CN1245537A - 保护植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过将传统杀微生物剂施用于免疫调节植物得到的协同抗病性来保护植物免受病原体侵袭的方法。免疫调节植物是指那些其中SAR被激活因而称为“SAR－开”的植物。免疫调节植物至少可以用三种方法提供:通过将SAR的化学诱导剂如BTH,INA或SA施用于植物;通过基于SAR基因组成型表达和/或抗病性表型的筛选育种方法;或通过用一种或多种SAR基因如NIM1基因的功能形式转化植物。通过将杀微生物剂同时施用于免疫调节植物,抗病性出乎意料地协同增强;即抗病性水平比预期的抗病性加合水平更高。

Description

保护植物的方法

本发明涉及通过将微生物剂施用于免疫调节植物得到的协同抗病性来保护植物免受病原体侵袭的方法。

植物经常受到多种病原生物包括病毒、细菌、真菌和线虫的攻击。农作物植物尤其脆弱因为它们通常作为遗传一致的单一培养物栽培；当疾病攻击时，损失会很严重。然而，大多数植物有抵御病原生物的天然防御机制。植物育种者和病理学家已经鉴定了对植物病原体有抗性的天然变种并培育成了多种农作物植物。这些天然抗病性基因通常产生高水平的抵御病原体的抗性或免疫性。

系统获得性抗性(SAR)是植物用于保护自身免受病原体伤害的复合体系的一个组成成分(Hunt和Ryals，Crit.Rev.in plantSci.15，583-606(1996)，在此引用作为参考；Ryals等，植物细胞8，1809-1819(1996)，在此引用作为参考)。也参见美国专利5,614,395，在此引用作为参考。SAR是植物-病原体发应尤其重要的方面因为它是病原体诱导性的对广泛侵染因子包括病毒，细菌和真菌的系统抗性。当SRA信号转导途径被封闭时，植物对在正常情况下致病的病原体更加敏感，它们对在正常情况不致病的侵染因子也变得敏感(Gaffney等，科学261，754-756(1993)，在此引用作为参考；Delaney等，科学266，1247-1250(1994)，在此引用作为参考；Delaney等，美国国家科学院院报，92，6602-6602(1995)，在此引用作为参考；Delaney，植物生理学113，5-12(1997)，在此引用作为参考；Bi等，植物杂志8，235-245(1995)，在此引用作为参考；Mauch-Mani和Slusarenko，植物细胞8，203-212(1996)，在此引用作为参考)。这些观察表明SAR信号转导途径对于维持植物健康是至关重要的。

概念上，SAR反应可分成两个阶段。在起始阶段，病原体侵染被识别并释放信号，信号通过韧皮部向远端组织传运。靶细胞识别系统信号，并通过SAR基因和抗病性的表达反应。SAR维持阶段是指几周直至植物整个生命过程的一段时间，在这个阶段植物处于准稳定状态，抗病性得以维持(Ryals等，1996)。

水杨酸(SA)积累看来是SAR信号转导必需的。由于用特定抑制剂处理、苯丙氨酸氨裂合酶的后生抑制或水杨酸羟化酶的转基因表达，不能积累SA的植物也不能诱导SAR基因表达或抗病性(Gaffney等，1993；Delaney等，1994；Mauch-Mani和Slusarenko 1996；Maher等，美国国家科学院院报91，7802-7806(1994)，在此引用作为参考；Pallas等，植物杂志10，281-293(1996)，在此引用作为参考)。尽管有人建议SA可能作为系统信号，但目前尚有争议，目前确定的一点是如果SA不能积累，SAR信号转导阻断[Pallas等，1996；Shulaev等，植物细胞7，1691-1701(1995)，在此引用作为参考；Vernooij等，植物细胞6，959-965(1994)，在此引用作为参考]。

最近，拟南芥开始作为研究SAR的模式体系(Uknes等，植物细胞4，645-656(1992)；在此引用作为参考；Uknes等，Mol.plant-Microbe.Interact.6，692-698(1993)，在此引用作为参考；Cameron等，植物杂志5：715-725(1994)，在此引用作为参考；Mauch-Mani和Slusarenko；Mol.plant-Microbe.Interact.7，378-383(1994)，在此引用作为参考；Dempsey和Klessig，Bulletin de L’Institut.Pasteur 93，167-186(1995)，在此引用作为参考)。已经证明，在拟南芥中SAR可被病原体和化学品活化如SA、2，6-二氯异烟酸(INA)和苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯(BTH)(Uknes等，1992；Vernooij等Mol.Plant-Microbe Interact.，8，228-234(1995)，在此引用作为参考；Lawton等，植物杂志10，71-82(1996)，在此引用作为参考)。INA或BTH处理或病原体侵染后，至少有三种病理相关(PR)蛋白基因，即PR-1、PR-2和PR-5与抗性的出现同时协同受到诱导(Uknes等，1992，1993)。在特征了解最清楚的物种烟草中，用病原体或免疫复合物处理诱导至少九套基因的表达(Ward等，植物细胞3，1085-1094(1991)，在此引用作为参考)。已通过用多种SAR基因转化植物制备了转基因抗病植物(美国专利5,614,395)。

已经分离到了具有修饰的SAR信号转导的多种拟南芥突变体(Delaney，1997)。这些突变体中的首批突变体为所谓的lsd(损伤刺激病)突变体和acd2(加速的细胞死亡)(Dietrich等，细胞77，565-577(1994)，在此引用作为参考，Greenberg等，细胞77，551-563(1994)，在此引用作为参考)。这些突变体有在其叶子上某些程度的自发性坏死损伤的形成、升高的SA水平、SAR mRNA的积累以及明显提高的抗病性。至少已分离鉴定了七株不同的lsd突变体(Dietrich等，1994；Weymann等，植物细胞7，2013-2022(1995)，在此引用作为参考)。另一类令人感兴趣的突变体是cim(组成型免疫)突变体(Lawton等，“系统获得性抗性的分子生物学”，于《植物中防御反应机制》中，B.Fritig和M.Legrand编(Dordrecht，The Netherlands：Kluwer Academic Publishers)，第422-432页(1993)，在此引用作为参考)。也见国际PCT申请WO94/16077，在此引用作为参考。与lsd和acd2突变体相同，cim突变体具有升高的SA和SAR基因表达和抗性，而与lsd或acd2不同，它们的叶子上不出现可观察到的损伤。Cpr1(PR基因的组成型表达者)可能是一种类型的cim突变体；然而，因为还未排除叶子上有极微小的损伤，Cpr1可能是一种类型的lsd突变体(Bowling等，植物细胞6，1845-1857(1994)，在此引用作为参考)。

也分离到了SAR信号通路被阻断的突变体。ndr1(非种特异性抗病性)是允许包含各种无毒基因的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和寄生霜霉(Peronospora parasitica)的正常无毒菌株生长的突变体(Century等，美国国家科学院院报92，6597-6601(1995)，在此引用作为参考)。很明显，这个突变体在SAR信号通路早期被阻断。npr1(PR基因的非表达者)是经INA处理后不能诱导SAR信号途径表达的突变体(Cao等，植物细胞6，1583-1592(1994)，在此引用作为参考)。eds(增强的疾病易感性)已根据其在接种低细菌浓度后能够支持细菌侵染的能力得到分离(Glazebrook等，遗传学143，973-982(1996)，在此引用作为参考；Parker等，植物细胞8，2033-2046(1996)，在此引用作为参考)。某些eds突变体表型上与npr1很相似，并且最近表明eds5和eds53与npr1是等位的(Glazebrook等，1996)。nim1(非诱导型免疫)是在INA处理后支持寄生霜霉(即霜霉病的致病因子)生长的突变体(Delaney等，1995；WO94/16077)。尽管病原体侵染后nim1能够积累SA，但是它不能诱导SAR基因表达或抗病性，表明突变阻断了SA下游途径。nim1对INA或BTH反应的能力也受到损伤，表明阻断存在于这些化学品作用的下游(Delaney等，1995；Lawton等，1996)。

最近，分离和鉴定了两个拟南芥等位基因，它们是分别负责nim1和npr表型的突变体(Ryals等，植物细胞9，425-439(1997)，在此引用作为参考；Cao等，细胞88，57-63(1997)，在此引用作为参考)。野生型NIM1基因产物参与了拟南芥中引起SAR和基因对基因(gene-for-gene)抗病性的信号转导级联反应(Ryals等，1997)。Ryals等，1997也报道了nim1的另外5个等位基因的分离，它们表现出从化学诱导的PR-1基因表达和真菌抗性较弱损伤到非常强的阻断的一系列表型。将野生型NPR1基因转化入npr1突变体不仅互补突变、恢复与PR基因表达有关的SAR诱导的反应性和抗病性，而且使转基因植物在没有SAR诱导的情况下对丁香假单胞菌侵染有更强的抗性(Cao等，1997)。

NF-κB/κB信号转导途径参与了从果蝇到哺乳动物多种生物的抗病性反应。在哺乳动物中，NF-κB/κB信号转导可被多种不同刺激诱导，包括细胞接触脂多糖、肿瘤坏死因子、白细胞介素1(IL-1)或病毒侵染(Baeuerle和Baltimore，细胞87，13-20(1996)；Baldwin，免疫学年评14，649-681(1996))。活化的途径导致参与炎症反应和免疫反应的多种因子的合成，如白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素8和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(deMartin等，基因152，253-255(1995))。在转基因小鼠研究中，NF-κB/IκB信号转导的敲除导致缺陷型免疫反应包括增强的对细菌和病毒病原体的易感性(Beg和Baltimore，科学274，782-784(1996)；Van Antwerp等，科学274，787-789(1996)；Wang等，科学274，784-787(1996)；Baeuerle和Baltimore(1996))。在拟南芥中，SAR与炎症反应在功能上相似，因为SAR活化后正常抗性过程增强，导致增强的抗病性(Bi等，1995；Cao等，1994；Delaney等，1995；Delaney等，1994；Gaffney等，1993；Mauch-Mani和Slusarenko 1996；Delaney；1997)。而且，此途径的失活导致对细菌、病毒和真菌病原体敏感性的增加。有趣地是，据报道，SA阻断哺乳动物细胞中NF-κB的活化(Kopp和Ghosh，科学265，956-959(1994))，而SA活化拟南芥中的信号转导。细菌侵染果蝇活化了信号转导级联反应从而导致大量抗真菌蛋白如cercropinB、防卫素、diptericin和drosomycin的合成(Ip等，细胞75，753-763(1993)；Lemaitre等，细胞86，973-983(1996))。在蝇中，这种诱导取决于NF-κB的两个同系物dorsal和dif的基因产物并被IκB的同系物cactus抑制。抗真菌和抗细菌蛋白的合成降低大大降低了对侵染的抗性。

尽管对熟练和精细的农作物保护措施做了大量研究和应用，包括植物的遗传转化，但是由于疾病导致的损失每年仍为几十亿美元。所以，仍不断要求发展基于不断增长的对植物抗病性遗传基础的理解的新的农作物保护措施。

基于上述，本发明优选的一方面涉及通过将杀虫微生物剂施用于免疫调节植物得到的协同抗病性保护植物免受病原体侵袭的新方法。免疫调节植物是指SAR被活化，通常表现出比野生型更强的SAR基因表达因而被称为“SAR-开”植物。应用于本发明方法中的免疫调节植物至少可通过三种不同的方法得到：将SAR化学药品诱导剂如BTH，INA或SA施用于植物；通过基于SAR基因组成型表达和/或抗病性表型筛选植物的选择育种方案；通过用一种或多种SAR基因如NIM1基因的功能形式转化植物得到的基因工程植物。施用于免疫调节植物的杀微生物剂可以是常规的杀微生物剂如杀真菌剂氨丙灵(matalaxyl)，或者如果施用于通过选择性育种或基因工程得到的免疫调节植物，杀微生物剂可以是SAR的化学诱导剂如BTH、INA或SA。

免疫调节给植物提供一定水平的抗病性。相似地，将杀微生物剂施用于植物提供了一定水平的抗病性。将免疫调节与杀微生物剂施用联合使用的预期结果是控制水平反映了由单种提供抗病性方法的加合控制水平。然而，通过同时将杀微生物剂施用于免疫调节植物，抗病性出乎预料地协同加强，即抗病性水平比预料的抗病性加合水平高。

相应地，本发明涉及免疫调节植物的栽培以及将适量的常规杀微生物剂施用于此植物。本发明特别优选的实施方案涉及用基因工程方法使植物包含和表达NIM1基因的功能形式或其同系物或其变体。

本发明的方法得到比通过仅用免疫调节或杀微生物剂更高的病原体控制。免疫调节提供给植物一定水平的抗病性。相似地，将杀微生物剂施用于植物提供了一定水平的抗病性。将免疫调节与杀微生物剂施用联合使用的预期效果是控制水平反映了由单种提供抗病性方法的加合控制水平。然而，通过同时将杀微生物剂施用于免疫调节植物，抗病性出乎预料地协同加强，即抗病性水平比预料的抗病性加合水平高。

除了抗病性增大外，本发明的另一优势是本发明方法达到抗病性水平所需的杀微生物剂比用普通野生型植物需要的量少。由此产生的结果是杀微生物剂经济耗费低，由某些杀微生物剂毒性导致不利环境问题的机率减小。而且，本发明的保护植物的方法通过联合免疫调节和杀微生物剂的效果使抗病原体作用时间延长并且作物产量提高。本方法的另一个优势是因为这两种病原体控制的联合作用模式彼此完全不同，形成抗性的威胁有效地得以避免。

因此本发明涉及通过协同抗病性保护植物免受病原体侵袭的方法；包括以下步骤：

(a)提供具有一级抗病性的免疫调节植物；并且

(b)向所述免疫调节植物施用至少一种杀微生物剂以赋予二级抗病性；

(c)由此所述杀微生物剂向所述免疫调节植物的施用赋予比一级和二级抗病性总和更大的协同增强的三级抗病性。

优选的是根据本发明所述的方法，其中所述免疫调节植物是组成型免疫(cim)突变植物。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述cim突变植物根据下列步骤从植物群体中选出来：

(a)评估SAR基因在表型正常的未受侵染的植物中的表达，其中未受侵染的植物缺少损伤模型表型；并且

(b)筛选在没有病毒、细菌或真菌侵染时，组成型表达SAR基因的未受侵染的植物。

优选的是根据本发明所述的方法，其中所述免疫调节植物是损伤模拟突变植物。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述损伤模拟突变植物根据下列步骤从植物群体中选出：

(a)评估SAR基因在具有损伤模型表型的未受侵染的植物中的表达；并且

(b)筛选在没有病毒，细菌或真菌侵染时，组成型表达SAR基因的未受侵染的植物。

优选的是根据本发明所述的方法，其中所述免疫调节植物是通过SAR基因在植物中的重组表达得到的。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述SAR基因是NIM1基因的功能形式。

更优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1基因编码的NIM1蛋白参与了植物中引起系统获得性抗性的信号转导级联反应。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1蛋白包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1基因在下列条件下与SEQ ID NO：1中所示的编码序列杂交：在1％BSA；520mM NaPO₄，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠盐；1mM EDTA；250mM氯化钠中于55℃杂交18-24小时，于55℃在6×SSC中洗15分钟，3次；在3×SSC中洗15分钟，1次。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1基因包括SEQ ID NO：1中所示的编码序列和在中等严格条件下与其杂交的所有DNA分子。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述SAR基因编码作为SAR信号转导途径的显性失活调控子的NIM1蛋白的改变形式。

更优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式在相当于SEQ ID NO：2的55和59位的氨基酸位是丙氨酸而不是丝氨酸。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQID NO：7中所示的核苷酸序列和在中等严格条件下与其杂交的所有DNA分子。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述DNA分子在下列条件与SEQ ID NO：7中所示的核苷酸序列杂交：在1％BSA，520mM NaPO₄，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠盐；1mM EDTA，250mM氯化钠中于55℃杂交18-24小时，于55℃在6×SSC中洗15分钟，3次，15在3×SSC中洗15分钟，1次。

更优选的是根据本发明所述的方法；其中所述NIM1蛋白的改变形式具有大约相当于SEQ ID NO：2的1-125氨基酸位的N-末端截短的氨基酸。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述DNA分子包括SEQID NO：9中所示的核苷酸序列和在中等严格条件下与其杂交的所有DNA分子。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述DNA分子在下列条件下与SEQ ID NO：9中所示的核苷酸序列杂交；在1％BSA；520mMNaPO₄，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mM EDTA；250mM氯化钠中于55℃杂交18-24小时，于55℃在6×SSC中洗15分钟，3次；在3×SSC中洗15分钟，1次。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式具有大约相当于SEQ ID NO：2的522-593氨基酸位的C-末端截短的氨基酸。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式包含SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述DNA分子包括SEQID NO：11中所示的核苷酸序列和在中等严格条件下与其杂交的所有DNA分子。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述DNA分子在下列条件下与SEQ ID NO：11中所示的核苷酸序列杂交：在1％BSA；520mMNaPO₄，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠盐；1mM EDTA；250mM氯化钠中于55℃杂交18-24小时，于55℃在6×SSC中洗15分钟，3次，在3×SSC中洗15分钟，1次。

更优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式具有大约相当于SEQ ID NO：2的1-125氨基酸位的N-末端截短的氨基酸和大约相当于SEQ ID NO：2的522-593位氨基酸的C-末端截短的氨基酸。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式包含SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述DNA分子包括SEQID NO：13中所示的核苷酸序列和在在中等严格条件下与其杂交的所有DNA分子。

特别优选的是根据本发明的所述方法，其中所述DNA分子在下列条件下与SEQ ID NO：13中所示的核苷酸序列杂交；在1％BSA；520mMNaPO₄；pH7.2；7％十二烷基硫酸钠盐；1mM EDTA；250mM氯化钠中于55℃杂交18-24小时，于55℃在6×SSC中洗15分钟，3次，在3×SSC中洗15分钟，1次。

更优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式基本上由大约相当于SEQ ID NO：2的103-362氨基酸位的锚蛋白基序组成。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述DNA分子包括SEQID NO：15中所示的核苷酸序列和在中等严格条件下与其杂交的所有DNA分子。

特别优选的是根据本发明所述的方法，其中所述DNA分子在下列条件下与SEQ ID NO：15中所示的核苷酸序列杂交：在1％BSA；520mMNaPO₄，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠盐；1mM EDTA；250mM氯化钠中于55℃杂交18-24小时，于55℃在6×SSC中洗15分钟，3次；在3×SSC中洗15分钟，1次。

此处公开的靶作物的例子包括但不局限于下列植物品种：谷物(玉米，小麦，大麦，黑麦，燕麦，水稻，高粱及相关作物)；甜菜(甜菜和饲料甜菜)；梨果，核果和软果(苹果，梨，李，桃，杏，樱桃，草莓，木莓和黑莓)；豆科植物(菜豆，小扁豆，豌豆，大豆)；油料植物(油菜，芥子，罂栗属植物，橄榄，向日葵，椰子，蓖麻，可可豆，落花生)；瓜类植物(南瓜，黄瓜，甜瓜)；纤维植物(棉花，亚麻，大麻，黄麻)；柑橘属植物(橘子，柠檬，葡萄柚，柑橘)；蔬菜(菠菜，莴苣，芦笋，卷心菜，胡萝卜，洋葱，蕃茄，土豆，辣椒)；月桂属植物(鳄梨，樟属植物，樟树)；或诸如烟草，坚果，咖啡，甘蔗，茶，蛇麻草香蕉和天然橡胶的植物以及观赏植物(开花植物，灌木，阔叶树和常绿树如针叶树)。此目录不代表任何限制。

本发明的方法可用于赋予对广泛的植物病原体的抗性，其中病原体包括但不限于：病毒或类病毒如烟草或黄瓜花叶病毒、环斑病毒或坏死病毒、天竺葵曲叶病毒、红三叶草斑驳病毒、蕃茄丛矮病毒等病毒；子囊菌纲真菌如黑星菌属、柄球菌属、白粉菌属、链核盘菌属、球腔菌属和钩丝壳霉；担子菌纲如驼孢锈菌属、丝核菌属和柄锈菌属；半知菌亚门如葡萄孢属、长蠕孢属、喙孢属、镰刀菌属(即亚粘团串联镰孢、壳针孢属、尾孢属、链格孢属、Pyricularia和假尾孢属(即P.herpotrichoides)；卵菌纲真菌如疫霉属(即寄生疫霉)、霜霉属(即烟草霜霉)、盘梗霉属、腐霉属和单轴霉属；及其它真菌如大孢指疫霉、Sclerophthora rayissiae、禾生指梗霉、Peronosclerosporasorghi、Peronosclerospora philippinensis、Peronosclerosporasacchari和Peronosclerospora maydis、Physopella zeae、Cercospora zeae-maydis、禾生刺盘孢、玉米蜀黍赤霉、Exserohilumturcicum、玉米蜀黍球梗孢和Bipolaris maydis；细菌如丁香假单胞菌、烟草假单胞菌和斯氏泛菌；昆虫如蚜虫，如桃蚜；和鳞翅目如Heliothus属种类；以及线虫如南方根结线虫。获得免疫调节植物

下面的三种获得免疫调节植物的普通途径是相关的，因为它们都适合Ryals等(1996)中所述的SAR信号转导途径模型。一旦SAR信号转导途径活化就获得抗病性，不论采取下述的三种途径的哪一种，一系列相同的SAR基因开启从而产生抗病性。这三种途径的区别只在于SAR途径的哪一个位点开启；三种途径的最终结果是一致的。所以，通过一种途径获得的对免疫调节植物分析和观察结果可以外推并适用于用不同途径获得的免疫调节植物。A系统获得性抗性诱导剂的应用

获得免疫调节植物的第一条途径涉及对植物使用能诱导SAR的化学品。特别强的SAR化学诱导剂是苯并噻二唑如苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯(BTH)。可用作调节剂的苯并噻二唑衍生物描述于美国专利5,523,311和5,614,395，两者在此引用作为参考。可在田间多种植物中提供针对广谱病害保护作用的BTH诱导的SAR在Freidrich等，植物杂志10(1)，61-70(1996)；Lawton等，植物杂志10(1)，71-82(1996)和Gorlach等，植物细胞8，629-643(1996)中有详细的描述，这两篇文章在此引用作为参考。其它的可用于得到本发明方法所用免疫调节植物的SAR化学诱导剂包括异烟酸化合物如2，6-二氯异烟酸(INA)及其低级烷基酯和水杨酸化合物(SA)。合适的INA和SA化合物的例子描述于美国专利5,614,395。B培育组成型免疫(CIM)突变植物

获得免疫调节植物的第二个途径是根据SAR基因的组成型表达和/或抗病性表型筛选方案。大量数据表明SAR基因表达和系统获得性抗性本身之间有紧密相关性(Ward等(1991)；Uknes等(1992)；Uknes等(1993)；Lawton等(1993)；和Alexander等(1993)，美国国家科学院院报90，7327-7331，在此引用作为参考)。在拟南芥中，确定的SAR基因为PR-1、PR-2和PR-5，PR-1表达水平最高背景最低。

为了鉴定和筛选组成型表达SAR基因的植物，进行Northern分析以检测SAR基因的表达。用Uknes等(1992)描述的方法用已知的SARDNA序列进行杂交试验。杂交和克隆核酸序列的方法为本领域熟知。(见，例如，分子克隆，实验室手册，第二版，第1-3卷，Sambrook等(编辑)，冷泉港实验室出版社(1989)及其引用的参考)。已经分离到至少两组组成型表达SAR基因的SAR信号转导突变体。一组被称为“lsd”突变体(lsd＝损伤刺激病)，也称为“cim I组”突变体。见WO94/16077。lsd(cim I组)突变体在叶子上自发形成损伤，积累高浓度SA，高水平的PR-1、PR-2和PR-5的mRNA，对真菌和细菌病原体有抗性(Dietrich等，1994；Weymann等，1995)。第二组被称为“cim”(cim＝组成型免疫)突变体，也称为“cim II组”突变体。见WO94/16077。cim突变体具有除自发损伤以外的lsd突变体的所有特征，即cim突变体的可见表型是正常的。

一旦筛选到组成型表达SAR基因的植物，它们可用于育种方案以将SAR基因的组成型表达和对病原体的抗性掺入植物株系中。根据植物育种领域技术人员熟知的方法，依据SAR基因的表达和抗病性以及其它对于生产和品质重要的特征筛选用于进一步交配的后代。例如，因为lsd突变体表现出损伤形成和坏死，具有正常表型的cim突变体对于用于这样的育种方案和本发明的方法是优先的，尽管如果需要，也可选用lsd突变体。C用SAR基因转化植物

第三条获得免疫调节植物的途径是通过用SAR基因，优选地NIM1基因的功能形式转化植物。

1.野生型NIM1基因的重组表达

野生型NIM1(SEQ ID NO：1)的重组过量表达产生了具有抗病性表型的转基因植物。见，共同未决的美国专利申请序号08/880,179，在此引用作为参考。活性NIM1蛋白水平升高产生的抗病性效果与用化学药品如BTH、INA和SA化学诱导相同。优选地，NIM1基因的表达水平至少是野生型植物中NIM1基因表达水平的两倍以上，更优选地至少是野生型表达水平十倍以上。下面称为“重组DNA技术”的部分描述可用于在转基因植物中以比野生型植物高的水平重组表达野生型NIM1基因的方法。替代地，可用Cao等(1997)描述的方法用野生型NPR1基因转化植物以产生抗病性植物。

2.NIM1基因的改变形式的重组表达

通过NIM1基因的改变形式重组表达获得用于本发明方法的免疫调节植物，由此NIM1基因的改变利用了两种认识，即植物中SAR途径表现与哺乳动物和蝇中的NF-κB/IκB调节机制的功能平行以及NIM1基因产物是哺乳动物信号转导因子IκBα亚类的结构同系物。见共同未决的PCT申请“用NIM1基因赋予植物抗病性的方法”；在此引用作为参考。

将NIM1基因序列(SEQ ID NO：1)用于BLAST搜索，根据NIM1基因中一个相当保守区域与锚蛋白区域的同源性，在多种蛋白如血影蛋白、锚蛋白、NF-κB和IκB中鉴定了匹配(Michaely和Bennett，Trendscell Biol.2，127-129(1992))。在NIM1蛋白(SEQ ID NO：2)和70个已知含锚蛋白的蛋白之间进行两两目测检查，发现与转录调控子IκBα类成员的惊人相似性(Baeuerle和Baltimore 1996；Baldwin，1996)。如图1所示，NIM1蛋白(SEQ ID NO：2)与小鼠、大鼠和猪(分别为SEQ ID NO：3、4和5)的IκBα蛋白有明显的同源性。在整个蛋白中，NIM1包含几个重要的IκBα结构域，包括锚蛋白区(在图1中通过不连续的下划线标出)，两个氨基端丝氨酸(NIM1的55和59位氨基酸)，一对赖氨酸(NIM1中的99和100位氨基酸)和酸性(末端。总体上，NIM1和IκBα有30％的残基是相同的，50％的残基为保守性替换。因此，IκBα和NIM1在整个蛋白中有同源性，有80％的总相似性。

