CN1228813A - 赋予植物抗病性的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因(命名为NIM1)的定位和描述,该基因是SAR途径的关键组分并且能与化学和生物学诱导物结合诱导植物SAR基因表达和广谱抗病性。本发明进一步涉及用NIM1基因转化的植物以及使用该基因以产生转基因植物的方法和使用该基因筛选分析能诱导植物中广谱抗病性的化合物的方法。

Description

赋予植物抗病性的基因及其应用
本发明涉及植物抗病性以及鉴定和培育具抗病性的植物。更具体地，本发明涉及参与植物中广谱抗病性的基因的鉴定、分离和特征分析。
植物经常受到多种病原有机体，包括病毒、细菌、真菌及线虫的侵袭。农作物因为它们通常作为遗传上一致的单种栽培物种植而尤为脆弱；当疾病袭击时，损失可能很惨重。
然而，许多植物具有自已的抵抗病原有机体的先天机制。植物育种工作者和病理学家已鉴定出对植物病原体有抗性的天然变异并将抗性培育进许多农作物。这些天然抗病基因常常提供针对病原体的高水平的抗性或免疫性。
在许多植物种类中，用杀死的病原体初始接种可使植物对随后的感染产生免疫。这种获得性抗病性于1901年首次记录并认为在自然界植物的保护中起重要的作用。特别详细描述的植物免疫性的例子有在植物如烟草、拟南芥菜和黄瓜中的系统获得性抗性(SAR)和诱导抗性的现象。在这些系统中，用杀死的病原体接种导致了对随后该病原体以及许多其它农学上重要的细菌、真菌及病毒病原体感染的系统性保护。
也可通过化学免疫化合物，一些诱导植物中免疫反应的化学制剂激发系统获得性抗性。这些化合物可以是天然来源的，如唾液酸(SA)，或可以是合成的化学制剂，如2,6-二氯异烟酸(INA)和苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)。用病原体或免疫化合物处理在烟草(最详尽鉴定的物种)中诱导至少9套基因的表达。不同数目和类型的基因可在其它植物中表达。由免疫化合物诱导的SAR相关基因的诱导水平较背景高出10,000倍。具体地说，SAR的特征在于表达SAR基因，包括致病相关性(PR)基因。
病原体感染后即诱导SAR基因。这些基因中有些在赋予植物系统获得性抗性中起作用。对各种病原体，包括病毒、细菌和真菌感染应答时大量诱导这些植物蛋白。PR蛋白首先在对用烟草花叶病毒(TMV)感染起过敏性反应的烟草植物(Nicotiana tabacum)中发现。随后，在许多植物种类中发现了PR蛋白[见Redolfi等(1983)荷兰植物病理学杂志89:245-254；Van Loon(1985)植物分子生物学4:111-116；和Uknes等(1992)植物细胞4:645-656.]认为这些蛋白是植物对病原体感染共同的防御性系统反应。
致病相关蛋白包括但不限于SAR8.2a和SAR8.2b蛋白、烟草PR-la、PR-lb和PR-lc的酸性及碱性形式；PR-1’、PR-2、PR-2’、PR-2”、PR-N、PR-O、PR-O’、PR-4、PR-P、PR-Q、PR-S和PR-R主要蛋白；黄瓜过氧化物酶；黄瓜碱性过氧化物酶；为PR-P或PR-Q碱性形式的壳多糖酶；为PR-2、PR-N或PR-O碱性形式的β-1,3-葡聚糖酶(葡聚糖内1,3-β-葡糖酐酶，EC 3.2.1.39)；和来自黄瓜的病原体可诱导的壳多糖酶。这些PR蛋白公开于，例如，Uknes等(1992)植物细胞4:645-656及其中引用的文献中。
SAR或SAR样基因在所有显示系统性获得抗性的植物中表达。通过用已知的SAR DNA序列探测可测定这些基因的表达。例如，见Lawton等(1992)第二届欧洲植物病理学联合会论文集(1983)，于：植物防御反应机制，B.Fritig和M.Legrand(编)，Kluwer学术出版社，Dordrecht,pp.410-420；Uknes等.(1992)；植物细胞4:645-656；和Ward等.(1991)植物细胞3:1085-1094。用于杂交和克隆的方法在本领域是众所周知的。见，例如，分子克隆实验手册，第2版，1-3卷，Sambrook等.(编辑)冷泉港实验室出版社(1989)及其中引用的文献。
作为选择，可通过其它方法如蛋白测序、+/-筛选等找到这样的SAR或SAR样基因。见，例如，Liang和Pardee(1992)科学257:967-971；和St.John和Davis(1979)细胞16:443。
尽管研究和使用了许多高深和深入的作物保护方法，包括植物的基因转化，但是由于病害，每年仍有数十亿美元的损失。以前已经克隆出抗病基因但是以这些基因转化的转基因植物通常只对特定病原体种类的菌株的亚群有抗性。除了克隆参与SAR的基因的努力，还没有分离和鉴定出控制广谱抗病性的基因。
几种来源的证据显示内源性产生的SA参与了偶联病原体感染识别与SAR启动的信号传导途径。施用在Delaney，等.美国国家科学院院报.92:6602-6606(1995)和WO94/16077(在此引用仅供参考)中描述的SA或INA后，具有对病原体应答而积累SA能力的突变体仍然没有诱导SAR基因或抗性的能力。
现已发现这些突变体含有突变基因，这些基因的野生型形式控制SAR基因表达和SAR本身。本发明认识到该突变基因赋予突变植物广谱的疾病易感性并导致它们不能由病原体和化学诱导物诱导。
本发明涉及野生型(NIM1)基因的鉴定、分离和特征分析，该基因使植物在对生物和化学诱导物应答时激活SAR和SAR基因的表达。
已鉴定了诱变的拟南芥属植物中的突变基因。已发现这些植物在它们对病原体感染的正常反应中是缺陷型的，它们既不表达与系统获得性抗性(SAR)有关的基因也不能表现SAR。这些突变体含有标记为nim1(即不可诱导的免疫性)的缺陷型基因。
本发明也涉及克隆的NIM1基因及其变异体的应用以产生具有广谱抗病性的转基因植物及由此而制备的转基因植物。本发明进一步涉及克隆的NIM1基因及其变异体在用于鉴定能够诱导植物广谱抗病性的化合物的筛选方法中的应用。附图简述
图1显示化学诱导物在野生型和nim1植物中诱导PR基因表达的效果。
图2描述从侵染开始起超过6天的时期，PR-1基因在病原体感染的Ws-O和nim1植物中的表达。
图3显示在用丁香假单孢菌侵染的Ws-O和nim1植物中SA的积累水平。
图4显示通过AFLP和SSLP测定的NIM1区域的遗传图谱。
图5描述通过YAC克隆所测定的NIM1区域的物理图谱。
图6显示延伸的P1/BAC毗连序列群的物理图谱。
图7显示相对于并列AFLP标记和YACs而列出的P1和BAC克隆位点的物理图谱。
图8显示含有NIM1基因的进一步延伸的P1/BAC毗连序列群的物理图谱。
图9显示NIM区域完整的遗传和物理精细图谱。
图10显示完整的NIM1区域的图谱。
图11显示包括新AFLP标记的完整的NIM1区域的图谱。
图12为重组子D169和C105的图示。
图13以NIM1为中心的染色体区域的完整图谱，表示了在NIM1区域的重组子，包括BACs、YACs和粘粒。
图14提供含有NIM1基因的克隆BAC-04的9.9kb区域的序列。
图15显示NIM1基因的核苷酸序列和NIM1基因产物的氨基酸序列，包括各种等位基因中的变化。
图16显示由INA、BTH、SA和病原体诱导在nim1野生型和突变型等位基因中NIM1的表达。
图17显示在nim1突变型和野生型植物中PR-1的表达。
图18显示现在各种nim1突变体中的抗病性。
图19是NIM1蛋白的表达序列标记区域和4种水稻基因序列(见SEQ ID NO:3)的cDNA蛋白产物的氨基酸序列比较。定义
AA：                 氨基酸
AFLP：               扩增片段长度多态性
avrRpt2：            从丁香假单胞菌分离的无毒基因Rpt2
BAC：                细菌人工染色体
BTH：                苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯
Col：                哥伦比亚拟南芥属生态型
ECs：                酶联合
INA:           2,6-二氯异烟酸
Ler：          拟南芥属生态型Landsberg erecta
NIM1：         赋予植物抗病性的野生型基因
nim：          赋予植物对疾病易感性的NIM1的突变型等位基因
nim1：         突变的植物株系
ORF：          开放阅读框架
Psc：          引物联合
SA：           水杨酸
SAR：          系统获得性抗性
SSLP：         简单序列长度多态性
Ws-O：         拟南芥属生态型Wassilewskija
YAC：          酵母人工染色体
已通过图谱和步移技术克隆了NIM1基因，表明该基因包含在105kb的区域内。(见图13和表16)。该区域由左边的L84.6b标记和右边的L84.T2标记限定。仅有3个从105Kb区域的野生型DNA制备的重叠粘粒nim1突变体表型互补(图13和表16)。如图13中所示，这3个粘粒仅在由粘粒克隆D7的左端和粘粒D5右端所限定的9.9Kb的区域重叠。在此105 Kb区域的其它部分制备的许多其它粘粒不与nim1表型互补(图13和表16)。NIM1基因的几乎全长的cDNA克隆显示了适当的内含子-外显子边界并限定了该基因产物的氨基酸序列。只有9.9Kb互补区域内的NIM1基因区域具有各种nim1突变体等位基因中的序列变化(表18)。3个其它潜在的基因区域没有显示出与nim1表型有关的序列变化。在NIM1基因区域中发现的序列改变与该基因产物功能改变或功能丧失一致。具体的突变型等位基因中NIM1基因区域变化的严重性粗略地与观察到的nim1等位基因的生理学严重性相关。仅仅NIM1基因区域具有可检测到的RNA(转录)并且此RNA显示与致病过程中NIM1生理学作用一致的足够的变化(图18和表16)。
本发明涉及分离的基因片段，NIM1基因，该基因是植物中系统获得性抗性(SAR)途径的关键因素。此NIM1基因与由化学或生物诱导物活化SRA相关，并且与这些诱导物一起是SAR和SAR基因表达所必须的。
通过对带有突变nim1基因的已知突变植物基因组进行分子生物学分析确定NIM1基因的位置，其中的突变基因带给宿主植物对多种病原体极端的敏感性并使它们不能对病原体和SAR的化学诱导物应答。
由于其对植物宿主的病原体的许多株系和致病型，以及对一般不感染植物宿主但感染其它宿主的病原体敏感，NIM1突变体用作“通用的疾病易感的”(UDS)植物。可通过用诱变剂处理种子或其它生物材料，然后通过以已知的系统获得性应答的化学诱导物(如INA)处理子代植物而筛选具有UDS表型的子代植物，然后以已知的病原体感染植物而产生这些突变体。在这些条件下，非诱导的突变体产生严重的疾病症状，而非突变体被化学化合物诱导产生系统获得性抗性。nim突变体可同样地选自通过化学或辐射诱变产生的突变体种群以及由T-DNA插入及转座子诱导诱变产生的种群。
产生突变植物株系的技术在本领域众所周知。nim植物表型可用来作为鉴定使植物中表达广谱抗病性的分离的基因片段的工具。
本发明包括含NIM1基因的突变体基因，nim1基因的分离的DNA分子。
在使用nim1突变体或植物分离对于SAR基因组成性表达所必须的野生型NIM1基因之后，该抗性特征与其它对产量和质量重要的特征一起可通过育种而掺入到植物株系中。育种方法和技术在本领域是众所周知的。见，例如，Welsh J.R.，植物遗传与育种基础，John Wiely &Sons,NY(1981)；作物育种Wood D.R.(编)美国农学会，MadisonWisconsin(1983)；Mayo O.，植物育种理论，第2版，Clarendon出版社，牛津(1987)；Singh,D.P.，针对疾病和昆虫虫害抗性的育种Springer-Verlag,NY(1986)；Wrickle和Weber，数量遗传学和植物育种筛选Walter de Gruyter和Co.,Berlin 1986)。
本发明的进一步目的是包含在植物中可操作地连接到编码根据本发明所述的NIM1基因产物和变异体氨基酸序列的异源DNA分子上的活性启动子的嵌合基因。
用于构建植物表达元件以及将外源DNA导入植物的方法学在本领域中已得到广泛描述。一般地，为了将外源DNA导入植物，使用Ti质粒载体运载外源DNA。直接DNA摄入、脂质体、电穿孔、显微注射、和微粒也已用于运载外源DNA。这些方法在本领域已公开。见，例如，Bilang等(1991)基因100:247-250；Scheid等(1991)普通分子遗传学.228:104-112；Guerche等(1987)植物科学52:111-116；Neuhause等(1987)理论应用遗传学75:30-36；Klein等(1987)自然327:70-73；Howell等(1980)科学208:1265；Horsch等(1985)科学227:1229-1231；DeBlock等(1989)植物生理学91:694-701；植物分子生物学方法(Weissbach和Weissbach，编)学术出版公司.(1988)；和植物分子生物学方法(Schuler Zielinski，编)学术出版公司.(1989)。也见1995年5月10日提交的美国专利申请系列Nos.08/438,666和WO93/07278，本文全文引用作为参考文献。应该理解转化方法将依赖于待转化的植物细胞。
应进一步认识到可修饰表达元件的组成以增加表达。例如，可利用截短的序列、核苷酸置换或其它修饰。然后，用这样修饰的表达系统转化的植物细胞将表现出对SAR激活必须的SAR基因的过表达或组成性表达。
使用常规的DNA重组技术，通过诱导SAR基因表达而赋予植物抗病性的DNA分子或基因片段可掺入到植物或细菌细胞中。一般地，这包括将该DNA分子插入到表达系统中，对于载体，DNA分子是异源的(即正常不存在)。此异源DNA分子以适当的方向和正确的阅读框插入到表达系统或载体中。该载体含有对于插入的编码蛋白序列的转录和翻译必须的元件。可使用许多本领域已知的载体系统，如质粒、噬菌体病毒及其它修饰的病毒。合适的载体包括但不限于病毒载体如λ载体系统Igt11,Igt10和Charon 4；质粒载体如pBI121,pBR322,pACYC177,pACYC184,pAR系列，pKK223-3,pUC8,pUC9,pUC18,pUC19,pLG339,pRK290,pKC37,pKC101,pCDNAⅡ；和其它类似系统。可用本领域标准的克隆方法，如由Maniatis等，分子克隆：实验指南，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1982)描述的将此DNA序列克隆入载体中。
本发明的进一步目的是包括根据本发明所述的嵌合基因的重组载体。
为了获得本发明基因或基因片段的有效表达，启动子必须存在于表达载体中。RNA聚合酶一般结合到基因的启动子上并起始转录。启动子的强度即启动转录的能力有差别。根据所用的宿主细胞系统，可使用许多合适启动子中的任意一个。合适的启动子包括遍在蛋白、nos启动子、核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因启动子、叶绿素A/B结合多肽小亚基启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子和从植物基因中分离的一些启动子。见C.E.Vallejos等，“含有与RRNA(45S)，主要叶绿素A/B结合多肽和核酮酶二磷酸羧化酶基因的同源的序列的DNA限制性片段在番茄基因组中的定位”遗传学112:93-105(1986)，其中公开了小亚基材料。nos启动子和花椰菜花叶病毒35S启动子在本领域是众所周知的。
一旦将本发明的抗病基因克隆入表达系统，就可以转化入植物细胞。适于转化的植物组织包括叶组织、根组织、分生组织和原生质体。
来自土壤杆菌属的细菌可用于转化植物细胞。这样的细菌的合适的种类包括根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌。根癌土壤杆菌(如.，LBA4404或EHA105菌株)由于其众所周知的转化植物的能力而特别有用。
以基因转化植物的另一种方法包括在植物组织和细胞中推进惰性或生物活性的颗粒。这些技术公开于由Sanford等申请的美国专利号4,945,050；5,036,006；和5,100,792中。一般地，该方法包括在有效穿透细胞外表面并能掺入其内部的条件下向细胞推进惰性或生物活性颗粒。当使用惰性颗粒时，可通过用含所需基因的载体包被颗粒而将载体导入细胞中。可选择地，靶细胞被载体包围从而通过颗粒的激发将载体带入细胞中。生物活性颗粒(如，干的酵母细胞、干的细菌或噬菌体，其中分别含有需导入的DNA)也可被推进入植物细胞中。
可用本发明的分离的基因片段赋予多种植物细胞，包括裸子植物、单子叶和双子叶植物细胞的抗病性。尽管可将该基因插入到这些大类中任何的植物细胞中，但其特别有用于农作物细胞，如水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、土豆、胡萝卜、甘薯、甜菜、蚕豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、莱菔、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、西葫芦、南瓜、密生西葫芦、黄瓜、苹果、梨、榅桲、甜瓜、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、悬钩子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。
本发明的表达系统在适当的条件下实质上可用于任何的作物细胞。转化的细胞可再生成完整的植物，这样该基因赋予完整转基因植物抗病性。如上面所列出的，可修饰表达系统从而使抗病基因连续或组成性表达。转化
