KR101495898B1

KR101495898B1 - 식물 내 인디고이드 함량 증대용 조성물 및 이를 이용한 인디고이드 함량 증가방법

Info

Publication number: KR101495898B1
Application number: KR20130036361A
Authority: KR
Inventors: 김수언; 제하오 진; 김진희; 홍성호; 권문혁; 김관수
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 목포대학교산학협력단
Priority date: 2012-04-03
Filing date: 2013-04-03
Publication date: 2015-02-25
Also published as: KR20130113991A

Abstract

본 발명은 식물 내 인디고이드 함량 증대용 조성물 및 이를 이용하여 인디고 생산 식물 내 인디고이드 함량을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 특히 인디고 생산 식물인 쪽(P. tinctorium), 인디고페라(indigofera tinctorium) 속 식물, 대청(Isatis tinctoria) 속 내 인디고이드 축적량을 무처리군에 비해 대략 두 배에 달할 정도로 현저히 증가하도록 유도할 수 있으므로 본 발명의 조성물 및 방법은 인디고 식물의 상업적 경작에 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한 본 발명에 따라 천연 인디고의 생산량을 현저히 증가시킬 수 있어 염료 분야뿐만 아니라, 비누, 화장품, 기타 의약분야에 이르기까지 천연 인디고를 이용한 다양한 고부가가치 상품의 개발이 가능할 것이다.

Description

식물 내 인디고이드 함량 증대용 조성물 및 이를 이용한 인디고이드 함량 증가방법{COMPOSITION FOR INCREASING INDIGOID CONTENTS IN INDIGO PLANTS AND METHOD OF INCREASING INDIGOID CONTENTS IN INDIGO PLANTS USING THE SAME}

본 발명은 식물 내 인디고이드 함량 증대용 조성물 및 이를 이용하여 식물 내 인디고이드 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

쪽(Polygonum tinctorium Lour.= Persicaria tinctoria H. Gross)은 다른 극동지역 국가뿐만 아니라 한국에서도 가장 중요한 인디고 염료 식물로 사용되어 왔다(Kim et al. Production of indoxyl derivatives in indole-supplemented tissue cultures of Polygonum tinctorium. Planta Med 62, 54-56, 1996). 최근의 천연 염료 사용에 관한 급증하는 관심은 전통적인 인디고 염색을 실현 가능한 사업으로 부흥시켰다.

약 백여 년 전 값싼 합성 인디고의 사용으로 인해 염료 작물의 중요성은 감소하였음에도 불구하고, 천연 인디고 염료의 심미적인 색상은 특히 일본에서 인디고 식물의 경작을 현재까지 이어지도록 하였으며, 화학적 인디고 염색 공정으로 인한 잠재적 환경훼손에 대한 우려로 인하여 천연 직물 염색 또한 대중으로부터 주의를 끌었다.

대청( Isatis ) 속에 속하는 종이 중요한 염료 작물인 유럽 국가들에서, 인디고 염색 산업은 현대 농학(Angelini et al. Differences in leaf yield and indigo precursors production in woad (Isatis tinctoria L.) and Chinese woad (Isatis indigotica Fort.) genotypes. Field Crops Res 101, 285-295, 2007) 및 미생물학(Padden et al. An indigo-reducing moderate thermophile from a woad vat, Clostridium isatidis sp. nov. Int J Syst Bacteriol 49, 1025-1031, 1999)의 적용으로 인해 틈새시장을 구축하였으며, 천연 인디고 염색의 역사적인 중심지인 한국의 나주 시는 천연 인디고 산업을 고부가가치 사업으로 여겨 그 지역에 환금작물로서 쪽(P. tinctorium)을 경작할 것을 장려하고 있다.

천연 인디고는 항균 활성이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 최근 연구에 따르면 이러한 항균 활성은 인디고 그 자체로 인한 것이라기보다는 다른 인독실 유도체인 트립탄트린 (tryptanthrin)에 기인한 것임을 시사하고 있다 (Kataoka et al. Antibacterial action of tryptanthrin and kaempferol, isolated from the indigo plant (Polygonum tinctorium Lour.), against Helicobacter pylori-infected Mongolian gerbils. J Gastroenterol 36, 5-9, 2001).