IκBα蛋白在信号转导中发挥功能的一种方法是通过与胞质转录因子NF-κB结合，阻止它进入细胞核，从而改变靶基因的转录(Baeuerle和Baltimore，1996；Baldwin，1996)。NF-κB的靶基因调节(活化或阻抑)几个细胞过程，包括抗病毒、抗微生物和细胞死亡反应(Baeuerle和Baltimore，1996)。当信号转导途径活化时，IκBα的两个丝氨酸残基磷酸化(小鼠IκBα的第32和36氨基酸)。这启动双赖氨酸处(小鼠IκBα的21和22位氨基酸)的遍在蛋白化作用。遍在蛋白化作用后，NF-κB/IκB复合物通过蛋白体输送，在蛋白体上IκBα被降解，并且NF-κB被释放至细胞核中。

对IκBα功能起重要作用的磷酸化的丝氨酸残基在从35位至84位氨基酸的连续的保守序列中(图1)保守。与IκBα形成对比，双赖氨酸位于离此蛋白N末端的约15个氨基酸处；在NIM1中，双赖氨酸位于离C末端40个氨基酸处。而且，在NIM1和IκBα丝氨酸/苏氨酸丰富的羧基端区域有高度同源性，这个区域对于基础代谢率是重要的(Sun等，分子细胞生物学16，1058-1065(1996))。根据本发明，基于结构同源性分析和已知对IκBα功能重要的元素的存在，预期NIM1象IκBα一样作用，即对植物基因调控有相似的效应。

当用化学诱导剂处理含有野生型NIM1基因的植物时，预计植物有更多的NIM1基因产物(IκB同系物)或更少的NIM1基因产物(IκB同系物)的磷酸化。根据此模型，结果是植物NF-κB同系物保留在细胞核之外并且产生SAR基因表达和抗性反应。在nim1突变体植物中，出现了非功能性的NIM1基因产物。所以，根据此模型，NF-κB同系物自由进入细胞核，抑制抗性和SAR基因表达。

与此观点一致，以水杨酸处理的动物细胞中IκB稳定性/丰度提高，细胞核内有活性的NF-κB减少(Kopp和Ghosh，1994)。已知IκB的突变作用为超抑制子或显性失活(Britta-Mareen Traenckner等，欧洲分子生物学组织14：2876-2883(1995)；Brown等，科学267：1485-1488(1996)；Brockman等，分子和细胞生物学15：2809-2818(1995)；Wang等，科学274；784-787(1996))。这些IκB的突变形式与NF-κB结合但不磷酸化也不遍在蛋白化，所以不被降解。NF-κB仍然与IκB结合不进入细胞核中。

就上述而言，可产生作用为SAR信号转导途径的显性失活调控子的NIM1的改变形式。转化了NIM1的显性失活形式的植物与nim1突变体植物有相反的表型，因为转化了NIM1的改变形式的植物表现出组成型SAR基因表达因此具有CIM表型，即转基因植物是免疫调节的。因为NIM1在SAR信号转导途径中所处的位置，可以预测除了在此具体公开的以外对于此基因的许多改变将会导致SAR基因的组成型表达，所以产生CIM表型。下面标题为“重组DNA技术”部分所述的方法可用于在转基因植物中表达比野生型水平高的NIM1基因的改变形式。下面描述了可作为SAR信号转导途径显性失活调控子的几种NIM1基因的改变形式。

a将55和59位丝氨酸残基变为丙氨酸残基。

人IκBα中丝氨酸磷酸化对于刺激活化IκBα降解由此活化NF-κB是必需的。人IκBα中丝氨酸残基(S₃₂和S₃₆)突变为丙氨酸残基抑制了刺激诱导的磷酸化，因此封闭了IκBα蛋白体介导的降解(Traenckner等，1995；Brown等，1996；Brockman等，1995；Wang等，1996)。改变形式的IκBα通过将NF-κB保留于细胞质中由此封闭下游事件作为显性失活形式行使功能。根据图1所示的NIM1和IκB之间氨基酸序列比较，NIM1(SEQ ID NO：2)中第55位(S₅₅)和59位(59)丝氨酸与人IκBα中的S32和S₃₆同源。为了构建是性失活形式的NIM1，55和59位的丝氨酸被突变成丙氨酸残基。因此，在一个优选的实施方案中，NIM1基因被改变使得其编码产物在拟南芥NIM1氨基酸序列(SEQ IDNO：2)中相应的55位和39位氨基酸是丙氨酸而不是丝氨酸。

b N-末端删除

人IκBα第1-36位氨基酸(Brockman等，1995；Sun等，1996)或第1-72位氨基酸(Sun等，1996)的删除，包括了遍在蛋白化赖氨酸残基K₂₁和K₂₂以及磷酸化位点S₃₂和S₃₆，导致了在转染的人细胞培养物中出现了显性失活IκBα表型。NIM1基因产物N-末端第125个氨基酸的删除将去掉作为遍在蛋白化位点的8个赖氨酸残基以及假定的上面讨论的S₅₅和S₅₉磷酸化位点。因此，在一个优选实施方案中，NIM1基因被改变使得其编码产物与天然拟南芥NIM1氨基酸序列(SEQ IDNO：2)相比，缺失了前约125个氨基酸。

c C-末端删除

人IκBα第261-317位氨基酸的删除通过封闭C-末端丝氨酸和苏氨酸残基的组成型磷酸化增强了内在的稳定性。改变形式的IκBα预计以显性失活形式发挥功能。丝氨酸和苏氨酸丰富区位于NIM1 C-末端的第522-593位氨基酸。因此，在一个优选的实施方案中，NIM1基因被改变使得其编码产物与天然的拟南芥NIM1氨基酸序列(SEQ IDNO：2)相比，缺失了约包括522-593位氨基酸的C-末端部分。

d N-末端/C-末端嵌合体和锚蛋白区域

NIM1基因的改变形式产物可作为C-末端和N-末端片段删除或嵌合体予以制备。在本发明的另一个实施方案中，提供了包含NIM1基因锚蛋白区域的构建体。

3其它SAR基因的重组表达

通过重组表达多种SAR基因，诸如Ward等(1991)中所述的，制备用于本发明方法的免疫调节植物。见例如，美国专利5,614,395，它描述了通过量表达一种或多种PR蛋白基因制备抗病性植物。尽管它特别谈及了NIM1基因形式的重组表达，下面标题为“重组DNA技术”的部分所述的方法可用于在转基因植物中以比野生型高的水平表达其它SAR基因，如PR蛋白基因。重组DNA技术

用常规重组DNA技术可将通过增强SAR基因表达赋予植物抗病性的野生型或NIM1基因的改变形式整合到植物细胞中。通常，用本领域标准的克隆方法，将编码所选上述形式的NIM1 DNA分子插入到表达系统中，其中DNA分子是异源的(即正常情况下不存在)。此栽体包含插入的蛋白编码序列转录和翻译必需的元件。本领域所知的多种载体可以应用，例如质粒，噬菌体病毒和其它经修饰的病毒。合适的载体包括但不限于，病毒载体，诸如λ载体系统λgtl1，λgtl0和Charon4；质粒载体诸如pBI121，pBR322，PACYC177，pACYC184，pAR系列，pKK223-3，pUC8，pUC9，pUC18，pUC19，pLG339，pRK290，pKC37，pKC101，pCDNAII；和其它相似的系统。表达系统的成分可以被修饰以提高表达。例如，可利用截短的序列，核苷酸替代或其它修饰。在此描述的表达系统实际上可在合适的条件下转化任何作物细胞。转化的细胞可被重新进入整体植物以使所选形式的NIM1基因在转基因植物中活化SAR。A植物表达盒的构建

用于转基因植物表达的基因序列首先要装配于位于可在植物中表达的适当启动子之后的表达盒中。表达盒中可包含任何转基因表达必需或可选的序列。这样的序列包括但不限于转录终止子，增强表达的外部序列如内含子，有活力的序列以及将基因产物定位至特定细胞器和细胞小室的序列。下文描述了这些表达盒容易被转移到植物转化栽体。下文描述了典型表达盒的各种成分。

1启动子

用于表达盒的启动子的选择将决定转基因在转基因植物中突间和时间表达方式。所选启动子将在特定细胞类型(如叶表皮细胞，叶肉细胞，根皮质细胞)中或在特定组织或器官(根，叶或花，例如)表达转基因，并且选择将反映基因产物希望的积累位置。替换地，所选启动子可在多种诱导条件下驱动基因表达。启动子强度即启动转录的能力不同。依据所用的宿主细胞系统，可用许多合适启动子中的任何一个。下面是可用于表达盒的无数的启动子的例子。

a组成型表达，CaMV35S启动子：

质粒pCGN1761的构建描述于公开的专利申请EP0392225(实施例23)，在此引用作为参考。pCGN1761包含“双”CaMV35S启动子和tm1转录终止子，在启动子和终止子之间有单一的EcoRI位点并具有pUC型骨架。构建pCGN1761的衍生物，它有经修饰的多接头，除了已存在的EcoRI位点外，还包括NotI和XhoI位点。此衍生物被命名为pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用于将cDNA序列或基因序列(包括微生物ORF序列)克隆至其多接头内，以使它们在转基因植物中在35S启动子的控制下表达。这样构建体中的整个的35S启动子—基因序列—tm1终止子表达盒可被接近启动子5′端的HindIII，Sphl，Sal I和Xba I位点以及接近终止子的3′端的Xba I，BamH I和Bgl II位点切割以用于转移至诸如下面所述的转化载体中。而且，以HindIII，Sph I，SalI，Xba I或PstI进行5′切割，以多接头的任一个限制性位点(EcoRI，Not I或Xho I)进行3′切割可替换为另一个启动子。如果希望的话，通过引入增强翻译的序列进行克隆位点周围的修饰。如果要进行过量表达，这一点特别有用。例如，按照美国专利5,639,949实施例37所述通过优化翻译起始位点对pCGN1761ENX进行修饰，此专利在此引用作为参考。

b在化学/病原体可调节的启动子下表达

pCGN1761ENX中的双35S启动子可被任何引起适当高表达的其它可供选择的启动子取代。例如，美国专利5,614,395中描述的化学诱导启动子可取代此35S启动子。可供选择的启动子优选地被限制性酶从其来源上切下，一种替代方法是用具有合适的末端限制性位点的引物PCR扩增得到。如果采用PCR扩增，将扩增的启动子插入靶载体后，应该对启动子重新测序以检测扩增错误。化学/病原体诱导的烟草PR-la启动子被从质粒pCIB1004(构建过程，见EP0332104的实施例21，在此引用作为参考)切下转移至质粒pCGN1761ENX(Uknes等，1992)。用Nco I切割pCIB1004，产生的线性片段的3′突出端以T4 DNA聚合酶处理使它成为平端。然后用HindIII切割这个片段，凝胶纯化得到的含PR-la启动子的片段，并将它克隆到去掉35S启动子的pCGN1761ENX中。这是通过用Xho I切割，T4聚合酶补平，然后用HindIII切割，分离含有大的插入pCIB1004启动子的载体的片段完成的。这产生了一个pCGN1761ENX衍生物，它具有PR-la启动子，tm1终止子和具有单一EcoR I和Not I位点的插入多接头。所选的编码序列可被插到这个载体中，融合产物(即启动子—基因—终止子)可被转移至任何所选的转化载体，包括下文所描述的载体。多种化学调节剂可用于以在本发明的转化植物中诱导所选编码序列的表达，包括美国专利5,523,311和5,614,395中公开的苯并噻二唑，异烟酸和水杨酸化合物。

c组成型表达，肌动蛋白启动子：

已知几种肌动蛋白异构体在大多数类型细胞中表达，因此肌动蛋白启动子是一个好的组成型启动子。特别是，水稻Actl基因的启动子已得到克隆、鉴定(McElroy等，植物细胞2：163-171(1990))。1.3kb的启动子片段包括在水稻原生质体内表达所需的所有调节元件。而且，多种以ActI启动子为基础构建的表达载体专门用于单子叶植物(McElroy等，Mol Gen Genet.231：150-160(1991))。它们将ActI-内含子，AdhI 5′侧翼序列和AdhI-内含子(来自玉米乙醇脱氢酶基因)和来自CaMV35S启动子的序列整合在一起。35S与Act I内含子或Act I 5′侧序列与Act I内含子融合的载体表达最高。起始密码子ATG周围序列(GUS报告基因的序列)的优化也增强表达。由McElory等(Mol.Gen.Genet.231：150-160(1991))描述的启动子表达盒很容易被修饰而用于基因表达而且特别适用于单子叶植物宿主。例如，从McElroy构建体上切下包含启动子的片段用于替换pCGN1761ENX中的双35S启动子，它可用以插入特定的基因序列。这样构建成的融合基因可被转移至合适的转化载体。在另一单独报道中，水稻Act I启动子与其内含子可以在培养的大麦细胞指导高表达(Chibbar等，Plant Cell Rep.12：506-509(1993))。

d组成型表达，遍在蛋白启动子

遍在蛋白是另一已知的其基因产物在多种类型细胞积累，其启动子已从几种植物中克隆并用于转基因植物(如，向日葵-Bine等，植物科学79：87-94(1991)和玉米—Christensen等，植物分子生物学12：619-632(1989))。玉米遍在蛋白启动子已在转基因单子叶植物系统中得以发展，其用于单子叶植物转化的序列和载体构建公开于专利公开EP0 342 926(到Lubrizol)；在此引用作为参考。Taylor等(Plant cellRep.12；491-495(1993))描述一个包含玉米遍在蛋白启动子及其第一个内含子的载体(pAHC25)，当它通过微粒轰击导入时，在多种单子叶植物细胞悬液中有很高的活性。遍在蛋白启动子适于转基因植物中基因表达，特别是单子叶植物。合适的载体有pAHC25的衍生物或在本申请中描述的任何转化载体，它们通过引入合适的遍在蛋白启动子和/或内含子序列而得到修饰。

e根特异表达

另外一种基因表达的方式是根表达。de Framond(FEBS 290；103-106(1991))及公开的专利申请EP 0 452 269中描述了一个合适的根启动子，在此引用作为参考。将此启动子转入合适的载体如pCGN1761ENX以插入所选基因，随后将全部的启动子—基因—终止子盒转入目的转化载体。

f创伤诱导的启动子

创伤诱导的启动子也适用于基因表达。已描述许多这样的启动子(如Xu等，植物分子生物学22；573-588(1993)，Logemann等，植物细胞1：151-158(1989)，Rohrmeier & Lehle，植物分子生物学22：783-792(1993)，Firek等，植物分子生物学22：129-142(1993)，Warner等，植物杂志：3：191-201(1993))并且适用于本发明。Logemann等描述了双子叶植物土豆Wunl基因的5′上游序列。Xu等表明双子叶植物土豆创伤诱导启动子(pin2)在单子叶植物水稻中有活性。进一步，Rohrmeier & Lehle描述了创伤诱导的玉米Wipl cDNA的克隆，它可用于以标准技术分离同源启动子。相似，Firek等和Warner等已描述了来自单子叶植物石刁柏的创伤诱导基因，它可在局部创伤和病原体侵袭位点表达。用本领域熟知的克隆技术，这些启动子可转入合适的载体中，与本发明有关的基因融合用于在植物创伤位点表达这些基因。

g木髓优先的表达：

专利申请WO93/07278在此引用作为参考，描述了在髓细胞优先表达的玉米trpA基因的分离。基因序列的转录起始位点和启动子之间有1726bp。用标准的分子生物学技术，此启动子或其一部分可转入诸如pCGN1761的载体中，它可取代35S启动子并且以髓优先的方式启动外源基因的表达。实际上，包含髓优先的启动子或其一部分的片段可转入任何载体，经修饰后用于转基因植物。

h叶特异表达：

Hudspeth & Grula(植物分子生物学12；579-589(1989))描述了编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。用标准分子生物学技术，此基因的启动子可用于在转基因植物以叶特异方式启动任何基因的表达。

2转录终止子

多种转录终止子可用于表达盒。它们负责转基因后的转录终止及其正确的多腺苷酸化。合适的转录终止子是那些已知在植物中起作用的，包括CaMV35S终止子，tm1终止子，胭脂氨酸合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。它们既可用于单子叶植物也可用于双子叶植物。

3增强或调节表达的序列

转录单位内的多种序列可增强基因表达，这些序列可与本发明的基因联合应用提高它们在转基因植物中的表达。

多种内含子序列可增强表达，特别是在单子叶植物细胞中。例如，当导入玉米细胞时，玉米AdhI基因的内含子明显提高位于其同源启动子下的野生型基因的表达。内含子1特别有效，能够增强含有氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中的表达(Callis等，基因发育1；1183-1200(1987))。在同一实验系统中，玉米bronzel基因的内含子在增强表达方面有相似的效应。内含子序列已被常规地整合到植物转化载体中，内含子典型地位于非翻译前导区内。

来自病毒的许多非翻译前导区可增强表达，它们在双子叶植物细胞中特别有效。特别是烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)，玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导区序列有效地增强表达(如，Gallie等，核酸研究15；8693-8711(1987)；Skuzeski等，植物分子生物学15；65-79(1990))。

4基因产物在细胞内的靶向

在植物中存在多种靶向基因产物的机制，已对控制这些机制发挥功能的序列做了较为细致的鉴定。例如，基因产物靶向叶绿体是由荐在于多种蛋白氨基末端的信号序列控制的，当运输至叶绿体以产生成熟蛋白时此信号序列被切除(如Comal等，生物化学杂志263：15104-15109(1988))。这些信号序列可与异源基因产物融合以影响异源产物到叶绿体的运输(an den Broeck，等，自然313：358-363(1985))。可从编码RUBISCO蛋白，CAB蛋白，EPSP合酶，GS2蛋白和其它多种已知导向叶绿体的蛋白的cDNA 5′末端分离编码合适信号序列的DNA。参见美国专利5,639,949实施例37标题为“叶绿体导向表达”部分。

其它基因产物定位于其它细胞器如线粒体和过氧化物酶体(如，Unger等，植物分子生物学13：411-418(1989))。可控制编码这些产物的cDNA以影响异源基因产物向这些细胞器的导向。这样序列的例子为编码核ATP酶和线粒体特异的天冬氨酸转氨酶异构体的序列。Rogers等已描述了细胞蛋白体的靶向(美国国家科学院院报82：6512-6516(1985))。

另外，已鉴定了导致基因产物靶向其它细胞小室的序列。氨基端序列负责到内质网，质外体和从糊粉细胞向细胞外分泌的靶向(Koehler & Ho，植物细胞2：769-783(1990))。另外，氨基端序列与羧基端序列共同负责液泡定位(Shinshi等，植物分子生物学14；357-368(1990))。

通过将上述合适的靶向序列与目的转基因序列融合，可能将转基因产物导向任何细胞器或细胞小室。对于叶绿体导向，例如，RUBISCO基因，CAB基因，EPSP合酶基因或GS2基因的叶绿体信号序列按框架与转基因氨基端ATG融合。所选的信号序列应包括已知的切割位点，构建融合体应该考虑需要切割的切割位点后的氨基酸序列。在某些情况下，这种要求可通过在切割位点和转基因的ATG之间增加少量几个氨基酸，或替换转基因序列内的几个氨基酸来满足。用Bartlett等，在Edelmann等(编辑)叶绿体分子生物学方法，Elsevier第1081-1091页(1982)和Wasmann等，Mol，Gen.Genet 205：446-453(1986)描述的技术，通过检测体外转录构建体的体外翻译以及随后的叶绿体的摄入测定叶绿体摄入效率从而检测用于叶绿体运输的融合构建体。这些构建技术为本领域熟知并且同样适用于线粒体和过氧化物酶体。

上述的细胞导向机制不仅可与其同源启动子共同使用，而且也可与异源启动子共同使用，以影响在启动子转录调控下的特定的细胞靶向，启动子的表达方式与靶向信号来源的启动子的表达方式不同。B植物转化载体的构建

用于植物转化的许多转化载体为植物转化领域的普通技术人员所熟知，与本发明有关的基因可与任何一个这样的载体共同使用。载体的选择取决于优选的转化技术和转化的靶物种。对于某些靶物种来说，可优选不同的抗生素或除草剂选择标记。常规用于转化的选择标记包括npt II基因，产生对卡那霉素和相关抗生素的抗性(Messing &Vierra基因19：259-268(1982)；Bevan等，自然304：184-187(1983))，bar基因，产生对除草剂膦丝菌素的抗性(White等，核酸研究18：1062(1990)；Spencer等，Theor.Appl.Genet 79：625-631(1990))，hph基因，产生对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger &Diggelmann分子细胞生物学4：2929-2931)和dhfr基因，产生对氨甲喋呤的抗性(Bourouis等，欧洲分子生物学组织杂志2(7)：1099-1104(1983))，以及EPSPS基因，产生对草甘膦抗性(美国专利4,940,935和5,186,642)。

1适用于土壤杆菌转化的载体

很多载体适用于以根瘤土壤杆菌进行转化。它们通常含至少一个T-DNA边界序列包括载体诸如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984)和pXYZ。下文描述了两个典型的适于土壤杆菌转化的载体。

a pCIB200和pCIB2001。

双元载体pCIB200和pCIB2001用于使用土壤杆菌的重组载体的构建，以下述方式进行构建。用Nar I消化pTJS75(Schrnidhauser &Helinski，细菌学杂志164：446-455(1985))切除四环素抗性基因，然后插入来自pUC4K携带NPTII的Acc I片段得到pTJS75Kan(Messing& Vierra，基因19：259-268(1982)；Bevan等，自然304：184-187(1983)；McBride等，植物分子生物学14：266-276(1990))。将Xho I接头与PCIB7的EcoRV片段连接，它包括左右T-DNA边界，植物可选择的nos/npt II嵌合基因和pUC多接头(Rothstein等，基因53：153-161(1987))，Xho I消化片段被克隆至Sal消化的pTJS75 Kan以产生pCIB200(见EP0332104，实施例19)。pCIB200包括下列单一多接头限制性位点：EcoR I，Sst I，Kpn I，Bgl II，Xba I和Sal I。pCIB2001是在pCIB200多接头中插入另外的限制性位点产生的衍生物。pCIB2001多接头中的单一限制性切点是EcoR I，Sst I，Kpn I，Bgl II，Xba I，Sal I，Mln I，Bc II，Avr II，Apa I，Hpa I和StuI。pCIB2001除了包含这些限制性位点外，还包括植物和细菌卡那霉素筛选，左和右T-DNA边界可用于土壤杆菌介导的转化，来自RK2的在大肠杆菌和其它宿主间运动的trfA功能以及来自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接头适合于克隆含有自身调节信号的植物表达盒。

b pCIB10及其潮霉素筛选的衍生物

双元载体pCIB10包含编码在植物中进行筛选的卡那霉素抗性的基因和左右T-DNA边界序列以及从广谱宿主质粒pRK252中整合的使其可在大肠杆菌和土壤杆菌都可复制的序列。其构建由Rothstein等(基因53：153-161(1987))描述。构建了整合有潮霉素B磷酸转移酶基因的多种pCIB10衍生物，由Gritz等(基因25：179-188(1983))描述。这些衍生物使转基因植物细胞只能在潮霉素上(pCIB743)或潮霉素和卡那霉素上筛选(pCIB715，pCIB717)。

2适于非土壤杆菌转化的载体

不用根瘤土壤杆菌的转化使在所选的转化载体中不必要求有T-DNA序列；所以除了使用上述含T-DNA序列的载体缺少这些序列的载体也可以应用。不依赖土壤杆菌的转化技术包括通过粒子轰击，原生质体摄入(如PEG和电穿孔)和显微注射。载体的选择主要取决于转化物种的优先选择。下文描述了适于非土壤杆菌转化的典型载体的构建。

a pCIB3064

pCIB3064是来源于pUC的载体，适合于直接基因转移技术和除草剂basta(或膦丝菌素)筛选的联合应用。质粒pCIB246包括与大肠杆菌GUS基因调控融合的CaMV35S启动子和CaMV35S转录终止子，描述于PCT公开的申请WO93/07278中。此载体的35S启动子包括两个起始位点5′的ATG序列。用标准PCR技术突变这些位点以去掉ATG并产生限制性位点Ssp I和Pvu II。新的限制性位点距离单一Sal I位点96和37bp，距离实际起始位点101和42bp。得到的pCIB246衍生物被命名为pCIB3025。用Sal I和Sac I消化切除pCIB3025中的GUS基因，将末端补平重新连接以产生质粒pCIB3060。质粒pJIT82来自JohnInnes Centre，Norwich，含有来自产绿色链霉菌的bar基因400bp片段被切下来插入到pCIB3060的Hpa I位点(Thompson等，欧洲分子生物学组织杂志6：2519-2523(1987))。由此产生了pCIB3064，它包括在CaMV 35S启动子和终止子控制下用于除草剂筛选的bar基因，一个氨苄抗性基因(用于大肠杆菌筛选)和具有单一位点Sph I，PstI，Hind III和BamH I的多接头。此载体适用于克隆包含自身调节信号的植物表达盒。

b pSOG19和pSOG35

pSOG35是用大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DFR)作为筛选标记赋予氨甲喋呤抗性的转化载体。利用PCR从pSOG10扩增35S启动子(约800bp)、玉米Adhl基因的内含子6(约550bp)和18bp的GUS非翻译前导区序列。也扩增了编码大肠杆菌二氢叶酸还原酶II型基因的250bp片段，这两个片段通过来自pB1221(Clontech)的包含pUC19载体骨架和胭脂氨酸合酶终止子的Sac I-Pst I片段装配起来。这些片段的装配产生pSOG19，它包含与内含子6序列融合的35S启动子，GUS前导区，DHFR基因和胭脂氨酸合酶终止子。用玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)前导序列取代pSOG19中的GUS前导区产生载体pSOG35。pSOG19和pSOG35具有氨苄抗性的pUC基因和用于克隆外源物质的HindIII，SphI，Pst I和EcoR I位点。C转化

一旦将目的编码序列克隆入表达系统，就将其转化至植物细胞中。转化和植物再生的方法为本领域所熟知。例如，Ti质粒载体已被用于运送外源DNA，以及直接DNA摄入，脂质体，电穿孔，显微注射和微粒轰击。另外，土壤杆菌属的细菌也可用于转化植物细胞。下文描述了用于转化双子叶植物和单子叶植物的典型技术。

1双子叶植物的转化

双子叶植物转化技术为本领域熟知，包括以土壤杆菌为基础的技术以及不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌技术涉及原生质体或细胞直接摄入外源遗传物质。这可通过PEG或电穿孔介导的摄入，粒子轰击介导的转运或显微注射实现。这些技术的例子的描述见Paszkowski等，欧洲分子生物学组织杂志3：2717-2722(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)；Reich等，生物技术4；1001-1004(1986)和Klein等，自然327：70-73(1987)。在每一种情况下，用本领域熟知的标准技术使细胞再生成整株植物。

土壤杆菌介导的转化是转化双子叶植物优选的技术，因为它的转化效率较高而且适于用多种植物。土壤杆菌转化一般涉及将携带外源目的DNA的双元载体(如pCIB200或pCIB2001)转移至合适的土壤杆菌菌株，依赖于宿主土壤杆菌株携带的vir基因的补充是在Ti质粒上还是在染色体上(如用于pCIB200和pCIB2001的CIB542株(Uknes等，植物细胞5：159-169(1993))。重组双元载体转移至土壤杆菌是通过三亲交配方法实现的，它使用携带重组双元载体的大肠杆菌，携带质粒如pRK2013并且能够将重组双元载体移至靶土壤杆菌株的辅助大肠杆菌株。替代地，重组双元载体可通过DNA转化转移至土壤杆菌(Hofgen & Willmitzer，核酸研究16：9877(1988))。

