JP2001508288A

JP2001508288A - 植物防御法

Info

Publication number: JP2001508288A
Application number: JP52959998A
Authority: JP
Inventors: ライアルズ，ジョン・アンドリュー; アクンズ，スコット・ジョゼフ; モリナ・フェルナンデス，アントニオ; フリードリック，レスリー・ベサーズ
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1997-12-23
Publication date: 2001-06-26
Also published as: HU224480B1; WO1998029537A3; HUP0000654A2; KR100500751B1; IL130452A0; EP1009838A2; AU5859798A; CN1232645C; CA2275854A1; CN1245537A; WO1998029537A2; AR010855A1; KR20000069743A; TR199901491T2; AU725767B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、常用の殺菌剤を免疫調節化植物に適用することによって、相乗的病害抵抗性により病原体攻撃から植物を防御する方法に関する。免疫調節化植物は、その中でＳＡＲが活性化されるため、“ＳＡＲ-オン”植物と呼ばれる。免疫調節化植物は、少なくとも３種の、即ち、植物に、ＢＴＨ、ＩＮＡまたはＳＡなどのＳＡＲの化学的誘導物質を適用する；ＳＡＲ遺伝子および/または病害抵抗性表現型の構成的発現に基づく選択的育種プログラムを介する；または、植物を、ＮＩＭ１遺伝子の機能的形態などの１以上のＳＡＲ遺伝子で形質転換させるという、異なる方法で提供できる。殺菌剤を免疫調節化植物に同時に適用することにより、予想外にも病害抵抗性が相乗的に高められる。即ち、その病害抵抗性レベルは予想した追加レベルよりも大きい。

Description

【発明の詳細な説明】植物防御法本発明は、免疫調節化植物に殺菌剤を適用することによって得られた相乗的病害抵抗性により病原体攻撃から植物を防御する方法に関する。植物は、ウイルス、細菌、真菌および線虫を含む広範囲の病原生物体の攻撃に絶えず曝されている。農産物植物は、遺伝的に均一の単一栽培物として育てられるので、特に攻撃されやすく、病気にかかると損害は非常に深刻である。しかしながら、殆どの植物は、病原生物体に対して植物自身の先天的な防御機構を持つ。植物病原体に対する自然の多様な抵抗性は、植物育種家や病理学者によって同定されており、多くの農産物植物内に組込まれている。これらの自然の病害抵抗性遺伝子は、多くの場合、病原体に対して高レベルの抵抗性または免疫を提供するものである。全身性獲得抵抗性(systemic acquired resistance)(ＳＡＲ)は、植物が自身を病原体から防御するのに使用する複雑なシステムの一要素である(Hunt and Ryal s，Crit．Rev．in Plant Sci．15，583-606(1996)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Ryals et al.，Plant Cell 8，1809-1819(1996)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。米国特許第５,６１４,３９５号、出典明示によりその全体を本明細書の一部とする、も参照。ＳＡＲは、ウイルス、細菌および真菌を含む広範囲の感染要因に対する病原体-誘導性の全身性抵抗性であるため、特に重要な植物-病原体応答の特徴である。ＳＡＲシグナル伝達経路がブロックされると、植物は、通常、病害を引き起こす病原体に対しては一層感受性になり、更に普通なら病害を引き起こさないような感染要因に対しても感受性になる(Gaffney et al.，Science 261，754-756(1993)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Delaney et al.，Science 266，1247-1250 (1994)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Delaney et al.，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 92，6602-6606(1995)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Delaney，Plant Phys．113，5-12(1997)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Bi et al.，Plant J．8，235-245(1995)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Mauch-Mani and Slusarenko，Plant Cell 8，203-212(1996)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。これらの所見は、ＳＡＲシグナル伝達経路が植物の健常状態を維持するのに重要であることを示している。概念的に、ＳＡＲ応答は、２段階に分けることができる。初期段階では、病原体感染が認められ、シグナルが放出されて、篩部により遠位組織へと伝えられる。この全身性シグナルが標的細胞に知覚されると、標的細胞はＳＡＲ遺伝子および病害抵抗性の両方を発現するという反応を示す。ＳＡＲの維持段階は、数週から植物の寿命全体までの期間で表し、その間、植物は準定常状態にあって、病害抵抗性を維持している(Ryals et al.，1996)。ＳＡＲシグナル伝達にはサリチル酸(ＳＡ)の蓄積が必要であるらしい。特異的にＳＡを分解する、特定の阻害剤での処置や、フェニルアラニンアンモニア-リアーゼの後成的抑制、またはサリチル酸ヒドロキシラーゼのトランスジェニック発現によりＳＡを蓄積できない植物は、ＳＡＲ遺伝子発現または病害抵抗性も誘導できない(Gaffney et al.，1993;Delaney et al.，1994;Mauch-Mani and Slus arenko 1996;Maher et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91，7802-7806(1994) ，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Pallas et al.，Plant J． 10，281-293(1996)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。ＳＡは全身性シグナルとして働くこともあると言われてきたが、このことは現在論争中であり、これまでで確かになったのは、ＳＡが蓄積できないならばＳＡＲシグナル伝達はブロックされるということだけである(Pallas et al.，1996;Shulaev e t al.，Plant Cell 7，1691-1701(1995)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Vernooij et al.，Plant Cell 6，959-965(1994)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。最近、シロイヌナズナ(Alabidopsis)がＳＡＲ研究用のモデル系として浮上してきた(Uknes et al.，Plant Cell 4，645-656(1992)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Uknes et al.，Mol．Plant-Microbe Interact．6，69 2-698(1993)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Cameron et al .，Plant J．5，715-725(1994)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Mauch-Mani and Slusarenko，Mo．Plant-Microbe Interact．7，378- 383(1994)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Dempsey and Kle ssig，Bulletin de L'Institut Pasteur 93，167-186(1995)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。ＳＡＲはシロイヌナズナにおいて、病原体および化学薬品、例えば、ＳＡ、２,６-ジクロロイソニコチン酸(ＩＮＡ)およびベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル(ＢＴＨ)の両方により活性化され得ることが明らかになっている(Uknes et al.，1992;Vern ooij et al.，Mol．Plant-Microbe Interact．8，228-234(1995)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Lawton et al.，Plant J．10，71-82(1996 )，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。ＩＮＡまたはＢＴＨでの処置または病原体感染の後、少なくとも３種の病原関連(ＰＲ)タンパク質遺伝子、即ち、ＰＲ-１、ＰＲ-２およびＰＲ-５が抵抗性の出現に付随して同等に誘導される(Uknes et al.，1992，1993)。最も詳しく特性化されているタバコでは、病原体または免疫化合物で処置すると、少なくとも９組の遺伝子の発現が誘導される(Ward et al.，Plant Cell 3，1085-1094(1991)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。病害抵抗性のトランスジェニック植物は、植物を様々なＳＡＲ遺伝子で形質転換させることにより作られる(米国特許第５,６１４, ３９５号)。ＳＡＲシグナル伝達を改変した多数のシロイヌナズナ変異体が単離されている (Delaney，1997)。これらの変異体の第１番目は、いわゆるlsd(病変擬態病lesio ns simulating disease)変異体およびacd２(加速細胞死accelerated cell death )である(Dietrich et al.，Cell 77，565-577(1994)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Greenberg et al.，Cell 77，551-563(1994)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。これらの変異体は全て、その葉上にある程度の自発的壊死病変が形成され、高レベルのＳＡ、ＳＡＲ遺伝子用のｍＲＮＡ蓄積、および顕著に高い病害抵抗性を持つ。少なくとも７種の異なるlsd 変異体が単離され、特性化されている(Dietrich et al.，1994;Weymann et al. ，Plant Cell 7，2013-2022(1995)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。その他の対象となる変異体クラスは、cim(構成的免疫constitutive im munity)変異体である(Lawton et al.，“The molecular biology of systemic aquired resistance”in Mechanisms of Defence Respons es in Plants，B．Fritig and M．Legrand，eds(Dordrecht，The Netherlands:K luwer Academic Publishers)，pp．422-432(1993)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。出典明示によりその全体を本明細書の一部とした国際ＰＣＴ出願ＷＯ９４/１６０７７も参照。lsd変異体やacd２同様、cim変異体は、高いＳＡおよびＳＡＲ遺伝子発現および抵抗性を持つが、lsdまたはacd２とは反対に、その葉に検出可能な病変が現れない。cpr１(ＰＲ遺伝子の構成的発現体co nstitutive expresser of PR genes)は、cim変異体の１種であると言えるが、cp r１の葉上に微視的病変が存在することは無視できないので、cpr１はlsd変異体の１種であるかもしれない(Bowling et al.，Plant Cell 6,1845-1857(1994)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。ＳＡＲシグナル形成においてブロックされる変異体も単離されている。ndr１( 非-種特異的病害抵抗性non-race-specific disease resistance)は、様々な非毒性遺伝子を含有するPseudomonas syrjngaeと普通は非毒性のPeronospora parasi tica単離物の両方を増殖させる変異体である(Century et al.，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 92，6597-6601(1995)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。明らかに、この変異体は、ＳＡＲシグナル形成において早期にブロックされる。npr１(ＰＲ遺伝子の非発現体nonexpresser of PR genes)は、ＩＮＡ処置後にＳＡＲシグナル形成経路の発現を誘導できない変異体である(Cae et al .，Plant Cell 6，1583-1592(1994)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。eds(高い病害感受性enhanced disease susceptibflity)変異体は、低濃度細菌植菌後の細菌感染を持続させるその能力に基づき単離されている(Glaze brook et al.，Genetics 143，973-982(1996)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Parker et al.，Plant Cell 8，2033-2046(1996)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。ある種のeds変異体は表現型がnpr１と非常に類似しており、また最近、eds５およびeds５３はnpr１の対立遺伝子であることが示された(Glazebrook et al.，1996)。nim１(非誘導性免疫noninduci ble immunity)は、ＩＮＡ処置後のP．parasitica(即ち、露菌病の原因となるもの)増殖を持続させる変異体である(Delaney et al.，1995; WO94/16077)。nim１は、病原体感染後にＳＡを蓄積できるが、ＳＡＲ遺伝子発現または病害抵抗性を誘導することはできず、これは、この変異がＳＡの下流にある経路をブロックすることを示唆している。nim１は、ＩＮＡまたはＢＴＨに応答する能力も損ねており、これは、ブロックがこれらの化学薬品作用の下流にあることを示唆している(Delaney et al.，1995;Lawton et al.，1996)。近年、２つのシロイヌナズナ対立遺伝子が単離および特性化されており、その変異体は、それぞれnim１およびnpr１表現型を担う(Ryals et al.，Plant Cell 9，425-439(1997)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする；Cao et a l.，Cell 88，57-63(1997)，出典明示によりその全体を本明細書の一部とする) 。野生型ＮＩＭ１遺伝子産物は、シロイヌナズナにおいてＳＡＲと遺伝子毎の(g ene-for-gene)病害抵抗性の両方を導くシグナル伝達カスケードに関与している( Ryals et al.，1997)。Ryals et al.，1997は、化学的に誘導されたＰＲ−１遺伝子発現および真菌抵抗性が少し損なわれたものから非常に強力にブロックされたものまでのある範囲の表現型を示すnim１の更に５つの対立遺伝子の単離についても報告している。野生型ＮＰＲ１遺伝子をnpr１変異体内に形質転換すると、その変異が補足されてＰＲ-遺伝子発現や病害抵抗性に関するＳＡＲ誘発の応答性が回復しただけでなく、そのトランスジェニック植物はまたＳＡＲ誘発の不在下でもP.syringa感染に対して一層抵抗性になった(Cao et al.，1997)。ＮＦ-κＢ/ＩκＢシグナル伝達経路は、キイロショウジョウバエから哺乳動物までのある範囲の生物体における病害抵抗性応答に関係している。哺乳動物では、細胞をリポ多糖類、腫瘍壊死因子、インターロイキン１(ＩＬ-１)またはヴイルス感染に曝すなど、多種の刺激によってＮＦ-κＢ/ＩκＢシグナル伝達を誘導することができる(Baeuerle and Baltimore，Cell 87，13-20(1996);Baldwin，A nnu．Rev．Immunol．14，649-681(1996))。経路が活性化されると、炎症および免疫応答に関与する多数の因子、例えば、ＩＬ-２、ＩＬ-６、ＩＬ-８および顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子が合成される(deMartin et al.，Gene 15 2，253-255(1995))。トランスジェニックマウス研究では、ＮＦ-κＢ/ＩκＢシグナル伝達のノックアウトは、細菌およびウイルス病原体に対する感受性の増強などの不完全な免疫応答をもたらす(Beg and Baltimore，Science 274，782- 784(1996)；Van Antwerp et al.，Science 274，787-789(1996)；Wang et al.， Science 274，784-787(1996)；Baeuerle and Baltimore(1996))。シロイヌナズナでは、正常な抵抗性プロセスがＳＡＲ活性化後に強化されて高い病害抵抗性をもたらす点で、ＳＡＲは炎症と類似している(Bi et al.，1995;Cao et al.，199 4;Delaney et al.，1995;Delaney et al.，1994;Gaffney et al.，1993;Mauch-M ani and Slusarenko 1996;Delaney，1997)。更に、この経路の不活性化は、細菌、ウイルスおよび真菌病原体に対する感受性の増強をもたらす。興味深いことに、哺乳動物細胞においてＳＡはＮＦ-κＢ活性化をブロックする(Kopp and Ghosh ，Science 265，956-959(1994))一方で、シロイヌナズナにおいてはＳＡはシグナル伝達を活性化することが報告されている。キイロショウジョウバエの細菌感染は、シグナル伝達カスケードを活性化し、セルクロピンＢ、デフェンシン、ジプテルシンおよびドロソマイシンなどの多数の抗真菌タンパク質の合成をもたらす(Ip et al.，Cell 75，753-763(1993);Lemaitre et al.，Cell 86，973-983(1 996))。この誘導は、２種のＮＦ-κＢ相同体であるdorsalおよびdifの遺伝子産物に左右されるものであり、ハエのＩκＢ相同体であるcactusに代表される。抗真菌および抗菌タンパク質の合成を低減させる変異体は、感染に対する抵抗性を劇的に弱めた。多くの研究や、植物の遺伝子形質転換を含む高性能で集中的な農産物防御法の使用にもかかわらず、病害による損失は依然として毎年数１０億ドルある。そのため、植物病害抵抗性の遺伝子ベースの逓増的理解に基づく新規の農産物防御法の開発に対しては継続的な需要がある。上記を考慮して、本発明の好ましい態様は、免疫調節化植物に殺菌剤を適用することによって得られた相乗的病害抵抗性により、植物を病原体攻撃から防御する新規の方法に関する。免疫調節化植物は、ＳＡＲを活性化し、典型的には、野生型以上のＳＡＲ遺伝子発現を示すようなものであるので、“ＳＡＲ-オン”植物と呼ぶ。本発明の方法に使用する免疫調節化植物には、少なくとも３種の：植物にＢＴＨ、ＩＮＡまたはＳＡなどのＳＡＲ化学誘導物質を適用する；植物をＳＡＲ遺伝子および/または病害抵抗性表現型の構成的発現に基づいて選択する、選択的育種により；または機能的形態のＮＩＭ１遺伝子などの１以上のＳＡＲ遺伝子で形質転換させることにより植物体を遺伝子操作する、という方法で得ることができる。免疫調節化植物に適用する殺菌剤は、常用の殺菌剤、例えば、殺真菌剤メタラキシルや、選択的育種または遺伝子操作により得られた免疫調節化植物に適用するならば、ＳＡＲの化学誘導物質であるＢＴＨ、ＩＮＡまたはＳＡなどの殺菌剤のいずれでもよい。免疫調節は植物にあるレベルの病害抵抗性を与える。同様に、殺菌剤の適用も植物にあるレベルの病害抵抗性を与える。免疫調節と殺菌剤塗布を併用すれば、その結果、病害抵抗性を与える個々の方法により提供される制御レベルを加算したレベルの制御がもたらされると予想される。しかしながら、免疫調節化植物に殺菌剤を同時に適用すると、病害抵抗性は、予想外にも相乗的に高められ、即ち、病害抵抗性レベルは予想した加算レベルの病害抵抗性よりも大きかった。従って、本発明は、免疫調節化植物の栽培と、それに対する適量の常用殺菌剤の適用に関する。特に好ましい本発明の実施態様は、ＮＩＭ１遺伝子またはその相同体または変種の機能的形態を含有し、かつ発現するように遺伝子操作した植物に関する。本発明の方法は、免疫調節または殺菌剤塗布のいずれか単独で達成されるよりも大きな病原体制御をもたらす。免疫調節は植物にあるレベルの病害抵抗性を与える。同様に、殺菌剤の適用は植物にあるレベルの病害抵抗性を与える。免疫調節と殺菌剤塗布を併用すれば、その結果、病害抵抗性を与える個々の方法により提供される制御レベルを加算したレベルの制御がもたらされると予想される。しかしながら、免疫調節化植物に殺菌剤を同時適用すると、病原性病害の制御は予想外にも相乗的に高められ、即ち、病害制御レベルは予想した加算レベルの病害抵抗性よりも大きかった。より大きい病害抵抗性のほかに、本発明の別の利点は、本発明の方法により提供される病害抵抗性レベルを達成するのに必要な殺菌剤の量が、通常の野生型植物に使用するのに必要な量よりも少ないという点である。この結果、殺菌剤の経済費用は低下し、またある種の殺菌剤の毒性に起因する有害環境の発生機会も低くなる。更に、免疫調節と殺菌剤塗布の効果を組合せることにより植物を防御する発明的方法により、抗病原性作用の持続時間が長くなり、全体的に農産物収穫量が高くなる。本方法のその他の利点は、病原体制御作用の２つの併用様式が互いに全く異なるため、抵抗性が生じる恐れを効果的に防ぐという点である。このように、本発明は、相乗的病害抵抗性により病原体攻撃から植物を防御する方法であって、下記段階： (ａ)第１レベルの病害抵抗性を持つ免疫調節化植物を提供し； (ｂ)該免疫調節化植物に第２レベルの病害抵抗性を与える少なくとも１種の殺菌剤を適用し； (ｃ)該殺菌剤を該免疫調節化植物に適用することにより、相乗的に増強された、第１および第２レベルの病害抵抗性の総和よりも大きい第３レベルの病害抵抗性を与える、を含む方法に関する。好ましいのは、該免疫調節化植物が構成的免疫(cim)変異体植物である本発明の方法である。特に好ましいのは、該cim変異体植物が下記段階： (ａ)病変擬態表現型を欠く正常表現型の非感染植物におけるＳＡＲ遺伝子の発現を評価し、 (ｂ)ウイルス、細菌、または真菌感染なしで、ＳＡＲ遺伝子を構成的に発現する非感染植物を選択するに従い、植物集団から選択される、本発明の方法である。また、該免疫調節化植物が病変擬態変異体植物である本発明の方法も好ましい。特に好ましいのは、該病変擬態変異体植物が下記段階： (ａ)病変擬態表現型を持つ非感染植物におけるＳＡＲ遺伝子の発現を評価し、 (ｂ)ウイルス、細菌、または真菌感染なしで、ＳＡＲ遺伝子を構成的に発現する非感染植物を選択するに従い、植物集団から選択される、本発明の方法である。また、該免疫調節化植物が植物中でのＳＡＲ遺伝子の組換え発現により得られるものである本発明の方法も好ましい。特に好ましいのは、該ＳＡＲ遺伝子がＮＩＭ１遺伝子の機能的形態である、本発明の方法である。より好ましいのは、該ＮＩＭ１遺伝子が全身性獲得抵抗性をもたらすシグナル伝達カスケードに関わるＮＩＭ１タンパク質をコードする、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＮＩＭ１タンパク質が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＮＩＭ１遺伝子が下記の条件で配列番号１に記載のコード配列とハイブリダイズする、本発明の方法である：１％ＢＳＡ；５２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７.２；７％ラウリル硫酸ナトリウム塩；１mＭＥＤＴＡ；２５０ｍＭ塩化ナトリウム中、５５℃で、１８−２４時間ハイブリダイゼーションし、６×ＳＳＣで１５分間(×３)、３×ＳＳＣで１５分間(×１)、５５℃で洗浄する。とりわけ好ましいのは、該ＮＩＭ１遺伝子が配列番号１に記載のコード配列と、穏やかなストリンジェント条件でそのコード配列とハイブリダイズする全てのＤＮＡ分子を含む、本発明の方法である。特に好ましいのは、該ＳＡＲ遺伝子が、ＳＡＲシグナル伝達経路の優性ネガティブレギュレーターとして作用するＮＩＭ１タンパク質の変化形態をコードする、本発明の方法である。より好ましいのは、該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号２の５５位および５９位に対応するアミノ酸位置でセリンの代わりにアラニンを持つ、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号８に示したアミノ酸配列からなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＤＮＡ分子が配列番号７に示したヌクレオチド配列と、穏やかなストリンジェント条件でそのヌクレオチド配列とハイブリダイズする全てのＤＮＡ分子からなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＤＮＡ分子が、下記の条件で配列番号７に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズする、本発明の方法である：１％ＢＳＡ；５２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７.２；７％ラウリル硫酸ナトリウム塩；１ｍＭＥＤＴＡ；２５０ｍＭ塩化ナトリウム中、５５℃で、１８−２４時間ハイブリダイゼーションし、６×ＳＳＣで１５分間(×３)、３×ＳＳＣで１５分間(×１)、５５℃ で洗浄する。より好ましくは、該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号２のアミノ酸位置１−１２５にほぼ対応するアミノ酸のＮ-末端トランケーションを持つ、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＤＮＡ分子が、配列番号９に示すヌクレオチド配列と、穏やかなストリンジェント条件でそのヌクレオチド配列とハイブリダイズする全てのＤＮＡ分子からなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＤＮＡ分子が、下記の条件で配列番号９に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズする、本発明の方法である：１％ＢＳＡ；５２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７.