살리실산은 초식동물의 공격이나 병원균과 같은 생물적 스트레스와 식물 반응을 매개한다고 알려져 있다. 다른 것들 중에서도 특히 벤조(1,2,3)티아디아졸

-7-카보티온산 S-메틸 에스테르(Benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carbothionic acid S-methyl ester; BTH), 2,6-디클로로이소니코틴산 (2,6-dichloroisonicotinic acid; INA), 및 아시벤졸라-S 메틸(acibenzolar-S methyl; ASM)는 식물에 궁극적으로 전신저항성(systemic acquired resistance; SAR)을 부여하는 유전자의 활성화를 이끌어내기 위해 살리실산(SA)을 모방하는 것으로 알려져 있다(Gozzo, Systemic acquired resistance in crop protection: from nature to a chemical approach. J Agric Food Chem 51, 4487-4503, 2003). 따라서, 이들 "전신저항성(SAR)유도제(또는 식물 방어 활성화제)"를 처리하는 것은 식물이 그들 자신을 병원균의 공격으로부터 보호하도록 도와준다.

SAR 유도는 병인 관련 단백질(pathogenesis-related proteins; PR protein)의 발현, 활성 산소의 축적 및 파이토알렉신(phytoalexin) 생합성과 같은 다양한 세포 반응을 포함한다. 그러나 상기 활성화제 처리는 식물의 적응 비용의 분배 문제로 인해 식물의 심각한 성장 지연을 야기하였다(Heil et al. Reduced growth and seed set following chemical induction of pathogen defense: does systemic acquired resistance incur allocation costs? J Ecol 88, 645-654, 2000). 그럼에도 불구하고, 현재 이러한 활성화제의 신중한 사용은 다양한 과채류 및 엽채류의 균류, 박테리아 및 바이러스로 인한 질환을 예방하기 위해 적용되는 농산물 관리의 한 부분이다.

그러나, 이러한 전신저항성 유도제를 특정 이차대사산물의 축적을 유도하기 위한 용도로 사용하는 것은 아직까지 알려져 있지 않다.

이에 본 발명은 상기 종래기술에 대한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 전신저항성 유도제를 포함하는, 식물 내 인디고이드 함량 증대용 조성물 및 이를 이용하여 식물 내 인디고이드 함량을 증가시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명의 바람직한 일 구현예는, 식물의 전신저항성(systemic acquired resistance; SAR) 유도제를 포함하는, 식물 내 인디고이드 함량 증대용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 바람직한 다른 일 구현예는,

1) 인디고이드 생산 식물 준비단계; 및

2) 상기 식물에 전신저항성(systemic acquired resistance; SAR) 유도제를 제공하는 단계를 포함하는 인디고 생산 식물 내 인디고이드 함량 증가 방법을 제공한다.

또한 본 발명의 바람직한 또 다른 일 구현예는, 상기 방법에 따라 인디고이드 함량이 30% 이상 증가된 식물체를 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

인디고(indigo 또는 indigotin; C₁₆H₁₀O₂N₂)는 지금까지 알려져 있는 가장 오래된 천연 염료이며, 이와 같은 인디고 및 그 이성질체로부터 생산되는 염료를 총칭하여 인디고이드 염료(indigoid dye)라 한다.

천연 인디고는 식물로부터 얻어질 수 있는데, 인디고를 생산하는 식물로는 천연 쪽(Polygonum tinctorium); 인디고페라 틴크토리아(Indigofera tinctoria), 인디고페라 과테말렌시스(Indigofera guatemalensis), 인디고페라 아닐(Indigofera anil/Indigofera suffruticosa) 등과 같은 인디고페라 속 식물; 및 초대청(Isatis indigotica Fort), 대청람(Isatis oblongat D.C.), 숭람(Isatis tinctoria/woad) 등과 같은 대청 속 식물이 주로 알려져 있으며, 그 외에도 네리움 틴토리움(Nerium tinctorium Roxb), 요루바쪽(Lonchocarpus cyanescens), 야코비니아 틴크토리아(Jacobinia tinctoria), 류큐쪽(Strobilanthes flaccidfolius) 등 세계 각지에 23과 100 종류 이상이 확인되고 있다.