用重组土壤杆菌转化靶植物通常涉及用本领域熟知的方法共培养土壤杆菌和植物的外植体。转化的组织在含有双源质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上再生。

另外一种用基因转化植物的方法涉及将无活性或有生物活性的颗粒推进到植物组织和细胞上。这项技术公布在授予Sanford等的美国专利4,945,050，5,036,006和5,100,792中。通常，这种方法涉及在有效地渗入细胞外表面及掺入到其内部的条件下将无活性或有生物活性的颗粒推进到细胞上。当使用无活性颗粒时，通过包被包含希望基因的颗粒将载体导入细胞。替代地，用载体包围靶细胞，通过颗粒的激活将载体带入细胞。具有生物活性的颗粒(如干的酵母细胞，干的细菌或噬菌体，每一种包含需导入的DNA)可用于推进到植物细胞组织中。

2单子叶植物的转化

大多数单子叶植物的转化已成为常规。优选的技术包括用PEG或电穿孔技术直接将基因转移到原生质体中；用颗子轰击转移到愈伤组织中。可用单个DNA种类或多种DNA(即共转化)进行转化，这两种技术都适用于本发明。共转化的优势是避免完全载体构建以及制备目的基因和筛选标记不连锁的转基因植物，使得随后的子代中不需要筛选标记，如果这一点被认为可选。然而，共转化的缺点是单个DNA整合到基因组中的概率小于100％(Schocher等，生物技术4；1093-1096(1986))。

专利申请EP0 292 435，EP0 392 225和WO93/07278描述的技术有从玉米原种近交系制备愈伤组织和原生质体，用PEG或电穿孔转化原生质体，从转化的原生质体再生玉米植物。Gordonkamm等(植物细胞2 603-618(1990))和Fromm等(生物技术8：833-839(1990))公布了用颗子轰击转化A188来源的玉米系的技术。而且，WO93/07278和Koziel等(生物技术11：194-200(1993))描述了通过颗子轰击转化玉米原种近交系的技术。此技术利用了从授粉后14-15天的玉米穗上切下的1.5-2.5mm长的未成熟胚胎和PDS-1000He Biolistics仪器进行轰击。

也可通过直接基因运送技术用原生质体或粒子轰击转化水稻。已描述了对Japonica型和Indica型进行的原生质体介导的转化(Zhany等，植物细胞繁殖7：379-384(1988)；Shimamoto等，自然338：274-277(1989)；Datta等，生物技术8：736-740(1990))。用粒子轰击可对两种类型进行常规转化(Christou等，生物技术9：957-962(1991))。

专利申请EP 0332581描述了制备，转化和再生Pooideae原生质体的技术。这些技术可用于转化Dactylis和小麦。而且，Vasil等(生物技术10：667-674(1992))描述了用粒子轰击进行的C型长期再生愈伤组织细胞的小麦转化，Vasil等(生物技术11：1553-1558(1993)和Week等(植物生理学102：1077-1084(1993))描述了用粒子轰击进行未成熟胚胎和未成熟胚胎来源的愈伤组织的小麦转化。然而，优先的小麦转化技术涉及通过粒子轰击转化未成熟胚胎并包括基因运送前的高蔗糖或高麦芽糖步骤。在轰击前，任意数目的胚胎(0.75-1mm长)被接种在含3％蔗糖(Murashiga & Skoog，植物生理学15：473-497(1962))和3mg/12.4-D的MS培养基上以诱导体细胞胚胎，此过程避光进行。在所选的轰击的那一天，将胚胎从诱导培养基中取出放在渗透剂中(即诱导培养基中含有希望浓度的蔗糖或麦芽糖，通常为15％。胚胎质壁分离2-3小时后进行轰击。通常每块靶平板有24个胚胎，但这不是关键的。用标准方法将携带合适基因的质粒(如pCIB3064或pSG35)沉淀到毫米大小的金颗粒上。用标准的80目屏以约1000psi的冲击压通过DuPont Biolistics^氦仪器轰击每个平板上的胚胎。轰击后，将胚胎放回至黑暗中恢复约24个小时(仍在渗透剂中)。24小时后，将胚胎从渗透剂中取出放回到诱导培养基中在再生前停留的一个月。约1个月后，具有发育的胚胎发生愈伤组织的胚胎外植体被转移至再生培养基中(MS+1mg/l NAA，5mg/l GA)，进一步包含合适的筛选剂(对于pCIB3064是10mg/l basta，对于pSOG35是2mg/lmethotrexate)。约1个月后，将发育的芽转移至大的无菌容器“GA7S”中，它包含半浓度MS，2％蔗糖和相同浓度的筛选剂。

最近，描述了用土壤杆菌转化单子叶植物。见WO94/00977和美国专利5,591,616，两者在此被引用作为参考。育种

通过用SAR基因如一种形式的NIM1基因转化得到的免疫调节植物可以是多种植物中的任何一种，包括单子叶植物和双子叶植物；然而，用于本发明方法的免疫调节植物优选地选自有农业重要性的下文所列的靶作物。通过育种可以将所选形式的NIM1基因的表达与其它对生产和质量有重要意义的特征融入一个植物品系。育种方法和技术为本领域熟知。如见Welsh J.R.植物遗传学和育种基础John Wiley & Sons，NY(1981)；作物育种，Wood D.R.(编辑)American Society of AgronomyMadison，Wigconsin(1983)；Mayo O.植物育种理论，第二版，Clarendon Press Oxford(1987)；Singh，D.P.；疾病和害虫抗性育种，Springer-Verlag；NY(1986)；以及Wricke和Weber，数量遗传学和选择植物育种，Walter cle Gruyter和Co.，柏林(1986)。

上述的通过基因工程方法整合到转基因种子和植物中的遗传学特征可通过有性繁殖和营养生长传递，这样可在后代植物中维持和繁殖。通常所说的维持和繁殖运用了已知的为了适合特定目的发展的方法如耕地，播种或收获。特殊的方法如水培或温室技术也可应用。因为生长的作物容易受到由昆虫或侵染导致的攻击或损坏以及要与杂草植物竞争，所以要采取措施控制杂草，植物疾病，昆虫，线虫和其它不利条件以提高产量。这包括机械措施如土壤耕地，杂草或受侵染植物的去除，以及使用农业化学药品如除草剂，杀真菌剂，杀配子剂，杀线虫剂，生长调节剂，催熟剂和杀虫剂。

本发明转基因植物和种子的优势遗传特征可通过植物育种得以利用，其目的是使培育的植物具有改良的特征如害虫，除草剂或胁迫抗性，提高的营养价值，提高的产量或改良的结构使由于倒伏或毁坏导致的损失减少。多种育种步骤都有明确规定的人的参与如选择杂交品系，指导亲本系的授粉或选择合适的后代植物。根据希望的特征，采用不同的育种措施。相关技术为本领域所熟知包括但不局限于杂交，近交，回交育种，多线育种，品种混合，种间杂交，非整倍体技术等。杂交技术也包括植物不育，通过机械的，化学的或生物化学手段产生雄性或雌性不育植物。一株雄性不育植物与不同品系的花粉之间授粉保证了雄性不育、雌性能育植物从双方亲本系中得到特征。这样，本发明的转基因种子和植物可用于改良植物品系的育种，即例如，提高传统方法如除草剂或杀虫剂的有效性或使其因为具改良的遗传特征可以通过该方法传播。替代地，可得到具有改良的胁迫抗性的新作物，由于其优化的遗传“装备”，产生的产品比不能够抵抗相同不利发育条件的作物的产品好。

在种子生产中，发芽质量和种子的均一性是基本的产品特征，而由农场主收获出售的种子的发芽质量和均一性不重要。因为很难使作物中没有其它作物和杂草种子，控制来自种子的疾病，产生具有好的发芽质量的种子，种子生产者已经发展了十分广泛和明确的种子生产实践，它们在生长，调理和出售纯种子方面富有经验。因此，对于农场主来说，购买符合特定质量标准的经证实的种子而不使用从自己庄稼中收获的种子是很常见的做法。用作种子的繁殖材料通常用保护剂包被处理，它包括除草剂，杀虫剂，杀真菌剂，杀细菌剂，杀线虫剂，杀软体动物剂或其混合物。通常使用的保护剂包被包括化合物如环己烯亚胺，萎锈灵，福美双(TMTD^)氨丙灵(氨丙灵)(Apron)和甲基嘧啶磷(Actellic^)。如果希望的话，这些化合物可与制剂领域常用的进一步的载体，表面活性物质或促进应用的佐剂制成制剂以保护不受由细菌、真菌或有害动物引起的损坏。保护剂包被可通过用液体制剂浸泡或湿的或干的制剂联合包被进行应用。其它的应用方法也是可能的，如直接处理芽或果实。

本发明进一步的方法是提供新的农业方法，如上文列举的，其特点是使用本发明的转基因植物，转基因植物材料或转基因种子。

这些的种子可包括合适的包装材料在袋，容器或管内提供，这个袋或容器能够被封口以包含种子。这个包、容器、管可用于长期，短期或既可长期又可短期保存种子。合适的包装材料的例子包括纸，诸如牛皮纸，坚硬的或弹性塑料或其它聚合材料，玻璃或金属。优选的包，容器或管由多层相同或不同类型的包装材料组成。在一个实施方案中，提供的包、容器或管可以防止或限制水和潮气接触种子。在一个实施例中，封住包，容器或管的口，例如热封口，以防止水或潮气进入。在另一个实施方案中，将吸水材料放在包装材料之间或包装材料附近。在另一个实施方案中，通过处理组成袋，容器或管的材料以限制，抑制疾病，污染或其它储存或运输种子过程中的不利影响。这样处理的一个例子是灭菌，如通过化学手段或通过射线照射。包含于本发明的是一个商品袋，它含有包含一种形式的NIM1基因或一种NIM蛋白的转基因植物种子；NIM1基因在该转化植物中的表达水平比在野生植物中的高，与种子一起的，还有合适的载体，还有标签说明它的应用，可使植物产生广泛的抗病性。将杀微生物剂应用于免疫调节植物

如在此处所描述的，保护植物的发明方法涉及两个步骤：首先，活化SAR途径以提供免疫调节植物，第二，将杀虫微生物应用于此免疫调节植物以达到协同增强的抗病性。A传统的杀微生物剂

根据本发明的方法，任何商业上购买到的或杀微生物剂可应用于通过上述三种途径任何一种得到的免疫调节植物。合适的杀微生物剂的例子包括但不限于下述杀真菌剂：4-[3-(4-氯苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙烯酰]吗啉(“烯酰吗啉”)(参考文献：C.Tomlin(编辑)：杀虫剂手册，第10版，Farnhan，英国，1994第351-352页)；5-甲基-1，2，4-三唑[3，4-b][1，3]苯并噻唑(“三环唑”)(参考文献：C.Tomlin(编辑)：杀虫剂手册，第10版，Farnham，英国，1994，第1017-1018页)；3-烯丙氧基-1，2-苯并噻唑-1，1-二氧化物(“烯丙基异噻唑”)(参考文献：C.Tomlin(编辑)：杀虫剂手册，第10版，Farnham，英国，1994，第831-832页)；α-[2-(4-氯苯基)乙基]-α-(1，1-二甲基乙基)-1H-1，2，4-三唑-1-乙醇(“戊唑醇”)(参考文献：EP-A-4 345)；1-[[3-(2-氯苯基)-2-(4-氟苯)环氧乙烷-2-基]甲基]-1H-1，2，4-三唑(“环氧唑醇”)，(参考文献：EP-A-196038)；α-(4-氯苯基)-α-(1-环异丙基乙基)-1H-1，2，4-三唑-1-乙醇(“环唑醇”)(参考文献：美国4 664 696)；5-(4-氧苯基)-2，2-二甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-环戊醇(“叶菌唑”)(参考文献：EP-A-267 778)；2-(2，4-二氯苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)-丙基-1，1，2，2-四氟乙基醚，(“氟醚唑”)(参考文献：EP-A-234.242)；甲基-(E)-2{2-[6-(2-氰苯氧基)嘧啶-4-基氧基]苯基}-3-甲氧丙烯酸盐(“ICI A5504”，“azoxystrobin”)(参考文献：EP-A-382 375)；甲基-(E)-2-甲氧亚氨基-2-(α-(O-甲苯氧基)-O-甲苯基]乙酸酯(“BAS 490F”，“kresoxime methyl”)(参考文献：EP-A-400 417)；2-(2-苯氧苯基)-(E)-2-甲氧亚氨基-N-甲基乙酰胺(参考文献：EP-A-398 692)，[2-(2，5-二甲基苯氧甲基)-苯基]-(E)-2-甲氧亚氨基-N-甲基乙酰胺(参考文献：EP-A-398 692)；(1R，3S/1S，3R)-2，2-二氯-N-[(R)-1-(4-氯(苯基)乙基]-1-乙基-3-甲基环丙烷甲酰胺(“KTU3616”)(参考文献：EP-A-341 475)；乙撑双(二硫代氨基甲酸)锰聚合体-锌复合物；(“代森锰锌”)(参考文献：美国2 974 156)；1-[2-(2，4-二氯苯基)-4-丙基-1，3-二氧戊环-2-亚甲基]1H-1，2，4-三唑；(“丙环唑”)(参考文献：GB-1522657)；1-{2-[2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基]-4-甲基-1，3-二氧戊环-2-基甲基)-H-1，2，4-三唑(恶醚唑”)(参考文献：GB-209860)；1-[2-(2，4-二氯苯基)戊基-1H-1，2，4-三唑(“戊菌唑”)(参考文献：(GB-1589852)；顺-4-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]-2，6-二甲基吗啉；(“丁苯吗啉”)(参考文献：DE2752135)；1-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]哌啶(“苯锈啶”)(参考文献：DE2752135)；4-环丙基-6-甲基-N-苯基-2-嘧啶氨(“嘧菌环胺”)(参考文献：EP-A-310550)；(RS)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙酰基)-丙氨酸甲酯(“氨丙灵”)(参考文献：GB-1500581)；(R)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙酰基)-丙氨酸甲酯(“R-氨丙灵”)(参考：GB-1500581)；1，2，5，6-四氢-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮(“咯喹酮”)(参考文献：GB-1394373)；磷酸氢乙酯(“乙磷铝”)(参考文献：C.Tomlin(编辑)：杀虫剂手册，第10版，Farnhan，英国，1994，第530-532页)；和氢氧化铜(参考：C.Tomlin(编辑)：杀虫剂手册，第10版，Farnhan，英国，1994，第229-230页)。

所选的杀微生物剂优选地与制剂技术中常用的进一步的载体，表面活性剂或其它应用刺激佐剂以组合物的形式应用于被保护的免疫调节植物。合适的载体和佐剂可以是固体可以是液体，它们是制剂技术中常用的物质，如天然的或再生的矿物质，溶剂，分散剂，润湿剂，胶粘剂，加厚剂，粘合剂和肥料。

使用杀微生物剂组合物优选的方法是将其施用于植物的地上部分，尤其是施用于叶上(叶面施用)。施用的频率和速率取决于病原体的生物的和气候的生活条件。然而，如果植物的位点被液体制剂浸润(如水稻培养)或杀微生物剂以固体形式，如以颗粒形式被引入土壤(土壤施用)，杀微生物剂可以通过土壤或通过水(系统作用)通过根渗透至整株植物。为了处理种子，杀微生物剂也可施用于种子(包被)，可通过用杀微生物制剂浸泡或用已经合并的湿的或干的制剂包被块茎或谷粒，将杀微生物剂施用于种子(包被)。另外，在特殊情况下，可采取其它可能的施用方法，例如处理芽或果实束。

杀微生物剂可以未经修饰的形式使用或优选地，与制剂技术中常用的佐剂联合使用，所以要以已知的方法制成，如可乳化的浓缩物，可包被的膏状物，可直接喷洒或稀释的溶液，稀释的乳液，可润湿的粉末，可溶粉末，粉剂，颗粒体或在如多聚体物质中胶囊化。根据组合物的性质，与预期目的和大环境相一致，选择施用方法诸如喷，喷雾，撒粉，散射，包被或倾注。杀微生物剂施用的优势比率通常为50g-2kg活性成分/公顷，优选的是100g-1000g活性成分/公顷，特别是150g-700g活性成分/公顷，处理种子时，施用比率为每100kg种子0.5g-1000g，优选地0.5g-100g活性成分。

以已知方式制备制剂，如通过同源混合和/或用延展剂如溶剂，固体载体和若使用，表面活性化合物(表面活性剂)研磨杀微生物剂。

合适的溶剂为：芳香族碳氢化合物，优选地包括8-12碳原子的部分，如二甲苯氰混合物或替代的萘，氨甲酰苯甲酸，如邻苯二甲酸二辛酯，脂族碳水化合物，如环己烷或石蜡，醇和甘油及其乙醚和酯，如乙醇，乙二醇，乙二醇单甲基或单乙基乙二醇醚，酮，如环己酮，强极性溶剂，如N-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基亚砜或二甲基甲酰胺以及植物油或环氧化植物油，如环氧化椰子油或大豆油；或水。

固体载体，如用于粉剂和可分散的粉末的，通常是天然的矿物填料，诸如方解石，滑石，高岭土，胶岭石或硅镁土。为了改善物理特性，有可能添加高度弥散的硅酸或高度弥散的吸收剂高分子。合适的颗粒吸附性载体是多孔型的，例如，轻石，碎砖，海泡石或皂土以及合适的非吸附型载体是，如方解石或沙。另外，可使用多种预颗粒化的无机和有机物质，例如特别是白云石或磨碎的植物残渣。

根据杀微生物剂的性质，合适的表面活性复合物是具有好的乳化，分散和润湿特性的非离子，阳离子和/或阴离子表面活性剂。术语“表面活性剂”可被理解为包含表面活性剂的混合物。

特别有优势的施用促进佐剂是天然或合成的脑磷脂和卵磷脂系列的磷脂，如磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油和溶血卵磷脂。

农用化学药品组合物通常包括0.1-99％，优选地0.1-95％活性杀微生物成分，99.9-1％优选地99.9-5％固体或液体佐剂和0-25％，优选地0.1-2.5％表面活性剂。

尽管商业产品优选地制成浓缩液，最终使用者通常施用稀释制剂。B植物活化的杀微生物剂

如果杀微生物剂施用于通过上述的第二或第三条途径获得的免疫调节植物(选择育种或遗传工程)，它可以是SAR的化学诱导剂(植物活化的杀微生物剂)如苯并噻二唑化合物，异烟酸化合物或水杨酸化合物，它们描述于美国专利5,523,311和5,614,395中。因此，同时运用了两种免疫调节的方法。通过将植物活化的杀微生物剂施用于通过选择育种途径或遗传工程途径获得的免疫调节植物，产生了“外-免疫调节”，获得了协同增强的抗病性。

如下文所述，过量表达NIM1的转基因免疫调节植物比野生型植物对BTH的反应更快而且对低得多的剂量的BTH发生反应，这一点可以从PR-1基因表达和对寄生霜霉的抗性看出来。见实施例35和图3的Northern印迹。仅仅施用10uM BTH就可在NIM1过量表达体中达到协同增强的抗病性，这个浓度正常情况下根本不足以发挥任何效力。通过利用协同作用，可以避免使用诱导SAR的正常情况下具植物毒性或不希望浓度的化学药品。另外，如果SAR诱导化学药品运用对象已经是免疫调节植物，如NIM1过量表达体，人们可以利用SAR活化的时间过程的改变。而且，达到给定的保护植物水平所需要的SAR诱导化学药品量的减少也有一定的经济效益。C常规杀微生物剂与植物活化的杀微生物剂联合应用

为了得到更大的抗病性，可将常规的杀微生物剂和植物活化的杀微生物剂同时施用于通过选择育种途径或遗传工程途径获得的免疫调节植物。与单独通过免疫调节，通过免疫调节和一种类型的杀微生物剂，或通过同时施用两种类型的杀微生物剂(常规的和植物活化的)获得的抗病性水平相比，这样产生更高水平的协同抗病性。见，实施例19中的表35。抗病性评估

用本领域熟知的方法进行抗病性评估。见，Uknes等(1993)分子植物微生物相互作用6：680-685；Gorlach等(1996)植物细胞8：629-643；Alexander等，美国国家科学院院报90；7327-7331(1993)。例如，下文描述了几个典型的抗病性测定A寄生疫霉(phytophthora parasitica)(黑胫病)抗性测定

对导致黑胫病的微生物寄生疫霉的测定在按Alexander等美国国家科学院院报90：7327-7331(1993)描述的方法生长的六周龄的植物上进行。把植物弄湿，令其干透，然后向土壤中接种10ml孢子囊悬液(300孢子囊/ml)。将接种的植物置于温室中，保持白天温度23-25℃，夜晚温度20-22℃。测定萎蔫病的标准为：0＝无症状；1＝无症状；1＝有某些萎蔫的症状，膨胀度降低；2＝明显的萎蔫症状；没有腐烂或矮化；3＝明显的萎蔫症状，矮化，无明显的茎腐烂；4＝严重萎蔫，可见茎腐烂和根系统的某些损伤；5＝同4，但植物接近死亡或死亡，严重的根系统减退。所有的测定是在随机设计安排的植物上进行的。B丁香假单胞菌抗性测定

将浓度为每ml含10⁶或3×10⁶的丁香假单胞菌烟草病变种#551株的水溶液注射到几株6-7周龄植物的两片较低叶片上。每个时间点测量6株植物。以5个点疾病严重性对烟草野火病假单胞菌侵染的植物评级，5＝100％死组织，0＝无症状。对每天的评估进行T检验(LSD)，在平均疾病评级值后标明组别。在评估当天的数值后有同样字母的数据在统计学上没有明显差异。C烟草尾孢(Cercospora nicotianae)抗性测定

将烟草尾孢(ATCC#18366)的孢子悬液(100,000-150,000个孢子/ml)喷到叶子的表面直至流出，将植物在100％湿度下维持5天。然后每天用水雾喷洒植物5-10次。每个时间点评价6株植物。根据表现病症的叶片面积百分数对烟草尾孢进行评级。对每天的评估进行T-检验(LSD)，在平均疾病评级值后标明组别。在评估当天的数值后有同样字母的数据在统计据上没有明显差异。D寄生霜霉抗性测定

按Uknes等(1993)所描述的在植物上进行寄生霜霉抗性测定。通过喷洒分生孢子悬液(约5×10⁴个孢子/ml)给植物接种竞争性寄生霜霉分离物。接种的植物在具有14小时日照/10小时黑暗周期的生长室内于17℃一定湿度条件下生长。在接种后3-14天，优选地7-12天检测植物上分生孢子梗的存在。另外，随机选择每项处理的几株植物进行乳酚台盼蓝染色进行显微检查(Keogh等，Trans Br.Mycol Soc.74：329-333(1980))。附图简述图1是NIM1蛋白序列与小鼠、大鼠和猪的IκBα的序列对比。序列上方垂直线代表NIM1和IκBα序列之间的氨基酸是相同的(矩阵值＝1.5)；序列上方的双点(：)代表相似值＞0.5；序列上方的单点(·)代表相似值＜0.5但大于＞0.0；数值＜0.0表示无相似性序列上方并且没有标记(见实施例)。根据de Martin等，基因152，253-255(1995)确定了哺乳动物IκBα锚蛋白区的位置。序列内的点代表了NIM1和IκBα蛋白之间的缺口。通过序列下面断线指示了IκBα中的五个锚蛋白重复。根据NIM1蛋白标出了氨基酸的数目，在适当的地方引入缺口。加号(+)被放在序列上方每10个氨基酸外。

图2是NIM1蛋白区域(数字相当于SEQ ID NO：2中氨基酸位置)和水稻EST蛋白产物(SEQ ID NO：17-24)的氨基酸序列比较。

图3代表了Northern分析的结果，表明用水或BTH处理后，PR-1基因在野生型和NIM1过量表达株系中表达的时间进程。按实施例中描述的方法从经处理的植物制备和分析RNA。“Ws”为野生型拟南芥Ws生态型。“3A”，“5B”“6E”和“7C”是根据实施例21制备的独立的NIM1过量表达植物株系。“0BTH”是以水处理；“10BTH”是以10μM BTH处理；“100BTH”是以100μM BTH处理。“0”是第0天的对照样品；“1”，“3”和“5”是第1，3和5天的样品。序列表中序列简述

SEQ ID NO：1是包含野生型拟南芥NIM1基因编码区的5655bp基因序列。

SEQ ID NO：2是由SEQ ID NO：1的编码序列编码的野生型拟南芥NIM1蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是图1中的小鼠IκBα氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是图1中大鼠IκBα氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是图1中猪IκBα氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是拟南芥NIM1基因的cDNA序列。

SEQ ID NO：7和8分别是NIM1蛋白的显性失活形式的DNA编码序列和编码的氨基酸序列，此蛋白的第55和59位氨基酸是丙氨酸而不是丝氨酸。

SEQ ID NO：9和10分别是N末端删除的NIM1蛋白的显性失活形式的DNA编码序列和编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11和12分别是C末端删除的NIM1蛋白的显性失活形式的DNA编码序列和编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13和14分别是N末端和C末端都删除的显性失活形式的NIM1基因的DNA编码序列和编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15和16分别是NIM1锚蛋白区域的DNA编码序列和编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是图2中水稻-1氨基酸序列33-155。

SEQ ID NO：18是图2中水稻-1氨基酸序列215-328。

SEQ ID NO：19是图2中水稻-2氨基酸序列33-155。

SEQ ID NO：20是图2中水稻-2氨基酸序列208-288。

SEQ ID NO：21是图2中水稻-3氨基酸序列33-155。

SEQ ID NO：22是图2中水稻-3氨基酸序列208-288。

SEQ ID NO：23是图2中水稻-4氨基酸序列33-155。

SEQ ID NO：24是图2中水稻-4氨基酸序列215-271。

SEQ ID NO：25-32是寡核苷酸引物。定义

下列定义将有助于理解本发明：

植物细胞：植物的结构和生理结构，是由原生质体和细胞壁组成。术语“植物细胞”指植物的一部分细胞或来自植物的细胞。某些细胞的例子包括是活细胞一部分的分化细胞；培养的分化细胞；培养的未分化细胞；未分化组织诸如愈伤组织或肿瘤的细胞；种子，胚胎，繁殖体和花粉的分化细胞。

植物组织：组织成结构和功能单位的一群植物细胞。包括植物或培养的任何组织。这个术语包括但不限于整体植物，植物器官，植物种子，组织培养或组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞群。此术语与上述的任何特殊类型的植物组织或由此定义包含的任何特殊类型的植物组织联合使用或单独使用并不是要排除任何其它类型的植物组织。

原生质体：没有细胞壁的植物细胞。

后代植物：以有性方式或无性方式产生的未来世代植物，包括但不限于子代植物。

转基因植物：在基因组内稳定整合了重组DNA的植物。

重组DNA：将不同来源的或用重组DNA技术制备的DNA片段连接形成的任何DNA分子。

重组DNA技术：体外制备重组DNA和将重组DNA转入它可以表达或繁殖的细胞的技术(见，生物医学和分子生物简明词典，Juo编辑，CRC出版社Boca Raton(1996))，例如，以多种形式将DNA转移至原生质体或细胞，DNA包括(1)环形，线形或超螺旋形的裸露DNA，(2)包含于核小体或染色体或细胞核或其植物的DNA，(3)与其它分子复合或相关的DNA，(4)包含于脂质体，原生质球，细胞或原生质体中的DNA或(5)转自宿主以外的生物的DNA(如根瘤土壤杆菌)。这些和其它多种将重组DNA转入细胞的方法为本领域所熟知；可以用于制备本发明的转基因细胞或转基因植物。