２；７％ラウリル硫酸ナトリウム塩；１ｍＭＥＤＴＡ；２５０ｍＭ塩化ナトリウム中、５５℃で、１８−２４時間ハイブリダイゼーションし、６×ＳＳＣで１５分間(×３)、３×ＳＳＣで１５分間(×１)、５５℃ で洗浄する。とりわけ好ましいのは、該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号２のアミノ酸位置５２２−５９３にほぼ対応するアミノ酸のＣ-末端トランケーションを持つ、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号１２に示すのアミノ酸配列からなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＤＮＡ分子が、配列番号１１に示すヌクレオチド配列と、穏やかなストリンジェント条件でそのヌクレオチド配列とハイブリダイズする全てのＤＮＡ分子からなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＤＮＡ分子が、下記の条件で配列番号１１に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズする、本発明の方法である：１％ＢＳＡ；５２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７.２；７％ラウリル硫酸ナトリウム塩；１ｍＭＥＤＴＡ；２５０ｍＭ塩化ナトリウム中、５５℃で、１８−２４時間ハイブリダイゼーションし、６×ＳＳＣで１５分間(×３)、３×ＳＳＣで１５分間(×１)、５５ ℃で洗浄する。より好ましくは、該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号２のアミノ酸位置１−１２５にほぼ対応するアミノ酸のＮ-末端トランケーションと、配列番号２のアミノ酸位置５２２−５９３にほぼ対応するアミノ酸のＣ-末端トランケーションを持つ、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＤＮＡ分子が、配列番号１３に示すヌクレオチド配列と、穏やかなストリンジェント条件でそのヌクレオチド配列とハイブリダイズする全てのＤＮＡ分子からなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＤＮＡ分子が下記の条件で配列番号１３に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズする、本発明の方法である：１％ＢＳＡ；５２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７.２；７％ラウリル硫酸ナトリウム塩；１ｍＭＥＤＴＡ；２５０ｍＭ塩化ナトリウム中、５５℃で、１８−２４時間ハイブリダイゼーションし、６×ＳＳＣで１５分間(×３)、３×ＳＳＣで１５分間(×１)、５５℃で洗浄する。より好ましくは、該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、実質的に配列番号２のアミノ酸位置１０３−３６２にほぼ対応するアンキリンモチーフからなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＤＮＡ分子が、配列番号１５に示すヌクレオチド配列と、穏やかなストリンジェント条件でそのヌクレオチド配列とハイブリダイズする全てのＤＮＡ分子からなる、本発明の方法である。とりわけ好ましいのは、該ＤＮＡ分子が下記の条件で配列番号１５に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズする、本発明の方法である：１％ＢＳＡ；５２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７.２；７％ラウリル硫酸ナトリウム塩；１ｍＭＥＤＴＡ；２５０ｍＭ塩化ナトリウム中、５５℃で、１８−２４時間ハイブリダイゼーションし、６×ＳＳＣで１５分間(×３)、３×ＳＳＣで１５分間(×１)、５５℃ で洗浄する。本明細書に開示した適応範囲の標的農産物の例には、これらに限定されないが、下記の植物種を含む：穀類(トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、イネ、モロコシ属および関連農産物)；ビート(砂糖ダイコンおよび飼料用ビート)；ナシ状果、石果および小果樹(リンゴ、西洋ナシ、プラム、モモ、アーモンド、サクランボ、イチゴ、ラズベリーおよびブラックベリー)；マメ科植物(インゲンマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、ダイズ)；油科植物(ナタネ、マスタード、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマシ油植物、カカオ豆、アメリカホドイモ)；キュウリ植物(大粒インゲンマメ、キュウリ、メロン)；繊維植物(綿、亜麻、麻、ジュート)；カンキツ果物(オレンジ、レモン、グレープフルーツ、マンダリン)；野菜(ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ、ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガイモ、パプリカ)；クスノキ科(アボカド、シナモン、樟脳)；またはタバコ、ナッツ、コーヒー、サトウキビ、茶、ブドウ、ホップ、バナナおよび天然ゴム植物、並びに、観賞植物(草花、低木、広葉樹および針葉樹などの常緑樹)。このリストは、なんら限定を表すものではない。本発明の方法を用いて、広範囲の植物病原体に対して抵抗性を与えることができ、それらの病原体には、下記のものがあるが、これらに限定されない：ウイルスまたはウイルイド、例えば、タバコまたはキュウリモザイクウイルス、輪紋ウイルスまたは壊疽ウイルス、ペラルゴニューム葉巻ウイルス、ムラサキツメクサ斑紋ウイルス、トマト低木楼化ウイルスおよび同様のウイルス類；子嚢菌、例えば、Venturia、Podosphaera、Erysiphe、Monolinia、Mycosphaerella、およびUn cinula属；担子菌、例えば、Hemileia、RhizoctoniaおよびPuccinia属由来もの；不完全な真菌、例えば、Botrytis、Helminthosposrium、Rhynchosporium、Fus arium(即ち、F．monoliforme)、Septoria、Cercospora、Alternaria、Pyricular ia、Pseudocercosporella(即ち、P．herpotrichoides)属；卵菌類の真菌、例えば、Phytophthora(即ち、P.parasitica)、Peronospora(即ち、P．tabacina)、Br emia、PythiumおよびPlasmopara；並びに、他の真菌、例えば、Scleropthora ma crospora、Sclerophthora rayissiae、Sclerospora graminicola、Peronosclero spora sorghi、Peronosclerospora philippinensis、Peronosclerospora saccha ri、Peronosclerospora maydis、Physopella zeae、Cercospora zeae-maydis、C olletotrichum graminicola、Gibberella zeae、 Exserohilm turcicum、Kabatiellu zeaeおよびBipolaris maydis；細菌、例えば、Pseudomonas syringae、Pseudomonas tabaciおよびErwinia stewartii；アリマキなどの昆虫、例えば、Myzus persicae；および鱗翅目の昆虫、例えばHeliot hus種；および線虫、例えばMeloidogyne incognita。免疫調節化植物の入手免疫調節化植物を入手するための下記の一般的な方法である３種全ては、Ryal s et al.,(1996)に記載のＳＡＲシグナル伝達経路モデルに全て適合するので、関連がある。病害抵抗性を得るためにＳＡＲシグナル伝達経路を活性化する際、３種類の経路のどれを採用しても、同じセットのＳＡＲ遺伝子が“オン”に変わり、下記病害抵抗性成果が得られる。この３種類の経路の違いは、経路中のどの点でＳＡＲがオンに変わるかという点のみに関係しており、最終成果はこれら３種類の経路間で同じである。そのため、１経路を経て得られた免疫調節化植物に関して観察された分析および成果を推定の基礎として、別の経路を経て得られた免疫調節化植物にも当てはまる。Ａ．全身性獲得抵抗性の化学的誘発物質の塗布免疫調節化植物を入手するための第１の経路は、ＳＡＲを誘発する能力のある化学品を植物に塗布することを伴う。特に強力なＳＡＲの化学誘発物質は、ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル(ＢＴＨ)などのベンゾチアジアゾールである。レギュレーターとしてさらに使用されるベンゾチアジアゾールの誘導体は、米国特許第5,523,311および5,614,395に記述されており、これらは出典明示により本明細書に組込まれている。様々な農作物において、広い範囲の病害に対し、現場で防御を与えるＢＴＨ-誘発ＳＡＲは、Freidri ch et al.，Plant Journal 10(1)，61-70(1996)、Lawton et al.，Plant Journa l 10(1)，71-82(1996)およびGorlach et al.，Plant Cell 8，629-643(1996)に、詳細に記載されており、これらは出典明示により本明細書に組込まれている。本発明の方法用に、免疫調節化植物を入手するために使用できる他のＳＡＲ化学誘発物質は、２,６-ジクロロイソニコチン酸(ＩＮＡ)およびその低級アルキルエステルなどのイソニコチン酸化合物を含み、サリチル酸化合物(ＳＡ)も同様である。適当なＩＮＡおよびＳＡ化合物の例は、米国特許第5,614,395 に叙述されている。Ｂ．構成的免疫(ＣＩＭ)変異体植物の育種免疫調節化植物を入手する第２の経路は、ＳＡＲ遺伝子の構成的発現および/ または病害抵抗性表現型に基づいた選択的育種プログラムである。多くのデータが、ＳＡＲ遺伝子の発現と、全身性獲得抵抗性自身との間の密着した相互関係を示している(Ward et al.(1991)、Uknes et al.(1992)、Uknes et al.(1993)、La wton,et al.(1993)およびAlexander et al(1993)PNAS USA 90，7327-7331、参照文献)。シロイヌナズナでは、十分に特徴化されたＳＡＲ遺伝子の例はＰＲ-１、ＰＲ-２およびＰＲ-５であり、ＰＲ-１は最小のバックグラウンドで最も高レベルで発現される。ＳＡＲ遺伝子を構成的に発現する植物を同定および選出するために、ＳＡＲ遺伝子の発現を検出するノーザン分析を行う。Uknes et al.(1992)で叙述されているように、知られたＳＡＲＤＮＡ配列をクロスハイブリダイゼーション実験に利用することができる。核酸配列のハイブリダイゼーションおよびクローニングの方法は当業者によく知られている(例えばMolecular Cloning，A Laboratory M anual，2nd Edition，Vol．1-3，Sambrook et al.(eds.)Cold Spring Harbor La boratory Press(1989)およびその中に引用されている文献参照)。構成的にＳＡＲ遺伝子を発現するＳＡＲシグナル伝達変異体の少なくとも２種類が単離されている。第1の種類は、“ｌｓｄ”変異体(lsd=病変擬似病(lesion simulating dis ease))として呼ばれており、“Ｉ型cim”変異体とも言われる。ＷＯ94/16077参照。、ｌｓｄ(Ｉ型cim)変異体は、葉上に自発的病変を形成し、高濃度のＳＡ、高レベルのＰＲ-１、ＰＲ-２およびＰＲ-５ｍＲＮＡを蓄積し、真菌および細菌性病原体に対して抵抗性である(Dietrich et al.，1994、Weymann et al.，1995 )。第2の種類は“cｉｍ”(cim=構成的免疫：constitutive immunity)変異体として呼ばれており、“II型cim”変異体とも言われている。ＷＯ94/16077参照。ｃｉｍ変異体は、自発的病変を除くｌｓｄ変異体の特徴全てを持つ。つまり、ｃｉｍ変異体は、見たところ表現型的には正常である。一旦、ＳＡＲ遺伝子を構成的に発現する植物個体を選出すれば、それらを育種プログラムに利用してＳＡＲ遺伝子の構成的発現および病原体の抵抗性を植物系列に組み込むことができる。さらに交雑するための子孫個体は、植物育種の業者によく知られている手法で、ＳＡＲ遺伝子の発現および病害抵抗性、ならびに生産と品質に重要な別の特徴に基づいて選択される。例えば、ｌｓｄ変異体は病変形成および壊死を示すので、正常な表現型のｃｉｍ変異体は、育種プログラムおよび本発明の方法用に好ましいが、所望ならばｌｓｄ変異体を使用してもよい。Ｃ．ＳＡＲ遺伝子による植物の形質転換免疫調節化植物を入手するための第3の経路は、ＳＡＲ遺伝子、好ましくはＮＩＭ１遺伝子の機能形態で植物形質転換するものである。１．野生型ＮＩＭ１遺伝子の組換え発現ＮＩＭ１の野生型(配列番号:１)の組換え過発現は、病害抵抗性表現型をもつトランスジェニック植物をもたらす。出典明示により本明細書に組込まれている、同時-係属中米国特許出願番号08/880,179参照。活性ＮＩＭ１タンパク質のレベル増加により、ＢＴＨ、ＩＮＡおよびＳＡなどの誘発性化学品による化学的誘発と同じ病害抵抗性効果が生じる。好ましくは、ＮＩＭ１遺伝子の発現は、野生型植物中のＮＩＭ１遺伝子の発現レベルの少なくとも２倍を上回るレベルであり、さらに好ましくは、野生型発現レベルの少なくとも１０倍を上回るレベルである。“組換えＤＮＡ技術”と題されるより下記の項は、野生型レベルより高いレベルでトランスジェニック植物において、野生型ＮＩＭ１遺伝子を組換え的に発現させるのに使用できるプロトコルについて述べている。あるいは、Cao,et al. (1997)に叙述されているように、病症抵抗性植物を生産するために、植物を野生型ＮＰＲ１遺伝子によって形質転換させることもできる。２．ＮＩＭ１遺伝子の変化形態の組換え発現本発明の方法で使用する免疫調節化植物は、ＮＩＭ１遺伝子の変化形態の組換え発現によりつくることができ、それは、植物中のＳＡＲ経路は、機能相同体を哺乳類のやハエのNFκB/lκB調節機構と機能的相似性を示すという認識と、ＮＩＭ１遺伝子産物は、哺乳類シグナル伝達因子lκBサブクラスαの構造相同体であるという発見の両方を活用してＮＩＭ１遺伝子を変化させることによる。出典明示により本明細書に組込まれている、同時-係属中ＰＣＴ出願“METHODS OF US ING THE NIM1 GENE TO CONFER DISEASE RESISTANCE IN PLANTS”参照。ＮＩＭ１遺伝子の配列(配列番号:１)はＢＬＡＳＴ探索に使用され、ＮＩＭ１遺伝子の配列中でかなり高度に保存された１ドメインの、スペクトリン、アンキリン、ＮＦ-κBおよびｌκBなどのたくさんのタンパク質でみられるアンキリンドメインに対する相同性に基づいてマッチが同定された(Michael and Bennett， Trends Cell Biol．2，127-129(1992))。ＮＩＭ１タンパク質(配列番号:２)と７０の知られているアンキリン含有タンパク質の２つ１組目視観察を実施すると、転写レギュレーターのｌκBαクラスのメンバーとの著しい類似性が見られた(Ba euerle and Baltimore 1996;Baldwin 1996)。図１で示すとおり、ＮＩＭ１タンパク質(配列番号:２)は、マウス、ラットおよびブタのｌκBαタンパク質(それぞれの配列番号:３,４および５)と、重要な相同性を共有している。ＮＩＭ１は、タンパク質全長中のいたるところに、アンキリンドメイン(図１中で破線で示す)、２アミノ末端セリン(ＮＩＭ１のアミノ酸５５および５９)、一対のリジン( ＮＩＭ１のアミノ酸９９および１００)および酸性Ｃ末端を含む、ｌκBαのいくつかの重要な構造ドメインを含む。全体的に、ＮＩＭ１およびｌκBαは、その残基の３０％の同一性および残基の５０％の保存性置換を共有する。このように、このタンパク質を通して、ｌκBαとＮＩＭ１の間には、相同性があり全体の類似性は８０％である。シグナル伝達においてｌκBαタンパク質が機能する１つの方法は、シトソル転写因子ＮＦ-κBに結合し、それが核へ侵入して標的遺伝子の転写を変更するの阻止することによる(Baeuerle and Baltimore，1996;Baldwin，1996)。ＮＦ-κB の標的遺伝子は、抗ウイルス性、抗菌性または細胞死反応を含む、いくつかの細胞プロセスを調節(活性化または阻害)する(Baeuerle and Baltimore，1996)。シグナル伝達経路が活性化されると、ｌκBαは二つのセリン残基(マウスｌκB αのアミノ酸３２および３６)をリン酸化される。これは２重リジン(マウスｌκ Bαの２１および２２のアミノ酸)でのユビキチン化をプログラム化するものである。ユビキチン化後、ＮＦ-κB/ｌκB複合体は、ｌκBαが分解し、ＮＦ-κBが核に放出されるというプロテオソームを経て行く。ｌκBα機能中で重要なリン酸化セリン残基は、ＮＩＭ１においてアミノ酸３５から８４の保存配列の大きなブロックに保存される(図１)。ｌκBαでは、２重リジンが、このタンパク質のＮ末端方向にある約１５アミノ酸に位置するのとは対照的に、ＮＩＭ１では、２重リジンはＣ末端方向にある約４０アミノ酸に位置する。さらに、高度の相同性が、基礎代謝回転速度において重要と示されているセリン/トレオニン豊富カルボキシ末端領域中のＮＩＭ１とｌκBαの間に存在する(Sun et al.，Mol．Cell．Biol．16，1058-1065(1996))。本発明によると、構造的相同性の分析およびｌκBαの機能として重要であると知られている成分の存在に基づき、ＮＩＭ１はｌκBαに似た機能であり、植物遺伝子レギュレーション調節において類似の効果を持つことが予想される。を取り扱う野生型ＮＩＭ１遺伝子を含む植物は、化学的誘導物質で処置すると、より多くのＮＩＭ１遺伝子産物(ｌκB相同体)を持つか、またはＮＩＭ１遺伝子産物(ｌκB相同体)のリン酸化がより少ないのではないかと予想される。本モデルによれば、植物ＮＦ-κB相同体は核から締め出され、ＳＡＲ遺伝子発現および抵抗性反応が起こる結果となる。ｎｉｍ１変異体植物中には、非機能性ＮＩＭ１遺伝子産物が存在する。それゆえ、本モデルによれば、ＮF-κB相同体は自由に核へ行き、抵抗性およびＳＡＲ遺伝子発現を抑制する。本発案と一致して、サリチル酸で処置した動物細胞では、その核内でのｌκB の安定性/発生量の増加および活性ＮＦ-κBの減少がみられる(Kopp and Ghosh， 1994)。ｌκBの変異は、スーパーレプレッサーまたは優性ネガティブとして働くことが知られている(Britta-Mareen Traenckner et al.，ENBO 14:2876-2883(19 95)、Brown et al.，Science 237:1485-1488(1996)、Molecular and Cellular B iology 15:2809-2818(1995)、Waang et al.，Science 274:784-787(1996))。ｌ κBのこれらの変異体形態はＮＦ-κBと結合するが、リン酸化またはユビキチン化されず、それゆえ分解されない。ＮＦ-κBはｌκBと結合したままであり、核内へ移動することができない。上述の点から、ＳＡＲシグナル伝達経路の優性ネガティブレギュレーターとして挙動するＮＩＭ１の変化形態を作ることができる。ＮＩＭ1の優性ネガティブ形態によって形質転換された植物は、ｎｉｍ1変異体植物として反対の表現型をもち、なぜならＮＩＭ1の変化形態によって形質転換された植物は、構成性ＳＡＲ遺伝子発現、およびそれゆえにＣＩＭ表現型を示す、；すなわちトランスジェニック植物は免疫調節されているからである。ＮＩＭ1遺伝子がＳＡＲシグナル伝達経路中で保持する位置により、本明細書中で特に開示したもの以外にも多くの遺伝子変化の結果、ＳＡＲ遺伝子の構成的発現およびそれゆえにＣＩＭ表現型が生じることが予想される。“組換えＤＮＡ技術”と題される下記の項は、野生型より高いレベルで、遺伝形質を転換された植物内でＮＩＭ1遺伝子の変化形態を、組換え的に発現するのに使用できるプロトコルについて述べている。以下に、ＳＡＲシグナル伝達経路の優性ネガティブレギュレータとして挙動するＮＩＭ 1遺伝子の変化形態について述べる。ａ．セリン残基５５および５９をアラニン残基へ変更：ヒトｌκBα中のセリン残基のリン酸化は、ｌκBαの刺激活性化分解とそれによるＮＦ-κBの活性化に必要とされる。ヒトｌκBα中のセリン残基(Ｓ３２およびＳ３６)のアラニン残基への突然変異誘発は、刺激により誘発されるリン酸化を抑制し、従ってｌκBαプロテオソーム媒介分解をブロックする(Traenckner e t al.，1995;Brown et al.，1996;Brockman et al.，1995 Wang et al.，1996) 。このｌκBαの変化形態は、細胞質中でＮＦ-κBを保持し、それによって下流のシグナル形成事象をブロックすることにより優性ネガティブ形態として機能できる。。図１に示すＮＩＭ1とｌκBの間のアミノ酸配列比較に基づけば、ＮＩＭ１(配列番号:２)中のセリン５５(Ｓ５５)および５９(Ｓ５９)は、ヒトｌκBαのＳ３２およびＳ３６と相同である。ＮＩＭ1の優性ネガティブ形態を構築するために、アミノ酸位置の５５および５９のセリンをアラニン残基へ突然変異させる。そのため、好ましい実施態様では、コード化した生成物が、シロイヌナズナNI M1アミノ酸配列(配列番号:２)の５５および５９位に相当するアミノ酸位置でセリンの代わりにアラニンを持つよう、ＮＩＭ1遺伝子を変える。ｂ．Ｎ末端欠失リン酸化部位Ｓ３２およびＳ３６と同様にユビキチン化リジン残基Ｋ２１およびＫ２２を含む、ヒトｌκBαのアミノ酸１-３６(Brockman et al.，1995;Sun e t al.，1996)または１-７２(Sun et al.，1996)の欠失は、トランスフェクションしたヒト細胞培養物において優性ネガティブｌκBα表現型をもたらす。ＮＩＭ1遺伝子産物の最初の１２５アミノ酸のＮ末端欠失により、上述したＳ５５およびＳ５９の推定リン酸化部位と同様に、ユビキチン化部位として作用する８つのリジン残基が除去される。好ましい実施態様では、コード化した生成物が、天然のシロイヌナズナＮＩＭ1アミノ酸配列(配列番号:２)と比較して、最初のおよそ１２５アミノ酸を欠いているように、ＮＩＭ1遺伝子を変える。ｃ．Ｃ末端欠失ヒトｌκBαのアミノ酸２６１-３１７の欠失は、Ｃ末端中のセリンおよびトレオニン残基の構成性リン酸化をブロックし、本来備わっている安定性の強化をもたらす。このｌκBαの変化形態は、優性ネガティブ形態として機能すると予想される。セリンおよびトレオニンが豊富な領域は、ＮＩＭ１のＣ末端中、アミノ酸５２２-５９３に存在する。したがって、好ましい実施態様では、コード化した生成物は、天然シロイヌナズナＮＩＭ１アミノ酸配列(配列番号:２)と比べて、アミノ酸５２２-５９３を含むそのＣ末端の一部を欠いているようにＮＩＭ1遺伝子を変える。ｄ．Ｎ末端/Ｃ末端欠失キメラおよびアンキリンドメインＮＩＭ1遺伝子産物の変化形態は、Ｃ末端およびＮ末端セグメント欠失またはキメラの結果として生産される。本発明のまた別の実施態様では、ＮＩＭ1遺伝子由来のアンキリンドメインを含む構築物が準備される。３．別のＳＡＲ遺伝子の組換え発現本発明の方法に使用される免疫調節化植物は、Ward et al.(1991)で叙述されている、様々なＳＡＲ遺伝子の組換え発現によって創ることも可能である。例として、１つ以上のＰＲ-タンパク質遺伝子の過発現によって作られる病害抵抗性稙物について叙述されている、米国特許第5,614,395を参照。それは特にＮＩＭ1 遺伝子の形態の組換え発現について言及しているが、“組換えＤＮＡ技術”と題される下記の項、野生型より高いレベルで、トランスジェニック植物においてＰＲ-タンパク質遺伝子等の別のＳＡＲ遺伝子を組換え的に発現させるのにも使用できる、プロトコルについて述べている。組換えＤＮＡ技術ＳＡＲ遺伝子発現を高めることによって植物に病害抵抗性を与える、この野生型または変化形態ＮＩＭ1遺伝子は、通常の組換えＤＡＮ技術を用いて、植物細胞中へ組み込むことができる。一般にこれは、上述ＮＩＭ１の選択された形態をコードするＤＮＡ分子を、当業者に知られている標準のクローニング手法を使用して、ＤＮＡ分子が異種(すなわち通常なら存在しない)である発現システムへ挿入することを含む。このベクターは、挿入したタンパク質-コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含む。プラスミド、バクテリオファージウイルス、および別の修飾されたウイルスといった、当業者に知られているたくさんのベクター系を使用することができる。適切なベクターは、ラムダベクター系λgtl１、λg tl０およびCharon４等のウイルスベクター、プラスミドベクター、例えばpBl 12 1、pBR 322、pACYC 177、pACYC 184、pAR群、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pU C19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNA11、および別の類似系などを含むが、これらに限られるものではない。発現システムの成分を、発現を強めるために修飾することもできる。例えば、先端を切った配列、ヌクレオチド置換または別の修飾を使用することもできる。本明細書中で述べるこの発現システムは、実質的には適切な条件において農産物植物細胞を形質転換するのに使用できる。ＮＩＭ1遺伝子の選択形態が、トランスジェニック植物中でＳＡＲを活性化するように、形質転換細胞は植物全体のなかで再生させることができる。Ａ．植物発現カセットの構築トランスジェニック植物中で、発現させた遺伝子配列を、最初に、植物中で発現可能な適切なプロモーターの後の、発現カセット中に集める。発現カセットは、導入遺伝子の発現のために必要なまたは選択される、別のどんな配列も含むことができる。このような配列は、転写ターミネーター、発現を増強するための外来配列、例えば、イントロン、生命維持に必要な配列、および遺伝子産物を特定の細胞小器官および細胞区画へターゲッティングする配列等を含むが、上述に限られるものではない。次いでこれらの発現カセットは、下記に示すとおり、植物形質転換ベクターへ容易に移転させることができる。下記は、典型的な発現カセットの様々な成分についての叙述である。１．プロモーター発現カセットに使用されるプロモーターの選択は、トランスジェニック植物内の、導入遺伝子の空間的または時間的発現パターンを決定する。選択したプロモーターは、特定の細胞種(葉表皮性細胞、葉肉細胞、根皮層細胞など)または特定の組織または器官(例えば根、葉、または花)中で導入遺伝子を発現させるので、その選択によって、遺伝子産物の望ましい蓄積位置が反映される。あるいは、選択したプロモーターは、様々な誘導条件のもとで、遺伝子の発現を制御し得る。プロモーターはその強度、すなわち転写を助長する能力で変わる。利用する宿主細胞に応じて、多くの適当なプロモーターのうち１つを使用する。以下は、発現カセットに使用できるプロモーターの、非制限的な例である。ａ．構成的発現、CaMV 35Sプロモーター：プラスミドpCGN1761の構築物は、公開特許出願EP 0 392 225に叙述されており (実施例２３)、出典明示により本明細書に組込まれている。pCGN1761は、“２重 ”CaMV 35Sプロモーターおよびtm1転写ターミネーターを含み、そのプロモーターとターミネーターの間にユニークEcoR1部位があり、また、pUC型バックボーンを持つ。現存するEcoR1部位に加えてNot1およびXho1部位を含む修飾されたポリリンカーをもつpCGN1761誘導体を構築する。