JP2001516588A - 耐病害性に関連したイネ由来アンキリン反復体含有ペプチドであるｒａｎｋ１ - Google Patents

耐病害性に関連したイネ由来アンキリン反復体含有ペプチドであるｒａｎｋ１

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JP2001516588A
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Abstract

(57)【要約】 配列番号１を含む配列を有する単離核酸。その核酸は、植物における耐病害性をコードする。形質転換植物細胞は、耐病害性植物の再生のために植物に導入されることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野及び背景技術】
作物における菌類病、細菌病及びウイルス病により、収量の減少及び製品品質
の低下が生じ、農業者にとって実質的な損失を招く。例えば、世界中におよぶほ
とんどのイネ栽培領域において生じるしばしば破壊的な病害となるイネいもち病
（ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ）は、農業者にとって１年で５０億ドルの経費となると
推定される（Ｍｏｆｆａｔ、１９９４）。この病害により、特に温帯潅漑及び熱
帯高地イネ生態系において、米の収量が顕著に減少する。耐性品種を使用するこ
とが、この病害の防除にとって最も経済的且つ効果的な方法である。ここ数十年
にわたって、いもち病菌に対する耐性の遺伝学について多くのことが判明した。
数多くの主要な耐性遺伝子が同定され、育種プログラムにおいて広く使用されて
きた。しかしながらこの病原体に対する宿主の耐性の分子メカニズムは、ほとん
ど知られていない。
【０００２】 植物がイネいもち病菌等の病原体により攻撃されるとき、ほとんどの場合、防
御反応バッテリ（ｂａｔｔｅｒｙ）を取り付けることにより、感染を防ぐことが
できる（Ｌｉｎｄｓａｙ等、１９９３）。植物防御の活性は、病原体認識により
生じ、病原体侵入が停止される。系統的に得られた耐性（ＳＡＲ）は、植物が病
原体に対してそれら自体を防御するのに使用する複合システムの一つの重要な成
分である（Ｒｙａｌｓ等、１９９６）。ＳＡＲは、無発病性病原体に対する局部
的過敏性反応（ＨＲ）によりトリガされ、植物の未感染部分を、種々の通常の毒
性病原体に対して耐性とする。ＳＡＲは、広範囲な病原体に対する病原体誘発性
系統耐性であるので、植物−病原体反応の特に重要な概念である。
【０００３】 最近、ＳＡＲの分子面の解読において顕著な進歩がなされた。シロイヌナズナ
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子ＮＰＲ１／ＮＩＭ１が、マップに基づいた手
法を用いてクローニングされた（Ｃａｏ等、１９９７；Ｒｙａｌｓ等、１９９７
）。ＮＰＲＩ／ＮＩＭ１に欠陥を有する変異体は、種々のＳＡＲ誘発処理に応答
せず、病原関連（ＰＲ）遺伝子をほとんど発現せず、且つ感染に対する感受性が
増加する。その遺伝子は、アンキリン反復体を含んでいる新規なタンパク質をコ
ードしており、哺乳動物シグナル伝達因子ＩκＢサブクラスａに対して相同性を
示す。このことは、ＲＰＮ１／ＮＩＭ１がＮＦ−κＢ関連転写因子と相互作用し
て、ＳＡＲ遺伝子発現を誘発し、耐病害性をトリガする可能性を示唆している（
Ｒｙａｌｓ等、１９９７）。
【０００４】 アンキリン反復体は、転写因子、細胞分化分子及び構造タンパク質を含む多様
な機能の多数のタンパク質に存在する３３アミノ酸モチーフである （Ｂｅｎ ｎｅｔ、１９９３）。アンキリン モチーフ コンセンサス（Ａｎｋｙｒｉｎ
ｍｏｔｉｆ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列は、以下のアミノ酸配列を含む： −Ｄ−−−−Ｇ−ＴＰＬＨ−ＡＡ−−−−−−−Ｖ−−ＬＬ−−ＧＡ− （ＬａＭａｒｃｏ、１９９１）。このモチーフは、タンパク質の相互作用を媒介
することが示され、通常、タンデムアレーに４〜７コピー存在している（Ｍｉｃ
ｈａｅｌｙ及びＢｅｎｎｅｔｔ、１９９３）。アンキリン反復体含有タンパク質
は、多様な機能を有すること、及びタンパク質間相互作用に関与していることが
判明した。哺乳動物におけるこれらのタンパク質の一部は、ＮＦ−κＢ、インヒ
ビターＩκＢ等の転写調整タンパク質である （Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａ、１９９６
；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ等、１９９７）。ＮＦ−κＢ／ＩκＢシグナル伝達経路は
、哺乳動物とハエの両方に保存される。ＩＬ−１処理又は細菌接種等の刺激によ
り、シグナル伝達経路が活性化される。これは、ＩκＢ又はその同族物の分解及
びＮＦ−κＢ転写因子が核に放出されて転写を刺激するためである（Ｂａｅｕｅ
ｒｉｅ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９６；Ｂａｌｄｗｉｎ、１９９６）。シロ
イヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において、ＮＦ−κＢインヒビターＩκ
Ｂと相同であるＮＰＲ１／ＮＩＭ１は、ＳＡＲの開始を制御する。ＮＰＲ１／Ｎ
ＩＭ１により標的とされている転写因子は、直接作用又は間接作用によりＳＡＲ
遺伝子発現及び病害耐性のレプレッサとしての役割を果たす（Ｒｙａｌｓ等、１
９９７）。
【０００５】 ＳＡＲは、感染性病原体に対する重要な植物防御メカニズムである。例えば、
ＳＡＲが植物をイネいもち病から防御することができることが実証された。ＳＡ
Ｒインデューサ、ベンゾ（１，２，３）チアジアゾール−７−カルボチオン酸Ｓ
−メチルエステル（「ＢＨＴ」）は、野外条件でいもち病を防除するのに有効で
あることが判明した。
【０００６】 （発明の概要） 耐いもち病性植物から、アンキリン反復体を含有する新規なタンパク質をコー
ドする遺伝子を単離した。イネアンキリン反復体（ｒｉｃｅ ａｎｋｙｒｉｎ
ｒｅｐｅａｔｓ）からこの遺伝子を「ＲＡＮＫ１」と称し、この遺伝子は、シロ
イヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子ＮＰＲ１／ＮＩＭ１及び哺乳動物
シグナル伝達因子インヒビターＩ−κＢと顕著に相同である。ＲＡＮＫ１遺伝子
は、いもち病病原体感染並びにＳＡＲを介して応答する他の病害に対するイネの
防御において重要な役割を果たしていると思われるタンパク質をコードしている
。ＲＰＮ１／ＮＩＭ１とＲＡＮＫ１との両方の遺伝子がアンキリン反復体をコー
ドしているので、これらの反復体は、植物病害、とりわけイネいもち病に対する
ＳＡＲ誘発耐性に関与することができると思われる。
【０００７】 したがって、本発明によれば、その一態様において、配列番号１（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１）を含んでなる配列を有する単離核酸が提供される。
【０００８】 本発明によれば、別の態様において、配列番号１を含んでなる核酸を含んでな
る、植物細胞中で機能する組換えＤＮＡ発現ベクターが提供される。
【０００９】 第三の態様によれば、配列番号１を含んでなる配列を有する核酸で安定的に形
質転換された植物細胞が提供される。
【００１０】 さらに別の態様によれば、配列番号１を含んでなる配列を有する核酸で形質転
換された遺伝子導入植物が提供される。
【００１１】 さらに本発明によれば、単子葉植物に耐病害性を付与する方法であって、アン
キリン モチーフ配列を含み、タンパク質をコードしている配列を有する核酸を
、その植物のゲノムに安定的に組込む工程を含んでなる、方法が提供される。
【００１２】 本発明の別の態様によれば、単子葉植物に耐イネいもち病性を付与する方法であ
って、アンキリン モチーフ配列を含み、タンパク質をコードしている配列を有
する核酸を、その植物のゲノムに安定的に組込む工程を含んでなる、方法が提供
される。
【００１３】 ［発明の詳細な説明］ 本発明は、イネいもち病に対する耐性を付与する単離核酸に関する。この核酸
は、アンキリン反復体を有すると予測されるタンパク質をコードしている。また
、この核酸は、有利にも配列番号１のヌクレオチド配列を有している。しかしな
がら、このヌクレオチド配列は、同じタンパク質をなおコードしながら遺伝子コ
ードの縮重によりなされるような変更が可能であることが分かるであろう。植物