상기 인디고 식물은 인디고를 비롯한 인디고이드 염료를 직접적으로 생산하지는 않으며, 대신 인독실 글리코시드(glycosides)(예컨대, 쪽(Polygonum tinctorium) 및 인디고페라 속(Indigofera sps.)의 경우 인디칸(Indican), 이사티스(Isatis sps.)의 경우 이사탄(isatan))를 액포 내에 축적한다(Kim et al. Production of indoxyl derivatives in indole-supplemented tissue cultures of Polygonum tinctorium . Planta Med 62, 54-56, 1996). 상기 글리코시드가 액포로부터 나오면 인독실로 가수분해되며, 이는 다시 산화 및 결합되어 인디고 및 인디루빈을 형성하게 된다. 이 중 천연 염료 내 붉은색 불순물인 인디루빈(indirubin)은 항백혈병 활성으로 인해 주목을 받았으며, 최근 그 작용기작이 제안되었다 (Eisenbrand et al. Molecular mechanisms of indirubin and its derivatives: novel anticancer molecules with their origin in traditional Chinese phytomedicine. J Cancer Res Clin Oncol 130, 627-635, 2007).

본 명세서에서 인디고이드(indigoid)란 상술한 바와 같은 인독실 글리코시드는 물론이고 인디고, 인디루빈 등의 인디고 이성체, 기타 인독실 이합체화(indoxyl dimerization) 산물들을 모두 포함하는 의미로 사용되며, 인독실 이합체화의 주 생성물은 인디고이므로 좁은 의미로 바람직하게는 인디고를 의미한다.

식물의 전신저항성(systemic acquired resistance; SAR)이란 병원균으로부터 자신을 보호하기 위하여 식물이 사용하는 복합 시스템 중 하나로서, SAR 유도는 병원균 관련 단백질(pathogenesis-related proteins; PR protein)의 발현, 활성 산소의 축적 및 파이토알렉신(phytoalexin) 생합성과 같은 다양한 세포 반응을 모두 포함한다.

본 발명자들의 연구 결과, 상술한 바와 같은 식물의 전신저항성(SAR)을 유도하는 물질(전신저항성 유도제 또는 식물 방어 활성화제)이 본래의 용도인 식물 방어 기작을 활성화시키는 작용뿐만 아니라, 식물, 특히 인디고 생산 식물에 제공될 경우 식물 내 인디고이드 함량을 현저히 증가시키는 효과가 또한 있음을 최초로 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따라, 식물의 전신저항성(systemic acquired resistance; SAR) 유도제를 포함하는, 식물 내 인디고이드 함량 증대용 조성물이 제공되며, 또한 이를 이용하여 식물 내 인디고이드 함량을 증가시키는 방법이 제공된다.

상기 전신저항성 유도제는 바람직하게는　벤조(1,2,3)티아디아졸 화합물을 사용할 수 있다. 상기 벤조(1,2,3)티아디아졸 화합물은 벤조(1,2,3)티아디아졸을 기본 구조로 하는 다양한 유도체가 될 수 있으며, 바람직하게는 벤조(1,2,3)티아디아졸-7-카보티온산 S-메틸 에스테르(Benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carbothionic acid S-methyl ester; BTH)를 포함하는 벤조(1,2,3)티아디아졸-7-카복실레이트(Benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carboxylate) 및 이의 에스터(ester) 유도체와, 벤조(1,2,3)티아디아졸-7-카보티오네이트(Benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carbothionate) 및 이의 티오에스터(thioester) 유도체, 벤조(1,2,3)티아디아졸-7-카복사마이드(Benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carboxamide) 및 이의 N-유도체 등이 될 수 있으며, 이외에도 예컨대, 미국 특허 제5,523,311호 및 제5,614,395호에 기재된 다양한 벤조(1,2,3)티아디아졸 유도제를 사용할 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 전신저항성 유도제는 2,6-디클로로이소니코틴산 (2,6-dichloroisonicotinic acid; INA)과 같은 이소니코틴산 화합물 및 이의 저급 알킬 에스테르, 아시벤졸라-S 메틸(acibenzolar-S methyl; ASM), 베타-아미노부티르산(β-aminobutryric acid; BABA) 및 티아민(Thiamine; Vitamine B1)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않고 당 분야에 알려진 다양한 SAR 유도제를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 인디고이드 함량 증대용 조성물은 상기 전신저항성 유도제를 0.01 내지 3mM의 농도로 포함하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.5 mM의 농도로 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 조성물은 전신저항성 유도제 외에도 농약 제조 분야에서 널리 사용되는 부가성분으로서 약품의 물에 대한 용해를 도와주는 유화제 및/또는 약품이 식물에 달라 붙도록 하기 위한 전착제 등의 부가성분을 함께 포함할 수 있다.