この誘導体を、pCGN1761ENXと呼ぶ。pCGN1761ENXは、トランスジェニック植物中、35Sプロモーターの制御下の発現を目的とするポリリンカーの範囲内で、ｃＤＮＡ配列または遺伝子配列(細菌ＯＲＦ配列を含む)をクローニングするのに有用である。そのような構築物の3 5Sプロモーター遺伝子配列tm1ターミネーターカセット全体を、下記の形質転換ベクターへ移動させる、プロモーターに対し５'側の、HindIII、Sph1、SaII、およびXba1位、およびターミネーターに対し３'側のXba1、BamH1、およびBgII部位によって摘出できる。さらに、２重35Sプロモーター断片は別のプロモーターで置換するため、HindIII、Sph1、SaII、Xba1、またはPst1での５'切除、およびポリリンカー制限部位(EcoR1、Not1、またはXho1)のいずれかに伴う３'切除によって除去できる。もし所望すれば、クローニング部位周辺を、翻訳を高めるような配列の導入でにより修飾することができる。これは過発現を望むときに特に有効である。例えば、pCGN1761ENXは、出典明示により本明細書に組込まれている、米国特許第5,639,949の実施例３７に叙述と同様に、翻訳開始部位の最適化によって修飾される。ｂ．化学的/病原体調節可能なプロモーター下での発現 pCGN1761ENXの２重35Sプロモーターを、適当な高い発現レベルをもたらすように選択した別のプロモーターと置き換えることができる。例として、米国特許第 5,614,395記述の化学的調節可能なプロモーターのひとつを、２重35Sプロモーターと置き換えることができる。選択したプロモーターは、好ましくは、制限酵素によってその供給源から摘出するが、代わりに、適切な末端制限部位を持つプライマーでＰＣＲ増幅してもよい。ＰＣＲ増幅行うなら、その場合は、このプロモーターを再配列して、標的ベクター中で、増幅プロモーターのクローニング後の増幅エラーを検査した方がよい。化学的/病原体調節可能なタバコPR-1aプロモーターは、プラスミドpCIB1004(構築は、出典明示により本明細書に組込まれているEP 0 322 104の実施例２１を参照)から切断し、プラスミドpCGN1761ENX(Uknes st al.，1992)へ移す。pCIB1004はNco1で切断し、得られた線状断片の３'突出部をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる処置で平滑末端にする。次いで断片をHindI II切断し、得られたPR-1aプロモーター含有断片をゲル精製し、２重35S プロモーターを取り除いておいたpCGN1761ENX中でクローニングした。これはXho 1での切断およびT4ポリメラーゼによる平滑末端化、次いでHindIIIでの切断、およびラージベクター-ターミネーター含有断片を単離してこの中に、pCIB1004プロモーター断片をクローニングすることによってなされる。これにより、PR-1a プロモーターおよびtm1ターミネーターを持つpCGN1761ENX誘導体、およびユニークEcoR1およびNot1部位を持つ介在ポリリンカーを産出する。この選択されたコード配列を、このベクター内へ挿入することもでき、続いてこの融合生成物(すなわちプロモーター-遺伝子-ターミネーター)を選択された形質転換ベクター(以下に記述するものを含む)へ移すことができる。米国特許第5,523,311および5,61 4,395で開示されている、ベンゾチアジアゾール、イソニコチン酸、およびサリチル酸化合物等の、様々な化学的レギュレーターを、本発明により形質転換した植物中で選択したコードの配列の発現を引き起こすために使用することができる。ｃ．構成的発現、アクチンプロモーターアクチンの数種のアイソフォームは、ほとんどの細胞型で発現することが知られており、それゆえにアクチンプロモーターは、構成性のプロモーターとして適するものである。とりわけ、イネAct1遺伝子由来のプロモーターがクローニングされ、特性化されている(McElroy et al．Plant Cell 2:163-171(1990))。このプロモーターの1.3kbフラグメントは、イネプロトプラスト中で発現するのに必要な調節エレメント全てを含むことが見出された。さらに、Act1プロモーターに基づく非常に多くの発現ベクターが、単子葉植物で使用するために具体的に構築されている(McElroy et al．Mol．Gen．Genet．231:150-160(1991))。これらはA ctl-イントロン１、Adh15フランキング配列、およびAdh1-イントロン1(トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来)およびCaMV 35S配列由来の配列を組み込んでいる。最も高い発現を示すベクターは、35SとAct1イントロンの融合物、またはAct15'フランキング配列およびAct1イントロンの融合物であった。( ＧＵＳリポーター遺伝子)の開始ＡＴＧあたりの配列の最適化もまた、発現を強める。McElroy et al.(Mol．Gen．Genet．231:150-160(1991))叙述の、プロモーター発現カセットは、遺伝子発現用に容易に修飾でき、単子葉植物の宿主での使用に特に適している。例えば、プロモータ含有フラグメントを、McElroy構成から取り除き、pCGN1761ENX中の２重35Sプロモーターと置き換えて使用し、これを次いで、特定の遺伝子配列の挿入に利用する。このように構築した融合遺伝子は、その後適当な形質転換ベクターへ移すことができる。別の報告では、第１のイントロンを持つイネAct1プロモーターも、培養大麦細胞で高度の発現を導くことがわかっている(Chibbar et al．Plant Cell Rep．12:506-509(1993))。ｄ．ユビキチンプロモーターの構成的発現ユビキチンは、たくさんの細胞形態中に累積すると知られている、もうひとつの遺伝子産物であり、そのプロモーターは、トランスジェニック植物(例えばヒマワリ-Binet et al．Plant Science 79:87-94(1991)およびトウモロコシ-Chris tensen et al．Plant Molec．Biol．12:619-632(1989))で使用される数種類からクローニングされている。トウモロコシユビキチンプロモーターは、トランスジェニック単子葉植物系で開発され、その配列および単子葉植物の形質転換用に構成されたベクターは、、出典明示により本明細書に組込まれている特許公開物EP 0 342 926(Lubrizolへ)に開示されている。Taylor et al．(Plant Cell Rep.12 :491-495(1993))は、トウモロコシユビキチンプロモーターおよび第１のイントロン、およびマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントを介して導入するとき多くの単子葉植物の細胞懸濁液におけるの高活性を含むベクター(pAHC25)について記載している。ユビキチンプロモーターはトランスジェニック植物、特に単子葉植物での遺伝子発現に適している。適したベクターはpACH25誘導体または、適切なユビキチンプロモーターおよび/またはイントロン配列の導入により修飾した本明細書中に叙述されている形質転換ベクターのいずれかである。ｅ．根特異的発現遺伝子発現の別のパターンは根発現である。適切な根プロモーターは、de Fra mond（FEBS 290:103-106(1991))および公開特許出願EP 0 452 269(出典明示により本明細書に組込まれている)に記述されている。このプロモーターは、選択された遺伝子の挿入や、続くプロモーター-遺伝子-ターミネーターカセット全体の、対象となる形質転換ベクターへの移入のために、pCGN1761ENX等の適切なベクターに移される。ｆ．創傷誘発プロモーター創傷誘発プロモーターもまた、遺伝子発現に適切である。このようなプロモーターの多くが記載されており(例えば、Xu et al．Plant Molec．Biol．22:573-5 88(1993)、Logemann et al．Plant Cell 1:151-158(1989)、Rohrmeier & lehle ，Plant Molec．Biol．22:783-792(1993)、Firek et al．Plant amolec．Biol．22 :129-142(1993)、Warner et al．Plant J．3:191-201(1993))、およびこれら全てが本発明での使用に適している。Logemann et al.は、双子葉植物のジャガイモwunl遺伝子の５'上流配列について叙述している。Xu et al.は、双子葉植物ジャガイモ(pin2)由来の創傷誘発プロモーターは、単子葉植物イネ中で活性であると示している。さらに、Rohrmeier & Lehleは、創傷誘発し、かつ通常の技術を使用する同起源のプロモーター(cognate promoter)を単離するときに使用できるトウモロコシWiplcＤＮＡのクローニングについて述べている。同様に、Firek et al.およびWarner et al.は、局部的創傷および病原体侵入部位で発現する、単子葉植物アスパラガス由来の創傷誘発遺伝子について述べている。クローニング技術の使用は、当分野でよく知られており、これらのプロモーターを、適切なベクターへ移し、本発明に適する遺伝子へ融合させ、植物創傷部位でこれらの遺伝子を発現させるのに使用することができる。ｇ．髄優先の発現出典明示により本明細書に組込まれている特許出願WO93/07278に、トウモロコシtrpA遺伝子で、髄細胞で優先的に発現されるものの単離について叙述されている。転写開始から１７２６bpまで伸長するこの遺伝子配列およびプロモーターを述べている。標準の分子生物学的技術を使用して、このプロモーターまたはその部分を、35Sプロモーターの代わりとなって、髄優先の方法で、外来の遺伝子の発現を制御するのに使用できるpCGN1761のようなベクターへ移すことができる。実際、髄優先のプロモーターまたはその部分を含む断片を、いずれのベクターにも移すことができ、トランスジェニック植物で有利なように修飾できる。ｈ．葉特異的発現ホスホエノールカルボキシラーゼ(ＰＥＰＣ)をコードするトウモロコシ遺伝子は、Hudspeth & Grula(Plant Molec Biol 12:579-589(1989))によって述べられている。標準の分子生物学的技術を使用して、この遺伝子のためのプロモーターを、トランスジェニック植物の葉特異的な方法で、いずれの遺伝子の発現を制御するのに使用することができる。２．転写ターミネーター様々な転写ターミネーターは、発現カセットにおいて利用可能である。これらは導入遺伝子およびその正確なポリアデニル化以外に、転写の終了を担う。適切な転写ターミネーターは、植物中で機能することが知られたものであり、CaMV 3 5Sターミネーター、tm1ターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーターおよびエンドウrbcS E9ターミネーターを含む。これらは単子葉植物および双子葉植物両方で使用可能である。３．発現の増強または調節のための配列転写単位内からの遺伝子発現を増強するたくさんの配列が見いだされており、これらの配列を、本発明の遺伝子と共に使用してトランスジェニック植物におけるその発現を増強することができる。様々なイントロン配列が、特に単子葉植物細胞で、発現を増強させると示されている。例えば、トウモロコシAdh1遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞内へ導入されると、その同起源のプロモーターのもとで、野生型遺伝子の発現を顕著に増強することが分かっている。イントロン１は特に効果的であることが分かっており、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との、融合構築物中で発現を増強した(Callis et al．Genes Develop．1:1183- 1200(1987))。同様の実験系で、トウモロコシbronze1遺伝子のイントロンは発現増強において、類似の効果を有していた。イントロン配列は、植物形質転換ベクター中へ、一般的には非翻訳リーダーの範囲内へごく普通に組み込まれる。ウイルス由来のたくさんの非翻訳リーダー配列もまた、発現を増強することが知られており、これらは双子葉植物で特に効果的である。とりわけ、タバコモザイクウイルス(ＴＭＶ:“Ｗ配列”)、トウモロコシクロロシス斑点ウイルス(ＭＣＭＶ)およびアルファルファモザイクウイルス(ＡＭＶ)由来のリーダー配列は、発現を増強するのに有効であることが示されている(例えば、Gallie et al．Nuc l．Acids Res．15:8693-8711(1987)、Skuzeski et al．Plant Molec．Biol．15: 65-79(1990)) ４．細胞内の遺伝子産物のターゲッティング遺伝子産物をターゲッティングする様々なメカニズムが植物に存在することが知られており、これらのメカニズムの機能を制御する配列は細部に髄って、特性化されている。例えば、葉緑体への遺伝子産物のターゲッティングは、種々のタンパク質のアミノ末端にあるシグナル配列によって制御されており、これは、葉緑体の移入の際に切断されて成熟タンパク質をもたらす(例えば、Comai et al． J．Biol．Chem．263:15104-15109(1988))。これらのシグナル配列を、異種遺伝子産物と融合させると異種産物の葉緑体への移入をもたらすことができる(Van d en Broeck，et al．Nature 313:358-363(1985))。適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、ＲＵＢＩＳＣＯタンパク質、ＣＡＢタンパク質、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２タンパク質および、葉緑体局在することが知られているほかの多くのタンパク質をコードするｃＤＮＡｓの５'末端から単離した。米国特許第5 ,639,949の実施例３７中“Expression With Chloroplast Targeting”表題の部分を参照。別の遺伝子産物は、ミトコンドリアおよびペルオキシソームなどの別の細胞小器官に局在している(例えば、Unger et al．Plant Molec．Biol．13:411-418(19 89))。これらの生成物をコードするｃＤＮＡｓもまた、異種遺伝子産物のこれらの細胞小器官へのターゲッティングを、もたらすよう操作する。このような配列の例は、ミトコンドリアの核-コード化ＡＴＰアーゼおよび特定アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼアイソフォームである。標的とする細胞タンパク質体はRogers et al.らによって叙述されている(Proc．Natl．Acad．Sci USA 82 :6512-6516(1985))。加えて、遺伝子産物の別の細胞画分へのターゲッティングをひき起こす配列が、特性化されている。アミノ末端配列は、ER、アポプラストに対するターゲッティング、およびアリューロン細胞からの細胞外分泌を担う(Koehler & Ho，Plant Cell 2:769-783(1990))。加えてアミノ末端配列は、カルボキシ末端配列とともに遺伝子産物の空胞ターゲッティング(vacuolar targeting)を担う(Shinshi et al．Plant Molec．Biol．14:357-368(1990))。上述した適切な標的化配列を対象となる導入遺伝子配列へ融合することによって、導入遺伝子産物をどの細胞小器官または細胞区画へも導くことが可能になる。葉緑体ターゲッティングの場合、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子、ＣＡＢ遺伝子、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子またはＧＳ２遺伝子由来の葉緑体シグナル配列は、フレーム内で導入遺伝子のアミノ末端ＡＴＧと融合させる。選択されたシグナル配列は、知られている切断部位を含み、また構築された融合体は、切断に必要な切断部位の後ろのアミノ酸も考慮に入れるべきである。ある事例では、この要件は、切断部位と導入遺伝子ＡＴＧの間に少数のアミノ酸を添加するか、または代わりに導入遺伝子配列のなかで何種類かのアミノ酸を置換することによって満たされる。葉緑体移入用に構築した融合体は、Barlett et al.著、Edelmann et al．（Eds.）Methods in Chloroplast Molecular Biology，Elsevier pp 1081-1 091(1982)およびWasmann et al．Mol．Gen．Genet．205:446-453(1986)に叙述されている技術を使用して、インビトロ転写構築物のインビトロ翻訳、続くインビトロ葉緑体摂取により葉緑体摂取効果について検査することができる。これらの構築技術は当分野でよく知られており、ミトコンドリアおよびペルオキシソームにも同様にあてはまる。細胞ターゲッティングに対する上述のメカニズムは、その同起源のプロモーターに関してだけでなく、異種プロモーターに関しても利用できるので、標的シグナルを導くプロモーターとは異なる発現パターンを持つプロモーターの転写レギュレーション下で、特異的な細胞ターゲッティングという目的も達成できる。Ｂ．植物形質転換ベクターの構築植物形質転換に利用できるたくさんの形質転換ベクターは、植物形質転換分野の当業者には知られており、本発明に適切な遺伝子はそのようなベクターとともに使用できる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換の標的種によって変わる。ある標的種では、異なる抗生物質のまたは除草剤の選択マーカーが好ましい。形質転換で通常使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関連抗生物質に対する抵抗性を与えるnptII遺伝子(Messing & Vierra．Gene 1 9:259-268(1982)、Bevan et al.，Nature 304:184-187(1983))、除草剤フォスフィノスリシンに対する抵抗性を与えるbar遺伝子(White et al.，Nucli．Acide R es 18:1062(1990)、Spencer et al．Theor．Appl Genet 79:625-631(1990))、抗生物質のハイグロマイシンに対する抵抗を与えるhph遺伝子(Blochinger & Diggl mann，Mol Cell Bio 4:2929-2931)、メタトレキセートに対する抵抗性を与えるd hfr遺伝子(Bourouis et al.，EMBO J．2(7))、およびグリフォセートに対する抵抗性を与えるEPSPS遺伝子(米国特許第4,940,935および5,188,642)を含む。１．アグロバクテリウム形質転換に適したベクターたくさんのベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用して形質転換に利用できる。これらは典型的に、少なくとも１つのＴ-ＤＮＡ境界配列を運搬し、pBIN19(Bevan．Nucl．Acids Res．(1984))およびpXYZなどのベクターを含む。以下に、アグロバクテリウム形質転換に適切な２つの典型的なベクターの構築について述べる。ａ．pCIB200およびpCIB2001 バイナリーベクターpCIB200およびpCIB2001は、アグロバクテリウムとともに使用するために、組換えベクターの構築に使用され、次の方法で構築される。 pTJS75kanは、pTJS75のNarl消化して(Schmidhauser & Helinski，J．Basteriol ．164 :446-455(1985))、テトラサイクリン抵抗遺伝子を摘出し、次いでNPTIIを運搬するpUC4K由来のAccl断片の挿入させることにより作られる(Messing & Vierra ，Gene 19:259-268(1982):Bevan et al.，Nature 304:184-187(1983):McBride e t al.，Plant Molecular Biology 14:266-276(1990))。Xho1リンカーを、左および右Ｔ-ＤＮＡ境界配列、植物選択性nos/nptIIキメラ遺伝子およびpUCポリリンカーを含むPCIB7のEcoR1断片に連結させ(Rothstein et al.，Gene 53:153-161(1 987))、およびXho1消化断片を、Sa11消化pTJS75kan中でクローニングしてpCIB20 0をつくる(EP 0 332 104、実施例１９参照)。pCIB200は次のユニークポリリンカー制限部位：EcoR1、Sst1、Kpn1、BgIII、Xba1、およびSaIIを含む。 pCIB2001は、別の制限部位のポリリンカーへの挿入によりつくられる。pCIB2001 のポリリンカー中のユニーク制限部位は、EcoR1、Sst1、Kpn1、BgIII、Xba1、Sa 11、Mlu1、Bc11、Avr11、Apa1、Hpa1、およびStu1である。pCIB20011ま、これらのユニーク制限部位を含む以外に、植物および細菌のカナマイシン選択、アグロバクテリウム介在形質転換用の左および右のＴ-ＤＮＡ境界、EcoR1と別の宿主間との起動のためのRK2-誘導trfA機能、およびRK2由来のoriTおよびoriV機能も持つ。このpCIB2001ポリリンカーは、自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適当である。ｂ．pCIB10およびそのハイグロマイシン選択誘導体このバイナリーベクターpCIB10は、植物選択用のカナマイシン抵抗性をコードする遺伝子、およびＴ-ＤＮＡ右および左の境界配列を含み、Ecoliおよびアグロバクテリウム両方の中で複製できる広い宿主範囲プラスミドpRK252由来の配列を組み込む。その構築は、Rothsrein et al．(Gene 53:153-161(1987))で述べられている。pCIB10のウイルス誘導体は、Gritz et al．(Gene 25:179-188(1983))叙述のハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼに対する遺伝子を組み込むことにより構築される。これらの誘導体は、ハイグロマイシンのみ(pCIB743)またはハイグロマイシン酸またはカナマイシン(pCIB715、pCIB717)に対するトランスジェニック植物細胞の選択を容易にする。２．非アグロバクテリウム形質転換に適したベクターアグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用しない形質転換は、選択した形質転換ベクター中にＴ-ＤＮＡを必要とせず、それゆえに上述したＴ-ＤＮＡ配列を含むようなベクターのほかにこれらの配列を欠くベクター利用することができる。アグロバクテリウムによらない形質転換技術は、粒子衝撃、プロトプラスト取り込み(例えばPEGおよびエレクトロポレーション)およびマイクロインジェクション経由の形質転換を含む。ベクターの選択は、形質転換対象となる種類を好ましく選択するかどうかに大きく依存する。以下に、非アグロバクテリウム形質転換に適する典型的なベクターの構築について述べる。ａ．pCIB3064 pCIB3064は、除草剤バスタ(またはフォスフィノスリシン)による選択と併用する、直接遺伝子導入技術に適したpUC由来のベクターである。このプラスミドpCI B264は、E．coli GUS遺伝子と作動可能に融合させたCaMV35Sプロモーターおよび CaMV35S転写ターミネーターを含み、PCT公開出願WO93/07278に叙述されている。このベクターの35Sプロモーターは、開始部位の５'に２つのＡＴＧ配列を含む。これらの部位は、通常のＰＣＲ技術を用いてＡＴＧを取り除くような方法で、変異させ、Ssp1およびPvu11の制限部位をつくる。この新しい制限部位は、ユニークSaII部位から９６および３７塩基対、および実際の開始部位から１０１および４２塩基対離れている。得られたpCIB246の誘導体は、pCIB3025と呼ぶ。このGUS 遺伝子は次いで、SaIIおよびSac1消化してpCIB3025より摘出し、平滑末端化し、再度連結させて、プラスミドpCIB3060を作る。プラスミドpJIT82は、John Innes Centre，Norwichより入手し、Streptomyces viridochromogene由来の、bar遺伝子を含む４００bpSma1フラグメントを摘出し、pCIB3060のHpa1部位へ挿入する(T hompson et al．EMBO J 6:2519-2523(1987))。こうして、除草剤選択のためのCa MV 35Sプロモーターおよびターミネーターの制御下のbar遺伝子、アンピシリン抵抗性の遺伝子(E．coliでの選択用)、およびユニーク部位Sph1、ベクターは、自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適している。ｂ．pSOG19およびpSOG35 pSOG35は、メトトレキセートに対する抵抗性を付与する選択マーカーとしてE ．coli遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DFR)を利用する、形質転換ベクターである。PCRを使用して、35Sプロモーター(800bp)、トウモロコシAdh1遺伝子由来のイントロン６(550bp)、およびpSOG10由来のGUS非翻訳リーダー配列１８bpを増幅する。E．coliジヒドロ葉酸レダクターゼII型遺伝子をコードする２５０bp断片もまたPCRによって増幅され、これら２つのPCR断片は、pUC19ベクターバックボーンおよびノパリンシンターゼターミネーターを含むpB1221(Clontech)由来の Sac1-Pst1断片と組み合わせる。これらのフラグメントを合わせて、イントロン6 配列と融合した35Sプロモーター、GUSリーダー、DHFR遺伝子およびノパリンシンターゼターミネーターを含むpSOG19をつくる。pSOG19中のGUSリーダーを、トウモロコシクロロシス斑ウイルス(MCMV)由来のリーダー配列と置換して、ベクター pSOG35をつくる。pSOG19およびpSOG35は、アンピシリン抵抗性のpUC遺伝子を運び、外来の物質のクローニングに利用できるHindIII、Sph1、Pst1およびEcoR1部位を持つ。Ｃ．形質転換一旦、対象のコード配列が、発現系でクローニングされると、それは植物細胞内で形質転換される。植物の形質転換および再生の方法は、当分野でよく知られている。例えば、Tiプラスミドベクターは、外来のＤＮＡの搬入や、直接ＤＮＡ取り込み、リポゾーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルにも利用される。加えて、アグロバクテリウム属の細菌は、植物細胞を形質転換するのに利用できる。以下は、双子葉類および単子葉類植物両方を形質転換させる代表的な技術の説明である。１．双子葉植物の形質転換双子葉植物の形質転換は当分野によく知られており、アグロバクテリウムに基づくの技術およびアグロバクテリウムを必要としない技術を含む。非アグロバクテリウム技術は、プロトプラストまたは細胞による、外来遺伝物質の直接摂取を伴う。これは、ＰＥＧまたはエレクトロポレーション介在摂取、粒子衝撃介在搬入、またはマイクロインジェクションによって達成できる。これらの技術の例は、Paszkowski et al.，EMBO J 3:2717-2722(1984)、Potrykus et al.，Mol．Gen ．Genet．199:169-177(1985)、Reich et al.，Biotechnology 4:1001-1004(1986 )、およびKlein et al.，Nature 327:70-73(1987)によって叙述されている。いずれの事例でも、形質転換細胞を、当分野で知られている標準の技術を使用して完全な植物へと再生させる。アグロバクテリウム介在形質転換は、形質転換能率が高く、多くの異なる種に広く利用できるので、双子葉植物の形質転換に好ましい技術である。