中での遺伝子の発現は、配列番号１に示されている一つ以上のコドンを、核酸を
挿入する植物に好ましいコドンで置き換えることにより高めることができる。
【００１４】 該核酸は、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて植物又はバクテリア細胞に組み込
むことができる。一般的に、このような方法には、該核酸をＤＮＡ発現ベクター
に挿入する工程が含まれる。このようなベクターは、挿入タンパク質をコードし
ている配列の転写及び翻訳に必要な因子、並びに形質転換細胞又は植物の選択を
容易にするための一種以上のマーカー配列を含むことが有利である。
【００１５】 多数の植物活性プロモータが、当該技術分野において公知であり、ここで開示
されている核酸配列の効果的な発現をおこなうのに使用できる。適当なプロモー
タとしては、例えば、ｎｏｓプロモータ、小サブユニットクロロフィルＡ／Ｂ結
合ポリペプチド、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモータ及び植物遺
伝子から単離されたプロモータなどがある。プロモータは、形質転換される植物
の種類によって単離できる。また、３５Ｓ又はアクチンプロモータは、単離され
たｃＤＮＡクローン用にも使用できる。また、これらは、遺伝子の過発現を試験
するのにも有用である。
【００１６】 本発明の核酸を一旦発現ベクターにクローニングすると、植物細胞に形質転換
できる状態となる。用語「植物細胞」は、植物由来のいずれの細胞をも含み、こ
れには、未分化組織、例えば、カルス及び懸濁培養だけでなく、植物種、花粉又
は植物胎芽も含まれる。形質転換に適当な植物組織には、葉組織、根組織、分裂
組織、プロトプラスト、胚軸子葉、胚盤、茎端、根、未成熟胚芽、花粉及び葯（
ａｎｔｈｅｒ）などがある。
【００１７】 植物を本発明による病害耐性を付与する核酸で形質転換する一つの方法に、こ
のような植物の組織を、本発明による核酸を含んでなるベクターで形質転換した
バクテリア接種源と接触させることがある。一般的に、この方法には、植物組織
に、バクテリア懸濁液を接種し、抗生物質なしで２５〜２８℃で再分化培養液に
よりその組織を４８〜７２時間インキュベーションする工程が含まれる。
【００１８】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属由来のバクテリアを利用して、植物細胞を形質
転換できる。このようなバクテリアの適当な種には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅ
ｎｓなどがある。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（例え
ば、ＬＢＡ４４０４又はＥＨＡ１０５菌株）は、植物を形質転換する能力が知ら
れており、特に有用である。
【００１９】 植物細胞を本発明の核酸で形質転換する別の手法では、植物細胞に不活性又は
生物学的に活性な粒子を推進させる工程を含む。この手法は、米国特許第４，９
４５，０５０号、第５，０３６，００６号、及び第５，１００，７９２号（これ
らの米国特許全ての発明者はＳａｎｆｏｒｄ等）に開示されており、引用するこ
とにより本発明で開示されたものとする。一般的に、この方法では、不活性又は
生物学的に活性な粒子を、その細胞に、細胞の外表面に浸透させ且つその内部に
組込むのに有効な条件下で推進させることを含む。不活性粒子を利用するときに
は、粒子に病害耐性を付与する核酸を含有するベクターをコーティングすること
によりベクターを細胞中に導入できる。生物学的に活性な粒子（例えば、導入し
ようとするＤＮＡを含有する、乾燥酵母細胞、乾燥バクテリア又はバクテリオフ
ァージ）を、植物細胞組織に推進させることもできる。
【００２０】 植物細胞を形質転換する別の方法に、エレクトロポレーション法がある。この方
法では、プロトプラストと所望の核酸とを混合することと、電気パルスにより細
胞膜に孔を形成して細胞にＤＮＡを導入できるようにすることにより、細胞を形
質転換することを含む。この方法は、現在では高い再現性があり、種々の遺伝子
が、この方法により単子葉、とりわけイネ植物に導入された（Ｔｏｒｉｙａｍａ
等（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ等（１９８９）；Ｒｈｏｄｅｓ等（１９８
８））。
【００２１】 エレクトロポレーションに類似した方法に、所望の遺伝子とプロトプラストと
を混合し、得られた混合物を、ＰＥＧで処理することにより、遺伝子をプロトプ
ラストに導入する方法がある。この方法は、エレクトロポレーション法とは、ポ
リエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を、電気パルスの代わりに用いる点が異な
る（Ｚｈａｎｇ Ｗ等（１９８８）；Ｄａｔｔａ等（１９９０）；Ｃｈｒｉｓｔ
ｏｕ等（１９９１））。
【００２２】 他の方法としては、１）種子又は胚芽を核酸と培養する方法（Ｔｏｐｆｅｒ
Ｒ等（１９８９）；Ｌｅｄｏｕｘ等（１９７４））、２）花粉管を処理する方法
（Ｌｕｏ等（１９８８））、３）リポソーム法（Ｃａｂｏｃｈｅ（１９９０）；
Ｇａｄ等（１９９０））、４）マイクロインジェクション法（Ｎｅｕｈａｕｓ等
（１９８７））などがある。
【００２３】 形質転換植物細胞から植物に再分化する公知の方法を、本発明の遺伝子導入植
物を調製するのに使用できる。一般的に、外植片、カルス組織又は懸濁培養を、
適当な化学的環境（例えば、サイトカイニン及びオーキシン）に暴露して、新し
く成長した細胞が分化し、胚芽を生じた後、根及び苗条に再分化するようにでき
る。
【００２４】 本発明の核酸配列を使用して、単子葉植物に、ＳＡＲにより調節された、イネ
いもち病及び他の病害に対する耐性を付与することができる。このような植物に
は、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ及びアスパラガスなどがあるが、こ
れらには限定されない。
【００２５】 本発明を、以下実施例によりさらに詳細に説明するが、これらは説明の目的で
なされるものであり、本発明は、これらの実施例に限定されない。
【００２６】
【実施例】
材料及び方法 イネ植物及びいもち病接種： Ｐｉ−２遺伝子を担持している耐性同質遺伝子系統Ｃ１Ｏ１Ａ５１と、感受性
品種ＣＯ３９とを、実験に使用した。３週齢のイネ植物に、単離ＰＯ６−６を接
種し、デューチャンバーに２６℃で２４時間保持した。葉組織を、接種０時間、
４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間後に両方の品種から
採取した。
【００２７】 ＲＮＡ単離及びＲＴ−ＰＣＲ ＲＮｅａｓｙミニキット（米国Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、イネ葉組織１
５０〜２００ｍｇから全ＲＮＡを単離した。Ｑｉａｇｅｎ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ
Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを用いて、全ＲＮＡから分画されたＰｏｌｙ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡを、１０ｍｅｒランダムプライマー（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
社製）を用いた逆転写酵素介在ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）における
鋳型として使用した。ＲＴ−ＰＣＲは、製造業者（米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製
）により提供されたプロトコルに準じて実施した。次に、増幅ｃＤＮＡを４．５
％配列決定用ゲルにより分離した。
【００２８】 クローニング及びＤＮＡ配列決定 特異的バンドを、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクロー
ニングした。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡシーケンサー（米国カリフォ
ルニア州Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、クローンの配列決定をおこ
なった。配列は、ソフトウエアＤＮＡｓｔａｒ及びＳｅｑｕｅｎｃｅｒ３．０に
