KR100500751B1 - 상승된 질병 내성에 의해 식물을보호하는 방법 - Google Patents

상승된 질병 내성에 의해 식물을보호하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 통상의 살미생물제를 면역조절 식물에 적용함으로써 획득한 상승적 질병 내성을 통하여 병원균 침입으로부터 식물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 면역조절 식물은 SAR이 활성화된 것이므로 "SAR-on" 식물로 언급된다. 면역조절 식물은 3가지 이상의 상이한 방법: BTH, INA, 또는 SA와 같은 SAR의 화학적 유도인자를 식물에 적용하는 방법; 식물을 SAR 유전자의 구성적 발현 및/또는 질병-내성 표현형을 토대로하는 선택적인 육종 프로그램을 통한 방법; 또는 식물을 NIM1 유전자의 작용형과 같은 SAR 유전자 1개 이상으로 형질전환시키는 방법으로써 수득될 수 있다. 면역조절 식물에 살미생물제를 동시에 적용함으로써, 질병 내성이 놀라울정도로 상승적으로 향상된다; 즉, 질병 내성의 수준이 질병 내성의 부가적 수준의 예측치 보다 더 크다.

Description

식물을 보호하는 방법{Method for protecting plants}
도 1은 마우스, 래트, 및 돼지로부터의 IКBα와 NIM1 단백질 서열의 서열 정렬이다. 서열위의 수직 막대(I)는 NIM1과 IКBα 서열간의 아미노산 동질성을 표시한다(매트릭스 점수는 1.5와 대등함); 서열위의 이중 도트(:)는 유사성 점수>0.5를 나타내고; 서열위의 단일 도트(.)는 유사성 점수가 <0.5 이나 >0.0임을 나타내며; 점수 <0.0은 유사성이 없음을 나타내는 것으로 서열위에 표시가 없다(실시예 참조). 포유동물의 IКBα 안키린 도메인의 위치는 문헌: Martin et al., Gene 152, 253-255 (1995)에 따라서 확인한다. 서열내의 도트는 NIM1과 IКBα 단백질간의 갭을 나타낸다. IКBα중 5개의 안키린 반복체는 서열 아래에 밑줄로 표시하였다. 아미노산은 경우에 따라 도입된 갭이 있는 NIM1 단백질에 대해 번호를 매긴다. 플러스 표시(+)는 10개의 아미노산 마다 서열위에 표시한다.
도 2는 NIM1 단백질 영역(번호는 서열 2중의 아미노산 위치에 대응함)과 벼의 EST 단백질 생성물(서열 17-24)의 아미노산 서열 배교이다.
도 3은 물 또는 BTH로 처리한 다음 야생형 및 NIM1-과발현주에서 PR-1 유전자 발현의 시간 경과를 나타내는 노던 분석 결과를 나타낸다. RNA는 처리된 식물로부터 제조하고 실시예에 기재된 바와 같이 분석한다. "Ws"는 야생형 아라비도프시스 탈리아나 Ws 생태형이다. "3A", "5B", "6E", 및 "7C"는 실시예 21에 따라서 생산된 각각의 NIM1-과발현 식물주이다. "0 BTH"는 수처리이고; "10 BTH"는 10 μM BTH 처리이며; "100 BTH"는 100 μM BTH 처리이다. "0"은 대조군 샘플이 없는 날이고; "1", "3", 및 "5"는 1, 3, 및 5일째 샘플이다.
<서열표중 서열의 간단한 설명>
서열 1은 야생형 아라비도프시스 탈리아나 NIM1 유전자의 암호화 영역을 포함하는 5655-bp 게놈성 서열이다.
서열확인 번호: 2는 서열 1의 암호화 영역에 의해 암호화된 아라비도프시스 탈리아나 NIM1 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 3은 도 1로부터 마우스 IКBα 아미노산 서열이다.
서열 4는 도 1로부터 래트 IКBα 아미노산 서열이다.
서열 5는 도 1로부터 돼지 IКBα 아미노산 서열이다.
서열 6은 아라비도프시스 탈리아나 NIM1 유전자의 cDNA 서열이다.
서열 7 및 8은 각각 아미노산 위치 55 및 59에서 세린 잔기 대신 알라닌 잔기를 갖는, 우성의-네가티브 형태의 NIM1 단백질의 DNA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 9 및 10은 각각, N-말단 결실을 갖는 우성의-네가티브 형태의 NIM1 단백질의 DNA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 11 및 12는 각각, C-말단 결실을 갖는 우성의-네가티브 형태의 NIM1 단백질의 DNA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 13 및 14는 각각, N-말단 결실 및 C-말단 결실을 둘다 갖는 변형된 형태의 NIM1 단백질의 DNA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 15 및 16은 각각, NIM1의 안키린 도메인의 DNA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 17은 도 2로부터 벼-1 AA 서열 33-155이다.
서열 18은 도 2로부터 벼-1 AA 서열 215-328이다.
서열 19는 도 2로부터 벼-2 AA 서열 33-155이다.
서열 20은 도 2로부터 벼-2 AA 서열 208-288이다.
서열 21은 도 2로부터 벼-3 AA 서열 33-155이다.
서열 22는 도 2로부터 벼-3 AA 서열 208-288이다.
서열 23은 도 2로부터 벼-4 AA 서열 33-155이다.
서열 24는 도 2로부터 벼-4 AA 서열 215-271이다.
서열 25 내지 32는 올리고뉴클레오티드 프라이머이다.
<정의>
다음 정의는 본 발명의 이해를 도울것이다.
식물 세포: 원형질체와 세포벽으로 이루어진, 식물의 구조 및 생리학적 단위. 용어 "식물 세포"는 식물의 일부 또는 식물로부터 유래된 세포를 언급한다. 세포의 일부예로는 살아있는 식물의 일부인 분화된 세포; 배양중의 분화된 세포; 배양중의 비분화된 세포; 유합조직 또는 종양과 같은 비분화된 조직의 세포; 종자, 배아, 주아 및 화분의 분화된 세포가 있다.
식물 조직: 구조 및 기능성 단위로 조직화된 식물 세포군. 식물계 또는 배양중 식물 조직이 포함된다. 이 용어는 비제한적으로, 전체 식물, 식물 기관, 식물 종자, 조직 배양 및 구조 및/또는 기능성 단위로 조직화된 식물 세포. 상기 열거한 것이거나 상기 정의에 포함되는 특정 타입의 식물 조직과 관련되거나, 부재하는 상이 용어를 사용하는 것은 다른 타입의 식물 조직만을 포함하는 것은 아니다.
원형질체: 세포벽이 없는 식물 세포.
후손 식물: 비제한적으로 자손 식물을 포함하는 유성적으로 또는 무성적으로 유래된 후기 세대 식물.
유전자전이 식물: 게놈중에 안정하게 포함된 재조합 DNA를 갖는 식물.
재조합 DNA: 상이한 공급원으로부터의 DAN 절편을 연결하여 형성되고 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산한 DNA 분자.
재조합 DNA 기술: 재조합 DNA를 시험관내에서 생산하고 DNA를 발현시키거나 보급시킬 수 있는 세포중으로 재조합 DNA를 운반시키는 기술(참조: Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Bioligy, Ed. Juo, CRC Press, Boca Raton (1996)), 예를들면, 원형질체(들) 또는 세포(들)중으로 DNA를 여러가지 형태로, 예를들어, (1) 원형, 선형 또는 슈퍼코일된 형태의 나상(naked) DNA, (2) 뉴클레오솜 또는 염색체 또는 핵 또는 이의 일부중에 함유된 DNA, (3) 다른 분자와 복합체화되거나 관련된 DNA, (4) 리포좀, 원형질체(spheroplast), 세포 또는 원형질체중에 함포된 DNA 또는 (5) 숙주 유기체(예, Agrobacterium tumefiaciens) 이외의 유기체로부터 전이된 DNA의 전이. 이들 및 다른 여러가지 세포중의로의 재조합 DNA를 도입시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 이를 사용하여 본 발명의 유전자전이 세포 또는 유전자전이 식물을 생산할 수 있다.
재조합 DNA 기술은 또한 다음 문헌: Treco et al., WO 94/12650 및 Treco et al., WO 95/31560에 기술된 상동 재조합 방법이 있으며, 이는 단자엽식물중 퍼옥시다제 활성을 증가시키는데 적용할 수 있다. 상술하면, 조절 영역(예, 프로모터)을 식물 게놈중에 도입시켜 내인성 퍼옥시다제의 발현을 증가시킬 수 있다.
선택된 발현 시그날이 결여되어 있는 퍼옥시다제 암호화 서열을 단자엽식물중에 삽입시키고 단자엽식물중에서 내인성 조절 서열로 인한 퍼옥시다제의 증가된 발현에 대해 유전자전이 단자엽식물을 평가하는 것이 또한 재조합 DNA 기술로 포함된다. 이는 식물내에서 퍼옥시다제 암호화 서열의 카피수를 증가시킨다.
R0 식물의 게놈중으로 재조합 DNA를 초기에 삽입시키는 것은 전통적인 식물 육종법 보다는 본 명세서에 기술된 바와 같은 기술 방법으로 수행하는 것으로 정의되지 않는다. 초기 삽입 이후, 유전자전이 후손 식물을 필수적으로 전통적인 육종법을 사용하여 보급시킬 수 있다.
키메라성 유전자: 2종 이상의 이종성 부분, 예를들면, 이미-존재하는 단계와 관련없는 이미-존재하는 DNA 서열로부터 유래된 부분을 함유하는 DNA 분자, 이들 서열은 재조합 DNA 기술을 사용하여 발생시킨 것이 바람직하다.
발현 카세트: 프로모터와 종결기 사이에 암호화 서열을 삽입시킬 수 있는, 프로모터와 종결기를 포함하는 DNA 분자.
암호화 서열: 전사되어 해독시 폴리펩타이드 또는 단백질을 형성시키는 DNA 분자.
유전자: 발현, 즉, 전사 및 해독, 및 명확한 폴리펩타이드 또는 단백질을 제공하도록 전사 및 해독되는 암호화 서열의 조정에 작용하는 조절 DNA 서열을 포함하는 별개의 염색체 영역.
acd: 상승된 세포 사멸 돌연변이 식물.
AFLP: 증폭된 단편 길이 다형성.
avrRpt2: 슈도모나스 시린개로부터 분리된, 비독성 유전자 Rpt2.
BAC: 세균성의 인공 염색체.
BTH: 벤조[1,2,3]티아디아졸-7-카보티오산-S-메틸 에스테르.
CIM: 구성적 면역성 표현형(SAR은 구성적으로 활성화된다).
cim: 구성적 면역성 돌연변이 식물.
cM: 센티모르간.
cpr1: PR 유전자 돌연변이 식물의 구성적 발현제.
Col-O: 아라비도프시스 생태형 콜럼비아.
ECs: 효소 배합물.
Emwa: 아라비도프시스의 Ws-O 생태형에 적합한 페로노스포라 파라시티가 분리물.
EMS: 에틸 메탄 술포네이트.
INA: 2,6-디클로로이소니코틴산.
Ler: 아라비도프시스 생태형 랜스버그 에렉타.
lsd: 병소 시뮬레이팅 질병 돌연변이 식물.
nahG: 살리실산을 카테콜로 전환시키는 살리실레이트 히드록실라제 슈도모나스 푸티다.
NahG: nahG 유전자로 형질전환시킨 아라비로프시스.
ndr: 비-종족-특이적 질병 내성 돌연변이 식물.
nim: 비-유도성 면역성 돌연변이 식물.
NIM1: SAR 신호전달 연속단계에 관계되는, 야생형 유전자.
NIM1: 야생형 NIM1 유전자에 의해 암호화된 단백질.
nim1: 식물에 질병 감응성을 부여하는, NIM1의 돌연변이 대립유전자; NIM1의 nim1 돌연변이 대립유전자를 갖는 돌연변이 아라비도프시스 탈리아나 식물을 언급하기도 함.
Noco: 아라비도프시스의 Col-O 생태형에 적합한 페로노스포라 파라시티카 분리물.
ORF: 개방 판독 프레임.
PCs: 프라이머 조합물.
PR: 병인 관련.
SA: 살리실산.
SAR: 조직의 후천적 내성.
SAR-on: SAR이 활성화되어, 전형적으로 야생형보다 더 큰 SAR 유전자 발현을 나타내며 질병 내성 표현형을 갖는 면역조절 식물.
SSLP: 단순한 서열 길이 다형성.
UDS: 광범위한 질병 감응성 표현형.
Wela: 아라비도프시스의 Weiningen 생태형에 적합한 페로노스포라 파라시티카 분리물.
Ws-O: 아라비도프시스 생태형 Issilewskija.
WT: 야생형.
YAC: 효모 인공 염색체.
본 발명은 하기 상세한 공정, 제조방법, 및 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명된다. 실시예는 설명을 위함이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 판단되어서는 안된다.
여기서 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 숙지된 것이며 하기 문헌에 기재되어 있다: Sambrook, et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) 및 T.J. Silhavy, M.L. Berman, 및 L.W. Enquist, Experiments withgene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1084) 및 Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. Greene Publishing Assoc. and Wile-Interscience (1987).
I. 조직의 후천적 내성의 화학적 유도인자와 통상의 살미생물제를 식물에 함께 적용시킴으로써 수득되는 상승적 질병 내성 효과
본 실시예에서는, 벤조티아디아졸과 같은 SAR의 화학적 유도인자를 적용시켜 식물에서 SAR을 유도시킨다. 또한, 통상의 살미생물제를 식물에 적용시킨다. 이어서 식물을 여러가지 병원균으로부터의 질병에 걸리도록한다. 병원균을 처리하는 두 방법을 함께 사용함으로써(화학적+살미생물제) 합한것 보다 더 큰, 즉, 상승적인 질병 내성이 발생하게되었다. 이는 상승 인자(SF), 즉, 예측되는 (E) 효과에 대한 관측(O) 효과의 비율로 결정된다.
활성 성분의 제시된 배합에 대해 예측되는 효과(E)를 소위 콜비(Colby)식으로 기술할 수 있으며 다음과 같이 계산할 수 있다(Colby, S.R., "Calculating synergistic and anatagonistic responses of herbicide combination", Weeds, Vol. 15, pages 20-22 (1967)):
ppm = 분무 혼합물ℓ당 활성 성분(=a.i.)의 ㎎,
X = 활성 성분 p ppm의 사용 비율에서 활성 성분 I에 의해 발생되는 작용%,
Y = 활성 성분 q ppm의 사용 비율에서 활성 성분 II에 의해 발생되는 작용%,
E = 활성 성분 의 p+q의 사용 비율에서 활성 성분 I+II의 예측 효과(부가적 활성).
콜비식은 다음과 같다:
실시예 1
보리에 있어서 에리시페 그라미니스(Erysiphe graminis)에 대한 활성
잔류-보호 작용: 높이가 약 8㎝인 보리 식물을 점적점(drip point)까지 수성 분무 혼합물(최대 0.02% 활성 성분)로 분무하고 3 내지 4일 경과후 진균 분생자를 산포한다. 감염된 식물을 22℃ 온실에 정치시킨다. 진균 감염은 일반적으로 감염후 10일 경과후 평가한다.
전식적 작용: 높이가 약 8㎝인 보리에 수성 분무 혼합물(최대 0.02%의 활성 성분, 토양의 용적을 기준)로 급수한다. 분무 혼합물이 토양위의 식물 부분과 접촉하지 않도록 주의한다. 3 내지 4일 경과후 식물에 진균 분생자를 산포한다. 감염된 식물을 22℃ 온실에 정치시킨다. 진균 감염은 일반적으로 감염후 10일 경과후 평가한다.
실시예 2
쿠쿠미스 사티버스 엘(Cucumis sativus L.)에서의 콜레토트리쿰 라게나리움(Colletotrichum lagenarium)에 대한 작용
10 내지 14일간 재배후, 오이에 시험 화합물의 습윤성 산제로부터 제조된 분무 혼합물을 분무한다. 3 내지 4일후, 식물을 진균의 포자 현탁액(1.0x105개 포자/㎖)으로 감염시켜 높은 습도에 23℃에서 30시간 동안 배양시킨다. 이어서 정상 습도에 22 내지 23℃에서 계속 배양시킨다. 감염후 7 내지 10일 경과후 보호 활성을 평가하고 진균 만연을 기준으로한다.
10 내지 14일간 재배후, 시험 화합물의 습윤성 산제로부터 제조된 분무 혼합물을 토양에 적용시킴으로써 오이를 처리한다. 3 내지 4일후, 식물을 진균의 포자 현탁액(1.0x105개 포자/㎖)으로 감염시켜 높은 습도에 23℃에서 30시간 동안 배양시킨다. 이어서 정상 습도에 22℃에서 계속 배양시킨다. 감염후 7 내지 10일 경과후 보호 활성을 평가하고 진균 만연을 기준으로한다.
*상승 인자 SF는 계산할 수 없다
실시예 3
담배에서의 세르코스포라 니코티아내(Cercospora nicotianae)에 대한 작용
담배 식물(6주령)에 시험 화합물의 조제된 액제(농도: 최대 0.02% 활성 성분)를 분무한다. 처리후 4일째, 식물에 세르코스포라 니코티아내의 포자 현탁액(150,000 포자/㎖)을 접종시키고 고습도에서 4 내지 5시간 동안 보관한 다음 정상적인 주야 사이클하에 배양시킨다. 시험에서의 증상의 평가는 진균으로 만연된 잎 표면을 기준으로한다.
실시예 4
벼과 식물에서의 피리쿨라리아 오리재(Pyricularia oryzae)에 대한 작용
약 2주령인 벼과 식물을 분무 혼합물(최대 0.006% 활성 성분)로 충전된 용기중에 뿌리 주변 토양과 함께 넣는다. 96시간 경과후, 벼과 식물을 진균의 분생자 현탁액으로 감염시킨다. 진균 만연은 95 내지 100% 상대 습도 및 약 24℃에서 5일간 감염된 식물을 배양한후 평가한다.
12㎡ 포트상에서, 벼과 식물에 활성 성분의 습윤성 산제로 제조된 분무 혼합물을 분무한다. 감염은 천연적인 것이다. 평가를 위하여, 진균으로 만연된 잎 영역을 적용후 44일째에 측정한다. 다음 결과를 수득한다:
약 2주령인 벼과 식물을 분무 혼합물로 충전되어 있는 용기중에 뿌리 주변의 토양과 함께 넣는다. 진균 만연은 36일 경과후 평가한다. 비처리된 식물의 만연은 0% 활성에 대응한다.
실시예 5
칠리(chili)에서의 콜레토트리쿰 종(Colletotrichum sp.; Anthracnose) 및 세르코스포라 종(Cercospora sp.; Leaf Spot)에 대한 작용
작물 수율에 대한 효과: 면적이 약 10㎡인 소구획(시험 장소: Cikampek, Java, Indonesia)에서, 칠리 식물에 헥타르당 분무 혼합물 500 내지 700 리터를 약 7일 간격으로 총 7회 분무한다. 1차 분무후 3일째, 식물에 진균을 인공적으로 감염시킨다.
실시예 6
밀에서의 푸치니아 레콘디타(Puccinia recondita)에 대한 작용
7일령 밀과 식물에 점적점까지 제형화된 활성 성분으로부터 제조된 분무 혼합물, 또는 활성 성분의 배합물을 분무한다. 4일후, 처리된 식물을 진균의 분생자 현탁액으로 감염시키고, 이어서 처리된 식물을 90 내지 100%의 상대적 대기 습도 및 20℃에서 2일간 배양시킨다. 감염후 10일째, 진균 만연을 평가한다.
실시예 7
밀에서의 에리시페 그라미니스(Erysiphe graminis)에 대한 작용
야지 시험으로(10㎡), 성장 기상의 동계 밀에 활성 성분의 습윤성 산제로 제조된 분무 혼합물을 분무한다. 감염은 천연적이다. 감염 10일후, 진균 만연을 평가한다. 다음 결과를 수득하였다:
실시예 8
바나나에서의 미코스패렐라 피지엔시스(Mycosphaerella fijiensis)에 대한 작용
300㎡ 소구획내의 40개의 바나나 식물에 활성 성분의 습윤성 산제로 제조된 분무 혼합물을 분무한다; 총 6회. 감염은 천연적이다. 평가의 경우, 진균으로 만연된 잎을 측정한다. 다음 결과를 수득하였다:
실시예 9
토마토에서의 알터나리아 솔라니(Alternaria solani)에 대한 작용
7㎡ 소구획상의 토마토 식물에 7일 간격으로 활성 성분의 습윤성 산제로 제조된 분무 혼합물을 분무한다; 총 9회. 감염은 천연적이다. 평가의 경우, 진균으로 만연된 잎을 측정한다. 다음 결과를 수득하였다:
실시예 10
토마토에서의 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)에 대한 작용
토마토 식물 재배종 "Roter Gnom"에 제형화된 활성 성분으로 제조된 분무 혼합물, 또는 활성 성분의 배합물을 점적점까지 분무한다. 4일후, 처리된 식물에 진균의 포자 현탁액을 분무하고 이어서 18 내지 20℃ 및 90 내지 100%의 상대적 대기 습도에서 2일간 캐비넷에서 배양시킨다. 감염후 5일 경과후, 진균 만연을 평가한다. 다음 결과를 수득하였다:
실시예 11
오이에서의 슈도페로노스포라 쿠벤시스(Pseudoperonospora cubensis)에 대한 작용
16 내지 19일된 오이과 식물("Wisconsin")에 제형화된 활성 성분으로 제조된 분무 혼합물, 또는 활성 성분의 배합물, 또는 활성 성분들의 배합물을 점적점까지 분무한다. 4일후, 처리된 식물을 슈도페로노스포라 쿠벤시스(균주 365, Ciba; 최대 5000/㎖)의 포자로 감염시키고, 이어서 처리된 식물을 18 내지 20℃ 및 70 내지 90%의 상대적 대기 습도에서 1 내지 2일간 배양시킨다. 감염후 10일 경과후, 진균 만연을 평가하고 비처리된 식물상에서의 만연과 비교한다. 다음 결과를 수득하였다:
실시예 12
담배에서의 페로노스포라 타바치나(Peronospora tabacina)에 대한 작용
담배(6주령)에 시험 화합물의 제형화된 액제를 분무한다. 처리후 4일째, 식물을 진균의 포자 현탁액으로 접종시켜, 고습도에서 4 내지 5일간 보관한 다음 정상적인 주/야 사이클하에서 배양시킨다. 시험에서의 증상의 평가는 진균으로 만연된 잎 표면을 기준으로한다. 비처리된 식물의 만연은 0% 활성에 대응한다.
실시예 13
아라비도프시스 탈리아나에서의 페로노스포라 파라시티카(Peronospora parasitica)에 대한 작용
습윤성 산제 담체와 함께, 각각 활성 성분(들) 25%, 80%, 70%, 및 25%로 제형화된, 살진균제 메탈락실, 포세틸, 및 수산화구리, 및 SAR 활성화제 벤조(1,2,3)-티아디아졸-7-카보티오산 S-메틸 에스테르(BTH)를 미세한 연무로 3주령 식물의 잎에 적용시킨다. 습윤성 산제만을 대조군으로 적용시킨다. 3일 경과후, 문헌[Delaney et al. (1995)]에 기재된 바와 같이 식물에 페로노스포라 파라시티카 분생자 현탁액을 접종시킨다. Ws 식물에 적합가능한 피. 파라시티카 분리물 Emwa(1-2x105개 포자/㎖)를 접종시키고; Col 식물에 적합가능한 피. 파라시티카 분리물 Noco2(0.5-1x105개 포자/㎖)를 접종시킨다. 접종후, 높은 습도를 유지하기위하여 식물을 피복하고 주간 14시간/야간 10시간 사이클로 17℃의 Percival 성장 챔버내에 놓는다(Uknes et al., 1993). 접종후 8일째에 조직을 수확한다.
진균 감염을 12일간 진행시킨 다음 해부 현미경하에서 관찰하여 분생자 포자의 발달을 평가한다[Delaney, et al. (1994); Dietrich, et al. (1994)]. 각각의 잎을 락토페놀트리판 블루로 염색하여 잎 조직내에서의 진균 성장을 관찰한다. 프라이머 NS1 및 NS2와 주형으로서 피. 파라시티카 EmWa DNA를 사용하여 문헌: White et al. 1990; PCR Protocols: A guide to Methods and Application, 315-322)에 따르는 PCR에 의해 수득한 rRNA 진균 프로브를 사용하여 정량한다. RNA를 페놀/클로로포름 추출에 이어 염화리튬 침전시켜 동결된 조직으로부터 정제한다(Lagrimini et al, 1987: PNAS, 84; 7542-7546). 포름알데히드 아가로스 겔을 통한 전기영동에 의해 샘플(7.5 μg)을 분리시켜 문헌[Ausbel et al. (1987)]에 기술된 바와 같이 나일론 막(Hybond-N+, Amersham)에 블로팅시킨다. 하이브리드화와 세척은 문헌[Church andgilbert(1984, PNAS, 81:1991-1995)]에 따른다. 제조업자의 지침에 따라서 Phosphor Imager(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 전사물의 상대적인 양을 측정한다. 스트리핑시킨 필터 블롯을 구성적으로 발현된 b-투불린 아라비도프시스 cDNA로 프로브화하여 샘플 충전을 표준화시킨다. 비처리된 식물의 만연은 0% 진균 성장 억제에 대응한다. 다음 결과를 수득하였다:
표 29에서 알 수 있는 바와 같이, 야생형 아라비도프시스 Col-0 식물에서 상승적 질병-내성이 입증되었다. 0.01mM BTH 또는 0.0001g/ℓ 메탈락실중 하나를 식물에 따로 적용한 경우 진균 성장 억제가 전현 관찰되지 않는데, 이는 이들 화합물 농도가 통상적으로 효과에 불충분하기 때문이다. 그러나, 이들 통상적으로 불충분한 농도에서 식물에 이들 화합물을 둘다 적용시킴으로써, 40.7%의 진균 성장 억제가 관찰되었는데, 이는 명백한 상승 효과이다. 표 30 내지 32는 야생형 아라비도프시스 Ws 식물에서의 상승적인 질병-내성 효과를 나타낸다. Ws 식물에 0.01mM BTH를 적용시킬 경우 20 내지 30%의 진균 성장 억제가 관찰되었다. 그러나, BTH와 메탈락실, 포세틸, 또는 수산화구리중 하나를 동시에 적용시킴으로써, 상승적인 질병 내성이 관찰되었다. 병원균 구제에 필요한 살진균제 및 BTH의 유효 농도를 감소시키는, 이들 혼합된 항진균 효과는 진균 성장을 중단시키는데 필요한 화학물질 투여량을 감소시키며 따라서 화학 내성으로 인한 잎의 손상 발생을 진정시킨다.
II. 통상의 살미생물제 및/또는 조직의 후천전 내성의 화학적 유도인자를 구성적 면역성(CIM) 돌연변이 식물에 투여함으로써 성취되는 상승적인 질병 내성
본 실시예에서는, 고성능 노던 블롯 선별법을 개발하여 정상적인 성장중에 고농도의 PR-1 mRNA를 갖는 돌연변이 식물을 확인하는데, 이들 돌연변이체가 조직의 후천적 내성을 또한 나타내는 것이 이상적이다. 상기 선별법을 사용하여 수많은 돌연변이체를 분리하였는데 이들은 PR-1 뿐만 아니라 PR-2 및 PR-5 mRNA도 축적하는 것으로 밝혀졌다(Lawton et al. (1993); Dietrich et al. (1994); 및 Weymann et al. (1995)). 이들 돌연변이체는 또한 SA 수준 및 병원균 감염에 대한 내성이 상승되었는데, 이는 이 방법을 사용하여 SAR 신호전달 돌연변이체를 분리할 수 있음을 확인시켜주는 것이다.
