70 75 80 Arg Glu Val Asn Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser Thr Glu 85 90 95 Arg Leu Glu Gln Leu Asp Asp Glu Glu His Ile Leu Gly Ile Arg Ile 100 105 110 Val Gly Gly Asp His Arg Leu Arg Asn Tyr Ser Ser Ile Ile Thr Val 115 120 125 His Pro Glu Val Ile Asp Gly Arg Pro Ser Thr Met Val Ile Glu Ser 130 135 140 Phe Val Val Asp Val Pro Asp Gly Asn Thr Arg Asp Glu Thr Cys Tyr 145 150 155 160 Phe Val Glu Ala Leu Ile Arg Cys Asn Leu Ser Ser Leu Ala Asp Val 165 170 175 Ser Glu Arg Met Ala Val Gln Gly Arg Thr Asp Pro Ile Asn His 180 185 190 <210> 113 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic PYR/PYL receptor protein <400> 113 Met Asn Gly Gly Glu Ser Tyr Gly Ala Ile Glu Thr Gln Tyr Ile Arg 1 5 10 15 Arg His His Lys His Glu Pro Arg Glu Asn Gln Cys Thr Ser Ala Leu 20 25 30 Val Lys His Ile Arg Ala Pro Val His Leu Val Trp Ser Leu Val Arg 35 40 45 Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys Pro Phe Val Ser Arg Cys Ile 50 55 60 Met Gln Gly Asp Leu Gly Ile Gly Ser Val Arg Glu Val Asn Val Lys 65 70 75 80 Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser Thr Glu Arg Leu Glu Gln Leu Asp 85 90 95 Asp Glu Glu His Ile Leu Gly Ile Arg Ile Val Gly Gly Asp His Arg 100 105 110 Leu Arg Asn Tyr Ser Ser Ile Ile Thr Val His Pro Glu Val Ile Asp 115 120 125 Gly Arg Pro Ser Thr Met Val Ile Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro 130 135 140 Asp Gly Asn Thr Arg Asp Glu Thr Cys Tyr Phe Val Glu Ala Leu Ile 145 150 155 160 Arg Cys Asn Leu Ser Ser Leu Ala Asp Val Ser Glu Arg Met Ala Val 165 170 175 Gln Gly Arg Thr Asp Pro Ile Asn His 180 185 <210> 114 <211> 204 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb10g022200 protein <400> 114 Met Glu Thr His Val Glu Arg Ala Leu Arg Ala Thr Leu Thr Glu Ala 1 5 10 15 Glu Val Arg Ala Leu Glu Pro Ala Val Arg Glu His His Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Gly Arg Val Ala Ala Gly Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Thr Cys 35 40 45 Thr Ser Leu Val Ala Gln Arg Val Ser Ala Pro Val Arg Ala Val Trp 50 55 60 Pro Ile Val Arg Ser Phe Gly Asn Pro Gln Arg Tyr Lys His Phe Val 65 70 75 80 Arg Thr Cys Ala Leu Ala Ala Gly Asp Gly Ala Ser Val Gly Ser Val 85 90 95 Arg Glu Val Thr Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Ser Ser Ser Thr Glu 100 105 110 Arg Leu Glu Val Leu Asp Asp Asp Arg His Ile Leu Ser Phe Arg Val 115 120 125 Val Gly Gly Asp His Arg Leu Arg Asn Tyr Arg Ser Val Thr Ser Val 130 135 140 Thr Glu Phe Gln Pro Gly Pro Tyr Cys Val Val Val Glu Ser Tyr Ala 145 150 155 160 Val Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Ala Glu Asp Thr Arg Met Phe Thr 165 170 175 Asp Thr Val Val Arg Leu Asn Leu Gln Lys Leu Ala Ala Val Ala Glu 180 185 190 Glu Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asn Arg Arg 195 200 <210> 115 <211> 204 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb04g008040 protein <400> 115 Met Glu Pro His Met Glu Thr Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Ser Glu 1 5 10 15 Leu Glu Gln Arg Glu Leu Glu Pro Val Val Arg Ala His His Thr Phe 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Pro Gly Thr Thr Cys Thr Ser Leu Val Thr Gln Arg 35 40 45 Val Asp Ala Pro Leu Ser Ala Val Trp Pro Ile Val Arg Gly Phe Ala 50 55 60 Ala Pro Gln Arg Tyr Lys His Phe Ile Lys Ser Cys Asp Leu Arg Ser 65 70 75 80 Gly Asp Gly Ala Thr Val Gly Ser Val Arg Glu Val Thr Val Val Ser 85 90 95 Gly Leu Pro Ala Ser Thr