より解析した。
【００２９】 結果 ＲＡＮＫ１は、耐性植物において強力に誘発された。 ２８のランダムプライマーを使用して、Ｃ１Ｏ１Ａ５１及びＣＯ３９からｃＤ
ＮＡを増幅した。プライマーＯＰＦ−１（ＡＣＧＧＡＴＣＣＴＧ）をＲＴ−ＰＣ
Ｒ反応に使用したとき、接種耐性植物においてのみ特異的バンド（約６００ｂｐ
）が観察された。これは、接種後４時間と早期に強力に誘発された。このバンド
を、配列決定用ゲルから切断し、同じプライマーを用いて再増幅し、ｐＧＥＭ−
Ｔベクターにクローニングした。このｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列を、配列番
号１に示す。この配列を公知の遺伝子のデータベースと比較して、公知の遺伝子
に対する相同性について探索した。この探索から、この遺伝子（ＲＡＮＫ１）が
コードしているタンパク質の予測されたアミノ酸配列が、シロイヌナズナ（Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子ＲＰＮ１／ＮＩＭ１及び哺乳動物遺伝子ＩκＢファ
ミリーを含むアンキリン反復体を含有するタンパク質と顕著な相同性があること
が分かった（図１）。
【００３０】 一対のＲＡＮＫ１特異的プライマーを設計し、それを使用して第二接種実験か
ら単離したｃＤＮＡを増幅した。増幅ｃＤＮＡをアガロースゲルに流した。６０
０ｂｐ断片が、耐性植物にのみ観察された（図２）。
【００３１】 耐性（Ｃ１Ｏ１Ａ５１）及び感受性（Ｃｏ３９）植物のサザン及びノーザン解
析を、図４及び図５に示すように実施した。
【００３２】 細菌性人工クロモゾーム（ＢＡＣ）ライブラリーからのＲＡＮＫ１ゲノムクロー
ンの単離
【００３３】 ＲＡＮＫ１の部分ｃＤＮＡクローンをプローブとして使用して、インディカ種
ＩＲ６４から作成したＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。６個の陽性Ｂ
ＡＣクローンを同定し、ミニプレペド（ｍｉｎｉｐｒｅｐｅｄ）してさらなるサ
ブクローニングをおこなった。２．０ｋｂサブクローンの配列から、６００ｂｐ
のｃＤＮＡ断片に及ぶ領域にイントロンが存在することが判明し、ＲＡＮＫ１遺
伝子を示している。ＲＡＮＫ１ゲノムクローンの配列を、配列番号２に示す。
【００３４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO: 1 TTGAAGTGTG CCCAAGTACT TCTTGAGGCG GGTGCTGCAG TGGATGCTTT GGACAAGAAC AAGAACACTC CGCTGCATTA CGCCGCTGGC TATGGTATGA AGGGGTGCGT GGATCTTCTG CTGAAGAACG GAGCCGCTGT CACCCTCGAA AACATGGATG GCAAGACGCC CATTGACGTT GCGAAGCTCA ACAACCAGGA TGAGGTTCTC AAGTTGCTGG AAAAGGATGC CTTCCTGTAG ATCGCCTTTG TTATTCTCAT GGGCGCATGA ACAGTTTGGC TCCAGGATCC GTA TACGGATCCT GCTGCACTGA TAAAGTACTG GAATGACCCA GAAACATTTC GAAAGATCAG CCAGGCAATG GGGCCTTTAG GCGGCCCTGA TTTTGCTGAA CCTTCTGGAA CTGAAGGAAC AGAGGAAGAA GGTGAATATG AAGATGAATC TATCGTCCAT CACACTGCCA GTGTTGGTGA TGATGAGG GTCTGAAGAA GGCTTTAGAT GGTGGAGCAG ACAAAGACGA AGAAGACTTG GAGGGCAGAA GGGCCTTACA CTTTGTATGT GGATACGGGG AG SEQ ID NO:2 . TTTACTTTGT TGAAGCTAAA ACTTTGTTAG TTTTTCTGGG GCAGTTCATT GATGATAATC CAGACCTCAC AGGTCAACCA ACAGTCCTCG GTTTCAAAAA AAAAAAAAAA TCCCACAGTA ACCTGTCCCG TTGAACATTG CACAAACTTG TCAGATCTGG TGCACCTCTC GTCTAGCTAT AATAGTATCG AACTATGAGT TTCCATAACC CCGCTGTTTG TATAATTGCA GTTGGTGTGC AATGCTAGAG CACAAAAGTT AATGAACGAC AAACTACCTT TTGATTCATT CTCTTGTGGA TCTAGAATGT GGTGTGAGAC TTTTTTTTTG GGAGCTGCAT CTGCTCCTTG TTCACTGACT AATCAGGATT TGGGTTAAAC TTTTGTTTTT CAGTTGAAGT GTGCCCAAGT ACTTCTTGAG GCGGGTGCTG CAGTGGATGC TTTGGACAAG AACAAGAACA CTCCGCTGCA TTACGCCGCT GGCTATGGTA TGAAGGGGTG CGTGGATCTT TTGCTGAAGA ACGGAGCCGC TGTGTAAGTT AAACCTGCTC GCTTTGCTAG TTGCGATCAC ATCATTTTTT TTGCATTATA TTATTTGACT GTCTCGAATT GCATCGCAGC ACCCTCGAAA ACATGGATGG CAAGACGCCC ATTGACGTTG CGA-GCTCAA CA-CCAGGAT GACCCAGAAA CATTTCGAAA GATCAGCCAG GCAATGGGGC CTTTAGGCGG CCCTGATTTT GCTGAACCTT CTGGAACTGA AGGAACAGAG GAAGAAGGTG AATATGAAGA TGAATCTATC GTCCATCACA CTGCCAGTGT CGGTGATGAT GAGGTAAGGG GGCAGAGTGC TAAGTAGTAC AGCTAAGGAT TTGAAATTAT TACTTCCTCC GTTTCATATT ATAACACTTC CTAGCATTGC CCACATTCAT ATACATGTTA ATGAATCTAG ACATATATGT GCGCCTAGAT TCATTAATAT CTATATGAAT ATGGGCAATG CTAGAAAGTC TTATAACCTGA AACGGAGGT AGTATTGATA TTACTATTTA GTCTCGAGCT TGAGAGTTTG TATATGTTTC TATGTCTTGT TGGTGTGTAA TGTATAATTT ACTAGAGAAG TGTCCATTCG TGTGTGTGTG TATGGTTATA TAATATCTTC AATTACAGTA ATATGCCTCT CCGTTTTGGT TTTGCTCTGA ACAACATGTA TAGGTTTTCG CACAAATTGT GATCTCGATG GCCTTTTCTG TTTCATTGTC AATTCAGCTT GCCTTTCTTT ACAAGTTTAA GTCATCTAAT AGGGTCTGAA GAAAGCTTTA GATGGTGGAG CAGACAAAGA CGAACAACAC TTGGAGGGCA GAAGGGCCTT ACACTTTGTA TGTGGATATG GGGAGGTATG CAAGTCTGCT TAACTAAACC CAATGACAAT TGAAACCTGT GCAAGTAGAA AATGCCGAAT AAATACTACT CCCTCCGTTT CATAATGTAA GTCATTCTAG CATTTTTCAT ATTCATATTC ATGTTTATGA ATCTAGAAAG ACATCAATAT GAATGTGGGA AATGCTAGAA TGACTTACAT TGTGAAACGG AAGAAGTACT ATTACCTATT TGTTGTTATT GCAAATGACA AGGTTAGCAA CTATAAAAAC ATCTCGTTGC GAATCCTGTG CAAAACGGAT TGCATGTATG CGTGACTAGT CTTCAGAAAA TTGCATGTAT GCAATGTGAC AGTTCATTAT GCAAAACGGT GAACCTACTG TTGCCATCAG TATCCCCGAT ACTAATTGAA GTTCTCCTAA TGTTTTCTTT TTTCCTTTTT GGTAATCAGC TAGCGTTGAA TTCAGCTTAG TTGGGGGCTA ACTGTCTTTT TGCATTCTAT GATGAGTTTT GACAAATTTA TTAATTTTAT CTTTTTTTTT TTTTGCTTTT AACACACTTC AAGATATTTT TGGTAGATGG AAAGGTGCAG AGCTTGCTGG