이 선별법으로 2가지 부류의 SAR 신호전달 돌연변이체가 분리되었다. 한 부류는 lsd 돌연변이체로 표시하였다(lsd=lesion simulating disease). 이 부류의 돌연변이체는 또한 본 명세서에서 전문 참고로 인용되는 WO 94/16077에 기재된 바와 같이 "cim 부류 I"로도 언급된다. 상기 lsd 부류(aka cim 부류 I)은 잎상에 자발적 병소를 형성시키고, 상승된 농도의 SA, 높은 수준의 PR-1, PR-2 및 PR-5 mRNA를 축적하며 진균 및 세균성 병원균에 대한 내성이 있다(Dietrich et al., 1994; Weymann et al., 1995).
cim(cim=constitutive immunity)으로 명명된 두번째 부류가 하기에 기술되며 자발적 병소를 제외하고 lsd 돌연변이체의 특징을 모두 갖는다. 상기 두번째 부류(cim)는 WO 94/16077에서 논의된 "cim 부류 II" 돌연변이체에 대응한다. 하기 기술되는 cim3 돌연변이 식물주는 상기 cim 부류(cim 부류 II)에 속하며 안정하고 상승된 수준의 SA, SAR 유전자 mRNA를 발현시키는 야생형 외관을 갖는 우성의 돌연변이이며 광범위한 스펙트럼의 질병 내성을 갖는다.
실시예 14
구성적 SAR 유전자 발현을 갖는 cim 돌연변이체의 분리 및 특성화
1100개의 M2 돌연변이된(EMS) 아라비도프시스 식물을 대략 100세트의 아라콘 트레이(Aracon trays; Lehie Seeds, Round Rock, TX)에서 성장시킨다. 식물을 문헌: Uknes et al., 1993, 상기에 기재된 바와 같이 성장시키고, 과하게 급수되는 것과 병원균 감염을 피하도록 특별한 주의를 기울인다. 간략하면, Metro Mix 360을 물로 포화시키고 10-리터 배치에서 70분간 3회 오토클레이브시킨다. 포팅 믹스를 각 오토클레이빙 사이에 철저히 교반시킨다. 종자의 표면을 20% 클로락스중에서 5분간 멸균시키고 파종전에 멸균수로 7회 세척한다. 파종한 종자를 3 내지 4일간 춘화시킨 다음 주간 9시간/야간 15시간의 사이클로 22℃ 챔버에서 성장시킨다. 식물이 3 내지 4주령이 되었을 때, 50 내지 100㎎에 달하는 1 내지 2개의 잎을 수확하여 전체 RNA를 신속한, 미니-RNA 제조법(Verwoerd et al. (1989) Nuc. Acid Res. 17, 2362)을 사용하여 분리시킨다. PR-1 유전자 발현은 노던 블롯 분석법(Lagrimini et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7542-7546; Ward et al., 1991)을 사용하여 분석한다. 각 세트의 식물은 또한 비-처리된 A. thaliana Col-0과 2-일 INA-처리된(0.25㎎/㎖) 대조군을 포함한다. 모든 식물은 문헌: Weymann et al., (1995)에 기술된 바와 같이 유지시킨다.
상승된 수준의 PR-1 mRNA를 축적하는 80개의 추정되는 돌연변이체가 분리된다. 후손을 시험한 다음, 추가 특성화를 위하여 5개를 선택한다. 추정되는 cim 돌연변이체는 병원균 또는 유도 처리 부재하에서도 상승된 SAR 유전자 발현을 나타낸다. 추정되는 cim 돌연변이체의 후손 시험으로 구조적 PR-1 발현이 유전되는 것으로 확인되었다. cim 돌연변이체중에서 가장 높고, 가장 안정하게 PR-1을 발현시키는 2개의 돌연변이체 cim2 및 cim3을 추가로 특성화한다.
Columbia로의 역교배는 F1 후손의 확인을 위한 마커로서 열성의 털없는 특성을 이용한다. Col-gl1 꽃봉오리는 화분을 발산시키기전에 약화시키고, 돌연변이체로부터의 화분을 즉시 및 다음날 적용시킨다. F1 식물을 토양에서 성장시키고 외부 교배시킨 식물은 트리콤(trichome)의 존재로 확인한다.
cim2 및 cim3를 생태형 Col-0 또는 La-er에 교배시킨 다음, 큰 비율의 F1 식물을 높은 SAR 유전자 발현으로 확인하는데, 이는 이들 특성이 우성임을 제시하는 것이다. cim2의 경우, 모두는 아니나 일부의 F1 식물이 구조적인 SAR 유전자 발현을 갖는다. 상기와 같은 결과는 cim2 돌연변이체가 우성이고 이종접합체로서 부모에 탑재될 경우 예측된다. cim2의 추가적인 유전자-시험은 불완전한 침투와 일치하여, F2 세대에서 연속적인 가변적 분리를 나타낸다.
cim3은 높은 수준의 PR-1 mRNA를 발현시키는 각각의 F1 식물 2개를 자가수분시켜 F2 집단을 형성시킬때 F1 세대에서 1:1 분리가 증명되었다. PR-1 mRNA 축적을 점수를 매김으로써 수득한, F2 분리는 PR-1 mRNA가 높은 93개의 F2 식물과 PR-1 mRNA를 현저하게 축적시키지 않는 25개의 F2 식물을 3.7:1의 비율(c2=1.77; 0.5>P>0.1)로 제공하는데, 이는 cim3가 우성인, 단일 유전자 돌연변이라는 가설과 일치한다. 후속의 외부교배로 cim3가 우성 돌연변이로서 유전되는 것으로 확인되었다.
cim3의 경우, 상기 선별에서 확인된 원래의 M2 식물과 M3 집단은 정상으로 나타났다. 그러나, cim3 식물을 자가수분시킴에 따라 가장 우수하게 발현시키는 주의 일부는 수정율이 낮았다. Col-gl1에 역교배시킴에 따라, 정상적인 외관과 수정율을 가지며 PR-1을 강력하게 발현시키는 식물을 수득하였다.
초기에 확인되었을때, cim3은 또한 약간 왜소하고, 얇고 뒤틀린 잎을 갖는것으로 나타났다. 그러나, 생태형 Col-gl1과 교배시켜 생성된 F2 식물은 높은 SAR 유전자 발현을 보유하고 있으며 야생형 식물과 구별할 수 없었다. 이는 왜소한, 뒤틀린-잎 표현형이 구성적 SAR 유전자 발현과 관련없는 독립적인 돌연변이에 의해 유도되었음을 제시하는 것이다. cim3 돌연변이 표현형은 또한 식물을 멸균 조건에서 성장시킬 경우 관찰되었는데, 이는 PR-1 mRNA 축적이 병원균에 의해 야기되지 않았음을 확인시켜주는 것이다.
실시예 15
SAR 유전자 발현
PR-1 이외에, 2개의 다른 SAR 유전자, PR-2 및 PR-5가 또한 cim3에서 높게 발현된다. SAR 유전자의 발현 수준은 후손간에 변화되지만, 비처리된 대조군보다 항상 10배 이상 높고 야생형 식물의 내성-유발 INA(0.25㎎/㎖) 처리후 수득한 수준과 유사하다.
실시예 16
살리실산 분석
SA의 내인성 농도는 아라비도프시스에서 병원균-유도된 괴사 이후 증가되는 것으로 밝혀졌다(Uknes et al., 1993, 상기). 살리실산과 이의 글루코오스 접합체를 문헌[Uknes et al., 1993]에 기재된 바와 같이 분석한다. 잎 조직을 4주령의 cim3 10개 및 대조군 10개로부터 수확한다. 각 식물로부터의 잎을 수확하여 PR-1 유전자 발현에 대해 분석한다. SA 수준은 PR-1을 발현시키는 식물로부터 측정한다. cim3중 유리 SA의 농도는 비-감염된 야생형 아라비도프시스에서보다 3.4배 높다(233±35 vs.69±8 ng/신선 중량g, 각각). SA의 글루코오스 접합체(SAG)는 cim3에서 비-감염된 야생형 아라비도프시스에서보다 13.1배 더 높다(4519±473 vs. 344±58 ng/신선 중량g, 각각). 이들 증가된 수준의 SA 및 SAG는 병원균-감염된 조직 또는 cpr 돌연변이체에 대해 보고된 수준에 필적한다.
실시예 17
질병 내성
cim3을 아라비도프시스의 다우니 백분병의 원인제인, 페로노스포란 파라시티카(NoCo2)에 대해 평가한다. 각각 4주된, 30개의 cim3(PR-1 RNA 발현에 의해 확인된 것)과 30개의 대조 식물(생태형 Columbia)을 문헌[Uknes, et al. 1992]에 기재된 바와 같이, 피. 파라시티카로 접종시킨다. 7일 경과후, 문헌[Keogh et al. (1980) Trans. Br. Mycol. Soc. 74, 329-333, 및 Koch and Slusarenko (1990) Plant Cell 2, 437-445]에 기재된 바와 같이, 식물을 포자형성에 대해 분석하고 트리판 블루로 염색하여 진균 구조를 가시화한다. 야생형(Col-0) 식물은 균사, 분생자, 및 포자의 성장을 지지하는 반면, INA(0.25㎎/㎖)로 처리한 야생형 식물과 cim3 식물은 진균 성장을 나타내지 않았다. cim3-매개된 내성은 전형적으로 병원균 감염 부위에서 작은 그룹의 사멸 세포로서 관찰된다. 상기 타입의 내성은 lsd 돌연변이체(Dietrich et al., 1994, 상기; Weymann et al., 1995, 상기), 또는 SAR을 유도시킨 야생형 식물(Uknes et al., 1992, 상기)에서 관찰되는 것과 유사하다. 때때로, cim3 식물에서 균사 끝의 구멍에서의 괴사를 포함하여, 중간 내성 표현형을 관찰된다. 괴사는 낮은 투여량의 SA 또는 INA로 처리된 야생형 식물에서 발견되는 것과 유사하다(Uknes et al., 1992, 상기; Uknes et al, 1993, 상기). 그러나, cim3 식물상에서 포자형성이 전혀 관찰되지 않는 반면, 대조군 식물은 모두 포자형성을 나타냈다. 트리판 블루로 염색시 접종시키지 않은 cim3 잎에서는 자발적 병소가 전혀 관찰되지 않았다.
진균성 병원균 피. 파라시티카에 대한 내성외에, cim3은 또한 세균성 병원균인 슈도모나스 시린개 DC3000의 감염에 대해 내성이 있다. 6주된 야생형(±INA 처리), 및 cim3 식물을 피. 시린개 DC3000의 현탁액으로 접종시키고 질병을 진행시킨 다음 감염된 잎으로부터 추출한 세균의 성장을 시간에 따라 모니터한다. 0일 또는 2일째 Col-0, Col-0+INA 및 cim3간의 세균 역가에서의 차는 통계학적으로 유의적이지 않다. 그러나, 4일째까지, 야생형과 cim3 식물간의 세균 성장이 31배 감소한다(P<0.003; Sokal and Rohlf, 1981). 식물을 또한 질병 증상에 대해 육안으로 검사한다. 야생형 식물로부터의 잎은 감염 초기 영역을 넘어 확산되어 질병 증상으로 심하게 백화되어 있다. 대조적으로, INA로 처리된 야생형 식물 또는 cim3 식물은 질병 증상이 거의 없다.
본 실시예의 경우, 슈도모나스 시린개 pv. 토마토 균주 DC3000의 배양물을 King's B 배지(아가 플레이트 또는 액체) + 리팜피신(50㎍/㎖)상에 28℃에서 성장시킨다(Walen et al. (1991) Plant Cell 3, 49-59). 밤새 배양물을 희석시키고 10mM MgCl2중에 2-5x105 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켜 아라비도프시스 잎에 주사한다. 잎위의 중앙에 28 게이지 바늘로 구멍을 생성시켜 1 cc 시린지로 희석된 세균 용액 대략 250㎕를 주입하여 주사한다. 여러 시점에서, #1 코르크 보러로부터 3개의 랜덤한 잎 펀치로 이루어져 있는 랜덤한 샘플 10개를 각 처리로부터의 식물 10개로부터 취한다. 3개의 잎 펀치를 에펜도르프관에 10mM MgCl2 300㎕와 함께 넣고 막자로 마쇄시킨다. 생성된 세균 현탁액을 적절하게 희석시키고 King's B 배지 + 리팜피신(50㎍/㎖)상에 플레이팅시켜 4일간 28℃에서 성장시킨다. 세균 콜로니를 계수하고 데이타를 스튜던트 t 통계 분석한다(Sokal and Rohlf (1981), Biometry, 2nd ed. New York W.H. Freeman and Company).
본 실시예의 경우, 2,6-디클로로이소니코틴산(INA)를 또한 멸균, 증류수에 습윤성 산제중에 조제된 25% 활성 성분으로 현탁시킨다(0.25㎎/㎖, 325 μM; Kessmann et al. (1994) Annu. Rev. Phytopathol. 32, 439-59). 모든 식물에 물 또는 INA 용액을 넘치기 직전까지 분무한다.
실시예 18
SAR 유전자 발현 및 질병 내성에 있어서 SA의 역할
SA, SAR 유전자 발현 및 cim3에서의 내성간의 관계를 조사하기위하여, 살리실레이트 하이드록실라제(nahG) 유전자를 발현시키는 아라비도프시스 식물과 교배시킨다(Delaney et al., 1994). 이들 "NahG 식물"은 35S 유발된 nahG 유전자를 아라비도프시스중으로 아그로박테리윰-매개된 형질전환법을 사용하여 형질전환시켜 만든다. 참조: Huang, H. Ma, H. (1992) Plant Mol. Biol. Rep. 10, 372-383, 본 명세서에서 참고로 인용됨; Gaffney, et al. (1993) Science 261, 754-756, 본 명세서에서 참고로 인용됨; 및 Delaney, et al. (1994) Science 266, 1247-1250, 본 명세서에서 참고로 인용됨). Col-nahG 아라비도프시스는 우성의 nahG 유전자외에 우성의 가나마이신 내성 유전자를 함유하고 있어, Col-nahG를 화분 공여체로서 사용한다. F1 종자를 수중에서 30분간 수화시킨 다음 10% Clorox, 0.05% Tween 20중에서 5분간 멸균시키고 멸균수중에서 철저히 세척한다. 종자를 25㎎/㎖ 가나마이신을 함유하는 발아 배지(GM, 0.5g/ℓ 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산으로 완충시키고 10g/ℓ 슈크로오스를 함유하는, pH 5.7이고 KOH를 갖는 Murashige and Skoog 배지)상에 플레이팅하여 F1 식물에 대해 선택한다. 참조: Valvekens et al. (1988) Proc. Antl. Acad. Sci, USA 85, 5536-5540. 가나마이신 내성 F1 식물을 18일후에 토양으로 옮긴다. nahG 유전자 및 PR-1 발현의 존재를 노던 블롯 분석으로 모든 실험에서 확인한다.
cim3 돌연변이와 nahG 표현형이 둘다 우성이기 때문에, 두 유전자간의 상위성은 F1 식물에서 분석할 수 있다. cim3 X nahG 교배로부터의 F1 식물 70개를 PR-1 및 nahG 유전자 발현에 대해 분석한다. mRNA 발현의 노던 블롯 분석에서, nahG 유전자의 존재는 상승된 SAR 유전자 발현과 상관있다. 각 F1중 cim3의 존재는 생성된 F2 분리물중 PR-1 mRNA를 평가함으로써 확인된다.
질병 내성에 대해 cim3 돌연변이가 nahG 보다 상위성인지 측정하기위하여, cim3 X nahG 교배로부터 F1 식물 5개(이는 nahG의 존재 및 PR-1 mRNA의 부재에 대해 확인된 것이다)를 자가수분시켜 20 내지 30개의 F2 종자를 파종한다. nahG 및 PR-1 mRNA의 발현을 상기 F2 집단으로부터의 개체에서 분석하고, 이후 피. 파라시티카(NoCo2)로 첼린지하여 이들의 질병 감응성을 평가한다. cim3에 의해 부여된 질병 내성은 nahG 유전자의 존재에 의해 제거되는데, 이는 SAR 유전자 발현 및 질병 내성 표현형에 대해 nahG가 cim3가 상위성임을 증명하는 것이다.
실시예 19
살미생물제 및/또는 BTH를 cim 돌연변이체에 적용시킴으로써 획득되는 상승적 질병-내성
병원균 접종 3일전에, 습윤성 산제 담체(Metraux et al, 1991)과 함께 25% 활성 성분(ai)로 제형화된 조직의 후천적 내성의 화학물질 유도인자인 BTH(벤조[1,2,3]티아디아졸-7-카보티오산-S-메틸 에스테르) 및/또는 25% ai로서 제형화된 살미생물제 메탈락실(CGA 48988), 또는 습윤성 산제 만을 미세 연무로서 4주된 식물의 잎에 적용한다. 식물에 적합성 병원균인 페로노스포라 파라시티카 NoCo2의 분생자 현탁액(1.8x105개 포자/㎖)을 접종한다. 접종후, 식물을 피복하여 고습도를 유지하고 주간 14-시간/야간 10-시간의 사이클로 17℃의 Percival 성장 챔버중에 넣는다(Uknes et al., 1993). 접종 8일후 조직을 수확한다.
프라이머로서 NS1 및 NS2와 주형으로서 피. 파라시티카 EmWa DNA를 사용하여 문헌[White et al. 1990; PCR Protocols: A guide to Methods and Application, 315-322에 따른 PCR로 수득한 rRNA 진균 프로브를 사용하여 진균 성장을 측정한다. RNA를 페놀/클로로포름 추출에 이어 염화리튬 침전시켜 동결된 조직으로부터 정제한다(Lagrimini et al, 1987: PNAS, 84; 7542-7546). 포름알데히드 아가로스 겔을 통한 전기영동에 의해 샘플(7.5 μg)을 분리시켜 문헌[Ausbel et al. (1987)]에 기술된 바와 같이 나일론 막(Hybond-N+, Amersham)에 블로팅시킨다. 하이브리드화와 세척은 문헌[Church andgilbert(1984, PNAS, 81:1991-1995)]에 따른다. 제조업자의 지침에 따라서 Phosphor Imager(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 전사물의 상대적인 양을 측정한다. 스트리핑시킨 필터 블롯을 구조적으로 발현된 b-투불린 아라비도프시스 cDNA로 프로브화하여 샘플 충전을 표준화시킨다. 비처리된 식물의 만연은 0% 진균 성장 억제에 대응한다.
메탈락실 단독, "식물 활성화제" BTH 단독, 또는 메탈락실과 BTH 둘다를 상기한 cim3 돌연변이체에 적용하여 부가적인 것 보다 더 큰, 즉, 상승적인, 질병-내성 효과를 수득하였다. 이 효과는 상승 인자(SF)로 측정되는데, 이는 관찰된(O) 효과 대 예측된(E) 효과의 비이다. 다음 결과를 수득하였다:
wt = 야생형 Col-0
ND = 측정되지 않음
wt = 야생형 Col-0
ND = 측정되지 않음
wt = 야생형 Col-0
ND = 측정되지 않음
상기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 메탈락실 단독, BTH 단독, 메탈락실과 BTH를 함께 적용함으로써 cim3 식물에서 상승적인 질병-내성 효과가 증명되었다. 예를들면, 비처리된 cim3 식물에서, 비처리된 야생형 식물과 상대적으로 12.5% 진균 성장 억제가 관찰되었으며; 이는 cim3 돌연변이체중에서의 구조적 SAR 유전자 발현이 질병 내성과 상관있음을 증명하는 것이다. 그러나, 표 30에 나타낸 바와 같이, 면역조절된(SAR-on) cim3 식물에 메탈락실을 0.0001g/ℓ(통상적으로 효과에 불충분한 농도)로 적용함으로써, 진균 성장 억제의 관찰된 수준은 57.8%로 상승하였다. 이들 데이타로부터 계산된 4.6의 상승 인자는 면역조절 식물에 살미생물제를 적용시킴으로써 성취되는 상승적 효과를 명백하게 증명한다.
표 31에 제시된 데이타는 조직의 후천적 내성의 화학적 유도인자, 예로서 BTH를 면역조절된(SAR-on) cim3 식물에 적용시킴으로써 상승 효과가 성취됨을 증명한다. 예를들어, 야생형 식물에서는, 0.03mM 농도의 BTH가 통상적으로 유효한 질병 내성을 부여하는데 불충분하며, 단지 20.8%의 진균 성장 억제만을 제공한다. 그러나, cim3 식물에서는, 상기 통상적으로 부적합한 농도의 BTH가 73.1%의 진균 성장 억제를 제공하는데, 이는 거의 효과에 대해 권장되는 농도인, 0.1mM BTH에 의해 제공되는 억제 수준일 정도로 높다. 표 31의 데이타로부터 계산된 2.2의 상승 인자는 다른 방법을 통하여 이미 면역조절 식물에 BTH를 적용시킴으로써 상승적인 효과가 성취됨을 명확하게 입증하는 것이다.
질병 내성에 대한 효과는 BTH와 메탈락실을 둘다 cim3 식물에 적용할 경우 더욱 극적이다. 실시예 13(표 29)에 제시된 바와 같이, 야생형 식물에서는, 0.01mM BTH 또는 0.0001g/ℓ 메탈락실중 하나를 식물에 따로 적용한 경우 진균 성장 억제가 전현 관찰되지 않는데, 이는 이들 화합물 농도가 통상적으로 효과에 불충분하기 때문이다. 그러나, 이들 통상적으로 불충분한 농도에서 식물에 이들 화합물을 둘다 적용시킴으로써, 40.7%의 진균 성장 억제가 관찰되었는데, 이는 야생형 식물에 대해 명백한 상승 효과이다. cim3 식물에서는, 0.01mM BTH와 0.0001g/ℓ 메탈락실을 동시에 적용시키면 진균 성장 억제가 100%가 되는데, 이는 상승적인 활성을 명백하게 증명하는 것이다.
따라서, 질병 내성을 성취하기 위하여 면역조절된 cim 식물을 낮은, 통상적으로 효과적이지 않은 농도의 화학물질과 함께 사용하면 농업 분야의 숙련가에게 자명한 잇점이 제공된다. 여기서 증명된 상승 잇점을 통하여 통상적으로 독성이거나 달리 바람직하지 못한 농도의 화학물질을 피할 수 있다. 또한, 제시된 수준의 보호를 식물에 제공하는데 필요한 화학물질의 양을 감소시킴으로써 경제적인 잇점을 실현시킬 수 있다.
III. NIM1 유전자의 형태를 함유하는 유전자전이 식물에 통상의 살미생물제 및/또는 조직의 후천전 내성의 화학적 유도인자를 사용함으로써 성취되는 상승적인 질병 내성 효과
NIM1 유전자는 식물에서 조직의 후천적 내성(SAR) 경로의 중요한 성분이다(Ryals et al., 1996). NIM1 유전자는 화학적 및 생물학적 유도인자에 의한 SAR의 활성화와 관련있으며, 상기와 같은 유도인자와 함께, SAR 및 SAR 유전자 발현을 필요로한다. NIM1 유전자의 위치는 숙주식물에 광범위한 병원균에 대한 극도의 감응성을 제공하여 이들이 병원균 및 SAR의 화학적 유도인자에 대해 반응할 수 없도록하는, 돌연변이 nim1 유전자를 함유하는 것으로 공지된 돌연변이 식물의 게놈을 분자생물학적 분석하여 측정하였다. 아라비도프시스의 야생형 NIM1 유전자가 맵화되어 서열화되었다(서열 1). 야생형 NIM1 유전자 생성물(서열 2)은 아라비도프시스에서의 SAR 및 유전자가 질병 내성 유전자가 되도록하는 신호전달 연속단계에 연루되어 있다. 야생 형태의 NIM1의 재조합적 과발현으로 구성적 면역성(CIM) 표현형을 갖는 면역조절 식물이 발생되며 따라서 유전자전이 식물에 질병 내성이 부여된다. 활성 NIM1 단백질의 수준이 증가함으로써 BTH, INA, 및 SA와 같은 유도성 화학물질에 의한 화학적 유도와 동일한 질병-내성 효과가 생성된다. 참조: 계류중인 미국 특허원 제08/880,179호, 본 명세서에서 참고로 인용됨.
또한, NIM1 유전자 생성물은 포유동물의 신호전달 인자 IКB 아류 α의 구조적 동족체인 것으로 밝혀졌다(Ryals et al., 1997). IКB의 돌연변이는 NF-КB/IКB 조절의 초-억제제 또는 우성-네가티브로서 작용한다고 기재되어 있다. 따라서, 특정 변형된 형태의 NIM1은 SAR 신호전달 경로의 우성-네가티브 조절제로서 작용한다. 이들 변형된 형태의 NIM1은 nim1 돌연변이체와 같이 이들로 형질전환된 식물에 반대 표현형을 부여한다; 즉, 변형된 형태의 NIM1으로 형질전환된 면역조절 식물은 구조적 SAR 유전자 발현 및 CIM 표현형을 나타낸다. 참조: 계류중인 PCT 출원 "Methods of using the NIM1 gene to confer disease resistance in plants"; 본 명세서에서 참고로 인용됨.
실시예 20
야생형 NIM1 유전자를 함유하는 코스미드 클론을 사용한 식물의 형질전환
코스미드 D7(ATCC 97736으로 1996년 9월 25일자로 ATCC에 기탁되었슴)은 NIM1 유전자 영역을 포함하는 클론으로부터 발생되므로 야생형 NIM1 유전자(서열 확인번호: 1)를 함유한다. 코스미드 E1은 또한 NIM1 유전자 영역을 포함하는 클론으로부터 발생되므로 야생형 NIM1 유전자(서열 1)를 포함한다. 코스미드 D7과 E1을 미국 특허원 제08/880,179호에 기재된 바와 같이 헬퍼 균주 HB101(pRK2013)rhk 3부모 교배에 있어서 접합적 전달을 통하여 아그로박테리움 투메파시엔스 AGL-1중으로 이동시킨다. 이들 코스미드를 사용하여 진공 유입법을 사용하여 가나마이신-감응성 nim1 돌연변이 아라비도프시스를 형질전환시킨다(Mindrinos et al., 1994, Cell 78, 1089-1099). 상기 유입된 식물로부터 종자를 수확하여 선택제로서 50㎎/㎖ 가나마이신을 함유하는 GM 아가판상에서 발아시킨다. 상기 선택에 대해 생존하는 종묘를 플레이팅후 대략 2주후에 토양으로 옮긴다.
토양으로 옮긴 식물은 옮긴후 대략 1주간 피토트론에서 성장시킨다. 300mM INA를 크로미스터를 사용하여 미세 연무로서 적용하여 식물을 완전히 피복한다. 2일후, 잎을 RNA 추출 및 PR-1 발현 분석을 위하여 잎을 수확한다. 이어서 식물에 슈도모나스 파라시티카(분리물 EmWa)를 분무하고 고습도 조건하에 19℃ 주/17℃ 야 온도 및 8시간의 명/16시간의 암 사이클로 성장 챔버중에서 성장시킨다. 진균 감염후 8 내지 10일 경과후, 식물을 진균 성장에 대해 평가하여 포지티브 또는 네가티브 점수를 매긴다. Ws 및 nim1 식물을 동일한 방법으로 처리하여 각 실험의 대조군으로 제공한다.
수집한 조직으로부터 LiCl/페놀 추출 완충액을 사용하여 전체 RNA를 추출한다(Verwoerd et al., 1989, Nuc Acid Res, 2362). RNA 샘플을 포름알데히드 아가로스 겔상에서 진행시켜 유전자 선별 플러스(DuPont) 막으로 블롯팅시킨다. 블롯을 32P-표지된 PR-1 cDNA 프로브와 하이브리드화시킨다. 생성된 블롯을 필름에 노출시켜 INA 처리후 형질전환체가 PR-1 발현을 유도시킬 수 있는지 측정한다.