アグロバクテリウム形質転換は、典型的に、対象の外来ＤＮＡ(例えばpCIB200またはpCIB20 01)を運ぶバイナリーベクターを、宿主アグロバクテリウム株の共存するTiプラスミド上にまたは染色体上(例えばpCIB200またはpCIB2001の菌株CIB542(Uknes e t al.，Plant Cell 5:159-169(1993)))のいずれかにあるvir遺伝子の補足に頼る、適切なアグロバクテリウム株へ転移させる必要がある。アグロバクテリウムに対する組換えバイナリーベクターの転移は、組換えバイナリーベクターをもつE ．coli、pRK2013等のプラスミドをもつヘルパーE．coli株、および標的アグロバクテリア株に対して組換えバイナリーベクターを起動させることができるもの、を使用して、３世代交配によって行われる。かわりに、組換えバイナリーベクターを、ＤＮＡ形質転換によってアグロバクテリウムへ転移させ組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常、植物の外植片とアグロバクテリウムとの共培養を必要とし、当分野でよく知られているプロトコルは下記である。形質転換された組織は、バイナリープラスミドＴ-ＤＮＡ境界間に存在する、抗生物質または除草剤抵抗性マーカーを入れた、選択培地上で再生させる。植物細胞を遺伝子で形質転換させる別の方法は、植物組織および細胞で不活性または生物学的に活性な粒子のねじ込み(propelling)を伴う。この技術は、すべてSanford et al.の米国特許第4,945,050、5,036,006および5,100,792で叙述されている。一般的に、この方法で、細胞で不活性または生物学的に活性な粒子を細胞の外側表面を貫通して、その内部に組み込ませるのに効果的な条件下でねじ込む。不活性粒子を利用するときは、粒子を標的遺伝子含有ベクターでコーティングすることにより、ベクターを細胞へ導入できる。あるいは、ベクターを粒子の通った跡にそって細胞内へ運ぶ、標的細胞をベクターで取り囲んでもよい。生物学的に活性な粒子(例えば、乾燥イースト細胞、乾燥細菌またはバクテリオファージ、それぞれ導入しようとするＤＮＡを含む)もまた、植物細胞組織中へねじ込む(propel)ことができる。２．単子葉植物の形質転換ほとんどの単子葉植物の形質転換は、今は慣用となっている。好ましい技術は、ＰＥＧまたはエレクトロポレーション技術を使用するプロトプラストへの直接的な遺伝子導入、およびカルス組織への粒子衝撃を含む。形質転換は、単一ＤＮＡ種または複数のＤＮＡ種(すなわち、同時形質転換)を用いて行われ、これらの技術両方は、本発明の使用に適している。同時形質転換は、ベクターを完全に構築しなくてもよく、対象遺伝子や選択マーカーの同一連鎖群に属さない遺伝子座をもつトランスジェニック植物をつくり、次世代で選択マーカーを取り外すことが可能であるという利点を持つ。しかし、同時形質転換を使用することの不利点は、別のＤＮＡ種がゲノム内に組み込まれる頻度が１００％より低い(Schocher et al．Biotechnology 4:1093-1096(1986))。特許出願EP 0 292 435、EP 0 392 225、およびWO 93/07278には、トウモロコシの精粋近交系からのカルスおよびプロトプラストの調製、ＰＥＧまたはエレクトロポレーションを使用したプロトプラストの形質転換、および形質転換プロトプラストからのトウモロコシの再生についての技術が述べられている。Grodon K ann et al.，(Plant Cell 2:603-618(1990))およびFromm et al.，(Biotechnolo gy 8:833-839(1990))は、粒子衝撃を使用した、A188誘導トウモロコシ系列の形質転換技術を公開している。さらに、WO 93/07278およびKoziel et al．(Biotec hnology 11:194-220(1993))は、粒子衝撃による、トウモロコシの精粋近交系の形質転換技術を述べている。この技術は、受粉後１４から１５日のトウモロコシ穂から切除した１.５から２.５mm長の未成熟のトウモロコシ胚、および衝撃用のPDS-1000Heマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント装置を利用する。イネの形質転換は、プロトプラストまたは粒子衝撃を利用する直接遺伝子導入技術により行うこともできる。プロトプラスト媒介形質転換は、Japonica種やIn dica種では報告されている(Zhang et al.，Plant Cell Rep 7:379-384(1988);Sh imamoto et al．Nature 338:274-277(1989);Datta et al．Biotechnology 8:736 -740(1990))。いずれの種も、粒子衝撃を用いて普通に形質転換可能である(Chri stou et al．Biotechnology 9:957-962(1991))。特許出願ＥＰ０３３２５８１は、Pooideaeプロトプラストの作製、形質転換および再分化についての技術を記載している。これらの技術によって、Dactylis やコムギの形質転換も可能である。更に、コムギ形質転換については、Vasil et al．(Biotechnology 10:667-674(1992))にＣ型長期再分化可能カルスの細胞への粒子衝撃を用いる場合が、更にVasil et al．(Biotechnology 11:1553-1558(1 993))およびWeeks et al．(Plant Physiol．102:1077-1084(1993))には未熟胚および未熟胚誘導カルスの粒子衝撃を用いる場合が記載されている。しかしながら、好ましいコムギ形質転換技術は、未熟胚の粒子衝撃によるコムギの形質転換を必要とし、遺伝子搬入の前に高スクロースまたは高マルトース段階のいずれかを含む。衝撃の前に、かなり多数の胚(長さ０.７５−１mm)を体細胞胚誘導用に３％スクロースと３mg/２,４-Ｄを含むＭＳ培地(Murashige & Skoog，Physiologia Plantarum 15:473-497(1962))上で平板培養し、暗所で発生させる。衝撃を実施する日に、胚を誘導培地から取り出し、浸透培地(osmoticum)(即ち、所定濃度、典型的には１５％のスクロースとマルトースを加えた誘導培地)上で平板培養した。この胚を２−３時間原形質分離させ、次いで衝撃を与えた。標的プレート１つ当り胚２０個が典型的であるが、絶対ではない。標準操作を用いて適切な遺伝子担持プラスミド(例えば、ｐＣＩＢ３０６４とｐＳＧ３５)をマイクロメーターサイズの金粒子上に沈積させる。標準８０メッシュスクリーンを用いてバースト圧〜１０００psiで胚のプレートそれぞれをDuPont Biolisticsま)回復させる。２４時間後、胚を浸透培地から取り出し、誘導培地に戻して再分化まで約１ヶ月の間そのまま維持する。およそ１ヶ月後、体細胞胚増殖カルスを発生した胚外植体を再分化培地(ＭＳ＋１mg/リットルＮＡＡ、５mg/リットルＧＡ)に移し、更に適切な選択剤(ｐＣＩＢ３０６４の場合１０mg/lバスタ、ｐＳＯＧ３５の場合２mg/1メトトレキセート)を含める。およそ１ヶ月後、発生したシュートを、半強度ＭＳ、２％スクロース、および同濃度の選択剤を含む“ＧＡ７ｓ”として知られている大きい滅菌容器に移す。最近では、Agrobacteriumを用いた単子葉植物の形質転換が報告されている。ＷＯ９４/００９７７および米国特許第５,５９１,６１６号、いずれも出典明示により本明細書の一部とする、を参照。育種ＳＡＲ遺伝子、例えば、ＮＩＭ１遺伝子の一形態での形質転換により得られた免疫調節化植物は、単子葉植物や双子葉植物を含む広範囲の植物種の中のいずれでもよいが、本発明の方法に使用した免疫調節化植物は、好ましくは、上記の農業経済的に重要な標的農産物のリストから選択される。生産量と品質に重要な他の特性と組合せて選択したＮＩＭ１遺伝子形態の発現は、育種により植物系列に組込むことができる。育種法および技術は、当分野では知られている。例えば、 Welsh J．R.，Fundamentals of Plant Genetics and Breeding，John Wiley & S ons，NY(1981);Crop Breeding，Wood D．R．(Ed.)American Society of Agronom y Madison，Wisconsin(1983);Mayo O.，The Theory of Plant Breeding，Second Edition，Clarendon Press，Oxford(1987);Singh，D．P.，Breeding for Resis tance to Diseases and Insect Pests，Springer-Verlag，NY(1986);and Wricke and Weber，Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding，Walter d e Gruyter and Co.，Berlin(1986)参照。上記のトランスジェニック種子および植物内に組込まれた遺伝的特性は、有性生殖または栄養繁殖により継代されるため、子孫植物において維持させ、伝搬させることができる。一般にこの維持や伝搬により、既知の農業的方法の用途を耕作、播種、または収穫などの特定目的に適合するよう発展させることができる。水耕法または温室技術などの特別な方法も応用できる。生長中の農産物は、昆虫や感染による攻撃や損傷、並びに、雑草との競合を受けやすいので、収量を増進するために、雑草、植物病害、昆虫、線虫、および他の有害な条件を制御する方法をとる。これらの方法には、土壌の耕作や雑草および感染植物の除去などの機械的方法や、除草剤、殺真菌剤、花粉発育阻止剤、抗線虫薬、生長調節剤、成熟化剤、および殺虫剤などの農薬の適用がある。本発明のトランスジェニック植物および種子の有利な遺伝的特性は、更に植物育種に使用でき、害虫、除草剤またはストレス耐性などの特性の増進した、栄養価の高い、収量の増した、または倒伏または飛散による損失の低下をもたらす改善された構造の植物の開発に役立つ。様々な育種段階は、交雑させる系列の選択、親系列の受粉管理、または適切な子孫植物の選択など、十分に確立されたヒトの介入を特徴とする。所望の特性に応じて、様々な育種法が採用される。これに関連した技術は当分野ではよく知られており、ハイブリダイゼーション、近親交配、戻し交雑育種、多系育種、変種融合(variety blend)、異種間ハイブリダイゼーション、異数体技術等があるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション技術には、機械的または化学的または生化学的手段による雄性または雌性不稔性稙物産出のための植物の不稔化も含む。異系列の花粉と雄性不稔植物を他家受粉すれば確実に、雄性不稔性であるが雌性稔性である植物のゲノムは両方の親系列の特性を均質に獲得する。そのため、本発明のトランスジェニック種子および植物は、例えば、除草剤または殺虫剤処置などの常法の効果を増大するように、または、その修飾された遺伝的特性により常法を省略できるように改良された植物系列の育種にも使用できる。あるいは、ストレス耐性の向上した新規農産物を得ることもでき、これは最適化された遺伝的“装置”により、比較的不利な発生条件に耐えることができなかった収穫産物よりも高品質の収穫産物をもたらす。種子生産では、種子の発芽良否や均質性が重要な生産品特性であるが、その一方で農家の収穫および販売する種子の発芽良否や均質性は重要でない。他の農産物や雑草の種子が混ざっていない状態に農産物を維持するのは困難であるので、種子の運ぶ病害を制御して、発芽良性の種子を生産するために、純粋種子の生育、条件付けおよびマーケティングに熟練した種子生産者により、かなり大規模で十分に確立された種子生産法が開発されてきた。このように、自作の農産物から採れた種子を用いる代わりに特定の品質基準に合致した保証付き種子を購入することは農家にとっては普通の行為である。種子として使用される繁殖物質は、習慣的に除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫薬、軟体動物駆除剤、またはこれらの混合物を含む保護剤コーティングで処置されている。習慣的に使用されるらば、これらの化合物を更に、習慣的に製剤分野で用いられる担体、界面活性剤、または適用促進補助剤と共に処方して、細菌、真菌または病害動物から保護する。保護剤コーティングは、繁殖物質を液体製剤に浸漬したり、混合湿潤または乾燥製剤でコーティングすることにより適用できる。芽または果実を対象に処置するようなその他の適用法も可能である。本発明の更なる態様は、本発明のトランスジェニック植物個体、トランスジェニック植物材、またはトランスジェニック種子の使用を特徴とする上記例示の方法などの新規農業法を提供することである。これらの種子は、適切なパッケージング材からなるバッグ、容器または器に入れてもよく、そのバッグや容器は種子を密封できるものである。バッグ、容器または器は、種子の短期または長期貯蔵のいずれか、または両方に合うように設計されたものである。適切なパッケージング材の例には、クラフト紙などの紙、硬質または軟質のプラスチックまたは他のポリマー材、ガラスまたは金属がある。望ましくは、このバッグ、容器または器は、同種または異種の多層のパッケージング材からなる。一実施態様では、バッグ、容器または器は水または水分と種子とが接触するのを排除または制限するために与える。一例では、バッグ、容器または器は、封止、例えば、加熱封止して、水や水分が入るのを防ぐ。その他の実施態様では、吸水材をパッケージング材層の間または隣に設置する。更に別の実施態様では、バッグ、容器または器またはそれを構成するパッケージング材は、種子の貯蔵または輸送の際の、病害、混入または他の有害作用を制限、抑制また予防するものとして扱われる。このような処置の一例は、例えば、化学的手段による、または放射線照射による滅菌である。本発明に含まれるのは、形質転換植物中で、野生型植物よりも高レベルで発現されるＮＩＭ１遺伝子またはＮＩＭ１タンパク質の一形態を含むトランスジェニック植物の種子を、適切な担体、並びに植物に対して広範囲の病害抵抗性を与えるためのその使用についての説明ラベルと共に含む市販のバッグである。免疫調節化植物への殺菌剤の適用本明細書に記載のとおり、植物を防御する本発明の方法は、次の２段階を必要とする:第１に、ＳＡＲ経路を活性化して免疫調節化植物を提供し、第２に、殺菌剤をかかる免疫調節化植物に適用して、病害抵抗性を相乗的に高める。Ａ．常用の殺菌剤本発明の方法によれば、市販または常用のいずれの殺菌剤も、上記３経路のいずれかにより得られた免疫調節化植物に適用できる。適切な殺菌剤の例には、下記の殺真菌剤があるが、これらに限定されない:４-[３-(４-クロロフェニル)-３ -(３,４-ジメトキシフェニル)アクリロイル]モルホリン(“ジメトモルフ”)(参照：C.Tomlin(編)：The Pesticide Manual，10th edition，Farnhan，UK，1994 ，pages 351-352)；５-メチル-１,２,４-トリアゾロ[３,４-ｂ][１,３]ベンゾチアゾール(“トリシクラゾール”)(参照：C.Tomlin(編)：The Pesticide Manual ，10th edition，Farnhan，UK，1994，pages 1017-1018)；３-アリルオキシ-１, ２-ベンゾチアゾール-１,１-ジオキシド(“プロボナゾール”)(参照：C.Tomlin( 編)：The Pesticide Manual，10th edition，Farnhan，UK，1994，pages 831-83 1)；α-[２-(４-クロロフェニル)エチル]-α-(１,１-ジメチルエチル)-１Ｈ-１, ２,４-トリアゾール-１-エタノール(“テブコナゾール”)(参照：EP-A-40 345) ；１-[[３-(２-クロロフェニル)-２-(４-フルオロフェニル)オキシラン-２-イル ]メチル]-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール(“エポキシコナゾール”)(参照：EP-A-1 96038)；μ-(４-クロロフェニル)-μ-(１-シクロプロピルエチル)-１Ｈ-１,２, ４-トリアゾール-１-エタノール(“シプロコナゾール”)(参照：US-4664696)；５-(４-クロロベンジル)-２,２-ジメチル-１-(１Ｈ-１,２,４-トリアゾル-１-イルメチル)-シクロペンタノール(“メトコナゾール”)(参照：EP-A-267778)；２- (２,４-ジクロロフェニル)-３-(１Ｈ-１,２,４-トリアゾル-１-イル)-プロピル- １,１,２,２-テトラフルオロエチル-エーテル (“テトラコナゾール”)(参照：EP-A-234 242);チル-(Ｅ)-２-{２-[６-(２-シアノフェノキシ)ピリミジン-４-イルオキシ]フェニル}-３-メトキシアクリレート( “ＩＣＩＡ５５０４”、“アゾキシストロビン”)(参照：EP-A-382 375)；メチル-(Ｅ)-２-メトキシイミノ-２-[α-(ｏ-トリルオキシ)-ｏ-トリル]アセテート(“ＢＡＳ４９０Ｆ”、“クレソキシムメチル”)(参照：EP-A-400 417)；２- (２-フェノキシフェニル)-(Ｅ)-２-メトキシイミノ-Ｎ-メチルアセトアミド)(参照：EP-A-398692)；[２-(２,５-ジメチルフェノキシメチル)-フェニル]-(Ｅ)-２ -メトキシイミノ-Ｎ-メチルアセトアミド)(参照：EP-A-398 692)；(１Ｒ,３Ｓ/ １Ｓ,３Ｒ)−2,２-ジクロロ-Ｎ-[(Ｒ)-１-(４-クロロフェニル)エチル]-１-エチル-３-メチルシクロプロパンカルボキサミド(“ＫＴＵ３６１６”)(参照：EP-A -341 475)；マンガンエチレンビス(ジチオカルバメート)ポリマー亜鉛錯体(“マンゼブ”)(参照：US 2 974 156)；１-[２-(２,４-ジクロロフェニル)-４-プロピル-１,３-ジオキソラン-２-イルメチル]-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール(“プロピコナゾール”)(参照：GB-1522657)；１-{２-[２-クロロ-４-(４-クロロフェノキシ)フェニル]-４-メチル-１,３-ジオキソラン-２-イルメチル)-１Ｈ-１,２,４- トリアゾール(“ジフェノコナゾール”)(参照：GB-209860)；１-[２-(２,４-ジクロロフェニル)ペンチル-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール(“ペンコナゾール”)( 参照：GB-1589852)；シス-４-[３-(４-tert-ブチルフェニル)-２-メチルプロピル]-２,６-ジメチルモルホリン(“フェンプロピモルフ”)(参照：DE 2752135)；１-[３-(４-tert-ブチルフェニル)-２-メチルプロピル]-ピペリジン(“フェンプロピジン”)(参照：DE 2752135)；４-シクロプロピル-６-メチル-Ｎ-フェニル- ２-ピリミジンアミン(“シプロジニル”)(参照：EP-A-310 550)；(ＲＳ)-Ｎ-(２ ,６-ジメチルフェニル-Ｎ-(メトキシアセチル)-アラニンメチルエステル(“メタラキシル”)(参照：GB-1500581)；(Ｒ)-Ｎ-(２,６-ジメチルフェニル-Ｎ-(メトキシアセチル)-アラニンメチルエステル(“Ｒ-メタラキシル”)(参照：GB-15005 81)；１,２,５,６-テトラヒドロ-４Ｈ-ピロロ[３,２,１-ij]キノリン-４-オン( “ピロキロン”)(参照：GB-1394373)；エチル水素ホスホネート(“ホセチル”)( 参照：C．Tomlin(編)：The Pesticide Manual，10th edition，Farnhan，UK，19 94，pages 530-532)；および水酸化銅(参照：C．Tomlin(編)： The Pesticide Manual，10th edition，Farnhan，UK，1994，pages 229-230)。選択した殺菌剤は、好ましくは、製剤技術において常用の担体、界面活性剤または他の適用促進補助剤との組成物の形で防御対象の免疫調節化植物に適用する。適切な担体および補助剤は、固形または液体であることができ、製剤技術で常用の物質、例えば、天然のまたは再生した無機物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着性付与剤、結合剤または肥料である。殺菌剤組成物の好ましい適用法は、表土より上に出た植物の部分、特に葉への適用である(葉面塗布)。適用頻度および割合は、病原体の生物学的および気候的生存条件によって変わる。しかしながら、植物のその部分を液体製剤に浸漬(例えば、イネ栽培の場合)すれば、または殺菌剤を固形、例えば顆粒形態で土に入れれば(土壌適用)、殺菌剤は土壌または水を経て根から植物本体に浸透できる( 全身性作用)。種子を処置するために、塊茎または穀粒を殺菌剤の液剤に浸漬するか、またはそれらに既に混合しておいた湿潤または乾燥製剤をコーティングすることにより種子に殺菌剤を適用することもできる(コーティング)。更に、特別な場合では、例えば、芽または果実の房を対象とした処置などの他の適用法も可能である。殺菌剤は、非修飾形態でまたは、好ましくは製剤技術で常用の補助剤と共に使用でき、そのため、既知のやり方で、例えば乳化可能な濃縮物、コーティング可能なペースト、直接噴霧可能または希釈可能な溶液、希乳化剤、湿潤可能な粉末、可溶性粉末、粉剤、顆粒に、または例えばポリマー物質内に封入することにより、製剤化する。組成物の性質に合わせたスプレー、噴霧、散布、分散、コーティングまたは注入(pouring)などの適用法が、意図する目的や主要環境に従って選択される。殺菌剤の有利な適用割合は、普通、有効成分５０gから２kg/ha、好ましくは有効成分１００gから１０００g/ha、特に有効成分１５０gから７００g/ haである。種子処置の場合、適用割合は種子１００kg当り有効成分０.５gから１０００g、好ましくは５gから１００gである。製剤は、既知のやり方、例えば、殺菌剤を増量剤、例えば、溶媒、固形担体、適切には、界面活性化合物(界面活性剤)と共に均一混合および/または摩砕することにより製造する。適切な溶媒は、芳香族炭化水素、好ましくは炭素原子８ないし１２を含む画分、例えば、キシレン混合物または置換ナフタレン、フタレート、例えば、ジブチルフタレートまたはジオクチルフタレート、脂肪族炭化水素、例えば、シクロヘキサン、またはパラフィン、アルコールおよびグリコールおよびそのエーテルおよびエステル、例えば、エタノール、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルまたはモノエチルエーテル、ケトン、例えば、シクロヘキサノン、強極性溶媒、例えば、Ｎ-メチル-２-ピロリドン、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミド、並びに、植物油またはエポキシド化植物油、例えば、エポキシド化ココナッツ油またはダイズ油、または水である。例えば、粉剤および分散可能粉末用に使用した固形担体は、普通、天然鉱物増量剤、例えば、方解石、タルク、カオリン、モンモリロナイトまたはアタパルジャイトである。物理的特性を向上するために、高分散化珪酸または高分散化吸収性ポリマーを添加するこもできる。適切な顆粒状吸着性担体は、多孔性型であり、例えば、軽石、煉瓦破片、海泡石またはベントナイトであり、適切な非吸着性担体は、例えば、方解石または砂である。更に、無機または有機質の予め顆粒状にした多数の材料、例えば、特に、ドロマイトまたは微粉化植物体が使用できる。殺菌剤の性質にもよるが、適切な界面活性化合物は、良好な乳化、分散および湿潤特性を持つ非イオン性、カチオン性および/またはアニオン性界面活性剤である。用語“界面活性剤”は、界面活性剤の混合物も含むと解釈される。特に有利な適用促進補助剤もまた、セファリンやレシチン系の天然または合成のリン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールおよびリゾレシチンである。その農芸化学的組成物は、一般に、有効殺菌性成分０.１から９９％、好ましくは０.１から９５％、固形または液体補助剤９９.９から１％、好ましくは９９ .９から５％、そして界面活性剤０から２５％、好ましくは０.１から２５％を含む。市販品は、好ましくは濃縮物として製剤化されるのに対し、最終消費者は普通、希釈製剤を使用する。Ｂ．植物活性化殺菌剤上記第２または第３経路(選択的育種または遺伝子操作)で得られた免疫調節化植物に適用するならば、その場合、殺菌剤は、ベンゾチアジアゾール化合物、イソニコチン酸化合物、またはサリチル酸化合物などのＳＡＲの化学誘導物質(植物活性化殺菌剤)であることができ、これらは米国特許第５,５２３,３１１および５,６１４,３９５に記載されている。よって、２つの免疫調節法を同時に使用する。植物活性化殺菌剤を選択的育種経路または遺伝子操作経路のいずれかで得られた免疫調節化植物に適用することにより、“免疫外調節(extra-immuno-modu lation)”が生じ、相乗的に増強される病害抵抗性がもたらされる。下記のとおり、ＮＩＭ１を過発現するトランスジェニック免疫調節化植物は、ＰＲ-１遺伝子発現およびP.parasiticaに対する抵抗性により示されるように、野生型植物と比べ、かなり低容量のＢＴＨに対してかなり迅速に応答した。実施例３５と図３のノーザンブロット参照。ＮＩＭ１過発現体における病害抵抗性の相乗的増強は、普通なら効果を生むには全く不十分な濃度であるほんの１０μＭのＢＴＨ塗布により達成できる。この相互依存性を利用すれば、普通なら植物有毒性かあるいは望ましくない濃度のＳＡＲ誘導性化学品の使用を回避できる。更に、ＳＡＲ-誘導性化学品をＮＩＭ１過発現体などの既に免疫調節した植物に適用する時に生じるＳＡＲ活性化の時間経過の変更も利用できる。また、所定レベルの植物防御を提供するのに必要なＳＡＲ-誘導性化学品量を減らした結果、経済的利益も認められる。Ｃ．植物活性化殺菌剤に関連する常用の殺菌剤一層顕著な病害抵抗性を求める場合、常用の殺菌剤と植物活性化殺菌剤の両方を選択的育種経路または遺伝子操作経路のいずれかにより得られた免疫調節化植物に適用してもよい。これにより、免疫調節単独、または免疫調節と殺菌剤１種のみ、または両方の殺菌剤種(常用のものと植物活性化するもの)の同時塗布を経て得られた病害抵抗性レベルに比べて一層高いレベルの相乗的病害抵抗性がもたらされる。例えば、実施例１９の表３５参照。病害抵抗性評価病害抵抗性評価は、当分野で知られている方法により実施する。Uknes et al ，（1993）Molecular Plant Microbe Interactions 6:680-685;Gorlach et al. ，（1996）Plant Cell 8:629-643;A1exander et al.，Proc．Natl．Acad．Sci． USA 90:7327-7331(1993)参照。例えば、数種の代表的な病害抵抗性アッセイを下記に説明する。Ａ．Phytophthora parasitica(タバコ疫病)抵抗性アッセイタバコ疫病の原因生物であるPhytophthoraparasjtjcaに対する抵抗性のアッセイは、Alexander et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:7327-7331(1993)に記載のように生育させた６週齢植物個体にて実施する。植物に水をかけ、十分に排水させ、次いで、胞子嚢懸濁液１０ml(３００胞子嚢/ml)を土に適用することにより植菌する。植菌済み植物を日中温度２３−２５℃、夜間温度２０−２２℃ に維持した温室で保存する。このアッセイに使用したしおれ指標(wiltindex)は次のとおりである：０＝兆候なし；１＝兆候なし；１＝少し萎れた状態で張りが低下している；２＝明らかに萎れているが、腐敗や矯化はない；３＝明らかに萎れて矯化しているが、見たところ茎は腐敗していない；４＝重度に萎れており、茎の腐敗が見られ、根系にも損傷がある；５＝４と同様であるが、植物はほぼ死滅状態かまたは死滅しており、根系も重度に縮小している。全てのアッセイは、無作為に並べた植物個体にてブラインド評価する。Ｂ．