【００３５】 参考文献 Ｂａｅｕｅｒｉｅ（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：１３−２０ Ｂａｌｄｗｉｎ（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：６４
９−６８１ Ｂｅｎｎｅｔ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２７０３−２２７０９ Ｃａｂｏｃｈｅ等（１９９０）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．７９：１７３−
１７６ Ｃａｏ等（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：５７−６３ Ｃｈｒｉｓｔｏｕ等（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７
−９６２ Ｄａｔｔａ等（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４
０ Ｇａｄ等（１９９０）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｉｕｍ ７９
：１７７−１８３ Ｇｏｒｉａｃｈ等（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：６２９−
６４３ ＬａＭａｒｃｏ等（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：７８９−７９２ Ｌｕｏ等（１９８８） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ６（３）：１６５−１７４ Ｍａｎｉａｔｉｓ等 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２） Ｍｏｆｆａｔ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１８０４−１８０５ Ｎｅｕｈａｕｓ等（１９８７）Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７５：３０−３６ Ｒｈｏｄｅｓ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：２０４−２０７ Ｒｙａｌｓ等（１９９７）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９：４２５−４３
９ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ等（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４−２７７ Ｔｏｐｆｅｒ等（１９８９）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：１３３−１
３９ Ｔｏｒｉｙａｍａ等（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． ６：１０７２−
１０７４ Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ等（１９９７）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １６
：１４１３−１４２６ Ｚｈａｎｇ等（１９８８）Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７６：８３５−８４０
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＲＡＮＫ１の予測アミノ酸配列と、アンキリン反復体含有ＩκＢ−Ｅ、ＩκＢ
−α、Ｃａｃｔｕｓ及びＮＰＲ１タンパク質とのアライメントを示す。
【図２】 接種後の耐いもち病植物におけるＮＰＲ１ ＲＮＡの蓄積を示すアガロースゲ
ル電気泳動を示す図である。ＲＡＮＫ１特異的プライマーを使用して、耐性（Ｃ
１０１Ａ５１）及び感受性（ＣＯ３９）植物から単離したｃＤＮＡを増幅した。
【図３】 ＲＡＮＫ１の部分ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列のアライメントを示す。
【図４】 ＲＡＮＫ１遺伝子を有する耐性（Ｃ１０１Ａ５１）及び感受性（Ｃｏ３９）植
物のサザン解析を示す。
【図５】 ＲＡＮＫ１遺伝子を有する耐性（Ｃ１０１Ａ５１）及び感受性（Ｃｏ３９）植
物のノーザン解析を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月１５日（２０００．３．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 耐病害性に関連した植物遺伝子
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野及び背景技術】 作物における菌類病、細菌病及びウイルス病により、収量の減少及び製品品質
の低下が生じ、農業者にとって実質的な損失を招く。例えば、世界中におよぶほ
とんどのイネ栽培領域において生じるしばしば破壊的な病害となるイネいもち病
（ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ）は、農業者にとって１年で５０億ドルの経費となると
推定される（Ｍｏｆｆａｔ、１９９４）。この病害により、特に温帯潅漑及び熱
帯高地イネ生態系において、米の収量が顕著に減少する。耐性品種を使用するこ
とが、この病害の防除にとって最も経済的且つ効果的な方法である。ここ数十年
にわたって、いもち病菌に対する耐性の遺伝学について多くのことが判明した。
数多くの主要な耐性遺伝子が同定され、育種プログラムにおいて広く使用されて
きた。しかしながらこの病原体に対する宿主の耐性の分子メカニズムは、ほとん
ど知られていない。
【０００２】 植物がイネいもち病菌等の病原体により攻撃されるとき、ほとんどの場合、防
御反応バッテリ（ｂａｔｔｅｒｙ）を取り付けることにより、感染を防ぐことが
できる（Ｌｉｎｄｓａｙ等、１９９３）。植物防御の活性は、病原体認識により
生じ、病原体侵入が停止される。系統的に得られた耐性（ＳＡＲ）は、植物が病
原体に対してそれら自体を防御するのに使用する複合システムの一つの重要な成
分である（Ｒｙａｌｓ等、１９９６）。ＳＡＲは、無発病性病原体に対する局部
的過敏性反応（ＨＲ）によりトリガされ、植物の未感染部分を、種々の通常の毒
性病原体に対して耐性とする。ＳＡＲは、広範囲な病原体に対する病原体誘発性
系統耐性であるので、植物−病原体反応の特に重要な概念である。
【０００３】 最近、ＳＡＲの分子面の解読において顕著な進歩がなされた。シロイヌナズナ
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子ＮＰＲ１／ＮＩＭ１が、マップに基づいた手
法を用いてクローニングされた（Ｃａｏ等、１９９７；Ｒｙａｌｓ等、１９９７
）。ＮＰＲＩ／ＮＩＭ１に欠陥を有する変異体は、種々のＳＡＲ誘発処理に応答
せず、病原関連（ＰＲ）遺伝子をほとんど発現せず、且つ感染に対する感受性が
増加する。その遺伝子は、アンキリン反復体を含んでいる新規なタンパク質をコ
ードしており、哺乳動物シグナル伝達因子ＩκＢサブクラスａに対して相同性を
示す。このことは、ＲＰＮ１／ＮＩＭ１がＮＦ−κＢ関連転写因子と相互作用し
て、ＳＡＲ遺伝子発現を誘発し、耐病害性をトリガする可能性を示唆している（
Ｒｙａｌｓ等、１９９７）。
【０００４】 アンキリン反復体は、転写因子、細胞分化分子及び構造タンパク質を含む多様
な機能の多数のタンパク質に存在する３３アミノ酸モチーフである （Ｂｅｎ ｎｅｔ、１９９３）。アンキリン モチーフ コンセンサス（Ａｎｋｙｒｉｎ
ｍｏｔｉｆ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列は、配列番号１１に示すように、以下の
アミノ酸配列を含む： −Ｄ−−−−Ｇ−ＴＰＬＨ−ＡＡ−−−−−−−Ｖ−−ＬＬ−−ＧＡ− （ＬａＭａｒｃｏ、１９９１）。このモチーフは、タンパク質の相互作用を媒介
することが示され、通常、タンデムアレーに４〜７コピー存在している（Ｍｉｃ