상기 범위에 미달하는 농도로 전신저항성 유도제를 사용하는 경우 충분한 인디고이드 함량 증대 효과를 얻을 수 없어 바람직하지 않으며, 상기 범위를 초과하는 농도로 사용하는 경우 본 발명의 후술할 실험예 3에서 확인할 수 있듯이, 인디고이드 함량 증대 효과는 그리 크지 않은 반면, 경제성과 환경적 측면에서 부정적인 영향을 초래할 수 있어 바람직하지 않다. 또한 전신저항성 유도제의 사용이 식물의 성장 지연을 야기한다는 이전의 보고(Heil et al. Reduced growth and seed set following chemical induction of pathogen defense: does systemic acquired resistance incur allocation costs? J Ecol 88, 645-654, 2000)를 고려할 때, 상기 기재된 바와 같은 낮은 농도로 전신저항성 유도제를 처리함이 바람직하다.

본 발명의 인디고이드 함량 증대용 조성물은 이처럼 전신저항성 유도제를 낮은 농도로 사용할지라도 상기 전신저항성 유도제를 처리하지 않은 경우에 비하여 30% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상에 달하는 매우 높은 인디고이드 함량 증가 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 조성물이 적용되는 인디고 생산 식물은 앞서 언급한 바와 같이 쪽(Polygonum tinctorium); 인디고페라 틴크토리아(Indigofera tinctoria), 인디고페라 과테말렌시스(Indigofera guatemalensis), 인디고페라 아닐(Indigofera anil/Indigofera suffruticosa) 등과 같은 인디고페라 속 식물; 및 초대청(Isatis indigotica Fort), 대청람(Isatis oblongat D.C.), 숭람(Isatis tinctoria/woad) 등과 같은 대청 속 식물이 될 수 있으며, 그 외에도 네리움 틴토리움(Nerium tinctorium Roxb), 요루바쪽(Lonchocarpus cyanescens), 야코비니아 틴크토리아(Jacobinia tinctoria), 류큐쪽(Strobilanthes flaccidfolius) 등 인디고를 생산할 수 있는 식물이라면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일 구현예에 따라, 식물 내 인디고이드 함량을 증가시키는 방법이 제공된다.

상기 인디고이드 함량 증가 방법은 바람직하게는 1) 인디고이드 생산 식물 준비단계; 및 2) 상기 식물에 전신저항성(systemic acquired resistance; SAR) 유도제를 제공하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 전신저항성 유도제 및 인디고이드 생산 식물과 관련하여서는 앞서 언급한 것을 그대로 적용할 수 있다.

상기 2) 단계, 전신저항성 유도제를 식물에 제공하는 단계에 있어서, 전신저항성 유도제의 제공 방법은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 전신저항성 유도제를 예컨대 알코올, 아세톤, 헥산(Hexane), 벤젠, 클로로포름(Chloroform), 에테르(Ether), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 다양한 유기용매에 용해시킨 후, 예컨대 Tween 20 및 기타 농업 분야에 널리 사용되는 다양한 유화제/전착제를 포함하는 물에 분산시켜 용액의 형태로 제조하여 식물에 분무하는 방법을 통해 제공될 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 3mM, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.5mM의 농도를 갖는 유도제 용액을 식물이 흠뻑 젖을 정도의 양으로 제공할 수 있다.

한편, 상기 전신저항성 유도제 제공에 따른 인디고이드 함량 증대 효과는 잎의 성숙도에 따른 영향이 크지 않으며, 오히려 성숙한 잎에서의 효과가 다소 높다는 점, 및 상기 유도제 처리에 따른 식물의 성장 지연 문제를 고려할 때, 바람직하게는 식물을 수확하기 5일 내지 10일 전에 제공하는 것이 좋다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 방법을 통해 식물 내 인디고이드 함량을 현저히 증가시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 바람직한 일 구현예에 따라, 상기 방법을 적용함으로써 인디고 함량이 상기 전신저항성 유도제를 처리하지 않은 경우에 비하여 30% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상 증가된 식물체가 제공된다.

상기 전신저항성 유도체 및 적용 대상 식물은 앞서 상술한 바와 같다.

상기 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 식물 내 인디고이드 축적량을 두 배 이상 증가하도록 유도할 수 있으므로 본 발명의 조성물 및 방법은 인디고 식물의 상업적 경작에 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한 본 발명에 따라 천연 인디고의 생산량을 현저히 증가시킬 수 있어 염료 분야뿐만 아니라, 비누, 화장품, 기타 의약분야에 이르기까지 천연 인디고를 이용한 다양한 고부가가치 상품의 개발이 가능할 것이다.