本发明系统可用于任何可被转化和再生的植物。用于转化和再生的方法在本领域是众所周知的。除了上面引用的文献外，也参见，An,G.,Watson,B.D.，和Chiang,C.C用双元Ti载体系统转化烟草、番茄，土喜，和拟南芥菜。植物生理学。81:301-305,1986；Fry,J.,Barnason,A.，和Horsch,R.B.用以根癌土壤杆菌为基础的载体转化蔓菁.植物细胞呼吸6:321-325,1987；Block,M.d.用根癌土壤杆菌对土豆(Solanum tuberosum)进行基因型非依赖性叶盘转化.遗传学理论及应用。76:767-774,1988；Deblock,M.,Brouwer,D.D.，和Tenning,P.用根癌土壤杆菌转化蔓菁和花椰菜及bar和neo基因在转基因植物中的表达.植物生理学。91:694-701,1989；Baribault,T.J.,Skene,K.G.M.，Cain,PA.，和Scott,N.S.转基因葡萄：表达β-葡糖醛酸酶的苗再生。植物细胞呼吸.41:1045-1049,1990；Hinchee,M.A.W.,Newell,CA.,ConnorWard,D.V.,Armstrong,T.A.,Deaton,W.R.,Sato,S.S.，和Rozman,R.J.非茄科作物的转化和再生.Stadler.Genet.Symp.203212.203-212,1990；Barfield,D.G.和Pua,E.C.用根癌土壤杆菌介导的转化在芥菜植物进行基因转移.植物细胞呼吸.10:308-314,1991；Cousins,Y.L.,Lyon,B.R.，和Llewellyn,D.J.澳大利亚棉花栽培品种的转化：经遗传工程改进棉花的前景.澳大利亚生理学杂志.18:481-494.1991；Chee,P.P.和Slightom,J.L.通过微粒轰击转化黄瓜组织鉴定含有功能和无功能转移基因的植物。基因118:255-260,1992；Christou,P.,Ford,T.L.，和Kofron,M.用于水稻的变异-非依赖性基因转化方法的开发。生物技术趋势。10:239-246,1992；D’Halluin,K.,Bossut,M.,Bonne.,E.,Mazur,B.,Leemans,J.，和Botterman,J.甜菜(Beta vulgarisL.)的转化和转基因植物中除草剂抗性的评估.生物/技术.10:309-314.1992；Dhir,S.K.,Dhir,S.,Savaka,M.A.,Belanger,F.,Kriz,A.L.,Farrand,S.K.，和Widholm,J.M.转基因大豆(Glycine Max)植物从电穿孔原生质体再生.植物生理学99:81-88,1992；Ha,S.B.,Wu,F.S，和Thorne,T.K.从原生质体再生的转基因草皮型高酥油草(Festucaarundinacea Schreb.)植物细胞呼吸.11:601-604,1992；Blechl,A.E.基因转化用于小麦改进的新工具第78届年会Keynote Address.谷物食物世界38:846-847,1993；Casas,A.M.,Kononowicz,A.K.,Zehr,U.B.,Tomes,D.T.,Axtell,J.D.,Butler,L.G.,Bressan,R.A.，和Hasegawa,P.M.通过微粒轰击的转基因高粱植株。美国国家科学院院报.90:11212-11216,1993；Christou,P.向疑难作物中进行变异非依赖性基因转移的原理和实践.IN VITRO CELLDEV BIOL-PLANT29P:119-124,1993；Christou,P.1993；Damiani,F.,Nenz,E.,Paolocci,F.，和Arcioni,S.经发根病土壤杆菌转化在Lotus spp中诱导对潮霉素的抗性.转基因研究2:330-335,1993；Davis,D.R.,Hamilton,J.，和Mullineaux,P.豌豆的转化.植物细胞呼吸.12:180-183,1993；Dong,J.Z.和Mchughen,A.从土壤杆菌介导的转化产生的转基因亚麻植物转基因植物嵌合再生和遗传的几率.植物科学91:139-148,1993；Fitch,M.M.M.,Manshardt,R.M.,Gonsaalves,D.，和Slightom,J.L.来自土壤杆菌介导的体细胞胚转化的转基因番木瓜植物.植物细胞呼吸.12:245-249,1993；Frankin,C.I.和Trieu,T.N.通过Biolistic轰击介导的DNA转移对饲料草CaucasianBluestem的转化.植物生理学102:167,1993；Golovkin,M.V.,Abraham,M.,Morocz,S.,Bottka,S.,Feher,A.，和Dudits,D.通过将DNA直接摄入胚胎发生原生质体而制备转基因玉米植物.植物科学90:41-52,1993；Guo,G.Q.,Xu,Z.H.,Wei,Z.M.，和Chen,H.M.从通过胚栓介导的直接基因转移而转化的小麦原生质体得到的转基因植物.中国科学38:2072-2078,1993；Asano,Y.和Ugaki,M.通过电穿孔介导直接基因转移入原生质体获得的转基因Agrostis alba植物.植物细胞呼吸1994；Ayres,N.M.和Parkl,W.D.水稻的基因转化.植物科学关键综述13:219-239,1994；Barcelo,P.,Hagel,C.,Becker,D.,Martin A.，和Lorz,H.通过微粒轰击花序组织高效获得转基因玉米(Tritordeum)植物.植物杂志5:583-592,1994；Becker,D.,Brettschneider,R.，和Lorz,H.来自微粒轰击的盾片组织的可育转基因小麦.植物杂志5:299-307,1994；Biswas,G.C.G.,VA.,Datta,S.K.，和Portrykus,I。通过向原生质体直接的基因转移得到转基因Indica水稻(Oryza Sativa L)植物。生物技术杂志32:1-10,1994；Borkowska,M.,Kleczkowski,K.,Klos,B.,Jakubiec,J.，和Wielgat,B．用根癌土壤杆菌双元载体系统转化二倍体土豆.1．方法学方法。植物生理学报16:225-230,1994；Brar,G.S.,Cohen,B.A.,Vick,C.L.，和Johnson,G.W.用Accell(R)技术从优良的栽培物中再生转基因花生(Arachis Hypogaea L)植物.植物杂志5:745-753,1994；Christou,P．豆科和禾本科作物的遗传工程现状和研究进展。农业食品工业高科技5:17-27,1994；Chupeau,M.C.,Pautot,V.，和Chupeau,Y.极性原生质体电穿孔后转基因树的再生。转基因研究3:13-19,1994；Eapen,S．和George.L.花生(Arachis Hypogaea L)中根癌土壤杆菌介导的基因转移.植物细胞呼吸.13:582-586,1994；Hartman,C.L.,Lee,L.,Day,P.R.，和Tumer,N.E.由Biolistic转化产生的杀虫剂抗性草坪草(Agrostis Palustris Huds).BID-技术12:919923,1994；Howe,G.T.,Goldfarb,B.，和Straauss,S.H土壤杆菌介导的杂交极性悬浮培养物的转化和转化植物的再生，植物细胞组织和器官培养36:59-71,1994.；Konwar,B.K.根癌土壤杆菌介导的甜菜(Beta Vulgaris L)的基因转化。植物生化和生物技术杂志3:37-41,1994,；Ritala,A.,Aspegren,K.,Kurten,U.,Salmenkalliomarttila,M.,Mannonen,L.,Hannus,R.,Kauppinen,V.,Teeri,T.H．和Enari,T.M由粒子轰击未成熟胚胎而得到的可育转基因大麦。植物分子生物学24:317-325,1994；Scorza,R.,Cordts,J.M.,Ramming,D.W.，和Emershad,R.L．葡萄(Vitis Vinifera L)体细胞胚的转化和转基因植物的再生.细胞生化杂志:102,1994；Shimamoto,K．转基因单子叶植物中的基因表达。当前生物技术观点。5:158-162,1994；Spangenberg,G.,Wang,Z.Y.,Nagel,J.，和Potrykus,I红色酥油草(Festuca Rubra L)原生质体培养和转基因植物的产生，植物科学97:83-94,1994；Spangenberg,G.,Wang,Z.Y.,Nagel,J.，和Potrykus I饲料草中的基因转移和转基因植物的再生。细胞生物化学杂志：102,1994；Wan,Y.C和Lemaux,P.G．大量独立转化的可育大麦植物的产生。植物生理学104:3748,1994；Weeks,J.T.,Anderson,O.D.，和Blechl,A.E．通过微粒轰击稳定转化小麦(TriticumAestivum L)。细胞生物化学杂志：104,1994；Ye,X.J.,Brown,S.K.,Scorza,R.,Cordts,J.，和Sanford,J.C．通过粒子轰击对桃组织的遗传转化。JAMER SOCHORTSCI 119:367-373,1994；Spangenberg,G.,Wang,Z.Y.,Nagel,J.,和Potrykus,I．红色酥油草(Festuca Rubra L)原生质体培养和转基因植物的产生。植物科学1994 97:83-94,1995。
由于nim1宿主植物也可以对其所在的宿主范围以外的病原体易感，所以这些植物在宿主-病原体相互作用的分子、遗传和生物学分析中也具有重要的应用。此外，nim1植物的UDS表型也使它们可用于抗真菌剂的筛选。在特定宿主种中筛选出的nim1突变体在用该宿主和宿主病原体筛选抗真菌剂中具有很多的用途。其优势在于突变体的UDS表型，避免了由于宿主分别对不同的病原体和致病型易感，或甚至对有些病原体或致病型具有抗性而遇到的麻烦。
本发明的病原体包括但不限于病毒或类病毒，如．烟草或黄瓜花叶病毒、环斑病毒或坏死病毒、天竹葵卷叶(pelargonium leaf curl)病毒、红色三叶草斑(red clover mottle)病毒、番茄丛矮病毒、等病毒；真菌，如Phythophthora parasitica和Peronospora tabacina；细菌如丁香假单胞菌和烟草假单胞菌；昆虫如蚜虫，例如．Myzuspersicae；和鳞翅目例如．Leliothus spp.；及线虫，例如，Meloidogyne incognita。本发明方法用于抵抗玉米的多种病原体包括但不限于霜霉如Scleropthoramacrospora,Scleropthora rayissiae,Scleropthora graminicola,Peronosclerospora sorghi,Peronosclerospora philippinensis,Peronosclerospora sacchari和Peronosclerospora maydis；和锈菌如高粱柄锈菌，多堆柄锈菌和Physopella zeae；其它真菌如Cercosporazeae-maydis，禾生刺盘孢，Fusarium monoliforme,玉蜀黍赤霉，Exserohilum turcicum，玉蜀黍球梗孢和Bipolaris maydis；细菌如斯氏泛菌。
序列表描述
SEQ ID NO:1-图14中9919-bp的基因组序列。
SEQ ID NO:2-图15中5655-bp的基因组序列。
SEQ ID NO:3-由seq id no:2的编码序列编码的野生型NIM蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4-图19中水稻-1的氨基酸序列33-155。
SEQ ID NO:5-图19中水稻-1的氨基酸序列215-328。
SEQ ID NO:6-图19中水稻-2的氨基酸序列33-155。
SEQ ID NO:7-图19中水稻-2的氨基酸序列208-288。
SEQ ID NO:8-图19中水稻-3的氨基酸序列33-155。
SEQ ID NO:9-图19中水稻-3的氨基酸序列208-288。
SEQ ID NO:10-图19中水稻-4的氨基酸序列33-155。
SEQ 1D NO:11-图19中水稻-4的氨基酸序列215-271。保藏
下面的载体分子按下述的日期保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),12301 Parklawn Drive Rockville,MD 20852 U.S.A:
质粒BAC-04于1996年5月8日保藏于ATCC,ATCC号为97543。
质粒P1-18于1996年6月13日保藏于ATCC,ATCC号为97606。
粘粒D7于1996年9月25日保藏于ATCC,ATCC号为97736。实施例实施例1
通过基于作图的克隆鉴定NIM1克隆。在拟南芥菜中对NIM1进行高分辨率遗传作图和物理作图。1．nim1突变体的植物原料和分离.
按Delaney等，(1995)在PNAS 92,6602-6606中所述从拟南芥菜psis生态型Ws-O植物种群中分离nim1突变体。一个突变体种群为来源于甲基磺酸乙酯(EMS)诱变种子(购自Lehle,RoundRock,Tx)的M2文库形式且另一个为来自从俄核俄州立大学拟南芥菜psis生物资源中心(Columbus,OH)获得种子的T-DNA种群形式。
筛选不可诱导突变体(nim1)的基础是筛选诱变的植物种群，其中的植物对毒性病原体的抗性不可由INA(2,6-二氯异烟酸；Metraux，等1991．位于：植物-微生物相互作用分子遗传学进展。卷1,432-439.Hennecke和Verma,编．；Kessmann．等．1993位于：农药的作用模式.Y Honma,编.；Vernooij，等1995，分子.植物.微生物相互作用8,228-234)所诱导。
将植物以高密度种植于商业上种植混合物的大盘子中。当植物2周龄时，将盘子用0.25mg/ml INA喷洒.4天后，以Peronospra parastica的孢子悬液，分离物EmWa(EmWa)，以5×104至1×105个孢子/ml喷洒植物。该真菌对拟南芥菜psis生态型Ws-O一般是有毒的，除非事先以INA或类似的混合物在这些植物中诱导出抗性。
在高湿度环境中孵育以后，一般在感染后7天鉴定出具有可见病症的植物。这些植物尽管使用了诱导抗性的药物但没有表现出对真菌的抗性并且因此为潜在的nim(无-免疫性)突变体植物。从360,000株植物中，鉴定出75株潜在的nim突变体。
从平台中分离出这些潜在的突变体植物，置于低湿条件下并允许其下种。以INA预处理后再次以与真菌EmWa相同的用于易感性的方式筛选来自这些种子的植物。显示感染症状的子代植物定义为nim突变体。这样鉴定出了6个nim品系。其中一个品系(nim)从T-DNA种群中分离得到而另5个从EMS种群中分离得到。2．评价植物对INA和其它抗病化学诱导物的反应。ⅰ．nim1的表型分析
水杨酸(SA)和苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲基酯(BTH)为与INA一样在野生型植物中诱导称为系统性获得抗性的广谱抗病性的2种药物。因为INA在nim1植物中没有诱导出抗性，所以也评价这些植物在以SA和BTH预处理后的抗病反应(部分描述于Delaney等，(1995)PNAS 92,6602-6606中)。
以1,5或15mM SA或0.25 mg/ml BTH喷洒植物并且5天后以EmWa接种(如上面实施例1中所述)。从这些植物上存在的病症和真菌生长来看,SA和BTH均未能保护.nim1植物免受真菌的感染。因此，.nim1不对诱导SAR化合物中的任何一种起反应提示该突变位于抗性诱导途径中这些化合物进入点的下游。
也评价nim1对2种不相容的P.parastica分离物,Wela和Noco(即这些真菌菌株在野生型Ws-O植物中不导致疾病)感染的疾病反应。以5-10×104个孢子/ml的Wela或Noco分生孢子悬液喷洒植物并于高湿度下孵育7天.与野生型植物不同，nim1植物既对Wela又对Noco感染形成疾病症状。这些症状为坏死性斑点和蔓延，具有一些孢子形成。乳酸酚蓝染色后，在nim1植物的叶子上容易地观察到菌丝。因此，nim1植物对通常不相容的P.parastica分离物是易感的。此结果表明nim1植物不仅为化学诱导抗病性是缺陷型的，而且对通常非致病性的微生物的突然抗性也是缺陷型的。ⅱ．nim1的生化分析
SA、INA和BTH诱导SAR和SAR基因的表达，SAR基因包括拟南芥菜psis中的致病相关基因PR-1、PR-2和PR-5。由于这些化合物在nim1中没有诱导出抗病性(如上面实施例1.2中所述)，所以用SA、INA或BTH预处理后分析这些突变系SAR基因的表达。
用SA、INA或BTH处理后，收获植物组织并分析PR-1、PR-2和PR-5基因RNA的积累。然后，从处理的组织中分离RNA并于琼脂糖凝胶上电泳。制备3份凝胶印迹且按Delaney等，(1995)PNAS92,6602-6606中所述分别用这3种SAR基因中的一种作物探针进行杂交。与野生型相反，在nim1植物中，这些药物诱导出这3个SAR基因中任何一种RNA的积累如图1所示。加起来，结果表明，这些药物在nim1植物中既不SAR又不诱导SAR基因表达。
由于这些药物在nim1植物中不SAR或不诱导SAR基因表达，因此研究是否病原体感染如同在野生型植物中一样，可诱导SAR基因在这些植物中的表达是有意义的。按上述以EmWa孢子喷洒Ws-O和nim1植物并在几个时间点收集组织用于RNA分析。如图2中所示，野生型Ws-O植物的病原体感染(EmWa)在感染后4天诱导PR-1基因的表达。然而在nim1植物中，直到感染后6天仍没有诱导PR-1基因的表达且在该时间相对于野生型其水平降低。因此，病原体感染后，PR-1基因在nim1植物中的表达被延误且相对于野生型其水平降低。
以导致坏死反应的病原体感染野生型植物导致SA在感染组织中的积累。以显示这些内源性的SA对于SAR途径中的信号传导是必须的，即内源性SA的降解导致了抗病性的下降。这将SA的积累定义为SAR途径中的标记(Gaffney等，1993，科学261,754-756)。
以病原体感染后测试nim1植物积累SA能力。将带有avrRpt2基因的番茄DC株3000丁香假单胞菌注射至4周龄的nim1植物叶子中。2天后收获叶子按Delaney等，(1995)PNAS92,6602-6606中所述用于SA分析。该分析表明nim1植物中的感染叶子中积累了高水平的SA，如图3所示。未感染的叶子中也积累了SA，与感染叶子中的水平不同，类似于在野生型拟南芥菜psis中所观察到的一样。这表明nim突变位于信号传导途径中SA标记的下游。这是预料之中的，如已知INA和BTH(在nim1植物中无活性)刺激在SA的SAR通路下游的组分(Vernooij.，等1995，分子.植物.微生物相互作用8,228-234；Friedrich,等，1996，植物杂志，9，待出版；和Lawton等，1996，植物杂志9，待出版)。此外，如上述例1.2中所述，外用的SA没有保护nim1免受EmWa的感染。3．nim1的遗传分析.
nim1植物与野生型Ws-O植物回交，并按上面实施例1.1中所述测试F1子代以INA预处理后对EmWa的抗性。没有INF-预处理的植物具有感染症状，而nim1对照植物的确显示出感染。因此，nim1突变测定为隐性的。
也对来自Ws-Oxnim1杂交的F2种群以INA预处理后的抗病性进行分析。在该种群中，约1/4(32/130株植物)在INA-预喷洒的植物的EmWa处理后表现出疾病症状且3/4(98/130株植物)未表现出疾病症状．。这些结果表明nim突变鉴定出单一的遗传位点并且证实了显示突变隐性性质的F1数据。4．标记的鉴定和NIM位点的遗传作图
为了对NIM基因进行常规的基于作图的克隆，不得不鉴定出与该突变在遗传上紧密连锁的标记。这用第2步完成。首先，将nim1植物与不同的拟南芥菜psis基因型，Landsberg erecta(Ler)杂交，并且从该杂交的F2植物中鉴定出具有nim1表型的F2植物(即在NIM位点该植物为纯合的nim/nim)。从这些植物中，通过分子分析，鉴定出靠近DNA标记的具有Ler基因型的植物。根据鉴定标准的性质，这些植物为标记和NIM位点之间的重组子。重组的频率限定了标记和NIM位点之间的遗传距离。
用于基于作图的克隆的第2个前提是鉴定出的与NIM位点之间具有遗传上很近的标记，即鉴定出很少重组子的标记。如果鉴定出的遗传标记很近，那么它们可用于分离与NIM位点之间较近的基因组DNA。如果在克隆出的DNA中不存在，那么可通过步移克隆NIM位点。步移可从基因的2端开始。其依赖于获得与目的基因连续较近的重叠克隆。当从例如，北端开始的步移而获得单一DNA标记并且在此标记和目的基因之间没有鉴定出重组子时，那么其一定与该基因很近。然而，如果标记没有从南端鉴定出重组子，那么从其中获得标记的克隆一定与该基因交叉。那么，通过定义，克隆出目的基因。其一定位于该标记和上一个北端标记之间，后者从北端鉴定出最少量的重组子。
在第1个步骤中，大量的重组子通过遗传杂交产生。在第2个步骤中，与NIM基因靠近的重组子用分子标记鉴定出来。文献中已描述了多种方法并且存在多种开发其它标记的方法。我们的方法依赖于许多标记系统，包括SSCPs和AFLPs(见下面)。ⅰ．遗传杂交.