Ser Thr Glu Arg Leu Glu Ile Leu Asp Asp 100 105 110 Asp Arg His Ile Leu Ser Phe Arg Val Val Gly Gly Asp His Arg Leu 115 120 125 Arg Asn Tyr Arg Ser Val Thr Ser Val Thr Glu Phe His His His His 130 135 140 Gln Ala Ala Ala Gly Arg Pro Tyr Cys Val Val Val Glu Ser Tyr Val 145 150 155 160 Val Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Glu Glu Asp Thr Arg Met Phe Thr 165 170 175 Asp Thr Val Val Lys Leu Asn Leu Gln Lys Leu Ala Ala Ile Ala Thr 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ser Asn Ser Ser Thr 195 200 <210> 116 <211> 258 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb01g028330 protein <400> 116 Met Val Glu Ser Pro Asn Pro Asn Ser Pro Ser Arg Pro Leu Cys Ile 1 5 10 15 Lys Tyr Thr Arg Ala Pro Ala Arg His Phe Ser Pro Pro Leu Pro Phe 20 25 30 Ser Ser Leu Ile Ile Ser Ala Asn Pro Ile Glu Pro Lys Ala Met Asp 35 40 45 Lys Gln Gly Ala Gly Gly Asp Val Glu Val Pro Ala Gly Leu Gly Leu 50 55 60 Thr Ala Ala Glu Tyr Glu Gln Leu Arg Ser Thr Val Asp Ala His His 65 70 75 80 Arg Tyr Ala Val Gly Glu Gly Gln Cys Ser Ser Leu Leu Ala Gln Arg 85 90 95 Ile Gln Ala Pro Pro Ala Ala Val Trp Ala Ile Val Arg Arg Phe Asp 100 105 110 Cys Pro Gln Val Tyr Lys His Phe Ile Arg Ser Cys Ala Leu Arg Pro 115 120 125 Asp Pro Glu Ala Gly Asp Ala Leu Arg Pro Gly Arg Leu Arg Glu Val 130 135 140 Ser Val Ile Ser Gly Leu Pro Ala Ser Thr Ser Thr Glu Arg Leu Asp 145 150 155 160 Leu Leu Asp Asp Ala Ala Arg Val Phe Gly Phe Ser Ile Thr Gly Gly 165 170 175 Glu His Arg Leu Arg Asn Tyr Arg Ser Val Thr Thr Val Ser Glu Leu 180 185 190 Ala Asp Pro Gly Ile Cys Thr Val Val Leu Glu Ser Tyr Val Val Asp 195 200 205 Val Pro Asp Gly Asn Thr Glu Asp Asp Thr Arg Leu Phe Ala Asp Thr 210 215 220 Val Ile Arg Leu Asn Leu Gln Lys Leu Lys Ser Val Ala Glu Ala Asn 225 230 235 240 Ala Ala Ala Ala Ala Ser Phe Val Ser Val Val Pro Pro Pro Glu Pro 245 250 255 Glu Glu <210> 117 <211> 222 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb01g038150 protein <400> 117 Met Pro Cys Leu Gln Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Met Pro His Gln 1 5 10 15 His His Gly Arg Val Leu Ala Gly Val Gly Cys Ala Ala Glu Val Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Val Ala Ala Thr Ser Pro Ala Ala Gly Met Arg Cys Gly 35 40 45 Ala His Asp Gly Glu Val Pro Ala Glu Ala Ala Arg His His Glu His 50 55 60 Ala Ala Pro Gly Pro Gly Arg Cys Cys Ser Ala Val Val Gln His Val 65 70 75 80 Ala Ala Pro Ala Ser Ala Val Trp Ser Val Val Arg Arg Phe Asp Gln 85 90 95 Pro Gln Ala Tyr Lys Arg Phe Val Arg Ser Cys Ala Leu Leu Ala Gly 100 105 110 Asp Gly Gly Val Gly Thr Leu Arg Glu Val Arg Val Val Ser Gly Leu 115 120 125 Pro Ala Ala Ser Ser Arg Glu Arg Leu Glu Val Leu Asp Asp Glu Ser 130 135 140 His Val Leu Ser Phe Arg Val Val Gly Gly Glu His Arg Leu Gln Asn 145 150 155 160 Tyr Leu Ser Val Thr Thr Val His Pro Ser Pro Ala Ala Pro Asp Ala 165 170 175 Ala Thr Val Val Val Glu Ser Tyr Val Val Asp Val Pro Pro Gly Asn 180 185 190 Thr Pro Glu Asp Thr Arg Val Phe Val Asp Thr Ile Val Lys Cys Asn 195 200 205 Leu Gln Ser Leu Ala Thr Thr Ala Glu Lys Leu Ala Ala Val 210 215 220 <210> 118 <211> 211 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb04g009280 protein <400> 118 Met Val Glu Met Asp Gly Gly Val Gly Val Val Gly Gly Gly Gln Gln 1 5 10 15 Thr Pro Ala Pro Arg Arg Trp Arg Leu Ala Asp Glu Leu Arg Cys Asp 20 25 30 Leu Arg Ala Met Glu Thr Asp Tyr Val Arg Arg Phe His Arg His Glu 35 40 45 Pro Arg Asp His Gln