Pseudomonas syringae抵抗性アッセイ Pseudomonas syringae pv.tabaci株＃５５１をＨ₂Ｏ中１ml当り１０⁶または３ ×１０⁶の濃度で６−７週齢植物数体の低部の葉２枚に注射する。植物６個体を各時点で評価する。Pseudomonas tabaci感染個体は５点病害重篤度規準で評価する。５＝１００％死滅組織、０＝兆候なし。日ごとの評価ではＴ検定(ＬＳＤ)を行い、平均病害評点値にてらしてグループ分けする。評価日に同じ文字でつけた値は、統計学的に有意な相異ではない。Ｃ．Cercospora nicotianae抵抗性アッセイ Cercospora nicotianae(ＡＴＣＣ＃１８３６６)の胞子懸濁液(１ml当り１００ ,０００−１５０,０００胞子)を葉の表面上に今にも表面流去するほど噴霧する。この植物を湿度１００％で５日間維持する。その後、植物に水を１日当り５− １０回、吹付ける。植物６個体を各時点で評価する。Cercospora nicotianaeは病害兆候基準を示す葉面積％で評価する。日ごとの評価ではＴ検定(ＬＳＤ)を行い、平均病害評点値にてらしてグループ分けする。評価日に同じ文字でつけた値は、統計学的に有意な相異ではない。Ｄ．Peronospora parasitica抵抗性アッセイ Peronospora parasiticaに対する抵抗性についてのアッセイは、Uknes et al ，(1993)に記載のとおり、植物個体にて実施する。植物にP.parasiticaの和合性単離物を分生子懸濁液(１ml当りおよそ５×１０⁴胞子)の噴霧により植菌する。植菌済み植物を生育室にて、湿潤条件下、１７℃で日中１４時間/夜間１０時間のサイクルでインキュベーションする。植菌後３−１４日、好ましくは７−1２日目に分生子柄の存在について植物個体を検査する。更に、各処置ごとの植物から数個体を無作為に選択し、顕微鏡検査用にラクトフェノールトリパンブルーで染色する(Keogh et al.，Trans．Br．Mycol．Soc．74:329-333(1980))。図面の簡単な説明図１は、マウス、ウサギおよびブタ由来のIκＢαを持つＮＩＭ１タンパク質配列の配列アラインメント(sequence alignment)である。配列の上の垂直線(|)は、ＮＩＭ１とIκＢα配列との間のアミノ酸同一性(マトリックススコアは１.５に等しい)を示し；配列の上の二重点(:)は、類似性スコア＞０.５を示し；配列の上の一重点(・)は、類似性スコア＜０.５、但し＞０.０を示し；スコア＜０.０のときは、何ら類似性がないことを示し、配列の上にも何も記していない(実施例参照)。哺乳動物IκＢαアンキリンドメインの位置は、de Martin et al.，Ge ne 152，253-255(1995)により同定された。配列内の小点は、ＮＩＭ１とIκＢα タンパク質間のギャップを示す。IκＢα中の５つのアンキリンリピートは、配列の下の破線で示す。アミノ酸は、適切に導入されたギャップを持つＮＩＭ１タンパク質に関して番号付けする。アミノ酸１０個毎に配列の上にプラス記号(＋)を付ける。図２は、ＮＩＭ１タンパク質(配列番号２のアミノ酸位置に対応する数)とＥＳＴタンパク質産物(配列番号１７−２４)の各領域のアミノ酸配列比較である。図３は、水またはＢＴＨ処置した後の野生型およびＮＩＭ１過発現系列におけるＰＲ-１遺伝子発現の時間経過を示すノーザン分析の結果を表す。ＲＮＡは、実施例に記載のように処置植物から調製して、分析した。“Ｗｓ”は、野生型シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)Ｗｓ生態型である。“３Ａ”、“５Ｂ”、 “６Ｅ”および“７Ｃ”は、実施例２１に従い生産した個々のＮＩＭ１過発現植物系列である。“０ＢＴＨ”は水処置であり、“１０ＢＴＨ”は１０μＭＢＴＨ処置であり、“１００ＢＴＨ”は１００μＭＢＴＨ処置である。“０”は、ゼロ日対照サンプルであり、“１”、“３”および“５”は、１、３および５日目のサンプルである。配列表中の配列の簡単な説明配列番号１は、野生型シロイヌナズナＮＩＭ１遺伝子のコード領域を含む５６５５bpゲノム配列である。配列番号２は、配列番号１のコード領域でコードされる野生型Arabidopsis th aliana ＮＩＭ１タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号３は、図１のマウスIκＢαアミノ酸配列である。配列番号４は、図１のラットIκＢαアミノ酸配列である。配列番号５は、図１のブタIκＢαアミノ酸配列である。配列番号６は、シロイヌナズナＮＩＭ１遺伝子のｃＤＮＡ配列である。配列番号７および８は、それぞれ、アミノ酸位置５５および５９でセリン残基の代わりにアラニン残基を持つＮＩＭ１タンパク質の優性ネガティブ形態のＤＮＡコード配列およびコード化アミノ酸配列である。配列番号９および１０は、それぞれ、Ｎ-末端欠失を持つＮＩＭ１タンパク質の優性ネガティブ形態のＤＮＡコード配列およびコード化アミノ酸配列である。配列番号１１および１２は、それぞれ、Ｃ-末端欠失を持つＮＩＭ１タンパク質の優性ネガティブ形態のＤＮＡコード配列およびコード化アミノ酸配列である。配列番号１３および１４は、それぞれ、Ｎ-末端およびＣ-末端アミノ酸欠失の両方を持つＮＩＭ１遺伝子の変化形態のＤＮＡコード配列およびコード化アミノ酸配列である。配列番号１５および１６は、それぞれ、ＮＩＭ１のアンキリンドメインのＤＮＡコード配列およびコード化アミノ酸配列である。配列番号１７は、図２のイネ-１ＡＡ配列３３−１５５である。配列番号１８は、図２のイネ-１ＡＡ配列２１５−３２８である。配列番号１９は、図２のイネ-２ＡＡ配列３３−１５５である。配列番号２０は、図２のイネ-２ＡＡ配列２０８−２８８である。配列番号２１は、図２のイネ-３ＡＡ配列３３−１５５である。配列番号２２は、図２のイネ-３ＡＡ配列２０８−２８８である。配列番号２３は、図２のイネ-４ＡＡ配列３３−１５５である。配列番号２４は、図２のイネ-４ＡＡ配列２１５−２７１である。配列番号２５から３２は、オリゴヌクレオチドプライマーである。定義下記の定義は、本発明の理解に役立つものである：植物細胞：プロトプラストと細胞壁からなる、植物の構造的および生理学的単位。“植物細胞”の用語は、植物の部分かまたは植物に由来するもののいずれかのあらゆる細胞を表す。幾つかの細胞例には、生存植物の部分である分化細胞；培養中の分化細胞；培養中の非分化細胞；カルスまたは腫瘍などの非分化組織の細胞；種子、胚、胎芽および花粉の分化細胞がある。植物組織：構造的および機能的単位内に組織された植物細胞群。生育中または培養中のどの組織も含まれる。この用語には、植物体全体、植物器官、植物種子、組織培養および構造的および/または機能的単位内に組織されたあらゆる植物細胞群があるが、これらに限定されない。上記のあるいはこの定義に含まれる具体的な植物組織と共に、または具体例なしでこの用語を使用する場合、その他の植物組織の排除は意図していない。プロトプラスト：細胞壁を持たない植物細胞。子孫植物：有性または無性的に派生する来世代植物で、後代植物を含むがこれに限定されない。トランスジェニック植物：そのゲノム内に安定に組込まれた組換えＤＮＡを持つ植物。組換えＤＮＡ：異種源由来のＤＮAセグメントと結合することにより形成され、組換えＤＮＡ技術を用いて生産されたあらゆるＤＮＡ分子。組換えＤＮＡ技術：インビトロで組換えＤＮＡを生産し、この組換えＤＮＡが発現し増殖できるような細胞内にそれを移す技術(Concise Dic tionary of Biomedicine and Molecular Biology，Ed．Juo， CRC Press，Boca Raton(1996)参照)であり、例えば、ＤＮＡをプロトプラストまたは細胞内に、例えば、(１)環状、直線状またはスーパーコイル状の裸(naked)ＤＮＡ、(２)ヌクレオソームまたは染色体または核またはその部分に含まれるＤＮＡ、( ３)他の分子と複合体形成した、または会合したＤＮＡ、(４) リポソーム、スフェロプラスト、細胞またはプロトプラストに封入されるＤＮＡ、または(５)宿主生物以外の生物体(例えば、Agrobacterium tumefiaciens)から移されたＤＮＡを含む、様々な形態で移す。組換えＤＮＡを細胞に導入するこれらの方法およびその他様々な方法が当分野で知られており、これらを用いて本発明のトランスジェニック細胞またはトランスジェニック植物を産生できる。組換えＤＮＡ技術はまた、Treco et al.，WO94/12650および Treco et al.，WO95/31560に記載の相同組換え法も含み、これらは、単子葉植物におけるペルオキシダーゼ活性を高めるのに応用できる。具体的には、調節領域(例えば、プロモーター)を植物ゲノムに導入して、内生ペルオキシダーゼの発現を高めることができる。組換えＤＮＡ技術に含まれるものには、選択発現シグナルを欠くペルオキシダーゼコード配列の単子葉植物への挿入や、単子葉植物内の内生制御配列によりペルオキシダーゼの発現を増大するトランスジェニック単子葉植物アッセイがある。これにより、植物内でのペルオキシダーゼコード配列のコピー数の増加がもたらされる。組換えＤＮＡのＲ^O植物のゲノムへの初期挿入は、従来の植物育種法では達成されないが、むしろ本明細書に記載の技術法によれば達成される。初期挿入後は、実質的に従来の育種法を用いてトランスジェニック子孫を繁殖させることができる。キメラ遺伝子：元の状態では会合していない少なくとも２つの異種部分、例えば、元のＤＮＡ配列に由来する部分、を含むＤＮＡ分子であり、これらの配列は、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて作られる。発現カセット：プロモーターおよびターミネーターを含み、その間にコード配列が挿入され得る、ＤＮＡ分子。コード配列：転写および翻訳されたときに、ポリペプチドまたはタンパク質の形成をもたらすＤＮＡ分子。遺伝子：発現、即ち転写および翻訳の制御を担う調節ＤＮＡ配列と、転写および翻訳されて不連続のポリペプチドまたはタンパク質を与えるコード配列とを含む別個の染色体領域。 acd: 加速細胞死(accelerated cell death)変異体植物ＡＦＬＰ：増幅断片長多型。 avrRpt２： Pseudomonas syringaeから単離した非毒性遺伝子Rpt２。ＢＡＣ：細菌性人工染色体ＢＴＨ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオン酸-Ｓ-メチルエステルＣＩＭ：構成的免疫(Constitutive IMmunity)表現型(ＳＡＲは構成的に活性化される) cim：構成的免疫変異体植物ｃＭ：センチモルガン cpr１：ＰＲ遺伝子変異体植物の構成的発現体 Col-Ｏ：シロイヌナズナ生態型Columbia ＥＣｓ：酵素組合せＥｍｗａ：シロイヌナズナのＷｓ-Ｏ生態型において和合性のPeronospora parasitica単離物ＥＭＳ：スルホン酸エチルメタンＩＮＡ：２,６-ジクロロイソニコチン酸 Ler：シロイヌナズナ生態型Landsberg erecta lsd：病変擬態病(lesion simulating disease)変異体植物 nahＧ：サリチル酸をカテコールに変換するサリチル酸ヒドロキシラーゼPseudomonas putida NahＧ： nahＧ遺伝子で形質転換させたシロイヌナズナ系列 ndr：非-種特異的病害抵抗性(non-race-specific disease resistan nce)変異体植物 nim：非誘導性免疫(non-inducible immunity)変異体植物ＮＩＭ１：ＳＡＲシグナル伝達カスケードに関連する、野生型遺伝子ＮＩＭ１：野生型ＮＩＭ１遺伝子によりコードされるタンパク質 nim１：植物へ病害感受性を与える、ＮＩＭ１の変異体対立遺伝子。ＮＩＭ１のnim１変異体対立遺伝子を持つ変異体シロイヌナズナ植物とも呼ぶ。 Noco：シロイヌナズナのCol-Ｏ生態型において和合性のPeronospora parasitica単離物ＯＲＦ：オープンリーディングフレームＰＣｓ：プライマー組合せＰＲ：病原関連ＳＡ：サリチル酸ＳＡＲ：全身性獲得抵抗性ＳＡＲ-オン：ＳＡＲを活性化した免疫調節化植物で、典型的に野生型ＳＡＲ遺伝子発現を示し、病害抵抗性表現型を持つ。ＳＳＬＰ：単配列長多型。ＵＤＳ：万病感受性表現型 Wela：シロイヌナズナのWeiningen生態型において和合性のPeronospo ra parasitica単離物Ｗｓ-Ｏ：シロイヌナズナ生態型Issilewskija ＷＴ：野生型ＹＡＣ：酵母人工染色体実施例本発明を、下記詳細な手順、製造および実施例により更に詳しく例示説明する。この実施例は、単なる例示であって、本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。ここで使用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当分野でよく知られており、Sambrook，et al.，Molecular Cloning，eds.，Cold Spri ng Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)およびT．J．Silh avy，M．L．Berman，and L．W．Enquist，Experiments with Gene Fusions，Col d Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)およびAusubel，F ．M．et al.，Current Protocols in Molecular Biology，pub．by Greene Publ ishing Assoc．and Wiley-Interscience(1987)に記載されている。Ｉ．常用の殺菌剤と全身性獲得抵抗性の化学的誘発物質を植物に同等に適用することにより達成される相乗的病害抵抗性効果この組の実施例では、ベンゾチアジアゾールなどのＳＡＲ化学的誘発物質の適用により植物にＳＡＲを誘発させた。更に、常用の殺菌剤をこの植物に適用した。次いで、植物を様々な病原体由来の病圧にかけた。病原に対抗する両方法の組合せ(誘発性化学品＋殺菌剤)により、加算した以上の、即ち、相乗的な病害抵抗性が生じた。これは、相乗係数(ＳＦ)、即ち、予測した(Ｅ)効果に対する観測した(Ｏ)効果の比率として測定した。有効成分を所定通り組合せた場合に予測される効果(Ｅ)は、いわゆる、コルビー(Colby)式で記載でき、下記のように計算できる(Colby，S．R.，“Calculatin g synergistic and antagonistic responses of herbicide combination”,Weed s，Vol．15，pages 20-22(1967)): ppm＝スプレー混合物リットル当り有効成分(＝a.i.)ミリグラムＸ＝有効成分ｐ ppmの適用比で有効成分Ｉにより引き起こされる作用％Ｙ＝有効成分ｑ ppmの適用比で有効成分IIにより引き起こされる作用％Ｅ＝有効成分ｐ＋ｑ ppmの適用比で有効成分Ｉ＋IIの予測される効果(加算作用) 実施例１：オオムギでのErysiphe graminisに対する作用残余防御作用：高さ約８cmのオオムギ植物個体に水性スプレー混合物(有効成分最大０.０２％)をしずくが落ちるまで噴霧し、３ないし４日後、真菌分生子を散布した。この感染個体を２２℃で温室内に立てておいた。真菌感染は、一般に、感染後１０日で評価した。全身性作用：高さ約８cmのオオムギ個体に水性スプレー混合物(土壌容量に対し有効成分最大０.００２％)をかけた。スプレー混合物が土面上に出た植物の部分に接触しないよう用心した。この個体に、３ないし４日後、真菌分生子を散布した。この感染個体を２２℃で温室内に立てておいた。真菌感染は、一般に、感染後１０日で評価した。表１オオムギでのErysiphe graminisに対する作用成分Ｉ：ベンゾチアジアゾール-７-カルボン酸成分II：メトコナゾール表２オオムギでのErysiphe graminisに対する作用成分Ｉ：ベンゾチアジアゾール-７-カルボン酸成分II：テトラコナゾール表３オオムギでのErysiphe graminisに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：メトコナゾール実施例２：Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用１０ないし１４日の栽培期間後、キュウリ植物個体に噴霧した。３ないし４日後、この個体を真菌の胞子懸濁液(１.０×１０⁵胞子/ml)に感染させ、高湿度、温度２３℃で３０時間インキュベーションした。次いで、インキュベーションを正常湿度で２２℃ないし２３℃で継続した。感染後７ないし１０日で、真菌侵入 (infestation)に基づき防御作用の評価を行った。１０ないし１４日の栽培期間後、試験化合物の湿潤性粉末製剤から調製したスプレー混合物の土壌塗布によりキュウリ植物個体を処置する。３ないし４日後、この個体を真菌の胞子懸濁液(１.５×１０⁵胞子/ml)に感染させ、高湿度、温度２３℃で３０時間インキュベーションした。次いで、インキュベーションを正常湿度、２２℃で継続した。感染後７ないし１０日で、真菌侵襲に基づき防御作用の評価を行った。表４ Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用/葉面適用成分Ｉ：ベンゾチアジアゾール-７-カルボン酸成分II：アゾキシストロビン表５ Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用/土壌塗布成分Ｉ：ベンゾチアジアゾール-７-カルボン酸成分II：アゾキシストロビン ^*相乗係数ＳＦは算出できない。表６ Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用/葉面塗布成分Ｉ：ベンゾチアジアゾール-７-カルボン酸成分II：クレソキシムメチル表７ Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用/葉面塗布成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：アゾキシストロビン表８ Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用/土壌塗布成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：アゾキシストロビン実施例３：タバコ植物でのCercospora nicotianaeに対する作用タバコ植物個体(６週齢)に試験化合物の製剤溶液(濃度：有効成分最大０.０２％)を噴霧した。処置後４日目、個体にCercospora nicotianaeの胞子嚢懸濁液( １５０,０００胞子/ml)を植菌し、４ないし５日間高湿度で維持し、次いで、更に正常な昼/夜順序でインキュベーションした。この試験では、真菌に感染した葉表面からその症状を評価した。表９タバコ植物でのCercospora nicotianaeに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：テブコナゾール表１０タバコ植物でのCercospora nicotianaeに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：シプロコナゾール表１１タバコ植物でのCercospora nicotianaeに対する作用成分Ｉ：ベンゾチアジアゾール-７-カルボン酸成分II：フェンプロピモルフ表１２タバコ植物でのCercospora nicotianaeに対する作用成分Ｉ：ベンゾチアジアゾール-７-カルボン酸成分II：ジフェノコナゾール実施例４：イネ植物でのPyricularia oryzaeに対する作用約２週齢のイネ植物個体を根周辺の土と一緒に、スプレー混合物を満たした容器内にいれた(有効成分最大０.００６％)。９６時間後、イネ植物を真菌の分生子懸濁液で感染させた。感染個体を相対湿度９５−１００％、２４℃で５日間インキュベーションした後、真菌侵入について評価した。表１３イネ植物でのPyricularia oryzaeに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：ＫＴＵ３６１６１２ｍ²の区画上で、有効成分の湿潤性粉末により調製したスプレー混合物をイネ植物に噴霧した。感染は自然に起こった。評価のために、真菌に感染した葉面積を適用後４４日目に測定した。下記の結果が得られた：表１４屋外のイネ植物でのPyricularia oryzaeに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：ピロキロン約２週齢のイネ植物を根周辺の土と一緒に、スプレー混合物を満たした容器内にいれた。３６日後、真菌侵入を評価した。非処置個体の侵入は、０％の作用に相当した。表１５イネ植物でのPyricularia oryzaeに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：トリシクラゾール実施例５：トウガラシでのColletotrichum sp.(炭疽病)および Cercospora sp.(斑点病)に対する作用農産物収穫量における作用：約１０ｍ²の土地区画(試験区画：Cikampek， Java，Indonesia)で、トウガラシ植物個体に、計７回、約７日間隔で１ヘクタール当り５００−７００リットルのスプレー混合物を噴霧した。最初の噴霧から３日後、この個体に真菌を人工感染させた。表１６ Colletotricumに対する作用：５回目の噴霧後、トウガラシの実における侵入を査定するこにより評価した。成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：マンゼブ表１７ Cercosporaに対する作用：６回目の噴霧後、葉における侵入を査定するこにより評価した。成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：マンゼブ表１８農産物収穫量に対する作用：６回目の噴霧後、トウガラシを収穫した。成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：マンゼブ実施例６：コムギでのPuccinia reconditaに対する作用７週齢のコムギ植物個体に、製剤化有効成分または有効成分の組合せから調製したスプレー混合物をしずくが落ちるまで噴霧した。４日後、処置個体を真菌の分生子懸濁液で感染させ、その処置個体を続いて相対大気湿度９０−１００％、２０℃で２日間インキュベーションした。感染後１０日で真菌侵入を評価した。表１９コムギでのPuccinia reconditaに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：プロピコナゾール表２０コムギでのPuccinia reconditaに対する作用成分Ｉ：ベンゾチアジアゾール-７-カルボン酸成分II：フェンプロピジン実施例７：コムギでのErysiphe graminisに対する作用野外実地試験(１０ｍ²)では、増殖期の冬コムギに、湿潤性粉末により調製した有効成分のスプレー混合物を噴霧した。感染は自然に起こった。感染後１０日で、真菌侵入を査定した。次の結果が得られた：表２１コムギでのErysiphe graminisに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：プロピコナゾール表２２コムギでのErysiphe graminisに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：シプロジニル実施例８：バナナでのMycosphaerella fijiensisに対する作用３００ｍ²区画のバナナ植物個体４０本に、１７−１９日間隔で、湿潤性粉末で調製した有効成分のスプレー混合物を計６回噴霧した。感染は自然に起こった。評価のために、真菌に感染させた葉を測定した。下記の結果が得られた：表２３バナナでのMycosphaerella fijiensisに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：プロピコナゾール実施例９：トマトでのAlternaria solaniに対する作用７ｍ²区画のトマト個体に、７日間隔で、有効成分の湿潤性粉末で調製したスプレー混合物を計９回噴霧した。感染は自然に起こった。評価のために、真菌に感染させた葉を測定した。下記の結果が得られた：表２４屋外のトマトでのAlternaria solaniに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：シプロジニル実施例１０：トマトでのPhytophthora infestansに対する作用トマト栽培品種“Roter Gnom”に、製剤有効成分または有効成分の組合せから調製したスプレー混合物をしずくが落ちるまで噴霧した。４日後、処置植物個体に真菌の分生子懸濁液を噴霧し、続いて相対大気湿度９０−１００％、１８−２０℃で２日間、キャビネット内でインキュベーションした。感染後５日で真菌侵入を評価した。下記の結果が得られた：表２５トマトでのPhytophthora infestansに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：メタラキシル表２６トマトでのPhytophthora infestansに対する作用成分Ｉ：ベンゾチアジアゾール-７-カルボン酸成分II：メタラキシル実施例１１：キュウリでのPseudoperonospora cubensisに対する作用１６−１９日齢のキュウリ植物個体(“Wisconsin”に、製剤有効成分または有効成分の組合せから調製したスプレー混合物をしずくが落ちるまで噴霧した。４日後、処置個体をPseudoperonospora cubenswas(株３６５、ciba:ml当り最大５０００)の胞子嚢で感染させ、続いて処置個体相対大気湿度７０−９０％、１８ −２０℃で１−２日間インキュベーションした。感染後１０日で真菌侵入を評価し、非処置植物での侵入と比較した。下記の結果が得られた：表２７キュウリでのPseudoperonospora cubensisに対する作用成分Ｉ：ベンゾチアジアゾール-７-カルボン酸成分II：メタラキシル実施例１２：タバコ植物でのPeronospora tabacinaに対する作用タバコ植物体(６週齢)に、試験化合物の製剤溶液を噴霧した。処置後４日で、その個体に真菌の胞子嚢懸濁液を植菌し、高湿度で４ないし５日間維持し、次いで、正常な昼/夜順序で更にインキュベーションした。この試験では、真菌に感染した葉表面の症状を評価した。非処置個体の侵入は０％の作用に相当した。表２８タバコ植物でのPeronospora tabacinaに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：ジメトモルフ実施例１３：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)での Peronospora parasiticaに対する作用それぞれ２５％、８０％、７０％、および２５％有効成分(ai)として湿潤性粉末担体と共に製剤化した殺菌剤メタラキシル、ホセチルおよび水酸化銅、ＳＡＲ活性化剤ベンゾ(１,２,３)-チアジアゾール-７-カルボチオン酸Ｓ-メチルエステル(ＢＴＨ)を細かい霧状で３週齢植物個体の葉に適用した。対照としては湿潤性粉末単独を適用した。３日後、Delany et al．(1995)に記載のように、植物個体にPeronospora parasitica分生子懸濁液を植菌した。Ｗｓ植物には、同等のP．p arasitica単離物Emwa(１−２×１０⁵胞子/ml)を植菌し；Col植物には、同等のP ．parasitica単離物Noco(０.５−１×１０⁵胞子/ml)を植菌した。植菌後、各植物個体にカバーを付けて高湿度を維持し、パーシバル培養室に１７℃、昼１４時間/夜１０時間のサイクルで置いた(Uknes et al.，1993)。植菌後８日目に組織を回収した。１２日間、分生子柄の発生を記録するために解剖顕微鏡で観察して、真菌感染経過を追跡した(Delaney，et al．(1994);Dietrich，et al．(1994))。個々の葉をラクトフェノールトリパンブルー染色し、葉組織内の真菌増殖を観察した。真菌増殖は、プライマーＮＳ１とＮＳ２および鋳型としてP．