为了对NIM基因相对于SSCP和AFLP标记进行染色体定位，nim1与Ler杂交以制备定位种群。种植该杂交的F2植物并且收获叶子用于将来的DNA提取。其次，按上面实施例1.1中所述评价F2植物的nim1表型。同样，种植来自单个F2植物的F3种群并且评价nim表型。如(Rogers和Bendich,1988，植物分子生物学手册，A6,1-10)所述，通过CTab方法从储存的nim1表型F2和F3植物组织中提取DNA。ⅱ．简单序列长度多态性标记
已描述过简单序列长度多态性(SSLP)标记ATHGENEA和nga植物(Bell和Ecker，基因组19,137-144)。用于这些SSCPs检测的引物列于表1中。相对于标记ATHGENEA对NIM基因进行遗传作图
用ATHGENEA(1)引物用于PCR扩增Ler的基因组DNA，预期得到205碱基对(bp)条带，而以Ws-O基因组DNA预期得到211bp的条带(Bell和Ecker,1994,基因组19,137-144)。证实扩增产物难以在常规的琼脂糖凝胶中分离。因此，开发出2种用于分离和检测这些PCR片段的替代方法。
表1．SSCP引物序列.
引物套 引物序列(5’至3’)
ATHGENEA(1)ATHGENEA(2)nga111(1)nga111(2) ACC ATG CAT AGC TTAAAC TTC TTGACA TAA CCA CAA ATAGGG GTG CACC ATG CAT AGC TTAAAC TTC TTGCCA AAT GTC AAA ATACTC GTCCTC CAG TTG GAA GCTAAA GGGTGT TTT TTA GGA CAAATG GCGCTC CAG TTG GAA GCTAAA GTGT TTT TTA GGA CAAATG G
在第1种方法中，用引物套ATHGENEA(1)(表1)在6-羧基罗丹明标记的UTP(dUTP-R110，获自ABI)存在下扩增基因组DNA，产生罗丹明标记的PCR片段。在DNA测序仪上分析该PCR片段，检测DNA片段具有单个核苷酸的分辨率。
特异性的试剂有：1×PCR缓冲液，2mM MgCl2,dNTPs每种200 mM,2mM dUTP-R110,0,75mM的ATHGENEA(1)引物，10ngDNA和0.75单位的Taq聚合酶，位于20ml的反应体积中。扩增条件为：94℃3分钟，然后94℃15秒，55℃15秒和72℃30秒进行35个循环。将这些样品于能够检测荧光标记DNA片段并且具有单个核苷酸(nt)分辨率的ABI DNA测序仪上进行分析。这允许对植物样品进行基因分型：从Ler DNA中得到205-核苷酸的DNA片段且从Ws-O DNA中得到211-核苷酸的条带。因此，可容易地区分具有6个核苷酸长度差异的DNA片段，从而容易地在ATHGENEA位点将样品分为纯合Ws-O，纯合Ler和杂合Ws-O/Ler。
为了增加该系统的产量，采用了多种策略。有些DNA样品按上述以引物套ATHGENEA(1)进行PCR扩增，而其它样品以引物套ATHGENEA(2)(列于表2)进行分析，每种情况均有6-羧基罗丹明标记的UTP存在。引物套ATHGENEA(2)根据发表的ATHGENEA序列(Simoens.，等，1988，基因67,1-11)制备。此引物套从Ler DNA中扩增出139 bp的DNA片段并且从Ws-O DNA中扩增出145bp的条带。引物套ATHGENEA(2)的扩增反应条件与上面的引物套ATHGENEA(1)所述的条件一致。
在ABI 377DNA测序仪上电泳之前将用引物套ATHGENEA(1)的简单反应和用引物套ATHGENEA(2)的简单反应混合到一起。此多重方法允许对2种样品在测序仪的一个泳道中进行基因分型，一个位于测序仪中145/139并且另一个位于211/205。
在第2种方法中，用以荧光染料FAM-6(6-羧基荧光素)(整合DNA技术公司)标记的引物标记PCR片段。ATHGENEA(1)和(2)引物套的正相ATHGENEA引物在序列上是一致的(见表1)。此引物以FAM-6标记并且用于用下面试剂(珀金埃尔默)的PCR扩增反应中：1×XL缓冲液，1mM MgCl2,dNTPs每种200 mM,0.5mM每种引物(正向引物以FAM-6标记)，10ng基因组DNA和0.5单位的XL聚合酶，位于20ml的反应体积中。循环条件为：94℃3分钟，然后94℃15秒，59℃15秒和72℃30秒进行35个循环。再一次在ABI377DNA测序仪上电泳之前将用引物套ATHGENEA(1)的简单反应和用引物套ATHGENEA(2)的简单反应混合到一起。此多重方法允许对2种样品在测序仪的一个泳道中进行基因分型，一个位于测序仪中145/139并且另一个位于211/205。
按上述分析所有来自nim1表型植物的F2和F3样品ATHGENEA位点的基因型。所有样品在鉴定植物的ATHGENEA位点均为杂合的，即为NIM1位点和ATHGENEA位点的重组子。用此方法分析的1142F2nim1表型植物和F3nim1表型植物种群中，其中的98个在ATHGENEA位点为杂合的，从而估计SSCP位点和NIM1位点之间的遗传距离为4.3cM。这便证实了NIM1位点位于靠近ATHGENEA标记的染色体1上。NIM1基因相对于标记nga1 11的遗传定位.
用SSCP标记nga1 11的2个引物套(在Bell和Ecker,1994,基因组19,137-144中描述过)扩增F2和F3nim1表型植物和对照Ws-O和Ler植物的基因组DNA。在下面条件下用引物套nga111(1)(在Bell和Ecker,1994，基因组19,137-144中描述过并列于表1中)：1×PCR缓冲液，2mM MgCl2,dNTPs每种200mM，引物0,75mM,10ngDNA和0.75单位的Taq聚合酶，位于20ml的反应体积中。在不同条件下用引物套nga111(2)(列于表1中，为引物套nga111(1)的衍生物)：1×PCR缓冲液，1.5mM MgCl2,dNTPs每种200mM，引物1mM,10ngDNA和1单位的Taq聚合酶，位于20ml的反应体积中。两者扩增条件均为：94℃孵育1分钟，然后94℃15秒，55℃15秒和72℃30秒进行40个循环。
将样品于3-5％的琼脂糖凝胶上分析。以任何一个引物套扩增Ws-O DNA获得的条带为146bp，而扩增Ler DNA得到了162bp的条带。在鉴定植物的nga111位点为杂合的植物样品为SSCP标记和NIM位点的重组子。在1144 F2 nim1表型植物和F3 nim1表型植物种群中，239个鉴定为nga111标记的杂合体，从而估计SSCP标记和NIM位点的遗传距离为10.4cM.这证实了NIM1位点位于染色体1上。由于几乎没有既在nga111位点又在ATHGENEA位点为杂合的nim1表型植物存在，故测定NIM1位点位于这2个标记之间，ATHGENEA位于NIM1基因的北端并且nga111位于NIM1基因的南端。这将NIM1基因定位于染色体1上靠近位置85处约nga111北端的10cM处(Lister和Dean,1993，植物杂志.4,745-750；Bell和Ecker,1994,基因组19,137-144)。ⅲ．扩增片段长度多态性标记
为了根据作图克隆NIM1基因，必须鉴定连续靠近该基因的分子标记。为了此目的，用Zabeau和Vos(1993，欧洲专利申请EP0534858)和Vos等.(1995，核酸研究23,4407-4414)所述的选择性限制片段扩增方法产生扩增片段长度多态性标记(AFLP)。AFLP技术大纲
在作图中对AFLP技术的使用依赖于选择性扩增2种遗传上不同的样品的一套DNA条带。找出获得的任一条带在2种基因型之间均不同后便将这些条带鉴定为该基因型的标记。如果此标记与目的基因(突变)以高频率共分离，那么此标记靠近该遗传位点。
在复合DNA样品中选择性扩增小套的DNA片段以2步完成。首先，以限制酶消化该DNA而产生DNA片段，然后向末端连接衔接子。其次，用由互补于该衔接子加上3’延伸(一般0-3个核苷酸)的序列所组成的引物仅仅扩增那些具有互补于这些引物末端的DNA片段。如果使用单核苷酸延伸，那么理论上，每个引物将与大约1/4的所以片段“匹配”，与1/16的两端均具有匹配引物的所以片段匹配。因此，以这些引物扩增出有些套的DNA引物。通过进一步放射标记一个引物，可获得一套更小的可见条带。AFLP分析
为了对DNA样品进行AFLP分析，以适当的酶(通常为EcoRⅠ和Msel；见下面)消化50ng的DNA并且将衔接子(列于下表2)连接到限制性片段(通常为EcoRⅠ和Msel)上。引物和YAC、P1及BAC克隆的序列在下面详细描述。用模板、互补于衔接子具有3’延伸(2或3个核苷酸；引物序列列于下面)的引物由于扩增反应。由于其中的一个引物被放射标记(通常为EcoRⅠ引物)，因此仅仅一个亚类的扩增片段在由于分离条带的放射自显影凝胶上是可见的。
克隆DNA(YAC,P1，粘粒)的扩增条件如下：94℃(变性)30秒，退火30秒并且于72℃延伸1分钟，进行36个循环。第1个循环的退火温度为65℃且在随后的12轮循环中每循环降低0.7℃并且然后维持于56℃。对于拟南芥菜psis植物的基因组DNA，扩增以2步进行：在第1步(预扩增)中，以具有单个核苷酸延伸的引物扩增DNA(2个引物均未标记)。此扩增条件如下：变性(94℃)30秒，退火1分钟(56℃)并且于延伸1分钟(72℃)，进行20个循环。在第2步中，将第1个扩增反应稀释10倍并且以含有全长延伸的引物(用一个标记引物)在下面的扩增条件下：94℃(变性)30秒，退火30秒并且于72℃延伸1分钟再次扩增36个循环。第1个循环的退火温度为65℃且在随后的12轮循环中每循环降低0.7℃并且然后维持于56℃。在聚丙烯酰胺凝胶上分离反应终产物并且将凝胶暴露于胶片，从而使能够观察放射性标记的PCR条带。当将此方法同时用于2种基因型的DNA时，鉴定出AFLP条带用于诊断一种基因型或另一种基因型。这种条带称为信息AFLP条带，或AFLP标记。表2显示了用于AFLP分析中的衔接子。表2酶           衔接子EcoRⅠ       5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
         3’-CATCTGACGCATGGTTAA-5’HindⅢ       5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
         3’-CATCTGACGCATGGTGCA-3’PstⅠ        5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3’
         3’-CATCTGACGCATGT-5’MseⅠ        5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’
         3’-TACTCAGGACTCAT-5’AFLP标记的产生和NIM1位点的精细作图
用来自拟南芥菜生态型Landsberg erecta(Ler)和Columbia(Col)(Lister和Dean,1993，植物杂志.4,745-750)杂交的重组近交系种群用于AFLP标记的筛选。用于AFLP筛选的引物为：
EcoRⅠ-引物：5’-GACTGCGTACCAATTCWN-3’
MseⅠ-引物：5’-GATGAGTCCTGAGTAAXWN-3’
引物中的“N”表示该部分是可变的(A,C,G或T)，“W”表示A或T，并且“X”表示C。所用可能的引物既用于EcoRⅠ-引物又用于MseⅠ-引物。这样便得到总共64(8×8)个引物组合(PCs)用于从上述重组的近交系和母本基因型，Ler和Col中扩增DNA。扩增反应产物于聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离不同大小的AFLP片段并且将凝胶对胶片曝光。检查胶片仅存在于一种基因型中的标记，即检查AFLP标记。
用AFLP标记，即，在重组近交系的2个母本之间为多态性的DNA片段构建该重组近交系种群的遗传图谱。例如，下面的1.5i描述了拟南芥菜psis染色体1上NIM1基因的定位，大约位于位置85。挑选那些被定位于(用重组近交系)拟南芥菜psis染色体1上位置81和88之间的AFLP标记用于分析存在所述AFLP标记的重组植物并且因此用于更为精确地定位NIM1基因。从该区域中鉴定出7个AFLP标记作为信息标记；它们在nim1×Ler杂交的2个母本之间为多态性的。6个AFLP标记为Ler-特异性的，即这些AFLP标记不存在于Ws(以及Col中)。1个AFLP标记为Ws特异性的，即Col-特异性的AFLP标记(不存在于Ler中)也存在于Ws中。这些AFLP标记为：L81.1,L81.2,W83.1,L84,L85,L87和L88(L-标记为生态型Ler特异性的并且W-标记为2个生态型Col和Ws均为特异性的)。用这些AFLP标记分析nim1×Ler杂交的重组植物(见下)。此外，AFLP标记C86(Col特异性的来源于重组近交系的标记)用于分离DNA克隆(见下面)。表3列出了用于获得这些AFLP标记的引物序列。
表3显示了来自重组近交系种群AFLP标记的引物组合。      “EcoRⅠ”指序列    5’-GACTGCGTACCAATTC-3’“MseⅠ”指序列     5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’。表3AFLP标记           相应的引物组合L81.1            EcoRⅠ-CA    MseⅠ-CCGL81.2            EcoRⅠ-AA    MseⅠ-CAAL83.1            EcoRⅠ-CA    MseⅠ-CTCL84              EcoRⅠ-AAT   MseⅠ-CAAL85              EcoRⅠ-CA    MseⅠ-CCTL87              EcoRⅠ-CA    MseⅠ-CTTL88              EcoRⅠ-AG    MseⅠ-CTAc86              EcoRⅠ-AG    MseⅠ-CCT
用上述的AFLP标记通过对重组子进行分类构建该区域的详细遗传图谱。从1144株F2nim1植物中总共可得到337株重组植物。首先用北侧的AFLP标记L81.2和ATHGENEA以及南侧的标记L88和nga1 11筛选这些重组子48株植物为同源的nim1/nim1并且在ATHGENEA和L81.2处为杂合的，并且有21株植物为同源的nim1/nim1并且在nga11 1和L88处为杂合的。以NIM区域的9个AFLP标记，包括来自重组近交系作图种群的4个AFLP标记，(W83.1,L84,L85和L87)和5个来自YAC克隆分析的AFLP标记(W83.3/W84.1,W84.2,W85.1,W86.1和L86，见下面)，进一步分析这些重组子植物。
根据此分析的NIM1的遗传图谱描述于图4中。正如所见到的，在标记W84.2和NIM1之间发现27个重组子并且在W85.1和NIM1之间发现14个重组子。标记L85与NIM1紧密连锁，但该标记不能够被定位于YAC、BAC或P1克隆(见下面)并且因此，不可用于MM1基因的鉴定。5．NIM1区域的物理作图ⅰ．用与NIM1紧密连锁的AFLP标记分离YAC克隆
为了NIM区域的YAC克隆，筛选CIC文库，拟南芥菜psis生态型Columbia YAC文库(Bouchez等，1995，第6届国际拟南芥菜psis研究大会，Ma dison,WI)。该文库大约2.5倍核基因组等分并且具有平均大小450kb的插入子。用2个AFLP标记筛选YAC文库：W83.1和C86.W83.1为最紧密连锁重组的近交系来源的NIM1北端AFLP标记，并且C86为Col特异性的重组的近交系来源的AFLP标记(不存在于Ler和Ws中)。C86定位于重组近交系种群图谱NIM1基因的南端。已用此Col AFLP标记代替紧密连锁的Ler AFLP标记(图4)，因为后者的AFLP标记仅仅检测生态型Landsberg erecta并且因此不能够用于筛选Columbia YAC文库。
用2个步骤筛选YAC文库.首先，合并12个96孔微滴定板上每板中的YAC克隆细胞(平板合并液)并且按Ross等所述(1991，核酸研究.19,6053)用于DNA分离。用2种AFLP标记筛选该合并产物。随后，用AFLP标记筛选每个阳性平板合并液中每行(8个克隆的合并液)和每列(12个克隆的合并液)的DNA样品。用这种方法，可鉴定出单个的阳性YAC克隆。此筛选共得到4个YAC克隆：用North AFLP标记W83.1分离YAC 12F04和YAC 12H07，并且用South AFLP标记C86分离YAC 10G07和YAC 7E03(为了YAC克隆的命名，使用了CIC计数)。通过AFLP对YAC“加上指纹”，得到YAC特异性的AFLP片段。比较YAC的指纹并且用于估计不同YAC之间的重叠(也见表5和表6)。根据AFLP指纹，克隆7E03基本上被克隆10G07所覆盖(也见表5)并且克隆12H07同样基本上被克隆12F04所覆盖(也见表6)。ⅱ．AFLP从YAC克隆中的产生
由于上述的AFLP标记与NIM1基因遗传上相对较远(见图3)，为了找到与NIM基因较近的标记，开发出其它的AFLP标记。
用下面的DNA样品筛选其它的来源于YAC的AFLP标记：分离YAC克隆的DNA(按上述鉴定出4个YAC)，没有YAC的酵母菌株DNA和3个拟南芥菜psis生态型Col,Ler和Ws的DNA。用这种方法，可以测试YAC克隆特异性片段(不存在于酵母菌株中但存在于Col中)在Ler和Ws处的多态性(重组植物的母本在下面的实施例1.5中鉴定出)。因此，所用鉴定出的多态片段将会是其它的AFLP标记。在第1个AFLP筛选中使用了酶联合(EC)EcoRⅠ/MseⅠ。在此筛选中，分析了2个YAC克隆，10G7和7E03(以AFLP标记C86检测到，见下面)，没有YAC的酵母菌株以及3个拟南芥菜生态型Col,Ler和Ws。所用的具有选择性延伸的引物联合可分成3组并且描述于表4中。筛选出总共256个引物组合(64+96+96)。
在下表4中显示了对2个YAC克隆，10G7和7E03，没有YAC的酵母菌株以及3个拟南芥菜生态型Col,Ler和Ws进行AFLP筛选所用引物的序列。使用了3组引物联合。引物中的“N”表示该部分是可变的(A,C,G或T),“S”表示C或G, “W’表示A或T，并且“Y”表示C或T。表4EcoRⅠ-引物：5’-GACTGCGTACCAATTCGW-3’5’-GACTGCGTACCAATTCTS-3’MseⅠ-引物：5’-GATGAGTCCTGAGTAAAAS-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAAASA-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAAATN-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAACAN-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAACTN-3’EcoRⅠ-引物：5’-GACTGCGTACCAATTCAN-3’5’-GACTGCGTACCAATTCCW-3’5’-GACTGCGTACCAATTCTW-3’MseⅠ-引物：5’-GATGAGTCCTGAGTAAAAS-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAAASA-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAAGAY-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAAGTW-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAATCG-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAATCT-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAATGW-3’EcoRⅠ-引物：5’-GACTGCGTACCAATTCGW-3’5’-GACTGCGTACCAATTCTN-3’MseⅠ-引物：5’-GATGAGTCCTGAGTAAGAW-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAAGCW-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAAGTW-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAATAN-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAATCW-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAATGW-3’5’-GATGAGTCCTGAGTAATTS-3’
总共产生了83个Col-特异性的片段，2个YAC克隆拥有其中的62个。3个片段在Ws和Ler之间为AFLP标记多态性的，其中的2个为Ws AFLP标记(Col片段也存在于Ws中但不存在于Ler中)并且1个为Ler AFLP标记(Col片段也存在于Ler中但不存在于Ws中)。结果列于下表5中.