重组DNA技术也包括可用于提高单子叶植物中过氧化物酶活性的Treco等，WO94/12650和Treco等，WO95/31560中描述的同源重组方法。特别是，调节区(如启动子)可以被转入植物基因组中以提高外源过氧化物酶的表达。

重组DNA技术也包括将缺乏选择表达信号的过氧化物酶编码序列插入单子叶植物并分析由于单子叶植物中的外源控制序列，转基因单子叶植物中过氧化物酶的表达提高。这将导致植物内过氧化物酶编码序列拷贝数的升高。

根据传统植物育种方法而不是此处描述的技术方法，最初将重组DNA插入R⁰植物的基因组不被定义为完成。在最初的插入后，用基本的传统的育种方法可以繁殖转基因后代。

嵌合基因：包含至少两个异源部分的DNA分子，即来自预先存在的DNA序列的部分不与其预先存在状态相关，优选地通过重组DNA技术制备这些序列。

表达盒：包含在启动子和终止子之间可以插入编码序列的DNA分子。

编码序列：DNA分子，转录和翻译时导致多肽或蛋白形成。

基因：包括负责控制表达即转录和翻译的调控DNA序列和编码序列的不连续的染色体区域，当转录和翻译时，此编码序列产生了独特的多肽或蛋白。

acd：加速细胞死亡的突变体植物

AFLP：扩增片段长度多态性

avrRpt2：毒性基因Rpt2，从丁香假单胞菌分离

BAC：细菌人工染色体

BTH：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯

CIM：组成型免疫表型(SAR组成型地活化)

cim：组成型免疫突变植株

cM：厘摩

cprl：PR基因突变体植株的组成型表达体

Col-O：拟南芥生态型Columbia

ECs：酶组合

Emwa：与拟南芥Ws-O生态型相容的寄生霜霉分离物

EMS：甲基磺酸乙酯

INA：2，6-二氯异烟酸

Ler：拟南芥生态型Landsberg erecta

lsd：损伤刺激疾病突变植株

nahG：将水杨酸转变成儿茶酚的水杨酸羟化酶恶臭假单胞菌

NahG：用nahG基因转化的拟南芥株系

ndr：非种特异性的抗病性突变植株

nim：非诱导免疫突变植株

NIM1：野生型基因，参与SAR信号转导级联反应

NIM1：野生型NIM1基因编码的蛋白

nim1：NIM1的突变等位基因，使植物对疾病易感；也指具有NIM1

的nim1突变等位基因的拟南芥突变植株

Noco：与拟南芥Col-O生态型相容的寄生霜霉分离物

ORF：开放读码框架

PCs：引物组合

PR：病理相关的

SA：水杨酸

SAR：系统获得性抗性

SAR-on：SAR活化的免疫调节植物，通常比野生型SAR基因表达

高并具有抗病性表型

SSLP：简单序列长度多态性

UDS：普遍疾病易感表型

Wela：与拟南芥Weiningen生态型相容的寄生霜霉分离体

Ws-O：拟南芥生态型Issilewskija

WT：野生型

YAC：酵母人工染色体

实施例

通过下文详细的方法、配方和实施例进一步详细说明本发明。实施例只是为了说明而不是限制本发明的范围。

此处所采用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知；Sambrook等分子克隆，编辑，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)，T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist.基因融合实验，冷泉港实验室出版社，冷泉港；纽约(1984)以及Ausubel F.M.等，现代分子生物学技术Greene Publishing Assoc和Wiley-Interscience(1987)中也描述了这些技术。I.将系统获得性抗性化学诱导剂与常规杀微生物剂联合施用于植物产

生的协同抗病性效果

在这组实施例中，通过运用SAR化学诱导剂如苯并噻二唑诱导植物的SAR。另外，常规的杀微生物剂也施用于这些植物。然后使植物接受来自各种病原体的致病压力。两种抵抗病原体的方法联合应用(诱导化学品+杀微生物剂)产生比加合作用大的效应即协同抗病性。这通过增效倍数(SF)来决定，即观察到的效果(O)与期望效果(E)的比率。

给定的活性成分联合作用的期望效果(E)可通过所谓的Colby公式来描述，按下述方法计算(Colby，S.R.“计算除草剂联合作用的协同和拮抗反应”杂草，第15卷，第20-22页(1967))：

ppm＝每升喷洒混合物中活性成分(＝a.i.)毫克数

X＝由活性成分I以p ppm活性成分施用时产生的作用百分数，

Y＝由活性成分II以q ppm活性成分施用时产生的作用百分数，

E＝由活性成分I+II以p+q ppm活性成分施用时产生的预期效果

(加性作用)。Colby公式为 $E=X+Y-\frac{X\×Y}{100}$ 实施例1在大麦上对禾白粉菌的作用

剩余保护作用：用水性喷洒混合物(最高为0.02％活性成分)喷洒约8cm高的大麦植物达到叶尖滴水的程度，3-4天后用真菌的分生孢子喷植物。被侵染的植物生长于22℃温室中。通常侵染10天后评价真菌的侵染。

系统作用：用水性喷洒混合物(最高为0.002％活性，取决于土壤的体积)浇灌8cm高的大麦植物。小心喷洒混合物使之不能接触植物的地上部分。3-4天后用真菌的分生孢子喷植物。被侵染的植物生长于22℃温室中。通常在侵染后10天评估真菌的侵染。表1大麦上抵抗白禾粉菌的作用成分I：苯并噻二唑-7-羧酸成分II：叶菌唑

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	123	0.626									04089
4567						0.62620		10405165
	891011	0.60.60.60.6		0.62620	1∶11∶31∶101∶30						37598178	10405165	3.71.51.61.2
1213			22			620	1∶31∶10	7898	7179	1.11.2

表2大麦上抵抗白禾粉菌的作用成分I：苯并噻二唑-7-羧酸成分II：氟醚唑

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	12	0.62									1427
34						0.62		4563
	56	0.60.6		0.62	1∶11∶3						7082	5368	1.31.2
7			2			0.6	3∶1	79	60	1.3

表3在大麦上对白禾粉菌的作用成分I：苯并{1，2，3}噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：叶菌唑

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	12	0.62									033
345						62060		173350
	678	0.60.60.6		62060	1∶101∶301∶100						335083	173350	1.91.51.7

实施例2：黄瓜上抵抗胡芦科毛盘孢(Colletotrichum lagenarium)

     的作用

培养10-14天后，用从可润湿的检测化合物粉剂制备的喷洒混合物喷洒黄瓜植株。3-4天后，用真菌的孢子悬液(1.0×10⁵孢子/ml)侵染植物，在高湿度下于23℃培养30小时。然后在常规湿度下于22-23℃继续培养。根据真菌侵染，侵染7-10天后评估保护作用。

培养10-14天后，通过土壤施用的方法，用从可润湿的检测化合物粉剂制备的喷洒混合物喷洒黄瓜植物。3-4天后，用真菌的孢子悬液(1.5×10⁵孢子/ml)侵染植物，在高湿度下于23℃培养30小时。然后在常规湿度下于22℃继续培养。根据真菌的侵染，侵染7-10天后评估保护作用。表4黄瓜/叶面施用抵抗胡芦科毛盘孢的作用成分I：苯并噻二唑-7-羧酸成分II：azoxystrobin

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	123	0.060.22									0522
4567						0.060.20.66		591217
	8	0.06		0.06	1∶1						16	5	3.2
91011			222			0.20.66	10∶13∶11∶3	654944	293135	2.21.61.3

表5黄瓜/土壤施用抵抗胡芦科毛盘孢的作用成分I：苯并噻二唑-7-羧酸成分II：azoxystrobin

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	1234	0.0060.020.060.2									0404991
5678						0.20.626		092866
	91011	0.006		0.20.62	1∶301∶1001∶300						113083	0928	*3.33.0
1213			0.020.06			66	1∶3001∶100	97100	8082	1.21.2

^*增效倍数不能计算表6黄瓜/叶面施用抵抗葫芦科毛盘孢的作用成分I：苯并噻二唑-7-羧酸成分II：kresoxime methyl

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	12	0.20.6									351
34						220		041
	56	0.20.2		220	1∶101∶100						1561	343	51.4

表7黄瓜/叶面施用抵抗葫芦科毛盘孢的作用成分I：苯并{1，2，3}噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：azoxystrobin

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	123	0.060.26									162260
45						26		1875
	67	0.060.2		22	1∶301∶10						4357	3136	1.41.6

表8黄瓜/土壤施用抵抗葫芦科毛盘孢的作用成分I：苯并{1，2，3}噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：azoxystrobin

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	1234	0.0060.020.060.2									062336
56789						0.020.060.626		15276193
	101112	0.0060.0060.006		0.020.62	1∶31∶1001∶300						264484	12761	261.61.4
1314			0.020.02			0.022	1∶11∶100	2377	764	3.31.2
	1516	0.060.06		0.022	3∶11∶30						4292	2470	1.81.3
17			0.2			2	1∶10	93	75	1.2

实施例3：烟草植物上抵抗烟草尾孢的作用

用检测化合物(浓度：最大值为0.02％活性成分)的制剂溶液喷洒烟草植物(6周龄)。处理后4天，用烟草尾孢(150,000孢子/ml)孢子囊悬液接种植物，在高湿度下放置4-5天后在常规的光照/黑暗节律进一步培养。根据侵染了真菌的叶表面评估实验中的症状。表9在烟草植物上对烟草尾孢的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：戊唑醇

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％  作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	1234	0.22620									0175578
56						26		00
	78	0.20.2		26	1∶101∶30						8797	00	* *
910			22			26	1∶11∶3	8794	1717	5.15.5
	1112	66		26	3∶11∶1						8790	5555	1.61.6
1314			2020			26	10∶13∶1	9797	7878	1.21.2

表10烟草植物上抵抗烟草尾孢的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：环唑醇

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	1234	0.22620									0175578
56						26		00
	78	0.20.2		26	1∶101∶30						7884	00	* *
910			22			26	1∶11∶3	9094	1717	5.35.5
	1112	66		26	3∶11∶1						8793	5555	1.61.7
1314			2020			26	10∶13∶1	100100	7878	1.31.3

表11烟草植物上抵抗烟草尾孢的作用成分I：苯并噻二唑-7-羧酸成分II：丁苯吗啉

测试号	kg活性成分/公顷		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	01234	--0.20.626		--							0(对照)036979
567						2610		132342
	891011	0.20.20.66		2626	1∶101∶301∶31∶1						526171100	13231683	42.74.41.2

表12烟草植物上烟草尾孢的作用成分I：苯并噻二唑-7-羧酸成分II：恶醚唑

测试号	kg活性成分/公顷		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	0123	--2620		--							0(对照)6979100
456						0.626		32332
	78	26		0.60.6	3∶110∶1						90100	7080	1.31.3

实施例4：在水稻植物上对Pyricularia oryzae的作用

将两周龄的水稻植物连同其根周围的土壤一起放在装有喷洒混合物(最大值0.006％活性成分)的容器中。96小时后，用此真菌的分生孢子悬液侵染水稻植物。在95-100％相对湿度下于24℃培养被侵染植物5天后评估真菌的侵染。表13水稻植株上抵抗Pyricularia oryzae的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-羧酸-S-甲酯成分II：KTU 3616

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	1	6									15
234567						0.020.060.20.626		02847798391
	8910111213	666666		0.020.060.20.626	300∶1100∶130∶110∶13∶11∶1						4276989810098	153955828692	2.81.91.81.21.21.1

在一块12m²的土地上，用从可润湿的活性成分粉制成的喷洒混合物喷洒水稻植物，自然侵染。侵染后44天测量被真菌侵染的叶的面积进行评估。结果如下：表14大田水稻植株上抵抗Pyricularia oryzae的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：咯喹酮

测试号	kg活性成分/公顷		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	-	--		--							0(对照)
12			0.250.5					2250
	34			0.751.5							4682
56			0.250.5			0.750.75	1∶31∶1.5	8085	5873	1.41.2

将两周龄的水稻植物连同其根周围的土壤一起放在装有喷洒混合物的容器中。36天后评估真菌侵扰。未经处理的植物的侵染作用百分数为0。表15水稻植株上抵抗Pyricularia oryzae的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：三环唑

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	1234	0.50.250.10.05									6539185
5678						10.50.250.1		74714832
	910111213	0.250.10.10.050.05		0.250.250.110.25	1∶11∶2.51∶11∶201∶5						7569618058	6857447550	1.11.21.41.11.2

实施例5在辣椒上对Colletotrichum属种类(碳疽病)和Cercospora

     属种类(叶斑病)的作用

对农作物产量的作用：在约10m²的土地上(试验位置：Cikampek，Java，Indonesia)，以每公顷500-700升的量对植物喷洒喷洒混合物总共7次，间隔约7天。首次喷洒3天后，用真菌人工侵染植物。表16抵抗毛盘孢属的作用：通过分析第五次喷洒后对辣椒果实的侵

染进行评估成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：代森锰锌

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	comp.II	O(观测值)	E(预测值)
	12	5		100							5512
3			5			100	1∶20	77	59	1.3

表17抵抗尾孢属的作用：通过分析第六次喷洒后对叶子的侵染进行

评估成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：代森锰锌

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	12	5		100							768
3			5			100	1∶20	87	78	1.1

表18对农作物产量的作用：第六次喷洒后收获辣椒。成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：代森锰锌

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	每公顷农作物产量(kg)		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	12	5		100							4598
3			5			100	1∶20	1400	约460	约3

实施例6：小麦中抵抗隐匿柄锈菌的作用

用从制成的活性成分制备的喷洒混合物或活性成分的组合喷洒7日龄的小麦植物至滴水叶尖。4天后，用此真菌分生孢子悬液侵染被处理的植物，随后被处理的植物于相对湿度90-100％下在20℃培养两天。侵染后10天，评估真菌侵染。表19小麦中抵抗隐匿柄锈菌的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：丙环唑

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	-1	--100		--							0(对照)51
2						5		10
	3	100		5	20∶1						79	56	1.4

表20小麦中抵抗隐匿柄锈菌的作用成分I：苯并噻二唑-7-羧酸成分II：苯锈啶

测试号	kg活性成分/公顷		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	-12	--620		--							0(对照)2040
34						2060		4060
	56	66		2020	1∶31∶10						7375	5268	1.41.1

实施例7：在小麦中对禾白粉菌的作用

在田间试验中(10m²)，用从可润湿的活性成分粉末制备的喷洒混合物喷洒处于生长期的冬小麦。自然侵染，侵染后10天评估真菌侵染。得到了下列结果：表21小麦中抵抗禾白粉菌的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：丙环唑

测试号	g活性成分/公顷		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	-1	--5		--							0(对照)29
23						50100		231
	45	55		50100	1∶101∶20						4959	3251	1.51.2

表22小麦中抵抗禾白粉菌的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：cyprodinil

测试号	g活性成分/公顷		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	-1	--5		--							0(对照)29
23						50100		231
	45	55		50100	1∶101∶20						4959	3251	1.51.2

实施例8在香蕉中对Mycosphaerella fijiensis的作用

用从可润湿的活性成分粉剂制成的喷洒混合物以17-19天的间隔喷洒300m²土地上的40棵香蕉植物，总共6次。自然侵染。测量真菌侵染的叶子进行评估。得到了下列结果：表23香蕉中抵抗Mycosphaerella fijiensis的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：丙环唑

测试号	g活性成分/公顷		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	-1	--50		--							0(对照)19
2						50		26
	3	50		50	1∶1						46	40	1.15

实施例9：在蕃茄中对马铃薯早疫病链格孢的作用

用从可润湿的活性成分粉末制备的喷洒混合物以7天间隔喷洒7m²土地上的蕃茄植物，总共9次。自然侵染。测量真菌侵染的叶子进行评估。得到了下列结果：表24大田中的蕃茄中抵抗马铃薯早疫病链格孢的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：cyprodinil

测试号	g活性成分/公顷		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	-1	--2.5		--							0(对照)32
23						12.525		3051
	45	2.52.5		12.525	1∶51∶10						7980	5367	1.51.2

实施例10在蕃茄中对致病疫霉的作用

用从可润湿的活性成分粉末制备的喷洒混合物或活性成分组合喷洒蕃茄植物“Roter Gnom”至叶尖滴水。4天后以真菌孢子囊悬液喷洒处理的植物，随后在相对空气湿度90-100％于18-20℃在小室中培养两天。侵染5天后评估真菌侵染。得到了下列结果：表25蕃茄上抵抗致病疫霉的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：氨丙灵

测试号	mg活性成分/升		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	-1234	--525100500		--							0(对照)14366172
5678						0.111050		13233568
	910111213141516	555525100100500		0.11105050105010	50∶15∶11∶21∶101∶210∶12∶150∶1						5062878492859597	2534447380758882	2.01.82.01.21.21.11.11.2

表26蕃茄中抵抗致病疫霉的作用成分I：苯并噻二唑-7-羧酸成分II：氨丙灵

测试号	mg活性成分/升		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值
	-	--		--							0(对照)
1234			0.10.515					092245
	5678			11050100							13336383
910111213			0.10.5115			111101	1∶101∶21∶11∶105∶1	3629577961	1321324852	2.81.41.81.61.2

实施例11黄瓜中抵抗古巴假霜霉的作用

用从可润湿的活性成分粉末制备的喷洒混合物或活性成分组合喷洒16-19天龄的黄瓜植物(“Wisconsin”)至叶尖滴水。4天后用古巴假霜霉(365株，Ciba；最大值5000个/毫升)孢子囊侵染处理的植物，随后在相对空气湿度70-90％下于18-20℃培养1-2天。侵染后10天评估真菌侵染并与未处理植物的侵染进行比较。得到下列结果：表27黄瓜中抵抗古巴假霜霉的作用成分I：苯并噻二唑-7-羧酸成分II：氨丙灵

测试号	mg活性成分/升		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	-1	--0.05		--							0(对照)0
23			0.55					666
	456			0.5550							316691
78910			0.050.050.50.5			0.550.55	1∶101∶1001∶11∶10	66838383	31663568	2.11.32.41.2

实施例12烟草植株上抵抗烟草霜霉菌的作用

用检测组合物制成的溶液喷洒烟草植物(6周龄)。处理4天后用真菌的孢子囊悬液接种植物，于高湿度下培养4-5天然后继续以正常光照/黑暗节律顺序继续培养。根据被真菌侵染的叶面评估试验中的症状。未处理植物的侵染作用百分数为0。表28烟草植株上抵抗烟草霜霉菌的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：烯酰吗啉

测试号	mg活性成分/升(ppm)		I∶II	％作用		SFO/E
							成分I	成分II	O(观测值)	E(预测值)
	123	0.030.10.3									143488
45						0.31		5252
	678	0.030.10.1		10.31	1∶331∶31∶10						749295	596868	1.31.41.4

实施例13拟南芥中抵抗寄生霜霉的作用

将杀真菌剂氨丙灵，乙磷铝和氢氧化铜以及SAR激活剂苯并(1，2，3)-噻二唑-7羟酸S-甲酯(BTH)与可润湿的粉末载体分别制成25％，80％，70％和25％的活性成分，它们以精细尘粉的形式施用于三周龄的植物上。单独施用可润湿的粉末作为对照。三天后，按Delaney等(1995)描述的方法以寄生霜霉分生孢子悬液接种植物。用可相容的寄生霜霉分离物Emwa(1-2×10⁵孢子/m)接种Ws植物；以可相容的寄生霜霉分离物Noco2(0.5-1×10⁵孢子/ml)接种Col植物。接种后，覆盖植物以维持高的湿度，并将之放置在17℃的具有14小时光照/10小时黑暗循环的生长室内(Uknes等，1993)。接种8周后收获组织。

通过在解剖显微镜下对分生孢子的发育进行评级，跟踪真菌侵染进程12天(Delaney等(1994)；Dietrich等(1994))。对单独叶片进行乳酚台盼蓝染色以观察叶组织内真菌的生长。用NS1和NS2作引物，寄生霜霉EmWa DNA作为模板根据White等(1990，PCR方法，方法和应用指南，第315-322页)的方法进行PCR得到的rRNA真菌探针对真菌生长进行定量。以酚/氯仿抽提后氯化锂沉淀的方法从冰冻组织中纯化RNA(Lagrimini等，1987美国国家科学院院报，84：7542-7546)。根据Ausbel等1987)描述，通过甲醛琼脂糖凝胶电泳分离样品(7.5μg)并将分离的样品转移至尼龙膜上(Hybond-N⁺， Amersham)。根据Church和Gilbert(1984，美国国家科学院院报，81：1991-1995)的方法进行杂交和洗涤。根据厂商说明用Phosphor Imager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)测定转录本的相对量。通过以组成型表达b-微管拟南芥cDNA探测条状滤纸进行样品上样标准化。未处理的植物侵染的真菌生长抑制为零。得到了下列结果：表29拟南芥(Col-O)中抵抗寄生霜霉NoCo2的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：氨丙灵

测试号	成分		真菌生长抑制％		增效倍数O/E
						BTH	氨丙灵	O(观测值)	E(预测值)
	对照	--	--	0
1					0.01mM	--	0
	2	--	0.1mg/l	0
3					0.01mM	0.1mg/l	40.7	0	∞

表30拟南芥(Ws)中抵抗寄生霜霉Emwa的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：氨丙灵

测试号	成分		真菌生长抑制    ％		增效倍数O/E
						BTH	氨丙灵	O(观测值)	E(预测值)
	对照	--	--	0
12					0.01mM0.003mM		200
	345		2.5mg/l0.5mg/l0.1mg/l	755050
6789					0.01mM0.01mM0.01mM0.003mM	2.5mg/l0.5mg/l0.1mg/l2.5mg/l	1009588100	90707075	1.11.41.31.3

表31拟南芥(Ws)中抵抗寄生霜霉Emwa的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：乙磷铝

测试号	成分		真菌生长抑制  ％		增效倍数O/E
						BTH	乙磷铝	O(观测值)	E(预测值)
	对照	--	--	0
1					0.01mM		30
	234		1.0g/l0.2g/l0.04g/l	40100
567					0.01mM0.01mM0.01mM	1.0g/l0.2g/l0.04g/l	10010095	704030	1.42.53.2

表32拟南芥(Ws)中抵抗寄生霜霉Emwa的作用成分I：苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II：氢氧化铜

测试号	成分		真菌生长抑制    ％		增效倍数O/E
						BTH	Cu(OH)2	O(观测值)	E(预测值)
	对照	--	--	0
1					0.01mM	--	30
	2		0.01g/l	0
3					0.01mM	0.01g/l	85	30	2.8

从表29中可以看出，野生型拟南芥Col-O植物中表现出了协同抗病性作用。通过将0.01mM BTH或0.0001g/L氨丙灵单独施用于植物未观察到真菌生长抑制，因为这些浓度在正常情况下不足以有效力。然而，以正常情况不足浓度的两种化合物同时施用，观察到40.7％的真菌生长抑制，很明显是协同效应。表30-32表示了野生型拟南芥Ws植物中的协同抗病性效应。将0.01mM BTH施用于Ws植物，只能观察到20-30％的真菌生长抑制。然而，同时将BTH和氨丙灵，乙磷铝或氢氧化铜同时施用于植物，可观察到协同抗病性。联合抗真菌效应降低了控制病原体所需的杀真菌剂和13TH有效浓度，从而减少了阻止真菌生长所需的化学剂量，所以可以缓和由于化学耐受导致了的叶破坏。II通过将常规杀微生物剂和/或系统获得性抗性化学诱导剂施用于组成型免疫(CIM)突变植物获得的协同抗病性效应

在这组实施例中，发展了高流通量的Northern印迹筛选鉴定在正常生长中具有高浓度PR-1 mRNA的突变植物，认为这些突变植物也表现系统获得性抗性。用这种筛选获得了大量突变体；它们不仅表现出PR-1的积累而且也表现出PR-2和PR-5 mRNA的积累(Lawton等(1993)；Dietrich等(1994)及Weymann等(1995)。这些突变体中SA水平升高，抵抗病原体侵染，证实这种方法可用于分离SAR信号转导突变体。

用这种筛选分离到了两组SAR信号转导突变体。一组被命名为lsd突变体(lsd＝损伤刺激疾病)。此组突变体在WO94/16077中公开为“cim组I”，此公开在此引用作为参考。lsd组(aka cim I组)在叶子上自发形成损伤，积累高浓度的SA，高水平的PR-1，PR-2和PR-5 mRNA，对真菌和细菌病原体有抗性(Dietrich等，1994；Weymann等，1995)。

第二组，被称为cim(cim＝组成型免疫)在下文有所描述具有除自发损伤以外所有的lsd突变体的特征。第二组(cim)相当于WO94/16077公开的“cim组II”突变体。下文描述的cim3突变植物系属于cim组(cim组II)是显性突变，其野生型表型为表达稳定的高水平的SA，SAR基因mRNA并具有广泛的抗病性。实施例14具有组成型SAR基因表达的cim突变体的分离和鉴定

将1100个单独的M₂诱变(EMS)拟南芥植物生长于Aracon盘中(lehle seeds，Round Rock，TX)生长，每组约100个。按上述Uknes等，1993描述的方法培养植物，特别注意避免过度浇水和病原体侵染。简而言之，用水饱和Metro Mix360并以10升为一组高压灭菌3次70分钟。每次高压灭菌之间充分搅拌载种混合物。将种子置于20％(lorox中5分钟进行消毒，在播种前用消毒水洗7次。将播种的种子春化3-4天后以9小时白昼15小时夜晚的周期于22℃在房中培养。当植物长至三至四周龄时，收获1至2片50-100mg重的叶子，用快的微量RNA制备方法分离总RNA(Verwoerd等(1989)核酸研究17，2362)。通过Norther印迹分析分析PR-1基因表达(Lagrimini等(1987)，美国国家科学院院报84，7542-7546；Ward等，1991)。每一组植物包括未经处理的和以INA处理(0.25mg/m)两天的拟南芥作为对照。所有植物的维持按照Weymann等(1995)所述进行。

鉴定了80株可能积累高水平PR-1 mRNA的突变体。对其后代进行试验，挑选了5株进行进一步鉴定。在没有病原体或诱导处理的情况下，假定的cim突变体SAR基因表达升高。对假定cim突变体后代试验证实组成型的PR-1表达是可以遗传的。在cim突变体中，cim2和cim3水平是最高的，进一步鉴定了最稳定的PR-1表达。

用隐性无毛性状作为鉴定F₁子代的标记与Columbia进行回交。在花粉散布前去掉Col-g11花芽，立即和施用来自突变体的花粉F₁植物在土壤中生长，通过香花簇的出现鉴定异型杂交植物。

cim2和cim3与生态型Col-O或La-er杂交后，鉴定到大部分的SAR基因高表达的F₁植物，表明这些性状是显性的。对于cim2而言，有些而不是全部F₁植物组成型表达SAR基因。如果cim2突变体是显性的而且以杂合子的形式存在亲本中，才可期望得到这样的结果。cim2进一步的遗传试验表明F₂代中有连续可变分离，这与不完全显性一致。

cim3在F₁代中表现出1∶1分离，两个表达高水平PR-1mRNA的F₁植物自交产生F₂群体。通过对PR-1 mRNA积累划分等级，F₂分离为93株F₂植物高表达PR-1 mRNA，52株F₂植物没有明显的PR-1 mRNA积累，比率为3∶7∶1(C²＝1.77；0.5＞P＞0.1)，这与cim3是显性单基因突变的假设相一致。随后的异型杂交证实cim3作为显性突变遗传。