D7 및 E1 형질전환체가 삽입 부위(위치) 효과로 인하여 NIM1을 과발현시키는지 알기위하여, D7 또는 E1 코스미드를 함유하는 주요 형질전환체를 자가수분시켜 T2 종자를 수거한다. E1주 및 95 D7주로부터의 종자를 토양에 뿌려 상기한 바와 같이 성장시킨다. T2 식물이 4개 이상의 진정 잎을 수득하였을 때, 각 식물에 대해 별도로 잎 하나를 수확한다. 상기 조직으로부터 RNA를 추출하여 PR-1 및 NIM1 발현에 대해 분석한다. 이어서 식물에 피. 파라시키타(EmWa)를 감염시켜 감염후 10일째 되는날 진균 성장에 대해 분석한다. 수많은 형질전환체가 정상적인 진균 성장 보다 더 적고 이들중 4종, 즉, D7-2, D7-74, D7-89 및 E1-1을 가시적인 진균 성장을 전혀 나타내지 않았다. 정상적인 NIM1 및 PR-1 발현 보다 더 높으며 진균 내성을 나타내는 식물은 NIM1 과발현으로 질병 내성이 부여된다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 21
천연 프로모터하에서의 NIM1 과발현
NIM1 유전자를 구성적으로 발현하는 식물은 Ws 야생형 식물을, 1.4 kb의 프로모터 서열을 갖는 BamHI-HindIII NIM1 게놈성 단편(서열 1 - 염기 1249-5655)으로 형질전환시켜 발생시킨다. 상기 단편을 pSGCG01중으로 클로닝시켜 아그로박테리움 균주 GV3101중으로 형질전환시킨다(pMP90, Konoz and Schell (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396). Ws 식물을 상기한 바와 같이 침투시킨다. 생성된 종자를 수확하여 50㎍/㎖ 가나마이신을 함유하는 GM 아가상에 플레이팅시킨다. 생존하는 모종을 토양으로 옮겨 페로노스포라 파라시티카 분리물 Emwa에 대한 내성에 대해 상기한 바와 같이 시험한다. 선택된 식물을 자가수분시키고 이후의 2세대에 대해 선택하여 동형접합성 주를 발생시킨다. 이들 수개의 식물주로부터의 종자를 토양에 파종하여 라인당 15 내지 18개의 식물을 3주간 성장시켜 유도성 화학물질을 사용한 전처리 없이 Emwa 내성에 대해 다시 시험한다. 진균 처리후 대략 24시간, 48시간, 및 5일후, 조직을 수확하고, 수집하고 각 주에 대해 동결시킨다. Emwa에 대한 내성에 대해 이들을 평가할 경우 접종후 10일까지 식물을 성장 챔버에 유지시킨다.
RNA를 상기 수집한 모든 샘플로부터 제조하여 상기한 바와 같이 분석한다(Delaney et al, 1995). 상기 블롯을 아라비도프시스 유전자 프로브 PR-1에 하이브리드화시킨다(Uknes et al, 1992). 분석한 13개의 유전자전이주중 5개가 PR-1 유전자 발현의 조기 유도를 나타냈다. 이들 주의 경우, PR-1 mRNA가 진균 처리후 24 또는 48시간 까지 자명하였다. 이들 5개의 주는 또한 가시적인 진균 성장을 나타내지 않는다. 잎을 락토페놀 블루로 기재된 바와 같이(Dietrich et al., 1994) 착색시켜 잎중에 진균 균사가 부재함을 입증한다. PR-1 유전자 발현은 48시간 내에 다른 8개의 주에서는 유도되지 않았으며 이들 식물을 Emwa에 대한 내성을 나타내지 않았다.
내성주의 서브세트를 또한 세균성 병원균 슈도모나스 시린개 DC3000에 대한 내성 증가에 대해 시험하여 문헌[Uknes et al. (1993)]에 기재된 바와 같이 내성 스펙트럼을 평가한다. 실험은 필수적으로 문헌[Lawton et al. (1996)]에 기재된 바와 같이 수행한다. 세균의 성장은 Emwa에 대한 구조적 내성이 있는 것으로 입증된 세포주에서 더 느리다. 이는 천연 프로모터하에서 NIM1 유전자를 과발현시키는 식물은 병원균에 대해 구조적 면역성을 갖고 있음을 나타내는 것이다.
이들 주에서 CIM 표현형의 추가적인 특징을 평가하기위하여, 감염되지 않은 식물을 유리 및 글루코오스-접합된 살리실산에 대해 평가하고 잎을 락토페놀 블루로 염색하여 미시적 병소의 존재에 대해 평가한다. 내성 식물을 NahG 및 ndr1과 같은 SAR 돌연변이체와 유성적으로 교배시켜 다른 돌연변이체에 대한 내성 표현형의 상위성 관계를 정립하고 이들 NIM1의 우성 네가티브 돌연변이체가 살리실산-의존적 피드백 루프에 어떻게 영향을 주는지 평가한다.
실시예 22
35S 유발된 NIM1의 과발현
완전한 길이의 NIM1 cDNA(서열 6)를 pCGN1761 ENX(Comai et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15, 373-381)의 EcoR1 부위중으로 클로닝시킨다. 생성된 플라스미드로부터, 향상된 CaMV 35S 프로모터, 전사에 대해 정확한 배향으로 NIM1 cDNA, 및 tml 3' 종결자를 함유하는 XbaI 단편을 수득한다. 상기 단편을 이원성 벡터 pCIB200중으로 클로닝시켜 GV3101중으로 형질전환시킨다. Ws 식물을 상기한 바와 같이 침투시킨다. 생성된 종자를 수확하고 50㎍/㎖ 가나마이신을 함유하는 GM 아가상에 플레이팅시킨다. 생존하는 모종을 토양으로 옮겨 상기한 바와 같이 시험한다. 선택된 식물을 자가수분시키고 이후의 2세대에 대해 선택하여 동형접합성 주를 발생시킨다. 시험된 58개의 식물주중 9개가 이들을 화학물질 전처리 없이 Emwa에로 처리시 내성을 갖는 것으로 입증되었다. 따라서, NIM1 cDNA의 과발현은 또한 질병-내성 식물을 생성시킨다.
실시예 23
NIM1은 IКBα의 동족체임
NIM1과 IКB의 유전자 생성물 간의 다중 서열 정렬을 수행하여 NIM1 유전자 생성물이 IКBα의 동족체임을 결정한다(도 1). 서열 상동성 조사는 BLAST(Altschul et al., J. Mol. Biol, 215, 403-410 (1990))를 사용하여 수행한다. 다중 서열 정렬은 DNASTAR(Madison, WI)으로부터의 Lasergene Biocomputing Software package의 일부로서 Clustal V(Higgins et al., CABIOS 5, 151-153 (1989))를 사용하여 작제한다. 상기 정렬에 사용되는 서열은 NIM1(서열 2), 쥐의 IКBα(서열 3, GenBank Accession #; 1022734), 래트의 IКBα(서열 4, GenBank 수탁번호 57674 및 X63594; Tewari et al., Nucleic Acids Res. 20, 607 (1992)), 및 돼지의 IКBα(서열 5, GenBank 수탁번호 Z21968; de Martin et al., EMBO J. 12, 2773-2779 (1993); GenBank 수탁번호 517193, de Martin et al., Gene 152, 253-255 (1995))이다. Clustal 분석에서 사용되는 인자는 갭 벌점이 10이고 갭 길이는 10이다. PAM250 중량표를 사용하여 진화적으로 분기된 거리를 계산한다(Dayhoff et al., "A model of evolutionary change in proteins. Matrices for detecting distant relationships." In Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Suppl. 3, M.O., Dayhoff, ed(National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.), pp.345-358 (1978)). 잔기 유사성은 개량된 Dayhoff 표를 사용하여 계산한다(Schwartz and Dayhoff, "A model of evolutionary change in proteins."In Atlas of Protein Sequence and Structure, M.O. Dayhoff, ed. (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) pp.353-358 (1979); Gribskov and Burgess, Nucleic Acids Res. 14, 6745-6763 (1986)).
상동성 조사는 안키린, NF-КB 및 IКB를 포함한 수개의 단백질의 안키린 도메인에 대한 NIM1 의 유사성을 나타낸다. IКB 및 관련 분자에 대해 최상의 전체적인 상동성이 있다(도 1). NIM1은 아미노산 위치 55 및 59에서 2개의 세린을 함유하며; 위치 59의 세린은(D/ExxxxS) 및 포스포릴화-의존성, 유비퀴틴-매개된, 유발성 분해에 있어서의 역할과 일치하는 위치(N-말단)에 있다. 모든 IКBα's는 이들 N-말단 세린을 갖고 있으며 이들은 IКB의 불활성화와 후속되는 NF-КB의 방출에 필요하다. NIM1은 안키린 도메인(아미노산 262-290 및 323-371)을 갖는다. 안키린 도메인은 단백질-단백질 상호반응에 연루되는 것으로 생각되며 IКB 및 NF-КB 분자에 대해 편재하는 양상이 있다. IКB's의 C-말단은 상이할 수 있다. NIM1은 일부 IКBs의 C-말단에서 발견되는 QL-풍부 영역(아미노산 491-499)에 대해 약간의 상동성을 갖는다.
실시예 24
변형된 형태의 NIM1의 생성 - 세린 잔기 55 및 59를 알라닌 잔기로 변화
사람의 IКBα중 세린 잔기의 포스포릴화는 IКBα의 자극-활성화된 분해와 이의 의한 NF-КB의 활성화에 필요하다. 사람의 IКBα중 세린 잔기(S32-S36)가 알라닌 잔기로 돌연변이되면 자극-유도된 포스포릴화가 억제되어 IКBα 프로테오좀-매개된 분해를 차단하게 된다(E. Britta-Mareen Traenckner et al., EMBO J. 14:2876-2883 (1995); Brown et al., Science 267:1485-1488 (1996); Brockman et al., Molecular and Cellular Biology 15:2809-2818 (1995); Wang et al., Science 274:784-787 (1996)).
상기 변형된 형태의 IКBα는 세포질중에 NF-КB를 보유함으로써, 다운스트림 시그날화가 일어나는 것을 차단함으로써 우성의 네가티브 형태로서 작용한다. NIM1과 IКB간의 서열 비교를 기준으로하여, NIM1의 세린 55(S55) 및 59(S59)는 사람의 IКBα중 S32 및 S36과 상동성이다. 우성-네가티브 형태의 NIM1을 작제하기위하여, 아미노산 위치 55 및 59중 세린을 알라닌 잔기로 돌연변이시킨다. 이는 예를들어, QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit(#200518: Strategene)을 사용하는 것과 같이, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
42 bp의 5'비해독된 서열(UTR)과 187 bp의 3'UTR을 포함하는 완전한 길이의 NIM1 cDNA(서열 6)을 사용하여, 다음과 같은 프라이머(서열 6, 위치 192-226)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라서 돌연변이된 작제물을 만들수 있다: 5'-CAA CAG CTT CGA AGC CGT CTT TGA CGC GCC GGA TG-3'(서열 25) 및 5'-CAT CCG GCG CGT CAA AGA CGG CTT CGA AGC TCT TG-3'(서열 26), 여기서 밑줄치 염기는 돌연변이를 나타낸다. 전략은 다음과 같다: 벡터 pSE936(Elledge et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:1731-1735 (1991))중으로 클로닝시킨 NIM1 cDNA를 변성시키고 변형된 염기를 함유하는 프라이머를 어닐링시킨다. DNA 폴리머라제(Pfu)는 비스트랜드-치환시켜 눈금을 새긴 환상의 스트랜드를 생성시킴으로써 프라이머를 확장시킨다. DNA를 메틸화된 부위만을 절단하는 Dpnl로 제한 엔도뉴클레아제 분해시킨다(비돌연변이 주형 DNA). 나머지 환상의 dsDNA를 이. 콜리 균주 XL1-블루중으로 형질전환시킨다. 생성된 콜로니로부터의 플라스미드를 추출하고 서열화하여 돌연변이된 염기의 존재를 증명하고 다른 돌연변이는 발생하지 않았음을 확인한다.
돌연변이된 NIM1 cDNA를 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI로 분해시키고 콜리플라워 모자이크 바이러스의 이중 35S 프로모터의 전자 조절하에서 pCGN1761중으로 클로닝시킨다. XbaI로 부분 제한 분해시켜 pCGN1761로부터 35S 프로모터, NIM1 cDNA 및 tml 종결자를 포함하는 형질전환 카세트를 방출시키고 XbaI에 결합시켜 탈포스포릴화된 pCIB200의 XbaI 부위에 결합시킨다. 서열 7 및 8은 각각 변형된 형태의 NIM1 유전자의 DNA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다.
실시예 25
변형된 형태의 NIM1의 생성 - N-종결기의 결실
K21, K22, S32 및 S36을 포함하는, 사람의 IКBα중 아미노산 1 내지 36(Brockman et al; Sun et al.) 또는 1 내지 72(Sun et al.)가 결실되면 형질감염된 사람의 세포 배양중에 우성의-네가티브 IКBα 표현형이 발생된다. NIM1 cDNA의 암호화된 생성물중 대략 첫번째 125개 아미노산의 N-종결기의 결실로 잠재적 유비퀴틴화 부위로서 제공될 수 있는 8개의 리신 잔기가 제거되고 S55 및 S59에서 추정되는 포스포릴화 부위가 제거된다(실시예 2 참조). 상기 변형된 유전자 작제물은 당해 분야의 숙련가에게 숙지된 방법으로 생산할 수 있다. 예를들면, 문헌: Ho et al., Gene 77:51-59(1989)의 방법을 사용하여, DNA가 대략 첫번째 125개의 아미노산 결실을 암호화하는 NIM1 형태를 발생시킬 수 있다. 다음 프라이머는 1612-bp PCR 생성물(서열 6: 418 내지 2011)을 생산한다: 5'-gg aat tca-ATG GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG-3'(서열 27) 및 5'-gga att cTA CAA ATC TGT ATA CCA TTG G-3'(서열 28), 여기서 합성 개시 코돈은 밑줄친(ATG)이고 EcoRI 링커 서열은 다음 경우에 있다. 단편의 증폭은 0.1 내지 100 ng의 주형 DNA, 10mM Tris pH 8.3/50mM KCl/2mM MgCl2/0.001% 젤라틴/각각 0.25mM의 dNTP/0.2mM 프라이머 및 1 단위의 rTth DNA 폴리머라제를 최종 용적 50㎖에 포함하는 반응 혼합물과 Perkin Elmer Cetus 9600 PCR 기계를 이용한다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃ 3분: 35x(94℃ 30초: 52℃ 1분: 72℃ 2분): 72℃ 10분. PCR 생성물을 직접 pCR2.1 벡터(Invitrogen)중으로 클로닝시킨다. PCR 벡터중에 PCR-생성된 삽입물은 이중 35S 프로모터의 전사 조절하에서, EcoRI를 사용하는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 방출시켜 탈포스포릴화된 pCGN1761의 EcoRI 부위에 결합시킨다. 작제물을 서열화하여 합성 개시 ATG의 존재를 증명하고 PCR중에 다른 돌연변이가 발생하지 않았음을 확인한다. 35S 프로모터, 개질된 NIM1 cDNA 및 tml 종결자를 포함하는 형질전환 카세트를 Xbal를 사용한 부분 제한 분해에 의해 pCGN1761로부터 방출시켜 pCIB200의 XbaI 부위에 결합시킨다. 서열 9 및 10은 각각, N-말단 아미노산 결실을 갖는 변형된 형태의 NIM1 유전자의 DNA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다.
실시예 26
변형된 형태의 NIM1의 생성 - C-종결기의 결실
사람의 IКBα중 아미노산 261 내지 317의 결실은 C-종결기중 세린과 트레오닌 잔기의 구조적 포스포릴화를 차단함으로써 고유의 안정성을 향상시키는 것으로 생각된다. 세린과 트레오닌이 풍부한 영역은 NIM1의 C-말단중 아미노산 522-593에 존재한다. NIM1 유전자의 C-말단 암호화 영역은 아미노산 522-593을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 결실시킴으로써 개질시킬 수 있다. 문헌: Ho et al. (1989)의 방법을 사용하여, NIM1 cDNA(서열 6; 1606-2011)의 C-말단 암호화 영역과 3'UTR을 PCR로 결실시켜, 다음 프라이머를 사용하여 1623 bp 단편을 생성시킨다: 5'-cggaattcGATCTCTTTAATTTGTGAATTT C-3'(서열 29) 및 5'-ggaattcTCAACAGTT CATAATCTGGTRCG-3'(서열 30), 여기서 합성 종결 코돈은 밑줄을 쳤으며(상보적 스트랜드상에서는 TGA) EcoRI 링커 서열은 다음 경우에 있다. PCR 반응 성분은 상기한 바와 같으며 사이클 인자는 다음과 같다: 94℃ 3분: 35x(94℃ 30초: 52℃ 30초: 72℃ 2분): 72℃ 10분. PCR 생성물을 직접 pCR2.1 벡터(Invitrogen)중으로 클로닝시킨다. PCR 벡터중에 PCR-생성된 삽입물은 EcoRI를 사용하는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 방출시켜 이중 35S 프로모터를 함유하는, 탈포스포릴화된 pCGN1761의 EcoRI 부위에 결합시킨다. 작제물을 서열화하여 합성 인-프레임(in-frame) 종결 코돈의 존재를 증명하고 PCR중에 다른 돌연변이가 발생하지 않았음을 확인한다. 프로모터, 개질된 NIM1 cDNA 및 tml 종결자를 포함하는 형질전환 카세트를 Xbal를 사용한 부분 제한 분해에 의해 pCGN1761로부터 방출시켜 pCIB200의 XbaI 부위에 결합시킨다. 서열 11 및 12는 각각, C-말단 아미노산 결실을 갖는 변형된 형태의 NIM1 유전자의 DNA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다.
실시예 27
변형된 형태의 NIM1의 생성 - N-종결기/C-종결기의 결실
키메라
N-종결기 및 C-종결기 결실 형태의 NIM1은 위치 819(서열 6)에서 독특한 KpnI 제한 부위를 사용하여 발생시킨다. N-종결기 결실 형태(실시예 25)를 EcoRI/KpnI로 제한 엔도뉴클레아제 분해시키고 개질된 N-종결기에 대응하는 415 bp 단편을 겔 전기영동법으로 회수한다. 마찬가지로, C-종결기 결실 형태(실시예 26)를 EcoRI/KpnI로 제한 엔도뉴클레아제 분해시키고 개질된 C-종결기에 대응하는 790 bp 단편을 겔 전기영동법으로 회수한다. 상기 단편들을 15℃에서 결합시켜, EcoRI로 분해시켜 EcoRI 단위를 제거하고 탈포스포릴화된 pCGN1761의 EcoRI 부위에 클로닝시킨다. N/C-종결기 결실 형태의 NIM1은 이중 35S 프로모터의 전사 조절하에 있다. 유사하게, C-종결기 결실(실시예 26)에 융합된 S55/S59 돌연변이된 추정 포스포릴화 부위(실시예 24)로 이루어진 키메라성 형태의 NIM1을 발생시킨다. 상기 작제물은 상기한 바와 같이 발생시킨다. 작제물을 서열화하여 개시 및 종결 코돈의 충실도를 증명하고 클로닝중에 돌연변이가 일어나지 않았음을 확인한다. 35S 프로모터, NIM1 키메라 및 tml 종결자를 포함하는 각각의 형질전환 카세트를 XbaI를 사용한 부분 제한 분해에 의해 pCGN1761로부터 방출시키고 탈포스포릴화된 pCIB200의 XbaI 부위에 결합시킨다. 서열 13 및 14는 각각 N-종결기 및 C-종결기 아미노산 결실을 둘다 갖는 변형된 형태의 NIM1 유전자의 DNA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다.
실시예 28
변형된 형태의 NIM1의 생성 - 안키린 도메인
NIM1은 대략 아미노산 103-362에서 안키린 모티프에 대한 상동성을 나타낸다. 문헌: Ho et al. (1989)의 방법을 사용하여, 추정되는 안키린 도메인(서열 1; 3093-3951)을 암호화하는 DNA서열을 NIM1 cDNA(서열 6: 349-1128)로부터 다음 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다(조건: 94℃ 3분: 35x(94℃ 30초: 62℃ 30초: 72℃ 2분): 72℃ 10분): 5'-ggaattcaATGGACTCCAACAACACCGCCGC-3'(서열 31) 및 5'-ggagttcTCAACCTTCCAAAGTTGCTTCTGATG-3'(서열 32). 생성물을 EcoRI로 제한 엔도뉴클레아제 분해시킨 다음 이중 35S 프로모터의 전자 조절하에서 탈포스포릴화된 pCGN1761의 EcoRI 부위중으로 스플라이싱시킨다. 작제물을 서열화하여 합성 개시 코돈(ATG), 인-프레임 종결 코돈(TAG)의 존재를 증명하고 PCR중 다른 돌연변이가 일어나지 않았음을 확인한다. 35S 프로모터, 안키린 도메인 및 tml 종결자를 포함하는 각각의 형질전환 카세트를 XbaI를 사용한 부분 제한 분해에 의해 pCGN1761로부터 방출시키고 탈포스포릴화된 pCIB200의 XbaI 부위에 결합시킨다. 서열 15 및 16은 각각 NIM1의 안키린 도메인의, DNA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다.
실시예 29
키메라성 유전자의 작제
변형된 NIM1 형태의 적합한 공간 및 주기적 발현의 가능성을 증가시키기 위하여, NIM1 프로모터와 유전자를 함유하는 4407 bp HindIII/BamHI 단편(서열 염기 1249-5655) 및/또는 5655 bp EcoRV/BamHI 단편(서열 1: 염기 1-5655)를 상기 실시예 24 내지 28에서 변형된 NIM1 형태의 발생용으로 사용한다. 작제 단계가 상이할 수 있지만, 개념은 상기한 실시예와 필적한다. 변형된 형태의 강력한 과발현은 잠재적으로 치사성일 수 있다. 그러므로, 실시예 24 내지 28에 기재된 변형된 형태의 NIM1 유전자는 비제한적으로 nos 프로모터 또는 Rubisco 프로모터의 작은 서브유니트를 포함하여, 내인성 NIM1 프로모터외의 프로모터의 조절하에 놓을 수 있다. 상기와 같은 발현으로 병원균 침입 또는 다른 SAR-활성화 조건하에서만 변형된 NIM1 형태가 강력하게 발현되도록한다. 또한, 질병 내성은 통상적으로 SAR을 활성화시키지 않아, 피드백 루프를 활성화시키는 SAR 활성화제 화합물(즉, BTH 또는 INA)의 농도로 처리시 PR-1 프로모터 조절하에서 변형된 NIM1 형태를 발현시키는 형질전환체에서 명백할 수 있다(Weymann et al., (1995) Plant Cell 7: 2013-2022).
실시예 30
변형된 형태의 NIM1을 아라비도프시스 탈리아나중으로 형질전환
생성된 작제물(실시예 24 내지 29)을 균주 GV3101중으로 일렉트로포레이션시켜 아그로박테리움 투메파시엔스중으로 이동시킨다. 이들 작제물을 사용하여 진공 침입법(Mindrinos et al., Cell 78, 1089-1099 (1994)) 또는 표준 루트 형질전환법으로 아라비도프시스 생태형 Col-0 및 Ws-0을 형질전환시킨다. 이들 식물로부터 종자를 수확하여 선택제로서 가나마이신(또는 다른 적합한 항생제)이 들어있는 아가판상에서 발아시킨다. 형질전환된 묘만이 선택제를 탈독소화할 수 있어 생존할 수 있다. 선택을 통과여 생존하는 묘목을 토양으로 옮겨 CIM(constitutive immunity) 표현형에 대해 시험한다. 식물을 야생형 식물과 비교하여 관측가능한 표현형 차이를 평가한다.
실시예 31
야생형 NIM1 유전자 또는 변형된 형태의 NIM1 유전자로 형질전환시킨 식물에서 CIM 표현형의 평가
각각의 주요 형질전환체로부터 잎을 수확하여, RNA를 분리하고(Verwoerd et al., 1989, Nuc Acid Res, 2362) 구조적 PR-1 발현에 대해 RNA 블롯 분석(Uknes et al., 1992)에 의해 시험한다. 각각의 형질전환체를 구조적 SAR 발현 분석의 지표인 향상된 질병 내성 반응에 대해 평가한다(Uknes et al., 1992). 양립성 피. 파라시티카 분리물인 Emwa 및 Noco(즉, 이들 진균 균주는 각각 야생형 Ws-0 및 Col-0 식물에서 질병을 일으킨다)로부터 5-104개 포자/㎖을 제조하고, 형질전환체에 형질전환체의 생태형에 따라 적합한 분리물을 분무한다. 접종시킨 식물을 고습도하에서 7일간 배양시킨다. 7일째에 식물의 질병을 평가하고 진균 감염을 측정하기위한 수단을 제공하는 프로브를 이용하는 RNA 블롯 분석용으로 잎 하나를 수확한다.
CIM 표현형을 나타내는 형질전환체를 T1 세대로 하고 동형접합성 식물을 확인한다. 형질전환체를 하기와 같은 질병 내성 시험에 투입한다. Noco 및 Emwa에 대한 진균 감염을 반복하고 잎은 락토페놀 블루로 염색하여 문헌[Dietrich et al., (1994)]에 기재된 바와 같이 진균 균사의 존재를 확인한다. 형질전환체를 세균성 병원균인 슈도모나스 시린개 DC3000으로 감염시켜 문헌[Uknes et al. (1993)]에 기재된 바와 같이 내성의 스펙트럼을 평가한다. 감염되지 않은 식물을 유리 및 글루코오스-접합된 SA 둘다에 대해 평가하고 잎을 락토페놀 블루로 염색하여 미소 병소의 존재에 대해 평가한다. 내성 식물을 유성적으로 SAR 돌연변이체, 예를들면 NahG(미국 특허 제5,614,395호) 및 ndr1과 교배시켜 다른 돌연변이체에 대한 내성 표현형의 상위성 관계를 확립하고 이들 NIM1의 우성-네가티브 돌연변이체가 SA-의존성 피드백 루프에 어떻게 영향을 줄 수 있는지 평가한다.
실시예 32
NIM1 동족체의 분리
중간으로 엄격한 조건하에서 아라비도프시스로부터의 전체 NIM1 유전자, 또는 바람직하게는, 길이가 대략 10개 뉴클레오티드 이상인 이의 암호화 서열의 인접한 영역을 포함하는 아라비도프시스 NIM1 유전자로부터 유래된 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드화되는 NIM1 동족체를 수득할 수 있다. 하이브리드의 안정성에 영향을 주는 인자는 하이브리드화의 엄격도를 결정한다. 그러한 인자중 하나가 융점 Tm으로, 이는 하기 문헌에 제공된 식에 따라서 용이하게 계산할 수 있다: DNA PROGES, George H. Keller and Mark M. Manak, Macmilan Publishers Ltd, 1993, Section one; Molecular Hybridization Technology; page 8 ff. 바람직한 하이브리드화 온도는 약 25℃에서 계산된 융점 온도 Tm 이하의 범위, 바람직하게는 약 12 내지 15℃에서 계산된 융점 온도 Tm 이하의 범위이고, 올리고뉴클레오티드의 경우, 약 5 내지 10℃ 내지 융점 온도 Tm 이하의 범위이다.
프로브로서 NIM1 cDNA(서열 6)을 사용하여, 아라비도프시스 NIM1의 동족체를 비제한적으로 실시예 33에 열거된 것과 같은 상이한 작물로부터의 게놈 또는 cDNA 라이브러리의 선별을 통하여 확인한다. 이를 수행하기위한 표준 기술로는 플레이팅된 DNA 라이브러리의 하이브리드화 선별법(플라크 또는 콜로니; 참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) 및 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 PCR에 의한 증폭법(참조: Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications eds., Academic Press (1990))이 있다. 확인된 동족체를 발현 벡터중으로 유전적으로 조작하여 상기 열거된 작물중으로 형질전환시킨다. 형질전환체를 시험할 작물의 관련 병원균을 사용하여 향상된 질병 내성에 대해 평가한다.