도 1은 쪽(P. tinctorium) 식물의 두 품종에 있어서 SAR 유도제 처리에 따른 인디고이드 축적량에 대한 영향을 나타낸 것이다(인디고이드 함량단위(인디고(mg)
/잎(g)); ML, 성숙한 잎(mature leaves); YL, 어린 잎(young leaves); NB, Naram Blue; NL, 나주재래종(Naju Local)).
도 2는 대청(Isatis tinctoria)식물의 두 종류 잎을 사용하여 SAR 유도제 처리에 따른 인디고이드 축적량을 나타낸 것이다 (인디고이드 함량단위 (인디고(mg)/잎(g)); rossete leaves, 방사상 잎; cauline leaves, 줄기에서 나는 잎).
도 3은 인디고페라(Indigofera tinctorium ) 식물에 SAR 유도제 처리에 따른 인디고이드 축적량을 나타낸 것이다 (인디고이드 함량단위 (인디고(mg)/잎(g)).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하도록 한다.　 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 　쪽 식물에 대한 SAR 유도제 처리 및 잎 수확

식물의 SAR 유도제인 BTH는 신젠타 코리아(Syngenta Korea, 서울, 한국)에서 제공받았으며, INA 및 ASM은 시그마사(St Louis, MO)로부터 구입하였다.

쪽(Polygonum tinctorium Lour.= Persicaria tinctoria H. Gross) 식물로는 목포대학교의 김관수 교수로부터 입수한 첨엽종에 속하는 전통적인 나주(대한민국 전라남도 나주시) 재래종(Naju local; NL) 및 원엽종인 "나람 블루(NaramBlue; NB; 대한민국 국립산림품종관리센터 품종보호 출원번호 2012-3 (출원일자: 2012. 2. 13))", 두 가지 품종을 사용하였으며, 이들은 2011. 4. 25자로 목포국립대학(한국, 무안)의 실험 농장지에 플러그 트레이(Plug tray)에 씨를 뿌린 후, 7월 2일 포장에 이식하고 자연 조건 하에 자라도록 하였다. 이후 2011, 8, 16에 식물 SAR 유도제(BTH, INA, 및 ASM)를 처리하고 상기 처리 후 7일이 되는 날에 잎을 수확하였다. 식물은 5식물을 한 실험구로 하여 한 처리당 5 구역을 난괴법으로 배치하였다.

SAR 유도제를 식물에 분무하는 방법으로 처리하기 위해, 각각 1.5 또는 15 mmol의 SAR 유도제를 25ml의 아세톤(Me₂CO)에 용해시킨 후, 이를 0.05%(v/v) 의 트윈 20(Tween 20)을 포함하고 있는 수돗물 5L 내로 빠르게 분산시켜 SAR 유도제 용액을 제조하였다. 상기 제조된 SAR 유도제 용액을 식물의 잎이 축축해질때까지(한 식물당 약 100~200mL) 분무하였다.

상기 처리 후 7일이 되는 시점에 정점 부분의 갓 펴진 어린 잎(young leaves, YL) 및 줄기 중간 부분의 성숙한 잎(mature leaves, ML)에서 각각 3~4장씩 채취하여 곧바로 드라이 아이스로 냉각된 아이스 박스 내에서 동결시켰다. 상기 잎들을 이후 실험실로 옮겨 분석을 수행하기 전까지 -20°C에서 보관하였다.

실험예 . 각 변이원에 따른 인디고이드 함량 측정

1. 인디고이드 함량 측정방법

1) 후술할 각 실험예에 따라 각 변이원별 인디고이드 함량을 비교하기 위해 인디고이드 함량을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

우선 상기 실시예 1에서 채취 및 동결 보관된 잎 10g과 NaOAc 버퍼(0.05 M, pH 5.0) 30mL를 믹서기에서 완전히 균질화하였다. 상기 균질 현탁액은 10,000 rpm으로 15분간 원심분리 후, 상등액을 회수하였다. 상등액 10mL에 베타-글루코시다제(almond β-glucosidase, Sigma) 10unit를 첨가하고 25℃에서 12시간 동안 반응시켜 쪽 잎에 존재하는 글리코시드를 가수분해하였다. 이후 베타-글루코시다제 5 unit를 더욱 첨가하여 12시간 동안 추가 반응시켰다. 상기 얻어진 가수분해물 0.5mL를 동량의 피리딘에 첨가하여 1200rpm에서 1분 동안 원심분리한 후, HP8452A 분광광도계를 이용하여 610nm 및 670 nm에서 각각 흡광도를 측정하였다. 측정된 값에서 클로로필(chlorophyll) b를 무시하고 인디고 함량을 계산하였다. 계산된 인디고 함량은 인디고(mg)/잎(g)으로 나타냈다. 계산에 사용된 몰 흡광계수 (ε)는 610nm과 670 nm에서 각각 인디고(I) 1.78×10⁴ cm^-1M^-1 과 400 cm^-1M^-1, 클로로필 a(chlorophyll a, chl)는 1.17×10⁴ cm^-1M^-1 과 7.69×10⁴ cm^-1M^- ¹ 로 하고 하기 수학식 1에 따라 시료 중 인디고 농도와 함량을 얻었다.