表5显示了许多共有的和独特的在YAC 10G07和7E03中检测到的AFLP片段以及在Ws和Ler基因型中这些片段中的信息AFLP片段。表5YAC克隆中的AFLP片段                   AFLP        标记
           10G7         7E03       Ws         Ler共有的          62           62         2         1独特的          21           0          0         0
因此，该AFLP分析得到了3个新的AFLP标记(见图4和下文)。通过以这些AFLP标记对重组子的分析测定它们彼此之间及相对于重组近交系来源的AFLP标记的位置。
分析所有4个鉴定出的YAC克隆(见下面)并且用酶组合PstⅠ/MseⅠ对AFLP标记进行第2次筛选。所用的引物为：
PstⅠ-引物：
5’-GACTGCGTACATGCAGAN-3’
5’-GACTGCGTACATGCAGCW-3’
5’-GACTGCGTACATGCAGGW-3’
5’-GACTGCGTACATGCAGTN-3’
MseⅠ-引物：
5’-GATGAGTCCTGAGTAAAN-3’
5’-GATGAGTCCTGAGTAACW-3’
5’-GATGAGTCCTGAGTAAGW-3’
5’-GATGAGTCCTGAGTAATN-3’
引物中的“N”表示该部分是可变的(A,C,G或T)并且引物中的“W”表示此部分为A或T。在所有4个分离的YAC克隆，12F04,12H07,10G07和7E03；没有YAC的酵母菌株；和3个拟南芥菜生态型Col,Ler和Ws中共筛选出144(12×12)个引物组合。总共产生219个AFLP片段，其中的144个存在于YAC克隆12F04和12H7中(其中的72个为克隆12F04所独有的并且72个为2个YAC所共有的)并且其中的75个存在于YAC克隆10G07和7E03中(其中的33个为克隆10G07所独有的并且42个为2个YAC所共有的)。来自第1套YAC克隆的3个片段为多态性的(Ws AFLP标记)。结果列于下表6中。
表6列出了许多共有的和独特的在YAC中检测到的AFLP片段以及在Ws和Ler基因型中这些片段中的信息AFLP片段。表6YAC克隆中的AFLP片段数目                              AFLP      标记
       12F04      12H07      10G07       7E03      Ws      Ler共有的      72         72         0           0         1      0独特的      72         0          0           0         2      0共有的      0          0         42           42        0      0独特的      0          0         33           0         0      0
结果表明YAC克隆12H07是较大的YAC克隆12F04的一部分，并且YAC克隆7E03是较大的YAC克隆10G07的一部分。这些数据显示较大的YAC克隆12F04和10G07不重叠。这些数据允许将NIM1基因定位于这些YAC克隆中的任一克隆上。整个筛选，包括在NIM区域中产生302个AFLP片段的400个引物组合产生5个有用的AFLP标记，其中的4个为Ws-特异性的并且1个为Ler-特异性的。已通过对重组植物的分析将这5个额外的AFLP标记定位(见图4和下文)并且命名为W84.1(a.k.a.W83.3),W84.2,W85.1,W86.1和L86。
表7列出了用于获得这些AFLP标记的引物序列。这5个额外的AFLP标记将L81.1到L88区域中的AFLP总数升至12(见图4和下文)。
表7显示了来自YAC克隆AFLP标记的引物组合。
“EcoRⅠ-”指序列5’-GACTGCGTACCAATTC-3’,
“MseⅠ-”指序列5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’并且
“PstⅠ-”指序列5’-GACTGCGTACATGCCAG-3’。表7AFLP标记具有选择性延伸的引物组合W84.1    PstⅠ-AT    MseⅠ-TTW84.2    PstⅠ-AA    MseⅠ-TTW85.1    EcoRⅠ-CT   MseⅠ-GTAW86.1    EcoRⅠ-GT   MseⅠ-CTTL86      EcoRⅠ-GT   MseⅠ-CTT
用此信息构建该区域的物理图谱，如图5所示，具有与YAC克隆遗传图谱相近的位置。该图谱显示了含有标记W83.1与W85.1之间NIM1位点的区域部分地由3个YAC克隆：12F04和10G07/7E03所覆盖。ⅲ．含有NIM1基因的P1/BAC重叠群的构建
在前面的部分中描述了如何分离连接到NIM1区域上的AFLP标记和如何鉴定相应于这些标记的YAC以及定位。定位N1M1基因至染色体片段上时或的结果未能对含有NIM1基因的特异性DNA片段进行定义：该侧翼AFLP标记定位于不重叠的不同YAC上。因此，测定NIM1基因的准确物理位置是不可能的；其可位于2个YAC中的任何一个当中或位于2个YAV之间的间隙中。选择别的方法从而将2个侧翼标记之间的物理间隙靠近：使用P1和BAC文库从而将2个侧翼AFLP标记之间的间隙联系起来。
用于间隙靠近的文库为Liu等所述的拟南芥菜psis生态型Columbia P1文库(植物杂志7,351-358,1995)和Choi等所述的生态型Columbia BAC文库(http/genome-www.stanford.edu/拟南芥菜psis/ww/Vol2/choi.html)。P1文库由大约10,000个具有80kb平均插入子大小的克隆所组成并且BAC文库由大约4000个具有100kb平均插入子大小的克隆所组成。在理论上，这些文库代表大约10倍核基因组的等分(认为单倍体拟南芥菜psis基因组大小为120Mb)。ⅳ．相应于侧翼标记的P1克隆的鉴定
用与前述筛选YAC文库类似的策略，以侧翼标记Ws84.2和Ws85.1筛选P1克隆库。筛选具有标记片段的P1克隆并且分离“质粒”DNA。用ECsEcoRⅠ/MseⅠ和HindⅢ/MseⅠ以及没有选择性核苷酸的引物对各种P1克隆的DNA指纹化(fingerprinted)。通过比较AFLP指纹构建物理图谱，即具有这些克隆大小和重叠的图谱。独特的AFLP片段的数目和不同克隆间共有的AFLP片段的数目表示重叠的含量。该图谱显示于图6中。AFLP指纹显示已构建出2套不重叠的含有标记Ws84.2的P1-重叠群，每个含有2个侧翼标记：P1-1和P1-2中的一个；含有标记Ws85.1的P1-重叠群，每个含有2个侧翼标记：P1-3和P1-4中的一个。因此，侧翼之间的间隙没有被靠近(图6)。
通过以许多上述YAC-特异性的PC对YAC和P1克隆的AFLP指纹化测定P1重叠群相对于YAC重叠群的位置。P1克隆P1-1和P1-2似乎与YAC克隆CIC12F04完全重叠，但仅仅与YAC CIC10H07部分重叠。因此，后者的P1克隆可定位于YAC重叠群CIC12H07/12F04中(图6)。P1克隆P1-3和P1-4与2个YAC CIC7E03和CIC10G07完全重叠并且似乎AFLP标记W86.1，与W85.1一样，定位于此P1重叠群中(图6)。
其次，用标记L85鉴定相应的P1和BAC克隆。L85为生态型-Landsberg-特异性的标记并且因此，使用放射性标记的L85 DNA至P1和BAC的菌落杂交。没有鉴定出一个与L85杂交的P1或BAC克隆。这支持了我们早期的发现，即在L85序列拟南芥菜psis生态型Columbia基因组中缺乏L85序列并且，因此，鉴定出为什么没有相应克隆的最为可能的原因。ⅴ．延伸NIM1-侧翼P1重叠群
使用各种方法从侧翼P1重叠群开始延伸：
通过对文库的AFLP筛选，用对于YAC CIC12F04南端特异性的YAC AFLP片段(对CIC12F04为特异性的，不存在于CIC 12H07中)鉴定P克隆。
1．用来自YAC 10G07并且与P1-4重叠的YAC AFLP片段通过P1文库的AFLP筛选鉴定P1。
2．来自P1克隆P1-6的EcoRⅠ片段(从步骤1基于AFLP对P1文库的筛选而得到)作为BAC文库滤膜上的杂交探针。
各种P1和BAC克隆从该筛选中得到并且所有均以EcsEcoRⅠ/MseⅠ用没有选择性核苷酸的引物进行AFLP-指纹化。按上述构建新的图谱并且描述于图7中。表8显示各种AFLP PC，其具有定位至侧翼YAC的AFLP片段并且用于筛选相应P1-克隆的P1文库。
表8代表了用于筛选P1文库的各种AFLP PC。表的上半部显示了对于YAC北端特异性的PC并且下半部显示了对于YAC南端特异性的PC。同时也显示了其中的AFLP片段被检测出的YAC和P1克隆。表8AFLP Pcs              CIC YACs           P1-克隆          备注PstⅠ-AA MseⅠ-TT     12F04和12H07       P1-1,P1-2       标记Ws84.2PstⅠ-AT MseⅠ-GT     12F04-特异性的     P1-1,P1-2PstⅠ-CA MseⅠ-AA     12F04-特异性的     P1-6PstⅠ-AC MseⅠ-TG     12F04-特异性的     P1-7PstⅠ-AG MseⅠ-TG     12F04-特异性的     P1-7PstⅠ-AT MseⅠ-GT     12F04-特异性的     P1-7EcoRⅠ-CT MseⅠ-GTA   10G07H和7E03       P1-3,P1-4       标记Ws85.1EcoRⅠ-GT MseⅠ-CTT   10G07H和7E03       P1-4            标记Ws86.1EcoRⅠ-AA MseⅠ-GT    10G07H和7E03       P1-4,P1-9EcoRⅠ-AT MseⅠ-GA    10G07H和7E03       P1-4,P1-9EcoRⅠ-GG MseⅠ-CT    10G07H和7E03       P1-4,P1-9
得到一个大约250kb的P1/BAC重叠群，其覆盖YAC CIC12F04的南端(没有从该YAC延伸)并且含有标记W84.2。得到一个含有标记W85.1和W86.1的大约150 kb的P1重叠群；此重叠群完全含在YACCIC7E03中。
构建覆盖NIM1基因AFLP标记的P1/BAC重叠群，以来自北部P1/BAC重叠群(WL84.4和WL84.5,见下面和表11)南端的标记对重组子的分析显示前面的“步移”方法在构建含有NIM1基因的重叠群中是不成功的(见下一部分)。因此，为了“步移”过NIM1基因，从而能够定义和分离含有NIM1基因DNA片段，将现存的北部P1/BAC重叠群向南延伸。进行基于杂交的方法，其中的位于北部P1/BAC重叠群南端的P1或BAC克隆用于鉴定靠近NIM1的克隆(结合于南端)。用AFLP指纹以上述的ECs EcoRⅠ/MseⅠ和HindⅢ/MseⅠ对从步移中得到的心得克隆相对于现存的重叠群进行定位。总共5个随后的步移步骤似乎对于“横跨过”(cross)NIM1基因是必须的。图9显示了在各种步移步骤中获得的克隆。
表9为各种步移步骤的综览，显示了用于筛选P1和BAC文库的杂交探针和筛选出的与这些探针杂交并且向南部方向延伸的克隆。表9
      探针         南部方向延伸的新克隆步骤1:    P1-7         BAC-02步骤2:    BAC-02       P1-16,BAC-03步骤3:    BAC-03       P1-17,P1-18步骤4:    P1-18        P1-21,P1-20,BAC-04步骤5:    BAC-04       P1-22,P1-23,P1-24,BAC-06,BAC-05
从该步移方法中得到的各种克隆的物理图谱描述于图8中。从起始的步移点标记W84.2开始覆盖了总共约600kb的距离。位于图8中重叠群南端似乎含有NIM1基因(见下一部分)。重叠群从YAC CIC12F04向南延伸超过300kb并且似乎不与YAC CIC10G07和CIC7E03重叠，表明NIM1基因位于侧翼YAC重叠群之间的间隙内并且此间隙至少300kb。ⅵ．NIM1区域整合遗传和物理图谱的构建
在前面的部分中描述了如何分离连接到NIM1区域上的AFLP标记，如何鉴定相应于这些标记的YAC以及如何构建从最靠近的北端侧翼AFLP标记W84.2向南延伸约550kb的P1/BAC重叠群。该部分描述从P1/BAC重叠群中新的AFLP标记的产生、在该重叠群上对这些标记进行物理作图以及以可得到的重组子对这些标记进行遗传作图。1．从P1/BAC重叠群中新的AFLP标记的产生
按前面所述，用Ecs EcoRⅠ/MseⅠ和HindⅢ/MseⅠ通过AFLP指纹对重叠群延伸的P1和BAC克隆进行特征分析。这便相当准确地定义了各种P1和BAC克隆之间重叠的延伸，并且除此之外，还产生了许多对这些克隆特异性的AFLP片段。没有选择性核苷酸的AFLP引物用于对纯化的P1和BAC克隆质粒DNA进行指纹化。然而，选择性核苷酸将是必须的以能够用这些P1或BAC-特异性的AFLP片段用于在拟南芥菜sis中的检测。通过测定扩增限制性片段的末端序列，可以设计具有适当选择性碱基的AFLP引物以在拟南芥菜中扩增P1或BAC-特异性的AFLP片段。所有的AFLP片段来源于生态型Columbia(Co1)并且，因此也应该测定Columbia AFLP标记在来源于生态型Landsbergerecta(Ler)和生态型Wassilewskija(Ws-nim)nim1突变体杂交的NIM1重组子中是否具有指示性。原则上，有4种AFLP片段，其中的2种用于标记，如下表10中所示：
表10为发现的不同类型AFLP标记的总结。(+)或(-)表示AFLP片段的存在与否。表10Col       Ler           Ws-nim          标记-类型+          +             +              非指示性+          +             -               Ler标记+          -             +               Ws标记+          -             -               非指示性
总的来说，P1和BAC克隆的指纹对每个单一的克隆产生30到40个EcoRⅠ/MseⅠAFLP片段和60到80个HindⅢ/MseⅠAFLP片段。通过标准的测序技术测定单个片段的末端序列。其次，于下面的DNA组中测试对于EcoRⅠ或HindⅢ引物以及/MseⅠ引物特异性的具有3个核苷酸选择性延伸的AFLP引物套：
1．从中得到AFLP标记的P1/BAC克隆
2a．酵母
2b．YAC克隆CIC12F04(仅仅对于来自P1-7的AFLP片段)2c．YAC克隆CIC10G07
3a．Col,P1和BAC文库来源
3b．Ler,nim重组子的母本1
3c．Ws-nim,nim重组子的母本2
选择6个克隆用于其EcoRⅠ/MseⅠ和HindⅢ/MseⅠAFLP片段的序列分析：BAC-01/P1-7,P1-17/P1-18,BAC-04/BAC-06。来自P1-7克隆的AFLP片段均在YAC CIC12F04中检测到，表明此克隆含有在YAC中。在YAC克隆CIC10G07中没有检测到一个P1/BAC-特异性的AFLP片段，表明此P1/BAC重叠群在2个侧翼YAC重叠群之间的间隙联系起来。选择的用于nim重组子分析的AFLP标记描述于表11中。
表11为从AFLP PC特异性的各种P1和BAC克隆中筛选出的AFLP标记的总结。“WL”标记为来源于相同的PC并且显示出2个AFLP标记，Ws和Ler标记的标记，在对NIM重组子分析时其似乎完全以互斥相连接。
表11来源           标记名                AFLP引物组合P1-7           WL84.4              EcoRⅠ-AGC MseⅠ-ACTP1-7           WL84.5              HindⅢ-CTC MseⅠ-TTCP1-17/P1-18    Ler84.6a            HindⅢ-CGT MseⅠ-ATTP1-17/P1-18    Ler84.6b            HindⅢ-ATT MseⅠ-CATP1-18          Ler84.6c            HindⅢ-TCT MseⅠ-TATP1-18          Ler84.7             EcoRⅠ-AAA MseⅠ-AGABAC-04/06      Ler84.8             EcoRⅠ-TTC MseⅠ-AGTBAC-06         Ler84.9a            EcoRⅠ-AAA MseⅠ-TGTBAC-06         Ler84.9b            EcoRⅠ-ATC MseⅠ-TCCBAC-06         Ler84.9c            EcoRⅠ-ATG MseⅠ-GTA2．对新AFLP标记的物理作图
通过检测其在各种P1和BAC克隆中存在而对上述的AFLP标记进行物理作图。结果列于图9-11中。3．对新AFLP标记的遗传作图
在选定的重组子组中分析所有的AFLP标记。获得的结果总结于表12a、12b和12c中。
表12aWL84.4&5北端的NIM重组子
Nr． 植物 PR-1on/off Ler84 Ws84．2 WL84．4&5 Ler84．6a Ler846b Ler84．6c Ler847 nim Ler85 Ler84．8 Ler84．9b Ler84．9a Ler84．9c  Ws85．1  Ws86．1 Ler86
N1 A-74nim  off (H) H W W W W W W W W W W
N2 A-113 H H W W W W W W W W W W
N3 B-023Rnim  off H H W W W W W W W W W W
N4 B-297notnim  on W W H (H) H H H H H H  H  H H H H H
N5 B-292nim  off H H W W W W W W W W W W
N6 D-269Rnim  off H H W W W W W W W W W W
N7  D-306  off H H W W W W W W W W W W
N8  E-086nim  off H H W W W W W W W W W W
N9  F-049Rnim  off H H W W W W W W W W W W
N10  G-002nim  off H H W W W (H) W W
N11  G-009Rnim  off (H) H W W W W W W W W W W
N12  G-064(nim) off H H W  W  W (W) W W  W  W W W W
N13 G-072nim off H H W W W W W W W W W W
N14  H-037nim off H H W W W W W W W W W W
N15  H-047Rnim off H H W W W W W W W W W W
N16  H-097(nim) off H H W W W (W) W W W W W W
W:Ws基因型；H：杂合的；()：非100％可靠或从邻近的分析得出；nim和Rnim:nim表型植物；notnim：测定不具有nim表型的植物；PR-1 on/off：涉及以INA诱导后由northern印迹分析测得的PR-1基因的表达(根据：检测到的PR-1 mRNA)。表12bLer84.9c南端的NIM重组子
Nr． 植物 PR-1on/off Ler84 Ws84．2 WL84．4&5 Ler84．6a Ler846b Ler84．6c Ler84．7 nim Ler85 Ler84．8 Ler84．9b Ler84．9a Ler84．9c Ws85．1 Ws86．1 Ler86
S6 A-116Rnim off W W W W W W W W  W  W W H H H
S7 B-111nim off W W W W W W W W  W  W W H H H