오이, 토마토, 담배, 옥수수, 밀 밍 보리의 게놈중 NIM1 동족체가 DNA 블롯 분석으로 검출되었다. 게놈성 DNA를 오이, 토마토, 담배, 옥수수, 밀 및 보리로부터 분리하여, 효소 BamHI, HindIII, XbaI, 또는 SaII로 제한 분해하여, 0.8% 아가로스 겔상에서 전기영동적으로 분리시켜 모세관 블로팅에 의해 나일론막으로 전달한다. DNA를 고정시키기위하여 UV-가교결합시킨 다음, 낮은 엄격한 조건 [(1% BSA; 520mM NaPO4, pH 7.2; 7% 라우릴 술페이트, 나트륨염; 1mM EDTA; 250mM 염화나트륨) 55℃에서 18 내지 24시간]하에서 상기 막을 32P-방사선표지된 아라비도프시스 탈리아나 NIM1 cDNA와 하이브리드화시킨다. 하이브리드화시킨 다음, 낮은 엄격한 조건 [6XSSC 15분간(X3), 3XSSC 15분간(X1), 55℃; 1XSSC는 0.15M NaCl, 15mM Na-시트레이트(pH 7.0)]하에서 상기 블롯을 세척하고 X-선 필름에 노출시켜 NIM1에 대응하는 밴드를 가시화한다.
또한, NIM1 유전자에 대한 유사성으로 확인된 발현된 서열 태그(EST)을 사용하여 동족체를 분리할 수 있다. 예를들어, 수개의 벼 발현된 서열 태그(EST)가 NIM1 유전자에 대한 유사성을 갖는 것으로 확인되었다. 수개의 다중 서열 정렬을 DNA*[1228 South Park Street, Madison Wisconsin, 53715) Lagergene Biocomputing Software package for the Macintosh (1994)]의 일부로서 Clustal V[Higgins, Desmondg. and Paul M. Sharp (1989), Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer, CABIOS 5:151-153)]를 사용하여 작제한다. NIM1 단백질의 특정 영역은 4개의 상이한 벼 cDNA 단백질 생성물에 대해 아미노산 서열에 있어서 상동성이다. 상기 상동성은 GenBank BLAST 서치중 NIM1 서열을 사용하여 확인한다. NIM1과 벼의 cDNA 생성물에서의 상동성인 영역을 비교한 것을 도 2에 나타냈다(참조, 서열 2 및 서열 17 내지 24). NIM1 단백질 단편은 4개의 벼 생성물과 아미노산 서열이 36 내지 48%가 동일한 것으로 나타났다. 이들 벼의 EST는 다른 단자엽식물로부터 NIM1 동족체를 분리하는데 있어서 필수적으로 유용할 수 있다.
동족체를 또한 PCR로 수득할 수 있다. 이 방법에서는, 공지된 동족체(예, 벼 및 아라비도프시스)간에 비교한다. 아미노산 및 DNA 유사성 또는 동일성이 높은 영역을 사용하여 PCR 프라이머를 만든다. 아미노산 잔기 M 및 W가 풍부한 영역은 이들 아미노산이 제한된 수의 코돈에 의해 암호화되기 때문에 아미노산 잔기, F, Y, C, H, Q, K 및 E가 풍부한 영역 다음에 위치한다. 적합한 영역을 일단 확인한 다음, 상기 영역에 대한 프라이머를 3' 코돈 위치에서 다양하게 치환시킨다. 제3 위치에서의 치환의 다양성은 표적이 되는 종에 따라 억제될 수 있다. 예를들면, 옥수수는 GC가 풍부하기 때문에, 가능한 경우, 따라 제3 위치에서 G 또는 C를 이용하는 프라이머를 디자인한다. PCR 반응을 여러가지 표준 조건하에서 cDNA 또는 게놈성 DNA로부터 수행한다. 밴드가 명확할 경우, 클로닝시키고(시키거나) 서열화하여 NIM1 동족체인지 결정한다.
실시예 33
농작물 식물중에서 NIM1 형태의 발현
Col-0 또는 Ws-0에 CIM 표현형을 부여하는 작제물을 평가용 농작물 식물중으로 형질전환시킨다. 달리, 선행 실시예에서 농작물로붜 분리된 변형된 천연 NIM1 유전자를 각각의 작물중으로 다시 넣는다. NIM1 유전자를 광범위한 부류내에 속하는 어느 식물 세포중으로 삽입할 수 있지만, 벼, 밀, 보리, 라이, 옥수수, 감자, 당근, 고구마, 사탕무, 콩, 완두, 치커리, 레투스, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 순무, 래디쉬, 시금치, 아스파라거스, 양파, 마늘, 가지, 박하, 셀러리, 당근, 스쿼시, 호박, 쥬키니, 오이, 사과, 배, 모과, 멜론, 자두, 체리, 복숭아, 승도 복숭아, 살구, 딸기, 포도, 래스베리, 블랙베리, 파인애플, 아보카도, 파파야, 망고, 바나나, 대두, 담배, 토마토, 사탕수수 및 슈가케인과 같은 농작물 식물 세포에서 특히 유용하다. 형질전환체를 향상된 질병 내성에 대해 평가한다. 본 발명의 바람직한 양태로, NIM1 유전자의 발현은 야생형 식물에서의 천연 NIM1 유전자의 발현 수준보다 2개 이상의 수준이며 바람직하게는 야생형 발현 수준보다 10배 이상이다.
실시예 34
NIM1을 과발현시키는 유전자전이 식물에 통상의 살미생물제를 적용시킴으로써 획득되는 상승적 질병 내성
본 실시예에서 사용되는 식물주(6E 및 7C)는 야생형 아라비도프시스 탈리아나 식물(생태형 Ws)을 실시예 21에 상술된 바와 같이, BamHI-HindIII NIM1 게놈성 단편(서열 1 - 염기 1249-5655)으로 형질전환시킴으로써 발생된다. 습윤성 산제 담체와 함께, 각각 활성 성분(ai) 25%, 80%, 및 70%로 제형화된, 살진균제 메탈락실, 포세틸, 및 수산화구리를 미세 분무로서 NIM1 유전자를 구조적으로 발현시키는 3주된 유전자전이 Ws 식물에 적용한다. 습윤성 산제만을 대조군으로서 도포한다. 3일 경과후, 문헌[Delaney et al. (1995)]에 기술된 바와 같이 식물에 페로노스포라 파라시티카 분리물 Emwa 분생자 현탁액(1-2x105개 포자/㎖)을 접종한다. 접종후, 식물을 피복하여 고습도를 유지하고 주간 14-시간/야간 10-시간 사이클로 17℃의 Percival 성장 챔버중에 넣는다(Uknes et al., 1993). 접종후 8일 경과후 조직을 수확한다.
진균 감염을 12일간 진행시킨 다음 해부 현미경하에서 검사하여 분생포자의 발달을 점수로 매긴다(Delaney, et al. (1994); Dietrich, et al. (1994)). 각 잎을 락토페놀트리판 블루로 염색하여 잎조직내에서의 진균 성장을 관찰한다. 프라이머로서 NS1 및 NS2와 주형으로서 피. 파라시티카 EmWa DNA를 사용하여 문헌[White et al. 1990; PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, 315-322]에 따른 PCR로 수득한 rRNA 진균 프로브를 사용하여 진균 성장을 측정한다. RNA를 페놀/클로로포름 추출에 이어 염화리튬 침전시켜 동결된 조직으로부터 정제한다(Lagrimini et al, 1987: PNAS, 84; 7542-7546). 포름알데히드 아가로스 겔을 통한 전기영동에 의해 샘플(7.5 μg)을 분리시켜 문헌[Ausbel et al. (1987)]에 기술된 바와 같이 나일론 막(Hybond-N+, Amersham)에 블로팅시킨다. 하이브리드화와 세척은 문헌[Church and Gilbert(1984, PNAS, 81:1991-1995)]에 따른다. 제조업자의 지침에 따라서 Phosphor Imager(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 전사물의 상대적인 양을 측정한다. 스트리핑시킨 필터 블롯을 구조적으로 발현된 b-투불린 아라비도프시스 cDNA로 프로브화하여 샘플 부하를 표준화시킨다. 비처리된 식물의 만연은 0% 진균 성장 억제에 대응한다.
메탈락실, 포세틸, 또는 수산화구리를 NIM1을 과발현시키는 식물주에 적용시켜 부가적인 것 보다 더 큰, 즉, 상승적인, 질병-내성 효과를 생산하였다. 이 효과는 상승 인자(SF)로 측정하는데, 이는 관찰된(O) 효과 대 예측된(E) 효과의 비이다. 다음 결과를 수득하였다:
wt = 야생형 Ws
wt = 야생형 Ws
wt = 야생형 Ws
wt = 야생형 Ws
wt = 야생형 Ws
상기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 메탈락실, 포세틸, 및 수산화구리를 적용시킴으로써 NIM1을 과발현시키는 식물에서 상승적인 질병-내성 효과가 증명되었다. 예를들면, 비처리된 NIM1 식물(주 6E)에서, 비처리된 야생형 식물과 상대적으로 10% 진균 성장 억제가 관찰되었으며; 이는 상기 NIM1 과발현체에서의 구조적 SAR 유전자 발현이 질병 내성과 상관있음을 증명하는 것이다. 그러나, 표 37에 나타낸 바와 같이, 면역조절된(SAR-on) NIM1 과발현 식물에 포세틸 5.0g/ℓ(통상적으로 효과에 불충분한 농도)로 적용함으로써, 진균 성장 억제의 관찰된 수준은 93%로 상승하였다. 이들 데이타로부터 계산된 5.5의 상승 인자는 면역조절된(SAR-on) 식물에 살미생물제를 적용시킴으로써 성취되는 상승적 효과를 명백하게 증명한다. 다른 예로, 비처리된 NIM1 식물(주 7C)에서, 비처리된 야생형 식물과 상대적으로 14% 진균 성장 억제가 관찰되었으며; 이는 상기 NIM1 과발현체에서의 구조적 SAR 유전자 발현이 질병 내성과 상관있음을 증명하는 것이다. 그러나, 표 40에서, 면역조절된(SAR-on) NIM1 과발현 식물에 수산화구리 2.0g/ℓ(통상적으로 효과에 불충분한 농도)로 적용함으로써, 진균 성장 억제의 관찰된 수준은 77%로 상승하였다. 이들 데이타로부터 계산된 5.5의 상승 인자는 면역조절된(SAR-on) 식물에 살미생물제를 적용시킴으로써 성취되는 상승적 효과를 명백하게 증명한다.
따라서, 질병 내성을 성취하기 위하여 NIM1을 과발현시키는 면역조절 식물을 낮은, 통상적으로 효과적이지 않은 농도의 화학물질과 함께 사용하면 농업 분야의 숙련가에게 자명한 잇점이 제공된다. 여기서 증명된 상승 잇점을 통하여 통상적으로 독성이거나 달리 바람직하지 못한 농도의 화학물질을 피할 수 있다. 또한, 제시된 수준의 보호를 식물에 제공하는데 필요한 화학물질의 양을 감소시킴으로써 경제적인 잇점을 실현시킬 수 있다.
실시예 35
NIM1을 과발현시키는 유전자전이 식물에 SAR의 화학적 유도인자를 적용시킴으로써 획득되는 상승적인 질병 내성
자체적인 프로모터하에서(실시예 21) NIM1 게놈성 DNA 단편을 함유하는 유전자전이 식물을 또한 야생형 Ws 주와 상대적으로 상이한 농도의 BTH에 대한 반응에 대해 분석한다. 각 식물주로부터의 종자를 파종하여 상기한 바와 같이 성장시킨다. 식재후 대략 3주 경과후, 각 식물주로부터 잎 샘플을 수확하고(0일 대조군), 나머지 식물은 H2O, 10 μM BTH, 또는 100 μM BTH로 처리한다. 처리후 추가의 샘플을 1일, 3일, 5일째에 수확한다. 3일째 샘플 수확후, 각 식물주에 대한 식물 서브세트를 제거하여 상기한 바와 같이 페로노스포라 파라시티카 분리물로 처리한다. 수확한 조직으로부터 RNA를 제조하고 아라비도프시스 PR-1 유전자 프로브를 사용하여 노던 분석을 수행한다. 감염후 8일째에 식물을 진균 내성에 대해 채점한다.
Ws 및 4개의 NIM1-과발현 주(3A, 5B, 6E, 및 7C)에 대한 노던 분석 결과를 도 3에 제시하였다. 야생형 Ws 주에서의 PR-1 유전자 발현은 낮은 수준인 10 μM BTH 처리후(효과를 위해서는 통상적으로 100 내지 300μM의 BTH 농도가 필요하다) 거의 검출할 수 없었다. 상기 처리로부터 Ws 식물은 또한 진균성 병원균인 피. 파라시티카(Emwa)에 대한 감응성이 된다. 그러나, 모든 NIM1-과발현주에서는, 낮은 수준의 BTH 처리후 PR-1 유전자 발현에 대해 더욱 강력한 반응이 있었다. 또한, 10μM BTH로 처리된 NIM1-과발현주 모두가 피. 파라시티카에 대해 완전한 또는 거의 완전한 내성을 나타냈다. 진균의 균사의 존재를 확인하기위하여 락토페놀 블루로 잎을 염색하여(Dietrich et al. (1994)) NIM1-과발현주에서 진균 성장이 부재함을 확인한다. 100μM BTH 처리후 잎 조직중 PR-1 유전자 발현은 또한 야생형 식물과 상대적으로 NIM1-과발현중서 훨씬 더 강력하고 더 신속하다. 따라서, 면역조절 식물은 야생형 식물보다, PR-1 유전자 발현 및 피. 파라시티카에 대한 내성으로 밝혀진 바와 같이, 훨씬 더 신속하고 훨씬 더 낮은 투여량의 BTH에 반응할 수 있다. 이 데이타는 NIM1-과발현 식물과 같은 면역조절된(SAR-on)식물에 BTH와 같은 조직의 후천전 내성의 화학적 유도인자를 적용시킴으로써 상승적 질병 내성을 획득할 수 있음을 증명한다.
따라서, 질병 내성을 성취하기 위하여 NIM1을 과발현시키는 면역조절 식물을 낮은, 통상적으로 효과적이지 않은 농도의, BTH와 같은 SAR-유발 화학물질과 함께 사용하면 농업 분야의 숙련가에게 자명한 잇점이 제공된다. 여기서 증명된 상승 잇점을 통하여 통상적으로 독성이거나 달리 바람직하지 못한 농도의 화학물질을 피할 수 있다. 또한, 제시된 수준의 보호를 식물에 제공하는데 필요한 SAR-유발 화학물질의 양을 감소시킴으로써 경제적인 잇점을 실현시킬 수 있다.
본 발명은 면역조절 식물에 살미생물제를 적용시킴으로써 획득되는 상승적인 질병-내성을 통하여 병원균 침입에 대해 식물을 보호하는 방법에 관한 것이다.
식물은 바이러스, 세균, 진균, 및 선충류를 포함한 광범위한 병원성 미생물에 의해 끊임없이 공격을 받는다. 경작 식물은 통상 유전적으로 균일한 단일재배종으로 성장되기 때문에 특히 공격받기 쉬우며, 질병이 발병할 경우, 손실량이 심각할 수 있다. 그러나, 대부분의 식물은 병원성 미생물에 대해 그들 자체의 선천적인 방어 기작을 갖고 있다. 식물 병원균에 대한 내성에 대해 천연 변이가 식물 육종업자 및 병리학자에 의해 확인되었으며 수많은 경작 식물로 개량되었다. 이들 천연 질병 내성 유전자는 흔히 병원균에 대해 높은 수준의 내성 또는 면역성을 제공한다.
조직전체의 후천적 내성(Systemic acquired resistance)(SAR)은 병원균으로부터 자신을 보호하기위하여 식물이 사용하는 복합 시스템의 성분 중 하나이다(Hunt and Ryals, Crit. Rev. in Plant Sci. 15, 583-606 (1996), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨; Ryals et al., Plant Cell 8, 1809-1819 (1996), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 또한, 미국 특허 제5,614,395호를 참고하며, 이는 본 명세서에서 전문 참고로 인용된다. SAR은 바이러스, 세균, 및 진균을 포함한, 광범위한 스펙트럼의 감염제에 대한 병원균-유발성, 조직 내성이기 때문에 식물-병원균 반응의 특히 중요한 양태이다. SAR 신호전달(signal transduction) 경로가 차단된 경우, 식물은 통상적으로 질병을 일으키는 병원균에 대해 더욱 감응성이 되며, 또한 통상적으로 질병을 일으키지 않는 일부 감염제에 대해 감응성이 된다(Gaffney et al., Science261, 754-756 (1993), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨; Delaney et al., Science 266, 1247-1250 (1994), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨; Delancy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6602-6606 (1995), 본 명세서에 전문 참고로 인용됨; Delaney, Plant Phys. 113, 5-12 (1997), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨; Bi et al., Plant J. 8, 235-245 (1995), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨; Mauch-Mani and Slusarenko, Plant Cell 8, 203-212 (1996), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 이들 관찰은 SAR 신호전달 경로가 식물 건강을 유지하는데 있어서 중요함을 나타낸다.
개념상, SAR 반응은 2개의 단계로 나눌수 있다. 초기 단계에서, 병원균 감염이 인지되고, 신호, 즉 시그날이 방출되어 체관부를 통하여 먼 조직으로 간다. 조직 시그날이 표적 세포에 의해 감지되고, 이는, SAR 유전자 및 질병 내성이 모두 발현됨으로써 반응하게된다. SAR의 유지단계는 수 주로부터 식물의 전체 생존기까지의 기간을 언급하는 것으로, 이때 식물은 준안정기(quasi steady state)에 있으며, 질병 내성이 유지된다(Ryals et al., 1996).
SAR 신호전달을 위해서는 살리실산(SA) 축적이 필요한 것으로 나타났다. 특이적 억제제를 사용한 처리, 페닐알라닌 암모니아-리아제의 발생유전학적 억제, 또는 살리실레이트 하이드록실라제의 전이유전자(transgenic) 발현으로 인하여 SA를 축적시킬 수 없는 식물은 또한 SAR 유전자 발현 또는 질병 내성을 유도시킬 수 없다(Gaffney et al., 1993; Dalaney et al., 1994; Mauch-Mani and Slusarenko 1996; Maher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7802-7806 (1994), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨; Pallas et al., Plant J. 10, 281-293 (1996), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). SA가 조직 시그날로서 작용할 수 있다고 제안된 바 있지만, 지금까지 논쟁의 여지가 있으며, 현재, 어느정도 알려진 것은 SA가 축적될 수 없다면, SAR 신호전달이 차단된다는 것이다(Pallas et al., 1996; Shulaev et al., Plant Cell 7, 1691-1701 (1995), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨; Vernooij et al., Plant Cell 6, 959-965 (1994), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨).
현재, 아라비도프시스(Arabidopsis)가 SAR을 연구하기위한 모델 시스템으로 부상하고 있다(Uknes et al., Plant Cell 4, 645-656 (1992); 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨; Uknes et al., Mol. Plant-Microb Interact. 6, 692-698 (1993), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨; Cameron et al., Plant J. 5, 715-725 (1994), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨; Mauch-Mani and Slusarenko, Mol. Plant-Microbe Interact. 7, 378-383 (1994), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨; Dempsey and Klessig, Bulletin de L'Institut Pasteur 93, 167-186 (1995), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨). SAR은 병원균 및 화학물질, 예를들면, SA, 2,6-디클로로이소니코틴산(INA) 및 벤조[1,2,3]티아디아졸-7-카보티오산-S-메틸 에스테르(BTH)에 의해 아라비도프시스에서 활성화될 수 있다는 것이 증명되었다(Uknes et al., 1992; Vernooij et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 8, 228-234 (1995), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨; Lawton et al., Plant J. 10, 71-82 (1996), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨). INA 또는 BTH으로 처리하거나 병원균 감염시킨후, 내성 개시와 동시에 3개 이상의 발병-관련(PR) 단백질 유전자, 즉, PR-1, PR-2, 및 PR-5가 대등하게 유도된다(Uknes et al., 1992, 1993). 가장 양호하게 특성화된 종인 담배에서, 병원균 또는 면역화 화합물로 처리하면 적어도 9세트의 유전자의 발현이 유도된다(Ward et al., Plant Cell 3, 1085-1094 (1991), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨). 식물을 여러가지 SAR 유전자로 형질전환시켜 유전자전이 질병-내성 식물을 발생시켰다(미국 특허 제5,614,395호).
SAR 신호전달체계를 변형시킨 수많은 아라비도프시스 돌연변이체가 분리되었다(Delaney, 1997). 이들 돌연변이체중 최초의 것이 소위 lsd(lesions simulating disease) 돌연변이체 및 acd2(accelerated cell death)이다(Dietrich et al., Cell 77, 565-577 (1994), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨; Greenberg et al., Cell 77, 551-563 (1994), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨). 이들 돌연변이체는 모두 이들의 잎상에서 어느 정도의 자발적 괴사성 병소 형성, 상승된 수준의 SA, SAR 유전자에 대한 mRNA 축적, 및 확실하게 향상된 질병 내성을 갖는다. 7종 이상의 상이한 lsd 돌연변이체가 분리되어 특성이 확인되었다(Dietrich et al., 1994; Weymann et al., Plant Cell 7, 2013-2022 (1995), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨). 다른 흥미있는 부류의 돌연변이체는 cim(constitutive immunity) 돌연변이체이다(Lawton et al., "The molecular biology of systemic aquired resistance" in Mechanisms of Defence Responses in Plants, B. Fritig and M. Legrand, eds(Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Pubilishers), pp. 422-432 (1993), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨). 본 명세서에서 참고로 전문 인용되는 국제 PCT 출원 WO 94/16077을 또한 참고한다. lsd 돌연변이체 및 acd2와 같이, cim 돌연변이체도 향상된 SA 및 SAR 유전자 발현 및 내성을 갖지만, lsd 및 acd2와는 대조적으로, 이들의 잎상에 검출가능한 병소를 나타내지 않는다. cpr1(constitutive expresser of PR genes)은 cim 돌연변이체 타입일 수 있지만; cpr1의 잎상의 미세 병소의 존재가 배제되지 않기 때문에, cpr1은 lsd 돌연변이체 타입일 수 있다(Bowling et al., Plant Cell 6, 1845-1857 (1994), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨).
SAR 신호체계가 차단된 돌연변이체가 또한 분리되었다. ndr1(non-race-specific disease resistance)는 여러가지 비독성 유전자를 함유하는 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)와 슈도모나스 파라시티카(Pseudomonas parasitica)의 통상적으로 독성이 없는 분리물을 둘다 성장시키는 돌연변이체이다(Century et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6597-6601 (1995), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨). 상기 돌연변이체는 SAR 신호체계가 초기에 차단된 것이 분명하다. npr1(nonexpresser of PR genes)은 INA 처리후 SAR 신호체계 경로의 발현을 유도시킬 수 없는 돌연변이체이다(Cao et al., Plant Cell 6, 1583-1592 (1994), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨). eds(enhanced disease susceptibility) 돌연변이체가 낮은 세균 농도의 접종후 세균 감염을 유지할 수 있는 이들의 능력을 기본으로하여 분리되었다(Glazebrook et al.,genetics 143, 973-982 (1996), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨; Parker et al., Plant Cell 8, 2033-2046 (1996), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨). 특정 eds 돌연변이체는 npr1과 표현형으로 매우 유사하며, 최근에, eds5 및 eds53은 npr1에 대해 대립유전자형인 것으로 밝혀졌다(Glazebrook et al., 1996). nim1(noninducible immunity)은 INA 처리후 피. 파라시티카(즉, 다우니 백분병 유도인자) 성장을 유지시키는 돌연변이체이다(Delaney et al., 1995; WO 94/16077). 병원균 감염후 nim1이 SA를 축적시킬 수 있지만, SAR 유전자 발현 또는 질병 내성을 유도시킬 수 없는데 이는 돌연변이가 SA의 다운스트림 경로를 차단함을 제시하는 것이다. nim1은 또한 INA 또는 BTH에 대한 반응성이 손상되는데, 이는 차단이 이들 화학물질의 작용 다운스트림에 존재함을 제시하는 것이다(Delaney et al., 1995; Lawton et al., 1996). 최근에, 2종의 대립유전자 아라비도프시스 유전자가 분리되여 특성확인이되었는데, 이는 각각 nim1 및 npr1 표현형에 관계된 돌연변이체이다(Ryals et al., Plant Cell 9, 425-439 (1997), 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨; Cao et al., Cell 88, 57-63 (1997), 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 야생형 NIM1 유전자 생성물은 아라비도프시스에 있어서 SAR 및 유전자가 질병 내성 유전자가 되도록하는 신호전달 연속단계(signal transduction cascade)와 관련이 있다(Ryals et al., 1997). 문헌[Ryals et al., 1997]에는 또한 화학적으로 유도된 PR-1 유전자 발현이 약간 손상되고 진균 내성이 매우 강력하게 차단된 것으로부터의 표현형 범위를 나타내는 nim1의 5개의 추가 대립유전자 분리가 보고되어 있다. 야생형 NPR1 유전자를 npr1 돌연변이체로 형질전환시키는 것은 PR-유전자 발현 및 질병 내성에 대한 SAR 유도 반응성을 회복시키는 돌연변이를 보충할 뿐만 아니라, SAR 유도 부재시 피. 시린개에 의한 감염에 대해 더욱 내성인 유전자전이 식물로 만든다(Cao et al., 1997).
NF-КB/IКB 신호전달 경로는 드로소필라(Drosophila)로부터 포유류에 이르기까지 광범위한 생명체에 있어서 질병 내성 반응과 관련있다. 포유류에서, NF-КB/IКB 신호전달은 리포폴리사카라이드, 종양 괴사 인자, 인터류킨 1(IL-1), 또는 바이러스 감염에 대한 세포 노출을 포함하여, 수많은 상이한 자극인자에 의해 유발될 수 있다(Baeuerle and Baltimore, Cell 87, 13-20 (1996); Baldwin, Annu, Rev. Immunol. 14, 649-681 (1996)). 상기 경로가 활성화되면, IL-2, IL-6, IL-8 및 과립구/대식세포-콜로니 자극 인자와 같은, 염증 및 면역 반응에 연루된 수많은 인자를 합성시킨다(deMartin et al., Gene 152, 253-255 (1995)). 유전자전이 마우스 연구에서, NF-КB/IКB 신호전달을 파괴시키면 세균 및 바이러스성 병원균에 대한 감응성이 향상되는 것을 포함하여 면역 반응이 불완전하게 된다(Beg and Baltimore, Science 274, 782-784 (1996); Van Antwerp et al., Science 274, 787-798 (1996); Wang et al., Science 274, 784-787 (1996); Baeuerle and Baltimore (1996)). 아라비도프시스에서, SAR은 질병 내성을 향상시키는 SAR 활성화후 정상적인 내성 과정이 강화되는 염증과 기능적으로 유사하다(Bi et al., 1995; Cao et al., 1994; Delaney et al., 1995; Delaney et al., 1994; Gaffney et al., 1993; Mauch-Mani and Slusarenko 1996; Delaney, 1997). 또한, 상기 경로가 불활성화되면 세균성, 바이러스성 및 진균성 병원균에 대한 감응성이 향상된다. 흥미있게도, SA가 포유동물 세포에서의 NF-КB 활성화를 차단하는 것으로 보고된 반면(Kopp and Ghosh, Science 265, 956-959 (1994), SA는 아라비도프시스에서 신호전달을 활성화시킨다. 드로소필라의 세균성 감염은 세르크로핀 B, 데펜신, 디프테리신 및 드로소마이신과 같은 수많은 항진균 단백질을 합성시키는 신호전달 연속 단계를 활성화시킨다(Ip et al., Cell 75, 753-763 (1993); Lemaitre et al., Cell 86, 973-983 (1996)). 상기 도입은 2개의 NF-КB 동족체인 dorsal 및 dif의 유전자 산물에 따르며, 파리에서, IКB 동족체인 cactus에 의해 억제된다. 항진균 및 항균 단백질의 합성이 감소된 돌연변이체는 감염에 대한 내성이 급격하게 저하된다.
수많은 연구와 식물의 유전자 형질전환을 포함한, 정교하고 집중적인 작물 보호 수단을 사용함에도 불구하고, 질병으로 인한 손실량이 매년 수십억 달러에 달한다. 그러므로, 식물에서 질병 내성에 대한 유전적 기초의 더욱 증대되는 이해를 토대로한 신규한 작물 보호 수단을 개발할 필요가 있다.