상기 식에서,

[I]는 인디고 농도;

A610 및 A670는 각각 610nm 및 670 nm에서의 흡광도;

ε_I610 및 ε_I670 는 각각 610nm 및 670 nm에서의 인디고의 몰흡광계수;

ε_chl610 및 ε_chl670는 각각 610nm 및 670 nm에서의 클로로필 a의 몰 흡광계수를 나타낸다.

2) 통계분석

상기 1)을 통해 구해진 인디고 함량의 통계 분석을 위해 SAS　및 마이크로소프트 엑셀 프로그램(Microsoft Excel programs)을 사용하여 ANOVA 및 스튜던트 t 검정을 수행하였으며, 통계적 유의성은 * (p<0.05), ** (p<0.01), 및 *** (p<0.001)로 나타냈다.

2. SAR 유도제의 처리 여부 및 종류에 따른 영향 측정

두 가지 쪽(P. tinctorium .) 식물 품종(나주 재래종(NL) 및 나람 블루(NB))에 대한 SAR 유도제 처리 및 비처리시의 인디고이드 축적량의 차이를 비교한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 SAR 유도제 비처리군(대조군)의 경우 어린 잎에서 인디고이드를 다소 덜 축적하는 것처럼 나타났으나, 품종간 그리고 잎의 성숙도에 따른 인디고이드 함량의 유의적 차이는 없음을 확인할 수 있었다.

그러나 식물 방어 SAR 유도제 처리군의 경우, 유도제의 종류를 불문하고 모든 경우에 있어서 식물 내 현저한 인디고이드 축적을 야기하였음을 알 수 있었다. (도 1 및 표 1)

종명	SAR 유도제	인디고이드 함량 (인디고(mg)/잎(g))
NL	대조군	0.82a
	BTH	1.51b
	INA	1.48b
	ASM	1.42b
	평균	1.31
NB	대조군	0.87a
	BTH	1.55b
	INA	1.62b
	ASM	1.51b
	평균	1.39

SAR 유도제 처리군의 대조군(비처리군) 대비 인디고이드 함량 증가율을 %로 하기 표 2에 나타냈다.

SAR 유도체 처리에 따른 함량 증가율 (%)

	BTH (mM)		INA (mM)		ASM (mM)
	0.3	3	0.3	3	0.3	3
NB-ML	75*	91	86**	98**	63*	65*
NB-YL	67*	78*	83**	78**	100*	79**
NL-ML	102*	78**	108***	54*	57	99*
NL-YL	75*	66**	109*	40 *	40*	89**

상기 표 2에서 NL은 나주 재래종(Naju Local), NB은 나람 블루(Naram Blue), ML은 성숙한 잎(mature leaves) 및 YL은 어린 잎(young leaves.)을 각각 나타낸다.

처리군의 대조군 대비 인디고이드 함량 평균 증가량은 58% 정도였으나, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 몇몇 개개의 처리군에 있어서는 거의 100%에 가까운 증가율을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, 본 실험에 있어서 SAR 유도제의 종류에 따른 현저한 차이는 없는 것으로 나타났다.

한편, 온실 조건 하에서 수행한 실험에서는 또 다른 SAR 유도제인 베타-아미노부티르산(β-aminobutryric acid; BABA)(Gozzo, Systemic acquired resistance in crop protection: from nature to a chemical approach. J Agric Food Chem 51, 4487-4503, 2003) 및 티아민(thiamine; Vitamine B1)(Ahn et al. Vitamin B1 functions as an activator of plant disease resistance. Plant Physiology 138, 1505-1515, 2005) 역시 인디고이드 함량 증가 효과가 있는 것으로 나타났다(데이터 미도시).

3. SAR 유도제 농도에 따른 영향 측정

상기 살펴본 바와 같이 사용된 SAR 유도제의 종류는 인디고이드 함량에 대체로 현저한 영향을 미치지는 않는 것으로 나타나, 유도제의 농도에 따른 영향 여부를 실험하여 하기 표 3에 나타냈다.