S8 B-165notnim interm H H H  H  H H H H H H  H  H H W W W
S9 B-182notnim interm H H H  H  H H H H H H  H  H H W W W
S10  B-190segWT  off W W W W W (W) W W  W  W W H H H
S11  B-243nim  off W W W W W W W W  W  W W H H H
S12  C-036nim  off W W W W W W W W  W  W W H H H
S13  C-088Rnim  off W W W W W W W W  W  W W H H H
S14  D-249nim  off W W W W W W W W  W  W W H H H
S15  E-050nim  off W W W  W  W W W W W W  W  W W H H H
S16  G-058nim W W W  W  W W W W W W  W  W W H H H
S17  C-017Rnim？ W W W W W W W  W  W W W H (H)
S18  H-083 W W W W W W  W  W W W H (H)
图注：见表12a．表12cWL84.4&5和Ler84.9之间的NIM重组子
Nr. 植物  PR-1on/off Ler84 Ws84．2 WL84．4&5 Ler84．6a Ler84．6b Ler84．6c Ler84．7 nim Ler85 Ler84．8 Ler84．9b Ler84．9a Ler84．9c  Ws85．1  Ws86．1 Ler86
N17  B-304nim H H H  W  W  W  W W W W  W  W W W W W
N18  C-111nim  off H H H  W  W W W W W W  W  W W W W W
N19  E-093nim  off H H H  W  W W W W W W  W  W W W W W
N20  E-110Rnim  off H H H  W  W W W W W W  W  W W W W W
N21  G-014nim  off H H H  W  W W W W W W  W  W W W W W
N22  A-019notnim  interm W W W  W  H H H H H H  H  H H -1 H H
N23  C-074Rnim  off H H H  H  H W W W W W  W  W W W W W
N24  D-169nim  off H H H  H  H W W W W W  W  W W W W W
N25  E-103nim  off H H H  H  H W W W W W  W  W W W W W
S1  C-105nim  off W W W  W  W W W W W H  H  H H H H H
S2  H-039nim W W W  W  W W W W W W  H  H H H H H
S3  B-052nim  off W W W  W  W W W W W W  W  H H H H H
S4  B-142nim  off W W W  W  W W W W W W  W  W H H H H
S5  B-110Rnim  off W W W  W  W W W W W W  W  W W H H H
图注：见表12a．
AFLP标记Ler84.8,Ler84.9 a,Ler84.9b和Ler84.9c似乎位于NIM1的南侧。发现了表型上为nim1(纯合的，基因型为Ws-nim1/Ws-nim1)并且对于这些AFLP标记为杂合的重组子(检测到Ler-特异性的AFLP标记，基因型为Ws-nim1/Ler)。AFLP标记Ler84.8似乎与NIM1最为靠近：仅仅一个重组子(C-105)被分析为杂合的Ws-nim1/Ler和纯合的WS-nim1/WS-nim1。AFLP标记Ler84.7和Ler84.6c似乎完全与NIM1共分离：所有的重组子具有一致的NIM1和AFLP标记基因型。NIM1的北端，标记Ler84.9b似乎与NIM1最为靠近：发现3个nim1表型重组子植物，C-074,D-169和E-103表12c在该标记处为杂合的。在从P1-18,BAC-04和BAC-06产生的粘粒重叠群的帮助下，将AFLP标记Ler84.6b和Ler84.8分别定位于P1-18和BAC-04，并且发现具有大约110kb的物理距离。这限定了nim1位于估计为110 kb长度的DNA片段上。根据此分析已经测定NIM1基因位于克隆BAC-04或P1-18中。克隆BAC-04和P1-18已经以ATCC保藏并且分别得到保藏号ATCC 97534和ATCC 97606。ⅶ．NIM1基因遗传和物理精细作图
前面的部分描述了如何对含有NIM基因的DNA片段通过P1/BAC重叠群侧翼AFLP标记(Ler84.6b和Ler84.8)的物理作图进行描述。侧翼标记似乎位于2个重叠的克隆，P1-18和BAC-04上。此部分描述如产生其它BAC-04-特异性的和P1-18-特异性的AFLP标记以增加含有NIM1基因的区域中遗传和物理图谱的分辨率。ⅷ．从粘粒组合中其它AFLP标记的产生
选择4个EC以产生用于NIM1精细作图的其它AFLP标记：PstⅠ/MseⅠ,XbaⅠ/MseⅠ,BstYⅠ/MseⅠ和TaqⅠ/MseⅠ。PstⅠ/MseⅠ和XbaⅠ/MseⅠAFLP标记在克隆P1-18和BAC-04上产生并且测定对于在拟南芥菜sis检测中必须的选择性序列。同样地，测定对于BstYⅠ/MseⅠ和TaqⅠ/MseⅠ的AFLP片段和选择性序列；然而，在该情况中用粘粒DNA完成方法：A11,C7,E1和E8用于BstYⅠ/MseⅠ(完全的NIM1区域)和D7,E8和E6用于TaqⅠ/MseⅠ(NIM1区域的南端)。筛选出的用于进一步遗传和物理作图的信息AFLP标记显示于表13中。用于此工作中的其它衔接子显示于表14中。
表13显示了用于NIM1遗传和物理精细作图的AFLP标记。“BstYI(T)”表示该限制位点和相应的引物为或者为AGATCT或者为GGATCT。表13标记                   EC/PCLer84.Y1    BstYⅠ(T)-GCT    MseⅠ-ACCWs84.Y2     BstYⅠ(T)-TCT    MseⅠ-GCALer84.Y3    BstYⅠ(T)-AAG    MseⅠ-TATLer84.Y4    BstYⅠ(T)-GTT    MseⅠ-AGAwS84.T1     TaqⅠ-TAC        MseⅠ-GGALer84.T2    TaqⅠ-TTG        MseⅠ-GGA表14显示了用于鉴定新的AFLP标记的相同的其它衔接子表14BstYⅠ:5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
   3’-CATCTGACGCATGGCTAG-5’TaqⅠ: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
   3’-CATCTGACGCATGGGC-5’ⅸ．将新的AFLP标记理定位于粘粒重叠群
通过测定其在各种粘粒克隆中存在将上述的标记理定位于粘粒组合中(图11)。1．新的AFLP标记的遗传作图
通过对最为靠近的北端和南端重组子的AFLP分析对新的AFLP标记进行遗传作图。已定位了最为靠近的北端(重组子D169)和南端(重组子C105)重组位点(见表15)。AFLP分析表明重组子D169与标记L84.Y1的南端重组，而标记W84.Y2的北端重组。在重组子C105中的重组位点位于2个标记L84.T2和L84.8之间。用可得到的重组套，从而可进一步描述含有NIM1的染色体内部；侧翼重组位点之间的距离似乎为60-90kb(图12)。表15WL84.4&5和Ler84.9c之间的NIM重组子
Nr 植物  PR-1on/off Ler84 Ws84.2  WL844&5 Ler84．6a Ler84．6b Ler84．Y1 Ws84．Y2 Ler84.7 Ler84．6c Ler84Y3 Ws84．Y 4 Ler84T1 Ler84．T2 Ler85 Nim Ler84.8 Ler84．9b Ler84．9a Ler84．9c Ws85．1 Ws86.1 Ler86
N17  B-304nim H H  H  W  W W W W W W W W W  W  W W W W W W W W
N18  C-111nim  off H H  H  W  W W W W W W W W W  W  W W W W W W W W
N19  E-093nim  off H H  H  W  W W W W W W W W W  W  W W W W W W W W
N20  E-110Rnim  off H H  H  W  W W W W W W W W W  W  W W W W W W W W
N21  G-014nim  off H H  H  W  W W W W W W W W W W  W W W W W W W W
N22  A-109notnim interm W W  W  W  H H H H H H H H H H  H H H H H -1 H H
N23  C-074Rnim  off H H  H  H  H W W W W W W W W  W  W W W W W W W W
N24  D-169nim  off H H  H  H  H W W W W W W W W  W  W W W W W W W W
N25  E-103nim  off H H  H  H  H H W W W W W W W  W  W W W W W W W W
S1  C-105nim  0ff W W  W  W  W W W W W W W W W  W  W H H H H H H H
S2  H-039nim W W W  W  W W W W W W W W W  H W W H H H H H H
S3  B-052nim  off W W  W  W  W W W W W W W W W  W W W W H H H H H
S4  B-142nim  off W W  W  W  W W W W W W W W W  W W W W W H H H H
S5  B-110Rnim  off W W W  W  W W W W W W W W W  W  W W W W W H H H
表15．AFLP标记WL84.4&5和Ler84.9c之间的重组。标记不一定按它们的物理位置显示。参见表12的进一步解释。2．粘粒重叠群的构建
为了与nim1植物表型互补，需要以野生型NIM1基因转化nim1植物。这可通过含有该基因的粘粒转化这些植物而完成。为了该目的，构建NIM1区域的粘粒重叠群。由于用土壤杆菌转化拟南芥菜，故所用的粘粒载体为双重载体。
从BAC-04,BAC-06和P1-18中分离DNA并且用于用限制酶Sau3AI进行部分消化。用蔗糖梯度分离，合并20-25kb的片段并且以dATP和dGTP填补。以Xhol切割双重载体且以dATP和dGTP填补。然后将此片段连接至载体中。包装连接混合物并且转导至E.coli.中。以BAC-04,BAC-06和P1-18克隆筛选该粘粒文库并且分离阳性克隆。然后将此粘粒指纹化并且定位于横跨NIM1区域重叠克隆的重叠群中。测定这些粘粒中插入子的大小并且进行有限的限制性作图。结果显示于图10中。实施例2含有NIM1基因克隆的鉴定1．通过稳定的转化补充
将从横跨NIM1区域克隆产生的粘粒(上述)通过3亲交配(triparental mating)转移制至土壤杆菌中。然后用这些粘粒通过真空渗入(Mindrions等.，1994，细胞78,1089-1099)或通过标准的根部转化转化nim1拟南芥菜。收获这些植物的种子并且使其在具有筛选剂卡拉霉素(或别的适当的抗生素)的琼脂板上发芽。仅仅以粘粒DNA转化的小板可以对筛选剂解毒并且存活。将在筛选中存活下来的幼苗转移至土壤中并且测试其nim表型或测定其后代的nim表型。不再具有nim表型的转化植物鉴定出含有有功能NIM1基因的粘粒。2．在转基因表达系统中补充
在2种转基因系统中测试DNA克隆补充nim1突变的能力。
在第1种系统中，含有PR1-荧光素(PR1-lux)转基因的nim1拟南芥菜植物用作轰击的受体材料。通过以PR1-lux构建体真空渗入转化Columbia生态型，然后按上述通过对收获种子的卡拉霉素筛选产生这些植物。以INA诱导后表达荧光素酶活性的转化植物进行近亲繁殖并且产生纯合的植物。将这些植物与nim1植物杂交。在短暂分析中，将来自此杂交的纯合nim1和PR1-lux后代植物用于鉴定可补充nim1表型的DNA克隆。此时，如上面的实施例1.1中所述，首先以INA处理这些植物。2天后收获这些植物，进行表明灭菌并且铺盘于GM琼脂培养基上。以来自NIM1区域的能力克隆,P1或BAC克隆(或亚克隆)轰击叶组织并且1天后，测定叶子的荧光素活性。诱导荧光素活性的克隆含有NIM1基因。
在第2中系统中，以INA处理nim1植物(如上面实施例1.1所述)并且2天后以来自NIM1位点区域的克隆DNA(粘粒,P1,BAC和/或YAC克隆或亚克隆)和受体质粒轰击。受体质粒含有由拟南芥菜启动子(PR1-lux)所驱动的荧光素酶。在nim1植物中，INA没有激活PR1启动子(如上面实施例1.2所述)并且因此没有诱导受体质粒的荧光素活性。然而，当共转化的DNA克隆含有补充NIM1基因时,INA没有诱导PR1启动子，如由荧光素活性诱导所证实的。轰击1天后，测定整个植物的荧光素活性。诱导显著高于背景水平荧光素活性的DNA克隆(粘粒，P1或BAC克隆或亚克隆)含有NIM1基因。3．在nim1表型系的转录的改变
由于nim1表型植物在NIM1基因中具有突变，所以可以想象在有些品系中该基因以下面的方式变化，即没有mRNA转录或产生异常的mRNA(大小)。为了对此进行验证，在nim1品系中进行RNA印迹分析。
(在水或INA或BTH处理后)从这些品系的Ws和Ler植物中分离RNA用于制备northern印迹。将这些印迹以从NIM1位点DNA重叠群克隆分离的DNA片段杂交。鉴定具有异常RNA表达的nim1品系的DNA片段(在大小或浓度上异常)，同样鉴定NIM1基因(部分)。测序该DNA片段和周围的DNA并且用于分离cDNA(通过文库筛选或反转录-PCR)，也对或者进行测序。从其中分离出该片段的克隆或此分离的cDNA用于显示稳定和短暂表达系统中nim1表型的互补。实施例3NIM1基因DNA序列的测定1．基因组测序.
用本领域已知的方法对含有NIM1基因的基因组克隆进行测序。这些包括来自NIM1区域的BAC-04,P1-18和粘粒。例如，以限制酶消化粘粒并且将来自插入子的片段克隆入通用的载体，如pUC18或Bluescript。将较大的P1和BAC克隆随机剪断并且将片段克隆入通用的载体。通过常规的方法(如.通过“引物步移”或插入子缺失的产生)对这些载体中片段进行测序。将得到的序列装配于连续的序列中。
该补充克隆的插入子序列中含有NIM1基因。根据此DNA序列，如TATA框的基序，存在于该序列中的开放阅读框，密码子使用，粘粒补充数据，AFLP标记的相对位置以及收集到的其它相关数据推导出NIM1基因近似的起点和终点(见下面实施例4)。2．cDNA测序
含有NIM1基因的粘粒或更大的克隆(上面实施例2中所述)用于分离cDNA。这可通过在筛选野生型拟南芥菜植物的cDNA文库中使用该克隆(或DNA片段)作为探针而完成。按照在对粘粒测序中所述对分离的cDNA测序并且用于补充实验。到此，全长的cDNA已经克隆适当植物表达载体的组成性启动子后面。这些构建体用于上述的短暂分析。作为选择，将cDNA克隆入双重的表达载体中，从而按上面实施例2中所述使其用于在植物组织和土壤杆菌介导的植物转化中的表达。测序含有NIM1基因的cDNA(通过补充，以紧密连锁的AFLP标记分离，以粘粒片段分离或通过其它的推导加以测定)。
分离和测序来自Ws-O和nim1植物的基因。这些基因用分离的NIM1基因片段作为探针从cDNA文库的粘粒中获得。作为选择，用NIM1-基因-特异性的引物以及基因组DNA或cDNA作为模板，通过PCR分离这些基因或cDNA。同样，以同样的方式分离和测序来自其它nim1品系的nim1等位基因。实施例4NIM1基因及推导的蛋白序列的描述
按照上面实施例3中所述测定该NIM1基因或cDNA的DNA序列。用DNA分析程序，如可以在遗传学计算机小组(GCG)文件包、测序仪或Staden文件包，或任何类似的DNA分析程序包中找到的程序分析此序列。
具体地，根据开放阅读框分析、终止和潜在起始密码子的存在、潜在启动子基序(如TATA框的存在)、多聚腺苷酸化信号等的存在测定该基因的起点和终点。同样，从开放阅读框推导预期的氨基酸。DNA和蛋白序列均用于搜寻数据库中具有同源性的序列，如转录因子、酶或该基因或蛋白的基序。实施例5NIM1类似物的分离
拟南芥菜的NIM1基因可用作低严谨条件下杂交筛选基因组或cDNA文库的探针从而从其它植物种类中分离NIM1类似物。作为选择，这可用根据拟南芥菜的NIM1基因序列而设计的引物以及用基因组或cDNA作为模板，通过PCR扩增完成。可以从玉米、小麦、水稻、大麦、油菜种子、甜菜、土豆、番茄、大豆、黄瓜、葡萄、烟草和其它感兴趣的作物中分离并测序。手中有一套NIM1基因类似物的序列，可从该基因的保守部分设计新的引物从而通过PCR扩增从亲缘关系更远的植物种类中分离NIM1类似物。实施例6以基因组片段对nim1-1基因的补充1．粘粒重叠群的构建
用从BAC04、BAC和P1-18 CsCl-纯化的DNA构建NIM1区域的粘粒重叠群。将这3个克隆DNA以等摩尔量混合并且以限制酶Sau3A部分消化。用蔗糖梯度分离、合并20-25kb的片段并且以dATP和dGTP填补。质粒pCLD04541用作T-DNA粘粒载体。此质粒含有广泛宿主范围的基于-pRK290的复制子，用于细菌筛选的四环素抗性基因以及用于植物筛选的nptⅡ基因。以XhoⅠ切割此载体并且以dCTP和dTTP填补。然后将制备的片段连接到载体中。包装连接反应混合物并且转导入E.coli菌株XL1-blue MR中(Stratagene)。通过以BAC04、BAC和P1-18克隆的杂交筛选得到的转化子并且分离阳性的克隆。从这些克隆中分离粘粒DNA并且用ECs EcoRⅠ/MseⅠ和HindⅢ/MseⅠ制备模板DNA。分析得到的AFLP印迹图形以测定粘粒克隆的顺序。筛选出一套15个横跨nim区域的半重叠粘粒(图13)。也以EcoRⅠ、PstⅠ、BssHⅡ和SgrAⅠ限制性消化该粘粒DNA。这允许对粘粒插入子大小进行估计并且核实由AFLP指纹测定的各种粘粒之间的重叠。2．含有NIM基因克隆的鉴定
将从横跨NIM1区域克隆产生的粘粒经与帮助菌株HB101(pRK2013)的三亲交配中的接合转移而转移至根癌土壤杆菌AGL-1中。然后用真空渗入(Mindrinos等，1994，细胞78,1089-1099)用这些粘粒转化卡拉霉素敏感的nim1-1拟南芥菜psis品系。收获这些被渗入后植物的种子并且使其在具有50mg/ml筛选剂卡拉霉素的GM琼脂板上发芽。仅仅以粘粒DNA转化的小板可以对筛选剂解毒并且存活。大约种植后2周将在筛选中存活下来的幼苗转移至土壤中并且按上述测试其nim1表型。不再具有nim1表型的转化植物鉴定出含有有功能NIM1基因的粘粒。3．转化子nim1表型的测定
转移约1周后将转移至土壤的植物种植于人工气候室中。用chromister将300μm的INA以细雾状施用以完全覆盖植物。2天后，收获叶子用于RNA提取和PR-1表达分析。然后以寄生霜霉(EmWa)喷洒植物并且在高湿度条件下种植于培养室中，其中具有19℃白天/17℃夜晚温度并且具有8小时光线/16小时黑暗的循环。真菌感染8到10天后，评价和分析真菌生长的阳性或阴性。以相同方式处理Ws和nim1植物以用作每个实验的对照。
用LiCl/酚提取缓冲液(Verwoerd，等.NAR 17:2362)从收集的组织中提取总RNA。将RNA样品于福尔马林琼脂糖凝胶上电泳并且印迹至GeneScreen Plus(DuPont)上。以32P-标记的PR-1cDNA探针对印迹进行杂交。将得到的的印迹对胶片曝光以测定以INA处理后哪一个转化子能够诱导PR-1的表达。结果总结于表16中。
表16显示粘粒克隆对nim1表型的互补.