상기 관점에서, 본 발명의 바람직한 양태는 면역조절 식물에 살미생물제를 투여함으로써 획득되는 상승적인 질병 내성을 통하여 병원균 침입으로부터 식물을 보호하는 신규한 방법에 관한 것이다. 면역조절 식물은 SAR이 활성화되고, 전형적으로 야생형 SAR 유전자 보다 더 큰 발현을 나타내는 것으로, "SAR-on" 식물로 언급된다. 본 발명의 방법에 사용하기위한 면역조절 식물은 3가지 이상의 상이한 방법: BTH, INA, 또는 SA와 같은 SAR의 화학적 유도인자를 식물에 적용하는 방법; 식물을 SAR 유전자의 구성적(constitutive) 발현 및/또는 질병-내성 표현형을 기본으로하여 선택하는 선택적 육종 프로그램을 통한 방법; 또는 식물을 NIM1 유전자의 작용형과 같은 SAR 유전자 1개 이상으로 형질전환시켜 유전공학적으로 조작하는 방법으로 수득할 수 있다. 면역조절 식물에 투여하는 살미생물제는 살진균제 메탈락실과 같은 통상의 살미생물제일 수 있거나, 선택적 육종법 또는 유전공학을 통해 얻은 면역조절 식물에 투여할 경우, 살미생물제는 BTH, INA, 또는 SA와 같은 SAR의 화학적 유도인자일 수 있다.
면역조절은 식물에 일정 수준의 질병 내성을 제공한다. 마찬가지로, 식물에 살미생물제를 투여하면 일정 수준의 질병 내성을 제공한다. 면역조절과 살미생물제 투여 방법을 함께 사용할 경우에 예측되는 결과는, 질병 내성을 제공하는 상기 각 방법에 의해 제공되는 합산적 방제(pathogen control) 수준을 반영하는 정도의 방제 수준일 것이다. 그러나, 면역조절 식물에 살미생물제를 동시에 적용함으로써, 질병 내성이 놀랍게 상승적으로(synergistically) 향상되는데, 즉, 질병 내성의 수준이 예측되는 질병 내성의 합산적 수준 보다 더 크다.
따라서, 본 발명은 면역조절 식물의 재배와, 적합한 양의 통상의 살미생물제를 식물에 적용하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 양태는 작용성 형태의 NIM1 유전자 또는 이의 동족체 또는 변이체를 함유하고 발현하도록 유전자 조작된 식물에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 면역조절 또는 살미생물제 적용중 하나만을 통하여 수행되는 병원균 방제보다 더 크게 병원균을 방제한다. 면역조절은 식물에 일정한 수준의 질병 내성을 제공한다. 마찬가지로, 살미생물제를 식물에 적용하면 일정 수준의 질병 내성이 식물에 제공된다. 면역조절과 살미생물제 적용을 함께 사용함에 따라 예측되는 결과는 질병 내성을 제공하는 상기 각 방법에 의해 제공되는 합산적 방제 수준을 반영하는 정도의 방제 수준일 것이다. 그러나, 면역조절 식물에 살미생물제를 동시에 적용하면 병원성 질병의 방제는 놀랍게도 상승적으로 향상된다. 즉, 질병 방제의 수준이, 예측되는 질병 내성의 합산적 수준 보다 더 크다.
질병 내성의 향상 이외에, 본 발명의 다른 잇점은 본 발명의 방법에 의해 제공되는 질병 내성 수준을 성취하는데 필요한 살미생물제의 양이 야생형 식물에 대해 통상적으로 필요로 되는 양 보다 더 적다는 것이다. 이 결과는 살미생물제의 경제적 단가를 낮게할 뿐만 아니라, 일부 살미생물제의 독성으로부터 야기되는 환경 오염 가능성을 더 적게한다. 또한, 면역조절 효과와 살미생물제 적용을 결합하여 식물을 보호하는 본 발명의 방법은, 항병원균 활성의 지속기간을 더 길게하고 작물 수율을 더 크게 한다. 본 발명의 다른 잇점은 상기 2가지 방식을 합한 병원균 방제 작용 방식이 서로 완전히 상이하기 때문에, 내성증가로 인한 위협이 효과적으로 방지될 수 있다는 것이다.
따라서, 본 발명은
(a) 제1 수준의 질병 내성을 갖는 면역조절 식물을 제공하는 단계; 및
(b) 상기 면역조절 식물에 제2 수준의 질병 내성을 부여하는 살미생물제 1종 이상 적용하는 단계를 포함하고,
(c) 이에 의해 상기 면역조절 식물에 상기 살미생물제를 적용한것이 제1 및 제2 수준의 질병 내성의 합보다 더 큰, 상승적으로 향상된 제3 수준의 질병 내성을 부여하는, 상승적 질병 내성을 통하여 병원균 침입으로부터 식물을 보호하는 방법에 관한 것이다.
상기 면역조절 식물을 구성적 면역성(cim) 돌연변이 식물인 본 발명에 따른 방법이 바람직하다.
상기 cim 돌연변이 식물을 다음 단계:
(a) 병소 의태적(lesion mimic) 표현형이 결여되었다는 점에서 표현형상 정상인 감염되지 않은 식물에서 SAR 유전자의 발현을 평가하는 단계; 및
(b) 바이러스, 세균, 또는 진균에 의한 감염이 없는 상태하에서 SAR 유전자를 구성적으로 발현하는 감염되지 않은 식물을 선택하는 단계에 따라 식물 집단으로부터 선택하는 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 면역조절 식물이 병소 의태적 돌연변이 식물인, 본 발명에 따르는 방법이 또한 바람직하다.
상기 병소 의태적 돌연변이 식물을, 다음 단계:
(a) 병소 의태적 표현형을 갖는 감염되지 않은 식물에서 SAR 유전자의 발현을 평가하는 단계; 및
(b) 바이러스, 세균, 또는 진균에 의한 감염이 없는 상태하에서 SAR 유전자를 구성적으로 발현하는 감염되지 않은 식물을 선택하는 단계에 따라서 식물 집단으로부터 선택하는 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
식물에서 SAR 유전자를 재조합 발현시켜 상기 면역조절 식물을 수득하는, 본 발명에 따르는 방법이 또한 바람직하다.
상기 SAR 유전자가 작용성 형태의 NIM1 유전자인, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 NIM1 유전자가 식물에서 조직의 후천적 내성을 유도하는 신호전달 연속단계에 연루된 NIM1 단백질을 암호화하는 유전자인, 본 발명에 따르는 방법이 더욱 바람직하다.
상기 NIM1 단백질이 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질인, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 NIM1 유전자를, 다음 조건: 1% BSA; 520mM NaPO4, pH 7.2; 7% 라우릴 술페이트, 나트륨염; 1mM EDTA; 250mM 염화나트륨, 55℃하에서 18 내지 24시간 동안 서열 1에 나타낸 암호화 서열로 하이브리드화시키고, 55℃에서, 6XSSC에서 15분간 세척(X3)하고, 3XSSC에서 15분간 세척(X1)하는 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 NIM1 유전자가 서열 1에 나타낸 암호화 서열 및 약간 엄격한 조건을 사용하여 이와 하이브리드화되는 모든 DNA분자를 포함하는, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 SAR 유전자가 SAR 신호전달 경로의 우성의-네가티브 조절제로서 작용하는 변형된 형태의 NIM1 단백질을 암호화하는 유전자인, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열2의 55 및 59번 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 세린 대신 알라닌을 갖는 단백질인, 본 발명에 따르는 방법이 더욱 바람직하다.
상기 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질인, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 DNA 분자가 서열 7에 나타낸 뉴클레오티드 서열 및 약간 엄격한 조건을 사용하여 이와 하이브리드화되는 모든 DNA분자를 포함하는, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 DNA 분자를, 다음 조건: 1% BSA; 520mM NaPO4, pH 7.2; 7% 라우릴 술페이트, 나트륨염; 1mM EDTA; 250mM 염화나트륨중, 55℃하에서 18 내지 24시간 동안 서열 7에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화시키고, 55℃에서, 6XSSC중에서 15분간 세척(X3)하고, 3XSSC에서 15분간 세척(X1)하는 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 2의 아미노산 위치 대략 1 내지 125에 대응하는 아미노산의 N-말단 절단을 갖는 단백질인, 본 발명에 따르는 방법이 더욱 바람직하다.
상기 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질인, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 DNA 분자가 서열 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열 및 약간 엄격한 조건을 사용하여 이와 하이브리드화되는 모든 DNA분자를 포함하는, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 DNA 분자를, 다음 조건: 1% BSA; 520mM NaPO4, pH 7.2; 7% 라우릴 술페이트, 나트륨염; 1mM EDTA; 250mM 염화나트륨중, 55℃하에서 18 내지 24시간 동안 서열 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화시키고, 55℃에서, 6XSSC에서 15분간 세척(X3)하고, 3XSSC에서 15분간 세척(X1)하는 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 2의 아미노산 위치 대략 522 내지 593에 대응하는 아미노산의 C-말단 절단을 갖는 단백질인, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질인, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 DNA 분자가 서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열 및 약간 엄격한 조건을 사용하여 이와 하이브리드화되는 모든 DNA분자를 포함하는, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 DNA 분자를 다음 조건: 1% BSA; 520mM NaPO4, pH 7.2; 7% 라우릴 술페이트, 나트륨염; 1mM EDTA; 250mM 염화나트륨중, 55℃하에서 18 내지 24시간 동안 서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화시키고, 55℃에서, 6XSSC에서 15분간 세척(X3)하고, 3XSSC에서 15분간 세척(X1)하는 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 2의 아미노산 위치 대략 1 내지 125에 대응하는 아미노산의 N-말단 절단과 서열 2의 아미노산 위치 대략 522 내지 593에 대응하는 아미노산의 C-말단 절단을 갖는 단백질인, 본 발명에 따르는 방법이 더욱 바람직하다.
상기 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질인, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 DNA 분자가 서열 13에 나타낸 뉴클레오티드 서열 및 약간 엄격한 조건을 사용하여 이와 하이브리드화되는 모든 DNA분자를 포함하는, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 DNA 분자를 다음 조건: 1% BSA; 520mM NaPO4, pH 7.2; 7% 라우릴 술페이트, 나트륨염; 1mM EDTA; 250mM 염화나트륨중, 55℃하에서 18 내지 24시간 동안 서열 13에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화시키고, 55℃에서, 6XSSC에서 15분간 세척(X3)하고, 3XSSC에서 15분간 세척(X1)하는 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 2의 아미노산 위치 대략 103 내지 362에 대략 대응하는 안키린 모티프로 필수적으로 이루어진 단백질인, 본 발명에 따르는 방법이 더욱 바람직하다.
상기 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질인, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 DNA 분자가 서열 15에 나타낸 뉴클레오티드 서열 및 약간 엄격한 조건을 사용하여 이와 하이브리드화되는 모든 DNA분자를 포함하는, 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
상기 DNA 분자를 다음 조건: 1% BSA; 520mM NaPO4, pH 7.2; 7% 라우릴 술페이트, 나트륨염; 1mM EDTA; 250mM 염화나트륨중, 55℃하에서 18 내지 24시간 동안 서열 15에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화시키고, 55℃에서, 6XSSC에서 15분간 세척(X3)하고, 3XSSC에서 15분간 세척(X1)하는 본 발명에 따르는 방법이 특히 바람직하다.
본 명세서에 기재된 표시 영역에 대한 표적 작물의 예에는 비제한적으로, 다음과 같은 식물종이 포함된다: 곡류(옥수수, 밀, 보리, 호밀, 오트, 쌀, 사탕수수 및 관련 작물); 첨채류(사탕무 및 마초); 이과, 핵과 및 연과(사과, 배, 자두, 복숭아, 아몬드, 체리, 딸기, 래스베리 및 블랙베리); 콩과 식물(강낭콩, 렌즈콩, 완두콩, 대두); 유과 식물(평지, 겨자, 양귀비, 올리브, 해바라기, 코코넛, 피마자유 식물, 카카오씨, 땅콩); 오이과 식물(강낭콩(marrows), 오이, 멜론); 섬유과 식물(면화, 아마, 대마, 황마); 감귤류 식물(오렌지, 레몬, 그레이프푸르트, 귤); 야채류(시금치, 양상추, 아스파라거스, 양배추, 당근, 양파, 토마토, 감자, 파프리카); 로라세(lauraceae)(아보카도, 계피, 장뇌); 또는 담배, 너트, 커피, 당밀, 차, 포도나무, 호프, 바나나 및 천연 고무 식물과 같은 식물 뿐만 아니라 장식용 식물(꽃, 관목, 활엽수 및 상록수, 예: 침엽수). 상기 목록으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법을 사용하여 비제한적으로 하기의 것들을 포함한, 광범위한 식물 병원균에 대한 내성을 부여할 수 있다: 바이러스 또는 비로이드, 예로서 담배 또는 오이 모자이크 바이러스, 링스포트 바이러스 또는 괴사 바이러스, 펠라르고늄 잎마름 바이러스, 적색 클로버 얼룩 바이러스, 토마토 부시 스턴트 바이러스, 등; 아스코마이세테(Ascomycete) 진균류, 예로서 벤투리아(Venturia), 포도스패라(Podosphaera), 에리시페(Erysiphe), 모놀리니아(Monolinia), 마이코스패렐라(Mycosphaerella), 및 운시눌라(Uncinula) 속; 바시디오마이세테(Basidomycete) 진균류, 예로서 헤밀레이아(Hemileia), 리족토니아(Rhizoctonia), 및 푸치니아(Puccinia) 속; 불완전 진균, 예로서 보트리티스(Botrytis), 헬민토스포륨(Helminthosporium), 린초스포륨(Rhynchosporium), 푸사륨(Fusarium)(즉, F. monoliforme), 셉토리아(Septoria), 세르코스포라(Cercospora), 알터나리아(Alternaria), 피리쿨라리아(Pyricularia), 및 슈도세르코스포렐라 속(Pseudocercosporella; 즉, P. herpotrichoides); 오오마이세테(Oomycete) 진균류, 예로서 피토프토라(Phytophthora; 즉, P. parasitica), 페로노스포라(Peronospora; 즉, P. tabacina), 브레미아(Bremia), 피튬(Pythium), 및 플라스모파라(Plasmopara) 속; 뿐만 아니라 스클레로프토라 매크로스포라(Scleropthora macrospora), 스클레로프토라 레이시애(Sclerophthora rayissiae), 스클레로스포라 그래미니콜라(Sclerospora graminicola), 페로노스클레로스포라 소르기(Peronosclerospora sorghi), 페로노스클레오스포라 필리피넨시스(Peronosclerospora philippinensis), 페로노스클레로스포라 사카리(Peronosclerospora sacchari) 및 페노로스클레로스포라 메이디스(Peronosclerospora maydis), 피조펠라 지아(Peronosclerospora zeae), 세르코스포라 지아-메이디스(Cercospora zeae-maydis), 콜레토트리쿰 그래미니콜라(Colletotrichum graminicola), 지베렐라 지아(Gibberella zeae), 엑세롤륨 투르시쿰(Exserohilum turcicum), 카바티엘루 지아(Kabatielllu zeae) 및 비폴라리스 메이디스(Bipolaris maydis); 세균류, 예로서 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 타박(Pseudomons tabaci), 및 에르위니아 스튜워트(Erwinia stewartii); 곤충류, 예로서 거미, 예를들면 마이조스 페르시캐(Myzus persicae); 및 레피도프테라(lepidoptera), 예로서 헬리오투스종(Helliothus)종; 및 선충류, 예로서 멜로이도가인 인코그니타(Melodogyne incognita).
<면역조절 식물의 수득>
면역조절 식물을 얻기위한 모두 3가지의 다음 일반적인 경로는 문헌: Ryals et al., (1996)에 나타낸 SAR 신호전달 경로에 맞춰진다는 점에서 관련있다. 질병 내성을 성취하기위한 SAR 신호전달 경로가 활성화되면, 동일한 세트의 SAR 유전자가 작동하게되어("turn-on") 하기 기술되는 3가지 경로중 어느것이 채택되는지에 상관없이 질병 내성이 발생된다. 이들 3가지 경로간의 차이점은 단지 경로에 있어서 SAR의 작동이 개시되는 점 뿐이며; 이들 3가지 경로간의 최종 결과는 동일하다. 그러므로, 상기 경로중 하나를 통하여 수득한 면역조절 식물에 대해 관찰된 분석치 및 결과는 외삽하여 상이한 경로를 통하여 수득한 면역조절 식물에 적용시킬 수 있다.
A. 조직의 후천적 내성(SAR)의 화학적 유도인자의 적용
면역조절 식물을 수득하기위한 첫번째 경로는 식물에 SAR을 유도시킬 수 있는 화학물질을 적용하는 것이다. SAR의 특히 강력한 화학적 유도인자는 벤조[1,2,3]티아디아졸-7-카보티오산-S-메틸 에스테르(BTH)와 같은 벤조티아디아졸이다. 조절제로서 사용될 수 있는 또 다른 벤조티아디아졸의 유도체가 미국 특허 제5,523,311호 및 제5,614,395호에 기재되어 있으며, 상기 특허는 본 명세서에서 참고로 인용된다. 여러가지 작물에서 광범위한 스펙트럼의 질병에 대해 야생(field)에서 보호를 제공하는, BTH-유도된 SAR이 문헌[Freidrich et al., Plant Journal 10(1), 61-70 (1996); Lawton et al., Plant Journal 10(1), 71-82 (1996); 및 Goriach et al., Plant Cell 8, 629-643 (1996), 본 명세서에서 참고로 인용됨]에 상세히 기술되어 있다. 본 발명의 방법에 사용하기위한 면역조절 식물을 수득하기위하여 사용할 수 있는 SAR의 다른 화학적 유도인자로는 2,6-디클로로이소니코틴산(INA)과 같은 이소니코틴산 화합물 및 이의 저급 알킬 에스테르, 뿐만 아니라 살리실산 화합물(SA)이 있다. 적합한 INA 및 SA 화합물의 예가 미국 특허 제5,614,395호에 기재되어 있다.
B. 구성적 면역(CIM) 돌연변이 식물의 육종
면역조절 식물을 수득하기위한 두번째 경로는 SAR 유전자의 구성적 발현 및/또는 질병-내성 표현형을 기본으로하는 선택적 육종 프로그램을 통한 것이다. 상당한 양의 데이타가 SAR 유전자의 발현과 조직 후천적 내성간에 강력한 상관관계가 있음을 나타낸다(Ward et al. (1991); Uknes et al. (1992); Uknes et al. (1993); Lawton, et al. (1993); 및 Alexander et al. (1993) PNAS USA 90, 7327-7331, 본 명세서에서 참고로 인용됨). 아라비도프시스에서, 특성이 잘 확인된 SAR 유전자의 예는 PR-1, PR-2 및 PR-5이며, PR-1의 경우 가장 낮은 백그라운드를 가지며 최대 수준으로 발현된다.
SAR 유전자를 구성적으로 발현하는 식물을 동정하여 선택하기 위하여, 노던 분석을 수행하여 SAR 유전자의 발현을 검출한다. 공지된 SAR DNA 서열을 문헌[Uknes et al. (1992)]에 기재된 교잡-하이브리드화 실험에 이용할 수 있다. 핵산 서열의 하이브리드화 및 클로닝 방법은 당해 분야에 숙지되어 있다(참고: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Vol. 1-3, Sambrook et al. (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); 본 명세서에서 참고로 인용됨). SAR 유전자를 구성적으로 발현시키는, 2종 이상의 SAR 신호전달 돌연변이체 부류가 분리되었다. 상기 부류중 하나를 "lsd" 돌연변이체(lsd=lesion simulating disease)로 표시하며, 이는 또한 "cim 부류 I" 돌연변이체로도 언급된다. 참조: WO 94/16077. lsd(cim 부류 I) 돌연변이체는 상승된 농도의 SA, 높은 수준의 PR-1, PR-2 및 PR-5 mRNA가 축적되어 있는 잎상에 자발적 병소를 형성하며, 진균 및 세균성 병원균에 대해 내성이 있다(Dietrich et al., 1994; Weymann et al., 1995). 제2 부류는 "cim"(cim=constitutive immunity) 돌연변이체로 표시되며, 이는 또한 "cim 부류 II" 돌연변이체로도 언급된다. 참조: WO 94/16077. cim 돌연변이체는 자발적 병소를 제외한, lsd 돌연변이체의 특징을 모두 갖는다. 즉, cim 돌연변이체는 가시적으로는 표현형상 정상이다.
SAR 유전자를 구성적으로 발현하는 식물이 일단 선택되면, 육종 프로그램에 이들을 이용하여 식물주내로 SAR 유전자의 구성적 발현과 병원균에 대한 내성을 혼입시킬 수 있다. 추가 교잡을위한 후손을, SAR 유전자의 발현 및 질병 내성 뿐만 아니라 식물 육종 분야의 숙련가에게 숙지된 방법에 따라서 생산 및 품질에 있어서 중요한 다른 특성을 기본으로하여 선택한다. 예를들면, lsd 돌연변이체가 병소 형성과 괴사를 나타내기 때문에, 경우에 따라 lsd 돌연변이체가 사용될 수 있지만, 표현형이 정상인 cim 돌연변이체가 상기와 같은 육종 프로그램 및 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직하다.
C. SAR 유전자를 사용한 식물의 형질전환
면역조절 식물을 수득하기위한 세번째 경로는 식물을 SAR 유전자로, 바람직하게는, 작용성 형태의 NIM1 유전자로 형질전환시키는 것이다.
1. 야생형 NIM1 유전자의 재조합 발현
야생 형태의 NIM1(서열 1)을 재조합 발현시키면, 질병 내성 표현형을 갖는 유전자전이 식물이 발생된다. 참조: 계류중인 미국 특허원 제08/880,179호, 본 명세서에서 참고로 인용됨. 활성 NIM1 단백질의 수준이 증가하면 BTH, INA, 및 SA와 같은 화학물질 유도인자를 사용한 화학적 유도와 동일한 질병-내성 효과가 생긴다. NIM1 유전자의 발현이 야생형 식물에서의 NIM1유전자의 발현 수준 보다 2배 이상인 것이 바람직하고, 야생형 발현 수준 보다 10배 이상인 것이 더욱 바람직하다. "재조합 DNA 기술"이라는 제목하의 섹션에는 유전자전이 식물에서 야생형 NIM1 유전자를 야생형 수준보다 더 높게 재조합적으로 발현시키는데 사용할 수 있는 프로토콜이 기술된다. 또 다르게는, 식물을 야생형 NPR1 유전자로 형질전환시켜 문헌[Cao, et al. (1997)]에 기재된 바와 같은 질병 내성 식물을 생산할 수 있다.
2. 변형된 형태의 NIM1 유전자의 재조합 발현
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 면역조절 식물은 또한, 변형된 형태의 NIM1 유전자의 재조합 발현으로 생성될 수 있는데, 여기서 NIM1 유전자의 변형으로 식물에서의 SAR 경로가 포유동물 및 파리에서 NF-КB/IКB 조절 도식과 기능적으로 대등함을 나타낸다고 인지할 뿐만 아니라, NIM1 유전자 생성물이 포유동물의 신호전달 인자 IКB 서브클래스 α의 구조적 동족체임을 발견하였다. 참조: 계류중인 PCT 출원 "Methods of using the NIM1gene to confer disease resistance in plants"; 본 명세서에서 참고로 인용됨.
NIM1 유전자의 서열(서열 1)을 BLAST 연구에 사용하여, 스펙트린, 안키린, NF-КB 및 IКB와 같은 수많은 단백질에서 발견되는 안키린 도메인에 대한 NIM1 유전자 서열중 고도로 보존되는 도메인의 상동성을 기준으로하여 매치를 확인하였다(Michaely and Bennett, Trends Cell Biol. 2, 127-129 (1992)). NIM1 단백질(서열 2)과 70개의 공지된 안키린-함유 단백질간의 짝맞춤식(pair-wise) 가시적 검사를 수행하여, IКBα 부류의 전사 조절자의 일원에 대해 놀라운 유사성을 발견하였다(Baeuerle and Baltimore 1996; Baldwin 1996). 도 1에 나타낸 바와 같이, NIM1 단백질(서열 2)은 마우스, 래트, 및 돼지로부터의 IКBα 단백질(각각, 서열 3, 4 및 5)과 상당한 상동성을 갖는다. NIM1은 안키린 도메인(도 1에서 밑줄로 표시), 2개의 아미노-말단 세린(NIM1의 아미노산 55 및 59), 한쌍의 리신(NIM1중 아미노산 99 및 100) 및 산성 C-말단을 포함하여, 단백질의 전체 길이를 통하여 IКBα의 수개의 중요한 구조적 도메인을 함유한다. 전체적으로, NIM1과 IКBα은 잔기중 30%가 동일하고 잔기중 50%가 보존적 대체물이다. 따라서, 단백질을 통하여 IКBα와 NIM1간에는 상동성이 있으며, 전체적인 유사성은 80%이다.
신호전달에 있어서 IКBα 단백질이 작용하는 방법중 하나는 사이토졸의 전사 인자 NF-КB에 결합하여 핵으로 들어가는 것을 방지하며 표적 유전자의 전사를 변형시키는 것이다(Baeuerle and Baltimore, 1996; Baldwin, 1996). NF-КB의 표적 유전자는 항바이러스, 항미생물 및 세포 사멸 반응을 포함한, 수개의 세포 공정을 조절한다(활성화시키거나 억제한다)(Baeuerle and Baltimore, 1996). 신호전달 경로가 활성화될 경우, IКBα가 2개의 세린 잔기(마우스 IКBα의 아미노산 32 및 36)에서 포스포릴화된다. 이는 2개의 리신(마우스 IКBα의 아미노산 21 및 22)에 유비퀴틴화시킨다. 유비퀴틴화시킨 다음, IКBα가 분해되고 NF-КB가 핵으로 방출되는 프로테오좀을 통하여 NF-КB/IКB 복합체가 경유한다.
IКBα 기능에 있어서 중요한 포스포릴화된 세린 잔기는 아미노산 35 내지 84로부터 보존된 잔기의 거대한 인접하는 블럭내의 NIM1에서 보존된다(도 1). 이중 리신이 단백질의 N-말단쪽으로 약 15개의 아미노산에 위치하는, IКBα와는 대조적으로, NIM1에서는 이중 리신이 C-말단쪽으로 약 40개의 아미노산에 위치한다. 또한, 기본적인 회전율에 있어서 중요한 것으로 밝혀진 세린/트레오닌 풍부 카복시 말단 영역에서 NIM1과 IКBα 사이에 고도의 상동성이 존재한다(Sun et al., Mol. Cell. Biol. 16, 1058-1065 (1996)). 구조적 상동성 분석 및 IКBα 기능에 있어서 중요한 것으로 공지된 인자의 존재를 기본으로하는 본 발명에 따르면, NIM1은 식물 유전자 조절에 대해 유사한 효과를 갖는, IКBα와 같이 작용하는 것으로 생각된다.
유도인자 화학 물질로 처리시 야생형 NIM1 유전자를 함유하는 식물은 더욱 많은 양의 NIM1 유전자 생성물(IКB 동족체)을 갖거나 NIM1 유전자 생성물(IКB 동족체)의 포스포릴화가 더 적을 것으로 예측된다. 상기 모델에 따르면, 식물의 NF-КB 동족체가 핵에 들어가지 못하도록하고, SAR 유전자 발현 및 내성 반응이 일어나도록 한다. nim1 돌연변이 식물에는, 비-작용성 NIM1 유전자 생성물이 존재한다. 그러므로, 상기 모델에 따르면, NF-КB 동족체는 핵으로 들어가는 것이 자유로와 내성 및 SAR 유전자 발현을 억제한다.