ｈａｅｌｙ及びＢｅｎｎｅｔｔ、１９９３）。アンキリン反復体含有タンパク質
は、多様な機能を有すること、及びタンパク質間相互作用に関与していることが
判明した。哺乳動物におけるこれらのタンパク質の一部は、ＮＦ−κＢ、インヒ
ビターＩκＢ等の転写調整タンパク質である（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａ、１９９６；
Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ等、１９９７）。ＮＦ−κＢ／Ｉκβシグナル伝達経路は、
哺乳動物とハエの両方に保存される。ＩＬ−１処理又は細菌接種等の刺激により
、シグナル伝達経路が活性化される。これは、Ｉκβ又はその同族物の分解及び
ＮＦ−κＢ転写因子が核に放出されて転写を刺激するためである（Ｂａｅｕｅｒ
ｉｅ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９６；Ｂａｌｄｗｉｎ、１９９６）。シロイ
ヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において、ＮＦ−κＢインヒビターＩκＢ
と相同であるＮＰＲ１／ＮＩＭ１は、ＳＡＲの開始を制御する。ＮＰＲ１／ＮＩ
Ｍ１により標的とされている転写因子は、直接作用又は間接作用によりＳＡＲ遺
伝子発現及び病害耐性のレプレッサとしての役割を果たす（Ｒｙａｌｓ等、１９
９７）。
【０００５】 ＳＡＲは、感染性病原体に対する重要な植物防御メカニズムである。例えば、
ＳＡＲが植物をイネいもち病から防御することができることが実証された。ＳＡ
Ｒインデューサ、ベンゾ（１，２，３）チアジアゾール−７−カルボチオン酸Ｓ
−メチルエステル（「ＢＨＴ」）は、野外条件でいもち病を防除するのに有効で
あることが判明した。
【０００６】 （発明の概要） 耐いもち病性植物から、アンキリン反復体を含有する新規なタンパク質をコー
ドする遺伝子を単離した。イネアンキリン反復体（ｒｉｃｅ ａｎｋｙｒｉｎ
ｒｅｐｅａｔｓ）からこの遺伝子を「ＲＡＮＫ１」と称し、この遺伝子は、シロ
イヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子ＮＰＲ１／ＮＩＭ１及び哺乳動物
シグナル伝達因子インヒビターＩ−κＢと顕著に相同である。ＲＡＮＫ１遺伝子
は、いもち病病原体感染並びにＳＡＲを介して応答する他の病害に対するイネの
防御において重要な役割を果たしていると思われるタンパク質をコードしている
。ＲＰＮ１／ＮＩＭ１とＲＡＮＫ１との両方の遺伝子がアンキリン反復体をコー
ドしているので、これらの反復体は、植物病害、とりわけイネいもち病に対する
ＳＡＲ誘発耐性に関与することができると思われる。
【０００７】 したがって、本発明によれば、その一態様において、配列番号１〜４（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１〜４）を含んでなる配列を有する単離核酸が提供される。
【０００８】 本発明によれば、別の態様において、配列番号１〜４を含んでなる核酸を含む
、植物細胞中で機能する組換えＤＮＡ発現ベクターが提供される。
【０００９】 第三の態様によれば、配列番号１〜４を含んでなる配列を有する核酸で安定的
に形質転換された植物細胞が提供される。
【００１０】 さらに別の態様によれば、配列番号１〜４を含んでなる配列を有する核酸で形
質転換された遺伝子導入植物が提供される。
【００１１】 さらに本発明によれば、単子葉植物に耐病害性を付与する方法であって、アン
キリン モチーフ配列を含み、タンパク質をコードしている配列を有する核酸を
、その植物のゲノムに安定的に組込む工程を含んでなる、方法が提供される。
【００１２】 本発明の別の態様によれば、単子葉植物に耐イネいもち病性を付与する方法であ
って、アンキリン モチーフ配列を含み、タンパク質をコードしている配列を有
する核酸を、その植物のゲノムに安定的に組込む工程を含んでなる、方法が提供
される。
【００１３】
【発明の詳細な説明】 本発明は、イネいもち病に対する耐性を付与する単離核酸に関する。この核酸
は、アンキリン反復体を有すると予測されるタンパク質をコードしている。また
、この核酸は、有利にも配列番号１〜４のヌクレオチド配列を有している。しか
しながら、このヌクレオチド配列は、同じタンパク質をなおコードしながら遺伝
子コードの縮重によりなされるような変更が可能であることが分かるであろう。
植物中での遺伝子の発現は、配列番号１〜４に示されている一つ以上のコドンを
、核酸を挿入する植物に好ましいコドンで置き換えることにより高めることがで
きる。
【００１４】 該核酸は、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて植物又はバクテリア細胞に組み込
むことができる。一般的に、このような方法には、該核酸をＤＮＡ発現ベクター
に挿入する工程が含まれる。このようなベクターは、挿入タンパク質をコードし
ている配列の転写及び翻訳に必要な因子、並びに形質転換細胞又は植物の選択を
容易にするための一種以上のマーカー配列を含むことが有利である。
【００１５】 多数の植物活性プロモータが、当該技術分野において公知であり、ここで開示
されている核酸配列の効果的な発現をおこなうのに使用できる。適当なプロモー
タとしては、例えば、ｎｏｓプロモータ、小サブユニットクロロフィルＡ／Ｂ結
合ポリペプチド、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモータ及び植物遺
伝子から単離されたプロモータなどがある。プロモータは、形質転換される植物
の種類によって単離できる。また、３５Ｓ又はアクチンプロモータは、単離され
たｃＤＮＡクローン用にも使用できる。また、これらは、遺伝子の過発現を試験
するのにも有用である。
【００１６】 本発明の核酸を一旦発現ベクターにクローニングすると、植物細胞に形質転換
できる状態となる。用語「植物細胞」は、植物由来のいずれの細胞をも含み、こ
れには、未分化組織、例えば、カルス及び懸濁培養だけでなく、植物種、花粉又
は植物胎芽も含まれる。形質転換に適当な植物組織には、葉組織、根組織、分裂
組織、プロトプラスト、胚軸子葉、胚盤、茎端、根、未成熟胚芽、花粉及び葯（
ａｎｔｈｅｒ）などがある。
【００１７】 植物を本発明による病害耐性を付与する核酸で形質転換する一つの方法に、こ
のような植物の組織を、本発明による核酸を含んでなるベクターで形質転換した
バクテリア接種源と接触させることがある。一般的に、この方法には、植物組織
に、バクテリア懸濁液を接種し、抗生物質なしで２５〜２８℃で再分化培養液に
よりその組織を４８〜７２時間インキュベーションする工程が含まれる。
【００１８】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属由来のバクテリアを利用して、植物細胞を形質
転換できる。このようなバクテリアの適当な種には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅ
ｎｓなどがある。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（例え
ば、ＬＢＡ４４０４又はＥＨＡ１０５菌株）は、植物を形質転換する能力が知ら
れており、特に有用である。
【００１９】 植物細胞を本発明の核酸で形質転換する別の手法では、植物細胞に不活性又は
生物学的に活性な粒子を推進させる工程を含む。この手法は、米国特許第４，９
４５，０５０号、第５，０３６，００６号、及び第５，１００，７９２号（これ
らの米国特許全ての発明者はＳａｎｆｏｒｄ等）に開示されており、引用するこ
とにより本発明で開示されたものとする。一般的に、この方法では、不活性又は
生物学的に活性な粒子を、その細胞に、細胞の外表面に浸透させ且つその内部に
組込むのに有効な条件下で推進させることを含む。不活性粒子を利用するときに
は、粒子に病害耐性を付与する核酸を含有するベクターをコーティングすること
によりベクターを細胞中に導入できる。生物学的に活性な粒子（例えば、導入し
ようとするＤＮＡを含有する、乾燥酵母細胞、乾燥バクテリア又はバクテリオフ
ァージ）を、植物細胞組織に推進させることもできる。
【００２０】 植物細胞を形質転換する別の方法に、エレクトロポレーション法がある。この方
法では、プロトプラストと所望の核酸とを混合することと、電気パルスにより細
胞膜に孔を形成して細胞にＤＮＡを導入できるようにすることにより、細胞を形