表16
克隆名称 转化子号 具有INA诱导PR -1的植物数/测试的总植物数(％)
A8 3 0/3(0％)
A11 8 4/18(22％)
C2 10 1/10(10％)
C7 33 1/32(3％)
D2 81 4/49(8％)
D5 6 5/6(83)
E1 10 10/10(100％)
D7 129 36/36(100％)
E8 9 0/9(0％)
F12 6 0/6(0％)
E6 1 0/1(0％)
E7 34 0/4(0％)
Ws-对照(野生型) NA 28/28(100％)
niml-1表型对照 NA 0/34(0％)
NA-没有施用实施例79.9kbNIM1基因区域的测序
BAC04 DNA(25ug,KeyGene获得)为用于序列分析的DNA来源。已显示此BAC为完全包括补充nim1突变体区域的克隆。用冷泉港方法随机剪断DNA。简言之，将BAC DNA于粉碎器(nebulizer)中剪断至大约2kb的平均分子量。用dNTPs,T4 DNA聚合酶和Klenow片段(宝灵曼)以2步方法修复剪断片段的末端。将末端修复的DNA于1％的低熔点琼脂糖凝胶上电泳并且从其中切下在1.3kb和2.0kb之间的区域。通过冻融方法(freeze-thaw)从凝胶中分离DNA。然后与EcoRⅤ-消化的pBRKanF4混合并于4℃连接过夜。pBRKanF4为从Vanderbilt大学的Kolavi Bhat获得的pBRKanF1的衍生物(Bhat,K.S.，基因134(1),83-87(1993))。以该连接混合物转化大肠杆菌DH5a菌株并且将转化混合物铺板于含有卡拉霉素和X-gal的平板上。筛选出1600个白色或蓝色的KanR菌落用于质粒分离。挑取单菌落于含有1.5ml TB+Kan(50ug/ml)的96-孔深孔板(Polyfiltronics,#U508)中。盖好平板并且置于37℃振荡的台式摇床上。用Wizard Plus9600 Miniprep系统(Promega,#A7000)根据制造商说明分离质粒DNA。
用Dye Terminator化学(应用生物系统PRISM Dye TerminatorCycle测序即用试剂盒，P/N 402078)和根据质粒2条链而收集的引物对质粒进行测序。在ABI DNA测序仪上收集数据。这些反应中大约75％产生有用的序列信息。编辑这些序列并且用Sequencher3.0(基因编码公司)，Staden gap4(Roger Staden,e-mail address rs@mre-1mb.cam.ac.uk)，和(Phil Green,e-mail address phg@u.washington.edu)将其组装成连续序列。最大的连续序列(大约76kb)覆盖了达平均深度7个独立的calls/base的补充区域。
通过互补分析鉴定出由粘粒E1和D7重叠所限定的含有nim1区域的大约9.9 kb的区域。用Oligo5.0引物分析软件(国力生物科学公司)设计位于载体插入子侧翼并且对粘粒骨架特异性的引物。用修改的醋酸铵方法(Traynor,P.L.,1990.生物技术9(6):676)从粘粒D7和E1中分离DNA。用上述的Dye Terminator化学对此DNA进行直接测序。得到的的序列允许测定补充区域的末端。
也构建BamHⅠ-EcoRⅤ片段的截短的副本，得到不含有“基因3”区域的构建体。由于在该DNA的Bam-Spe区域中HindⅢ位点的存在，所以下面的方法是必须的。以SpeⅠ完全消化BamHⅠ-EcoRⅤ构建体，然后分成2个独立的反应由于双酶切。其中的一等分以BamHⅠ消化，另一等分以HindⅢ酶切。从琼脂糖凝胶中分离(QiaQuick凝胶提取试剂盒)分离2816bp的BamHⅠ-SpeⅠ片段和1588bp的HindⅢ-SpeⅠ片段并且连接至BamHⅠ-HindⅢ消化的pSGCG01中。以连接混合物转化DH5a。用Wizard Magic MiniPreps(Promega)制备DNA后以HindⅢ消化筛选得到克隆中正确的插入子。将含有正确构建体的克隆电穿孔进入土壤杆菌菌株GV3101中由于拟南芥菜植物的转化。实施例8通过等位基因测序对NIM1基因的鉴定.表17．不可诱导免疫性突变体的遗传分离.
                                                     表型突变体       代数      雌性  雄性  野生型nim1nim1-1a       F1      野生型bnim1-1           24         0
           F2                               98         32nim1-2         F1      nim1-2  野生型           3          0nim1-3         F1      nim1-3  野生型           3          0nim1-4         F1      nim1-4  野生型           3          0nim1-5         F1      nim1-5  野生型           0          35nim1-6         F1      nim1-6  野生型           3          0nim1-2         F1      nim1-2  nim1-1           0          15nim1-3         F1      nim1-3  nim1-1           0          10nim1-4         F1      nim1-4  nim1-1           0          15nim1-5         F1      nim1-5  nim1-1           0          14
           F2                               9          85nim1-6         F1      nim1-6  nim1-10          12a数据来自Delaney等.(1995)PNAS 92,6602-6606.b野生型表示野生型Ws-0菌株.1．遗传分析
为了测定显示nim1表型各种突变体的显著性，将来自野生型植物的花粉转移至nim1-1,-2-3,-4,-5,-6的柱头上。如果突变是显性的，那么将在得到的F1植物中观察到nim1表型。如果突变是隐性的，那么得到的F1植物中将显示野生型表型。
在表17中列出的数据显示当nim1-1,-2,-3,-4,-5,-6与野生型杂交时，得到的F1显示野生型表型。因此，这些突变是隐性的。相反，nim1-5 X野生型F1后代所有均显示nim1表型，表明这是显性突变。INA处理后，在野生型植物中没有观察到寄生霜霉孢子形成，而F1植物支持生长和一些寄生霜霉孢子形成。然而，当nim1-5为纯合体时观察到这些F1植物中nim1表型较轻。
为了检测等位性，将来自卡拉霉素抗性的nim1-1突变体植物花粉转移至nim1-1,-2,-3,-4,-5,-6的柱头上。将来自此杂交的种子铺板至含有25ug/ml卡拉霉素的Murashige-Skoog B5平板上以核实该种子的杂交来源。将卡拉霉素抗性的(F1)植物转移至土壤中并且分析nim1表型。因为nim1-5突变体与Ws野生型杂交的F1代显示出nim1表型，所以也对nim1-5X nim1-1F2进行分析。
如表17中所示，所有得到的F1植物显示nim1-1表型。因此，在nim1-2,-3,-4,-5,-6的突变没有被nim1-1补充；这些植物均位于相同的补充组中且因此为等位基因。对来自nim1-5X nim1-1杂交的F2代分析也显示出nim1表型，证实nim1-5为nim1的等位基因。2．NIM1区域的序列分析和亚克隆
用Sequcncher3.0和GCG软件包分析含有NIM1区域的9.9kb区域中开放阅读框在所有6个框架中的存在。含有大的ORF’s的4个区域鉴定为可能的基因(基因区域1-4)。从野生型母本和6个不同的nim1等位变异体的DNA中PCR扩增这4个区域。用Oligo 5.0(国立生物科学公司)筛选这些扩增的引物并且通过整合的DNA技术公司进行分析。PCR产物于1.0％的琼脂糖凝胶上分离并且用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。以用于起始扩增的引物和设计用于测序不包括起始引物的任何区域的其它引物对纯化的基因组PCR产物直接测序。对这些基因区域的平均覆盖大约3.5阅读(reads)/碱基。
编辑序列并且用Sequcncher3.0进行组装。仅仅在命名为基因区域2中鉴定出对nim1等位基因特异性的碱基改变。
列于表18中的位置涉及图14和示于图13中9.9kb区域的上链(top strand)。对图13中1,2,3和4基因区域的开放阅读框进行测序并且在表中显示不同nim1等位基因中变化。描述的变化位于上链(topstrand),5c至3c，正如其涉及图13。
显然克隆出NIM1基因并且其位于基因区域2内，因为在所有6个nim7等位基因中基因区域2开放阅读框中具有氨基酸的变化或改变。同时，至少1个nim1等位基因在基因区域1,3或4中中开放阅读框中没有显示出变化。因此，仅仅可以为NIM1的9.9kb区域内的基因为基因区域2,NIM1基因。
表18的Ws部分表示拟南芥属Ws生态型相对于拟南芥属Columbia生态型的变化。图13,14,15和所有其它其中序列已显示的图中涉及在进行的实验中含有野生型基因的拟南芥属Columbia生态型。列出了基因2或NIM1区域中氨基酸的变化以及其它区域中碱基对的变化。
图13显示4种描述NIM1基因的克隆以及整个9.9kb区域的不同图板。图14为与图13中描述的方向相同的整个9.9kb区域的序列。图15为是图13中所示基因区域2的特异性NIM1基因区域的序列；图15序列中含有NIM1基因。体15以单字母密码显示氨基酸序列并且以大写字母显示在该DNA序列中获得的全长cDNA和RACE产物。已发现的有些等位突变显示于该DNA序列的上面并且显示出具有此改变的特定nim1等位基因。
对该区域的序列分析和对各种nim1等位基因的测序(见下面)允许鉴定含有nim1基因的粘粒区域。该区域通过～5.3kb BamHⅠ-EcoRⅤ限制性片段加以描绘。以BamHⅠ和EcoRⅤ(NEB)消化来自D7的粘粒DNA和来自pBlueScriptⅡ(pBSⅡ)的质粒DNA。从琼脂糖凝胶中分离来自D7的5.3kb的片段并且用QIAquick凝胶提取试剂盒(#28796,Qiagen)加以纯化。将该片段与Bam-EcoRⅤ-消化的pBSⅡ连接过夜并且将连接混合物转化入大肠杆菌DH5a菌株中。筛选含有插入子的菌落，分离DNA，并且通过以HindⅢ消化加以确证。然后将BamHⅠ-EcoRⅤ片段加工成双重载体(pSGCG01)用于转化入拟南芥属中。
3．4个基因区域的Northern分析.
按照前述(Delaney,等，1995，美国自然科学院院报.92:6602-6606)对从以水-、SA-、BTH-和INA-处理的Ws和nim1品系制备相同的Northern印迹。用从在9.9kbNIM1基因区域中鉴定出的4个基因区域产生的PCR产物对这些探针进杂交。仅仅含有NIM1基因的基因区域(基因区域2)具有与该RNA样品可检测到的杂交，表示仅仅NIM1区域含有可检测到的转录基因(图16和表18)。
表18显示nim1等位基因变异.
表18
    基因区域
等位基因/生态型 1(碱基590-1090) 2(NIM1)(碱基1380-4100) 3(碱基5870-6840) 4(碱基8140-9210)
nim1-1 没有变化 在2981处插入t:7AA改变且蛋白质成熟前终止 没有变化 没有变化
nim1-2 没有变化 2799处g变为a:His变为Tyr 没有变化 没有变化
nim1-3 没有变化 3261处t缺失：10AA改变且蛋白质成熟前终止 没有变化 没有变化
nim1-4 没有变化 2402处c变为t:Arg变为lys 没有变化 没有变化
nim1-5 没有变化 2402处c变为t:Arg变为lys 没有变化 没有变化
nim1-6 734处g变为a:asp变为lys 2670处g变为a:Gln变为终止 没有变化 没有变化
WS(与Columbia比较) 没有变化 1067处a变为g:Ile变为Leu2344处a变为c：内含子2480处t变为g:Gln变为Pro2894处g变为c:Ser变为 5746处t变为a5751处a变为t5754处t变为a 8705处t变为g8729处g变为t8739处g变为t
Trp3449处缺失ggc：丢失Ala3490处c变为t:Ala变为Thr3498处c变为t:Ser变为Asn3873处a变为t：非编码3992处g变为a：非编码4026处g变为a：非编码4061处g变为a：非编码 6728处c变为t6815处a变为t6816处t变为c 8784处g变为t8789处c变为a8812处c变为t8829处a变为g8856处t变为g9004处a变为c9011处a变为t8461处a变为g
检测的RNA 否 是 否 否
列于表中的位置涉及含有9.9 Kb序列的图14。所有的等位基因nim1-1至nim1-6均为WS菌株。Columbia-0代表野生型
我们也通过做其它的补充实验证实了基因区域2(图13.)含有有功能的NIM1基因。从粘粒D7中分离含有基因区域2的BamHⅠ/HindⅢ基因组片段并且克隆入含有卡拉霉素抗性基因的双重载体pSGCG01(图13；Steve Goff，个人通讯)。将得到的质粒转化入土壤杆菌菌株GV3101中并且筛选对卡拉霉素为阳性的菌落。用PCR核实筛选出的克隆含有该质粒。按照前述用该细菌渗入卡拉霉素敏感性的nim1-nim中。收获得到的种子并且铺板于含有50ug/ml卡拉霉素的GM琼脂上。将存活过此筛选的植物转移至土壤中用于补充测试。以300um的INA喷洒转化的植物和对照的Ws和nim1植物。2天以后，收获叶子用于RNA提取和PR-1的表达分析。然后以寄生霜霉(分离物EmWa)喷洒植物并且按前述种植。真菌感染10天后，评价和分析植物对于真菌生长阳性或阴性的植物。INA处理后，所有15株转化的植物以及Ws对照均为真菌生长阴性，而nim1对照为真菌收获阳性。按照前述提取和分析这些转化子和对照的RNA。Ws对照和所有15个转化子在INA处理后显示出PR-1基因诱导，而nim1对照没有显示出由INA对PR-1的诱导。4．NIM1cDNA的分离
将在1YES表达载体(Elledge，等，1991,PNAS 88,1731-1735)中制备的拟南芥属cDNA文库铺板并且进行噬菌体挑选(lifits)。滤膜与从含有nim1基因区域产生的32P-标记的PCR产物杂交。从150,000个噬菌斑筛选中鉴定出14个阳性。纯化每个噬菌斑并且回收质粒DNA。用EcoRⅠ将cDNA插入子从载体中消化出来，琼脂糖凝胶纯化并且测序。从最长的cDNA中获得的序列显示于图15中。为了证实我们已经获得cDNA的5c末端，根据制造商的说明施用Gibco BRL5’RACE试剂盒。将得到的RACE产物测序并且发现其包括显示于图15中其它的碱基。在2个cDNA克隆中存在并且在RACE中检测到的转录区域在图15中以大写字母显示。等位基因中变化显示于该DNA链的上方。大写字母表示RACE PCR处理后该序列存在于cDNA克隆或中或被检测到。实施例9NIM1基因的特征分析
用Clustal V(Higgins,Desmond G.和Paul M.Sharp(1989)，在微机上快速而敏感的多重序列比较，CABIOS 5:151-153)作为DNA*的一部分(1228南公园大街,MadisoB Wisconsin,53715)用于Macintosh的Lasergene生物计算软件包(1994)建立多重序列比较。已经测定NIM1蛋白的一定区域在氨基酸序列中与4种不同的水稻cDNA蛋白产物是同源的。用GenBankBLAST search中的NIM1序列鉴定同源性。在NIM1和水稻cDNA产物中同源性区域的比较显示于图19中。NIM1蛋白片段显示4种水稻产物中36至48％的一致氨基酸序列。实施例10各种nim1等位基因的表型特征分析1．nim1等位基因中化学反应性的分析
针对PR基因表达和寄生霜霉抗性化学诱导，我们分析了各种nim1等位基因中的差异(见图17和18)。
以化学诱导物处理突变的植物并且然后用于PR基因表达和抗病性的分析。2．植物生长和化学药物的应用
将野生型种子和每种nim1等位基因(nim1-1,-2,-3,-4,-5,-6)的种子种植于MetroMix300培养基上，以透明塑料圆顶覆盖并且置于黑暗中4℃3天。4℃处理3天后，将植物移至人工气候室中2周。种植后2周，长出的幼苗具有4片真叶片。然后以H2O,5mM SA,300uM BTH或300uM INA处理植物。用chromister以细雾将化学药物施用以完全覆盖幼苗。将水对照植物放回培养人工气候室中而将化学处理的植物维持于单独但一致的人工气候室中。3天后，将植物分成2组。收集一组用于RNA提取和分析。第2组以P.parsitica接种。3．寄生霜霉接种和诱导
P.parsitica分离物’EmWa’为与Ws生态型相容的P.p分离物。相容的分离物为那些能够在特定的宿主中导致疾病的分离物。Pparsitica分离物’Noco’不与Ws相容但与Columbia生态型相容。不相容的病原体为潜在的宿主所识别，诱发防止疾病产生的宿主反应。化学施用后3天，将水和化学处理的植物以相容的’EmWa’分离物接种。’Noco’接种仅仅对水处理的植物进行。接种后，将植物以透明的塑料圆顶覆盖以维持成功P.parsitica感染所需的高湿度并且置于具有19℃白天/17℃夜间温度和8h光/16h黑暗循环的培养室中。
于接种后的各个时间点对植物进行显微分析以评估症状的发生。在放大的情况下，可以在疾病发生的很早期观察到真菌孢子的形成。测定接种后5天、6天、7天、11天和14天显示出孢子形成的植物/位点(pot)的百分比并且记录孢子形成的密度。
图18显示了P.parsitica接种后对各种nim1等位基因的疾病分析。最突出的时间点为接种后的5天和6天。在接种后的5天，nim1-4在所有进行过诱导化学处理的情况中显示出～80％的感染，清楚地表明此等位基因/基因型具有最为严重的疾病易感性。在接种后的6天，nim1-1,-2,-3,-4和-6在所有进行过诱导化学处理的情况中显示出疾病现象。然而，nim1-5在第6天处理时较Ws-野生型显示出较少的感染。因此，nim1-5为各种nim1等位基因中是最具有疾病抗性的。以BTH但不是其它诱导处理后nim1-2对于疾病易感性来说似乎是居间的。
PR-1基因表达表明nim1-4对所有测定的诱导化合物是具有最少反应性的(图17)，而在没有诱导物存在时nim1-5显示出PR-1表达增高的水平。这些PR-1基因表达结果与以P.parsitica进行的疾病分析相一致(图18)并且表明nim1等位基因可以导致抗性或易感性。
将上面获得的样品用于分析NIM1基因表达(图7)。在野生型植物中，NIM1mRNA存在于于未处理的对照样品中。以SA,INA,BTH处理后或以相容的病原体感染后，NIM1 mRNA积累至较高的水平。与野生型相比，观察到nim1等位基因中NIM1信使(mRNA)丰度的差异。除了nim1-2和-5其中的量类似外，NIM1 mRNA在未处理突变植物中的丰度低于在野生型中观察到的丰度。nim1-1,-3和-4具有低水平的NIM1信使而nim1-6具有很低的NIM1 mRNA的积累。以SA,INA或BTH处理后在nim1-1,-2,-3中观察到mRNA的增加而在nim1-5，或-6中没有观察到增加。然而，此增加少于在野生型中观察到的增加。病原体感染后，在野生型和突变体中均观察到与NIM1cDNA探针杂交的其它条带并且除了在nim1-6中外，NIM1 mRNA水平相对于未处理的对照有升高。
图18显示了通过以寄生霜霉感染后各个时间点nim1等位基因以及NahG植物的感染比例而进行的抗病性分析。WsWT表示其中的nim1等位基因已被发现的Ws野生型母本系。各种nim1等位基因示于表中并且NahG植物也被显示。NahG植物在以前已发表.(Delaney等.科学266,pp.1247-1250(1994))。在WO 95/19443中也描述了NahG拟南芥属。
NahG基因是来自恶臭假单胞菌的基因，其将水杨酸转变成儿茶酚，因而排除了水杨酸的积累，后者是植物中用于SAR所必须的信号转导成份。因此，NahG拟南芥属植物没有显示出正常的SAR。此外，它们一般对病原体显示出更大的易感性。因此，NahG植物用作一种通用的易感性对照。此外，NahG植物仍然对化学诱导物INA和BTH反应；这显示于图17中底部的2个图板中。
从图18可看出nim1-4和nim1-6等位基因似乎是最为严重的；在此部分结果中较早所述和在图中EmWa BTH图板，最下面图板中所示，在较早的时间点最容易观察到。此外，nim1-5等位基因对INA和BTH显示出最大的反应并且因此在nim1等位基因中是最为脆弱的。
NahG植物对INA和BTH显示出很高的反应并且看上去与nim1-5等位基因很相似。然而，在晚期时间点，图中的11天，在NahG植物中诱导出的抗病性开始衰退，并且在INA和BTH之间具有复杂的差异因为INA-诱导的抗性较BTH在NahG植物诱导出的抗性快得多并且更为严重。在这些实验中也见到的是在Ws中INA和BTH诱导出对EmWa很好的抗性，并且nim1-1,nim1-2和其它nim1等位基因对抗病性方面对SA或INA基本上没有显示出反应。
图18列出了以P.parsitica的EmWa种类感染后孢子的形成，并且每个柱状图表示评价过抗病性的感染后的天数。
也对同样的样品进行分析SAR基因PR1表达的Northern分析，如图17中所示。图17显示由增强的PR1基因表达所证实的野生型植物对水杨酸、INA、BTH和病原体感染显示出很好的反应。nim1-1等位基因，在另一方面，对包括病原体的所有化学诱导物显示出很有限的反应。
病原体诱导在nim1-1等位基因中较野生型中至少低数倍。nim1-2,nim1-3和nim1-6对各种处理显示出与nim1-1类似的反应。然而，nim1-4等位基因在对所用的任何一个诱导物反应中基本上没有显示出表达。基本上，背景水平是观察到的所用水平。nim1-5等位基因相对于水的对照显示出很高的背景水平并且此背景水平在所有的处理中维持；然而，化学诱导物的诱导是有限的或没有诱导。
NahG植物用作良好的对照，显示在SA存在时它们不能够诱导PR-1；另一方面，INA和BTH均诱导出很高水平的PR-1的表达。病原体感染的效应类似于SA的效应；在EmWa处理的NahG植物中没有PR-1的表达。
用被检测的全长cDNA克隆以NIM1基因也对在诱导研究中制备的这些相同的RNA样品进行检测。在图16中，可见到INA在野生型Ws等位基因中诱导NIM1基因。然而，nim1-1突变等位基因显示出NIM1基因较低的基本表达水平，并且通过INA是不可诱导的。这类似于在nim1-3等位基因和nim1-6等位基因中所观察到的情况。nim1-2等位基因在未处理的样品中大约显示出正常的水平并且与nim1-4等位基因一样，显示出与野生型样品类似的诱导。nim1-5等位基因当以化学诱导物诱导时似乎显示出NIM1基因更高的基本表达水平和更强的表达。
由抗性化学诱导物和其它诱导物对NIM1的诱导与其在病原体防御中的作用相一致并且也进一步证明了我们在9.9kb的区域内获得了正确的基因。
                     序列表(1)基本信息：
(ⅰ)申请人：
  (A)名称：Novartis AG
  (B)街道：Schwarzwaldallee 215
  (C)城市：Basel
  (E)国家：瑞士
  (F)邮编(ZIP):4002
  (G)电话：+41 61 69 11 11
  (H)电传：+41 61 696 79 76
  (I)电报：962 991
(ⅱ)发明名称：赋予植物抗病性的基因及其应用
(ⅲ)序列数目：11
(ⅴ)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(2)关于SEQ ID NO:1的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：9919个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：否
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:TGATCATGAA TTGCGTGTAG GGTTGTGTTT TAAAGATAGG GATGAGCTGA AGAAGGCGGT      60GGACTGGTGT TCCATTAGAG GGCAGCAAAA GTGTGTAGTA CAAGAGATTG AGAAGGACGA     120GTATACGTTT AAATGCATCA GATGGAAATG CAATTGGTCG CGTCGGGCAG ATTGAATAGA     180AGAACATGGA CTTGTTAAGA TAACTAAGTG TAGTTGGTCC ACATACTTGT TGTTCTATTA     240AGCCGGAAAA CTTCAACTTG TAATTTGCAG CAGAAGAGAT TGAGTGTCTG ATCAGGGTAC     300AACCCACTCT AACAGCAGAG TTGAAAAGTT TGGTGACATG CTTAAAACTT CAAAGCTGCG     360GGCAGCAGAA CAGGAAGTAA TCAAAGATCA GAGTTTCAGA GTATTGCCTA AACTAATTGG     420CTGCATTTCA CTCATCTAAT GGGCTACTTG TGGACTGCAA TATGAGCTTT TCCCTAATCC     480TGAATTTGCA TCCTTCGGTG GCGCGTTTTG GGCGTTTCCA CAGTCCATTG AAGGGTTTCA     540ACACTGTAGA CCTCTGATCA TAGTGGATTC AAAAGACTTG AACGGCAAGT ACCCTATGAA     600ATTGATGATT TCCTCAGGAC TCGACGCTGA TGATTGCTTT TTCCCGCTTG CCTTTCCGCT     660TACCAAAGAA GTGTCCACTG ATAGTTGGCG TTGGTTTCTC ACTAATATCA GAGAGAAGGT     720AACACAAAGG AAAGACGTTT GCCTCGTCTC CAGTCCTCAC CCGGACATAG TTGCTGTTAT     780TAACGAACCC GGATCACTGT GGCAAGAACC TTGGGTCTAT CACAGGTTCT GTCTGGATTG     840TTTTTGCTTA CAATTCCATG ATATTTTTGG AGACTACAAC CTGGTGAGCC TTGTGAAGCA     900GGCTGGATCC ACAAGTCAGA AGGAAGAATT TGATTCCTAC ATAAAGGACA TCAAAAAGAA     960GGACTCAGAA GCTCGGAAAT GGTTAGCCCA ATTCCCTCAA AATCAGTGGG CTCTGGCTCA     1020TGACCAGTGG TCGGAGATAT GGAGTCATGA CGATAGAAAC AGAAGATTTG AGGGCAATTT     1080GTGAAAGCTT TCAGTCTCTT GGTCTATCAG TGACAGCGAA CGCACCTGCA CATGTGGGAA     1140GTTTCAATCG AAGAAGTTTC CATGTATGCA CCCAGAAATG GTGCAAAGGA TTGTTAACTT    1200GTGTCATTCA CAAATGTTGG ATGCAATGGA GCTGACTAGG AGAATGCACC TTACACGCCC    1260ACTCAGTGTT CTCTTATCTC TAGACCTGAA ACTAACTTGC TGTGTAATTC GAGTTACAAA    1320AGGTTAAAGG AAGAATTAGG AAGATACATA TAACATGAAT GTTGCCAGAA GTTCAGGGAA    1380CTTGAATATT CTTTTGGTTC TTGGTGGAAA ATATCCAACA GATGAACAAT TTGACATTAT    1440TTCACACTTT GATTCTAGCA ACTCTGTAAC ACCATCATGG GTTATTGTTG ATGTACATAA    1500ATATATATTA CAAATCTGTA TACCATTGGT TCAAATTGTT ACAACATTTG TTTGAAGCAC    1560ACCTGCAGCA ATAATACACA GGATGCAAAA CGAAGAGCGA AACTATATGA CGCCAACGAT    1620AGACATAAAC AGTTACAGTC ATCATGAAAA CAGAATTATA TGGTACAGCA AAAATTACAC    1680TAAGAGGCAA GAGTCTCACC GACGACGATG AGAGAGTTTA CGGTTAGACC TCTTTCCACC    1740GGTTGATTTC GATGTGGAAG AAGTCGAATC TGTCAGGGAC GAATTTCCTA ATTCCAAATT    1800GTCCTCACTA