상기 개념과 일치하여, 살리살산으로 처리한 동물 세포는 IКB의 증가된 안정성/다량성과 핵중 활성 NF-КB의 감소를 나타낸다(Kopp andghosh, 1994). IКB의 돌연변이는 초-억제제 또는 우성-네가티브로 작용하는 것으로 공지되어 있다(Britta-Mareen Traenckner et al., EMBO 14:2876-2883 (1995); Brown et al., Science 267: 1485-1488 (1996); Brockman et al., Molecular and Cellular Biology 15:2809-2818 (1995); Wang et al., Science 274: 784-787 (1996)). 이들 형태의 IКB 돌연변이체가 NF-КB에 결합하지만 포스포릴화되거나 유비퀴틴화되지 않으므로 분해되지 않는다. NF-КB는 IКB에 결합된 상태로 남아있어 핵중으로 이동할 수 없다.
상기 관점에서, SAR 신호전달 경로의 우성의-네가티브 조절제로서 작용하는 변형된 형태의 NIM1이 생성될 수 있다. 이들 우성의-네가티브 형태의 NIM1으로 형질전환된 식물은 변형된 형태의 NIM1으로 형질전환된 식물이 구성적 SAR 유전자 발현을 나타내고 따라서 CIM 표현형을 나타내는 nim1 돌연변이 식물과 반대의 표현형을 갖는다. 즉, 유전자전이 식물은 면역조절된다. NIM1 유전자의 위치가 SAR 신호전달 경로에서 유지되기 때문에, 본 명세서에 상술된 것 외에, 수많은 유전자 변형에 의해 SAR 유전자의 구성적 발현이 발생하게 되며, 따라서, CIM 표현형이 될 것으로 생각된다. "재조합 DNA 기술"이란 제목하의 섹션에는 유전자전이 식물에서 변형된 형태의 NIM1 유전자를 야생형 수준 보다 더 높은 수준으로 재조합식으로 발현시키기는데 사용할 수 있는 프로토콜이 기재되어 있다. 하기에 SAR 신호전달 경로의 우성의-네가티브 조절제로서 작용하는 변형된 형태의 NIM1 유전자가 수개 기재되어 있다.
a. 세린 잔기 55 및 59가 알라닌 잔기로의 변화:
IКBα의 자극 활성화된 분해에 의한 NF-КB 활성화에는 사람의 IКBα중 세린 잔기의 포스포릴화가 필요하다. 사람의 IКBα중 세린 잔기(S32 및 S36)가 알라닌 잔기로 돌연변이되면 자극-유발된 포스포릴화가 억제되어, IКBα 프로테오좀-매개된 분해가 차단된다(Traenckner et al., 1995; Brown et al., 1996; Brockman et al., 1995; Wang et al., 1996). 상기 변형된 형태의 IКBα는 세포질중에 NF-КB을 보유하여 다운스트림 시그날화가 일어나는 것을 차단하는 우성의-네가티브 형태로 작용할 수 있다. 도 1에 나타낸 NIM1과 IКB간의 아미노산 서열 비교를 기본으로, NIM1(서열 2)중 세린 55(S55) 및 59(S59)는 사람의 IКBα중 S32 및 S36과 상동성이다. 우성의-네가티브 형태의 NIM1을 작제하기위하여, 아미노산 위치 55 및 59에서의 세린을 알라닌 잔기로 돌연변이시킨다. 따라서, 바람직한 양태에서, NIM1 유전자는 암호화된 생성물이 아라비도프시스 NIM1 아미노산 서열 (서열 2)의 위치 55 및 59에 대응하는 아미노산 위치에서 세린 대신 알라닌을 갖도록 변형되어 있다.
b. N-말단 결실:
유비퀴틴화 리신 잔기 K21 및 K22 뿐만 아니라 포스포릴화 부위 S32 및 S36을 포함하는, 사람의 IКBα중 아미노산 1-36(Brockman et al., 1995; Sun et al., 1996) 또는 1-72(Sun et al., 1996)이 결실되면, 형질감염된 사람의 세포 배양중 우성의-네가티브 IКBα 표현형이 생성된다. NIM1 유전자 생성물의 제1의 125개 아미노산의 N-말단 결실로 상기 논의된 S55 및 S59에서 유비퀴틴화 부위 뿐만 아니라 추정되는 포스포릴화 부위로서 작용할 수 있는 8개의 리신 잔기가 제거된다. 따라서, 바람직한 양태에서, NIM1 유전자는 암호화된 생성물이 천연 아라비도프시스 NIM1 아미노산 서열(서열 2)과 비교하여 대략 첫번째 125개 아미노산이 소실되도록 변형된다.
c. C-말달 결실:
사람의 IКBα중 아미노산 261-317이 결실되면 C-말단중 세린과 트레오닌의 구성적 포스포릴화가 차단됨으로써 고유의 안정성이 향상된다. 상기 변형된 형태의 IКBα가 우성의-네가티브 형태로서 작용할 것으로 예측된다. 세린 및 트레오닌이 풍부한 영역이 NIM1의 C-말단중 아미노산 522-593에 존재한다. 따라서, 바람직한 양태에서, NIM1 유전자는 암호화된 생성물이 천연 아라비도프시스 NIM1 아미노산 서열(서열 2)과 비교하여, 아미노산 522-593을 포함하여, 대략 이의 C-말단 영역이 소실되도록 변형된다.
d. N-말단/C-말단 결실 키메라 및 안키린 도메인
변형된 형태의 NIM1 유전자 생성물이 또한 C-말단 및 N-말단 절편 결실 또는 키메라의 결과로 생산될 수 있다. 본 발명의 다른 양태로, NIM1 유전자로부터 안키린 도메인을 포함하는 작제물이 제공된다.
3. 기타 SAR 유전자의 재조합 발현
본 발명의 방법에 사용하기 위하여 면역조절 식물을 또한 문헌[Ward et al. (1991)]에 기재된 바와 같은 여러가지 SAR 유전자를 재조합 발현시켜 생성시킬 수 있다. 참조[미국 특허 제5,614,395호]에는 1종 이상의 PR-단백질 유전자를 과발현시킴으로써 생성된 질병 내성 식물이 기재되어 있다. 특히 NIM1 유전자 형태의 재조합 발현을 언급하지만, "재조합 DNA 기술"이란 제목하의 섹션에는 유전자전이 식물에서 PR-단백질 유전자와 같은 다른 SAR 유전자를 야생형 수준보다 더 높은 수준으로 재조합식으로 발현시키는데 사용할 수 있는 프로토콜이 기재되어 있다.
<재조합 DNA 기술>
SAR 유전자 발현을 향상시킴으로써 식물에 질병 내성을 부여하는 야생형 또는 변형된 형태의 NIM1 유전자를 통상의 재조합 DNA 기술을 사용하여 식물 세포중으로 혼입시킬 수 있다. 일반적으로, 이는 상기 기술된 선택된 형태의 NIM1을 암호화하는 DNA 분자를 상기 DNA 분자가 이종성인 (즉, 통상적으로 존재하지 않는) 발현 시스템중으로 당해 분야에 공지된 표준 클로닝 공정을 사용하여 삽입시키는 것이다. 벡터는 삽입된 단백질-암호화 서열의 전사 및 해독에 필수적인 요소를 함유한다. 플라스미드, 박테리오파지 바이러스 및 기타 개질된 바이러스와 같은, 당해 분야에 공지된 다수의 벡터 시스템을 사용할 수 있다. 적합한 벡터로는 비제한적으로, 람다 벡터 시스템 λgtl1, λgtl0 및 카론 4와 같은 바이러스성 벡터; pBI121, pBR322, pACY177, pACYC184, pAR 시리즈, pKK223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pRK290, pKC37, pKC101, pCDNA11과 같은 플라스미드 벡터; 및 기타 유사한 시스템이 있다. 발현 시스템의 성분은 또한 발현을 증가시키기 위하여 개질시킬 수 있다. 예를들면, 절단된 서열, 뉴클레오티드 치환 또는 기타 개질을 이용할 수 있다. 본 명세서에 기술된 발현 시스템을 사용하여 적합한 조건하에서 작물 식물을 실제로 형질전환시킬 수 있다. 형질전환된 세포는 선택된 형태의 NIM1 유전자가 유전자전이 식물에서 SAR을 활성화시키도록 전체 식물중에서 재생될 수 있다.
A. 식물 발현 카세트의 작제
유전자전이 식물에서 발현시키고자하는 유전자 서열을 먼저 식물중에서 발현될 수 있는 적합한 프로모터의 뒤에서 발현 카세트중에 포함시킨다. 발현 카세트는 또한 전이유전자의 발현에 필요하거나 선택된 추가의 서열을 포함할 수 있다. 상기와 같은 서열로는 비제한적으로, 전사 종결자(terminator), 인트론과 같은 발현을 향상시키기위한 외인성 서열, 바이탈 서열, 및 특정 세포기관 및 세포 구획에 유전자 생성물을 표적시키기위한 서열이 있다. 이들 발현 카세트는 상기한 식물 형질전환 벡터로 용이하게 전이시킬 수 있다. 하기에는 전형적인 발현 카세트의 여러가지 성분이 기술되어 있다.
1. 프로모터
발현 카세트에 사용되는 프로모터의 선택은 유전자전이 식물중 전이유전자의 공간적 및 주기적 발현 패턴을 결정한다. 선택된 프로모터는 특성 세포 타입(예를들면 잎 표피 세포, 엽육 세포, 뿌리 피층 세포) 또는 특정 조직 또는 기관(예를들면, 뿌리, 잎 또는 꽃)에서 전이유전자를 발현시키며, 선택은 유전자 생성물의 축적의 목적하는 위치를 반영한다. 달리, 선택된 프로모터는 여러가지 유도 조건하에서 유전자의 발현을 유발할 수 있다. 프로모터는 이들의 강도, 즉 전사를 증진시킬 수 있는 능력에 있어서 변화된다. 이용되는 숙주 세포 시스템에 따라서, 수많은 적합한 프로모터중 하나를 사용할 수 있다. 다음은 발현 카세트에 사용할 수 있는 프로모터의 비제한 예이다.
a. 구성적 발현, CaMV 35S 프로모터:
플라스미드 pCGN1761의 작제가 본 명세서에서 참고로 인용되는 공개된 특허원 EP 0 392 225(실시예 23)에 기재되어 있다. pCGN1761는 "이중" CaMV 35S 프로모터와 상기 프로모터와 종결자 사이에 독특한 EcoRI 부위를 갖는 tml 전사 종결자를 함유하며 pUC-타입 골격을 갖는다. 존재하는 EcoRI 부위외에 Notl 및 Xhol 부위를 포함하는 개질된 폴리링커를 갖는 pCGN1761의 유도체를 작제한다. 상기 유도체를 pCGN1761 ENX로 표시한다. pCGN1761 ENX는 유전자전이 식물중에서 35S 프로모터의 조절하에 이들을 발현시키고자하는 폴리링커내에서 cDNA 서열 또는 유전자 서열(미생물 ORF 서열을 포함)을 클로닝시키는데 유용하다. 상기와 같은 작제의 전체 35S 프로모터-유전자 서열-tml 종결자 카세트는 하기 기술되는 바와 같은 형질전환 벡터로 전달하기위해 프로모터에 대해 HindIII, SphI, SaII, 및 XbaI 부위 5' 및 종결자에 대해 XbaI, BamHI 및 BgII 부위 3'에 의해 절제될 수 있다. 또한, 다른 프로모터로 대체시키기위하여, 이중 35S 프로모터 단편을 HindIII, SphI, SaII, XbaI, 또는 PstI를 사용한 5' 절제 및 폴리링커 제한 부위(EcoRI, NotI 또는 XhoI)를 사용한 3' 절제에 의해 제거할 수 있다. 경우에 따라, 해독을 향상시킬 수 있는 서열을 도입시켜 클로닝 부위 주변을 개질시킬 수 있다. 이는 과발현이 바람직할 경우 특히 유용하다. 예를들면, 본 명세서에서 참고로 인용되는 미국 특허 제5,639,949호의 실시예 37에 기재된 바와 같이 해독 개시 부위를 최적화하여 pCGN1761 ENX를 개질시킬 수 있다.
b. 화학적/병원균 조절가능한 프로모터하에서의 발현:
pCGN1761 ENX중 이중 35S 프로모터를 발현 수준을 적합하게 높일 수 있도록 선택된 다른 프로모터로 대체시킬 수 있다. 일례로서, 미국 특허 제5,614,395호에 기재된 화학적으로 조절가능한 프로모터중 하나로 이중 35S 프로모터를 대체시킬 수 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소에 의해 이의 근원으로부터 절제되는 것이 바람직하지만, 달리 적합한 말단 제한 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR-증폭된 것일 수 있다. PCR-증폭시킨 다음, 프로모터를 재-서열화하여 표적 벡터중에서 증폭된 프로모터의 클로닝후 증폭 에러에 대해 체크하여야 한다. 화학적/병원균 조절가능한 담배 PR-1a 프로모터를 플라스미드 pCIB1004(작제용, 본 명세서에서 참고로 인용되는 EP 0 332 104의 실시예 21 참조)로부터 분해하여 플라스미드 pCGN1761 ENX로 옮긴다(Uknes et al., 1992). pCIB1004를 NcoI로 분해하여 생성된 선형화된 단편의 3' 오버행(overhang)을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활 상태로 만든다. 이어서 상기 단편을 HindIII로 분해하여 생성된 PR-1a 프로모터-함유 단편을 겔 정제하고 이중 35S 프로모터가 제거된 pCGN1761 ENX중으로 클로닝시킨다. 이는 XhoI로 분해하고 T4 DNA 폴리머라제로 평활시킨 다음, HindIII로 분해하고 pCIB1004 프로모터가 클로닝되어 있는 단편을 함유하는 더 큰 벡터-종결자를 분리시킴으로써 수행된다. 이로써 PR-1a 프로모터와 tml 종결자 및 독특한 EcoRI 및 NotI 부위를 갖는 개재 폴리링커를 갖는 pCGN1761 ENX 유도체가 생성된다. 선택된 암호화 서열을 상기 벡터중으로 삽입시킬 수 있으며, 융합 생성물(즉, 프로모터-유전자-종결자)을 계속해서 상기한 바와 같은 것들을 포함한, 선택된 형질전환 벡터로 전이시킬 수 있다. 미국 특허 제5,523,311호 및 제5,614,395호에 기재된 벤조티아디아졸, 이소니코틴산, 및 살리실산 화합물을 포함하여, 여러가지 화학적 조절제를 이용하여 본 발명에 따라서 형질전환시킨 식물중에서 선택된 암호화 서열의 발현을 유발시킬 수 있다.
c. 구성적 발현, 액틴 프로모터:
수개의 액틴 동형이 대부분의 세포 타입에서 발현되는 것으로 공지되어 있으며 그 결과 액틴 프로모터가 구성적 프로모터용으로 잘 선택된다. 특히, 벼의 Actl 유전자로부터의 프로모터가 클로닝되어 특징화되어 있다(McElroy et al. Plant Cell 2: 163-171 (1990)). 상기 프로모터의 1.3kb 단편이 벼의 원형질체에서의 발현에 필요한 모든 조절 인자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 또한, Actl 프로모터를 기본으로하는 수많은 발현 벡터가 단자엽식물에서 사용하기위하여 특별하게 작제되었다(McElroy et al. Mol.gen.genet. 231: 150-160 (1991)). 이들은 Actl-인트론 1, Adhl 5' 플랭킹 서열 및 Adh1-인트론 1(옥수수 알코올 탈히드로게나제 유전자로부터 기원) 및 CaMV 35S 프로모터로부터의 서열을 통합하고 있다. 최대 발현을 나타내는 벡터는 35S와 Actl 인트론 또는 Actl 5' 플랭킹 서열과 Actl 인트론의 융합체이다. (GUS 리포터 유전자의) 개시 ATG 주변 서열을 최적화시키면 또한 발현이 향상된다. 문헌[McElroy et al. Mol.gen.genet. 231:150-160 (1991)]에 기술된 프로모터 발현 카세트를 유전자 발현용으로 용이하게 개질시킬 수 있으며 단자엽식물 숙주에서 사용하기에 특히 적합하다. 예를들면, 프로모터-함유 단편을 McElroy 작제로부터 제거하여 pCGN1761 ENX중의 이중 35S 프로모터를 대체시키는데 사용하고, 이후 특정 유전자 서열의 삽입에 이용할 수 있다. 이어서 상기 작제된 융합 유전자를 적절한 형질전환 벡터로 전이시킬 수 있다. 별도의 보고서에서, 제1 인트론을 갖는 벼 Actl 프로모터가 배양된 보리 세포중에서의 높은 발현을 지시하는 것으로 밝혀졌다(Chibbar et al. Plant Cell Rep. 12:506-509 (1993)).
d. 구성적 발현, 유비퀴틴 프로모터
유비퀴틴은 수많은 세포 타입중에서 축적되는 것으로 공지된 다른 유전자 생성물이며 이의 프로모터는 유전자전이 식물에서 사용하기위한 수개의 종으로부터 클로닝되었다(예, 해바라기 - Binet et al. Plant Science 79:87-94 (1991) 및 옥수수 - Christensen et al. Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)). 옥수수 유비퀴틴 프로모터가 유전자전이 단자엽식물 시스템으로 개발되었으며 단자엽식물 형질전환용으로 작제된 이의 서열 및 벡터가 본 명세서에서 참고로 인용되는 특허 공보 EP 0 342 926(Lubrizol)에 기재되어 있다. 문헌[Taylor et al. Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993)]에는 옥수수 유비퀴틴 프로모터와 제1 인트론을 포함하며 미세 발사체 피폭법(microprojectile bombardment)을 통하여 도입시 수많은 단자엽식물의 세포 현탁액중에서 활성이 높은 벡터(pAHC25)가 기재되어 있다. 유비퀴틴 프로모터는 유전자전이 식물, 특히 단자엽식물에서의 유전자 발현에 적합하다. 적합한 벡터는 pAHC25의 유도체 또는 적절한 유비퀴틴 프로모터 및/또는 인트론 서열을 도입시켜 개질시킨, 상기 출원에 기재된 형질전환 벡터중 하나이다.
e. 뿌리 특이적 발현:
다른 패턴의 유전자 발현은 뿌리 발현이다. 적합한 뿌리 프로모터가 프라몬드(Framond; FEBS 290: 103-106 (1991))에 의해 기재되었으며 또한 본 명세서에서 참고로 인용되는 공개된 특허원 EP 0 452 269에 기재되어 있다. 선택된 유전자의 삽입을 위하여 프로모터를 pCGN176ENX와 같은 적합한 벡터로 전이시키고 이어서 전체 프로모터-유전자-종결자 카세트를 해당 형질전환 벡터로 전이시킨다.
f. 상처(wound)-유도성 프로모터:
상처-유도성 프로모터가 또한 유전자 발현에 적합할 수 있다. 수많은 상기와 같은 프로모터가 기재되어 있으며(예, Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Longemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), Warner et al. Plant J. 3: 191-201 (1993)) 본 발명에 따라 사용하기에 적합하다. 로게만 등(Logemann et al.)은 쌍자엽식물인 감자 wunl 유전자의 5' 업스트림 서열을 기술하였다. 수 등(Xu et al.)은 쌍자엽식물인 감자로부터의 상처-유도성 프로모터(pin2)가 단자엽식물이 병에서 활성이라는 것을 밝혔다. 또한, 로마이어 등(Rohrmeier & Lehle)은 상처-유도되며 표준기술을 사용하여 인지되는 프로모터를 분리하는데 사용할 수 있는 옥수수의 Wipl cDNA의 클로닝을 기재하였다. 유사하게, 피렉(Firek et al.)과 워너(Warner et al.)은 단자엽식물인 아스파라거스오피시날리스로부터의 상처-유도된 유전자를 기술하였는데, 이는 국소적인 감긴 병원균 침입 부위에서 발현된다. 당해 분야에 숙지된 클로닝 기술을 사용하여, 이들 프로모터를 적합한 벡터로 전이시키고, 본 발명에 따르는 유전자에 융합시켜, 이들 유전자를 식물의 상처 부위에서 발현시키는데 사용할 수 있다.
g. 수(pith)-우선적 발현:
본 명세서에서 참고로 인용되는, 특허원 WO 93/07278에는 수(pith) 세포에서 우선적으로 발현되는 옥수수의 trpA 유전자의 분리가 기재되어 있다. 전사 개시로부터 -1726 bp 까지 확장되는 유전자 서열 및 프로모터가 제공된다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 상기 프로모터, 또는 이의 일부를 pCGN1761와 같은 벡터로 전이시킬 수 있는데 여기서 35S 프로모터를 대체할 수 있으며 수-우선적 방법으로 외래 유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 사실, 수-우선적 프로모터 또는 이의 일부를 함유하는 단편을 벡터로 전이시켜 유전자전이 식물에서 사용할 수 있도록 개질시킬 수 있다.
h. 잎-특이적 발현
포스포에놀 카복실라제(PEPC)를 암호화하는 옥수수 유전자가 문헌[Hudspeth & Grula; Plant Molec Biol 12:579-589 (1989)]에 기재되어 있다. 표준 분자생물학 기술을 이용하여 상기 유전자에 대한 프로모터를 사용하여 유전자전이 식물에서 잎-특이적 방법으로 유전자의 발현을 유도시킬 수 있다.
2. 전사 종결자
발현 카세트에 사용하기 위한 여러가지 전사 종결자를 입수할 수 있다. 이들은 전이유전자 이후의 전사 종결 및 이의 정확한 폴리아데닐화에 작용한다. 적합한 전사 종결자는 식물에서 작용하는 것으로 공지된 것들이며 CaMV 35S 종결자, tml 종결자, 노팔린 신타제 종결자 및 완두 rbcS E9 종결자가 있다. 이들은 단자엽식물 및 쌍자엽식물 모두에 사용할 수 있다.
3. 발현 향상 또는 조절용 서열
수많은 서열이 전사 단위내로부터 유전자 발현을 향상시키는 것으로 밝혀졌으며 이들 서열은 유전자전이 식물에서 이들의 발현을 증가시키기 위하여 본 발명의 유전자와 관련하여 사용할 수 있다.
여러가지 인트론 서열이 발현, 특히 단자엽식물 세포중에서의 발현을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 예를들면, 옥수수 Adhl 유전자의 인트론은 옥수수 세포중으로 도입시 인식 프로모터하에서 야생형 유전자의 발현을 현저하게 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 인트론 1은 특히 효과적인 것으로 밝혀졌으며 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자와의 융합 작제물에서의 발현을 향상시킨다(Callis et al.,genes Develop. 1:1183-1200 (1987)). 동일한 실험 시스템에서, 옥수수 bronze 1 유전자로부터의 인트론은 발현을 향상시키는데 있어서 유사한 효과를 갖는다. 인트론 서열을 식물 형질전환 벡터중으로, 전형적으로 비-해독된 리더내로 통상적으로 포함시킨다.
바이러스로부터 유래된 수많은 비-해독된 리더 서열이 또한 발현을 향상시키는 것으로 공지되어 있으며, 이들은 쌍자엽식물 세포에서 특히 효과적이다. 상술하면, 담배 모자이크 바이러스(TMV, "W-서열"), 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스(MCMV), 및 알팔파 모자이크 바이러스(AMV)로부터의 리더 서열이 발현을 향상시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다(예, Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15:8693-8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15:65-79 (1990)).
4. 세포내 유전자 생성물의 표적화
유전자 생성물을 표적시키는 여러가지 메카니즘이 식물에 존재하는 것으로 공지되었으며 이들 메카니즘의 기능화를 조절하는 서열이 약간 상세하게 특징화되어 있다. 예를들면, 유전자 생성물을 엽록체에 표적시키는 것은 성숙 단백질을 수득하기 위하여 엽록체로 수송중에 분해되는 여러가지 단백질의 아미노 종결 말단에서 발견되는 시그날 서열에 의해 조정된다(예, Comai et al. J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). 이들 시그날 서열을 이종성 유전자에 융합시켜 이종성 생성물을 엽록체로 수송할 수 있다(van den Broeck, et al. Nature 313:358-363 (1985)). 적합한 시그날 서열을 암호화하는 DNA가 RUBISCO 단백질, CAB 단백질, EPSP 신타제 효소, GS2 단백질 및 엽록체를 편재시키는 것으로 공지된 수많은 다른 단백질을 암호화하는 cDNA의 5' 말단으로부터 분리될 수 있다. 참조: 미국 특허 제5,639,949호의 실시예 37의 "엽록체 표적화를 사용한 발현"이란 제목하의 섹션.
다른 유전자 생성물이 미토콘드리아와 퍼옥시좀과 같은 다른 기관에 편재된다(예, Unger et al. Plant Molec. Biol. 13:411-418 (1989)). 이들 생성물을 암호화하는 cDNA를 또한 조작하여 이종성 유전자 생성물을 이들 기관으로 표적시킬 수 있다. 상기와 같은 서열의 예는 핵-암호화된 ATPase와 미토콘드리아에 대한 특정 아스파테이트 아미노 트랜스퍼라제 동형(isoform)이다. 표적화 세포 단백질체가 문헌에 기재되었다(Rogers et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6512-6516 (1985)).
또한, 유전자 생성물을 다른 세포 구획으로 표적화시키는 서열이 특징화되었다. 아미노 종결 서열은 ER, 아포플라스트로의 표적화, 및 알류론 세포로부터의 세포외 분비에 관련한다(Koehler & Ho, Plant Cell : 769-783 (1990)). 또한, 카복시 종결 서열과 함께 아미노 종결 서열은 유전자 생성물을 액포로 표적시키는데 관여한다(Shinshi et al. Plant Molec. Biol. 14:357-368 (1990)).
상기한 적합한 표적화 서열을 당해 전이유전자 서열에 융합시킴으로써 전이유전자 생성물을 기관 또는 세포 구획으로 지시할 수 있다. 엽록체 표적화의 경우, 예를들면, RUBISCO 유전자, CAB 유전자, EPSP 신타제 유전자, 또는 GS2 유전자로부터의 엽록체 시그날 서열을 전이유전자의 아미노 종결 ATG에 프레임내에서 융합시킨다. 선택된 시그날 서열은 공지된 분해 부위를 포함하여야 하며, 작제된 융합체는 분해에 필요한 분해 부위후의 아미노산을 고려하여야 한다. 일부 경우에 있어서, 상기 요구조건은 분해 부위와 전이유전자 ATG 사이에 적은 수의 아미노산을 첨가하거나, 또는 달리, 전이유전자 서열내의 일부 아미노산을 대체시켜 수행할 수 있다. 엽록체 수송용으로 작제된 융합체시험관내 전사된 작제물을 시험관내 해독시킨 다음 하기 문헌에 기재된 기술을 사용하여 시험관내 엽록체 흡수시켜 엽록체 흡수 효과에 대해 시험할 수 있다: Bartlett et al. In: Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier pp 1081-1091 (1982) 및 Wasmann et al. Mol. Gen. Genet. 205:446-453 (1986). 이들 작제 기술을 당해 분야에 숙지되어 있으며 미토콘드리아 및 퍼옥시좀에도 대등하게 적용시킬 수 있다.
세포 표적에 대해 상기한 메카니즘은 이들의 인지 프로모터와 관련되어서 뿐만 아니라, 이종성 프로모터와 관련해서 이용할 수 있으므로 표적화 시그날이 유래되는 프로모터의 발현 패턴과 상이한 발현 패턴을 갖는 프로모터의 전사 조절하에서 특정 세포-표적화 목표를 수행할 수 있다.
B. 식물 형질전환 벡터의 작제
식물 형질전환에 이용가능한 수많은 형질전환 벡터가 식물 형질전환 기술 분야에서의 숙련가에게 공지되어 있으며, 본 발명에 따른 유전자를 상기와 같은 벡터와 함께 사용할 수 있다. 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환용 표적 종에 따른다. 특정 표적 종의 경우, 상이한 항생제 또는 제초제 선택 마커가 바람직할 수 있다. 형질전환에 통상적으로사용되는 선택 마커로는 가나마이신 및 관련 항생제에 대한 내성을 부여하는, nptll 유전자(Messing & Vierra. Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983), 제초제 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자(White et al., Nucl. Acids Res 18:1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79:625-631 (1990)), 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hph 유전자(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931), 및 메타트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr 유전자(Bourouis et al., EMBO J. 2(7):1099-1104 (1983)), 및 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 EPSPS 유전자(미국 특허 제4,940,935호 및 제5,188,642호)가 있다.