Cys Ser Ser Ala Val Ala Lys His Ile Lys Ala 50 55 60 Pro Val His Leu Val Trp Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln 65 70 75 80 Leu Phe Lys Pro Phe Val Ser Arg Cys Glu Met Lys Gly Asn Ile Glu 85 90 95 Ile Gly Ser Val Arg Glu Val Asn Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr 100 105 110 Arg Ser Thr Glu Arg Leu Glu Leu Leu Asp Asp Asn Glu His Ile Leu 115 120 125 Ser Val Lys Phe Val Gly Gly Asp His Arg Leu Gln Asn Tyr Ser Ser 130 135 140 Ile Leu Thr Val His Pro Glu Val Ile Asp Gly Arg Pro Gly Thr Leu 145 150 155 160 Val Ile Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro Asp Gly Asn Thr Lys Asp 165 170 175 Glu Thr Cys Tyr Phe Val Glu Ala Leu Leu Lys Cys Asn Leu Lys Ser 180 185 190 Leu Ala Glu Val Ser Glu Arg Gln Val Ile Lys Asp Gln Thr Glu Pro 195 200 205 Leu Asp Arg 210 <210> 119 <211> 216 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <220> <223> sorghum Sb09g023180 protein <400> 119 Met Pro Tyr Thr Ala Pro Arg Pro Ser Pro Gln Gln His Ser Arg Val 1 5 10 15 Thr Gly Gly Gly Ala Lys Ala Ala Ile Val Ala Ala Ser His Gly Ala 20 25 30 Ser Cys Ala Ala Val Pro Ala Glu Val Ala Arg His His Glu His Ala 35 40 45 Ala Arg Ala Gly Gln Cys Cys Ser Ala Val Val Gln Ala Ile Ala Ala 50 55 60 Pro Val Gly Ala Val Trp Ser Val Val Arg Arg Phe Asp Arg Pro Gln 65 70 75 80 Ala Tyr Lys His Phe Ile Arg Ser Cys Arg Leu Val Asp Asp Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Thr Val Ala Val Gly Ser Val 100 105 110 Arg Glu Val Arg Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Thr Ser Ser Arg Glu 115 120 125 Arg Leu Glu Ile Leu Asp Asp Glu Arg Arg Val Leu Ser Phe Arg Val 130 135 140 Val Gly Gly Glu His Arg Leu Ala Asn Tyr Arg Ser Val Thr Thr Val 145 150 155 160 His Glu Ala Glu Ala Gly Ala Gly Gly Thr Val Val Val Glu Ser Tyr 165 170 175 Val Val Asp Val Pro Pro Gly Asn Thr Ala Asp Glu Thr Arg Val Phe 180 185 190 Val Asp Thr Ile Val Arg Cys Asn Leu Gln Ser Leu Ala Arg Thr Ala 195 200 205 Glu Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala 210 215 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for Arabidopsis AT1G05100 MAPKKK18 <400> 120 aagcggcgcg tggagagaga 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for Arabidopsis AT1G05100 MAPKKK18 <400> 121 gctgtccatc tctccgtcgc 20 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for Arabidopsis AT5G52310 RD29A <400> 122 tgaagtgatc gatgcaccag g 21 <210> 123 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for Arabidopsis AT5G52310 RD29A <400> 123 gacacgacag gaaacacctt tg 22 <210> 124 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for Arabidopsis AT5G52300 RD29B <400> 124 tatgaatcct ctgccgtgag aggtg 25 <210> 125 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for Arabidopsis AT5G52300 RD29B <400> 125 acaccactga gataatccga tcct 24 <210> 126 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for Arabidopsis AT4G34000 ABF3F <400> 126 gttgatggtg tgagtgagca gc 22 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for Arabidopsis AT4G34000 ABF3F <400> 127 aacccattac tagctgtccc aag 23 <210> 128 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for Arabidopsis AT2G46270 GBF3 <400> 128 gacgcttttg agcatcgaca ct 22 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for Arabidopsis AT2G46270 GBF3 <400> 129 actgtttcct tcgctcccgt ttc 23 <210> 130 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for Arabidopsis internal control ACT2 <400> 