AAGGCCTTCT TTAGTGTCTC TTGTATTTCC ATGTACCTTT GCTTCTTTTG    1860TAGTCGTTTC TCAGCAGTGT CGTCTTCTCC GCAAGCCAGT TGAGTCAAGT CCTCACAGTT    1920CATAATCTGG TCGAGCACTG CCGAACAGCG CGGGAAGAAT CGTTTCCCGA GTTCCACTGA    1980TGATAAAAAA AACAAGGTCA GACAGCAAGT AACAAAACCA TGTTTAAAGA TCATTTAGTT    2040TTGTTTTTTG TGATAAGGAG TCCGATGAAG TGGGTGAGAA TCCATACCGG TTTTAGAAAG    2100CGCTTTTAGT CTACTTTGAT GCTCTTCTAG GATTCTGAAA GGTGCTATCT TTACACCCGG    2160TGATGTTCTC TTCGTACCAG TGAGACGGTC AGGCTCGAGG CTAGTCACTA TGAACTCACA    2220TGTTCCCTTC ATTTCGGCGA TCTCCATTGC AGCTTGTGCT TCCGTTGGAA AAAGACGTTG    2280AGCAAGTGCA ACTAAACAGT GGACGACACA AAGAATAGTT ATCATTAGTT CACTCAGTTT    2340CCTAATAGAG AGGACATAAA TTTAATTCAA ACATATAAGA AATAAGACTT GATAGATACC    2400TCTATTTTCA AGATCGAGCA GCGTCATCTT CAATTCATCG GCCGCCACTG CAAAAGAGGG    2460AGGAACATCT CTAGGAATTT GTTCTCGTTT GTCTTCTTGC TCTAGTATTT CTACACATAG    2520TCGGCCTTTG AGAGAATGCT TGCATTGCTC CGGGATATTA TTACATTCAA CCGCCATAGT    2580GGCTTGTTTT GCGATCATGA GTGCGGTTCT ACCTTCCAAA GTTGCTTCTG ATGCACTTGC    2640ACCTTTTTCC AATAGAGATA GTATCAATTG TGGCTCCTTC CGCATCGCAG CAACATGAAG    2700CACCGTATAT CCCCTCGGAT TCCTATGGTT GACATCGGCA AGATCAAGTT TTAAAAGATC    2760TGTTGCGGTC TTCACATTGC AATATGCAAC AGCGAAATGA AGAGCACACG CATCATCTAG    2820ATTGGTGTGA TCCTCTTTCA AAAGCAACTT GACTAACTCA ATATCATCCG AGTCAAGTGC    2880CTTATGTACA TTCGAGACAT GTTTCTTTAC TTTAGGTACC TCCAAACCAA GCTCTTTACG    2940TCTATCAATT ATCTCTTTAA CAAGCTCTTC CGGCAATGAC TTTTCAAGAC TAACCATATC    3000TACATTAGAC TTGACAATAA TCTCTTTACA TCTATCCAAT AGCTTCATAC AAGCTTTACC    3060ACATATATTA GCAAGCTTGA GTATAACCAA TGTGTCCTCT ATAACAACTT TGTCTACAAC    3120GTCCAATAAG TGCCTCTGAA ATACAAATAC AAGTACTCAA GTAAGAACAT ATTCATGAAT    3180GTGTAACCAT AGCTTAATGC AGATGGTGTT TTACCTGATA GAGAGTAATT AATTCAGGGA    3240TCTTGAAGAT GAAAGCCAAA TAGAGAACCT CCAACATGAA ATCCACCGCC GGCCGGCAAG    3300CCACGTGGCA GCAATTCTCG TCTGCGCATT CAGAAACTCC TTTAGGCGGC GGTCTCACTC    3360TGCTGCTGTA AACATAAGCC AAAACAGTCA CAACCGAATC GAAACCGACT TCGTAATCCT    3420TGGCAATCTC CTTAAGCTCG AGCTTCACGG CGGCGGTGTT GTTGGAGTCT TTCTCCTTCT    3480TAGCGGCGGC TAAAGCGCTC TTGAAGAAAG AGCTTCTCGC TGACAAAACG CACCGGTGGA    3540AAGAAACTTC CCGGCCGTCG GAGAGAACAA GCTTAGCGTC GCTGTAGAAA TCATCCGGCG    3600AGTCAAAGAC GGATTCGAAG CTGTTGGAGA GCAATTGCAG AGCAGATACA TCAGGTCCGG    3660TGAGTACTTG TTCGGCGGCC AGATAAACAA TAGAGGAGTC GGTGTTATCG GTAGCGACGA    3720AACTAGTGCT GCTGATTTCA TAAGAATCGG CGAATCCATC AATGGTGGTG TCCATCAACA            3780GGTTCCGATG AATTGAAATT CACAAATTAA AGAGATCTCT GCTAATCAAC GAAGAGACCT            3840TATCAACTGG ATTTGGTTAA AGATCGAAGA TAACCATTGA CGAGCAGAGC CAAGTCAAGT            3900CAACGAGAGT GGTGGTGAGA TATGAAGAAG CATCCTCGTC CCACGGTTTA CATTTCACCA            3960AAACCGGTAA ATTTCCAGGA AAGGAATCTT TGTCAGAGAT CTTTTTTAAA AAGATATAAC            4020AGGAAGCTAA ACCGGTTCGG GTTATAAATG TTAGTATTTA T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(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：5655个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假定：无
(ⅳ)反义：否
(ⅹⅰ)特征：
   (A)名称/关键：外显子
   (B)位置：2787..3347
   (D)其它信息：/产物=“NIM1的第1个外显子”
(ⅹⅰ)特征：
   (A)名称/关键：外显子
   (B)位置：3427..4162
   (D)其它信息：/产物=“NIM1的第2个外显子”
(ⅹⅰ)特征：
    (A)名称/关键：外显子
    (B)位置：4271..4474
    (D)其它信息：/产物=“NIM1的第3个外显子”
(ⅹⅰ)特征：
   (A)名称/关键：外显子
   (B)位置：4586.4866
   (D)其它信息：/产物=“NIM1的第4个外显子”
(ⅹⅰ)特征：
   (A)名称/关键：CDS
   (B)位置：联合(2787..3347,3427..4162,4271..4474,4586..4866)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:TGTGATGCAA GTCATGGGAT ATTGCTTTGT GTTAAGTATA CAAAACCATC ACGTGGATAC        60ATAGTCTTCA AACCAACCAC TAAACAGTAT CAGGTCATAC CAAAGCCAGA AGTGAAGGGT       120TGGGATATGT CATTGGGTTT AGCGGTAATC GGATTGAACC CTTTCCGGTA TAAAATACAA       180AGGCTTTCGC AGTCTCGGCG TATGTGTATG TCTCGGGGTA TCTACCATTT GAATCACAGA       240ACTTTTATGT GCGAAGTTTT CGATTCTGAT TCGTTTACCT GGAAGAGATT AGAAAATTTG       300CGTCTACCAA AAACAGACAG ATTAATTTTT TCCAACCCGA TACAAGTTTC GGGGTTCTTG       360CATTGGATAT CACGGAACAA CAATGTGATC CGGTTTTGTC TCAAAACCGA AACTTGGTCC       420TTCTTCCATA CTCCGAACTC TGATGTTTTC TCAGGATTAG TCAGATACGA AGGGAAGCTA       480GGTGCTATTC GTCAGTGGAC AAACAAAGAT CAAGAAGATG TTCACGAGTT ATGGGTTTTA       540AAGAGCAGTT TTGAAAAGTC GTGGGTTAAA GTGAAAGATA TTAAAAGCAT TGGAGTAGAT       600TTGATTACGT GGACTCCAAG CAACGACGTT GTATTGTTTC GTAGTAGTGA TCGTGGTTGC       660CTCTACAACA TAAACGCAGA GAAGTTGAAT TTAGTTTATG CAAAAAAAGA GGGATCTGAT       720TGTTCTTTCG TTTGTTTTCC GTTTTGTTCT GATTACGAGA GGGTTGATCT GAACGGAAGA       780AGCAACGGGC CGACACTTTA AAAAAAAAAT AAAAAAAATG GGCCGACAAA TGCAAACGTA       840GTTGACAAGG ATCTCAAGTC TCAAGTCTCA ATTGGCTCGC TCATTGTGGG GCATAAATAT       900ATCTAGTGAT GTTTAATTGT TTTTTATAAG GTAAAAAGGA ATATTGAATT TTGTTTCTTA       960GGTTTATGTA ATAATACCAA ACATTGTTTT ATGAATATTT AATCTGATTT TTTGGCTAGT      1020TATTTTATTA TATCAAGGGT TCCTGTTTAT AGTTGAAAAC AGTTACTGTA TAGAAAATAG      1080TGTCCCAATT TTCTCTCTTA AATAATATAT TAGTTAATAA AAGATATTTT AATATATTAG      1140ATATACATAA TATCTAAAGC AACACATATT TAGACACAAC ACGTAATATC TTACTATTGT      1200TTACATATAT TTATAGCTTA CCAATATAAC CCGTATCTAT GTTTTATAAG CTTTTATACA      1260ATATATGTAC GGTATGCTGT CCACGTATAT ATATTCTCCA AAAAAAACGC ATGGTACACA      1320AAATTTATTA AATATTTGGC AATTGGGTGT TTATCTAAAG TTTATCACAA TATTTATCAA      1380CTATAATAGA TGGTAGAAGA TAAAAAAATT ATATCAGATT GATTCAATTA AATTTTATAA      1440TATATCATTT TAAAAAATTA ATTAAAAGAA AACTATTTCA TAAAATTGTT CAAAAGATAA      1500TTAGTAAAAT TAATTAAATA TGTGATGCTA TTGAGTTATA GAGAGTTATT GTAAATTTAC      1560TTAAAATCAT ACAAATCTTA TCCTAATTTA ACTTATCATT TAAGAAATAC AAAAGTAAAA      1620AACGCGGAAA GCAATAATTT ATTTACCTTA TTATAACTCC TATATAAAGT ACTCTGTTTA      1680TTCAACATAA TCTTACGTTG TTGTATTCAT AGGCATCTTT AACCTATCTT TTCATTTTCT      1740GATCTCGATC GTTTTCGATC CAACAAAATG AGTCTACCGG TGAGGAACCA AGAGGTGATT      1800ATGCAGATTC CTTCTTCTTC TCAGTTTCCA GCAACATCGA GTCCGGAAAA CACCAATCAA      1860GTGAAGGATG AGCCAAATTT GTTTAGACGT GTTATGAATT TGCTTTTACG TCGTAGTTAT      1920TGAAAAAGCT GATTTATCGC ATGATTCAGA ACGAGAAGTT GAAGGCAAAT AACTAAAGAA      1980GTCTTTTATA TGTATACAAT AATTGTTTTT AAATCAAATC CTAATTAAAA AAATATATTC      2040ATTATGACTT TCATGTTTTT AATGTAATTT ATTCCTATAT CTATAATGAT TTTGTTGTGA      2100AGAGCGTTTT CATTTGCTAT AGAACAAGGA GAATAGTTCC AGGAAATATT CGACTTGATT      2160TAATTATAGT GTAAACATGC TGAACACTGA AAATTACTTT TTCAATAAAC GAAAAATATA      2220ATATACATTA CAAAACTTAT GTGAATAAAG CATGAAACTT AATATACGTT CCCTTTATCA      2280TTTTACTTCA AAGAAAATAA ACAGAAATGT AACTTTCACA TGTAAATCTA ATTCTTAAAT      2340TTAAAAAATA ATATTTATAT ATTTATATGA AAATAACGAA CCGGATGAAA AATAAATTTT      2400ATATATTTAT ATCATCTCCA AATCTAGTTT GGTTCAGGGG CTTACCGAAC CGGATTGAAC      2460TTCTCATATA CAAAAATTAG CAACACAAAA TGTCTCCGGT ATAAATACTA ACATTTATAA      2520CCCGAACCGG TTTAGCTTCC TGTTATATCT TTTTAAAAAA GATCTCTGAC AAAGATTCCT      2580TTCCTGGAAA TTTACCGGTT TTGGTGAAAT GTAAACCGTG GGACGAGGAT GCTTCTTCAT      2640ATCTCACCAC CACTCTCGTT GACTTGACTT GGCTCTGCTC GTCAATGGTT ATCTTCGATC      2700TTTAACCAAA TCCAGTTGAT AAGGTCTCTT CGTTGATTAG CAGAGATCTC TTTAATTTGT      2760GAATTTCAAT TCATCGGAAC CTGTTG ATG GAC ACC ACC ATT GAT GGA TTC GCC       2813
                        Met Asp Thr Thr Ile Asp Gly Phe Ala
                          1             5GAT TCT TAT GAA ATC AGC AGC ACT AGT TTC GTC GCT ACC GAT AAC ACC       2861Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser Thr Ser Phe Val Ala Thr Asp Asn Thr10                 15                  20                   25GAC TCC TCT ATT GTT TAT CTG GCC GCC GAA CAA GTA CTC ACC GGA CCT       2909Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu Ala Ala Glu Gln Val Leu Thr Gly Pro
             30                  35                  40GAT GTA TCT GCT CTG CAA TTG CTC TCC AAC AGC TTC GAA TCC GTC TTT       2957Asp Val Ser Ala Leu Gln Leu Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ser Val Phe
        45                   50                  55GAC TCG CCG GAT GAT TTC TAC AGC GAC GCT AAG CTT GTT CTC TCC GAC       3005Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser Asp
     60                  65                  70GGC CGG GAA GTT TCT TTC CAC CGG TGC GTT TTG TCA GCG AGA AGC TCT       3053Gly Arg Glu Val Ser Phe His Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser Ser
 75                  80                  85TTC TTC AAG AGC GCT TTA GCC GCC GCT AAG AAG GAG AAA GAC TCC AAC       3101Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser Asn90                  95                         100         105AAC ACC GCC GCC GTG AAG CTC GAG CTT AAG GAG ATT GCC AAG GAT TAC       3149Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu Ile Ala Lys Asp Tyr
            110                 115                 120GAA GTC GGT TTC GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG GCT TAT GTT TAC AGC       3197Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser
        125                 130                 135AGC AGA GTG AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT GAA TGC GCA GAC GAG        3245Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu
          140           145                 150AAT TGC TGC CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG GAT TTC ATG TTG GAG        3293Asn Cys Cys His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu
155                 160                 165GTT CTC TAT TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT GAA TTA ATT ACT CTC         3341Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu170                 175                 180                 185TAT CAG GTAAAACACC ATCTGCATTA AGCTATGGTT ACACATTCAT GAATATGTTC          3397Tyr GlnTTACTTGAGT ACTTGTATTT GTATTTCAG AGG CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC         3450
                            Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp
                                    190                 195AAA GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA         3498Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu Ala ASn Ile
            200                 205                 210TGT GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT         3546Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile
        215                 220                 225GTC AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA         3594Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu
    230                 235                 240GAG CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG         3642Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu
245                 250                 255GTA CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC         3690Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp260                 265                 270                 275TCG GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC         3738Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr
            280                 285                 290AAT CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT         3786Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn
        295                 300                 305GTG AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC         3834Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn
    310                 315                 320CAT AGG AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG       3882His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg
325                 330                 335AAG GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA       3930Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala340                 345                 350                 355TCA GAA GCA ACT TTG GAA GGT AGA ACC GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA       3978Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile Ala Lys Gln
            360                 365                 370GCC ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT       4026Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln Cys Lys His
        375                 380                 385TCT CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA       4074Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln Glu Asp Lys
    390                 395                 400CGA GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC       4122Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala
405                 410                 415GAT GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT CTT GAA AAT AGA G                 4162Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg420                 425                 430GTATCTATCA AGTCTTATTT CTTATATGTT TGAATTAAAT TTATGTCCTC TCTATTAGGA     4222AACTGAGTGA ACTAATGATA ACTATTCTTT GTGTCGTCCA CTGTTTAG  TT GCA CTT      4278
                                                 Val Ala Leu
                                                         435GCT CAA CGT CTT TTT CCA ACG GAA GCA CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC       4326Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met Glu Ile Ala