parasitica単離物 Emwa ＤＮＡを用いるWhite et al.(1990;PCR Protocols:A guide to Methods an d Application，315-322)のＰＣＲにより得られたｒＲＮＡ真菌プローブを用いて定量した。ＲＮＡは、塩化リチウム沈殿、次いでフェノール/クロロホルム抽出により凍結組織から精製した(Lagrimini et al，1987:PNAS，84:7542-7546)。サンプル(７.５ug)は、Ausbel et al．(1987)に記載のように、ホルムアルデヒドアガロースゲルによる電気泳動で分離し、ナイロン膜(Hybond-N+，Amersham) にブロットした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、Church and Gilbert(1 984，PNAS，81:1991-1995)に従った。転写物の相対量は、Phosphor Imager(Mole cular Dynamics，Sunnyvale，CA)を用いて製造元指導書に従い測定した。剥がしたフィルターブロットを構成的に発現したｂ-チューブリンシロイヌナズナｃＤＮＡｓでプローブすることにより、サンプル充填物を正規化した。非処置植物の侵入は、０％の真菌増殖阻害に相当した。下記の結果が得られた：表２９シロイヌナズナ(Col-０)でのPeronospora parasitica NoCo２に対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：メタラキシル表３０シロイヌナズナ(Ｗｓ)でのPeronospora parasitica Emwaに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：メタラキシル表３１シロイヌナズナ(Ｗｓ)でのPeronospora parasitica Emwaに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：ホセチル表３２シロイヌナズナ(Ｗｓ)でのPeronospora parasitica Emwaに対する作用成分Ｉ：ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７-カルボチオ酸-Ｓ-メチルエステル成分II：水酸化銅表２９から理解できるように、相乗的病害抵抗性効果は、野生型シロイヌナズナCol−０植物で示された。０.０１ｍＭＢＴＨまたは０.０００１g/Ｌメタラキシルのいずれかをその植物個体に別個に適用しても、なんら真菌増殖阻害は観察されなかったが、これは、通常ならこれらの濃度では効果をあげるのに不十分だからである。しかしながら、これらの化合物の両方を通常なら不十分な濃度で植物個体に適用すると、４０.７％の真菌増殖阻害が観察された。これは明らかに相乗的作用である。表３０−３２は、野生型シロイヌナズナＷｓ植物における相乗的病害抵抗性作用を示す。０.０１ｍＭＢＴＨをＷｓ植物に適用すると、２０ −３０％の真菌増殖阻害しか観察されなかった。しかしながら、ＢＴＨおよびメタラキシル、ホセチル、または水酸化銅のいずれかを植物個体に同時適用することにより、相乗的病害抵抗性が観察された。これらの複合的な抗真菌作用は、病原体制御に必要な殺真菌剤やＢＴＨの有効濃度の低減をもたらし、真菌増殖を抑制するのに必要な化学用量を下げることができるので、化学品耐性による葉面損傷負担を緩和する。 II．常用の殺菌剤および/または全身性獲得抵抗性の化学的誘発物質を構成的免疫(ＣＩＭ)変異体植物に適用することによる相乗的病害抵抗性効果この組の実施例では、正常増殖に際して高濃度のＰＲ-１ｍＲＮＡを持つ変異体植物を同定するために、これらの変異体もまた全身性獲得抵抗性を示すという見解をもって、高処理量ノーザンブロットスクリーンを展開した。このスクリーンの使用により多数の変異体が単離されており、これらはＰＲ-１だけでなくＰＲ-２およびＰＲ-５ｍＲＮＡも蓄積することが示されている(Lawton et al．(1 993);Dietrich et al．(1994);and Weymann et al．(1995))。これらの変異体もまた、高レベルのＳＡを持ち、病原体感染に対して抵抗性であるので、この方法によりＳＡＲシグナル形質導入変異体を単離できることを確認する。このスクリーンを用いて２種のＳＡＲシグナル形質導入変異体が単離されている。１種は、lsd変異体(lsd＝病変擬態病(lesion simulating disease))と呼ぶ。この種の変異体は、出典明示によりその全体を本明細書の一部とした、ＷＯ９４/１６０７７に開示のように、“Ｉ型cim”とも呼ばれる。このlsd種(別名Ｉ型 cim)は葉上に自発的病変を形成し、高濃度のＳＡ、高レベルのＰＲ-１、ＰＲ-２およびＰＲ-５ｍＲＮＡを蓄積し、真菌および細菌病原体に対して抵抗性である( Dietrich et al.，1994;Weymann et al.，1995)。第２種はcim(cim＝構成的免疫(constitutive immunity))と呼ばれ、下記のように、自発的病変以外の、lsd変異体の特徴全てを持つ。この第２種(cim)は、ＷＯ９４/１６０７７に開示の“II型cim”に相当する。下記のcim３変異体植物系列は、このcim(II型cim)に分類され、安定で高レベルのＳＡ、ＳＡＲ遺伝子ｍＲＮＡを発現し、広範囲の病害抵抗性を持つという野生型の様相を持った優性変異である。実施例１４：構成性ＳＡＲ遺伝子発現によるcim変異体の単離および特性化１１００個体のＭ２突然変異誘発(ＥＭＳ)シロイヌナズナ植物をおよそ１００組、Araconトレイ(Lehie Seeds，Roud Rock，TX)にて生育させた。水をやりすぎたり、病原体に感染させることのないよう特に注意して、Uknes et al.，1993，前掲に記載のとおり植物個体を生育させた。要約すると、Metro Mix 360を水で飽和させ、１０リットルバッチで７０分間３回オートクレーブにかけた。オートクレーブ処理毎にこの混合物を入念に撹拌した。種子を２０％Clorox中で５分間表面滅菌し、滅菌水を７回取り替えて洗浄した後に播種した。植込んだ種子を３ −４日間春化処理し、２２℃、昼９時間、夜１５時間の培養室で生育させた。植物個体が３ないし４週齢になったら、１、２枚の葉、重量５０ないし１００mgを集め、全ＲＮＡを迅速ミニＲＮＡ調製(Verwoerd et al．（1989）Nuc．Acid．Re s．17，2362)により単離した。ＰＲ-１遺伝子発現は、ノーザンブロット分析(La grimini et al．（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84，7542-7546;Ward et al.，1991)により分析した。植物個体の各組には、非処置のシロイヌナズナCol- ０と２日ＩＮＡ-処置(０.２５mg/ml)した対照も含まれた。全ての個体をWeymann et al.，(1995)に記載のように保持した。高レベルのＰＲ-１ｍＲＮＡを蓄積していると推定される８０の変異体を同定した。後代試験(descendants testing)の後、５個体を選択して更に特性化した。推定cim変異体は、病原体の不在下または誘発処置なしで高いＳＡＲ遺伝子発現を示した。推定cim変異体の後代試験により、構成性ＰＲ-１発現が遺伝性であることを確認した。cim変異体のうち、ＰＲ-１を最高かつ最も安定に発現したci m２およびcim３の２種を更に特性化した。 Columbiaへの戻し交雑では、Ｆ１後代同定用のマーカーとして劣性無毛特性を利用した。花粉が付く(pollen shed)前にCol-gl１花芽を除雄し、直後および翌日に変異体由来の花粉を塗布した。Ｆ１個体を土壌で生育させ、トリコームが存在するかどうかで他配個体を同定した。 cim２およびcim３を生態型Col-０またはLa-erに交配させた後、大部分のＦ１個体が高度にＳＡＲ遺伝子を発現することが分かり、これらの特徴は優性であることが示された。cim２の場合、全てではないが幾つかのＦ１個体は、構成性ＳＡＲ遺伝子発現を示した。cim２変異体が優性であり、ヘテロ接合体として親個体に担持されているならば、このような結果が予測されることもある。更に、ci m２の遺伝子試験は、不完全な浸透度(penetrance)と矛盾しない、Ｆ２世代における継続した変化性の分離を示した。 cim３は、Ｆ１世代における１：１分離を示し、その上、高レベルのＰＲ-１ｍＲＮＡを発現する２個体のＦ１が自家受粉してＦ２集団を形成した。ＰＲ-１ｍＲＮＡ蓄積を評価することにより得られたＦ２分離は、３.７：１の比率(ｃ²＝１.７７；０.５＞Ｐ＞０.１)で、高ＰＲ-１ｍＲＮＡを持つＦ２個体９３と有意なＰＲ-１ｍＲＮＡを持たないＦ２個体２５を示し、これは、cim３が優性の単一遺伝子変異であるという仮説と矛盾しない。その後の他配により、cim３が優性変異として遺伝されることを確認した。 cim３の場合、元のＭ２個体はそのスクリーンにおいて同一であり、Ｍ３集団は正常な外観であった。しかしながら、cim３個体を自家受粉したところ、最も良好に発現した系列の中には、稔性の低いものがあった。Col-gl１の戻し交雑の後、外観および稔性が正常でＰＲ-１を強力に発現する個体が得られた。最初に同定したとき、cim３はまた、薄くて歪みのある葉を持ち、僅かに矮小化したように見えた。しかしながら、生態型Col-gl１との交雑から得られたＦ２個体は、高ＳＡＲ遺伝子発現を保持し、野生型植物と区別できなかった。これにより、矮小化して葉の歪んだ表現型は構成的ＳＡＲ遺伝子発現に関連しない無関係の変異によって引き起こされたことが示された。cim３変異表現型はまた、滅菌条件下で植物個体を生育させた場合にも観察され、よって、ＰＲ-１ｍＲＮＡ蓄積が病原体によって引き起こされるのではないことが確認された。実施例１５：ＳＡＲ遺伝子発現ＰＲ-１以外に、他のＳＡＲ遺伝子２種、ＰＲ-２およびＰＲ-５もまた、cim３中で高度に発現される。ＳＡＲ遺伝子発現レベルは子孫間で変化するが、常に非処置対照よりも１０倍以上高く、野生型植物の抵抗性誘発ＩＮＡ(０.２５mg/ml) 処置後に得られたレベルと類似した。実施例１６：サリチル酸分析シロイヌナズナではＳＡの内生濃度が病原体誘発性壊死の後に増加することが示されている(Uknes et al.，1993，前掲)。サリチル酸とそのグルコースコンジュゲートは、Uknes et al.，1993に記載のようにして分析した。葉組織を４週齢のcim３１０個体と対照１０個体から集めた。個々の植物個体から葉を集めて、ＰＲ-１遺伝子発現について分析した。ＰＲ-１を発現する個体のＳＡレベルを測定した。cim３中の遊離ＳＡ濃度は、非感染野生型シロイヌナズナよりも３.４倍高かった(それぞれ、２３３±３５対６９±８ng/g新鮮重量)。ＳＡのグルコースコンジュゲート(ＳＡＧ)は、cim３では非感染野生型シロイヌナズナよりも１３. １倍高かった(それぞれ、４５１９±４７３対３４４±５８ng/g新鮮重量)。これらのＳＡおよびＳＡＧの増加レベルは、病原体感染組織またはcpr変異体のいずれかについて報告されているレベルに匹敵する。実施例１７：病害抵抗性シロイヌナズナの露菌病の原因であるPeronospora parasitica（NoCo２）に対する抵抗性についてcim３を評価した。cim３(ＰＲ-１ＲＮＡ発現により確認した)３０個体と対照(生態型Columbia)３０個体、それぞれ約４週齢のものに、Ukn es，et al.，1992，前掲に記載のとおり、P．parasiticaを植菌した。７日後、K eogh et al．（1980）Trans．Br．Mycol．Soc．74，329-333とKoch and Slusare nko（1990）Plant Cell 2，437-445に記載のとおり、各個体の胞子形成について分析するため、トリパンブルーで染色して、真菌構造を可視化した。野生型(Col -０)植物は菌糸、分生子、卵胞子の増殖を持続させたが、ＩＮＡ(０.２５mg/ml) で処置した野生型植物とcim３植物はなんら真菌増殖を示さなかった。cim３媒介抵抗性は、典型的には、小グループの死亡細胞として病原体感染部位にみられる。このタイプの抵抗性は、lsd変異体(Dietrich et al.，1994，前掲;Weymann et al.，1995，前掲)またはＳＡＲを誘発させた野生型植物(Uknes et al.，1992，前掲)でみられるものと類似する。時折、cim３植物では中間の抵抗性表現型が観察され、菌糸先端を追うように壊死の跡があった。この壊死の跡は、低用量のＳＡまたはＩＮＡで処置した野生型植物でみられるものと類似する(Uknes et al. ，1992,前掲;Uknes et al.，1993，前掲)。しかしながら、cim３植物では胞子形成は全くみられないが、対照植物は全て胞子形成を示した。非植菌cim３葉では、トリパンブルーで染色しても自発的病変はなんら観察されなかった。真菌病原体P．parasiticaに対する抵抗性以外に、cim３は、細菌病原体Pseudo monas syringae DC3000による感染に対しても抵抗性であった。６週齢の野生型( ±ＩＮＡ処置)およびcim３植物にP．syringae DC3000の懸濁液を植菌し、感染葉から抽出した細菌の増殖を経時監視することにより病害の進行を追跡した。０日目または２日目のCol-０、Col-０＋ＩＮＡおよびcim３の細菌力価の相異は、統計学的には有意でなかった。しかしながら、４日目までに、野生型とcim３植物との間の細菌増殖において３１倍の減少があった(Ｐ＜０.００３;Sokal and Roh lf，1981)。各植物個体の病害症状については可視的にも検査した。野生型植物由来の葉は、初期感染範囲以外にも病害症状が広く蔓延した重度のクロロシスであった。反対に、ＩＮＡで前処理した野生型植物またはcim３植物のいずれかは、ほとんど病害症状がなかった。この実施例の場合、Pseudomonas syringae pv.トマト株DC3000の培養物は、リファムピシン(５０μg/ml)を加えたキングＢ培地(寒天平板または液体)にて２８ ℃で増殖させた(Walen et al.，(1991)，Plant Cell 3，49-59)。一晩培養したものを１０ｍＭ MgCl₂に１ml当り細胞２−５×１０⁵の密度まで希釈および懸濁させ、シロイヌナズナの葉に注射した。注射は、２８ゲージの針で葉の中ほどに小孔を作り、次いで、希釈細菌溶液およそ２５０μlを１ccシリンジで注射することにより実施した。様々な時点で、それぞれの処置植物１０個体から、＃１コルクボーラーで無作為に切り貫いた３個のリーフディスク(leaf punch)からなる１０の無作為サンプルを得た。３個のリーフディスクを１０ｍＭ MgCl₂３００μ lと共にエッペンドルフ管に入れ、乳鉢で磨り潰した。得られた細菌懸濁液を適切に希釈し、リファムピシン(５０μg/ml)を加えたキングのＢ培地で平板培養し、２８℃で４日間増殖させた。細菌コロニーを数え、、データをステューデントｔ検定分析にかけた(Sokal and Rohlf(1981)，Biometry，2nd ed．New York:W． H．Freeman and Company)。この実施例の場合も、２,６-ジクロロイソニコチン酸(ＩＮＡ)を、湿潤性粉末に製剤化した２５％有効成分として滅菌希釈水に懸濁させた(０.２５mg/ml、３２５μＭ；Kessmann et al.，（1994）Annu．Rev．Phytopathol．32，439-59)。全ての植物個体に水またはＩＮＡ溶液を今にも流れだすほど噴霧した。実施例１８：ＳＡＲ遺伝子発現および病害抵抗性におけるＳＡの役割 cim３におけるＳＡ、ＳＡＲ遺伝子発現と抵抗性との関係を調査するため、サリチル酸ヒドロキシラーゼ(nahＧ)遺伝子を発現するシロイヌナズナ植物個体で交雑を行った(Delaney et al.，1994)。これらの“NahＧ植物”は、Agrobacteri um媒介形質転換を用いて３５Ｓ制御化nahＧ遺伝子をシロイヌナズナ内に形質転換することによって作った。Huang，H．Ma，H．（1992）Plant Mol．Biol．Rep ．10，372-383、出典明示により本明細書の一部とする；Gaffney，et al.，（1993）Science 261，754-756、出典明示により本明細書の一部とする；およびDelaney et al．（1994）Science 266，1247-1250、出典明示により本明細書の一部とする、参照。Col-nahＧシロイヌナズナは、優性nahＧ遺伝子以外に優性カナマイシン耐性遺伝子を持つので、Col-nahＧを花粉ドナーとして使用した。Ｆ１種子に水を３０分間含ませ、次いで、１０％Clorox、０.５％ツイーン２０中５分間表面滅菌し、滅菌水で十分に洗浄した。種子を２５mg/mlカナマイシン含有発芽培地(ＫＯＨと共に０.５g/Ｌ２-(Ｎ-モルホリノ)エタンスルホン酸で緩衝化した１０g/Ｌショ糖含有ＧＭ、ムラシゲおよびスクーグ培地、ｐＨ５. ７)で平板培養し、Ｆ１個体を選択した。Valvekens et al．（1988）Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 85，5536-5540参照。１８日後にカナマイシン耐性Ｆ１個体を土に移す。ノーザンブロット分析により全ての実験においてnahＧ遺伝子の存在とＰＲ-１発現を確認した。 cim３変異体とnahＧ表現型の両方が優性であるため、２つの遺伝子間の上位性は、Ｆ１個体で分析できた。cim３×nahＧ交雑由来のＦ１個体７０をＰＲ-１およびnahＧ遺伝子発現について分析した。ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析において、nahＧ遺伝子の存在はＳＡＲ遺伝子発現の抑制と相関した。得られたＦ２分離体(segregant)中のＰＲ-１ｍＲＮＡを評価することにより、各Ｆ１におけるcim３の存在を確認した。 cim３変異が病害抵抗性に関し、nahＧより上位であるかどうかを測定するため、nahＧの存在およびＰＲ-１ｍＲＮＡの不在について確認されているcim３×na hＧ交雑由来のＦ１個体５を自家受粉させ、２０−３０個のＦ２種子を植えた。 nahＧの存在およびＰＲ-１ｍＲＮＡの発現は、このＦ２集団由来の各個体にて分析し、その後、P．parasitica(NoCo２)で攻撃してその病害感受性を評価した。c im３により与えられる病害抵抗性は、nahＧ遺伝子の存在によって排除され、このことは、nahＧがＳＡＲ遺伝子発現および病害抵抗性表現型についてcim３より上位であることを示す。実施例１９：殺菌剤および/またはＢＴＨをcim変異体に適用することにより獲得される相乗的病害抵抗性病原体植菌の３日前に、湿潤性粉末担体で有効成分(ai)２５％として処方した全身性獲得抵抗性の化学的誘発物質ＢＴＨ(ベンゾ[１,２,３]チアジアゾール-７ -カルボチオン酸-Ｓ-メチルエステル)(Metraux et al.，1991)および/または有効成分２５％として処方した殺菌剤メタラキシル(ＣＧＡ４８９８８)または湿潤性粉末単独を微細ミストとして４週齢植物個体の葉に適用した。植物個体に和合性病原体Peronospora parasitica NoCo２の分生子懸濁液(１.８×１０⁵胞子/ml) を植菌した。植菌後、植物個体にカバーをかけて高湿度を保ち、Percival培養室に１７℃、昼１４時間/夜１０時間のサイクルで置いた(Uknes et al.，1993)。植菌後８日で、組織を集めた。真菌増殖は、White et al．(1990;PCR Protocols:A guide to Methods and Ap plication，315-322)のＰＣＲにより得られたｒＲＮＡ真菌プローブを用いて測定した。凍結組織からフェノール/クロロホルム抽出、次いで塩化リチウム沈殿によりＲＮＡを精製した(Lagrimini et al.，1987:PNAS，84:7542-7546)。Ausbe l et al．(1987)に記載のようにして、サンプル(７.５ug)をホルムアルデヒドアガロースゲルでの電気泳動により分離し、ナイロン膜(Hybond-N+，Amersham)へブロットした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄はChurch and Gilbert(1984 ，PNAS，81:1991-1995)に従った。転写物の相対量は、Phosphor Imager(Molecul ar Dynamics，Sunnyvale，CA)とその製造元指示書に従い測定した。剥がしたフィルターブロットを構成的に発現されたｂ-チューブリンシロイヌナズナｃＤＮＡでプローブすることにより、サンプル充填物を正規化した。非処置植物個体の侵入は、０％の真菌増殖阻害に相当した。メタラキシル単独、“植物活性化剤”ＢＴＨ単独、またはメタラキシルとＢＴＨの両方を上記cim３変異体に適用すると、加算した以上の、即ち相乗的な病害抵抗性効果を生んだ。この効果は、予測(Ｅ)された効果に対する観察された(Ｏ) 効果の比率である相乗係数(ＳＦ)として測定した。下記の結果が得られた：表３３シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用成分Ｉ：cim３変異成分II：メタラキシルｗｔ＝野生型Col-０ＮＤ＝測定されず表３４シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用成分Ｉ：cim３変異成分II：ＢＴＨｗｔ＝野生型Col-０ＮＤ＝測定されず表３５シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用成分Ｉ：cim３変異成分II：ＢＴＨとメタラキシル(Ｍ) ｗｔ＝野生型Col-０ＮＤ＝測定されず上の表から理解できるように、相乗的病害抵抗性効果は、cim３植物においてメタラキシル単独の適用、ＢＴＨ単独の適用、およびメタラキシルおよびＢＴＨの併用塗布の場合で示された。例えば、非処置cim３植物では、非処置野生型植物に対して真菌増殖阻害１２.５％であり、このことは、cim３変異体における構成性ＳＡＲ遺伝子発現が病害抵抗性に相関することを表している。しかしながら、表３０に示されているように、メタラキシルを０.０００１g/l(普通なら効果を上げるには不十分な濃度)で免疫調節化(ＳＡＲ-オン)cim３植物植物に適用すると、観測される真菌増殖阻害レベルは５７.８％まで増加した。これらのデータから算出した相乗係数４.６は、明らかに、殺菌剤を免疫調節化植物に適用することにより相乗効果が達成されたことを示す。表３１に与えたデータは、相乗性がＢＴＨなどの全身性獲得抵抗性の化学的誘発物質を免疫調節化(ＳＡＲ-オン)cim３植物植物に適用しても達成されることを示す。例えば、野生型植物では、０.０３ｍＭ濃度のＢＴＨは、普通なら、効果的な病害抵抗性を付与するには不十分であり、ほんの２０.８％の真菌増殖阻害を与える程度である。しかしながら、cim３植物では、この普通なら不適当なＢＨＴ濃度でも、効果的な推奨濃度の０.１ｍＭＢＴＨで得られる阻害レベルとほぼ同程度に高い７３.１％の真菌増殖阻害を与えた。表３１のデータから算出した相乗係数２.２は、明らかに、この相乗効果がＢＴＨを既に他の手段で免疫調節しておいた植物に適用すると達成されることを示す。病害抵抗性における効果は、ＢＴＨとメタラキシルをcim３植物に併用適用するとより一層劇的であった。上記実施例１３(表２９)に記載のように、野生型植物において、０.０１ｍＭＢＴＨまたは０.０００１g/lメタラキシルのいずれかを別個に適用しても、これらの濃度は普通なら効果を生むには不十分であるため、なんら真菌増殖阻害は達成されない。しかしながら、これらの化合物両方を普通なら不十分な濃度で植物個体に塗布すると、野生型植物では相乗効果である４０.７％の真菌増殖阻害が観測された。cim３植物では、０.０１ｍＭＢＴＨおよび０.０００１g/lメタラキシルの同時塗布により、１００％の真菌増殖阻害がもたらされ、明らかに更に一層の相乗的作用を示している。このように、免疫調節化cim植物と、普通なら不十分な低濃度の化学品とを併用した病害抵抗性の獲得は有利であり、農業分野の当業者ならば明らかである。本明細書に示した相乗性を利用すれば、普通ならば毒性であるか、または望ましくない濃度の化学品の使用を回避できる。更に、植物を所定レベルまで防御するのに必要な化学品量が減った結果として、経済的利益も実感できる。 III．常用の殺菌剤および/または全身性獲得抵抗性の化学的誘発物質をＮＩＭ１遺伝子の各形態を含むトランスジェニック植物に適用することによる、相乗的病害抵抗性効果ＮＩＭ１遺伝子は、植物における全身性獲得抵抗性(ＳＡＲ)経路のキイ成分である(Ryals et al.，1996)。ＮＩＭ１遺伝子は、化学的および生物学的誘発物質によるＳＡＲの活性化と関連しており、かかる誘発物質と共に、ＳＡＲおよびＳＡＲ遺伝子発現にとって必要である。ＮＩＭ１遺伝子の所在は、宿主植物に広範囲の病原体に対する極度の感受性を付与して、病原体およびＳＡＲの化学的誘発物質に応答できないようにする、変異体nim１遺伝子を持つことが知られている変異体植物ゲノムの分子生物学的分析により測定されている。野生型ＮＩＭ１遺伝子産物(配列番号２)は、シグナル伝達カスケードに関与して、シロイヌナズナにおけるＳＡＲと遺伝子毎の(gene-for-gene)病害抵抗性の両方を導く(Ryals et al.，1997)。ＮＩＭ１の野生型形態の組換え過発現が構成的免疫(ＣＩＭ)表現型の免疫調節化植物を生じさせ、そうしてトランスジェニック植物中に病害抵抗性を付与する。増加レベルの活性ＮＩＭ１タンパク質は、ＢＴＨ、ＩＮＡおよびＳＡなどの誘発性化学品による化学的誘発と同程度の病害抵抗性効果を生む。同時係属中米国出願０８/８８０,１７９、出典明示により本明細書の一部とする、参照。更に、ＮＩＭ１遺伝子産物は、哺乳動物シグナル伝達因子ＩκＢサブクラスα の構造的相同体であることが示されている(Ryals et al.，1997)。ＩκＢの変異は、ＮＦ-κＢ/ＩκＢレギュレーション機構のスーパーレプレッサーまたは優性ネガティブとして働くと記載されている。よって、ＮＩＭ１の変化形態はＳＡＲシグナル伝達経路の優性ネガティブレギュレーターとして働く。これらのＮＩＭ１の変化形態は、nim１変異体としてその変化形態により形質転換させた植物において反対の表現型を付与する。即ち、ＮＩＭ１の変化形態で形質転換させた免疫調節化植物は、構成性ＳＡＲ遺伝子発現とＣＩＭ表現型を示す。同時係属中のＰＣＴ出願“METHODS OF USING THE NIM1 GENE TO CONFER DISEASE RESISTANCE IN PLANTS”、出典明示により本明細書の一部とする、参照。実施例２０：野生型ＮＩＭ１遺伝子を含有するコスミドクローンによる植物の形質転換コスミドＤ７(ＡＴＣＣ９７７３６として１９９６年９月２５日、ＡＴＣＣに寄託)はＮＩＭ１遺伝子領域にわたるクローンから作られているため、野生型ＮＩＭ１遺伝子(配列番号１)を含む。コスミドＥ１もＮＩＭ１遺伝子領域にわたるクローンから作られているため、野生型ＮＩＭ１遺伝子(配列番号１)も含む。米国特許出願０８/８８０,１７９に記載のように、コスミドＤ７およびＥ１をヘルパー株ＨＢ１０１(ｐＲＫ２０１３)との三親交配(tri-parental mating)における接合伝達によりAgrobacterium tumefaciens ＡＧＬ-１に移した。次いで、これらのコスミドを用いて真空浸透(vacuum infiltration)によりカナマイシン感受性nim１変異体シロイヌナズナ系列を形質転換した(Mindrinos et al.，1994， Cell 78，1089-1099)。浸透化植物(infiltrated plants)の種子を集め、選択因子として５０mg/mlカナマイシンを含むＧＭ寒天平板で発芽させた。平板培養からおよそ２週間後に選択に耐えた実生を土に移した。土に移した植物個体を移転後およそ１週間フィトトロン中で生育させた。植物全体に完全にかかるよう、霧吹きで３００ｍＭＩＮＡを微細ミストとして適用した。２日後、ＲＮＡ抽出およびＰＲ-１発現分析用に葉を集めた。次いで、この植物にPeronospora parasitica(単離物ＥｍＷａ)を噴霧し、生育室で高湿度条件下、昼１９℃/夜１７℃、明８時間/暗１６時間のサイクルで生育させた。