1. 아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터
아그로박테리움 투메파시엔스를 사용한 형질전환에 유용한 수많은 벡터가 있다. 이들은 전형적으로 1개 이상의 T-DNA 보더(border) 서열을 탑재하고 있으며 pBIN 19(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)) 및 pXYZ와 같은 벡터를 포함한다. 이후, 아그로박테리움 형질전환에 적합한 2개의 전형적인 벡터의 작제를 기술한다.
a. pCIB200 및 pCIB2001:
이원성 벡터인 pCIB200 및 pCIB2001은 아그로박테리움과 사용하기위한 재조합 벡터의 작제용으로 사용되며 다음 방법으로 작제한다. 테트라사이클린-내성 유전자가 절제되도록 pTJS75(Schmidhauser & Helinski, J Bacteriol. 164:446-455 (1985))를 Narl 분해시킨 다음, NPTII(Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266-276 (1990))을 탑재하고 있는 pUC4K로부터의 Accl 단편을 삽입시켜 pTJS75kan을 발생시킨다. Xhol 링커를 좌측 및 우측 T-DNA 보더, 식물 선택성 nos/nptll 키메라성 유전자 및 pUC 폴리링커(Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987))를 함유하는 pCIB7의 EcoRV 단편에 연결하고, Xhol-분해된 단편을 Sall-분해된 pTJS75kan중으로 클로닝시켜 pCIB200을 생성시킨다(참조: EP-A-332 104, 실시예 19). pCIB200은 하기 독특한 폴리링커 제한 부위를 함유한다: EcoRI, Sstl, Kpnl, Bglll, Xbal, 및 Sall. pCIB2001은 추가의 제한 부위를 폴리링커중으로 삽입시켜 생성된 pCIB2000의 유도체이다. pCIB2001의 폴리링커중 독특한 제한 부위는 EcoRl, Sstl, Kpnl, Bglll, Xbal, Sall, Mlul, Bcll, Avrll, Apal, Hpal, 및 Stul이다. 이들 독특한 제한 부위를 함유하는 것외에, pCIB2001은 또한 식물 및 세균성 가나마이신 선택, 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위한 좌측 및 우측 T-DNA 보더, 이. 콜리와 다른 숙주간의 이동을 위한 RK2-유래된 trfA 기능, 및 RK2로부터의 OriT 및 OriV 기능을 갖는다. pCIB2001 폴리링커는 자체적인 조절 시그날을 함유하는 식물 발현 카세트를 클로닝하는데 적합하다.
b. pCIB10 및 이의 하이그로마이신 선택 유도체:
이원성 벡터 pCIB10은 식물에서의 선택을 위한 가나마이신 내성을 암호화하는 유전자, T-DNA 우측 및 좌측 보더 서열을 함유하며 이. 콜리 및 아그로박테리움 둘다에서 복제되도록하는 광범위한 숙주-범위 플라스미드 pRK252로부터의 서열을 포함한다. 이의 작제는 문헌[Rothstein et al.,gene 53:153-161 (1987)]에 기재되어 있다. pCIB10의 여러가지 유도체가 작제되었는데 이는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자를 포함하며 문헌[gritz et all., Gene 25:179-188 (1983)]에 기재되어 있다. 이들 유도체는 하이그로마이신 만에 대해(pCIB743), 또는 하이그로마이신과 가나마이신(pCIB715, pCIB717)에 대해 유전자전이 식물을 선택할 수 있도록 한다.
2. 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터
아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하지 않는 형질전환은 선택된 형질전환 벡터중 T-DNA 서열에 대한 필요조건을 피할 수 있으며 따라서 이들 서열이 결여되어 있는 벡터를 T-DNA 서열을 함유하는 상기한 바와 같은 벡터외에 이용할 수 있다. 아그로박테리움에 의존하지 않는 형질전환 기술로는 입자 피폭, 원형질체 흡수(예, PEG 및 일렉트로포레이션) 및 미세주입을 통한 형질전환법이 있다. 벡터의 선택은 주로 형질전환시킬 종에 대해 우선되는 선택에 따른다. 하기에, 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 전형적인 벡터의 작제를 기술한다.
a. pCIB3064:
pCIB3064는 제초제 Basta(또는 포스피노트리신)에 의한 선택과 함께 직접적인 유전자 전달 기술에 적합한 pUC-유래된 벡터이다. 플라스미드 pCIB246은 이. 콜리 GUS 유전자에 기능적으로 융합된 CaMV 35S 프로모터와 CaMV 35S 전사 종결자를 포함하고 공개된 PCT 출원 WO 93/07278에 기재되어 있다. 상기 벡터의 35S 프로모터는 2개의 ATG 서열 5'의 개시 부위를 함유한다. 이들 부위는 ATG를 제거하고 제한 부위 Sspl 및 Pvull을 생성시키는 방법으로 표준 PCR 기술을 사용하여 돌연변이시킨다. 새로운 제한 부위는 독특한 Ssll 부위로부터 96 및 37 bp 떨어져 있고 실제의 개시 부위로부터는 101 및 42 bp 떨어져있다. 생성된 pCIB246의 유도체를 pCIB3025로 표시한다. 이어서, GUS 유전자를 Ssll 및 Sacl로 분해시켜 pCIB3025로부터 절제하고, 말단을 평활 상태로 만들어 재결합시켜 플라스미드 pCIB3060을 생성시킨다. 플라스미드 pJIT82는 다음 기관[John Innes Centre, Norwich]로부터 입수하며 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로부터의 bar 유전자를 함유하는 400 bp Smal 단편을 절제하여 pCIB3060의 Hpal 부위에 삽입한다(Thompson et al. EMBO J 6:2519-2523 (1987)). 이로써 CaMV 35S 프로모터의 조정하에 bar 유전자와 제초제 선택에 대한 종결자, 암피실린 내성에 대한 유전자(이. 콜리중에서의 선택용) 및 독특한 부위 Sphl, Pstl, HindIII, 및 BamHI를 갖는 폴리링커를 포함하는 pCIB3064가 생성된다. 상기 벡터는 자체적인 조절 시그날을 함유하는 식물 발현 카세트의 클로닝에 적합하다.
b. pSOG19 및 pSOG35:
pSOG35는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 선택성 마커로서 이. 콜리 유전자 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)을 이용하는 형질전환 벡터이다. PCR을 사용하여 35S 프로모터(-800 bp), 옥수수 Adh1 유전자로부터의 인트론 6(-550 bp) 및 pSOG10으로부터의 GUS 비해독된 리더 서열의 18 bp를 증폭시킨다. 이. 콜리 디하이드로폴레이트 리덕타제 타입 II 유전자를 암호화하는 250 bp 단편을 또한 PCR로 증폭시키고 이들 2개의 PCR 단편은 pUC19 벡터 주쇄와 노팔린 신타제 종결자로 이루어진 pBI221(Clontech)로부터의 Sacl-Pstl 단편과 조립한다. 이들 단편의 조립으로 pSOG19가 생성되는데 이는 인트론 6 서열과 융합된 35S 프로모터, GUS 리더, DHFR 유전자 및 노팔린 신타제 종결자를 함유한다. pSOG19중의 GUS 리더를 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스(MCMV)로부터의 리더 서열로 대체시키면 벡터 pSOG35가 생성된다. pSOG19 및 pSOG35는 암피실린 내성을 위한 pUC 유전자를 탑재하고 있으며 외래 서열의 클로닝에 이용될 수 있는 Hindlll, Sphl, Pstl 및 EcoRl 부위를 갖는다.
C. 형질전환
해당 암호화 서열을 발현 시스템중으로 일단 클로닝시킨 다음, 식물 세포중으로 형질전환시킨다. 식물의 형질전환 및 재생 방법은 당해 분야에 숙지되어 있다. 예를들면, Ti 플라스미드 벡터가 외래 DNA의 운반, 뿐만 아니라 직접적인 DNA 흡수, 리포좀, 일렉트로포레이션, 미세주입법, 및 미세발사체에 이용되고 있다. 또한, 아그로박테리움속으로부터의 세균을 이용하여 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다. 이후 쌍자엽식물 및 단자엽식물 둘다를 형질전환시키는 대표적인 기술을 기재한다.
1. 쌍자엽식물의 형질전환
쌍자엽식물에 대한 형질전환 기술은 당해 분야에 숙지되어 있으며 아그로박테리움-필수 기술 및 아그로박테리움을 필요로하지 않는 기술이 있다. 비-아그로박테리움 기술은 외인성 유전자 물질을 원형질체 또는 세포에 의해 직접 흡수시키는 것이다. 이는 PEG 또는 일렉트로포레이션 매개된 흡수, 입자 피폭-매개된 운반, 또는 미세주입법으로 수행할 수 있다. 이들 기술의 예가 다음 문헌에 기재되어 있다: Paszkoswski et al., EMBO J 3:2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4:1001-1004 (1986), 및 Klein et al., Nature 327:70-73 (1987). 각 경우 형질전환된 세포를 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 완전한 식물로 재생시킨다.
아그로박테리움-매개된 형질전환이 수많은 상이한 종에 대한 높은 형질전환 효율 및 이의 광범위한 용도 때문에 쌍자엽식물의 형질전환에 바람직한 기술이다. 아그로박테리움 형질전환은 통상적으로 대상이 되는 외래 DNA를 탑재하고 있는 이원성 벡터(예, pCIB200 또는 pCIB2001)를 함께-존재하는 Ti 플라스미드상에 또는 염색체적으로 숙주 아그로박테리움 균주에 의해 탑재된 vir 유전자의 보충물에 따를수 있는 적절한 아그로박테리움 균주[예, pCIB200 및 pCIB2001의 경우 균주 CIB542(Uknes et al. Plant Cell 5: 159-169 (1993)]로 전달시키는 것이다. 재조합 이원성 벡터를 아그로박테리움으로 전달하는 것은 재조합 이원성 벡터를 탑재하고 있는 이. 콜리, pRK2013과 같은 플라스미드를 탑재하고 잇으며 표적 아그로박테리움 균주로 재조합 이원성 벡터를 이동시킬 수 있는 헬퍼 이. 콜리 균주를 사용하는 3 부모 교배(triparental mating) 방법으로 수행한다. 달리, 재조합 이원성 벡터를 DNA 형질전환에 의해 아그로박테리움으로 전달할 수 있다(Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16:9877 (1988)).
재조합 아그로박테리움에 의한 표적 식물종의 형질전환은 통상적으로 아그로박테리움을 식물로부터의 이식물과 함께 배양시킨 다음 당해 분야에 숙지된 공정에 따른다. 형질전환된 조직은 이원성 플라스미드 T-DNA 보더 사이에 존재하는 항생제 또는 제초제 마커를 탑재하고 있는 선택성 배지상에서 재생시킨다.
유전자로 식물 세포를 형질전환시키는 다른 방법은 불활성이거나 생물학적으로 활성인 입자를 식물 조직 및 세포에서 프로펠링시키는 것이다. 이 기술은 미국 특허 제4,945,050호, 제5,036,006호, 및 제5,100, 792호(Sanford et al.)에 기재되어 있다. 일반적으로, 이 공정은 불활성이거나 생물학적으로 활성인 입자를 세포에서 세포의 외피를 관통하여 세포 내부내에 혼입시키기에 효과적인 조건하에서 프로펠링시키는 것이다. 불활성 입자를 사용하는 경우, 목적하는 유전자를 함유하는 벡터로 입자를 피복시켜 세포중으로 벡터를 도입시킬 수 있다. 달리, 벡터가 입제의 웨이크(wake)에 의해 세포내에 함유되도록 표적 세포를 벡터로 감쌀 수 있다. 생물학적으로 활성인 입자(예, 건조된 효모 세포, 건조된 세균 또는 박테리오파지, 이들 각각은 도입시키고자하는 DNA를 함유함)를 식물 세포 조직중으로 프로펠링시킬 수 있다.
2. 단자엽식물의 형질전환
대부분의 단자엽식물종의 형질전환은 현재 통상적인 것이 되었다. 바람직학 기술로는 PEG 또는 일렉트로포레이션 기술, 및 유합조직 조직중으로 입자를 피폭시키는 방법을 사용하여 원형질체중으로 유전자를 직접 전달하는 것이다. 형질전환은 단일 DNA 종 또는 다중 DNA 종(즉, 동시-형질전환)으로 수행할 수 있으며 이들 기술은 둘다 본 발명에 대해 사용하기에 적합하다. 동시-형질전환은 완전한 벡터 작제와 대상이 되는 유전자에 대한 비결합된 좌(loci) 및 선택성 마커를 갖는 유전자전이 식물의 생산을 피할 수 있는 잇점을 가질 수 있으며 후속 재생 단계에서 선택성 마커를 제거할 수 있다는 것이 바람직한 것으로 인지되어야 한다. 그러나, 동시-형질전환을 사용하는데 따른 단점은 빈도가 100% 미만이라는 점인데, 이는 별개의 DNA 종을 게놈중으로 통합시킬 수 있다(Schocher et al. Biotechnology 4: 1093-1096).
특허원 EP 0 292 435, EP 0 392 225 및 WO 93/07/7278에는 옥수수의 우수한 내부육종 주로부터 유합조직와 원형질체의 제조 기술, PEG 또는 일렉트로포레이션을 사용한 원형질체의 형질전환, 및 형질전환된 원형질체로부터 옥수수 식물의 재생 기술이 기술되어 있다. 문헌[Gordon-Kamm et al. (Plant Cell 2:603-618 (1990)) 및 Fromm et al. (Biotechnology 8:833-839 (1990)]에는 입자 피폭법을 사용하여 A188-유래된 옥수수 주의 형질전환 기술이 공개되어 있다. 또한, WO 93/07278 및 코지일 등(Koziel et al.; Biotechnology 11:194-200 (1993))은 입자 피폭법에 의한 우수한 내부육종 옥수수 주의 형질전환 기술이 기재되어 있다. 이 기술은 수분시킨지 14 내지 15일된 옥수수 이삭으로부터 절제된 길이가 1.5 내지 2.5 ㎜인 미성숙 옥수수 배와 충돌용 PDS-1000He Biolistics 장치를 이용한다.
벼의 형질전환은 또한 원형질체 또는 입자 피폭법을 이용하는 직접적인 유전자 전달 기술에 의해 수행할 수 있다. 원형질체-매개된 형질전환이 자포니카(Japonica)-타입 및 인디카(Indica)-타입에 대해 기재되어 있다(Zhang et al. Plant Cell Rep 7:379-384 (1988); Shimamoto et al. Nature 338:274-277 (1989); Datta et al. Biotechnology 8:726-740 (1990)). 상기 두가지 타입은 또한 입자 피폭법을 사용하여 통상적으로 형질전환시킬 수 있다(Christou et al. Biotechnology 9:957-962 (1991)).
특허원 EP 0 332 581에는 포오이데아데(Pooideae) 원형질체의 발생, 형질전환 및 재생에 대한 기술이 기재되어 있다. 이들 기술은 닥틸리스(Dactylis) 및 밀의 형질전환을 가능케한다. 또한, 밀에 대해 입자 피폭법을 사용하여 C형의 장기간 재생가능한 유합조직 세포중으로 형질전환(Vasil et al; Biotechnology 10:667-674 (1992)), 및 미성숙 배 및 미성숙 배-유래된 유합조직의 입자 피폭법을 사용한 밀의 형질전환(Vasil et al; Biotechnology 11:1553-1558 (1993); 및 Weeks et al.; Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993))이 기재되어 있다. 그러나, 밀의 형질전환에 바람직한 기술은 미성숙 배의 입자 피폭에 의해 밀을 형질전환시키는 것으로 유전자 전달전에 높은 슈클로오스 또는 높은 말토오스 단계를 포함한다. 피폭전, 수 많은 배(0.75 내지 1 ㎜ 길이)를 체세포 배를 유도시키기위하여 3% 슈크로오스(Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15:473-497 (1962)) 및 3㎎/ℓ 2,4-D가 보충된 MS 배지상에 플레이팅시킨 다음, 이를 암실에서 진행시킨다. 선택된 피폭날, 배를 유발 배지로부터 제거하여 오스모티쿰(osmoticum; 즉, 목적하는 농도, 전형적으로 15%로 슈크로오스 또는 말토오스가 첨가된 유도 배지)상에 놓는다. 배를 2 내지 3시간 동안 원형질분리시킨 다음 피폭시킨다. 임계적인 것은 아니나, 표적판 당 20개의 배가 전형적이다. 적절한 유전자-탑재 플라스미드(예, pCIB3064 또는 pSG35)를 ㎛ 크기의 금 입자상에 표준 기술을 사용하여 침전시킨다. 각 플레이트의 배를 표준 80 메쉬 스크린을 사용하여 대략 1000 psi의 분출압을 사용하는 DuPont BiolisticsR 헬륨 장치로 발사한다. 피폭후, 배를 다시 암실에 넣어 약 24시간 동안 회복시킨다(오스모티쿰상에서). 24시간후, 배를 오스모티쿰으로부터 제거하여 다시 유발 배지상에 놓는데 여기서 이들은 재생전 약 1개월 동안 머물게 한다. 대략 1개월 경과후 성장하는 배발생성 유합조직를 갖는 배 이식물을, 적합한 선택제(pCIB3064의 경우 10㎎/ℓ 바스타 및 pSOG35의 경우 2㎎/ℓ 메토트렉세이트)를 또한 함유하는 재생 배지(MS + 1㎎/ℓNAA, 5㎎/ℓgA)로 옮긴다. 대략 1개월후, 발달한 발아물(shoots)을 1/2 농도의 MS, 2% 슈크로오스, 및 동일한 농도의 선택제를 함유하는, "GA7"로 공지된 더 큰 멸균 용기로 옮긴다.
더욱 최근에는, 아그로박테리움을 사용한 단자엽식물의 형질전환이 기재되었다. 참조: WO 94/00977 및 미국 특허 제5,591,616호, 본 명세서에서 모두 참고로 인용됨.
<육종>
NIM1 유전자의 형태와 같은 SAR 유전자를 사용한 형질전환을 통하여 수득한 면역조절 식물은 단자엽식물 및 쌍자엽식물을 포함하여, 다양한 식물종일 수 있다; 그러나, 본 발명의 방법에서 사용되는 면역조절 식물은 상기한 농경상 중요한 표적 작물 목록으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 생산 및 품질에 있어서 중요한 다른 특징과 함께 선택된 형태의 NIM1 유전자의 발현을 육종을 통하여 식물주중으로 포함시킬 수 있다. 육종법 및 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 참조: 예를들면, Welsh J. R., Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981); Crop Breeding, Wood D. R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wisconsin (1983); Mayo O., The Theory of Plant Breeding, Second Edition, Clarendon Press, Oxford (1987); Singh, D.P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (2986); 및 Wricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co., Berlin (1986).
상기 언급한 유전자전이 종자 및 식물중으로 조작된 유전자 특성은 유성적 번식 또는 식물성 성장에 의해 전수되어 후손 식물에 유지되어 보급될 수 있다. 일반적으로 상기 유지 및 보급은 경작, 파종 또는 수확과 같은 특정 목적에 맞게 개발된 공지된 농사법을 사용할 수 있도록 한다. 수경재배 또는 온식 기술과 같은 특화된 공정을 또한 적용할 수 있다. 성장하는 작물이 곤충 또는 감염 뿐만 아니라 잡초 식물과의 경쟁으로 야기되는 공격 및 손상을 받기 쉽기 때문에, 잡초, 식물 질병, 곤충, 선충류, 및 수율을 증진시키는데 부정적인 기타 조건을 조정하기위한 수단을 실시한다. 이들로는 토양의 경작 또는 잡초 및 감염된 식물의 제거와 같은 기계적 수단 뿐만 아니라 제초제, 살진균제, 배우자체제거제(gametocides), 살선충제, 성장 조절제, 숙성제 및 살충제와 같은 농약의 사용이 있다.
본 발명에 따라서 유전자전이 식물 및 종자의 유리한 유전자 특성을, 곤충, 제초제, 또는 스트레스에 대한 내성, 향상된 영양 가치, 증가된 수율, 또는 로징(lodging) 또는 파괴로부터의 소실량을 더욱 적게 하는 개선된 구조를 갖는 식물의 개발을 목적으로하는 식물 육종에 사용할 수 있도록한다. 여러가지 육종 단계는 교배시킬 주를 선택하는 것, 부모주의 수분을 지시하는 것, 또는 적절한 후손 식물을 선택하는 것과 같이 잘-정의된 사람의 개입으로 특징된다. 목적하는 특성에 따라서 상이한 육종 수단을 선택한다. 관련 기술은 당해 분야에 숙지되어 있으며 비제한적으로 하이브리드화, 동종번식, 역교배 번식, 다중 번식, 다양성 블렌드, 내부특이적 하이브리드화, 이수성 기술 등이 있다. 하이브리드화 기술로는 기계적, 화학적 또는 생화학적 수단으로 웅성 또는 자성 불임 식물을 생산하기위한 식물의 중성화가 있다. 웅성 불임 식물을 상이한 주의 화분으로 타가 수분시킴으로써 웅성 불임이지만 자성 번식가능한 식물의 게놈이 두 부모주의 특성을 균일하게 수득하도록 한다. 따라서, 본 발명에 따르는 유전자전이 종자 및 식물은 예를들어 제초제 또는 살충제 처리와 같은 통상의 방법의 효과를 증가시키거나 이들의 개질된 유전자 특성으로 인하여 상기 방법을 수행하지 않아도 되는 개량된 식물주의 육종에 사용할 수 있다. 달리, 최적화된 유전자 "장치"로 인하여, 필적하는 나쁜 성장 조건을 견딜 수 없는 생성물 보다 품질이 더욱 우수한 생성물을 수확하도록하는 개선된 스트레스 내성을 갖는 신규한 작물을 수득할 수 있다.
종자 생산에 있어서 종자의 발아 품질과 균일성이 필수적인 생성물 특징인 반면 농부에 의해 수확되어 판매되는 종자의 발아 품질과 균질성은 중요하지 않다. 다른 작물 및 잡초 종자와 따로 보관하기 어렵기 때문에, 종자태생 질병을 구제하고, 발아가 양호한 종자를 생산하기 위해서, 순수한 종자의 성장, 정련 및 판매 분야에 있어서 경험이 풍부한 종자 생산업자에 의해 극히 집중적이고 잘-정의된 종자 생산 관례가 개발되었다. 따라서, 농부가 생산한 작물로부터 수확한 종자를 사용하는 대신 특정 품질 기준을 만족시키는 인증된 종자를 사는것이 농부에 있어서 관례이다. 종자로서 사용될 보급물은 통상적으로 제초제, 살충제, 살진균제, 살균제, 살선충제, 연체동물박멸제(molluscicides) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 보호성 피복물로 처리한다. 통상적으로 사용되는 보호성 피복물은 캅탄, 카르복신, 티람(TMTD: 등록상표), 메탈락실(Apron: 등록상표), 및 피리미포스-메틸(Actellic: 등록상표)과 같은 화합물을 포함한다. 경우에 따라 이들 화합물은 제형 분야에서 통상적으로 이용되는 추가의 담체, 계면활성제 또는 도포-증진 애주번트와 함께 제형화하여 세균성, 진균성 또는 동물 기생충에 의해 야기되는 손상에 대한 보호를 제공한다. 보호성 피복물은 보급물을 액체 제형으로 함침시키거나 합한 습 또는 건 제형으로 피복시켜 적용시킬 수 있다. 발아눈 또는 과실에 직접 처리하는 것과 같은 다른 적용법도 가능하다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따르는 유전자전이 식물, 유전자전이 식물 물질, 또는 유전자전이 종자를 사용함을 특징으로하는 상기 예시된 방법과 같은 신규한 농사법을 제공하는 것이다.
종자는 적합한 포장재로 이루어진 백, 컨테이너 또는 용기에 제공될 수 있으며, 백 또는 컨테이너는 종자를 함유하여 밀폐시킬 수 있다. 백, 컨테이너 또는 용기는 종자를 단기간 또는 장기간 저장, 또는 둘다 할 수 있도록 디자인될 수 있다. 적합한 포장재의 예로는 크라프트지와 같은 종이, 경질 또는 유연 플라스틱 또는 중합체 물질, 유리 또는 금속이 있다. 백, 컨테이너, 또는 용기가 동일하거나 상이한 타입의 다수개의 포장재층으로 이루어진 것이 바람직하다. 하나의 양태로, 물 및 수분이 종자와 접촉하는 것을 배제시키거나 제한하도록 백, 컨테이너 또는 용기를 제공한다. 일례로, 백, 컨테이너 또는 용기를 봉합, 예를들면 열봉합시켜 물 또는 수분이 들어가는 것을 방지한다. 다른 양태로 수분 흡수재를 포장재층 사이 또는 인접한 곳에 배치시킨다. 또 다른 양태로 질병, 오염 또는 기타 종자의 저장 또는 운반에 나쁜 영향을 주는 것을 제한, 억제 또는 방지하기 위하여 백, 컨테이너 또는 용기, 또는 포장재를 처리한다. 상기와 같은 처리의 예로는 멸균, 예를들면 화학적 방법 또는 방사선에 노출시키는 것이 있다. 형질전환된 식물에서 야생형 식물에서의 수준 보다 더 높은 수준으로 발현되는 NIM1 유전자 또는 NIM1 단백질의 형태를 포함하는 유전자전이 식물의 종자를 적합한 담체와 함께 포함하며, 또한 식물에 광범위한 스펙트럼의 질병 내성을 부여하기위하여 이의 사용에 대한 라벨 지침서가 함께 포함되어 있는 상업적 백이 본 발명에 포함된다.
<면역조절 식물로의 살미생물제 적용>
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 식물 보호 방법은 다음 2개의 단계: 첫째, SAR 경로를 활성화시켜 면역조절 식물을 제공하는 단계, 및 둘째, 상기와 같은 면역조절 식물에 살미생물제를 적용시켜 상승적으로 향상된 질병 내성을 획득하는 단계를 포함한다.