            440                 445                 450GAA ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC       4374Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp
        455                 460                 465CGT CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT         4422Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys Ile Ala Pro
    470                 475                 480TTC AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA         4470Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys
   485               490               495ACC G GTATGGATTC TCACCCACTT CATCGGACTC CTTATCACAA AAAACAAAAC            4524Thr500TAAATGATCT TTAAACATGG TTTTGTTACT TGCTGTCTGA CCTTGTTTTT TTTATCATCA       4584G  TG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC           4629Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu
              505                 510                 515GAC CAG ATT ATG AAC TGT GAG GAC TTG ACT CAA CTG GCT TGC GGA GAA         4677Asp Gln Ile Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gln Leu Ala Cys Gly Glu
            520                 525                 530GAC GAC ACT GCT GAG AAA CGA CTA CAA AAG AAG CAA AGG TAC ATG GAA         4725Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gln Lys Lys Gln Arg Tyr Met Glu
        535                 540                 545ATA CAA GAG ACA CTA AAG AAG GCC TTT AGT GAG GAC AAT TTG GAA TTA         4773Ile Gln Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu
    550                 555                 560GGA AAT TCG TCC CTG ACA GAT TCG ACT TCT TCC ACA TCG AAA TCA ACC         4821Gly Asn Ser Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr
565                 570                 575GGT GGA AAG AGG TCT AAC CGT AAA CTC TCT CAT CGT CGT CGG TGA             4866Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg Arg  *580                 585                 590GACTCTTGCC TCTTAGTGTA ATTTTTGCTG TACCATATAA TTCTGTTTTC ATGATGACTG       4926TAACTGTTTA TGTCTATCGT TGGCGTCATA TAGTTTCGCT CTTCGTTTTG CATCCTGTGT       4986ATTATTGCTG CAGGTGTGCT TCAAACAAAT GTTGTAACAA TTTGAACCAA TGGTATACAG       5046ATTTGTAATA TATATTTATG TACATCAACA ATAACCCATG ATGGTGTTAC AGAGTTGCTA      5106GAATCAAAGT GTGAAATAAT GTCAAATTGT TCATCTGTTG GATATTTTCC ACCAAGAACC      5166AAAAGAATAT TCAAGTTCCC TGAACTTCTG GCAACATTCA TGTTATATGT ATCTTCCTAA      5226TTCTTCCTTT AACCTTTTGT AACTCGAATT ACACAGCAAG TTAGTTTCAG GTCTAGAGAT      5286AAGAGAACAC TGAGTGGGCG TGTAAGGTGC ATTCTCCTAG TCAGCTCCAT TGCATCCAAC      5346ATTTGTGAAT GACACAAGTT AACAATCCTT TGCACCATTT CTGGGTGCAT ACATGGAAAC      5406TTCTTCGATT GAAACTTCCC ACATGTGCAG GTGCGTTCGC TGTCACTGAT AGACCAAGAG      5466ACTGAAAGCT TTCACAAATT GCCCTCAAAT CTTCTGTTTC TATCGTCATG ACTCCATATC      5526TCCGACCACT GGTCATGAGC CAGAGCCCAC TGATTTTGAG GGAATTGGGC TAACCATTTC      5586CGAGCTTCTG AGTCCTTCTT TTTGATGTCC TTTATGTAGG AATCAAATTC TTCCTTCTGA      5646CTTGTGGAT                                                              5655(2)关于SEQ ID NO:3的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：594个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Met Asp Thr Thr Ile Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser1              5                10                15Thr Ser Phe Val Ala Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu
         20                  25                  30Ala Ala Glu Gln Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Ala Leu Gln Leu
     35                  40                  45Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ser Val Phe Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr
 50                  55                  60Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His65                  70                  75                  80Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala
             85                  90                  95Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu
        100                 105                 110Glu Leu Lys Glu Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val
    115                 120                 125Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro
130                 135                 140Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys145                 150                 155                 160Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile
            165                 170                 175Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp
        180                 185                 190Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu
    195                 200                 205Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys
210                 215                 220Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser225                 230                 235                 240Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu
            245                 250                 255Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys
        260                 265                 270Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu
    275                 280                 285Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala
290                 295                 300Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala305                 310                 315                 320Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala
            325                 330                 335Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly
        340                 345                 350Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile
    355                 360                 365Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln
370                 375                 380Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln385                 390                 395                 400Glu Asp Lys Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala
            405                 410                 415Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg
        420                 425                 430Val Ala Leu Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met
    435                 440                 445Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu
450                 455                 460Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys465                 470                 475                 480Ile Ala Pro Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala
            485                 490                 495Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser
        500                 505                 510Ala Val Leu Asp Gln Ile Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gln Leu Ala
    515                 520                 525Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gln Lys Lys Gln Arg
530                 535                 540Tyr Met Glu Ile Gln Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn545                 550                 555                 560Leu Glu Leu Gly Asn Ser Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser
            565                 570                 575Lys Ser Thr Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg
        580                 585                 590Arg   *(2)关于SEQ ID NO:4的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：41个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：无关
  (D)拓扑学：无关
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:I1e Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp A1a A1a Asp Ile Glu Leu Val1               5                   10                   15Lys Leu Met Val Met Gly G1u Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala
        20                   25                 30Val His Tyr Ala Val G1n His Cys Asn
     35                 40(2)关于SEQ ID NO:5的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：38个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：无关
  (D)拓扑学：无关
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5：Pro Thr Gly Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val Ser Pro1               5                  10                   15Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp His His Ala Asp Xaa Asn Phe Arg
        20                  25                  30Thr Xaa Asp Gly Val Thr
    35(2)关于SEQ ID NO:6的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：41个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：无关
  (D)拓扑学：无关
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:Ile Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val1               5                   10                  15Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala
        20                  25                  30Val His Tyr Ala Val Gln His Cys Asn
    35                  40(2)关于SEQ ID NO:7的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：27个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：无关
  (D)拓扑学：无关
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Arg Arg Pro Asp Ser Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val1               5                   10                  15Ser Pro Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp Gln
        20                  25(2)关于SEQ ID NO:8的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：41个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：无关
  (D)拓扑学：无关
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:Ile Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val1               5                   10                  15Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala
        20                  25                  30Val His Tyr Ala Val Gln His Cys Asn
    35                  40(2)关于SEQ ID NO:9的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：27个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：无关
  (D)拓扑学：无关
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:Arg Arg Pro Asp Ser Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val1               5                   10                  15Ser Pro Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp Gln
        20                  25(2)关于SEQ ID NO:10的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：41个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：无关
  (D)拓扑学：无关
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:Ile Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val1               5                   10                  15Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala
        20                  25                  30Val His Tyr Ala Val Gln His Cys Asn
    35                  40(2)关于SEQ ID NO:11的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：19个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：无关
  (D)拓扑学：无关
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:Pro Thr Gly Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val Ser Pro1               5                   10                  15Asp Met Val

Claims (30)

1．包含NIM1基因的分离的DNA分子。
2．根据权利要求1所述的分离的DNA分子，包含SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列。
3．编码NIM1基因产物的约9.9kb的分离的DNA分子。
4．根据权利要求1所述的分离的DNA分子，包含SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列。
5．权利要求1的分离的DNA分子，编码SEQ ID NO:2中列出的NIM1基因产物的氨基酸序列。
6．含权利要求1的NIM1突变基因的分离的DNA分子，其是nim1基因。
7．克隆BAC-04，其ATCC保藏号为97543。
8．包含在植物中有活性的启动子的嵌合基因，其中的启动子可操作地连接到编码NIM1基因产物的氨基酸序列的异源DNA分子上。
9．包含在植物中有活性的启动子的嵌合基因，其中的启动子与根据权利要求3所述的异源DNA片段可操作地连接。
10．包含在植物中有活性的启动子的嵌合基因，其中的启动子可操作地连接到编码SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的异源DNA分子上。
11．包含在植物中有活性的启动子的嵌合基因，其中的启动子可操作地连接到编码nim1基因产物氨基酸序列的异源DNA分子上。
12．包含权利要求8到11的任意一项的嵌合基因的重组载体。
13．根据权利要求12所述的重组载体，其中所述的载体能够稳定地转化入宿主细胞。
14．根据权利要求12所述的重组载体，其中所述的载体能够稳定地转化入植物，植物种子，植物组织或植物细胞。
15．包含权利要求8到11的任意一项的嵌合基因的植物表达盒。
16．包含权利要求8到10的嵌合基因的植物表达盒。
17．包含权利要求11的嵌合基因的植物表达盒。
18．根据权利要求15到17所述的植物表达盒，能连续地或组成性表达嵌合基因。
19．包含权利要求8到11的任意一项的嵌合基因的植物，植物细胞及其子代。
20．包含权利要求8到10的任意一项的嵌合基因的植物、植物细胞及其子代，具有广谱抗病性。
21．包含权利要求11的嵌合基因的植物、植物细胞及其子代。
22．权利要求19的植物，植物细胞及其子代，其中所述的植物选自裸子植物、单子叶和双子叶植物。
23．权利要求19的植物，植物细胞及其子代，其中所述的植物是农作物。
24．权利要求23的植物，植物细胞及其子代，其中所述的植物选自水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、土豆、胡萝卜、甘薯、甜菜、蚕豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、莱菔、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、西葫芦、南瓜、密生西葫芦、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、悬钩子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。
25．根据权利要求1所述的分离的DNA分子的应用，该DNA分子是赋予植物抗病性的基因。
26．根据权利要求1所述的分离的DNA分子及其变异体在用于鉴定能够诱导植物广谱抗病性的化合物的筛选方法中的应用。
27．根据权利要求17所述的植物表型在鉴定允许于植物中表达广普抗病性的分离的基因片段中的应用。
28．根据权利要求1到5中任意一项所述的分离的DNA分子在赋予植物细胞，植物及其子代抗病性中的应用。
29．根据权利要求6所述的分离的DNA分子在赋予植物细胞，植物及其子代普遍疾病易感性中的应用。
30．根据权利要求20所述的抗性植物及其子代在经过育种将抗性特征掺入到植物中的应用。
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