真菌感染後８ないし１０日で、真菌増殖についてポジティブであるかネガティブであるかを評価し、記録した。Ｗｓおよびnim１植物を各実験の対照とするため、同様に処置した。 LiCl/フェノール抽出緩衝液を用いて、集めた組織から全ＲＮＡを抽出した(Ve rwoerd et al.，1989，Nuc．Acid．Res．2362)。ＲＮＡサンプルをホルムアルデヒドアガロースゲルに流し、GeneScrees Plus(DuPont)膜にブロットした。ブロットを³²Ｐ-標識ＰＲ-１ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。得られたブロットをフィルムに曝し、どの形質転換体がＩＮＡ処置後にＰＲ-１発現を誘発できるかを測定した。挿入部位(位置)効果によりどのＤ７およびＥ１形質転換体もＮＩＭ１を過発現するかどうかを調べるため、Ｄ７またはＥ１コスミドを含有する主要な形質転換体を自家受粉させ、Ｔ２種子を集めた。１つのＥ１系列と９５のＤ７系列の種子を土に播種し、上記のように生育させた。Ｔ２個体に少なくとも４枚の真葉が出たら、各個体毎に別々に１枚づつ集めた。ＲＮＡをその組織から抽出し、ＰＲ- １およびＮＩＭ１発現について分析した。次いで、植物個体にP．parasitica(ＥｍＷａ)を植菌し、感染後１０日で真菌増殖について分析した。多数の形質転換体が正常以下の真菌増殖を示し、そのうちの４個体、即ち、系列Ｄ７-２、Ｄ７- ７４、Ｄ７-８９およびＥ１−１は目に見える真菌増殖を全く示さなかった。正常より高いＮＩＭ１およびＰＲ-１発現を示し、かつ真菌抵抗性を示した植物個体は、ＮＩＭ１の過発現が病害抵抗性を付与することを示している。実施例２１：その天然プロモーター下でのＮＩＭ１過発現ＮＩＭ１遺伝子を構成的に発現する植物は、１.４ｋｂのプロモーター配列を含有するBamHＩ-HindIII ＮＩＭ１ゲノム断片(配列番号１−塩基１２４９−５６５５)をもつＷｓ野生型植物の形質転換から作られた。この断片をｐＳＧＣＧ０１内にクローニングし、Agrobacterium株ＧＶ３１０１内に形質転換させた(ｐＭＰ９０，Koncz and Schell（1986）Mol．Gen．Genet．204:383-396)。Ｗｓ植物を上記のように浸透化(inflated)させた。得られた種子を回収し、５０μg/mlカナマイシン含有ＧＭ寒天上で平板培養した。生き残った苗木を土に移し、上記のように、Peronospora parasitica単離物Ｅｍｗａに対する抵抗性について試験した。選択した植物個体を自家受粉させて、二連続世代について選択し、ホモ接合性系列を作った。これら数種の系列に由来する種子を土に播種し、一系列当り１５−１８個体を３週間生育させ、誘発性化学品で前処置することなく、Ｅｍｗａ抵抗性について再度試験した。真菌処置後、およそ２４時間、４８時間および５日で、各系列毎に組織を集めてプールし、凍結させた。植物個体は、Ｅｍｗａに対する抵抗性について評価したら、植菌後１０日まで生育室に残しておいた。集めたサンプル全てからＲＮＡを調製し、前述のように分析した(Delaney et al.，1995)。ブロットをシロイヌナズナ遺伝子プローブＰＲ-１にハイブリダイズさせた(Uknes et al.，1992)。分析した１３のトランスジェニック系列のうち５個体は、早期にＰＲ１遺伝子発現誘発を示した。これらの系列の場合、ＰＲ- １ｍＲＮＡは、真菌処置後２４または４８時間まで明らかにそれと分かった。これら５系列はまた、目に見える真菌増殖を示さなかった。上記のように葉をラクトフェノールブルーで染色(Dietrich et al.，1994)して、葉の中に真菌の菌糸がないことを確かめた。ＰＲ-１遺伝子発現は、その他８系列では４８時間までに誘発されず、これらの植物個体は、Ｅｍｗａに対する抵抗性を示さなかった。抵抗性系列のサブセットも、Uknes et al．(1993)に記載のように、細菌性病原体Pseudomonas syringae DC3000に対する抵抗性の増大について試験し、抵抗性スペクトルを評価した。実験は、実質的にLawton et al．(1996)に記載のようにして行った。細菌増殖は、Ｅｍｗａに対する構成的抵抗性も示した系列では遅かった。このことは、その天然プロモーター下でＮＩＭ１遺伝子を過発現する植物個体は病原体に対して構成的免疫を持つことを示す。これらの系列におけるＣＩＭ表現型の更なる特徴を評価するために、非感染植物個体を遊離のグルコースコンジュゲート化サリチル酸について評価し、葉をラクトフェノールブルーで染色して、微視的病変の存在について評価した。抵抗性個体をNahＧおよびndr１などのＳＡＲ変異体と有性交配させ、他の変異体に対する抵抗性表現型の上位関係を確立し、これらのＮＩＭ１有性ネガティブ変異体がどのようにサリチル酸依存性フィードバックループに影響を与え得るかを評価した。実施例２２：ＮＩＭ１の３５Ｓ制御化過発現全長ＮＩＭ１ｃＤＮＡ(配列番号６)をｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸのEcoRＩ部位にクローニングした(Comai et al．（1990）Plant Mol．Biol．15，373-381)。得られたプラスミドから、増強CaMV ３５Ｓプロモーター含有Xba1断片、正確な転写配向のＮＩＭ１ｃＤＮＡおよびtml３'ターミネーターを得た。この断片をバイナリーベクターｐＣＩＢ２００内にクローニングし、ＧＶ３１０１内で形質転換させた。Ｗｓ植物は前述のように浸透化させた。得られた種子を集め、５０ μg/mlカナマイシン含有ＧＭ寒天にて平板培養した。生き残った苗木を土に移し、上記のように試験した。選択した植物個体を自家受粉させて、二連続世代について選択し、ホモ接合性系列を作った。試験した５８系列のうち９系列は、化学品前処置なしにＥｍｗａで処置すると、抵抗性を示した。よって、ＮＩＭ１ｃＤＮＡの過発現によっても病害抵抗性植物は生じる。実施例２３：ＮＩＭ１はＩκＢαの相同体であるＮＩＭ１遺伝子産物がＩκＢαの相同体であることを測定することにより、ＮＩＭ１およびＩκＢのタンパク質遺伝子産物間の多重配列アラインメント(multi ple sequence alignment)を実施した(図１)。配列相同性調査は、ＢＬＡＳＴ(Al tschul et al.，J．Mol．Biol．215，403-410(1990))を用いて行った。この多重配列アラインメントは、ＤＮＡＳＴＡＲ社(Madison，WI)のLasergeneバイオコンピューティング・ソフトウェア・パッケージの一部であるClustal V(Higgins et al.，CABIOS 5，151-153(1989))を用いて構築した。アラインメントに使用した配列はＮＩＭ１(配列番号２)、マウスＩκＢα(配列番号３；GenBank受託番号：１０２２７３４)、ラットＩκＢα(配列番号４；GenBank受託番号：５７６７４およびＸ６３５９４；Tewari et al.，Nucleic Acids Res．20，607(1992))およびブタＩκＢα(配列番号５；GenBank受託番号：Ｚ２１９６８；de Martin et a l.，EMBO J．12，2773-2779(1993)；GenBank受託番号５１７１９３,de Martin e t al.,Gene 152，253-255(1995))であった。Clustal分析に使用したパラメーターは、１０のギャップペナルティーと１０のギャップ長ペナルティーであった。進化論的分岐距離は、PAM250加重表を用いて算出した(Dayhoff et al.,“A mode l of evolutionary change in proteins．Matrices for detecting distant rel ationships.”In Atlas of Protein Sequence and Structure，Vol．5，Suppl． 3，M．O.，Dayhoff，ed(National Biomedical Research Foundation，Washingto n，D.C.)，pp．345-358(1978))。残基類似性は、修飾Dayhoff表を用いて算出した(Schwartz and Dayhoff，“A model of evolutionary change in proteins.” In Atlas of Protein Sequence and Structure,M．O．Dayhoff,ed（National Bi omedical Research Foundation，Washington,D.C.）pp．353-358(1979);Gribsko v and Burgess，Nucleic Acids Res．14，6745-6763(1986))。相同性調査は、アンキリン、ＮＦ-κＢおよびＩκＢを含む数種のタンパク質のアンキリンドメインに対するＮＩＭ１の類似性を示す。最も全体的な相同性は、ＩκＢおよび関連分子に対するものである(図１)。ＮＩＭ１はアミノ酸位置５５および５９にセリン２つを含有し、その５９位のセリンは、リン酸化依存性ユビキチン媒介誘発性分解での役割に矛盾しない情況(Ｄ/ＥxxxxＳ)および位置(Ｎ -末端)にある。全てのＩκＢは、これらのＮ-末端セリンを持ち、ＩκＢの不活性化やその後のＮＦ-κＢの放出に必要とされる。ＮＩＭ１はアンキリンドメイン(アミノ酸２６２−２９０および３２３−３７１)を持つ。アンキリンドメインは、タンパク質-タンパク質相互作用に関与すると考えられており、ＩκＢおよびＮＦ-κＢ分子の偏在的特徴である。ＩκＢのＣ-末端は、類似していなくてもよい。ＮＩＭ１は、あるＩκＢのＣ-末端でみられるＱＬ-豊富領域(アミノ酸４９１-４９９)にある程度相同性である。実施例２４：ＮＩＭ１変化形態の作製− セリン残基５５および５９のアラニン残基への変化ヒトＩκＢにおけるセリン残基のリン酸化は、ＩκＢの刺激活性化分解に必要とされ、それによってＮＦ-κＢを活性化する。ヒトＩκＢにおけるセリン残基( Ｓ３２−Ｓ３６)のアラニン残基への突然変異誘発は、刺激誘導性リン酸化を阻害するため、ＩκＢαプロテオソーム媒介分解をブロックする(E．Britta-Maree n Traenckner et al.，EMBO J．14:2876-2883(1995);Brown et al.，Science 26 7:1485-1488(1996);Brockman et al.，Molecular and Cellular Biology 15:280 9-2818(1995);Wang et al.，Science 274:784-787(1996))。このＩκＢαの変化形態は、ＮＦ-κＢを細胞質中に保持することにより、優性ネガティブ形態として機能するので、下流のシグナル形成事象をブロックする。ＮＩＭ１とＩκＢとの間の配列比較によれば、ＮＩＭ１のセリン５５(Ｓ５５) および５９(Ｓ５９)は、ヒトＩκＢαにおいて、Ｓ３２およびＳ３６と相同である。ＮＩＭ１の優性ネガティブ形態を構築するために、アミノ酸位置５５および５９のセリンをアラニン残基へと突然変異誘発させる。これは、当業者には知られているどの方法でも、例えば、クイックチェンジ部位指向性突然変異誘発キット(#200518:Strategene)を用いて実施できる。４２ｂｐの５'非転写配列(ＵＴＲ)と１８７ｂｐの３'ＵＴＲを含む全長ＮＩＭ１ｃＤＮＡ(配列番号６)を使えば、その突然変異誘発構築物は、下記のプライマー(配列番号６；１９２−２２６位)：５'-ＣＡＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＧＴＣＴＴＴＧＡＣＧＣＧＣＣＧＧＡＴＧ-３'(配列番号２５)および５'-ＣＡＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＣＡＡＡＧＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧ-３'(配列番号２６)、下線付き塩基は変異を示す、を用いて製造元指導書により作ることができた。方法は次のとおりである：ベクターｐＳＥ９３６内でクローニングしたＮＩＭ１ｃＤＮＡ(Elledge et al.，Proc．Nat．A cad．Sci．USA 88:1731-1735(1991))を変性させ、変化塩基含有プライマーをアニーリングする。ＤＮＡポリメラーゼ(Pfu)は、ニック形成環状鎖をもたらす非鎖状置換(non-strand displacement)によりプライマーを伸長させる。ＤＮＡをD pnＩでの制限エンドヌクレアーゼ消化し、メチル化部位のみを切断する(非突然変異誘発化鋳型ＤＮＡ)。残りの環状dsＤＮＡをE.コリ株ＸＬ１-ブルー内に形質転換させる。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、配列決定して、変異塩基の存在を立証し、他の変異は起こっていないことを確認する。突然変異誘発化ＮＩＭ１ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼEcoRＩで消化し、カリフラワーモザイクウイルスの二重３５Ｓプロモーターの転写調節下でｐＣＧＮ１７６１内にクローニングした。３５Ｓプロモーター、ＮＩＭ１ｃＤＮＡおよびtmlターミネーターを含む形質転換カセットを、XbaＩでの部分制限消化によりｐＣＧＮ１７６１から解離させ、XbaＩに連結させ、脱リン酸化ｐＣＩＢ２００のXbaＩ部位に連結させる。配列番号７と８は、ＮＩＭ１遺伝子のこの変化形態のＤＮＡコード配列とコード化アミノ酸配列それぞれを示す。実施例２５：ＮＩＭ１変化形態の作製−Ｎ-末端欠失Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ３２およびＳ３６を含むヒトＩκＢαのアミノ酸１−３６ (Brockman et al.;Sun et al.)または１−７２(Sun et al.)の欠失は、トランスフェクション化ヒト細胞培養物において優性ネガティブＩκＢα表現型をもたらす。ＮＩＭ１ｃＤＮＡのコード化産物の先頭のおよそ１２５アミノ酸のＮ-末端欠失により、強力なユビキチン化部位として働き得る８つのリジン残基が除去され、またＳ５５およびＳ５９の推定リン酸化部位も除去される(実施例２参照) 。この変化遺伝子構築物は、当業者には知られているどの方法でも作ることができる。例えば、Ho et al.，Gene 77:51-59(1989)の方法を用いて、最初のおよそ１２５アミノ酸をコードするＤＮＡが欠失しているＮＩＭ１形態を作ることができる。次のプライマーにより、１６１２ｂｐＰＣＲ産物(配列番号６：４１８ないし２０１１)を作る：５'-gg aat tca-ＡＴＧＧＡＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＡＣＴＧＴＴＴＴＧ-３'(配列番号２７)および５'-gga att cＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＴＡＴＡＣＣＡＴＴＧＧ-３'(配列番号２８)、合成開始コドンには下線(ＡＴＧ)を付し、EcoRＩリンカー配列は小文字である。断片の増幅には、最終容量５０ml中、０.１から１００ngの鋳型ＤＮＡ、１０ｍＭトリスｐＨ８.３ /５０ｍＭＫＣｌ/２ｍＭＭｇＣｌ₂/０.００１％ゼラチン/０.２５ｍＭ各ｄＮＴＰ/０.２ｍＭ各プライマーと、１ユニットrTth ＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物とPerkin Elmer Cetus 9600 ＰＣＲ機を利用する。ＰＣＲ条件は、下記のとおりである：９４℃３分:３５×(９４℃３０秒：５２℃１分：７２℃２分) ：７２℃１０分。ＰＣＲ産物はｐＣＲ２.１ベクター(Invitrogen)内に直接クローニングする。ＰＣＲベクター中のＰＣＲ作製挿入物は、二重３５Ｓプロモーターの転写調節下で、EcoRＩを用いる制限エンドヌクレアーゼ消化により解離させ、脱リン酸化ｐＣＧＮ１７６１のEcoRＩ部位に連結させる。構築物の配列を決定して、合成開始ＡＴＧの存在を立証し、その他の変異がＰＣＲ中に起こらなかったことを確認する。３５Ｓプロモーター、修飾ＮＩＭ１ｃＤＮＡおよびtmlターミネーターを含む形質転換カセットをXbaＩでの部分制限消化によりｐＣＧＮ１７６１から解離させ、ｐＣＩＢ２００のXbaＩ部位に連結させる。配列番号９および１０は、それぞれ、Ｎ-末端アミノ酸欠失を持つＮＩＭ１遺伝子の変化形態のＤＮＡコード配列とコード化アミノ酸配列を示す。実施例２６：ＮＩＭ１の変化形態の作製−Ｃ-末端欠失ヒトＩκＢのアミノ酸２６１−３１７の欠失は、Ｃ-末端におけるセリンおよびトレオニン残基の構成性リン酸化をブロックすることにより、本来備わっている安定性の増強をもたらすと考えられる。セリンおよびトレオニンに富む領域は、ＮＩＭ１のＣ-末端のアミノ酸５２２−５９３に存在する。ＮＩＭ１遺伝子のＣ- 末端コード領域は、アミノ酸５２２−５９３をコードするヌクレオチド配列を欠失することにより修飾できる。Ho et al．(1989)の方法を用いて、ＮＩＭ１ｃＤＮＡのＣ-末端コード領域と３'ＵＴＲ(配列番号６：１６０６−２０１１)をＰＣＲにより欠失させ、次のプライマー：５'-cggaattcＧＡＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＴＣ-３'(配列番号２９)および５'-ggaattcＴＣＡＡＣＡＧＴＴＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＴＣＧ-３'(配列番号３０)、合成停止コドンには下線を付し、EcoRＩリンカー配列は小文字である、を用いて１６２３ｂｐ断片を作製する。ＰＣＲ反応成分は前述の通りであり、サイクリングパラメーターは次のとおりである：９４℃３分：３５×(９４℃３０秒：５２℃３０秒：７２℃２分) ；７２℃１０分。ＰＣＲ産物はｐＣＲ２.１ベクター(Invitrogen)内に直接クローニングする。ＰＣＲベクター中のＰＣＲ作製挿入物は、EcoRＩを用いる制限エンドヌクレアーゼ消化により解離させ、二重３５Ｓプロモーターを含有する脱リン酸化ｐＣＧＮ１７６１のEcoRＩ部位に連結させる。構築物の配列を決定して、合成フレーム内停止コドンの存在を立証し、その他の変異がＰＣＲ中に起こらなかったことを確認する。プロモーター、修飾ＮＩＭ１ｃＤＮＡおよびtmlターミネーターを含む形質転換カセットをXbaＩでの部分制限消化によりｐＣＧＮ１７６１から解離させ、ｐＣＩＢ２００のXbaＩ部位に連結させる。配列番号１１および１２は、それぞれ、Ｃ-末端アミノ酸欠失を持つＮＩＭ１遺伝子の変化形態のＤＮＡコード配列とコード化アミノ酸配列を示す。実施例２７：ＮＩＭ１変化形態の作製−Ｎ-末端/Ｃ-末端欠失キメラＮＩＭ１のＮ-末端およびＣ-末端欠失形態は、８１９位のユニークKpnＩ制限部位を用いて作製する(配列番号６)。Ｎ-末端欠失形態(実施例２５)は、EcoRＩ/ KpnＩで制限エンドヌクレアーゼ消化し、修飾Ｎ-末端に相当する４１５ｂｐ断片をゲル電気泳動により回収する。同様にＣ-末端欠失形態(実施例２６)は、EcoR Ｉ/KpnＩで制限エンドヌクレアーゼ消化し、修飾Ｎ-末端に相当する７９０ｂｐ断片をゲル電気泳動により回収する。この各断片を１５℃で連結させ、EcoRＩで消化して、EcoRＩコンカテマーを排除し、脱リン酸化ｐＣＧＮ１７６１のEcoRＩ部位にクローニングする。ＮＩＭ１のＮ/Ｃ-末端欠失形態は、二重３５Ｓプロモーターの転写調節下にある。同様に、Ｃ-末端欠失に融合させたＳ５５/Ｓ５９突然変異誘発化推定リン酸化部位(実施例２４)からなるＮＩＭ１のキメラ形態を作る。構築物は上記のようにして作る。構築物の配列を決定し、開始および停止コドンの適合度(fidelity)を立証し、クローニング中に変異が起こらなかったことを確認する。３５Ｓプロモーター、ＮＩＭ１キメラおよびtmlターミネーターを含む形質転換カセットをXbaＩでの部分制限消化によりｐＣＧＮ１７６１から解離させ、脱リン酸化ｐＣＩＢ２００のXbaＩ部位に連結させる。配列番号１３および１４は、それぞれ、Ｎ-末端およびＣ-末端アミノ酸欠失両方を持つＮＩＭ１遺伝子の変化形態のＤＮＡコード配列とコード化アミノ酸配列を示す。実施例２８：ＮＩＭ１の変化形態の作製−アンキリンドメインＮＩＭ１は、およそアミノ酸１０３−３６２でアンキリンモチーフとの相同性を示す。Ho et al．(1989)の方法を用い、推定アンキリンドメインをコードするＤＮＡ配列(配列番号１：３０９３−３９５１)を、次のプライマー：５'-ggaatt caＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＧＣ-３'(配列番号３１)および５'-ggaattcＴＣＡＡＣＣＴＴＣＣＡＡＡＧＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＧ-３'(配列番号３２)を使用して、ＮＩＭ１ｃＤＮＡ(配列番号６：３４９−１１２８)からＰＣＲ増幅する(条件：９４℃３分：３５×(９４℃３０秒：６２℃３０秒：７２ ℃２分)：７２℃１０分)。得られた産物をEcoRＩで制限エンドヌクレアーゼ消化し、次いで、脱リン酸化ｐＣＧＮ１７６１のEcoRＩ部位に二重３５Ｓプロモーターの転写調節下でスプライシングする。構築物の配列を決定して、合成開始コドン(ＡＴＧ)、フレーム内停止コドン(ＴＧＡ)の存在を立証し、ＰＣＲ中に他の変異が起こらなかったことを確認する。３５Ｓプロモーター、アンキリンドメインおよびtmlターミネーターを含む形質転換カセットをXbaＩでの部分制限消化によりｐＣＧＮ１７６１から解離させ、脱リン酸化ｐＣＩＢ２００のXbaＩ部位に連結させる。配列番号１５および１６は、それぞれ、ＮＩＭ１のアンキリンドメインのＤＮＡコード配列とコード化アミノ酸配列を示す。実施例２９：キメラ遺伝子の構築ＮＩＭ１変化形態の適切な空間的かつ時間的発現の見込みを増加させるために、ＮＩＭ１プロモーターおよび遺伝子を含有する４４０７bp HindIII/BamHＩ断片(配列番号１：塩基１２４９−５６５５)および/または５６５５bp EcoRＶ/Bam HＩ断片(配列番号１：塩基１−５６５５)を使用して、上記実施例２４−２８のＮＩＭ１変化形態を作製する。構築段階は異なるが、その概念は前述の実施例に相当する。変化形態の強力な過発現は、潜在的に致死性であるかもしれない。そのため、実施例２４−２８に記載したＮＩＭ１遺伝子の変化形態は、内生ＮＩＭ１プロモーター以外の、nosプロモーターまたはRubiscoプロモーターの小さいサブユニットを含むがこれらに限定されない、プロモーターの調節下に置くことができる。同様に、ＮＩＭ１変化形態は、病原体応答プロモーターＰＲ-１の調節下に発現させることができる(米国特許５，６１４，３９５)。このような発現により、病原体攻撃またはその他のＳＡＲ活性化条件下でのみＮＩＭ１変化形態を強力に発現させることができる。更に、病害抵抗性は、通常ならばＳＡＲを活性化しないＳＡＲ活性化剤化合物(即ち、ＢＴＨまたはＩＮＡ)の濃度で処置して、フィードバックループを活性化した場合、ＰＲ-１プロモーター調節下でＮＩＭ１変化形態を発現する形質転換体では、はっきりと分かる(Weymann et al.，（1 995）Plant Cell 7:2013-2022)。実施例３０：ＮＩＭ１の変化形態のシロイヌナズナへの形質転換作製した構築物(実施例２４−２９)をＧＶ３１０１株への電気穿孔法によりアグロバクテリウムツメファシエンスへ移す。これらの構築物は、真空浸透(Min drinos et al.，Cell 78，1089-1099(1994))または標準の根形質転換によりシロイヌナズナ生態型Ｃｏｌ−０およびＷｓ−０を形質転換するのに使用される。これらの植物の種子を採取し、選択試薬としてカナマイシン(または他の適切な抗生物質)を用いて寒天プレート上に発芽させる。形質転換された苗木のみが選択試薬を無毒化して、生存し得る。選択後に残った実生を土壌に移し、ＣＩＭ（構成的免疫）表現型について試験する。観察可能な表現型相違について植物個体を野生型個体と比較評価する。実施例３１：野生型ＮＩＭ１遺伝子またはＮＩＭ１遺伝子の変化形態により形質転換した植物におけるＣＩＭ表現型の評価各一次形質転換体から１枚の葉を採取し、ＲＮＡを単離し（Verwoerd et al. ，1989，Nuc Acid Res，2362）、ＲＮＡブロット分析（Uknes et al.，1992）により構成的ＰＲ−１発現について試験する。構成的ＳＡＲ発現分析の指標となる病害抵抗性反応の増強について各形質転換体を試験をする（Uknes et al.，1992 ）。２つの和合性P.parasitica単離物、EmwaおよびNoco（すなわち、これらの真菌株は野生型Ｗｓ−０およびＣｏｌ−０植物にそれぞれ病害をおこす）から５− １０×１０⁴胞子/mlの分生子懸濁液を準備し、形質転換体にその生態型に応じた適切な単離物を噴霧する。植菌ずみ植物を高湿度で７日間インキュベーションする。植物は７日目に罹病するとし、真菌感染測定法を提供するプローブを用いたＲＮＡブロット分析のため１枚の葉を採取した。ＣＩＭ表現型を示す形質転換体をＴ１世代とし、ホモ接合性個体を同定する。形質転換体を下記のような一連の病害抵抗性試験に付す。NocoおよびEmwaによる真菌感染を繰り返し、Dietrich et al.，(1994)に記載のような真菌菌糸の存在を同定するためにラクトフェノールブルーで葉を染色する。細菌病原体Pseudomo nas syringae DC3000で形質転換体を感染させ、Uknes et al．(1993)に記載のような抵抗性スペクトルを評価する。遊離のおよびグルコースコンジュゲートしたＳＡの両方について非感染植物を評価し、微細な病変の存在を評価するためにラクトフェノールブルーを用いて葉を染色する。抵抗性植物個体をＳＡＲ変異体、例えばNahG（米国特許第5,614,395号）およびndl１と有性交雑し、他の変異体に対する抵抗性表現型の上位関係を確認し、これらのＮＩＭ１の優性ネガティブ変異体がどのようにＳＡ依存フィードバックループに影響するか評価する。実施例３２：ＮＩＭ１相同体の単離シロイヌナズナ由来の全ＮＩＭ１遺伝子に対して、または好ましくは、そのコード配列の隣接部分を少なくとも長さ約１０ヌクレオチド含むシロイヌナズナＮＩＭ１遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドプローブに対して適度なストリンジェント条件下でハイブリダイズするＮＩＭ１相同体は入手可能である。ハイブリッドの安定性に影響を与える要因により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決まる。このような要因の一つは、融解温度Ｔ_mであり、DNA PROBE S，George H．Keller and Mark M．Manak，Macmillan Publishers Ltd，1993，S ection one:Molecular Hybridization Technology;page 8 ffに記載の式に従って容易に計算できる。好ましいハイブリダイゼーション温度は、計算した融解温度Ｔ_mから下約２５℃の範囲であり、好ましくは計算した融解温度Ｔ_mから下約１２−１５℃の範囲であり、オリゴヌクレオチドの場合は、計算した融解温度Ｔ_m から下約５−１０℃の範囲である。ＮＩＭ１ｃＤＮＡ（配列番号６）をプローブとして使用して、限定するわけではないが、例えば下記実施例３３のような異なる農産物由来のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってシロイヌナズナＮＩＭ１の相同体を同定する。これを成し遂げる標準技法には、平板培養したＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング(プラークまたはコロニーのいずれか；参照、例えば、Sambrook et al.，Molecular Cloning，eds.，Cold S pring Harbor Laboratory Press．(1989))およびオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲによる増幅（参照、例えば、Innis et al.，PCR Protocols ，a Guide to Methods and Applications eds.，Academic Press(1990)）がある。