对于cim3而言，在筛选中鉴定的最初M2植物和M3群体看上去正常。然而，因为cim植物是自交的，某些表达最好的品系受精能力较低。与Col-gll回交后得到了具有正常表现和受精能力以及PR-1表达强的植物

最初鉴定时，cim3稍微有些矮；而且有薄而变形的叶子。然而，与野生型Col-gl杂交产生的F₂植物保留了SAR基因高表达，而且不能与野生型植物区分。这表明矮的变性的表型是由与组成型SAR基因表达无关的独立突变引起的。当植物在无菌条件下生长时，也可观察到cim3突变表型，证实了PR-1 mRNA积累不是由病原体引起。实施例15：SARA基因表达

除PR-1之外，cim3也高表达另外两种SAR基因，PR-2和PR-5。后代中SAR基因表达水平不同，但总比未被处理的对照高10倍，与经抗性诱导的INA(0.25mg/ml)处理野生型植物得到的水平相似。实施例16：水杨酸分析

病原体诱导拟南芥坏死后，内源性SA浓度升高(Uknes等，1993，上述)。根据Uknes等；1993所述，分析了水杨酸及其葡萄糖偶联物。从10株cim3和10株对照4周龄植物中收获叶组织。收获单株植物的叶子并分析其PR-1基因表达。测量表达PR-1植物的SA水平。cim3中自由SA的浓度比未受侵染的野生型拟南芥的高3.4倍(分别为233±35VS 69±8ng/g鲜重)。cim3中SA葡萄糖偶联物(SAG)比未受侵染的野生型拟南芥高13.1倍(分别为4519±473VS 344±58ng/g鲜重)。SA和SAG升高的水平与报道的病原体侵染的组织或epr突变体的水平可以比拟。实施例17：抗病性

评估了cim3对拟南芥霜霉病致病因子寄生霜霉(NoCo2)的抗性。根据Uknes等1991，上述，所述将寄生霜霉接种约4周龄的cim(由PR-1RNA表达证实)30株，对照植物(野生型Columbia)30株。7天后，根据keogh等(1980)Trans Br Mycol.Soc 74，329-333及koch和Slusarenko(1990)植物细胞2437-445所述分析植物孢子形成并用盼台蓝染色观察真菌结构。野生型(Col-O)植物支持菌丝，分生孢子和卵孢子生长，而以INA(0.25mg/ml)处理的野生型植物和cim植物不能支持真菌生长。典型的cim3介导的抗性可在病原体侵染部位看到一小群死细胞。这种抗性与lsd突变体(Dietrich等，1994，上述，Weymann等，1995，上述)或SAR被诱导的野生型植物(Uknes等，1992，上述)中的抗性相似。通常，可观察到中间抗性表型，包括cim3植物中尾随菌丝尖的蔓延坏死。蔓延坏死与用低剂量的SA或INA处理的野生型植物中发现的相似(Uknes等，1992上述，Uknes等，1993，上述)。然而，cim3植物上从未见卵孢子生长而所有的对照植物都表现出卵孢子生长。盼台蓝染色未见未接种的cim3叶子上有自发的损伤。

除了对真菌病原体寄生霜霉有抗性外，cim3对细菌病原体丁香假单胞菌DC3000的侵染也有抗性。用丁香假单胞菌DC3000悬液接种六周龄的野生型(±INA处理)以及cim3植物，在时间进程中通过监测从侵染叶片中提取的细菌的生长跟踪疾病的进展。在第0天和第2天Col-O，Col-O+INA和cim3细菌滴度之间的差异在统计学上不明显。然而，第4天时，野生型植物和cim3植物的细菌生长有31倍的降低(P＜0.003，Sokal和Rohlf，1981)。肉眼观察植物以检测病症。野生型植物的叶子严重退绿，病症大大超出了最初接种区域。相反，以INA预处理的野生型植物或cim3植物中几乎没有病症。

在这个实施例中，于28℃在含有利福平(50μg/ml)的King B培养基上(琼脂平板或液体)上培养丁香假单胞菌蕃茄株DC3000(Walen等(1991)植物细胞3，45-59)。稀释过夜培养物并以2-5×10⁵细胞/ml重新悬浮于10mM MgCl₂中并注射到拟南芥叶子中。用28号针头在叶子的中上部扎一个洞，然后用1cc注射器将约250ul稀释的细菌溶液注射到洞中。在不同的时间点，用1号木栓打孔器从每一种处理的10株植物取3个随机的叶片穿孔片，总共有10个随机样品。将3个穿孔片放在含有300ul 10mM MgCl₂的Eppendorf管内并用研杆研磨。合适地稀释得到的细菌悬液并将之接种在含利福平(50μg/ml)的King B培养基上于28℃培养4天。计数细菌克隆，对数据进行Student数据分析(Sokal和Rohlf(1981)，Biometry，第二版，纽约：W.H.Freemanand Company)。

在这个实施例中，将2，6-二氯异烟酸(INA)悬浮于无菌去离子水中形成制成可润湿的粉剂中的25％活性成分(0.25mg/ml，325μM；Kessmann等(1994)植物病理学年评32，439-59)。所有的植物以水或I溶液喷洒至即将流出的程度。实施例18：SA在SAR基因表达和抗病性中的作用

为了研究cim3中SA，SAR基因表达和抗性之间的关系，对表达水杨酸羟化酶(nahG)基因的拟南芥植物进行杂交(Delaney等，1994)。通过利用土壤杆菌介导的转化将35S驱动的nahG基因转化至拟南芥制备了“NahG植物”。见，Huang H，Ma，H.(1992)Plant Mol.Biol.Rep.10，372-383，在此引用作为参考；Gaffney等(1993)科学261，754-756，在此引用作为参考；以及Delaney等(1994)科学266，1247-1250，在此引用作为参考。Col-nahG拟南芥除了具显性nahG基因外，还携带显性卡那霉素抗性基因，因此Col-nahG用作花粉供体。将F₁种子于水中水化30分钟，然后以10％(lorox 0.05％吐温20进行表面灭菌5分钟并用无菌水彻底冲洗。将种子接种于含有25mg/ml卡那霉素的培养上(GM，Murashige和Skoog培养基，含10g/L蔗糖，0.5g/L2-(吗啉)乙磺酸，以KOH调节pH为5.7)以筛选F₁植物。见Valvekens等(1988)美国国家科学院院报85，5536-5540。18天后将具有卡那霉素抗性的F₁植物转移至土壤中。通过Northern印迹分析证实在所有实验中都有nahG基因的存在和PR-1的表达。

因为cim突变体和nahG表型都是显性的，可在F₁植物中分析这两个基因之间的上位性。分析了cim3×nahG杂交的70株F₁植物中的PR-1和nahG基因表达。mRNA表达的Northern印迹分析中，nahG基因的存在与SAR基因表达的抑制相关。通过分析得到的F₂分离体中的PR-1 mRNA证实每一株F₁都有cim的存在。

为了确定对于抗病性cim3突变是否对于nahG是上位的，cim3×nahG杂交的5株F₁植物自交，种植了20-30粒F₂种子，其中5株F₁植物已被证实有nahG缺少PR-1mRNA。分析了F₂群体中单株植物中的nahG和PR-1mRNA的表达，然后以寄生霜霉(NoCo₂)攻击这些植物以评估其疾病易感性。nahG基因的存在消除了由cim3赋予的抗病性，表明在SAR基因表达和抗病性表型中nahG对于cim3是上位的。实施例19：将杀微生物剂和/或BTH施用于cim突变体获得的协同抗病性

在病原体接种前3天，将以可润湿的粉末载体制成25％活性成分(ai)的化学诱导剂系统获得性抗性BTH(苯并[1，2，3]噻二唑-7-羧酸-S-甲酯)(Metraux等，1991)和/或制成25％活性成分的杀微生物剂metulaxyl(cGA48988)，或单独将可润湿的粉末以精细粉尘的形式施用于4周龄植物的叶子。用可相容的病原体寄生霜霉NoCo₂分生孢子悬液(1.8×10⁵孢子/ml)接种植物。接种后，覆盖植物以保持高的湿度并将之放在17℃的14小时白昼/10小时夜晚周期的Percival生长室内(Uknes等，1993)。接种后8天收获植物。

用以NS1和NS2作引物寄生霜霉EmWa DNA作为模板，根据White等(1990；PCR方法：方法和应用指南，第315-322页)的PCR的方法获得的rRNA真菌探针测定真菌生长。通过酚/氯仿抽提后氯化锂沉淀的方法从冷冻的组织中纯化RNA(Lagrimini等，1987：美国国家科学院院报84：7542-7546)。根据Ausbel等(1987)描述的通过甲醛琼脂糖凝胶电泳分离样品(7.5ng)并印迹到尼龙膜上(Hybond-N⁺，Amersham)。根据Church和Gilbert(1984，美国国家科学院院报81；1991-1995)的方法进行杂交和洗涤。根据厂商说明用PhosphorImager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)测定转录本的相对量。通过以组成型表达b-微管拟南芥cDNA探测条状滤纸进行样品上样标准化。未被处理的植物侵染的真菌生长抑制为零。

单独将氨丙灵，“植物活化剂”BTH或将氨丙灵和BTH同时施用于上述的cim植物产生了比加性大的，即协同抗病性效应。以增效倍数(SF)即观察到的(O)效应与期望的(E)效应的比值测定效应。得到了下列结果。表33拟南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分I：cim3突变成分II：氨丙灵

测试号	成分		真菌生长抑制  ％		增效倍数O/E
						cim3	氨丙灵	O(观测值)	E(预测值)
	对照	wt	--	0
1					cim3	--	12.5
	2345	wtwtwtwt	12.5mg/l2.5mg/l0.1mg/l0.02mg/l	52.700ND
678					cim3cim3cim3	12.5mg/l2.5mg/l0.1mg/l	ND82.257.8	ND12.512.5	ND6.64.6
	9	cim3	0.02mg/l	55.6						ND	ND

WT＝野生型Col-OND＝未测定表34拟南芥中抵抗寄生霜霉的作用成份I：cim3突变成份II：BTH

测试号	成分		真菌生长抑制  ％		增效倍数O/E
						cim3	BTH	O(观测值)	E(预测值)
	对照	wt	--	0
1					cim3	--	12.5
	234	wtwtwt	0.1mM0.03mM0.01mM	85.720.80
567					cim3cim3cim3	0.1mM0.03mM0.01mM	ND73.116.6	98.233.312.5	ND2.21.3

WT＝野生型Col-OND＝未测定表35拟南芥中抵抗寄生霜霉的作用成份I：cim3突变成份II：BTH和氨丙灵(M)

测试号	成分		真菌生长抑制％		增效倍数O/E
						cim3	BTH+M	O(观测值)	E(预测值)
	对照	wt	--	0
1					cim3	--	12.5
	2	wt	BTH0.01mM+M0.5mg/l	100
34					wtwt	BTH0.01mM+M0.1mg/lBTH0.01mM+M0.02mg/l	40.7ND
	567	cim3cim3cim3	BTH0.01mM+M0.5mg/lBTH0.01mM+M0.1mg/lBTH0.01mM+M0.02mg/l	ND10077.7						10053.2ND	ND1.9ND

WT＝野生型Col-OND＝未测定

由上列表中可以看出，通过单独施用氨丙灵，单独使用BTH和联合使用氨丙灵和BTH，cim3植物可表现出协同抗病性效应。例如，与未被处理的野生植物相比，可见未被处理的cim3植物有12.5％真菌生长抑制；这表明cim3突变体中SAR基因的组成型表达与抗病性相关。然而，如表30中所示，通过将氨丙灵以0.0001g/l(正常情况下不足以有效的浓度)施用于免疫调节的(SAR-开)cim3植物，观察到的真菌生长抑制水平提高至57.8％。从这些数据计算到的增效倍数4.6清楚地表明通过将杀微生物剂施用于免疫调节植物得到的协同效应。

表31中列出的数据表明协同是通过将系统获得性抗性化学诱导剂诸如BTH施用于免疫调节的(SAR-开)cim3植物得到的。例如，在野生型植物中，0.03mM的BTH正常情况下不足以赋予有效的抗病性，只提供20.8％真菌生长抑制。然而，在cim3植物中，正常情况下不足浓度的BTH可提供73.1％真菌生长抑制，几乎与推荐的BTH的有效浓度0.1mM的抑制水平一样高。从表31中的数据中计算的增效倍数2.2清楚地表明通过将BTH施用于免疫调节植物得到的协同效应是通过其它途径得到的。

当BTH和氨丙灵同时施用于cim3植物时，抗病性效应更为明显。如上文实施例13(表29)所述，在野生型植物中，单独施用0.01mMBTH或0.0001g/l氨丙灵不能获得真菌生长抑制，因为这些浓度正常情况下不足以产生效应。然而，通过同时将这些在正常情况不足浓度的组合物施用于植物，可观察到40.7％真菌生长抑制，对于野生型植物来说是一种协同效应。在cim3植物中，同时施用0.01mMBTH和0.001g/l氨丙灵可产生100％真菌生长抑制，这表明有进一步的协同活性。

因此，将正常情况下无效的低浓度化学药品联合用于免疫调节cim植物得到的抗病性提供了对于农业领域技术人员来说很明显的优势。通过利用本文表现出的协同性优势，可避免正常情况下有毒的或不希望浓度的化学药品。另外，由于达到给定植物保护水平需要的化学药品量降低可以实现经济上的收益。

III通过将常规的杀微生物剂和/或系统获得性抗性化学诱导剂施用于包含NIM1基因形式的转基因植物获得的协同抗病性效应

NIM1基因是植物的系统获得性抗性(SAR)途径的关键成分(Ryals等，1996)。通过化学和生物诱导剂NIM1基因与SAR的活化相关联，与这些诱导剂相连是SAR和SAR基因表达必需的。通过分子生物学分析已知携带突变nim1基因植物的基因组确定NIM1基因的位置，此基因使宿主植物对多种病原体极其敏感从而使它们不能对病原体和SAR化学诱导剂进行应答。已对拟南芥的野生型NI曲因进行了作图和测序(SEQ ID NO：1)。野生型NIM1基因产物(SEQ ID NO：2)参与了导致拟南芥中SAR和基因-对-基因抗病性的信号转导级联反应(Ryals等，1997)。野生型形式的NIM1的重组过量表达使免疫调节植物具有组成型免疫(CIM)表型，因此可赋予转基因植物抗病性。活性NIM1蛋白水平的升高产生的抗病性效应与诱导化学药品诸如BTH，INA和SA等产生的化学诱导抗病性效应相同。见，共同悬而未决的美国申请08/880,179，在此引用作为参考。

而且，已表明NIM1基因产生是哺乳动物信号转导因子IκBα亚类的结构同系物(Ryals等，1997)。IκB的突变可作为NF-κB/IκB调节程序的超阻抑物或显性失活物。因此，某些NIM1的改变形式可作为SAR信号转导通路的显性-失活调节物。这些NIM1的改变形式赋予转化了它们的植物的表型与nim1突变体相反，即，转化了NIM1的改变形式的免疫调节植物表现出组成型SAR基因表达和CIM表型。见，共同悬而未决的PCT申请“用NIM1基因赋予植物抗病性的方法”，在此引用作为参考。实施例20：用包含野生型NIM1基因的粘粒克隆转化植物

粘粒D7(于1996年9月25日以ATCC97736贮存于美国典型培养物保藏中心)是从包含DIM1基因区产生而来因此包括野生型NIM1基因(SEQ ID NO：1)。粘粒E1也是从包含NIM1基因区域产生而来因此也包括野生型NIM1基因(SEQ ID NO：1)。根据美国专利申请08/880,179描述的，通过辅助株AB101(pRK2013)以三亲交配通过接合转移将粘粒D7和E1移入根瘤土壤杆菌AGL-1。用真空抽滤将这些粘粒转化卡那霉素敏感的nim1突变拟南芥系(Mindrinos等，1994，细胞78，1089-1099)。收获抽滤植物的种子并使其在含有50mg/ml卡那霉素作为筛选剂的GM琼脂板上发芽。划平板约两周后将经受了筛选的幼苗转移至土壤中。

转移至土壤中的植物在转移后在人工气侯室中大约生长一周。用Chromister将300mMINA以精细的粉尘施用并完全覆盖植物。约两天后，收获叶子以抽提RNA并进行PR-1表达分析。用寄生霜霉(分离物EmWa)喷洒植物，于高湿度条件下在19℃白昼/17℃夜晚温度和8小时光照/16小时黑暗周期的生长室中生长。真菌侵染8-10天后，评估植物对真菌生长划分阳性或阴性。在每一组实验中以同样的方式处理Ws和nim1植物作为对照。

用LiCl/酚抽提缓冲液从收集的组织中提取总RNA(Verwoerd等，1989，核酸研究，2362)。在甲醛琼脂糖凝胶上分离RNA样品并将它转移至GeneScreen Plue(DuPont)膜上。用³²P标记的PR-1 cDNA探针对印迹进行杂交。将得到的印迹对胶片进行曝光以确定经INA处理后诱导PR-1表达的转化子。

为了观察是否D7和E1转化子过量表达NIM1是由于插入位点(位置)效应，包含D7或E1粘粒的初级转化子进行自交并收集T2种子。将来自一株E1系和95株D7系的种子播种于土壤中并按上述的方法生长。当T2植物至少有4片真叶时，分别收集每株植物的一片叶子。从组织中提取RNA，分析PR-1和NIM1表达。用寄生霜霉(EmWa)接种植物并于侵染后10天分析真菌生长。大多数转化子真菌生长比正常低，其中的4个即D7-2，D7-74，D7-89和E1-1系根本没有可见的真菌生长。植物比正常NIM1和PR-1表达水平高并具有真菌抗性表明NIM1过量表达赋予抗病性。实施例21：NIM1在其天然启动子下过量表达

用包含1.4kb启动子序列的BamHI-HindIII NIM1基因组片段(SEQID NO：1-碱基1249-5655)转化Ws野生型植物产生组成型表达NIM1基因的植物。将此片段克隆入pSGCG01并转化入土壤杆菌菌株GV3101(pMP90，Koncz和Schell(1986)，Mol Gen Genet 204：383-396)。按前述方法抽滤Ws植物。收获得到的种子并将之接种于含50ug/ml卡那霉素的GM琼脂上。将存活的植物转移至土壤中并按前述方法检测对寄生霜霉分离物Emwa的抗性。被选择的植物自交并继续筛选两代以产生纯合系。将其中几个品系的种子播种在土壤中，培养每种品系的15-18株植物三周，再次在不用诱导化学药品处理的前提下检测Emwa抗性。在真菌处理后约24小时，48小时天收获，合并，冷冻每个品系的组织。植物继续在生长室中生长至接种后10天，然后说估其对Emwa的抗性。

从收集的所有样品中制备RNA并按前述方法进行分析(Delaney等，1995)。印迹与拟南芥基因探针PR-1进行杂交(Uknes等，1992)。被分析的13株转基因植物中的五株表现出PR₁基因表达的早期诱导。在这些品系中，真菌处理后24或48小时PR-1 mRNA比较明显。这五个品系也没有可见的真菌生长。按照(Dietrich等，1994)所述用乳酚蓝染叶片以证实叶片里没有真菌菌丝。48小时时在其它8个品系中没有PR-1基因的诱导表达，这些植物对Emwa无抗性。

也检测了一亚组抗性株系的对细菌病原体丁香假单胞菌DC3000抗性的提高以评估按照Uknes等(1993)描述的抗性范围基本上按照Lawton等(1996)描述的方法进行实验。那些细菌生长缓慢的品系也表现出对Emwa的组成型抗性。这表明NIM1基因在其天然启动子下过量表达的植物对病原体有组成型免疫性。

为了评估这些品系中CIM表型的其它特征，评估未受侵染的植物中自由的和与葡萄糖偶联的水杨酸，用乳酚蓝染叶片以评估微损伤的出现。抗性植物以有性方式与SAR突变体诸如NahG和ndr1杂交以建立抗性表型和其它突变体的上位关系，评估NIM1的显性失活突变体如何影响水杨酸依赖的反馈环。实施例22：35S启动的NIM1的过量表达

将全长NIM1 cDNA(SEQ ID NO：6)克隆至pCGN1761 ENXr EcoRI位点(Comai等(1990)植物分子生物学15，373-381)。从产生的质粒中得到了含有增强的CaMV 35S启动子，转录正确方向的NIM1 cDNA和tm1 3′终止子的Xba I片段。这个片段被克隆至双元载体pCIB200并被转入GV3101。按前述方法抽滤Ws植物。收获得到的种子并将之接种在含50ug/ml卡那霉素的GM琼脂上。将存活的幼小植物转移至土壤中，按前述方法进行检测。所选的植物进行自交并继续选择两代以产生纯合系。当用Emwa处理而又没有用化学药品处理时被检的58个品系中有9个表现出抗性。因此，NIM1 cDNA的过量表达也会产生抗病性。实施例23：NIM1是IκBα的同系物

在NIM1的蛋白基因产物和IκB之间进行多序列对比，表明NIM1基因产物是IκBα的同系物(图1)。用BLAST(Al+schul等，分子生物学杂志215，403-410(1990))进行序列同系物搜索。用ClustV(Higgin等，CABIO 5，151-153(1989))作为DNASTAR(Madison，WI)公司的Lasergene Biocomputing Software包的一部分构建了多序列对比。用于对比的序列是NIM1(SEQ ID NO：2)，小鼠IκBα(SEQ IDNO：3，基因库录入号1022734)，大鼠IκBα(SEQ ID NO：4，基因库录入号57674和X63594；Tewari等，核酸研究20，607(1992)和猪IκBα(SEQ ID NO：5，基因库录入号Z21968；de Martin等，欧州分子生物学组织杂志12，2773-2779(1993)；基因录入号517193，deMartin等，基因152，253-255(1995))。用于Clustal分析的参数是gap penalty 10和gap length penalty 10。用PAM250 weight table计算进化趋异距离(Dayhoff等，“一种蛋白进化变化模型。检测远关系矩阵”，蛋白序列和结构图集，第5卷增补3，M.O.Dayhoff编辑(国家生物医学研究基金会，Washiagton D.C.)第345-358页(1978))。用改进的Dayhoff table计算残基相似性(Schwartz和Dayhoff，“一种蛋白进化变化模型”，蛋白序列和结构图集，M.O.Dayhoff编辑(国家生物医学研究基金会，Washington，D.C.)第353-358页(1979)；Gribskov和Burgess核酸研究14，6745-6763(1986))。

同源性搜索表明NIM1与几种蛋白，包括锚蛋白，NF-κB和IκB的锚蛋白区域有同源性。总同源性最好的是与IκB及相关分子的同源性(图1)。NIM1在第55位和第59位氨基酸有两个丝氨酸；第59位的丝氨酸处于邻近效应序列中(D/ExxxxS)，此位置(N-末端)与磷酸化依赖的，遍在蛋白介导的可诱导降解作用是一致的。所有的IκBα都含这些N-末端丝氨酸，并且是IκB失活及随后的NF-κB释放所必需的。NIM1具有锚蛋白区域(氨基酸260-290和323-371)。据认为锚蛋白区域涉及蛋白蛋白相互作用；是IκB和NF-κB分子的普遍特征。IκB的C末端可以是不相似的。NIM1与某些IκB C-末端的QL-丰富区(氨基酸491-499)有某些相似性。实施例24：第55和59位丝氨酸残基换成丙氨酸残基的NIM1的改变形式的制备

人IκBα中丝氨酸残基的磷酸化是刺激活化的IκBα降解及其活化NF-κB所必需的。将人IκBα中丝氨酸残基(S32-S36)诱变成丙氨酸抑制了刺激诱导的磷酸化由此封闭IκBα蛋白体-介导的降解(E.Britta-Mareen Traenckuer等，欧洲分子生物学组织杂志14：2876-2883(1995)；Broun等，科学267：1485-1488(1996)；Brockman等，分子和细胞生物学15：2809-2818(1995)；Wang等，科学274：784-787(1996))。

此改变形式的IκBα作为一种显性失活形式将NF-κB阻滞在细胞浆中，由此封闭下游信号转导事件。根据NIM1和IκB之间的序列比较，NIM1的丝氨酸55(S55)和59(S59)与人IκBα中的S32和S36同源。为了构建显性失活形式的NIM1，第55和59位的丝氨酸被突变成丙氨酸残基。这可通过本领域技术人员熟知的方法进行，诸如，用QuikChange定点诱变试剂盒(#200518：Strategene)。

以下列引物(SEQ ID NO：6，位置192-226)根据厂商说明，用包含42bp5′非翻译序列(UTR)和187bp的3′UTR的全长NIM1 cDNA(SEQID NO：6)可制备成诱变构建体：5′-CAA CAG CTT CGA A GC CGT CTTTGA C GC GCC GGA TG-3′(SEQ ID NO：25)和5′CAT CCG GCG  CGT CAAAGA CGG  CTT CGA AGC TGT TG-3′(SEQ ID NO：26)，其中下划线的碱基为突变位置。技术路线为：将克隆至载体pSE936(Elledeg等，美国国家科学院院报88：1731-1735(1991))的NIM1 cDNA变性与包含有改变碱基的引物退火。DNA聚合酶(pfu)通过非链置换延伸引物从而产生有缺刻的环形链。用限制性核酸内切酶DpnI消化DNA，它只切割甲基化位点(非诱变的模板DNA)。剩余的环形双链DNA用以转化大肠杆菌株XL-1-BLue。从得到的克隆中提取质粒并进行序列测序以证实有突变碱基存在同时没有其它突变出现。

用限制性核酸内切酶EcoRI消化诱变的NIM1 cDNA并将它克隆至pCGN1761，使它处于花椰菜花叶病毒双35S启动子的转录调控下。通过XbaI部分消化将包含35S启动子，NIM1 cDNA和tm1终止子的转化盒并将之连接到去磷酸化的pCIB200的XbaI位点。SEQ ID NO：7和8分别表示了NIM1基因的改变形式的DNA编码序列及其编码的氨基酸序列。实施例25：N末端删除的NIM1的改变形式的制备

将人IκBα第1-36位氨基酸(Brockman等；Sun等)或第1-72位氨基酸包括K21，K22，S32和S32删除导致了转化人细胞培养物中的显性失活IκBα表型。NIM1 cDNA编码产物的N-末端删除约125个氨基酸去除了可能作为遍在蛋白化位点的8个赖氨酸残基及S55和S59位可能的磷酸化位点(见实施例2)。通过本领域技术人员熟知的任何技术，可制备改变的基因构建体。例如，用Ho等基因77：51-59(1989)的方法，可制备编码约前125个氨基酸的DNA被删除的NIM1形式。下列引物可产生一个1612bp的PCR产物(SEQ ID NO：6：418-2011)：5′-ggaattca- ATG GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG-3′(SEQ ID NO：27)和5′-gga att cTA CAA ATC TGT ATA CCA TTG G-3′(SEQ ID NO：28)，其中合成的起始密码子被下划线(ATG)，EcoRI接头序列为小写。