130 ctcatgaaga tccttacag 19 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for Arabidopsis internal control ACT2 <400> 131 ctttcaggtg gtgcaacgac 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for soybean GmNAC4 <400> 132 acgtcagttc cgcaaaagat 20 <210> 133 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for soybean GmNAC4 <400> 133 ggacccgttg gtttctcac 19 <210> 134 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for soybean GmbZIP1 <400> 134 gggaatggga atttgggtga gaa 23 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for soybean GmbZIP1 <400> 135 ccttctgcca gggctagcat g 21 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for soybean internal control Gm18S <400> 136 cctgcggctt aatttgactc aac 23 <210> 137 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for soybean internal control Gm18S <400> 137 taagaacggc catgcacca 19 <210> 138 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for barley HVA1 <400> 138 aacacgctgg gcatgggag 19 <210> 139 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for barley HVA1 <400> 139 cgaacgacca aacacgacta aa 22 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for barley HvDRF1 <400> 140 cgggcggcgc gattgcgagc 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for barley HvDRF1 <400> 141 acggaattag ggccatcacg 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for barley internal control Hvtubulin2 <400> 142 tccatgatgg ccaagtgtga 20 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for barley internal control Hvtubulin2 <400> 143 gacatcccca cggtacatga g 21 <210> 144 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for maize ZmLEA <400> 144 gcagcaggca ggggagaa 18 <210> 145 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for maize ZmLEA <400> 145 gccgagcgag ttcatcatc 19 <210> 146 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for maize ZmRAB17 <400> 146 atgagtacgg tcagcagggg cag 23 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for maize ZmRAB17 <400> 147 ctccctcgca ggctggaact g 21 <210> 148 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR forward primer for maize internal control ZmUbi <400> 148 tgccgatgtg cctgcgtcgt ctggtgc 27 <210> 149 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic quantitative RT-PCR reverse primer for maize internal control ZmUbi <400> 149 tgaaagacag aacataatga gcacag 26

Claims (29)

  1. 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함하는 농업용 제형:
    [화학식 I]
    Figure 112019061161111-pct00010

    상기 식에서,
    R1은 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R2는 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되며, 각각은 1 내지 4개의 R2a 기로 선택적으로 치환되고,
    각각의 R2a는 H, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 할로알콕시, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, -OH, C1-6 알킬하이드록시, -CN, -NO2, -C(O)R2b, -C(O)OR2b, -OC(O)R2b, -C(O)NR2bR2c, -NR2bC(O)R2c, -SO2R2b, -SO2OR2b, -SO2NR2bR2c 및 -NR2bSO2R2c로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며,
    각각의 R2b 및 R2c는 H 및 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    각각의 R3, R4 및 R5는 H 및 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며,
    L은 결합 및 C1-6 알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이고,
    아래첨자 m은 0 내지 4의 정수이며,
    아래첨자 n은 0 내지 3의 정수이고,
    -N(R5)SO2LR2 술폰아미드는 6번 위치에 있다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식을 갖는 것인 농업용 제형:
    Figure 112019061161111-pct00043
    .