同定した相同体を、本明細書の発現ベクター内へ遺伝子操作し、および上記の農産物内に形質転換する。試験対象の農産物個体の関連病原体を使用して、形質転換体の増強病害抵抗性について評価する。キュウリ、トマト、タバコ、トウモロコシ、小麦、大麦のゲノムにおけるＮＩＭ１相同体はＤＮＡブロット分析により検出されている。ゲノムＤＮＡをキュウリ、トマト、タバコ、トウモロコシ、小麦、大麦から単離し、酵素BamHI、HindI II、XbaIまたはSaIIにより制限消化し、０.８％アガロースゲル上で電気泳動により分離させ、毛管ブロッティングによりナイロン膜に吸着させる。ＤＮＡを固定させるために紫外線照射した後、低ストリンジェンシー条件[（１％ＢＳＡ；５２０mM ＮａＰＯ₄、ｐＨ７.２；７％ラウリル硫酸ナトリウム塩；１mM ＥＤＴＡ；２５０mM塩化ナトリウム）５５℃で１８−２４時間]で³²Ｐ放射標識したシロイヌナズナＮＩＭ１ｃＤＮＡと膜をハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの後、ブロットを低ストリンジェンシー条件[５５℃で１５分間６ ×ＳＳＣ(×３)１５分間３×ＳＳＣ(×１)；１×ＳＳＣは０.１５ＭＮａＣｌ、１５mMクエン酸Ｎａ（ｐＨ７.０）]で洗浄し、ＮＩＭ１に対応するバンドを可視化するためにＸ線フィルムにさらす。さらに、ＮＩＭ１遺伝子との類似性によって同定された発現配列タグ(ＥＳＴ) を用いて相同体を単離できる。例えば、いくつかのイネ発現配列タグ（ＥＳＴ）は、ＮＩＭ１遺伝子との類似性によって同定されてきた。多重複配列アラインメントはＤＮＡ^*（1228 South Park Street，Madison Wisconsin，53715）Laserge ne Biocomputing Software package for the Macintosh(1994)の一部としてClus tal V(Higgins，Desmond G．and Paul M．Sharp(1989)，Fast and sensitive mu ltiple sequence alignments on a microcomputer，CABIOS 5:151-153)を使用して構築した。ＮＩＭ１タンパク質のある領域は、４つの異なるイネｃＤＮＡタンパク質産物とアミノ酸配列において相同性である。相同体をGenBank BLAST調査におけるＮＩＭ１配列を使用して同定した。ＮＩＭ１の相同性領域とイネｃＤＮＡ産物の比較は図２に示す（配列番号２および１７−２４も参照）。ＮＩＭ１タンパク質フラグメントは、イネ産物４つと３６−４８％同一のアミノ酸配列を示す。これらのイネＥＳＴは、他の単子葉植物からＮＩＭ１相同体を単離するのに特に有用であり得る。相同体はまた、ＰＣＲにより得られる。この方法では、既知の相同体（例えば、イネとシロイヌナズナ）間で比較する。このときアミノ酸およびＤＮＡ類似性または同一性の高い領域ＰＣＲプライマーをつくる。アミノ酸残基ＭおよびＷが豊富な領域が最適であり、アミノ酸残基Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｈ、Ｑ、ＫおよびＥが豊富な領域がそれに続くが、なぜならこれらのアミノ酸が限られた数のコドンを使ってコードされるからである。一旦適当な領域が同定されると、第３コドン位置に置換多様性をもつその領域のプライマーがつくられる。第３位置における置換の多様性は標的される種類によってきめられる。例えば、トウモロコシはＧＣが豊富であるので、可能であれば第３位置にＧまたはＣを使用するプライマーを設計する。ＰＣＲ反応は様々な標準的条件下でｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから行う。バンドが現れたら、クローン化および／または配列決定して、ＮＩＭ１相同体であるかどうかを測定する。実施例３３：農産物植物におけるＮＩＭ１形態の発現 Col-0またはWs-0においてＣＩＭ表現型をもたらすこれらの構築物を、評価するために農産物稙物に形質転換する。別法として、前述の実施例の農産物から単離された変化した天然ＮＩＭ１遺伝子をそれぞれの農産物に戻す。ＮＩＭ１遺伝子は、これらの広範な種類の中のいかなる植物細胞にも挿入可能であるが、特にイネ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、豆、エンドウ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリ、カブ、ラディッシュ、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、ウリ類（squash）、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、カリン、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシおよびサトウキビなどの農産物植物細胞において有用である。病害抵抗性の増強について形質転換体を評価する。本発明の好ましい実施態様において、ＮＩＭ１遺伝子の発現レベルは、野生型植物における天然ＮＩＭ１遺伝子の発現レベルの少なくとも２倍、好ましくは野生型発現レベルの１０倍である。実施例３４：ＮＩＭ１過発現トランスジェニック植物に常用の殺菌剤を塗布することにより得られる相乗的病害抵抗性本実施例（６Ｅおよび７Ｃ）で使用された植物系列は、上記実施例２１に記載のように、BamHＩ-HindIII ＮＩＭ１ゲノム断片（配列番号１：塩基１２４９− ５６５５）を有する野生型シロイヌナズナ植物（生態型Ｗｓ）の形質転換から作った。メタラキシル殺菌剤、ホセチル殺菌剤、水酸化銅殺菌剤は、それぞれ有効成分２５％、８０％、および７０％で湿潤性粉末担体と共に製造され、細かい霧として構成的にＮＩＭ１遺伝子を発現する３週齢のトランスジェニックＷｓ植物の葉に塗布する。対照として湿潤性粉末のみを塗布する。３日後、Delaney et a l.(1995)記載のように、植物にPeronospora parasitica単離物Emwa分生子懸濁液（１−２×１０⁵胞子/ml）を植菌した。植菌後、高い湿度を保っために植物を覆い、１7℃、昼１４時間／夜１０時間のサイクル（Uknes et al.，1993）でパーシバル培養室に置いた。接種後８日で、組織を採取した。分生子柄の発育を記録するために解剖顕微鏡で観察することにより真菌感染の進行を１２日間追跡した（Delaney，et al．(1994);Dietrich，et al.(1994)）。葉組織内の真菌生長を観察するため、個々の葉をラクトフェノールトリパンブルー（Lactophenoltrypan blue）染色した。プライマーＮＳ１およびＮＳ２および鋳型としてP.parasitica EmWa DNAを使用し、White et al（1990;PCR Protoco ls:A guide to Methods and Application，315-322)に従ってＰＣＲにより得たｒＲＮＡ真菌プローブを使用して、真菌生長を定量した。ＲＮＡを塩化リチウム沈殿の後、フェノール／クロロホルム抽出により凍結細胞から精製した（Lagrim ini et al，1987:PNAS，84:7542-7546）。サンプル（７.５μg）をホルムアルデヒドアガロースゲルによる電気泳動で分離し、Ausbel et al.(1987)に記載のようにナイロン膜（Hybond-Ｎ⁺，Amersham）に吸着させる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄はChurchおよびGilbert(1984，PNAS，81:1991-1995)に従う。転写物の相対量を、Phosphor Imager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)を使用し、メーカーの指示に従って測定する。剥がしたフィルターブロットを構成的に発現したb-チューブリンシロイヌナズナｃＤＮＡでプローブすることによりサンプル充填物を正規化する。非処置個体の侵入は、０％の真菌増殖阻害に相当した。ＮＩＭ１過発現植物系列へのメタラキシル、ホセチル、水酸化銅の塗布は、加算した以上の、すなわち相乗的な病害抵抗性効果をもたらした。この効果を観察（Ｏ）効果と予測（Ｅ）効果との比率である相乗係数（ＳＦ）として測定した。結果を下記に示す。表３６シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用成分Ｉ：ＮＩＭ１過発現（系列６Ｅ）成分II：メタラキシルｗｔ＝野生型Ｗｓ表３７シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用成分Ｉ：ＮＩＭ１過発現（系列６Ｅ）成分II：ホセチルｗｔ＝野生型Ｗｓ表３８シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用成分Ｉ：ＮＩＭ１過発現（系列７Ｃ）成分II：ホセチルｗｔ＝野生型Ｗｓ表３９シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用成分Ｉ：ＮＩＭ１過発現（系列６Ｅ）成分II：水酸化銅ｗｔ＝野生型Ｗｓ表４０シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用成分Ｉ：ＮＩＭ１過発現（系列７Ｃ）成分II：水酸化銅ｗｔ＝野生型Ｗｓ上記表から分かるように、相乗的病害抵抗性効果は、メタラキシル、ホセチルおよび水酸化銅の塗布によりＮＩＭ１過発現植物において証明された。例えば、非処置ＮＩＭ１植物（系列６Ｅ）では、非処置野生型植物に対して１０％の真菌増殖阻害がみられた。これにより、このＮＩＭ１過発現体における構成的ＳＡＲ遺伝子発現は病害抵抗性と相関していることが明らかである。しかしながら、上記表３７に示すように、５.０g/l（通常なら効果をあげるには不充分な濃度）でホセチルを免疫調節化（ＳＡＲ-オン）ＮＩＭ１過発現植物に塗布すると、観察された真菌増殖阻害レベルが９３％に上昇した。これらのデータから計算した５ .５という相乗係数は、明らかに免疫調節化（ＳＡＲ-オン）植物へ殺菌剤を塗布して相乗効果が得られたことを示している。別の例において、非処置ＮＩＭ１植物（系列７Ｃ）では、非処置野生型植物に対して１４％の真菌増殖阻害が見られ、このＮＩＭ１過発現体における構成的ＳＡＲ遺伝子発現が病害抵抗性と相関していることを証明している。しかしながら、上記表４０に示すように、２.０g/l（通常なら効果をあげるには不充分な濃度）で水酸化銅を免疫調節化（ＳＡＲ-オン）ＮＩＭ１過発現植物に塗布すると、観察された真菌増殖阻害レベルが７７％に上昇した。これらのデータから計算した５.５という相乗係数はさらに、免疫調節化（ＳＡＲ-オン）植物へ殺菌剤を塗布して相乗効果が得られたことを示している。従って、病害抵抗性を得るためにＮＩＭ１過発現免疫調節化稙物を、通常なら非効果的な低濃度の殺菌剤と組み合わせて使用すると、有益であり、これは当農業関係者には明らかである。通常毒性、さもなくば望ましくない濃度の殺菌剤は、本明細書で証明された相乗性を利用することにより回避できる。さらに、植物に所定の防御レベルをもたらすために要する殺菌剤の量を減らすことで、経済的利益を実現し得る。実施例３５：ＮＩＭ１過発現トランスジェニック植物にＳＡＲの化学誘発物質を塗布することにより得られる相乗的病害抵抗性ＢＴＨの異なる濃度に対する反応についても野生型Ｗｓ系列と比較して、ＮＩＭ１核遺伝子ＤＮＡフラグメントを含むトランスジェニック植物を自身のプロモーター（実施例２１）下に分析した。前述のように各系列からの種子を播き、育生する。播種後約３週間で、サンプルの葉を各系列（０日対照）から採取し、残存する葉をＨ₂Ｏ、１０μＭＢＴＨまたは１００μＭＢＴＨで処置した。追加のサンプルを処置後１、３および５日目に採取した。３日のサンプルを採取後、各系列の植物のサブセット（subset）を除去し、上記のようにPeronospora pa rasitica単離物Emwaで処置した。採取した組織からＲＮＡを準備し、シロイヌナズナＰＲ−１遺伝子プローブを用いてノーザン分析を行った。感染後８日目で真菌抵抗性について植物を記録した。ＷｓおよびＮＩＭ-過発現系列の４つ（３Ａ、５Ｂ、６Ｅおよび７Ｃ）についてノーザン分析の結果を図３に示す。野生型Ｗｓ系列におけるＰＲ−１遺伝子発現は、低レベル１０μＭＢＴＨ処置（効果をあげるには通常１００−３００μ ＭのＢＴＨ濃度が必要である）後、かろうじて検出できた。この処置からのＷｓ個体はまた、真菌病原体P.parasitica（Emwa）に感受性であった。しかしながら、ＮＩＭ１過発現系列のすべてにおいて、低レベルＢＴＨ処置後、ＰＲ−１遺伝子発現に対してより強い応答があった。さらに１０μＭのＢＴＨで処置したＮＩＭ１−過発現系列の全てがP.parasiticaに対して、完全、またはほぼ完全な抵抗性を示した。真菌菌糸の存在を同定するために（Dietrich et al．(1994)）葉をラクトフェノールブルーで染色し、ＮＩＭ１過発現系列における真菌生長の不存在を確認した。１００μＭＢＴＨ処置後の葉組織におけるＰＲ−１遺伝子発現はまた、野生型と比較して、ＮＩＭ１過発現系列ではより強く、迅速であった。従って、P.parasiticaに対するＰＲ−１遺伝子発現および抵抗性が示すように、免疫調節化植物は野生型植物より速く、より低用量のＢＴＨに対して応答し得る。このデータから、相乗的病害抵抗性は、ＢＴＨなどの全身性獲得抵抗性（syst emic acquired resistance）の化学的誘発物質を、ＮＩＭ１過発現植物などの免疫調節化（ＳＡＲ-オン）植物に塗布することにより得られることが証明された。従って、病害抵抗性を得るために、ＮＩＭ１過発現免疫調節化植物を、通常なら非効果的な低濃度のＳＡＲ誘発化学物質、例えばＢＴＨと組み合わせて使用することは、有利であり、当農業関係者にも明らかである。通常毒性、さもなければ望ましくない濃度のＳＡＲ誘発化学物質は、本明細書で証明された相乗性を利用することにより回避できる。さらに、一定レベルの植物防御をもたらすために要するＳＡＲ誘発化学物質の量を減らすことで、経済的利益も実現し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者モリナ・フェルナンデス，アントニオスペイン、エ―30540ブランカ、グラン・ビア18番 (72)発明者フリードリック，レスリー・ベサーズアメリカ合衆国27502ノースカロライナ州エイペックス、ワイクフォード・プレイス4208番

Claims

【特許請求の範囲】１．相乗的病害抵抗性により病原体攻撃から植物を防御する方法であって、下記段階： (ａ)第１レベルの病害抵抗性を持つ免疫調節化植物を提供し； (ｂ)該免疫調節化植物に第２レベルの病害抵抗性を与える少なくとも１種の殺菌剤を適用し； (ｃ)該殺菌剤を該免疫調節化植物に適用することにより、相乗的に増強された、第１および第２レベルの病害抵抗性の総和よりも大きい第３レベルの病害抵抗性を与えるを含んでなる、方法。２．該免疫調節化植物が、 (ａ)構成的免疫(cim)変異体植物； (ｂ)病変擬態変異体植物； (ｃ)植物中でのＳＡＲ遺伝子の組換え発現により得られるもの； (ｄ)植物にＳＡＲ誘導可能な化学物質を適用することにより得られるものである、請求項１に記載の方法。３．該cim変異体植物が下記段階： (ａ)病変擬態表現型を欠く正常表現型の非感染植物におけるＳＡＲ遺伝子の発現を評価し、 (ｂ)ウイルス、細菌、または真菌感染なしで、ＳＡＲ遺伝子を構成的に発現する非感染植物を選択するに従い、植物集団から選択される、請求項２に記載の方法。４．該病変擬態変異体植物が下記段階： (ａ)病変擬態表現型を持つ非感染植物におけるＳＡＲ遺伝子の発現を評価し、 (ｂ)ウイルス、細菌、または真菌感染なしで、ＳＡＲ遺伝子を構成的に発現する非感染植物を選択するに従い、植物集団から選択される、請求項３に記載の方法。５．該SＡＲ遺伝子が、全身性獲得抵抗性をもたらすシグナル伝達カスケードに関わるＮＩＭ１タンパク質をコードするＮＩＭ１遺伝子の機能的形態である、請求項２に記載の方法。６．該ＮＩＭ１タンパク質が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の方法。７．該ＮＩＭ１遺伝子が配列番号１に記載のコード配列からなる、請求項５に記載の方法。８．該ＳＡＲ遺伝子が、ＳＡＲシグナル伝達経路の優性ネガティブレギュレーターとして作用するＮＩＭ１タンパク質の変化形態をコードする、請求項３に記載の方法。９．該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号２の５５位および５９位に対応するアミノ酸位置でセリンの代わりにアラニンを持つ、請求項８に記載の方法。１０．該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号８に示したアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の方法。１１．該ＤＮＡ分子が配列番号７に示したヌクレオチド配列からなる、請求項９に記載の方法。１２．該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号２のアミノ酸位置１−１２５にほぼ対応するアミノ酸のＮ-末端トランケーションを持つ、請求項８に記載の方法。１３．該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる、請求項１３に記載の方法。１４．該ＤＮＡ分子が、配列番号９に示すヌクレオチド配列からなる、請求項１３に記載の方法。１５．該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号２のアミノ酸位置５２２ −５９３にほぼ対応するアミノ酸のＣ-末端トランケーションを持つ、請求項８に記載の方法。１６．該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号１２に示すのアミノ酸配列からなる、請求項１５に記載の方法。１７．該ＤＮＡ分子が配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなる、請求項１５に記載の方法。１８．該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号２のアミノ酸位置５２２ −５９３にほぼ対応するアミノ酸のＣ-末端トランケーションを持つ、請求項８に記載の方法。１９．該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなる、請求項１８に記載の方法。２０．該ＤＮＡ分子が配列番号１３に示すヌクレオチド配列からなる、請求項１８に記載の方法。２１．該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、実質的に配列番号２のアミノ酸位置１０３−３６２にほぼ対応するアンキリンモチーフからなる、請求項８に記載の方法。２２．該ＮＩＭ１タンパク質の変化形態が、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなる、請求項２１に記載の方法。２３．該ＤＮＡ分子が、配列番号１５に示すヌクレオチド配列からなる、請求項２１に記載の方法。２４．該ＤＮＡ分子が次の：１％ＢＳＡ；５２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．２；７％ラウリル硫酸ナトリウム塩；１ｍＭＥＤＴＡ；２５０ｍＭ塩化ナトリウム中、５５℃で、１８−２４時間ハイブリダイゼーションし、６×ＳＳＣで１５分間(×３)、３×ＳＳＣで１５分間(×１)、５５℃で洗浄する；という条件下、配列番号１、７、９、１１、１３または１５に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズする、請求項７、１１、１４、１７、２０および２３のいずれか１項に記載の方法。２５．該殺菌剤が下記の群から選択される殺真菌剤である、請求項１ないし２４のいずれかに記載の方法：４-[３-(４-クロロフェニル)-３-(３,４-ジメトキシフェニル)アクリロイル] モルホリン(“ジメトモルフ”)；５-メチル-１,２,４-トリアゾロ[３,４-ｂ][１,３]ベンゾチアゾール(“トリシクラゾール”)；３-アリルオキシ-１,２-ベンゾチアゾール-１,１-ジオキシド(“プロボナゾール”)； α-[２-(４-クロロフェニル)エチル]-α-(１,１-ジメチルエチル)-１Ｈ-１,２ ,４-トリアゾール-１-エタノール(“テブコナゾール”)；１-[[３-(２-クロロフェニル)-２-(４-フルオロフェニル)オキシラン-２-イル ]メチル]-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール(“エポキシコナゾール”)； α-(４-クロロフェニル)-α-(１-シクロプロピルエチル)-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール-１-エタノール(“シプロコナゾール”)；５-(４-クロロベンジル)-２,２-ジメチル-１-(１Ｈ-１,２,４-トリアゾル-１- イルメチル)-シクロペンタノール(“メトコナゾール”)；２-(２,４-ジクロロフェニル)-５-(１Ｈ-１,２,４-トリアゾル-１-イル)-プロピル-１,１,２,２-テトラフルオロエチル-エーテル(“テトラコナゾール”)；メチル-(Ｅ)-２-{２-[６-(２-シアノフェノキシ)ピリミジン-４-イルオキシ] フェニル}-３-メトキシアクリレート(“ＩＣＩＡ５５０４”、“アゾキシストロビゾ”)；メチル-(Ｅ)-２-メトキシイミノ-２-[α-(ｏ-トリルオキシ)-ｏ-トリル]アセテート(“ＢＡＳ４９０Ｆ”、“クレソキシムメチル”)；２-(２-フェノキシフェニル)-(Ｅ)-２-メトキシイミノ-Ｎ-メチルアセトアミド)； [２-(２,５-ジメチルフェノキシメチル)-フェニル]-(Ｅ)-２-メトキシイミノ- Ｎ-メチルアセトアミド)； (１Ｒ,３Ｓ/１Ｓ,３Ｒ)-２,２-ジクロロ-Ｎ-[(Ｒ)-１-(４-クロロフェニル)エチル]-１-エチル-３-メチルシクロプロパンカルボキサミド(“ＫＴＵ３６１６ ”)；マンガンエチレンビス(ジチオカルバメート)ポリマー亜鉛錯体(“マンゼブ”) ；１-[２-(２,４-ジクロロフェニル)-４-プロピル-１,３-ジオキソラン-２-イルメチル]-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール(“プロピコナゾール”)；１-{２-[２-クロロ-４-(４-クロロフェノキシ)フェニル]-４-メチル-１,３-ジオキソラン-２-イルメチル)-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール(“ジフェノコナゾール”)；１-[２-(２,４-ジクロロフェニル)ペンチル-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール(“ ペンピコナゾール”)；シス-４-[３-(４-tert-ブチルフェニル)-２-メチルプロピル]-２,６-ジメチルモルホリン(“フェンプロピモルフ”)；１-[３-(４-tert-ブチルフェニル)-２-メチルプロピル]-ピペリジン(“フェンプロピジン”)；４-シクロプロピル-６-メチル-Ｎ-フェニル-２-ピリミジンアミン(“シプロジニル”)； (ＲＳ)-Ｎ-(２,６-ジメチルフェニル-Ｎ-(メトキシアセチル)-アラニンメチルエステル(“メタラキシル”)； (Ｒ)-Ｎ-(２,６-ジメチルフェニル-Ｎ-(メトキシアセチル)-アラニンメチルエステル(“Ｒ-メタラキシル”)；１,２,５,６-テトラヒドロ-４Ｈ-ピロロ[３,２,１-ij]キノリン-４-オン(“ピロキロン”)；およびエチル水素ホスホネート(“ホセチル”)。２６．該殺真菌剤がメタラキシルである、請求項２５に記載の方法。２７．該ＳＡＲ誘導可能な化学が、ベンゾチアジアゾール化合物、イソニコチン酸化合物、またはサリチル酸化合物のいずれかである、請求項２ないし２６のいずれかに記載の方法。２８．該殺菌剤か、ベンゾチアジアゾール化合物、イソニコチン酸化合物、またはサリチル酸化合物である、請求項１ないし２６のいずれかに記載の方法。２９．２つの殺菌剤を同時に該免疫調節化植物に適用する、請求項１ないし２８のいずれかに記載の方法。３０．該殺菌剤の１つが下記の群：４-[３-(４-クロロフェニル)-３-(３,４-ジメトキシフェニル)アクリロイル] モルホリン(“ジメトモルフ”)；５-メチル-１,２,４-トリアゾロ[３,４-ｂ][１,３]ベンゾチアゾール(“トリシクラゾール”)；３-アリルオキシ-１,２-ベンゾチアゾール-１,１-ジオキシド(“プロボナゾール”)； α-[２-(４-クロロフェニル)エチル]-α-(１,１-ジメチルエチル)-１Ｈ-１,２ ,４-トリアゾール-１-エタノール(“テブコナゾール”)；１-[[３-(２-クロロフェニル)-２-(４-フルオロフェニル)オキシラン-２-イル ]メチル]-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール(“エポキシコナゾール”)； α-(４-クロロフェニル)-α-(１-シクロプロピルエチル)-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール-１-エタノール(“シプロコナゾール”)；５-(４-クロロベンジル)-２,２-ジメチル-１-(１Ｈ-１,２,４-トリアゾル-１- イルメチル)-シクロペンタノール(“メトコナゾール”)；２-(２,４-ジクロロフェニル)-３-(１Ｈ-１,２,４-トリアゾル-１-イル)-プロピル-１,１,２,２-テトラフルオロエチル-エーテル(“テトラコナゾール”)；メチル-(Ｅ)-２-{２-[６-(２-シアノフェノキシ)ピリミジン-４-イルオキシ] フェニル}-３-メトキシアクリレート(“ＩＣＩＡ５５０４”、“アゾキシストロビン”)；メチル-(Ｅ)-２-メトキシイミノ-２-[α-(ｏ-トリルオキシ)-ｏ-トリル]アセテート(“ＢＡＳ４９０Ｆ”、“クレソキシムメチル”)；２-(２-フェノキシフェニル)-(Ｅ)-２-メトキシイミノ-Ｎ-メチルアセトアミド）； [２-(２,５-ジメチルフェノキシメチル)-フェニル]-(Ｅ)-２-メトキシイミノ- Ｎ-メチルアセトアミド)； (１Ｒ,３Ｓ/１Ｓ,３Ｒ)-２,２-ジクロロ-Ｎ-[(Ｒ)-１-(４-クロロフェニル)エチル]-１-エチル-３-メチルシクロプロパンカルボキサミド(“ＫＴＵ３６１６ ”)；マンガンエチレンビス(ジチオカルバメート)ポリマー亜鉛錯体(“マンゼブ”) ；１-[２-(２,４-ジクロロフェニル)-４-プロピル-１,３-ジオキソラン-２-イルメチル]-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール(“プロピコナゾール”)；１-{２-[２-クロロ-４-(４-クロロフェノキシ)フェニル]-４-メチル-１,３-ジオキソラン-2-イルメチル)-２Ｈ-１,２,４-トリアゾール(“ジフェノコナゾール”)；１-[２-(２,４-ジクロロフェニル)ペンチル-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール(“ ペンピコナゾール”)；シス-４-[３-(４-tert-ブチルフェニル)-２-メチルプロピル]-２,６-ジメチルモルホリン(“フェンプロピモルフ”)；１-[３-(４-tert-ブチルフェニル)-２-メチルプロピル]-ピペリジン(“フェンプロピジン”)；４-シクロプロピル-６-メチル-Ｎ-フェニル-２-ピリミジンアミン(“シプロジニル”)； (ＲＳ)-Ｎ-(２,６-ジメチルフェニル-Ｎ-(メトキシアセチル)-アラニンメチルエステル(“メタラキシル”)； (Ｒ)-Ｎ-(２,６-ジメチルフェニル-Ｎ-(メトキシアセチル)-アラニンメチルエステル(“Ｒ-メタラキシル”)；１,２,５,６-テトラヒドロ-４Ｈ-ピロロ[３,２,１-ij]キノリン-４-オン(“ピロキロン”)；およびエチル水素ホスホネート(“ホセチル”)、から選択される殺真菌剤であり、もう１つの殺菌剤がベンゾチアジアゾール化合物、イソニコチン酸化合物、またはサリチル酸化合物のいずれかである、請求項２９に記載の方法。３１．殺真菌剤がメタラキシルであり、もう１つの殺菌剤がベンゾチアジアゾール化合物である、請求項３０に記載の方法。