用包含0.1-100ng模板DNA，10mM Tris pH8.3/50mM KCl/2mMMgCl₂/0.00％明胶/0.25mM每种dNTP/0.2mM每种引物和1单位rTth DNA聚合酶的终体积为50μl的反应混合液在Perkin Elmer Cetus 9600PCR机器上扩增片段。PCR条件如下：94℃ 3分钟：35×℃(94℃30秒：52℃1分钟：72℃2分钟)：72℃10分钟。PCR产物直接克隆至pCR2.1载体(Invitrogen)。用限制性内切酶EcoRI消化使PCR产生的插入片段从PCR载体中释放出来并将之连接到去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位点，使之处于双35S启动子的转录调控之下。对构建体进行序列测定以证实合成起始ATG的存在并证实PCR过程中没有发生其它突变。通过XbaI部分限制性消化将包含35S启动子，修饰的NIM1cDNA和tm1终止子的转化盒从pCGN1761中释放出来连接到pCIB200的XbaI位点。SEQ ID 9和10分别表示了具有N-末端氨基酸删除的NIM1基因的改变形式的DNA编码序列及其氨基酸序列。实施例26 C末端删除的NIM的改变形式的制备

据认为删除人IκBα的第261-317位氨基酸会通过阻断C末端的丝氨酸和苏氨酸残基的组成型磷酸化导致增强的内在的稳定性。NIM1C末端的第522-593位氨基酸含有一段丝氨酸和苏氨酸丰富区。通过删除编码第522-593位氨基酸的核苷酸序列可对NIM1基因的C末端编码区进行修饰。用Ho等(1989)的方法，通过PCR删除了NIM1cDNA(SEQ ID NO：6：1606-2011)的C-末端编码区和3′UTR，产生了一个1623bp的片段，所用的引物为：5′-cggaattcGATCTCTTTAATTTGTGAATTTC-3′(SEQ ID NO：29)和5′-ggaattcTCAACAGTTCATAATCTGGTCG-3′(SEQ ID NO：30)，其中，一个合成的终止密码子被下划线(互补链上为TGA)，EcoRI接头序列是小写字母。PCR反应成分与前文所述的相同，循环参数如下：94℃3分钟：35×(94℃ 30分钟：52℃ 30秒：72℃ 2分钟)；72℃10分钟]。PCR产物被直接克隆到pCR2.1载体(Invitrogen)。用EcoRI进行限制性核酸内切酶消化将PCR载体中PCR产生的插入片段游离出来并连接到包含双35S启动子的去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位点。对此构建体进行序列测定以证实合成的符合读框的终止密码子的存在，同时证实PCR过程中没有出现其它突变。通过用Xba I进行部分限制性消化将包含启动子，饰的NIM1 cDNA和tm1终止子的转化盒从pCGN1761中释放出来连接到去磷酸化的pCIB200的Xba I位点。SEQ ID NO11和12分别表示了一种改变形式的C-末端氨基酸删除的NIM1基因的DNA编码序列和编码的氨基酸序列。实施例27：N-末端/C-末端删除嵌合NIM1的改变形式的制备

用第819位(SEQ ID NO：6)的一个单一的KpnI限制性位点可制备N-末端和C-末端缺失形式的NIM1(SEQ ID NO：6)。N-末端删除形式(实施例25)是用EcoRI/KpnI限制性核酸内切酶消化产生的，通过凝胶电泳回收与修饰的N末端一致的415bp的片段。同样，C末端删除形式是用EcoRI/KpnI限制性核酸内切酶消化产生的，通过凝胶电泳回收与修饰的C-末端一致的790bp的片段。将片段于15℃连接，用EcoRI消化以消除EcoRI多联体并将之克隆至去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位点。Nlc末端删除形式的NIM1处于双35S启动子的转录调控下。相似地，可制备由诱变的推测的磷酸化位点S55/S59(实施例24)与C-末端删除(实施例26)融合形成的嵌合形式的NIM1。此构建体通过上述方法制备。对此构建体进行序列测定以证实起始和终止密码子的忠实性并证实克隆过程中没有出现突变。通过用Xba I部分限制性消化各自的包含35S启动子，NIM1嵌合体和tm1终止子的转化盒释放出来连接到去磷酸化的pCIB200的Xba I位点。SEQ ID NO13和14分别表示改变形式的N-末端和C末端氨基酸都缺失的NIM1基因的DNA编码序列及其编码的氨基酸序列。实施例28：锚蛋白区域的NIM1的改变形式的制备

NIM1在约103-362氨基酸处与锚蛋白基序有同源性。用Ho等(1989)的方法，通过PCR[条件：94℃3分钟：35×(94℃ 30秒：62℃30秒：72℃ 2分钟)：72℃ 10分钟]从NIM1 cDNA(SEQ ID NO：6：349-1128)扩增编码推测的锚蛋白区域的DNA序列(SEQ ID NO：1：3093-3951)，所用引物为：5′-ggaattca ATGGACTCCAACAACACCGCCGC-3′(SEQ ID NO：31)和5′-ggaattc TCAACCTTCCAAAGTTGCTTCTGATG-3′(SEQ ID NO：32)。用EcoRI限制性核酸内切酶消化得到的产生然后连接到去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位点，它处于双35S启动子的转录调控下。对构建体进行序列测定以证实合成的起始密码子(ATG)，符合读框的终止密码子(TGA)的存在，同时证实PCR过程没有出现其它突变。通过用Xba I部分限制性核酸内切酶消化将包含35S启动子，锚蛋白区域和tm1终止子的转化盒从pCGN1761中释放出来并连接到去磷酸化的pCIB200的Xba I位点。SEQ ID NO15和16分别表示了NIM1锚蛋白区域的DNA编码序列及其编码的氨基酸序列。实施例29：嵌合基因的构建

为了提高NIM1的改变形式的合适的空间和时间表达的可能性，一个4407bp包含NIM1启动子和基因的HindIII/BamHI片段(SEQ ID NO：1：碱基1249-5655)和/或一个5655bp的EcoRV/BamHI片段(SEQ IDNO：1：碱基1-5655)用于制备上述实施例24-28的NIM1的改变形式。尽管构建步骤可能不同，思路与此述上文描述的实施例相似。改变形式的强过量表达有可能是致死性。所以，实施例24-28中描述的NIM1基因的改变形式可以放在内源性的NIM1启动子以外的启动子的控制下，包括但不局限于nos启动子或Rubisco启动子的小亚单位。同样，改变形式NIM1可在病原体-反应启动子PR-1的控制下表达(美国专利5,614,395)。这样的表达只在病原体攻击或其它SAR活化条件下允许NIM1的改变形式强表达。而且，当用在正常情况下不活化SAR的浓度的SAR激活剂化合物(即BTH或INA)处理时，在PR-1启动子调控下表达改变形式的NIM的转化子中，抗病性可以明显，由此活化反馈环(Weymann等，(1995)植物细胞7：2013-2022)。实施例30：将NIM1的改变形式转化入拟南芥

制备的构建体(实施例24-29)通过电穿孔进入GV3101株而移入根瘤土壤杆菌。这些构建体通过真空抽滤(Mindrinos等，细胞78，1089-1099(1994))或通过标准根转化用以转化拟南芥生态型Col-O和Ws-O。收获这些植物的种子并使它们在以卡那霉素(或其它合适的抗生素)作为筛选剂的琼脂平板上发芽。只有转化的幼小植物能够解除筛选剂的毒性而生存。经受筛选的幼苗被转移至土壤中检测其CIM(组成型免疫)表型。通过与野生型植物比较，评估可观察到的表型差异。实施例31：评估转化了野生型NIM1基因或NIM1基因的改变形式的植物的CIM表型

收获每一株初级转化体的一片叶子，分离RNA(Verwoerd等，1989，核酸研究，2362)，通过RNA印迹分析检测组成型PR-1表达(Uknes等，1992)。评估每一株植物的表示组成型SAR表达分析的增强的抗病性反应(Uknes等，1992)。制备了两种可相容的寄生霜霉分离物，Emwa和Noco，的浓度为5-10×10⁴孢子/ml分生孢子悬液(即，这些真菌株分别导致野生型Ws-O和Col-O植物的疾病)，根据转化子的野生型，用合适的分离物喷洒转化子。在第7天对植物进行疾病分级，收获一片叶子用探针进行RNA印迹分析，提供了一种测量真菌侵染的方法。

生产表现CIM表型的转化子的T₁代并鉴定纯合子植物。根据下述对转化子进行一系列的抗病性测试。根据Dietrich等(1994)描述的，用Noco和Emwa重复进行真菌侵染，用乳酚蓝染叶子以鉴定真菌菌丝的存在。根据Uknes等(1993)描述的，用细菌病原体丁香假单胞菌DC3000侵染转化体以评估抗性范围。评估未受侵染叶子的自由和葡萄糖偶联的SA，用乳酚蓝染叶子以评估微小损伤的出现。抗性植物通过有性方式与SAR突变体如NahG(美国专利5,614,395)和hdr1杂交以建立抗性表型与其它突变体的上位关系，评估NIM1的显性失活突变体如何影响SA依赖的反馈环。实施例32：NIM1同系物的分离

通过在中等严格条件下与拟南芥或优选与一个来自拟南芥NIM1基因的寡核苷酸探针杂交可以得到NIM1同系物，此探针包括至少10核苷酸的其编码序列连续部分。影响杂合体稳定性的因素决定了杂交的严谨性。其中因素之一是解链温度Tm，根据DNA探针，George HKeller和Mark M.Manak；Macmillan Publisher Ltd，1993第一部分；分子杂交技术；第8页提供的公式很容易计算出Tm值。优选的杂交温度是比计算的解链温度Tm低约25℃的温度，如果是寡核苷酸，是比解链温度Tm低约5-10℃的温度。

用NIM1 cDNA(SEQ ID NO：6)作探针，通过筛选不同农作物的基因文库或cDNA文库确定拟南芥NIM1的同系物，这些农作物包括但不局限于实施例33中所列出的。完成此项工作的标准技术包括平板DNA文库的杂交筛选(噬斑或克隆；见如Sambrook等，分子克隆，编辑，冷泉港实验室出版社(1989))以及用寡核苷酸引物通过PCR扩增(见，如Innis等，PCR方法，方法和应用指南编辑，Academic Press(1990))。鉴定的同系物通过遗传工程整合到此处表达载体中并转化到上述的农作物中。用被检农作物植物的相关病原体评估转化子的增强的抗病性。

已通过DNA印迹分析检测了黄瓜，蕃茄，烟草，玉米，小麦和燕麦基因组中的NIM1同系物。从黄瓜，蕃茄，烟草，玉米，小麦和大麦中分离基因组DNA，用BamHI，HindIII，XbaI或SalI限制性切割上述基因组，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离切割后的基因组并通过毛细印迹将它们转移到尼龙膜上。经UV-交叉固定DNA后，用³²P-放射标记的拟南芥NIM1 cDNA与膜在低严格条件下杂交[(1％BSA；520mM NaPO₄，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mM EDTA；250mM氯化钠)于55℃杂交18-24小时]。杂交后，在低严格条件下洗涤印迹[6×SSC 15分钟(×3)，3×SSC 15分钟(×1)，于55℃；1×SSC是0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠(pH7.0)]，对X-光胶片曝光以观察与NIM1一致的带。

另外，通过与NIM1基因相似鉴定的表达序列标签(EST)可用于分离同系物。例如，通过与NIM1基因的相似性鉴定了几个水稻表达序列标签(ESTs)。用ClustalV(Higgins，Desmond G.和Panl M.Sharp(1989)，微型计算机的快速敏感的多序列对比；CABIOS 5：151-153)作为DNA^*(1228 South Park Street，Madison Wisconsin，53715)Lasergen Biocomputing Software package for theillacintosh(1994)的一部分构建成多序列对比。NIM1蛋白的某些区域与4个不同的水稻cDNA蛋白产物的氨基酸序列同源。在GenBankBLAST搜索用NIM1序列确定了同源性。NIM1和水稻cDNA产物的同源区域的比较列于图2(见SEQ ID NO：2和SEQ ID NO17-24)。此NIM1蛋白片段与4个水稻产物有36-48％共同的氨基酸序列。这些水稻EST对于从其它单子叶植物中分离NIM1同系物特别有用。

也可通过PCR得到同系物。在这种方法中，在已知同系物(如水稻和拟南芥)之间进行了比较。氨基酸和DNA高度相似或完全相同的区域可用作PCR引物。氨基酸M和W丰富的区域后面最好是氨基酸残基F，Y，C，H，Q，K和E丰富的区域，因为这些氨基酸由有限数量的密码子编码。一旦确定了合适的区域，通过不同的第三位密码子的替代可制备那个区域的引物。靶物种限制第三位替代的多样性。例如，因为玉米为GC丰富，如果可能的话，设计引物时在第三位用G或C。在多种标准条件下对cDNA或基因组DNA进行PCR反应。如果出现了一条带，则克隆它并/或对它测序以确定它是NIM1同系物。实施例33：一种NIM1在农作物植物中表达

赋予Col-O或Ws-O CIM表型的构建体被转化到农作物植物进行评估。替代地，从前述实施例中分离的改变了的天然NIM1基因被放回各自的植物中。尽管NIM1基因可被插入到广泛范围的任何植物细胞，它对于农作物细胞特别有用，诸如水稻，小麦，燕麦，黑麦，玉米，土豆，胡萝卜，甘薯，甜菜，菜豆，豌豆，菊苣，莴苣，卷心菜，花椰菜，花茎甘蓝，芜菁，小萝卜，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，茄子，胡椒，芹菜，胡萝卜，西葫芦，南瓜，zucchini，黄瓜，苹果，梨，榅桲，甜瓜，李，樱桃，桃，油挑，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，凤梨，鳄梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，烟草，蕃茄，高梁和甘蔗。评估转化子的增强的抗病性。在本发明一个优选实施方案中，NIM1基因的表达水平甚少是野生型植物中天然NIM1表达水平的两倍，优选地，比野生型表达水平高10倍。实施例34：通过将常规杀微生物剂施用于过量表达NIM1的转基因植物得到的协同抗病性

用于本实施例(6E和7C)的植物品系是根据实施例21描述的，用BamHI-HindIII NIM1基因片段(SEQ ID NO：1-碱基1249-5655)转化野生型拟南芥植物(生态型Ws)得到的。将杀真菌剂氨丙灵乙磷铝和氢氧化铜分别以可润湿的粉末载体制成25％，80％和70％活性成分(ai)以精细粉尘的形式施用于三周龄的组成型表达NIM1基因的转基因植物Ws的叶子上。单独施用可润湿粉末作为对照。三天后，根据Delaney等(195)所述，用寄生霜霉分离物Emwa分生孢子悬液(1-2×10⁵孢子/ml)接种植物。接种后，覆盖植物以保持高湿度，并将之放置在17℃14小时光照/10小时黑暗周期的Pervical生长室内(Uknes等，1993)。接种后8天收获组织。

通过在解剖显微镜下观察对分生孢子的发育划分等级(Delaney等(1994)；Dietrich，等，1994)，跟踪真菌侵染进程12天。对单个叶片进行乳酚台盼蓝染色以观察叶片内真菌生长。用以NS1和NS2为引物，以寄生霜霉EmWa DNA为模板，根据White等(1990；PCR方法，方法和应用指南，第315-322页)的方法通过PCR获得的rRNA真菌探针对真菌生长进行定量。通过酚/氯仿抽提后氯化锂沉淀的方法(Lagrimini等，1987，美国国家科学院院报84：7542-7546)，从冷冻组织中纯化RNA。根据Ausbel等(1987)所述通过甲醛琼脂糖凝胶电泳分离样品(7.5ug)并将它迹到尼龙膜上(Hybond N⁺，Amersham)。根据Church和Gilbert(1984，美国国家科学院院报81：1991-1995)进行杂交和洗涤。根据厂商说明用Phosphor Image(Molecular DynamicsSunnyvale，CA)确定转录本的相对量。通过以组成型表达b-微管拟南芥cDNA探测条状滤纸进行样品上样标准化。未被处理的植物侵染的真菌生长抑制为零。

将氨丙灵，乙磷铝或氢氧化铜施用于过量表达NIM1的植物品系产生一个比加性大的即协同抗病性效应。效应根据增效倍数(SF)测定，SF是观察的(O)效应与期望的(E)效应的比率。得到如下结果：表36拟南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分I：NIM1过量表达(6E株系)成分II：氨丙灵

测试号	成分		真菌生长抑制  ％		增效倍数O/E
						NIM1	氨丙灵	O(观测值)	E(预测值)
	对照	wt	--	0
1					NIM1	--	10
	23	wtwt	0.0125g/l0.0012g/l	5927
4					NIM1	0.0125g/l	76	69	1.1
	5	NIM1	0.0012g/l	56						37	1.5

WT＝野生型Ws表37拟南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分I：NIM1过量表达(6E株系)成分II：乙磷铝

测试号	成分		真菌生长抑制    ％		增效倍数O/E
						NIM1	乙磷铝	O(观测值)	E(预测值)
	对照	wt	--	0
1					NIM1	--	10
	234	wtwtwt	5.0g/l0.5g/l0.05g/l	720
567					NIM1NIM1NIM1	5.0g/l0.5g/l0.05g/l	938342	171210	5.56.94.2

WT＝野生型Ws表38拟南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分I：NIM1过量表达(7C系)成分II：乙磷铝

测试号	成分		真菌生长抑制  ％		增效倍数O/E
						NIM1	乙磷铝	O(观测值)	E(预测值)
	对照	wt	--	0
1					NIM1	--	14
	23	wtwt	5.0g/l0.5g/l	72
45					NIM1	5.0g/l0.5g/l	8056	2116	3.83.5
		NIM1

WT＝野生型Ws表39拟南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分I：NIM1过量表达(6E株系)成分II：氢氧化铜

测试号	成分		真菌生长抑制  ％		增效倍数O/E
						NIM1	Cu(OH)2	O(观测值)	E(预测值)
	对照	wt	--	0
1					NIM1	--	10
	234	wtwtwt	2.0g/l0.2g/l0.02g/l	000
567					NIM1NIM1NIM1	2.0g/l0.2g/l0.02g/l	661420	101010	6.61.42.0

WT＝野生型Ws表40拟南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分I：NIM1过量表达(7C株系)成分II：氢氧化铜

测试号	成分		真菌生长抑制  ％		增效倍数O/E
						NIM1	Cu(OH)2	O(观测值)	E(预测值)
	对照	wt	--	0
1					NIM1	--	14
	234	wtwtwt	2.0g/l0.2g/l0.02g/l	000
567					NIM1NIM1NIM1	2.0g/l0.2g/l0.02g/l	775155	141414	5.53.63.9

WT＝野生型Ws

从上述表中可以看出，通过施用氨丙灵，乙磷铝和氢氧化铜，过量表达NIM1的植物表现出协同抗病性效应。例如，未处理的NIMI植物中(6E系)相对于未处理的野生型植物有10％真菌生长抑制；这表明此NIM1过量表达者中组成型的SAR基因表达与抗病性相关。然而，可以从表37中看出，通过将乙磷铝以5.0g/l(正常情况下不足以有效的浓度)施用于免疫调节的(SAR-开)NIM1过量表达植物，观察到的真菌生长抑制增加到93％。从这些资料计算得出的5.5的增效倍数清楚地表明了将杀微生物剂施用于免疫调节植物(SAR-开)得到的协同效应。在另一个实施例中，未被处理的NIM1植物(7C系)相对于未处理的野生型植物有14％的真菌生长抑制，表明此NIM1过量表达者中组成型的SAR基因表达与抗病性相关。然而，可以从表40看出来，通过将氢氧化铜以2.0g/l(正常情况下不足以有效的浓度)施用于免疫调节的(SAR-开)NIM1过量表达植物，观察到的真菌生长抑制增加到77％。从这些资料计算得出的5.5的增效倍数清楚地说明了将杀微生物剂施用于免疫调节植物(SAR-开)得到的协同效应。

因此，将过量表达NIM1的免疫调节植物与低的，在正常情况下不足以有效浓度的杀微生物剂联合应用得到抗病性的优势对于农业领域的技术人员来说很明显。利用此处表明的协同性优势，可避免正常情况下有毒或另外的不希望的杀微生物剂浓度。另外，由于达到给定保护植物水平所需要的杀微生物剂的量减少，可以实现经济效益。实施例35将SAR化学诱导剂施用于过量表达NIM1的转基因植物得到的协同抗病性

也分析了包含有在自身启动子控制下的NIM1基因组DNA片段(实施例21)的植物相对于野生型Ws品系对不同浓度的BTH的反应。按照前述方法播种培养每一品系的种子。种植后约3周，从每一品系上收获叶样品(第0天作对照)，剩余的植物以H₂O，10uM BTH或100uM BTH处理。处理1，3和5天收获另外的样品。收获了第3天的样品后，每个品系的一亚组植物被移走并根据上述方法用寄生霜霉分离物Emwa进行处理。从收获的组织中制备RNA，以拟南芥PR-1基因探针进行Northern分析。侵染后8天对植物真菌抗性进行划分等级。

对Ws和4株NIM过量表达品系(3A，5B，6E和7E)的Northern分析结果示于图3。经低水平的10uM BTH处理后(正常情况下BTH的有效浓度为100-300uM)，野生型Ws品系中几乎检测不到PR-1基因表达。经这种处理的Ws植物仍然对真菌病原体寄生霜霉(Emwa)敏感。然而，在所有NIM-1过量表达品系中，在低水平BTH处理后有一个强的多的PR-1基因表达反应。另外，用10uM BTH处理的所有NIM1过量表达品系表现出对寄生霜霉全部或部分抗性。用乳酚蓝染叶子以鉴定真菌菌丝的存在(Dietrich等，1994))证实NIM1过量表达品系中没有真菌生长。相对于野生型而言，经100uM BTH处理后，NIM1过量表达品系的叶组织中的PR-1基因表达强的多而且也快得多。因此，从PR-1基因表达和对寄生霜霉的抗性可以看出，免疫调节植物能对低的多的BTH作出快的多的反应。这个数据表明通过将系获得性抗性化学诱导剂诸如BTH施用于免疫调节(SAR-开)植物诸如NIM1过量表达植物可以获得协同抗病性。

因此，将过量表达NIM1的免疫调节植物与低的在正常情况下不足以有效浓度的杀微生物剂联合应用得到抗病性的优势对于农业领域的技术人员来说很明显。利用此处表明的协同性优势，可避免正常情况下有毒或另外的不希望的杀微生物剂浓度。另外，由于达到给定保护植物水平所需的杀微生物剂的量减少，可以实现经济效益。

                      序列表(1)基本信息(i)申请人：

  (A)名称：NOVARTIS AG

  (B)街道：Schwarzwaldallee 215

  (C)城市：Basel

  (D)国家：瑞士

  (F)邮政编号：4002

  (G)电话：+41 61 696 11 11

  (H)传真：+41 61 696 79 76

  (H)电传：962 991(ii)发明名称：保护植物的方法(iii)序列数：32(iv)计算机可读形式

  (A)介质类型：软盘

  (B)计算机：IBM PC兼容机

  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

  (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(2)关于SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征

 (A)长度：5655个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无  (ix)特征：

 (A)名称/关键：外显子

 (B)位置：2787..3347

 (D)其它信息：/产物＝“NIM1的第一个外显子”(ix)特征：

 (A)名称/关键：外显子

 (B)位置：3427..4162

 (D)其它信息：/产物＝“NIM1的第二个外显子”(ix)特征：

 (A)名称/关键：外显子

 (B)位置：4271..4474

 (D)其它信息：/产物＝“NIM1的第三个外显子”(ix)特征：

 (A)名称/关键：外显子

 (B)位置：4586..4866

 (D)其它信息：/产物＝“NIM1的第四个外显子”(ix)特征：

 (A)名称/关键：CDS

 (B)位置：连接(2787..3347，3427..4162，4271..4474，4586..4866)。(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TGTGATGCAA GTCATGGGAT ATTGCTTTGT GTTAAGTATA CAAAACCATC ACGTGGATAC          60ATAGTCTTCA AACCAACCAC TAAACAGTAT CAGGTCATAC CAAAGCCAGA AGTGAAGGGT         120TGGGATATGT CATTGGGTTT AGCGGTAATC GGATTGAACC CTTTCCGGTA TAAAATACAA         180AGGCTTTCGC AGTCTCGGCG TATGTGTATG TCTCGGGGTA TCTACCATTT GAATCACAGA         240ACTTTTATGT GCGAAGTTTT CGATTCTGAT TCGTTTACCT GGAAGAGATT AGAAAATTTG         300CGTCTACCAA AAACAGACAG ATTAATTTTT TCCAACCCGA TACAAGTTTC GGGGTTCTTG         360CATTGGATAT CACGGAACAA CAATGTGATC CGGTTTTGTC TCAAAACCGA AACTTGGTCC         420TTCTTCCATA CTCCGAACTC TGATGTTTTC TCAGGATTAG TCAGATACGA AGGGAAGCTA       480GGTGCTATTC GTCAGTGGAC AAACAAAGAT CAAGAAGATG TTCACGAGTT ATGGGTTTTA       540AAGAGCAGTT TTGAAAAGTC GTGGGTTAAA GTGAAAGATA TTAAAAGCAT TGGAGTAGAT       600TTGATTACGT GGACTCCAAG CAACGACGTT GTATTGTTTC GTAGTAGTGA TCGTGGTTGC       660CTCTACAACA TAAACGCAGA GAAGTTGAAT TTAGTTTATG CAAAAAAAGA GGGATCTGAT       720TGTTCTTTCG TTTGTTTTCC GTTTTGTTCT GATTACGAGA GGGTTGATCT GAACGGAAGA       780AGCAACGGGC CGACACTTTA AAAAAAAAAT AAAAAAAATG GGCCGACAAA TGCAAACGTA       840GTTGACAAGG ATCTCAAGTC TCAAGTCTCA ATTGGCTCGC TCATTGTGGG GCATAAATAT       900ATCTAGTGAT GTTTAATTGT TTTTTATAAG GTAAAAAGGA ATATTGAATT TTGTTTCTTA       960GGTTTATGTA ATAATACCAA ACATTGTTTT ATGAATATTT AATCTGATTT TTTGGCTAGT      1020TATTTTATTA TATCAAGGGT TCCTGTTTAT AGTTGAAAAC AGTTACTGTA TAGAAAATAG      1080TGTCCCAATT TTCTCTCTTA AATAATATAT TAGTTAATAA AAGATATTTT AATATATTAG      1140ATATACATAA TATCTAAAGC AACACATATT TAGACACAAC ACGTAATATC TTACTATTGT      1200TTACATATAT TTATAGCTTA CCAATATAAC CCGTATCTAT GTTTTATAAG CTTTTATACA      1260ATATATGTAC GGTATGCTGT CCACGTATAT ATATTCTCCA AAAAAAACGC ATGGTACACA      1320AAATTTATTA AATATTTGGC AATTGGGTGT TTATCTAAAG TTTATCACAA TATTTATCAA      1380CTATAATAGA TGGTAGAAGA TAAAAAAATT ATATCAGATT GATTCAATTA AATTTTATAA      1440TATATCATTT TAAAAAATTA ATTAAAAGAA AACTATTTCA TAAAATTGTT CAAAAGATAA      1500TTAGTAAAAT TAATTAAATA TGTGATGCTA TTGAGTTATA GAGAGTTATT GTAAATTTAC      1560TTAAAATCAT ACAAATCTTA TCCTAATTTA ACTTATCATT TAAGAAATAC AAAAGTAAAA      1620AACGCGGAAA GCAATAATTT ATTTACCTTA TTATAACTCC TATATAAAGT ACTCTGTTTA      1680TTCAACATAA TCTTACGTTG TTGTATTCAT AGGCATCTTT AACCTATCTT TTCATTTTCT      1740GATCTCGATC GTTTTCGATC CAACAAAATG AGTCTACCGG TGAGGAACCA AGAGGTGATT      1800ATGCAGATTC CTTCTTCTTC TCAGTTTCCA GCAACATCGA GTCCGGAAAA CACCAATCAA      1860GTGAAGGATG AGCCAAATTT GTTTAGACGT GTTATGAATT TGCTTTTACG TCGTAGTTAT      1920TGAAAAAGCT GATTTATCGC ATGATTCAGA ACGAGAAGTT GAAGGCAAAT AACTAAAGAA      1980GTCTTTTATA TGTATACAAT AATTGTTTTT AAATCAAATC CTAATTAAAA AAATATATTC      2040ATTATGACTT TCATGTTTTT AATGTAATTT ATTCCTATAT CTATAATGAT TTTGTTGTGA      2100AGAGCGTTTT CATTTGCTAT AGAACAAGGA GAATAGTTCC AGGAAATATT CGACTTGATT      2160TAATTATAGT GTAAACATGC TGAACACTGA AAATTACTTT TTCAATAAAC GAAAAATATA      2220ATATACATTA CAAAACTTAT GTGAATAAAG CATGAAACTT AATATACGTT CCCTTTATCA      2280TTTTACTTCA AAGAAAATAA ACAGAAATGT AACTTTCACA TGTAAATCTA ATTCTTAAAT      2340TTAAAAAATA ATATTTATAT ATTTATATGA AAATAACGAA CCGGATGAAA AATAAATTTT      2400ATATATTTAT ATCATCTCCA AATCTAGTTT GGTTCAGGGG CTTACCGAAC CGGATTGAAC      2460TTCTCATATA CAAAAATTAG CAACACAAAA TGTCTCCGGT ATAAATACTA ACATTTATAA      2520CCCGAACCGG TTTAGCTTCC TGTTATATCT TTTTAAAAAA GATCTCTGAC AAAGATTCCT      2580TTCCTGGAAA TTTACCGGTT TTGGTGAAAT GTAAACCGTG GGACGAGGAT GCTTCTTCAT      2640ATCTCACCAC CACTCTCGTT GACTTGACTT GGCTCTGCTC GTCAATGGTT ATCTTCGATC      2700TTTAACCAAA TCCAGTTGAT AAGGTCTCTT CGTTGATTAG CAGAGATCTC TTTAATTTGT      2760GAATTTCAAT TCATCGGAAC CTGTTG ATG GAC ACC ACC ATT GAT GGA TTC GCC       2813