A. 통상적인 살미생물제
본 발명의 방법에 따라서, 시판되거나 통상적인 살미생물제를 상기한 3가지 경로중 하나를 통하여 수득한 면역조절 식물에 적용시킬 수 있다. 적합한 살미생물제의 예로는 비제한적으로 다음과 같은 진균제: 4-[3-(4-크로로페닐)-3-(3,4-디메톡시페닐)아크릴로일모르폴린("디메토모르프"), (참조: C. Tomlin(Editor): The Pesticide Manual, 10th edition, Farnhan, UK, 1994, pages 351-352); 5-메틸-1,2,4-트리아졸로[3,4-b][1,3]벤조티아졸("트리사이클라졸"), (참조: C. Tomlin(Editor): The Pesticide Manual, 10th edition, Farnhan, UK, 1994, pages 1017-1018); 3-알릴옥시-1,2-벤조티아졸-1,1-디옥사이드("프로보나졸"), (참조: C. Tomlin(Editor): The Pesticide Manual, 10th edition, Farnhan, UK, 1994, pages 831-832); α-[2-(4-클로로페닐)에틸]-α-(1,1-디메틸에틸)-1H-1,2,4-트리아졸-1-에탄올, ("테부코나졸"), (참조: EP-A-40 345); 1-[[3-(2-클로로페닐)-2-(4-플루오로페닐)옥시란-2-일]메틸]-1H-1,2,4-트리아졸, (에폭시코나졸"), (참조: EP-A-196 038); μ-(4-클로로페닐)-μ-(1-사이클로프로필에틸)-1H-1,2,4-트리아졸-1-에탄올, ("시프로코나졸"), (참조: US-4 664 696); 5-(4-클로로벤질)-2,2-디메틸-1-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일메틸)-사이클로펜타놀, ("메트코나졸"), (참조: EP-A-267 778); 2-(2,4-디클로로페닐)-3-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-프로필-1,1,2,2-테트라플루오로에틸-에테르, ("테트라코나졸"), (참조: EP-A-234 242); 메틸-(E)-2-{2-[6-(2-시아노페녹시)피리미딘-4-일옥시]페닐}-3-메톡시아크릴레이트, ("ICI A 5504", "아족시스트로빈"), (참조: EP-A-382 375); 메틸-(E)-2-메톡시미노-2-[α-(o-톨릴옥시)-o-톨릴]아세테이트, ("BAS 490 F", "크레스옥심 메틸"), (참조: EP-A-400 417); 2-(2-페녹시페닐)-(E)-2-메톡시미노-N-메틸아세트아미드, (참조: EP-A-398 692); [2-(2,5-디메틸페녹시메틸)-페닐]-(E)-2-메톡시미노-N-메틸아세트아미드, (참조: EP-A-398 692); (1R,3S/1S,3R)-2,2-디클로로-N-[(R)-1-(4-클로로페닐)에틸]-1-에틸-3-메틸사이클로프로판카복스아미드, ("KTU 3616"), (참조: EP-A-341 475); 망간 에틸렌비스(디티오카바메이트)중합체-아연 착화합물, ("만코젭"), (참조: US 2974 156); 1-[2-(2,4-디클로로페닐)-4-프로필-1,3-디옥솔란-2-일메틸]-1H-1,2,4-트리아졸, ("프로피코나졸"), (참조:GB-1422657); 1-{2-[2-클로로-4-(4-클로로페녹시)페닐]-4-메틸-1,3-디옥솔란-2-일메틸)-1H-1,2,4-트리아졸, ("디페노코나졸"), (참조:GB-209860); 1-[2-(2,4-디클로로페닐)펜틸-1H-1,2,4-트리아졸, ("펜코나졸"), (참조:GB-1589852); 시스-4-[3-(4-3급-부틸페닐)-2-메틸프로필]-2,6-디메틸모르폴린, ("펜프로피모르프"), (참조: DE 2752135); 1-[3-(4-3급-부틸페닐)-2-메틸프로필]-피페리딘, ("펜프로피딘"), (참조: DE 2752135); 5-사이클로프로필-6-메틸-N-페닐-2-피리미딘아민 ("시프로디닐") (참조: EP-A-310550); (RS)-N-(2,6-디메틸페닐-N-메톡시아세틸)-알라닌 메틸 에스테르("메탈락실"), (참조:GB-1500581); (R)-N-(2,6-디메틸페닐-N-(메톡시아세틸)-알라닌 메틸 에스테르("R-메탈락실"), (참조:GB-1500581); 1,2,5,6-테르라히드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온("피로퀼론"), (참조:GB-1394373); 에틸 수소 포스포네이트("포세틸"), (참조: C. Tomlin(Editor): The Pesticide Manual, 10th edition, Farnhan, UK, 1994, pages 530-532); 및 수산화구리(참조: C. Tomlin(Editor): The Pesticide Manual, 10th edition, Farnhan, UK, 1994, pages 229-230)이 있다.
선택된 살미생물제를 보호하고자하는 면역조절 식물에 추가의 담체, 계면활성제 또는 제형 기술에서 통상적으로 이용되는 기타 도포 증진 애주번트와의 조성물의 형태로 도포하는 것이 바람직하다. 적합한 담체 및 애주번트는 고체 또는 액체일 수 있으며 제형 기술에서 일상적으로 이용되는 물질, 예를들면, 천연 또는 재생된 무기 물질, 용매, 분산제, 습윤제, 농조화제, 희석제, 결합제 또는 비료이다.
바람직한 살미생물 조성물의 적용 방법은 토양위의 식물, 특히 잎에 적용하는 것이다(잎 적용). 적용 빈도 및 비율은 병원균의 생물학적 및 기후 생활 조건에 따른다. 그러나, 식물의 위치가 액체 제형과 함침되는 경우(예, 벼 경작) 또는 살미생물을 고체 형태로 토양중으로, 예를들면 입제의 형태로 도입시키는 경우(토양 적용)살미생물제를 토양 또는 물을 경유하여 뿌리를 통하여 식물에 침입시킬 수 있다(전신적 작용). 종자를 시험하기위하여, 살미생물제를 또한 괴경 또는 곡물을 살미생물제의 액체 제형으로 함침시키거나 이들을 미리 합한 습 또는 건 제형으로 코팅시켜 종자에 도포할 수 있다(코팅). 또한, 특별한 경우, 예를들어, 싹 또는 과실 다발에 직접 처리하는 것과 같은 식물에 도포하는 다른 방법이 가능하다.
살미생물제를 비개질 형태로, 바람직하게는, 제형 기술에서 통상적으로 이용되는 애주번트와 함께 사용할 수 있으며, 따라서, 공지된 방법으로, 예를들면 유화가능한 농축물, 피복가능한 페이스트, 직접 분무가능한 또는 희석가능한 액제, 희석 유제, 습윤성 산제, 가용성 산제, 산제, 입제로, 또는 예를들어 중합체 물질중에 캡슐화하여 제형화한다. 조성물의 성질에 따라서, 분무, 미세분무, 산포, 흩뿌리기, 피복 또는 붓기와 같은 적용법을 의도한 대상 및 경황에 따라 선택한다. 살미생물의 유리한 적용 비율은 통상적으로 50g 내지 2㎏ a.i./ha, 바람직하게는 100g 내지 1000g a.i./ha, 특히 150g 내지 700g a.i./ha이다. 종자를 처리하는 경우, 적용 비율은 종자 100㎏ 당 0.5g 내지 1000g, 바람직하게는 5g 내지 100g a.i.이다.
제형은 공지된 방법으로, 예를들면, 살미생물을 희석제, 예로는 용매, 고체 담체, 및 경우에 따라, 표면-활성 화합물(계면활성제)와 균질하게 혼합 및/또는 마쇄시켜 제조한다.
적합한 용매는 다음과 같다: 방향족 탄화수소, 바람직하게는 탄소수가 8 내지 12인 분획물(예; 크실렌 혼합물 또는 치환된 나프탈렌, 프탈레이트, 예를들면 디부틸 프탈레이트 또는 디옥틸 프탈레이트), 지방족 탄화수소(예; 사이클로헥산 또는 파라핀), 알코올 및 글리콜 및 이들의 에테르 및 에스테르(예; 에탄올, 에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 모노메틸 또는 모토에틸 에테르), 케톤(예; 사이클로헥사논), 강력한 극성 용매(예, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸 술폭사이드 또는 디메틸포름아미드), 뿐만 아니라 식물성 오일 또는 에폭시화된 식물성 오일(예, 에폭시화된 코코넛 오일 또는 대두유); 또는 물.
예를들어 산포제 및 분산성 산제용으로 사용되는 고체 담체는 통상적으로 천연 무기 충진제, 예를들면 방해석, 활석, 카올린, 몬트모릴로나이트 또는 애타펄자이트이다. 물성을 향상시키기 위하여 고도로 분산된 실릭산 또는 고도로 분산된 흡수성 종합체를 가할 수 있다. 적합한 과립화된 흡착성 담체는 다공질 타입, 예를들어, 속돌(pumice), 파쇄된 브릭, 세피올라이트 또는 벤토나이트가 있으며, 적합한 비흡수성 담체는 예를들어, 방해석 또는 모래이다. 또한, 무기 또는 유기성의 수많은 미리과립화한 물질, 예를들어, 특히 돌로마이드 또는 분쇄된 식물 잔기를 사용할 수 있다.
살미생물제의 성질에 따라서, 적합한 표면-활성 화합물은 유화, 분산 및 습윤 특성이 우수한 비이온성, 양이온성 및/또는 음이온성 계면활성제이다. 용어 "계면활성제"는 또한 계면활성제의 혼합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
특히 유리한 적용-촉진 애주번트는 또한 세팔린 및 레시틴 계열의 천연 또는 합성 인지질, 예를들면 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤 및 라이소레시틴이다.
농화학 조성물은 일반적으로 활성 살미생물 성분 0.1 내지 99%, 바람직하게는 0.1 내지 95%, 고체 또는 액체 애주번트 99.9 내지 1%, 바람직하게는 99.9 내지 5%, 및 계면활성제 0 내지 25%, 바람직하게는 0.1 내지 25%를 포함한다.
반면 시판 제품은 농축물로서 제형화된 것이 바람직하며, 최종 사용자가 통상적으로 희석 제형을 이용한다.
B. 식물 활성화 살미생물제
상기한 두번째 또는 세번째 경로(선택적 육종 또는 유전공학)를 통하여 수득한 면역조절 식물에 적용되는 경우, 살미생물제는 달리 미국 특허 제5,523,311호 및 제5,614,395호에 기술된 바와 같은 벤조티아디아졸 화합물, 이소니코틴산 화합물, 또는 살리실산 화합물과 같은 SAR의 화학적 유도인자(식물 활성화 살미생물제)일 수 있다. 따라서, 두가지 면역조절 방법을 동시에 이용한다. 식물 활성화 살미생물제를 선택적 육종 경로 또는 유전공학 경로를 통하여 수득한 면역조절 식물에 적용시킴으로써, "초과-면역조절"이 발생하며, 상승적으로 향상된 질병 내성을 성취하게 된다.
하기 기술되는 바와 같이, NIM1을 과발현시키는 유전자전이 면역조절 식물은 PR-1 유전자 발현 및 피. 파라시티카에 대한 내성에 의해 밝혀진 바와 같이, 야생형 식물보다 훨씬 더 빠르고 훨씬 더 낮은 투여량의 BTH에 대해 반응한다. 참조: 실시예 35 및 도 3의 노던 블롯. NIM1-과발현체에 있어서 상승적으로 향상된 질병 내성은 통상적으로 효과가 전현 충분치 못한 농도인, 단지 10 μM BTH 적용으로 성취될 수 있다. 통상적으로 식물독성이거나 달리 바람직하지못한 농도의 SAR-유도 화학물질은 상기 상승효과의 덕으로 피할 수 있다. 또한, SAR-유도 화학물질을 NIM1-과발현체와 같은 이미-면역조절 식물에 적용시 발생하게되는 SAR 활성화의 시간-경과를 유리하게 변형시킬 수 있다. 또한, 제시된 수준의 식물 보호를 제공하는데 필요한 SAR-유도 화학물질의 양을 감소시킴으로써 경제적인 이득일 현실화될 수 있다.
C. 식물 활성화 살미생물제와 통상의 살미생물제의 병용
훨씬 더 큰 질병 내성을 원하는 경우, 선택적 육종 경로 또는 유전공학 경로를 통하여 수득한 면역조절 식물에 통상의 살미생물제와 식물 활성화 살미생물제를 둘다 적용시킬 수 있다. 이로써 면역조절만을 통하거나, 면역조절과 살미생물중 하나만을 사용한 경우, 또는 두가지 타입의 살미생물제(통상의 살미생물제 및 식물 활성화 살미생물제)의 동시 적용을 통하여 수득한 질병 내성 수준 비교시 훨씬 더 높은 수준의 상승적 질병 내성이 발생한다. 참조: 실시예 19의 표 35.
<질병 내성 평가>
질병 내성 평가는 당해 분야에 공지된 방법으로 수행한다. 참조: Uknes et al, (1993) Molecular Plant Microbe Interactions 6:680-685; Gorlach et al., (1996) Plant Cell 8:629-643; Alexander et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7327-7331 (1993). 예를들어, 수개의 대표적인 질병 내성 검정법을 하기에 기술한다.
A. 피토프토라 파라시티가(Phytophthora parasitica; Black shank) 내성 검정법
검은 꼭지병(black shank)의 원인 미생물인, 피토프토라 파라시티가에 대한 내성의 검정은 문헌[Alexander et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7327-7331 (1993)]에 기재된 바와 같이 6주간 성장시킨 식물에 대해 수행한다. 식물에 물을 주고, 잘 배수시킨 다음, 토양에 포자체 현탁액(300개 포자체/㎖) 10㎖를 적용시켜 접종시킨다. 접종시킨 식물을 23 내지 25℃ 주간 온도, 및 20 내지 22℃ 야간 온도가 유지되는 온실에 보관한다. 상기 검정에 대해 사용되는 시드는 지수(wilt index)는 다음과 같다: 0=징후가 없슴; 1=징후가 없슴; 1=팽창성이 감소되는 것과 함께, 약간 시드는 표시가 있슴; 2=시드는 징후가 명확하나, 썩거나 발육이 멎지는 않음; 3=발육이 멎는 것과 함께 시드는 징후가 명확하지만, 줄기가 썩는 것은 명확치 않음; 4=심하게 시들고, 줄기가 썩는 것을 볼수 있으며 뿌리 시스템에 약간의 손상이 있슴; 5=4의 경우와 마찬가지이나, 식물이 거의 죽거나 죽었으며, 뿌리 시스템이 심하게 감소되었슴. 모든 검정은 랜덤 디자인으로 배열된 식물에 대해 블라인드 방식으로 채점한다.
B. 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 내성 검정법
슈도모나스 시린개 pv. 타바치 균주 #551을 수개의 6 내지 7주된 식물의 하부 잎 2개에 106 또는 3x106/㎖ H2O의 농도로 주사한다. 6개의 각 식물을 각 시점에서 평가한다. 슈도모나스 타바치 감염된 식물은 5점 질병 심화도 스케일로 평가한다: 5=100% 사멸 조직, 0=증상이 없음. 각 날짜의 평가에 대해 T-시험(LSD)을 수행하고 평균 질병 등급 수치 다음에 그룹을 표시한다. 평가날의 동일한 문자 다음의 수치는 통계학적으로 확실히 상이한 것은 아니다.
C. 세르코스포라 니코티아내(Cercospora nicotianae) 내성 검정법
세르코스포라 니코티아내(ATCC #18366)의 포자 현탁액(100,000 내지 150,000 포자/㎖)을 잎 표면상에 바로 분무한다. 식물을 100% 습도에서 5일간 유지시킨다. 이후 식물에 5 내지 10회/일의 비율로 물을 분무한다. 세르코스포라 니코티아내를 질병 증상 기준을 나타내는 잎 영역%로 등급을 매긴다. 각 날짜의 평가에 대해 T-시험(LSD)을 수행하고 평균 질병 등급 수치 다음에 그룹을 표시한다. 평가날의 동일한 문자 다음의 수치는 통계학적으로 확실히 상이한 것은 아니다.
D. 페로노스포라 파라시티카(Peronospora parasitica) 내성 검정법
페로노스포란 파라시티가에 대한 내성을 문헌[Uknes et al, (1993)]에 기술된 바와 같은 식물에 대해 수행한다. 식물을 분생자 현탁액(대략 5x104개 포자/㎖)을 분무하여 피. 파라시티카의 적합성 분리물로 접종시킨다. 접종시킨 식물을 주간 14시간/야간 10시간 사이클로 성장 챔버중 17℃에 습한 조건하에서 배양시킨다. 접종후 3 내지 14일후, 바람직하게는 7 내지 12일후 분생포자의 존재에 대해 식물을 조사한다. 또한, 각 처리로부터 수개의 식물을 랜덤하게 선택하여 현미경 조서를 위하여 락토페놀-트리판 블루(Keogh et al., Trans. Br. Mycol. Soc. 74:329-333 (1980))로 착색시킨다.
<110> Novartis AG <120> Method for protecting plants <130> 5-1998-060300-2 <150> PCT/US 60/034,378 <151> 1996-12-27 <150> PCT/US 60/035,024 <151> 1997-01-10 <160> 32 <170> KOPATIN 1.0 <210> 1 <211> 5655 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear <220> <221> exon <222> (2787)..(3347) <223> product="1st exon of NIM1" <220> <221> exon <222> (3427)..(4162) <223> product="2nd exon of NIM1" <220> <221> exon <222> (4271)..(4474) <223> product="3rd exon of NIM1" <220> <221> exon <222> (4586)..(4866) <223> product="4th exon of NIM1" <220> <221> CDS <222> (2787)..(3347) <220> <221> CDS <222> (3427)..(4162) <220> <221> CDS <222> (4271)..(4474) <220> <221> CDS <222> (4586)..(4866) <400> 1 tgtgatgcaa gtcatgggat attgctttgt gttaagtata caaaaccatc acgtggatac 60 atagtcttca aaccaaccac taaacagtat caggtcatac caaagccaga agtgaagggt 120 tgggatatgt cattgggttt agcggtaatc ggattgaacc ctttccggta taaaatacaa 180 aggctttcgc agtctcggcg tatgtgtatg tctcggggta tctaccattt gaatcacaga 240 acttttatgt gcgaagtttt 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Ile Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val 1 5 10 15 Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala 20 25 30 Val His Tyr Ala Val Gln His Cys Asn 35 40 <210> 20 <211> 27 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Strandedness: not relevant, Topology: not relevant, peptide <400> 20 Arg Arg Pro Asp Ser Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val 1 5 10 15 Ser Pro Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp Gln 20 25 <210> 21 <211> 41 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Strandedness: not relevant, Topology: not relevant, peptide <400> 21 Ile Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val 1 5 10 15 Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala 20 25 30 Val His Tyr Ala Val Gln His Cys Asn 35 40 <210> 22 <211> 27 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Strandedness: not relevant, Topology: not relevant, peptide <400> 22 Arg Arg Pro Asp Ser Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val 1 5 10 15 Ser Pro Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp Gln 20 25 <210> 23 <211> 41 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Strandedness: not relevant, Topology: not relevant, peptide <400> 23 Ile Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val 1 5 10 15 Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala 20 25 30 Val His Tyr Ala Val Gln His Cys Asn 35 40 <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Strandedness: not relevant, Topology: not relevant, peptide <400> 24 Pro Thr Gly Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val Ser Pro 1 5 10 15 Asp Met Val <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, /desc="oligonucleotide" <400> 25 caacagcttc gaagccgtct ttgacgcgcc ggatg 35 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, /desc= "oligonucleotide." <400> 26 catccggcgc gtcaaagacg gcttcgaagc tgttg 35 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, /desc= "oligonucleotide" <400> 27 ggaattcaat ggattcggtt gtgactgttt tg 32 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, /desc= "oligonucleotide" <400> 28 ggaattctac aaatctgtat accattgg 28 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, /desc= "oligonucleotide" <400> 29 cggaattcga tctctttaat ttgtgaattt c 31 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, /desc= "oligonucleotide" <400> 30 ggaattctca acagttcata atctggtcg 29 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, /desc="oligonucleotide" <400> 31 ggaattcaat ggactccaac aacaccgccg c 31 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, /desc= "oligonucleotide" <400> 32 ggaattctca accttccaaa gttgcttctg atg 33

Claims (31)

  1. (a) (i) 식물에서 조직후천적내성(systemic acquired resistance, SAR)을 유도하는 신호전달 연속단계에 관계된 야생형 비유도성면역돌연변이 단백질(non-inducible immunity mutant protein, NIM1 protein)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 (ii) SAR 신호전달경로의 우성-네가티브 조절제로 작용하는 변형된 형태의 NIM1 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 연결되어 작동하는, 식물에서 활성인 프로모토를 포함하는 융합유전자로 형질전환된 식물로서 제1 수준의 질병 내성을 보이는 식물을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 식물에 제2 수준의 질병 내성을 부여하는 살미생물제 1종 이상을 적용하는 단계를 포함하고,
    상기 식물에 상기 살미생물제를 적용한 것이 제1 및 제2 수준의 질병 내성의 합보다 더 큰 상승적으로 향상된 제3 수준의 질병 내성을 부여하는, 병원균 침입으로부터 식물을 보호하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, NIM1 단백질이 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, NIM1 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열 1에 나타낸 암호화 서열을 포함하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 변형된 형태의 NIM1 단백질이, 서열 2의 55번 및 59번 위치에 대응하는 아미노산 위치에 세린 대신 알라닌을 갖는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, NIM1 단백질이 서열 7에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 2의 아미노산 1 내지 125번 위치에 대응하는 아미노산의 N-말단 절단을 갖는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, NIM1 단백질이 서열 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 2의 아미노산 위치 522 내지 593에 대응하는 아미노산의 C-말단 절단을 갖는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, NIM1 단백질이 서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 암호되는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 2의 아미노산 위치 1 내지 125에 대응하는 아미노산의 N-말단 절단 및 서열 2의 아미노산 위치 522 내지 593에 대응하는 아미노산의 C-말단 절단을 갖는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, NIM1 단백질이 서열 13에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 2의 아미노산 위치 103 내지 362에 대응하는 안키린 모티프로 필수적으로 이루어진 방법.
  22. 제21항에 있어서, 변형된 형태의 NIM1 단백질이 서열 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, NIM1 단백질이 서열 15에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 방법.
  24. 제1항, 제9항, 제12항, 제15항, 제18항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, NIM1 단백질이, 1% BSA; 520mM NaPO4, pH 7.2; 7% 라우릴 술페이트, 나트륨염; 1mM EDTA; 250mM 염화나트륨; 55℃에서 18 내지 24시간 동안이라는 조건하에서 서열 1, 7, 9, 11, 13 또는 15에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하이브리드되고 55℃에서 15분간 6XSSC(x3)로, 15분간 3XSSC(x1)로 세척된, 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 방법.
  25. 제1항, 제6항, 제7항, 제9항 및 제10항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서, 살미생물제가 하기 그룹 중에서 선택되는 살진균제인 방법.
    4-[3-(4-클로로페닐)-3-(3,4-디메톡시페닐)아크릴로일]모르폴린("디메토모르프");
    5-메틸-1,2,4-트리아졸로[3,4-b][1,3]벤조티아졸("트리사이클라졸");
    3-알릴옥시-1,2-벤조티아졸-1,1-디옥사이드("프로보나졸");
    α-[2-(4-클로로페닐)에틸]-α-(1,1-디메틸에틸)-1H-1,2,4-트리아졸-1-에탄올, ("테부코나졸");
    1-[[3-(2-클로로페닐)-2-(4-플루오로페닐)옥시란-2-일]메틸]-1H-1,2,4-트리아졸, ("에폭시코나졸");
    α-(4-클로로페닐)-α-(1-사이클로프로필에틸)-1H-1,2,4-트리아졸-1-에탄올, ("시프로코나졸");
    5-(4-클로로벤질)-2,2-디메틸-1-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일메틸)-사이클로펜타놀, ("메트코나졸");
    2-(2,4-디클로로페닐)-3-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-프로필-1,1,2,2-테트라플루오로에틸-에테르, ("테트라코나졸");
    메틸-(E)-2-{2-[6-(2-시아노페녹시)피리미딘-4-일옥시]페닐}-3-메톡시아크릴레이트, ("ICI A 5504", "아족시스트로빈");
    메틸-(E)-2-메톡시미노-2-[α-(o-톨릴옥시)-o-톨릴]아세테이트, ("BAS 490 F", "크레스옥심 메틸");
    2-(2-페녹시페닐)-(E)-2-메톡시미노-N-메틸아세트아미드;
    [2-(2,5-디메틸페녹시메틸)-페닐]-(E)-2-메톡시미노-N-메틸아세트아미드);
    (1R,3S/1S,3R)-2,2-디클로로-N-[(R)-1-(4-클로로페닐)에틸]-1-에틸-3-메틸사이클로프로판카복스아미드, ("KTU 3616");
    망간 에틸렌비스(디티오카바메이트)중합체-아연 착화합물, ("만코젭");
    1-[2-(2,4-디클로로페닐)-4-프로필-1,3-디옥솔란-2-일메틸]-1H-1,2,4-트리아졸, ("프로피코나졸");
    1-{2-[2-클로로-4-(4-클로로페녹시)페닐]-4-메틸-1,3-디옥솔란-2-일메틸)-1H-1,2,4-트리아졸, ("디페노코나졸");
    1-[2-(2,4-디클로로페닐)펜틸-1H-1,2,4-트리아졸, ("펜코나졸");
    시스-4-[3-(4-3급-부틸페닐)-2-메틸프로필]-2,6-디메틸모르폴린, ("펜프로피모르프");
    1-[3-(4-3급-부틸페닐)-2-메틸프로필]-피페리딘, ("펜프로피딘");
    4-사이클로프로필-6-메틸-N-페닐-2-피리미딘아민, ("시프로디닐");
    (RS)-N-(2,6-디메틸페닐-N-메톡시아세틸)-알라닌 메틸 에스테르("메탈락실");
    (R)-N-(2,6-디메틸페닐-N-(메톡시아세틸)-알라닌 메틸 에스테르("R-메탈락실");
    1,2,5,6-테르라히드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온("피로퀼론"); 및
    에틸 수소 포스포네이트("포세틸").
  26. 제25항에 있어서, 살진균제가 메탈락실인 방법.
  27. 삭제
  28. 제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 살미생물제가 벤조티아디아졸 화합물, 이소니코틴산 화합물, 또는 살리실산 화합물 중 하나인 방법
  29. 제1항, 제6항, 제7항, 제9항 및 제10항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서, 2종의 살미생물제를 동시에 식물에 적용하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 살미생물제 중 하나는
    4-[3-(4-클로로페닐)-3-(3,4-디메톡시페닐)아크릴로일]모르폴린("디메토모르프");
    5-메틸-1,2,4-트리아졸로[3,4-b][1,3]벤조티아졸("트리사이클라졸");
    3-알릴옥시-1,2-벤조티아졸-1,1-디옥사이드("프로보나졸");
    α-[2-(4-클로로페닐)에틸]-α-(1,1-디메틸에틸)-1H-1,2,4-트리아졸-1-에탄올, ("테부코나졸");
    1-[[3-(2-클로로페닐)-2-(4-플루오로페닐)옥시란-2-일]메틸]-1H-1,2,4-트리아졸, ("에폭시코나졸");
    α-(4-클로로페닐)-α-(1-사이클로프로필에틸)-1H-1,2,4-트리아졸-1-에탄올, ("시프로코나졸");
    5-(4-클로로벤질)-2,2-디메틸-1-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일메틸)-사이클로펜타놀, ("메트코나졸");
    2-(2,4-디클로로페닐)-3-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-프로필-1,1,2,2-테트라플루오로에틸-에테르, ("테트라코나졸");
    메틸-(E)-2-{2-[6-(2-시아노페녹시)피리미딘-4-일옥시]페닐}-3-메톡시아크릴레이트, ("ICI A 5504", "아족시스트로빈");
    메틸-(E)-2-메톡시미노-2-[α-(o-톨릴옥시)-o-톨릴]아세테이트, ("BAS 490 F", "크레스옥심 메틸");
    2-(2-페녹시페닐)-(E)-2-메톡시미노-N-메틸아세트아미드;
    [2-(2,5-디메틸페녹시메틸)-페닐]-(E)-2-메톡시미노-N-메틸아세트아미드);
    (1R,3S/1S,3R)-2,2-디클로로-N-[(R)-1-(4-클로로페닐)에틸]-1-에틸-3-메틸사이클로프로판카복스아미드, ("KTU 3616");
    망간 에틸렌비스(디티오카바메이트)중합체-아연 착화합물, ("만코젭");
    1-[2-(2,4-디클로로페닐)-4-프로필-1,3-디옥솔란-2-일메틸]-1H-1,2,4-트리아졸, ("프로피코나졸");
    1-{2-[2-클로로-4-(4-클로로페녹시)페닐]-4-메틸-1,3-디옥솔란-2-일메틸)-1H-1,2,4-트리아졸, ("디페노코나졸");
    1-[2-(2,4-디클로로페닐)펜틸-1H-1,2,4-트리아졸, ("펜코나졸");
    시스-4-[3-(4-3급-부틸페닐)-2-메틸프로필]-2,6-디메틸모르폴린, ("펜프로피모르프");
    1-[3-(4-3급-부틸페닐)-2-메틸프로필]-피페리딘, ("펜프로피딘");
    4-사이클로프로필-6-메틸-N-페닐-2-피리미딘아민, ("시프로디닐");
    (RS)-N-(2,6-디메틸페닐-N-메톡시아세틸)-알라닌 메틸 에스테르("메탈락실");
    (R)-N-(2,6-디메틸페닐-N-(메톡시아세틸)-알라닌 메틸 에스테르("R-메탈락실");
    1,2,5,6-테르라히드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온("피로퀼론"); 및
    에틸 수소 포스포네이트("포세틸")의 그룹중에서 선택되는 살진균제이고, 다른 살미생물제는 벤조티아디아졸 화합물, 이소니코틴산 화합물, 또는 살리실산 화합물 중 하나인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 살진균제가 메탈락실이고, 다른 살미생물제가 벤조티아디아졸 화합물인 방법.
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