SAR 유도제 농도에 따른 영향

품종	SAR 유도제	인디고이드 함량(인디고(mg)/잎(g))
품종	SAR 유도제	0.3 mM	3 mM
NL	BTH	1.58	1.44
	INA	1.73	1.23*
	ASM	1.24	1.61
	평균	1.52	1.42
NB	BTH	1.48	1.61
	INA	1.61	1.63
	ASM	1.53	1.50
	평균	1.54	1.58

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 부정적인 영향을 나타낸 INA를 제외하고는 본 실험에서도 역시 현저한 차이가 측정되지 않았다.

그러나, 품종-의존적으로 반응이 나타남은 분명히 확인할 수 있었다. 즉, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 나주 재래종(NL)의 경우 INA 농도가 높아질수록 인디고이드 함량 증가 효과가 오히려 약 100%에서 약 50% 정도로 감소한 것으로 나타난 반면, ASM은 NL 종에 있어서 2 배 정도 향상된 인디고이드 축적량을 야기하였다. 이와 달리, 나람 블루(NB)종은 SAR 유도제 농도와 무관하게 현저히 안정적인 반응을 보였다 (표 2).

한편, SAR 유도제를 3mM 보다 높게 처리시 0.3mM로 처리하였을 경우와 비교하여 인디고이드 축적량의 경미한 증가를 보였으며 이는 통계적으로 무의미한 정도였다(결과 미도시). 따라서 경제성과 환경적 측면을 고려할 때 가능한 한 SAR 유도제를 낮은 농도로 처리함이 바람직하다. 뿐만 아니라 BTH의 밀에 대한 적용이 식물의 적응 비용의 분배 문제로 인해 식물의 성장 지연을 야기한다는 이전의 보고(Heil et al. Reduced growth and seed set following chemical induction of pathogen defense: does systemic acquired resistance incur allocation costs? J Ecol 88, 645-654, 2000)를 고려할 때, 높은 농도의 처리는 바이오매스(biomass)의 감소를 더욱 크게 할 것임을 알 수 있다.

따라서 INA 또는 BTH를 0.3mM로 처리하는 것이 좋다. 상기 살펴본 바와 같이 이처럼 적은 농도의 SAR 유도제 사용으로도 80 내지 100%에 달하는 높은 인디고이드 함량 증가 효과를 얻을 수 있다.

4. 잎의 성숙도에 따른 영향 및 변이원간 상호관게 측정

식물 방어 활성화제인 SAR 유도제는 SAR 관련 유전자의 발현을 이끌어냄으로써 SAR 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 활발하게 자라나는 어린 잎이 성숙한 잎에 비해 더욱 영향을 받을 것으로 추론하고, 실제로 잎의 성숙도가 인디고이드 함량 증가율에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해 어린 잎과 성숙한 잎에서의 인디고이드 함량을 각각 측정하여 비교하고 그 결과를 하기 표 4에 나타냈다.

SAR 유도제로 처리된 어린 잎과 성숙한 잎에서의 인디고이드 함량(인디고(mg)/잎(g))(괄호 안의 수치: 대조군 대비 증가량(%))

품종	SAR 유도제	성숙한 잎(ML)	어린 잎(YL)
NL	대조군	0.87	0.77
	BTH	1.69 (94)	1.33** (73)
	INA	1.60 (84)	1.36** (77)
	ASM	1.57 (75)	1.28** (66)
	평균(처리군)	1.62 (86)	1.32 (71)
NB	대조군	0.89	0.85
	BTH	1.63 (83)	1.46* (72)
	INA	1.71 (92)	1.53* (80)
	ASM	1.46 (64)	1.57* (85)
	평균 (처리군)	1.60 (79)	1.52 (79)

상기 표 4에서 알 수 있듯이, 본 발명자들의 추측과는 달리 어린 잎과 성숙한 잎간의 인디고이드 함량의 차이가 거의 없었으며, 나주 재래종의 경우는 오히려 성숙한 잎에서 인디고이드 함량이 조금 더 높게 나타남을 확인할 수 있었다(표 4).

즉, 성숙한 잎들이 적어도 SAR 유도제 처리 기간 동안에 계속하여 인디고이드를 생합성하는 것으로 생각된다. 또한 어린 잎의 총 중량이 성숙한 잎의 총 중량에 비해 훨씬 적기 때문에, 어린 잎에 포함되어 있는 상대적으로 적은 인디고이드 함량은 전초에 있어서 총 인디고이드 함량에 대해 큰 영향을 미치지 못할 것으로 생각된다.