                         Met Asp Thr Thr Ile Asp Gly Phe Ala

                           1               5GAT TCT TAT GAA ATC AGC AGC ACT AGT TTC GTC GCT ACC GAT AAC ACC        2861Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser Thr Ser Phe Val Ala Thr Asp Asn Thr10                  15                  20                  25GAC TCC TCT ATT GTT TAT CTG GCC GCC GAA CAA GTA CTC ACC GGA CCT      2909Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu Ala Ala Glu Gln Val Leu Thr Gly Pro

             30                  35                  40GAT GTA TCT GCT CTG CAA TTG CTC TCC AAC AGC TTC GAA TCC GTC TTT      2957Asp Val Ser Ala Leu Gln Leu Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ser Val Phe

         45                  50                  55GAC TCG CCG GAT GAT TTC TAC AGC GAC GCT AAG CTT GTT CTC TCC GAC      3005Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser Asp

     60                  65                  70GGC CGG GAA GTT TCT TTC CAC CGG TGC GTT TTG TCA GCG AGA AGC TCT      3053Gly Arg Glu Val Ser Phe His Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser Ser

 75                  80                  85TTC TTC AAG AGC GCT TTA GCC GCC GCT AAG AAG GAG AAA GAC TCC AAC      3101Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser Asn90                  95                 100                 105AAC ACC GCC GCC GTG AAG CTC GAG CTT AAG GAG ATT GCC AAG GAT TAC      3149Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu Ile Ala Lys Asp Tyr

            110                 115                 120GAA GTC GGT TTC GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG GCT TAT GTT TAC AGC      3197Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser

        125                 130                 135AGC AGA GTG AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT GAA TGC GCA GAC GAG      3245Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu

    140                 145                 150AAT TGC TGC CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG GAT TTC ATG TTG GAG      3293Asn Cys Cys His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu

155                 160                 165GTT CTC TAT TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT GAA TTA ATT ACT CTC      3341Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu170                 175                 180                 185TAT CAG GTAAAACACC ATCTGCATTA AGCTATGGTT ACACATTCAT GAATATGTTC       3397Tyr GlnTTACTTGAGT ACTTGTATTT GTATTTCAG AGG CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC      3450

                            Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp

                                    190                 195AAA GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA      3498Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu Ala Asn Ile

            200                 205                 210TGT GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT      3546Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile

        215                 220                 225GTC AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA      3594Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu

    230                 235                 240GAG CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG      3642Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu

245                 250                 255GTA CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC      3690Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp260                 265                 270                 275TCG GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC      3738Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr

            280                 285                 290AAT CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT      3786Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn

        295                 300                 305GTG AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC      3834Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn

    310                 315                 320CAT AGG AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG      3882His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg

325                 330                 335AAG GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA      3930Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala340                 345                 350                 355TCA GAA GCA ACT TTG GAA GGT AGA ACC GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA      3978Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile Ala Lys Gln

            360                 365                 370GCC ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT      4026Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln Cys Lys His

        375                 380                 385TCT CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA      4074Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln Glu Asp Lys

    390                 395                 400CGA GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC      4122Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala

405                 410                 415GAT GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT CTT GAA AAT AGA G                4162Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg420                 425                 430GTATCTATCA AGTCTTATTT CTTATATGTT TGAATTAAAT TTATGTCCTC TCTATTAGGA    4222AACTGAGTGA ACTAATGATA ACTATTCTTT GTGTCGTCCA CTGTTTAG  TT GCA CTT     4278

                                                 Val Ala Leu

                                                         435GCT CAA CGT CTT TTT CCA ACG GAA GCA CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC      4326Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met Glu Ile Ala

            440                 445                 450GAA ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC      4374Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp

        455                 460                 465CGT CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT      4422Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys Ile Ala Pro

    470                 475                 480TTC AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA      4470Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys

485                 490                 495ACC G GTATGGATTC TCACCCACTT CATCGGACTC CTTATCACAA AAAACAAAAC         4524Thr500TAAATGATCT TTAAACATGG TTTTGTTACT TGCTGTCTGA CCTTGTTTTT TTTATCATCA    4584G  TG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC        4629Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu

              505                 510                 515GAC CAG ATT ATG AAC TGT GAG GAC TTG ACT CAA CTG GCT TGC GGA GAA      4677Asp Gln Ile Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gln Leu Ala Cys Gly Glu

            520                 525                 530GAC GAC ACT GCT GAG AAA CGA CTA CAA AAG AAG CAA AGG TAC ATG GAA      4725Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gln Lys Lys Gln Arg Tyr Met Glu

        535                 540                 545ATA CAA GAG ACA CTA AAG AAG GCC TTT AGT GAG GAC AAT TTG GAA TTA      4773Ile Gln Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu

    550                 555                 560GGA AAT TCG TCC CTG ACA GAT TCG ACT TCT TCC ACA TCG AAA TCA ACC      4821Gly Asn Ser Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr

565                 570                 575GGT GGA AAG AGG TCT AAC CGT AAA CTC TCT CAT CGT CGT CGG TGA          4866Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg Arg  *580                 585                 590GACTCTTGCC TCTTAGTGTA ATTTTTGCTG TACCATATAA TTCTGTTTTC ATGATGACTG    4926TAACTGTTTA TGTCTATCGT TGGCGTCATA TAGTTTCGCT CTTCGTTTTG CATCCTGTGT    4986ATTATTGCTG CAGGTGTGCT TCAAACAAAT GTTGTAACAA TTTGAACCAA TGGTATACAG    5046ATTTGTAATA TATATTTATG TACATCAACA ATAACCCATG ATGGTGTTAC AGAGTTGCTA    5106GAATCAAAGT GTGAAATAAT GTCAAATTGT TCATCTGTTG GATATTTTCC ACCAAGAACC    5166AAAAGAATAT TCAAGTTCCC TGAACTTCTG GCAACATTCA TGTTATATGT ATCTTCCTAA    5226TTCTTCCTTT AACCTTTTGT AACTCGAATT ACACAGCAAG TTAGTTTCAG GTCTAGAGAT    5286AAGAGAACAC TGAGTGGGCG TGTAAGGTGC ATTCTCCTAG TCAGCTCCAT TGCATCCAAC    5346ATTTGTGAAT GACACAAGTT AACAATCCTT TGCACCATTT CTGGGTGCAT ACATGGAAAC    5406TTCTTCGATT GAAACTTCCC ACATGTGCAG GTGCGTTCGC TGTCACTGAT AGACCAAGAG    5466ACTGAAAGCT TTCACAAATT GCCCTCAAAT CTTCTGTTTC TATCGTCATG ACTCCATATC    5526TCCGACCACT GGTCATGAGC CAGAGCCCAC TGATTTTGAG GGAATTGGGC TAACCATTTC    5586CGAGCTTCTG AGTCCTTCTT TTTGATGTCC TTTATGTAGG AATCAAATTC TTCCTTCTGA    5646CTTGTGGAT                                                            5655(2)关于SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征

 (A)长度：594个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Asp Thr Thr Ile Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser1               5                  10                  15Thr Ser Phe Val Ala Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu

         20                  25                  30Ala Ala Glu Gln Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Ala Leu Gln Leu

     35                  40                  45Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ser Val Phe Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr

 50                  55                  60Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His65                  70                  75                  80Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala

             85                  90                  95Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu

        100                 105                 110Glu Leu Lys Glu Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val

    115                 120                 125Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro

130                 135                 140Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys145                 150                 155                 160Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile

            165                 170                 175Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp

        180                 185                 190Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu

    195                 200                 205Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys

210                 215                 220Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser225                 230                 235                 240Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu

            245                 250                 255Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys

        260                 265                 270Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu

    275                 280                 285Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala

290                 295                 300Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala305                 310                 315                 320Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala

            325                 330                 335Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly

        340                 345                 350Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile

    355                 360                 365Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln

370                 375                 380Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln385                 390                 395                 400Glu Asp Lys Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala

            405                 410                 415Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg

        420                 425                 430Val Ala Leu Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met

    435                 440                 445Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu

450                 455                 460Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys465                 470                 475                 480Ile Ala Pro Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala

            485                 490                 495Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser

        500                 505                 510Ala Val Leu Asp Gln Ile Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gln Leu Ala

    515                 520                 525Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gln Lys Lys Gln Arg

530                 535                 540Tyr Met Glu Ile Gin Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn545                 550                 555                 560Leu Glu Leu Gly Asn Ser Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser

            565                 570                 575Lys Ser Thr Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg

        580                 585                 590Arg  ^*(2)关于SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征

 (A)长度：314个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (C)链型：无关

 (D)拓扑结构：无关(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met Phe Gln Pro Ala Gly His Gly Gln Asp Trp Ala Met Glu Gly Pro1               5                   10                  15Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Val Asp Asp Arg His Asp Ser

        20                  25                  30Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu

    35                  40                  45Leu Arg Glu Ile Arg Leu Gln Pro Gln Glu Ala Pro Leu Ala Ala Glu

50                  55                  60Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu65                  70                  75                  80Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Pro Leu Thr Met Glu Val Ile Gly Gln

            85                  90                  95Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln

        100                 105                 110Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Gly Ile Ala Glu

    115                 120                 125Ala Leu Leu Lys Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly

130                 135                 140Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val145                 150                 155                 160Ala Val Leu Thr Gln Thr Cys Thr Pro Gln His Leu His Ser Val Leu

            165                 170                 175Gln Aia Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Thr

        180                 185                 190His Gly Tyr Leu Ala Ile Val Glu His Leu Val Thr Leu Gly Ala Asp

    195                 200                 205Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala

210                 215                 220Val Asp Leu Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly225                 230                 235                 240Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu

            245                 250                 255Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu

        260                 265                 270Thr Leu Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser

    275                 280                 285Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro Tyr Asp Asp

290                 295                 300Cys Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu305                 310(2)关于SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征

 (A)长度：314个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (C)链型：无关

 (D)拓扑结构：无关(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Phe Gln Pro Ala Gly His Gly Gln Asp Trp Ala Met Glu Gly Pro1               5                   10                  15Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Val Asp Asp Arg His Asp Ser

        20                  25                  30Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Asp Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu

    35                  40                  45Leu Arg Glu Ile Arg Leu Gln Pro Gln Glu Ala Pro Leu Ala Ala Glu

50                  55                  60Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu65                  70                  75                  80Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Thr Leu Thr Met Glu Val Ile Gly Gln

            85                  90                  95Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln

        100                 105                 110Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Gly Ile Ala Glu

    115                 120                 125Ala Leu Leu Lys Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly

130                 135                 140Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val145                 150                 155                 160Ala Val Leu Thr Gln Thr Cys Thr Pro Gln His Leu His Ser Val Leu

            165                 170                 175Gln Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Ile

        180                 185                 190His Gly Tyr Leu Gly Ile Val Glu His Leu Val Thr Leu Gly Ala Asp

    195                 200                 205Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala

210                 215                 220Val Asp Leu Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly225                 230                 235                 240Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu

            245                 250                 255Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu

        260                 265                 270Thr Leu Glu Asn Leu Gln Thr Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser

    275                 280                 285Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro Tyr Asp Asp

290                 295                 300Cys Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu305                 310(2)关于SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征

 (A)长度：314个氨基酸

 (B)类型：氨基酸  (C)链型：无关(D)拓扑结构：无关(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Phe Gln Pro Ala Glu Pro Gly Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro1               5                   10                  15Arg Asp Ala Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser

        20                  25                  30Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu

    35                  40                  45Leu Arg Glu Ile Arg Leu Glu Pro Gln Glu Ala Pro Arg Gly Ala Glu

50                  55                  60Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu65                  70                  75                  80Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Val Arg Gln

            85                  90                  95Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln

        100                 105                 110Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Glu Ile Ala Glu

    115                 120                 125Ala Leu Leu Glu Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly

130                 135                 140Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val145                 150                 155                 160Gly Val Leu Thr Gln Pro Arg Gly Thr Gln His Leu His Ser Ile Leu

            165                 170                 175Gln Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Ile

        180                 185                 190His Gly Tyr Leu Gly Ile Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp

    195                 200                 205Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala

210                 215                 220Val Asp Leu Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly225                 230                 235                 240Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu

            245                 250                 255Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu

        260                 265                 270Thr Leu Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser

    275                 280                 285Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro Tyr Asp Asp

290                 295                 300Cys Val Leu Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu305                 310(2)关于SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征

 (A)长度：2011个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(vi)原始来源：

 (A)生物：拟南芥(ix)特征：

 (A)名称/关键：misc_feature

 (B)位置：1..2011

(D)其它信息：/备注＝“NIM1的cDNA序列”(ix)特征：(A)名称/关键：CDS(B)位置：43..1824(D)其它信息：/产物＝“NIM1蛋白”(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GATCTCTTTA ATTTGTGAAT TTCAATTCAT CGGAACCTGT TG ATG GAC ACC ACC       54

                                           Met Asp Thr Thr

                                             1ATT GAT GGA TTC GCC GAT TCT TAT GAA ATC AGC AGC ACT AGT TTC GTC     102Ile Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser Thr Ser Phe Val5                  10                  15                  20GCT ACC GAT AAC ACC GAC TCC TCT ATT GTT TAT CTG GCC GCC GAA CAA     150Ala Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu Ala Ala Glu Gln

             25                  30                  35GTA CTC ACC GGA CCT GAT GTA TCT GCT CTG CAA TTG CTC TCC AAC AGC     198Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Ala Leu Gln Leu Leu Ser Asn Ser

         40                  45                  50TTC GAA TCC GTC TTT GAC TCG CCG GAT GAT TTC TAC AGC GAC GCT AAG     246Phe Glu Ser Val Phe Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr Ser Asp Ala Lys

     55                  60                  65CTT GTT CTC TCC GAC GGC CGG GAA GTT TCT TTC CAC CGG TGC GTT TTG     294Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His Arg Cys Val Leu

 70                  75                  80TCA GCG AGA AGC TCT TTC TTC AAG AGC GCT TTA GCC GCC GCT AAG AAG     342Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala Ala Ala Lys Lys85                  90                  95                 100GAG AAA GAC TCC AAC AAC ACC GCC GCC GTG AAG CTC GAG CTT AAG GAG     390Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu

            105                 110                 115ATT GCC AAG GAT TAC GAA GTC GGT TTC GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG     438Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu

        120                 125                 130GCT TAT GTT TAC AGC AGC AGA GTG AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT     486Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser

    135                 140                 145GAA TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG     534Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val

150                 155                 160GAT TTC ATG TTG GAG GTT CTC TAT TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT     582Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro165                 170                 175                 180GAA TTA ATT ACT CTC TAT CAG AGG CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC AAA     630Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys

            185                 190                 195GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA TGT     678Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu Ala Asn Ile Cys

        200                 205                 210GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT GTC     726Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile Val

    215                 220                 225AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG     774Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu

230                 235                 240CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG GTA     822Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val245                 250                 255                 260CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC TCG     870Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser

            265                 270                 275GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT     918Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn

        280                 285                 290CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG     966Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val

    295                 300                 305AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT    1014Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His

310                 315                 320AGG AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG    1062Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys325                 330                 335                 340GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA    1110Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser

            345                 350                 355GAA GCA ACT TTG GAA GGT AGA ACC GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA GCC    1158Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile Ala Lys Gln Ala

        360                 365                 370ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT TCT    1206Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln Cys Lys His Ser

    375                 380                 385CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA CGA    1254Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln Glu Asp Lys Arg

390                 395                 400GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC GAT    1302Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp405                 410                 415                 420GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT CTT GAA AAT AGA GTT GCA CTT GCT    1350Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala

            425                 430                 435CAA CGT CTT TTT CCA ACG GAA GCA CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC GAA    1398Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met Glu Ile Ala Glu

        440                 445                 450ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC CGT    1446Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg

    455                 460                 465CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT TTC     1494Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys Ile Ala Pro Phe

470                 475                 480AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA ACC     1542Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr485                 490                 495                 500GTG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC     1590Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp

            505                 510                 515CAG ATT ATG AAC TGT GAG GAC TTG ACT CAA CTG GCT TGC GGA GAA GAC     1638Gln Ile Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gln Leu Ala Cys Gly Glu Asp

        520                 525                 530GAC ACT GCT GAG AAA CGA CTA CAA AAG AAG CAA AGG TAC ATG GAA ATA     1686Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gln Lys Lys Gln Arg Tyr Met Glu Ile

    535                 540                 545CAA GAG ACA CTA AAG AAG GCC TTT AGT GAG GAC AAT TTG GAA TTA GGA     1734Gln Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu Gly

550                 555                 560AAT TTG TCC CTG ACA GAT TCG ACT TCT TCC ACA TCG AAA TCA ACC GGT     1782Asn Leu Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr Gly565                 570                 575                 580GGA AAG AGG TCT AAC CGT AAA CTC TCT CAT CGT CGT CGG TGA             1824Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg Arg  *

            585                 590GACTCTTGCC TCTTAGTGTA ATTTTTGCTG TACCATATAA TTCTGTTTTC ATGATGACTG   1884TAACTGTTTA TGTCTATCGT TGGCGTCATA TAGTTTCGCT CTTCGTTTTG CATCCTGTGT   1944ATTATTGCTG CAGGTGTGCT TCAAACAAAT GTTGTAACAA TTTGAACCAA TGGTATACAG   2004ATTTGTA                                                             2011(2)关于SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征

 (A)长度：2011个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：

 (A)名称/关键：CDS

 (B)位置：43..1824

 (D)其它信息：/产物＝“NIM1的改变形式”/备注＝“野生型NIM1基因产物在55和59位氨基酸的丝氨酸残基改变为丙氨酸残基”(ix)特征：

 (A)名称/关键：misc_feature

 (B)位置：205..217

 (D)其它信息：/备注＝“与野生型序列相比，205和217位核苷酸从T变为G”(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GATCTCTTTA ATTTGTGAAT TTCAATTCAT CGGAACCTGT TG ATG GAC ACC ACC       54

                                           Met Asp Thr Thr

                                             1ATT GAT GGA TTC GCC GAT TCT TAT GAA ATC AGC AGC ACT AGT TTC GTC     102Ile Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser Thr Ser Phe Val5                  10                  15                  20GCT ACC GAT AAC ACC GAC TCC TCT ATT GTT TAT CTG GCC GCC GAA CAA     150Ala Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu Ala Ala Glu Gln

             25                  30                  35GTA CTC ACC GGA CCT GAT GTA TCT GCT CTG CAA TTG CTC TCC AAC AGC     198Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Ala Leu Gln Leu Leu Ser Asn Ser

         40                  45                  50TTC GAA GCC GTC TTT GAC GCG CCG GAT GAT TTC TAC AGC GAC GCT AAG     246Phe Glu Ala Val Phe Asp Ala Pro Asp Asp Phe Tyr Ser Asp Ala Lys

     55                  60                  65CTT GTT CTC TCC GAC GGC CGG GAA GTT TCT TTC CAC CGG TGC GTT TTG     294Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His Arg Cys Val Leu

 70                  75                  80TCA GCG AGA AGC TCT TTC TTC AAG AGC GCT TTA GCC GCC GCT AAG AAG     342Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala Ala Ala Lys Lys85                  90                  95                 100GAG AAA GAC TCC AAC AAC ACC GCC GCC GTG AAG CTC GAG CTT AAG GAG     390Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu

            105                 110                 115ATT GCC AAG GAT TAC GAA GTC GGT TTC GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG     438Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu

        120                 125                 130GCT TAT GTT TAC AGC AGC AGA GTG AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT     486Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser

    135                 140                 145GAA TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG     534Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val

150                 155                 160GAT TTC ATG TTG GAG GTT CTC TAT TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT     582Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro165                 170                 175                 180GAA TTA ATT ACT CTC TAT CAG AGG CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC AAA     630Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys

            185                 190                 195GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA TGT     678Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu Ala Asn Ile Cys

        200                 205                 210GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT GTC     726Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile Val

    215                 220                 225AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG     774Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu

230                 235                 240CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG GTA     822Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val245                 250                  255                260CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC TCG     870Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser

            265                 270                 275GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT     918Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn

        280                 285                 290CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG     966Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val

    295                 300                 305AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT    1014Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His

310                 315                 320AGG AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG    1062Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys325                 330                 335                 340GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA    1110Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser

            345                 350                 355GAA GCA ACT TTG GAA GGT AGA ACC GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA GCC    1158Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile Ala Lys Gln Ala

        360                 365                 370ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT TCT    1206Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln Cys Lys His Ser

    375                 380                 385CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA CGA    1254Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln Glu Asp Lys Arg

390                 395                 400GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC GAT     1302Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp405                 410                 415                 420GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT CTT GAA AAT AGA GTT GCA CTT GCT     1350Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala

            425                 430                 435CAA CGT CTT TTT CCA ACG GAA GCA CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC GAA     1398Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met Glu Ile Ala Glu

        440                 445                 450ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC CGT     1446Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg

    455                 460                 465CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT TTC     1494Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys Ile Ala Pro Phe

470                 475                 480AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA ACC     1542Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr485                 490                 495                 500GTG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC     1590Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp

            505                 510                 515CAG ATT ATG AAC TGT GAG GAC TTG ACT CAA CTG GCT TGC GGA GAA GAC     1638Gln Ile Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gln Leu Ala Cys Gly Glu Asp

        520                 525                 530GAC ACT GCT GAG AAA CGA CTA CAA AAG AAG CAA AGG TAC ATG GAA ATA     1686Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gln Lys Lys Gln Arg Tyr Met Glu Ile

    535                 540                 545CAA GAG ACA CTA AAG AAG GCC TTT AGT GAG GAC AAT TTG GAA TTA GGA     1734Gln Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu Gly

550                 555                 560AAT TTG TCC CTG ACA GAT TCG ACT TCT TCC ACA TCG AAA TCA ACC GGT     1782Asn Leu Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr Gly565                 570                 575                 580GGA AAG AGG TCT AAC CGT AAA CTC TCT CAT CGT CGT CGG TGA             1824Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg Arg  ^*

            585                 590GACTCTTGCC TCTTAGTGTA ATTTTTGCTG TACCATATAA TTCTGTTTTC ATGATGACTG   1884TAACTGTTTA TGTCTATCGT TGGCGTCATA TAGTTTCGCT CTTCGTTTTG CATCCTGTGT   1944ATTATTGCTG CAGGTGTGCT TCAAACAAAT GTTGTAACAA TTTGAACCAA TGGTATACAG   2004ATTTGTA                                                             2011(2)关于SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征

 (A)长度：594个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Met Asp Thr Thr Ile Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser1               5                  10                  15Thr Ser Phe Val Ala Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu

         20                  25                  30Ala Ala Glu Gln Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Ala Leu Gln Leu

     35                  40                  45Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ala Val Phe Asp Ala Pro Asp Asp Phe Tyr

 50                  55                  60Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His65                  70                  75                  80Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala

             85                  90                  95Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu

        100                 105                 110Glu Leu Lys Glu Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val

    115                 120                 125Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro

130                 135                 140Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys145                 150                 155                 160Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile

            165                 170                 175Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp

        180                 185                 190Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu

    195                 200                 205Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys

210                 215                 220Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser225                 230                 235                 240Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu

            245                 250                 255Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys

        260                 265                 270Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu

    275                 280                 285Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala

290                 295                 300Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala305                 310                 315                 320Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala

            325                 330                 335Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly

        340                 345                 350Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile

    355                 360                 365Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln

370                 375                 380Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln385                 390                 395                 400Glu Asp Lys Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala

            405                 410                 415Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg

        420                 425                 430Val Ala Leu Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met

    435                 440                 445Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu

450                 455                 460Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys465                 470                 475                 480Ile Ala Pro Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala

            485                 490                 495Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser

        500                 505                 510Ala Val Leu Asp Gln Ile Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gln Leu Ala

    515                 520                 525Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gln Lys Lys Gln Arg

530                 535                 540Tyr Met Glu Ile Gln Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn545                 550                 555                 560Leu Glu Leu Gly Asn Leu Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser

            565                 570                 575Lys Ser Thr Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg

        580                 585                 590Arg  ^*(2)关于SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征

 (A)长度：1597个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：

 (A)名称/关键：CDS

 (B)位置：1..1410

 (D)其它信息：/产物＝“NIM1的改变形式”/备注＝“与野生型序列相比删除了N端”(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：ATG GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG GCT TAT GTT TAC AGC AGC AGA GTG      48Met Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val1               5                  10                  15AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT GAA TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC      96Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys

         20                  25                  30CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG GAT TTC ATG TTG GAG GTT CTC TAT     144His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr

     35                  40                  45TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT GAA TTA ATT ACT CTC TAT CAG AGG     192Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg

 50                  55                  60CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC AAA GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT     240His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val65                  70                  75                  80ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA TGT GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG     288Ile Leu Lys Leu Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu

             85                  90                  95GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT GTC AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT     336Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser

        100                 105                 110CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA     384Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg

    115                 120                 125CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG GTA CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG     432Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser

130                 135                 140AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC TCG GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG     480Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu145                 150                 155                 160CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT     528Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His

            165                 170                 175TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA     576Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys

        180                 185                 190CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT AGG AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG     624Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val

    195                 200                 205CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA     672Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu

210                 215                 220TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA GAA GCA ACT TTG GAA GGT AGA ACC     720Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr225                 230                 235                 240GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA GCC ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT     768Ala Leu Met Ile Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn

            245                 250                 255ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT TCT CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA     816Ile Pro Glu Gln Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu

        260                 265                 270ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA CGA GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT     864Ile Leu Glu Gln Glu Asp Lys Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro

    275                 280                 285CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC GAT GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT     912Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp

290                 295                 300CTT GAA AAT AGA GTT GCA CTT GCT CAA CGT CTT TTT CCA ACG GAA GCA     960Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala305                 310                 315                 320CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC GAA ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA    1008Gln Ala Ala Met Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile

            325                 330                 335GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC CGT CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA    1056Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser

        340                 345                 350CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT TTC AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT    1104Pro Gly Val Lys Ile Ala Pro Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser

    355                 360                 365AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA ACC GTG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC    1152Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe

370                 375                 380CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC CAG ATT ATG AAC TGT GAG GAC TTG     1200Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp Gln Ile Met Asn Cys Glu Asp Leu385                 390                 395                 400ACT CAA CTG GCT TGC GGA GAA GAC GAC ACT GCT GAG AAA CGA CTA CAA     1248Thr Gln Leu Ala Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gln

            405                 410                 415AAG AAG CAA AGG TAC ATG GAA ATA CAA GAG ACA CTA AAG AAG GCC TTT     1296Lys Lys Gln Arg Tyr Met Glu Ile Gln Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe

        420                 425                 430AGT GAG GAC AAT TTG GAA TTA GGA AAT TTG TCC CTG ACA GAT TCG ACT     1344Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu Gly Asn Leu Ser Leu Thr Asp Ser Thr

    435                 440                 445TCT TCC ACA TCG AAA TCA ACC GGT GGA AAG AGG TCT AAC CGT AAA CTC     1392Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu

450                 455                 460TCT CAT CGT CGT CGG TGA GACTCTTGCC TCTTAGTGTA ATTTTTGCTG            1440Ser His Arg Arg Arg  ^*465                 470TACCATATAA TTCTGTTTTC ATGATGACTG TAACTGTTTA TGTCTATCGT TGGCGTCATA   1500TAGTTTCGCT CTTCGTTTTG CATCCTGTGT ATTATTGCTG CAGGTGTGCT TCAAACAAAT   1560GTTGTAACAA TTTGAACCAA TGGTATACAG ATTTGTA                            1597(2)关于SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征

 (A)长度：470个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质  (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Met Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val1               5                  10                  15Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys

         20                  25                  30His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr

     35                  40                  45Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg

 50                  55                  60His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val65                 70                  75                  80Ile Leu Lys Leu Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu

             85                  90                  95Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser

        100                 105                 110Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg

    115                 120                 125Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser

130                 135                 140Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu145                 150                 155                 160Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His

            165                 170                 175Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys

        180                 185                 190Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val

    195                 200                 205Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu

210                 215                 220Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr225                 230                 235                 240Ala Leu Met Ile Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn

            245                 250                 255Ile Pro Glu Gln Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu

        260                 265                 270Ile Leu Glu Gln Glu Asp Lys Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro

    275                 280                 285Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp

290                 295                 300Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala305                 310                 315                 320Gln Ala Ala Met Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile

            325                 330                 335Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser

        340                 345                 350Pro Gly Val Lys Ile Ala Pro Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser

    355                 360                 365Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe

370                 375                 380Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp Gln Ile Met Asn Cys Glu Asp Leu385                 390                 395                 400Thr Gln Leu Ala Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gln

            405                 410                 415Lys Lys Gln Arg Tyr Met Glu Ile Gln Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe

        420                 425                 430Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu Gly Asn Leu Ser Leu Thr Asp Ser Thr

    435                 440                 445Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu

450                 455                 460Ser His Arg Arg Arg   ^*465                  470(2)关于SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征

 (A)长度：1608个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：

 (A)名称/关键：CDS

 (B)位置：43..1608

 (D)其它信息：/产物＝“NIM1的改变形式”/备注＝“与野生型序列相比删除了N端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GATCTCTTTA ATTTGTGAAT TTCAATTCAT CGGAACCTGT TG ATG GAC ACC ACC       54

                                           Met Asp Thr Thr

                                             1ATT GAT GGA TTC GCC GAT TCT TAT GAA ATC AGC AGC ACT AGT TTC GTC     102Ile Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser Thr Ser Phe Val5                   10                  15                  20GCT ACC GAT AAC ACC GAC TCC TCT ATT GTT TAT CTG GCC GCC GAA CAA     150Ala Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu Ala Ala Glu Gln

             25                  30                  35GTA CTC ACC GGA CCT GAT GTA TCT GCT CTG CAA TTG CTC TCC AAC AGC     198Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Ala Leu Gln Leu Leu Ser Asn Ser

         40                  45                  50TTC GAA TCC GTC TTT GAC TCG CCG GAT GAT TTC TAC AGC GAC GCT AAG     246Phe Glu Ser Val Phe Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr Ser Asp Ala Lys

     55                  60                  65CTT GTT CTC TCC GAC GGC CGG GAA GTT TCT TTC CAC CGG TGC GTT TTG     294Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His Arg Cys Val Leu

 70                  75                  80TCA GCG AGA AGC TCT TTC TTC AAG AGC GCT TTA GCC GCC GCT AAG AAG     342Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala Ala Ala Lys Lys85                  90                  95                 100GAG AAA GAC TCC AAC AAC ACC GCC GCC GTG AAG CTC GAG CTT AAG GAG     390Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu

            105                 110                 115ATT GCC AAG GAT TAC GAA GTC GGT TTC GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG     438Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu

        120                 125                 130GCT TAT GTT TAC AGC AGC AGA GTG AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT     486Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser

    135                 140                 145GAA TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG     534Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val

150                 155                 160GAT TTC ATG TTG GAG GTT CTC TAT TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT     582Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro165                 170                 175                 180GAA TTA ATT ACT CTC TAT CAG AGG CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC AAA     630Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys

            185                 190                 195GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA TGT     678Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu Ala Asn Ile Cys

        200                 205                 210GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT GTC     726Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile Val

    215                 220                  225AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG     774Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu

230                 235                 240CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG GTA      822Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val245                 250                 255                 260CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC TCG      870Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser

            265                 270                 275GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT      918Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn

        280                 285                 290CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG      966Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val

    295                 300                 305AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT     1014Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His

310                 315                 320AGG AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG     1062Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys325                 330                 335                 340GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA     1110Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser

            345                 350                 355GAA GCA ACT TTG GAA GGT AGA ACC GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA GCC     1158Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile Ala Lys Gln Ala

        360                 365                 370ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT TCT     1206Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln Cys Lys His Ser

    375                 380                 385CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA CGA     1254Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln Glu Asp Lys Arg

390                 395                 400GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC GAT     1302Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp405                 410                 415                 420GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT CTT GAA AAT AGA GTT GCA CTT GCT     1350Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala

            425                 430                 435CAA CGT CTT TTT CCA ACG GAA GCA CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC GAA     1398Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met Glu Ile Ala Glu

        440                 445                 450ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC CGT     1446Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg

    455                 460                 465CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT TTC     1494Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys Ile Ala Pro Phe

470                 475                 480AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA ACC     1542Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr485                 490                 495                 500GTG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC     1590Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp

            505                 510                 515CAG ATT ATG AAC TGT TGA                                             1608Gln Ile Met Asn Cys  ^*

        520(2)关于SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征

 (A)长度：522个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Met Asp Thr Thr Ile Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser1               5                  10                  15Thr Ser Phe Val Ala Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu

         20                  25                  30Ala Ala Glu Gln Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Ala Leu Gln Leu

     35                  40                  45Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ser Val Phe Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr

 50                  55                  60Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His65                  70                  75                  80Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala

             85                  90                  95Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu

        100                 105                 110Glu Leu Lys Glu Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val

    115                 120                 125Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro

130                 135                 140Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys145                 150                 155                 160Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile

            165                 170                 175Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp

        180                 185                 190Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu

    195                 200                 205Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys

210                 215                 220Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser225                 230                 235                 240Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu

            245                 250                 255Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys

        260                 265                 270Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu

    275                 280                 285Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala

290                 295                 300Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala305                 310                 315                 320Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala

            325                 330                 335Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly

        340                 345                 350Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile

    355                 360                 365Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln

370                 375                 380Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln385                 390                 395                 400Glu Asp Lys Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala

            405                 410                 415Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg

        420                 425                 430Val Ala Leu Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met

    435                 440                 445Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu

450                 455                 460Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys465                 470                 475                 480Ile Ala Pro Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala

            485                 490                 495Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser

        500                 505                 510Ala Val Leu Asp Gln Ile Met Asn Cys  ^*

    515                 520(2)关于SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征

 (A)长度：1194个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：

 (A)名称/关键：CDS

 (B)位置：1..1194

 (D)其它信息：/产物＝“NIM1的改变形式”/备注＝“N端/C端嵌合体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：ATG GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG GCT TAT GTT TAC AGC AGC AGA GTG      48Met Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val1               5                  10                  15AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT GAA TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC      96Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys

         20                  25                  30CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG GAT TTC ATG TTG GAG GTT CTC TAT     144His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr

     35                  40                  45TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT GAA TTA ATT ACT CTC TAT CAG AGG      192Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg

 50                  55                  60CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC AAA GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT      240His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val65                  70                  75                  80ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA TGT GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG      288Ile Leu Lys Leu Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu

             85                  90                  95GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT GTC AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT      336Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser

        100                 105                 110CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA      384Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg

    115                 120                 125CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG GTA CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG      432Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser

130                 135                 140AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC TCG GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG      480Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu145                 150                 155                 160CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT      528Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His

            165                 170                 175TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA      576Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys

        180                 185                 190CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT AGG AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG      624Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val

    195                 200                 205CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA      672Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu

210                 215                 220TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA GAA GCA ACT TTG GAA GGT AGA ACC      720Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr225                 230                 235                 240GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA GCC ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT      768Ala Leu Met Ile Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn

            245                 250                 255ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT TCT CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA      816Ile Pro Glu Gln Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu

        260                 265                 270ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA CGA GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT      864Ile Leu Glu Gln Glu Asp Lys Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro

    275                 280                 285CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC GAT GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT      912Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp

290                 295                 300CTT GAA AAT AGA GTT GCA CTT GCT CAA CGT CTT TTT CCA ACG GAA GCA      960Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala305                 310                 315                 320CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC GAA ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA     1008Gln Ala Ala Met Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile

            325                 330                 335GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC CGT CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA     1056Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser

        340                 345                 350CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT TTC AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT     1104Pro Gly Val Lys Ile Ala Pro Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser

    355                 360                 365AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA ACC GTG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC     1152Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe

370                 375                 380CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC CAG ATT ATG AAC TGT TGA         1194Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp Gln Ile Met Asn Cys  ^*385                 390                 395(2)关于SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征

 (A)长度：398个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Met Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val1               5                  10                  15Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys

         20                  25                  30His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr

     35                  40                  45Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg

 50                  55                  60His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val65                  70                  75                  80Ile Leu Lys Leu Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu

             85                  90                  95Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser

        100                 105                 110Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg

    115                 120                 125Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser

130                 135                 140Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu145                 150                 155                 160Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His

            165                 170                 175Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys

        180                 185                 190Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val

    195                 200                 205Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu

210                 215                 220Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr225                 230                 235                 240Ala Leu Met Ile Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn

            245                 250                 255Ile Pro Glu Gln Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu

        260                 265                 270Ile Leu Glu Gln Glu Asp Lys Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro

    275                 280                 285Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp

290                 295                 300Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala305                 310                 315                 320Gln Ala Ala Met Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile

            325                 330                 335Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser

        340                 345                 350Pro Gly Val Lys Ile Ala Pro Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser

    355                 360                 365Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe

370                 375                 380Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp Gln Ile Met Asn Cys  ^*385                 390                 395(2)关于SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特征

 (A)长度：786个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：

 (A)名称/关键：CDS

 (B)位置：1..786

 (D)其它信息：/产物＝“NIM1的改变形式”/备注＝“NIM1的锚蛋白结构域”(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：ATG GAC TCC AAC AAC ACC GCC GCC GTG AAG CTC GAG CTT AAG GAG ATT      48Met Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu Ile1               5                  10                  15GCC AAG GAT TAC GAA GTC GGT TTC GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG GCT      96Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala

         20                  25                  30TAT GTT TAC AGC AGC AGA GTG AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT GAA     144Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu

     35                  40                  45TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG GAT     192Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp

 50                  55                  60TTC ATG TTG GAG GTT CTC TAT TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT GAA     240Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro Glu 65                  70                  75                  80TTA ATT ACT CTC TAT CAG AGG CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC AAA GTT      288Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val

             85                  90                  95GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA TGT GGT      336Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu Ala Asn Ile Cys Gly

        100                 105                 110AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT GTC AAG      384Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile Val Lys

    115                 120                 125TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG CTT      432Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu

130                 135                 140GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG GTA CCT      480Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro145                 150                 155                 160AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC TCG GAT      528Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp

            165                 170                 175GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT CTA      576Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu

        180                 185                 190GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG AAG      624Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys

    195                 200                 205ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT AGG      672Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg

210                 215                 220AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG GAG      720Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu225                  230                235                 240CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA GAA      768Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu

            245                 250                 255GCA ACT TTG GAA GGT TGA                                              786Ala Thr Leu Glu Gly  ^*

        260(2)关于SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特征

 (A)长度：262个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：Met Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu Ile1               5                  10                  15Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala

         20                  25                  30Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu

     35                  40                  45Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp

 50                  55                  60Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro Glu65                  70                  75                  80Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val

             85                  90                  95Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu Ala Asn Ile Cys Gly

        100                 105                 110Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile Val Lys

    115                 120                 125Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu

130                 135                 140Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro145                 150                 155                 160Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp

            165                 170                 175Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu

        180                 185                 190Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys

    195                 200                 205Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg

210                 215                 220Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu225                 230                 235                 240Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu

            245                 250                 255Ala Thr Leu Glu Gly  ^*

        260(2)关于SEQ ID NO：17的信息：(i)序列特征

 (A)长度：41个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (C)链型：无关

 (D)拓扑结构：无关(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：Ile Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val1               5                   10                  15Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala

        20                  25                  30Val His Tyr Ala Val Gln His Cys Asn

    35                  40(2)关于SEQ ID NO：18的信息：(i)序列特征

 (A)长度：38个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (C)链型：无关

 (D)拓扑结构：无关(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：Pro Thr Gly Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val Ser Pro1               5                   10                  15Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp His His Ala Asp Xaa Asn Phe Arg

        20                  25                  30Thr Xaa Asp Gly Val Thr

    35(2)关于SEQ ID NO：19的信息：(i)序列特征

 (A)长度：41个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (C)链型：无关

 (D)拓扑结构：无关(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：Ile Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val1               5                   10                  15Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala

        20                  25                  30Val His Tyr Ala Val Gln His Cys Asn

    35                  40(2)关于SEQ ID NO：20的信息：(i)序列特征

 (A)长度：27个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (C)链型：无关

 (D)拓扑结构：无关(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：Arg Arg Pro Asp Ser Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val1               5                   10                  15Ser Pro Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp Gln

        20                  25(2)关于SEQ ID NO：21的信息：(i)序列特征

 (A)长度：41个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (C)链型：无关

 (D)拓扑结构：无关(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：Ile Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val1               5                   10                  15Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala

        20                  25                  30Val His Tyr Ala Val Gln His Cys Asn

    35                  40(2)关于SEQ ID NO：22的信息：(i)序列特征

 (A)长度：27个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (C)链型：无关

 (D)拓扑结构：无关(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：Arg Arg Pro Asp Ser Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val1               5                   10                  15Ser Pro Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp Gln

        20                  25(2)关于SEQ ID NO：23的信息：(i)序列特征

 (A)长度：41个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (C)链型：无关

 (D)拓扑结构：无关(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：Ile Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val1               5                   10                  15Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala

        20                  25                  30Val His Tyr Ala Val Gln His Cys Asn

    35                  40(2)关于SEQ ID NO：24的信息：(i)序列特征

 (A)长度：19个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (C)链型：无关

 (D)拓扑结构：无关(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：Pro Thr Gly Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val Ser Pro1               5                   10                  15Asp Met Val(2)关于SEQ ID NO：25的信息：(i)序列特征

 (A)长度：35个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：其它核酸(A)描述：/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：CAACAGCTTC GAAGCCGTCT TTGACGCGCC GGATG                               35(2)关于SEQ ID NO：26的信息：(i)序列特征

 (A)长度：35个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：其它核酸

 (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：CATCCGGCGc GTCAAAGACG GCTTCGAAGC TGTTG                               35(2)关于SEQ ID NO：27的信息：(i)序列特征

 (A)长度：32个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：其它核酸(A)描述：/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：GGAATTCAAT GGATTCGGTT GTGACTGTTT TG                                  32(2)关于SEQ ID NO：28的信息：(i)序列特征

 (A)长度：28个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：其它核酸

 (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：GGAATTCTAC AAATCTGTAT ACCATTGG                                       28(2)关于SEQ ID NO：29的信息：(i)序列特征

 (A)长度：31个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：其它核酸

 (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：CGGAATTCGA TCTCTTTAAT TTGTGAATTT C                                   31(2)关于SEQ ID NO：30的信息：(i)序列特征

 (A)长度：29个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：其它核酸(A)描述：/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：GGAATTCTCA ACAGTTCATA ATCTGGTCG                                      29(2)关于SEQ ID NO：31的信息：(i)序列特征

 (A)长度：31个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：其它核酸

 (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：GGAATTCAAT GGACTCCAAC AACACCGCCG C                                   31(2)关于SEQ ID NO：32的信息：(i)序列特征

 (A)长度：33个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：其它核酸

 (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：GGAATTCTCA ACCTTCCAAA GTTGCTTCTG ATG                                 33

Claims (31)

1.通过协同抗病性保护植物免受病原体侵袭的方法，包括以下步骤：

(a)提供具有一级抗病性的免疫调节植物；并且

(b)向所述免疫调节植物施用至少一种杀微生物剂以赋予二级抗病性；

(c)由此所述杀微生物剂向所述免疫调节植物的施用赋予比一级和二级抗病性水平总和更大的协同增强的三级抗病性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫调节植物是

(a)组成型免疫(cim)突变植物；

(b)损伤模拟突变植物；

(c)通过在植物中重组表达SAR基因得到的；

(d)通过向植物施用能诱导SAR的化学品得到的。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述cim突变植物根据下列步骤从植物群体中选出：

(a)评估SAR基因在表型正常的未受侵染植物中的表达，其中所述未受侵染的植物缺少损伤模拟表型，并且

(b)筛选在没有病毒、细菌或真菌侵染时，组成型表达SAR基因的未受侵染的植物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述损伤模拟突变植物根据下列步骤从植物群体中选出：

(a)评估SAR基因在具有损伤模拟表型的未受侵染的植物中的表达；并且

(b)筛选在没有病毒、细菌或真菌侵染时，组成型表达SAR基因的未受侵染的植物。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述SAR基因是编码NIM1蛋白功能形式的NIM1基因，NIM1蛋白参与植物中引起系统获得性抗性的信号转导级联反应。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述NIM1蛋白包含SEQ IDNO：2中所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述NIM1基因包含SEQ IDNO：1中所示的编码序列。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述SAR基因编码作为SAR信号转导途径显性失活调控子的NIM1蛋白的改变形式。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式在相当于SEQ ID NO：2的55和59位的氨基酸位是亮氨酸而不是丝氨酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQ IDNO：7中所示的核苷酸序列。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式具有大约相当于SEQ ID NO：2的1-125氨基酸位的N末端截短的氨基酸。

13.根据权利要求13所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQ IDNO：9中所示的核苷酸序列。

15.根据权利要求8所述的方法，其中所述NIM1蛋白的具有大约相当于SEQ ID NO：2的522-593氨基酸位的C末端截短的氨基酸。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQ IDNO：11中所示的核苷酸序列。

18.根据权利要求8所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式具有大约相当于SEQ ID NO：2的1-125氨基酸位的N-末端截短的氨基酸和大约相当于SEQ ID NO：2的522-593氨基酸位的C末端截短的氨基酸。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式包含SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQ IDNO：13中所示的核苷酸序列。

21.根据权利要求8所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式基本上由大约相当于SEQ ID NO：2的103-362氨基酸位的锚蛋白基序组成。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改变形式包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQ IDNO：15中所示的核苷酸序列。

24.根据权利要求7、11、14、17、20和23中的任意一项所述的方法，其中所述DNA分子在下列条件下与SEQ ID NO：1、7、9、11、13或15中所列的核苷酸序列杂交：在1％BSA；520mM NaPO₄；pH7.2；7％十二烷基硫酸钠盐；1mM EDTA；250mM氯化钠中，于55℃杂交18-24小时，并于55℃在6×SSC中洗15分钟(3次)，3×SSC中洗15分钟(1次)。

25.根据权利要求1-24中的任意一项所述的方法，其中所述杀微生物剂是选自下列群体的杀真菌剂：

4-3[(4-氯苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙烯酰]吗啉(“烯酰吗

啉”)；

5-甲基-1，2，4-三唑[3，4-b][1，3]苯并噻唑(“三环唑”)；

3-烯丙氧基-1，2-苯并噻唑-1，1-二氧化物(“烯丙基异噻唑”)；

α-[2-(4-氯苯基)乙基]-α-(1，1-二甲基乙基)-1H-1，2，4-三

唑-1-乙醇(“戊唑醇”)；

1-[3-(2-氯苯基)-2-(4-氟苯)环氧乙烷-2-基]甲基]-1H-1，2，

4-三唑(“环氧唑醇”)；

α-(4-氯苯基)-α-(1-环异丙基乙基)-1H-1，2，4-三唑-1-乙醇(“环唑醇”)；5-(4-氯苯基)-2，2-二甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-环戊醇(“叶菌唑”)；2-(2，4-二氯苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)-丙基-1，1，2，2-四氟乙醚(“氟醚唑”)；甲基-(E)-2-{2-[6-(2-氰苯氧基)嘧啶-4-基氧基]苯基}-3-甲氧丙烯酸盐(“ICIA 5504”“azoxystrobin”)；甲基-(E)-2-甲氧亚氨基-2-[α-(O-甲苯氧基)-O-甲苯基]乙酸酯(“BAS 490F”，“cresoxime methyl”)；2-(2-苯氧苯基)-(E)-2-甲氧亚氨基-N-甲基乙酰胺；[2-(2，5-二甲基苯氧甲基)-苯基)]-(E)-2-甲氧亚氨基-N-甲基乙酰胺；(1R，3S/1S，3R)-2，2-二氯-N-[(R)-1-(4-氯(苯基)乙基]-1-乙基-3-甲基环丙烷甲酰胺，(“KTU3616”)；乙撑双(二硫代氨基甲酸)锰聚合体-锌复合物(代森锰锌)；1-[2-(2，4-二氯苯基)-4-丙基-1，3-二氧戊环-2-基甲基]-1H-1，2，4-三唑(“丙环唑”)；1-{2-[2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基]-4-甲基-1，3-二氧戊环-2-基甲基)-1H-1，2，4-三唑(“恶醚唑”)1-[2-(2，4-二氯苯基)戊基-1H-1，2，4-三唑(“戊菌唑”)顺-4-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]-2，6-二甲基吗啉(“丁苯吗啉”)1-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]哌啶(“苯锈啶”)；4-环丙基-6-甲基-N-苯基-2-嘧啶氨(“嘧菌环胺”)；(RS)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙酰基)-丙氨酸甲酯(“氨丙灵”)；(R)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙酰基)-丙氨酸甲酯(“R-氨丙灵”)；1，2，5，6-四氢-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮(“咯喹酮”)；

和磷酸氢乙酯(“乙磷铝”)。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述杀真菌剂是氨丙灵。

27.根据权利要求2-26中的任意一项所述的方法，其中所述能诱导SAR的化学品是苯并噻二唑化合物、异烟酸化合物或水杨酸化合物。

28.根据权利要求1-26中的任意一项所述的方法，其中所述杀微生物剂是苯并噻二唑化合物、异烟酸化合物或水杨酸化合物。

29.根据权利要求1-28中的任意一项所述的方法，其中将两种杀微生物剂同时施用于所述免疫调节植物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述杀微生物剂是选自下列群体的杀真菌剂：

4-3[(4-氯苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙烯酰]吗啉(“烯酰吗

啉”)；

5-甲基-1，2，4-三唑[3，4-b][1，3]苯并噻唑(“三环唑”)；

3-烯丙氧基-1，2-苯并噻唑-1，1-二氧化物(“烯丙基异噻唑”)；

α-[2-(4-氯苯基)乙基]-α-(1，1-二甲基乙基)-1H-1，2，4-三

唑-1-乙醇(“戊唑醇”)；

1-[3-(2-氯苯基)-2-(4-氟苯)环氧乙烷-2-基]甲基]-1H-1，2，

4-三唑(“环氧唑醇”)；

α-(4-氯苯基)-α-(1-环异丙基乙基)-1H-1，2，4-三唑-1-乙醇

(“环唑醇”)；

5-(4-氯苯基)-2，2-二甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-

环戊醇(“叶菌唑”)；

2-(2，4-二氯苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)-丙基-1，1，2，

2-四氟乙醚(“氟醚唑”)；

甲基-(E)-2-{2-[6-(2-氰苯氧基)嘧啶-4-基氧基]苯基}-3-甲氧

丙烯酸盐(“ICIA 5504”“azoxystrobin”)；

甲基-(E)-2-甲氧亚氨基-2-[α-(O-甲苯氧基)-O-甲苯基]乙酸

酯(“BAS 490F”，“cresoxime methyl”)；

2-(2-苯氧苯基)-(E)-2-甲氧亚氨基-N-甲基乙酰胺；

[2-(2，5-二甲基苯氧甲基)-苯基)]-(E)-2-甲氧亚氨基-N-甲基

乙酰胺；

(1R，3S/1S，3R)-2，2-二氯-N-[(R)-1-(4-氯(苯基)乙基]-1-乙

基-3-甲基环丙烷甲酰胺，(“KTU3616”)；

乙撑双(二硫代氨基甲酸)锰聚合体-锌复合物(代森锰锌)；

1-[2-(2，4-二氯苯基)-4-丙基-1，3-二氧戊环-2-基甲基]-1H-

1，2，4-三唑(“丙环唑”)；

1-{2-[2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基]-4-甲基-1，3-二氧戊环-2-

基甲基)-1H-1，2，4-三唑(“恶醚唑”)

1-[2-(2，4-二氯苯基)戊基-1H-1，2，4-三唑(“戊菌唑”)

顺-4-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]-2，6-二甲基吗啉(“丁苯

吗啉”)

1-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]哌啶(“苯锈啶”)；

4-环丙基-6-甲基-N-苯基-2-嘧啶氨(“嘧菌环胺”)；

(RS)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙酰基)-丙氨酸甲酯(“氨丙

灵”)；

(R)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙酰基)-丙氨酸甲酯(“R-氨

丙灵”)；

1，2，5，6-四氢-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮(“咯喹酮”)；

和磷酸氢乙酯(“乙磷铝”)。

并且另一种杀微生物剂是苯并噻二唑化合物、异烟酸化合物或水杨酸化合物。

31.根据权利要求30所述的方法，其中杀真菌剂是氨丙灵，另一种杀微生物剂是苯并噻二唑化合物。

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