質転換することを含む。この方法は、現在では高い再現性があり、種々の遺伝子
が、この方法により単子葉、とりわけイネ植物に導入された（Ｔｏｒｉｙａｍａ
等（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ等（１９８９）；Ｒｈｏｄｅｓ等（１９８
８））。
【００２１】 エレクトロポレーションに類似した方法に、所望の遺伝子とプロトプラストと
を混合し、得られた混合物を、ＰＥＧで処理することにより、遺伝子をプロトプ
ラストに導入する方法がある。この方法は、エレクトロポレーション法とは、ポ
リエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を、電気パルスの代わりに用いる点が異な
る（Ｚｈａｎｇ Ｗ等（１９８８）；Ｄａｔｔａ等（１９９０）；Ｃｈｒｉｓｔ
ｏｕ等（１９９１））。
【００２２】 他の方法としては、１）種子又は胚芽を核酸と培養する方法（Ｔｏｐｆｅｒ
Ｒ等（１９８９）；Ｌｅｄｏｕｘ等（１９７４））、２）花粉管を処理する方法
（Ｌｕｏ等（１９８８））、３）リポソーム法（Ｃａｂｏｃｈｅ（１９９０）；
Ｇａｄ等（１９９０））、４）マイクロインジェクション法（Ｎｅｕｈａｕｓ等
（１９８７））などがある。
【００２３】 形質転換植物細胞から植物に再分化する公知の方法を、本発明の遺伝子導入植
物を調製するのに使用できる。一般的に、外植片、カルス組織又は懸濁培養を、
適当な化学的環境（例えば、サイトカイニン及びオーキシン）に暴露して、新し
く成長した細胞が分化し、胚芽を生じた後、根及び苗条に再分化するようにでき
る。
【００２４】 本発明の核酸配列を使用して、単子葉植物に、ＳＡＲにより調節された、イネ
いもち病及び他の病害に対する耐性を付与することができる。このような植物に
は、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ及びアスパラガスなどがあるが、こ
れらには限定されない。
【００２５】 本発明を、以下実施例によりさらに詳細に説明するが、これらは説明の目的で
なされるものであり、本発明は、これらの実施例に限定されない。
【００２６】
【実施例】 材料及び方法 イネ植物及びいもち病接種： Ｐｉ−２遺伝子を担持している耐性同質遺伝子系統Ｃ１Ｏ１Ａ５１と、感受性
品種ＣＯ３９とを、実験に使用した。３週齢のイネ植物に、単離ＰＯ６−６を接
種し、デューチャンバーに２６℃で２４時間保持した。葉組織を、接種０時間、
４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間後に両方の品種から
採取した。
【００２７】 ＲＮＡ単離及びＲＴ−ＰＣＲ ＲＮｅａｓｙミニキット（米国Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、イネ葉組織１
５０〜２００ｍｇから全ＲＮＡを単離した。Ｑｉａｇｅｎ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ
Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを用いて、全ＲＮＡから分画されたＰｏｌｙ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡを、１０ｍｅｒランダムプライマー（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
社製）を用いた逆転写酵素介在ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）における
鋳型として使用した。ＲＴ−ＰＣＲは、製造業者（米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製
）により提供されたプロトコルに準じて実施した。次に、増幅ｃＤＮＡを４．５
％配列決定用ゲルにより分離した。
【００２８】 クローニング及びＤＮＡ配列決定 特異的バンドを、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクロー
ニングした。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡシーケンサー（米国カリフォ
ルニア州Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、クローンの配列決定をおこ
なった。配列は、ソフトウエアＤＮＡｓｔａｒ及びＳｅｑｕｅｎｃｅｒ３．０に
より解析した。
【００２９】 結果 ＲＡＮＫ１は、耐性植物において強力に誘発された。 ２８のランダムプライマーを使用して、Ｃ１Ｏ１Ａ５１及びＣＯ３９からｃＤ
ＮＡを増幅した。プライマーＯＰＦ−１（ＡＣＧＧＡＴＣＣＴＧ）をＲＴ−ＰＣ
Ｒ反応に使用したとき、接種耐性植物においてのみ特異的バンド（約６００ｂｐ
）が観察された。これは、接種後４時間と早期に強力に誘発された。このバンド
を、配列決定用ゲルから切断し、同じプライマーを用いて再増幅し、ｐＧＥＭ−
Ｔベクターにクローニングした。このｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列を、配列番
号１〜４に示す。この配列を公知の遺伝子のデータベースと比較して、公知の遺
伝子に対する相同性について探索した。この探索から、この遺伝子（ＲＡＮＫ１
）がコードしているタンパク質の予測されたアミノ酸配列が、シロイヌナズナ（
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子ＲＰＮ１／ＮＩＭ１及び哺乳動物遺伝子Ｉκβ
ファミリーを含むアンキリン反復体を含有するタンパク質と顕著な相同性がある
ことが分かった（図１）。
【００３０】 一対のＲＡＮＫ１特異的プライマーを設計し、それを使用して第二接種実験か
ら単離したｃＤＮＡを増幅した。増幅ｃＤＮＡをアガロースゲルに流した。６０
０ｂｐ断片が、耐性植物にのみ観察された（図２）。
【００３１】 耐性（Ｃ１Ｏ１Ａ５１）及び感受性（Ｃｏ３９）植物のサザン及びノーザン解
析を、図４及び図５に示すように実施した。
【００３２】 細菌性人工クロモゾーム（ＢＡＣ）ライブラリーからのＲＡＮＫ１ゲノムクロー
ンの単離
【００３３】 ＲＡＮＫ１の部分ｃＤＮＡクローンをプローブとして使用して、インディカ種
ＩＲ６４から作成したＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。６個の陽性Ｂ
ＡＣクローンを同定し、ミニプレペド（ｍｉｎｉｐｒｅｐｅｄ）してさらなるサ
ブクローニングをおこなった。２．０ｋｂサブクローンの配列から、６００ｂｐ
のｃＤＮＡ断片に及ぶ領域にイントロンが存在することが判明し、ＲＡＮＫ１遺
伝子を示している。ＲＡＮＫ１ゲノムクローンの配列を、配列番号５に示す。
【００３４】 参考文献 Ｂａｅｕｅｒｉｅ（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：１３−２０ Ｂａｌｄｗｉｎ（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：６４
９−６８１ Ｂｅｎｎｅｔ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２７０３−２２７０９
Ｃａｂｏｃｈｅ等（１９９０）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．７９：１７３−
１７６ Ｃａｏ等（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：５７−６３ Ｃｈｒｉｓｔｏｕ等（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７
−９６２ Ｄａｔｔａ等（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４
０ Ｇａｄ等（１９９０）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｉｕｍ ７９
：１７７−１８３ Ｇｏｒｉａｃｈ等（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：６２９−