한편, 품종, SAR 유도제, 농도 및 잎의 성숙도 등의 변이원 간의 상호작용은 관찰되지 않았다(표 5).

변이원간 상호작용

		제곱평균(Mean of Square)
변이원	df	인디고 함량	유의확률(Significant Probability)
품종	1	0.243	ns
SAR 유도제	3	2.597	**
농도	1	0.073	ns
잎 성숙도	1	1.044	**

다만 상기 실험예들을 통해 살펴본 바와 같이, SAR 유도제의 농도 및 잎의 성숙도가 인디고이드 함량 증가에 큰 영향이 없음은 물론이고, 또한 SAR 유도제 처리가 바이오매스 감소에 미치는 영향을 고려할 때, 대상 식물을 수확하기 7일 전에 유도제를 가능한 저농도로 처리함이 바람직함을 알 수 있다.

실시예 2. 　대청( Isatis tinctoria ) 식물에 대한 SAR 유도제 처리 및 잎 수확

전년도 포장에서 9월에 파종하여 재배하는 대청 (Isatis tinctoria)에 4월 초에 BTH, INA를 실시예 1의 쪽 식물과 같은 방법으로 처리하였다. 다만 농도는 0.3 mM 하나로만 하였다. 시약처리 후 8일째에 줄기에서 나는 잎 (cauline leaves)과 방사상 잎(rosette leaves)을 분리하여 시료를 채취하였다.

인디고이드 함량분석은 실험예 1의 쪽 식물과 같은 방법으로 수행하되, 효소를 추출액 10 mL 당 베타-글루코시다제(β-glucosidase)와 베타-글루코로니

다제 (β-glucoronidase) 를 각각 10 U 처리하는 것만 달리하였다.

비처리군(대조군)과SAR 유도체 처리군에서 5회 반복 실험한 data의 통계분석 결과, 방사상 잎 (rosette엽)에서는 200%, 줄기에서 나는 잎 (cauline엽)에서는 35% 인디고이드 함량이 증가하였고, 전체 식물로서는 110% 증가를 보였다 (도 2).

실시예 3. 　 인디고페라 틴크토리아 ( Indigofera tinctorium ) 식물에 대한 SAR 유도제 처리 및 잎 수확

인디고페라 틴크토리아(Indigofera tinctorium)는 온실 조건에서 파종하여 키가 약 10 cm에 도달하였을 때 0.3 mM BTH 처리를 하고 7일 후 잎을 수확하였다. 인디고이드 함량 분석은 실시예 1 및 실험예 1에 기재된 쪽 식물과 같은 방법으로 수행하였다. 3회 반복 실험한 결과, SAR 유도체 처리군에서 평균 34% 의 인디고이드 함량 증가를 관찰할 수 있었다 (도 3).

Claims

벤조(1,2,3)티아디아졸(Benzo(1,2,3)thiadiazole), 2,6-디클로로이소니코틴산 (2,6-dichloroisonicotinic acid; INA), 및 아시벤졸라-S-메틸(acibenzolar-S methyl; ASM)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 식물의 전신저항성(systemic acquired resistance; SAR) 유도제를 포함하는, 식물 내 인디고이드 함량 증대용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 전신저항성 유도제를 0.01 내지 3mM의 농도로 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 식물은 쪽(Polygonum tinctorium),
인디고페라(Indigofera) 속 식물, 또는 대청(Isatis) 속 식물인 조성물.
1) 인디고이드 생산 식물 준비단계; 및
2) 상기 식물에 전신저항성(systemic acquired resistance; SAR) 유도제를 제공하는 단계를 포함하고,
상기 전신저항성 유도제는 벤조(1,2,3)티아디아졸(Benzo(1,2,3)thiadiazole), 2,6-디클로로이소니코틴산 (2,6-dichloroisonicotinic acid; INA), 및 아시벤졸라-S-메틸(acibenzolar-S methyl; ASM)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인,
식물 내 인디고이드 함량 증가 방법.
삭제
제5항에 있어서, 상기 2) 단계는 전신저항성 유도제를 식물에 0.01 내지 3mM의 농도로 제공하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 인디고이드 생산 식물은 쪽(Polygonum tinctorium), 인디고페라(indigofera tinctorium) 속 식물, 또는 대청(Isatis tinctoria) 속 식물인 방법.
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