  3. 제2항에 있어서,
    R1은 C1-6 알킬 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2는 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L은 결합 및 C1-2 알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 농업용 제형.
  4. 제2항에 있어서,
    R1은 C1-6 알킬이고,
    R2는 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되며, 각각은 선택적으로 1 내지 4개의 R2a 기로 치환되는 것인 농업용 제형.
  5. 제4항에 있어서, 각각의 R2a는 H, 할로겐 및 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 것인 농업용 제형.
  6. 제4항에 있어서, R2는 페닐, 나프틸, 티오펜, 퓨란, 피롤 및 피리딜로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 농업용 제형.
  7. 제4항에 있어서,
    R1은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 뷰틸, 아이소-뷰틸, sec-뷰틸, tert-뷰틸, 펜틸, 아이소펜틸, 네오-펜틸 및 헥실로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2는 페닐 및 티오펜으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 각각은 선택적으로 1개의 R2a 기로 치환되고;
    각각의 R2a는 H, F, Cl, 메틸, 및 에틸로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    L은 결합 및 메틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 농업용 제형.
  8. 제7항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식을 갖는 것인 농업용 제형:
    Figure 112014097732748-pct00013
    .
  9. 제7항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식을 갖는 것인 농업용 제형:
    Figure 112014097732748-pct00014
    .
  10. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기에 나타낸 화합물들 중 하나인 것인 농업용 제형:
    Figure 112019061161111-pct00044

    Figure 112019061161111-pct00045

    Figure 112019061161111-pct00046
    .
  11. 제1항에 있어서, 상기 화합물은
    Figure 112014097732748-pct00015
    인 것인 농업용 제형.
  12. 제1항에 있어서, 살진균제, 제초제, 농약, 살선충제, 살충제, 식물 활성제, 상승제, 제초제 약해경감제, 식물 생장 조절제, 곤충 퇴치제, 살비제, 연체동물 구충제, 또는 비료 중 적어도 하나를 더 포함하는 농업용 제형.
  13. 제1항에 있어서, 계면활성제를 더 포함하는 농업용 제형.
  14. 제1항에 있어서, 담체를 더 포함하는 농업용 제형.
  15. 식물에서 무생물적 스트레스 내성을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 식물을 제1항의 제형의 충분한 양과 접촉시켜, 상기 식물을 상기 제형과 접촉시키지 않는 것에 비해 상기 식물에서의 무생물적 스트레스 내성을 증가시키는 단계를 포함하는, 식물에서 무생물적 스트레스 내성을 증가시키는 방법.
  16. 식물에서 종자발아를 저해하는 방법으로서, 상기 방법은 종자를 제1항의 제형의 충분한 양과 접촉시켜 발아를 저해하는 단계를 포함하는, 식물에서 종자발아를 저해하는 방법.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 제형과 접촉된 식물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 식물은 종자인 것인 식물.
  19. PYR/PYL 단백질을 활성화시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 PYR/PYL 단백질을 제1항의 제형과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
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