６４３ ＬａＭａｒｃｏ等（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：７８９−７９２ Ｌｕｏ等（１９８８） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ６（３）：１６５−１７４ Ｍａｎｉａｔｉｓ等 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２） Ｍｏｆｆａｔ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１８０４−１８０５ Ｎｅｕｈａｕｓ等（１９８７）Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７５：３０−３６ Ｒｈｏｄｅｓ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：２０４−２０７ Ｒｙａｌｓ等（１９９７）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９：４２５−４３
９ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ等（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４−２７７ Ｔｏｐｆｅｒ等（１９８９）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：１３３−１
３９ Ｔｏｒｉｙａｍａ等（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． ６：１０７２−
１０７４ Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ等（１９９７）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １６
：１４１３−１４２６ Ｚｈａｎｇ等（１９８８）Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７６：８３５−８４０
【０００１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING (l) GENERAL INFORMATION (i) APPLICANT: Institute of Molecular Agrobiology (ii) TITLE OF THE INVENTION: Plant Gene Associated with Gene Resistanc
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Gly Gly Pro Glu Pro Gly Arg 85 90 95 Gly Thr Ser Gln Gly Leu Ala Cys Leu His Ile Ala Thr Leu Gln Lys 100 105 110 Asn Gln Pro Leu Met Glu Leu Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asp Ile Asp 115 120 125 Val Gln Glu Gly Ser Gly Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Val Glu Thr 130 135 140 Gln Glu Arg Gly Leu Val Gln Phe Leu Leu Gln Ala Gly Ala Gln Val 145 150 155 160 Asp Ala Arg Met Leu Asn Gly Cys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gly 165 170 175 Arg Gly Leu Met Gly Ile Ser Ser Thr Leu Cys Lys Ala Gly Ala Asp 180 185 Ser Leu Leu Arg Asn Val 195 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 165 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8: Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala 1 5 10 15 Leu Thr Met Glu Val Ile Arg Gln Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu 20 25 30 Asn Leu Gln Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro 35 40 45 Glu Ile Ala Glu Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg 50 55 60 Asp Phe Arg Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Phe Gln Gly Cys 65 70 75 80 Leu Ala Ser Val Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu 85 90 95 His Ser Ile Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Ile His Gly 100 105 110 Tyr Leu Gly Ile Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Glu Pro Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala Val Asp Leu 130 135 140 Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly Ala Asp Val 145 150 155 160 Asn Arg Val Thr Tyr 165 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 165 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9: Asp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Ile Ser Gly Ser Val Asp 1 5 10 15 Val Val Ala Ala Leu Ile Arg Met Ala Pro His Pro Cys Leu Leu Asn 20 25 30 Ile Val Ala Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Thr Ala Gln Pro 35 40 45 Asn Ile Met Arg Ile Leu Leu Leu Ala Gly Ala Glu Pro Thr Val Arg 50 55 60 Asp Arg Asp Gly Glu Arg Cys Val His Leu Ala Ala Glu Ala Gly His 65 70 75 80 Ile Asp Ile Leu Arg Leu Leu Val Ser His Gly Ala Asp Ile Asn Ala 85 90 95 Arg Glu Gly Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Ile Ala Ile Glu Gly Cys 100 105 110 Asn Glu Asp Leu Ala Asn Phe Leu Leu Asp Glu Cys Glu Lys Leu Asn 115 120 125 Leu Glu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Ala Tyr Gln Phe Ala Cys Ile Met 130 135 140 Asn Lys Ser Arg Met Gln Asn Ile Leu Glu Lys Arg Gly Ala Glu Thr 145 150 155 160 Val Thr Pro Pro Asp 165 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 165 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10: Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val 1 5 10 15 Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg 20 25 30 Val Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp Val 35 40 45 Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu Ala 50 55 60 Asn Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser 65 70 75 80 Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu 85 90 95 Gly Leu Glu Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn 100 105 110 Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn 115 120 125 His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg 130 135 140 Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala 145 150 155 160 Ser Glu Ala Thr Leu 165 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 32 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) FEATURE: Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Xaa Ala Ala Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Leu Leu Xaa Xaa Gly Ala Xaa 20 25 30
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＲＡＮＫ１の予想アミノ酸配列（配列番号６）と、アンキリン反復体含有Ｉκ
β−Ｅ（配列番号７）、Ｉκβ−α（配列番号８）、Ｃａｃｔｕｓ（配列番号９
）及びＮＰＲ１（配列番号１０）タンパク質とのアライメントを示す。
【図２】 接種後の耐いもち病植物におけるＮＰＲ１ ＲＮＡの蓄積を示すアガロースゲ
ル電気泳動を示す図である。ＲＡＮＫ１特異的プライマーを使用して、耐性（Ｃ
１０１Ａ５１）及び感受性（ＣＯ３９）植物から単離したｃＤＮＡを増幅した。
【図３】 ＲＡＮＫ１の部分ｃＤＮＡ（配列番号１〜４）及びゲノムＤＮＡ（配列番号５
）のアライメントを示す。
【図４】 ＲＡＮＫ１遺伝子を有する耐性（Ｃ１０１Ａ５１）及び感受性（Ｃｏ３９）植
物のサザン解析を示す。
【図５】 ＲＡＮＫ１遺伝子を有する耐性（Ｃ１０１Ａ５１）及び感受性（Ｃｏ３９）植
物のノーザン解析を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，１ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ Ｌｉｎｋ，Ｓｉｎｇａｐｏｒ ｅ 117604，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ (72)発明者 ワン、グオーリャン シンガポール国シンガポール 117604，リ サーチ・リンク １，ナショナル・ユニバ ーシティー・オブ・シンガポール Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA04 GA11 4B065 AA88X AA88Y AA89X AB01 AC14 BA02 CA24 CA53 4H045 AA10 BA10 CA31 EA05 FA72 FA74

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含んでなる配列を有
    する単離核酸。
  2. 【請求項２】配列番号１を含んでなるヌクレオチド配列によってコードされ
    るタンパク質をコードする配列を有する単離核酸。
  3. 【請求項３】植物において活性なプロモータに有効に結合している、請求項
    １に記載の単離核酸。
  4. 【請求項４】前記植物が、単子葉植物である、請求項３に記載の単離核酸。
  5. 【請求項５】前記植物が、イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ及びアス
    パラガスからなる群から選択されるものである、請求項３に記載の単離核酸。
  6. 【請求項６】請求項１に記載の核酸を含み、植物細胞中で機能する組換えＤ
    ＮＡ発現ベクター。
  7. 【請求項７】前記植物が、単子葉植物である、請求項６に記載の組換えＤＮ
    Ａ発現ベクター。
  8. 【請求項８】前記植物が、イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ及びアス
    パラガスからなる群から選択されるものである、請求項５に記載の組換えＤＮＡ
    発現ベクター。
  9. 【請求項９】その植物で発現する配列番号１を含んでなる核酸を、単子葉植
    物のゲノムに安定的に組込む工程を含んでなる、遺伝子導入単子葉植物の製造方
    法。
  10. 【請求項１０】配列番号１を含んでなる核酸を単子葉植物のゲノムに安定的に
    形質転換する工程を含んでなる、単子葉植物に耐病性を付与する方法。
  11. 【請求項１１】配列番号１を含んでなる核酸を単子葉植物のゲノムに安定的
    に形質転換する工程を含んでなる、イネに耐イネいもち病性を付与する方法。
  12. 【請求項１２】前記単子葉植物が、イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ
    及びアスパラガスからなる群から選択されるものである、請求項９，１０及び１
    １のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】配列番号１の核酸配列を含んでなるヌクレオチド配列で安定
    的に形質転換された植物細胞。
  14. 【請求項１４】配列番号１を含んでなるヌクレオチド配列を含み、植物ゲノ
    ムに安定的に組込まれた核酸と、 前記配列が発現されるように前記核酸配列に有効に結合している植物プロモー
    タと、 を含んでなる遺伝子導入植物。
  15. 【請求項１５】前記植物が、単子葉植物である、請求項１４に記載の遺伝子
    導入植物。
  16. 【請求項１６】前記単子葉植物が、イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ
    及びアスパラガスからなる群から選択されるものである、請求項１４に記載の遺
    伝子導入植物。
  17. 【請求項１７】アンキリン モチーフ コンセンサス（ankyrin motif con
    sensus）配列を含み、タンパク質をコードしている配列を有する核酸を、その植
    物のゲノムに安定的に組込む工程を含んでなる、単子葉植物に耐病性を付与する
    方法。
  18. 【請求項１８】前記単子葉植物が、イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ
    及びアスパラガスからなる群から選択されるものである、請求項１７に記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】アンキリン モチーフ コンセンサス配列を含み、タンパク
    質をコードしている配列を有する核酸を、その植物のゲノムに安定的に組込む工
    程を含んでなる、単子葉植物に耐イネいもち病性を付与する方法。
  20. 【請求項２０】前記単子葉植物が、イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ
    及びアスパラガスからなる群から選択されるものである、請求項１９に記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】配列番号２を含んでなる配列を有する単離核酸配列。
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