JP2001508288A - 植物防御法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、常用の殺菌剤を免疫調節化植物に適用することによって、相乗的病害抵抗性により病原体攻撃から植物を防御する方法に関する。免疫調節化植物は、その中でSARが活性化されるため、“SAR-オン”植物と呼ばれる。免疫調節化植物は、少なくとも3種の、即ち、植物に、BTH、INAまたはSAなどのSARの化学的誘導物質を適用する;SAR遺伝子および/または病害抵抗性表現型の構成的発現に基づく選択的育種プログラムを介する;または、植物を、NIM1遺伝子の機能的形態などの1以上のSAR遺伝子で形質転換させるという、異なる方法で提供できる。殺菌剤を免疫調節化植物に同時に適用することにより、予想外にも病害抵抗性が相乗的に高められる。即ち、その病害抵抗性レベルは予想した追加レベルよりも大きい。
Description
【発明の詳細な説明】
植物防御法
本発明は、免疫調節化植物に殺菌剤を適用することによって得られた相乗的病
害抵抗性により病原体攻撃から植物を防御する方法に関する。
植物は、ウイルス、細菌、真菌および線虫を含む広範囲の病原生物体の攻撃に
絶えず曝されている。農産物植物は、遺伝的に均一の単一栽培物として育てられ
るので、特に攻撃されやすく、病気にかかると損害は非常に深刻である。しかし
ながら、殆どの植物は、病原生物体に対して植物自身の先天的な防御機構を持つ
。植物病原体に対する自然の多様な抵抗性は、植物育種家や病理学者によって同
定されており、多くの農産物植物内に組込まれている。これらの自然の病害抵抗
性遺伝子は、多くの場合、病原体に対して高レベルの抵抗性または免疫を提供す
るものである。
全身性獲得抵抗性(systemic acquired resistance)(SAR)は、植物が自身を
病原体から防御するのに使用する複雑なシステムの一要素である(Hunt and Ryal
s,Crit.Rev.in Plant Sci.15,583-606(1996),出典明示によりその全体を
本明細書の一部とする;Ryals et al.,Plant Cell 8,1809-1819(1996),出典
明示によりその全体を本明細書の一部とする)。米国特許第5,614,395号
、出典明示によりその全体を本明細書の一部とする、も参照。SARは、ウイル
ス、細菌および真菌を含む広範囲の感染要因に対する病原体-誘導性の全身性抵
抗性であるため、特に重要な植物-病原体応答の特徴である。SARシグナル伝
達経路がブロックされると、植物は、通常、病害を引き起こす病原体に対しては
一層感受性になり、更に普通なら病害を引き起こさないような感染要因に対して
も感受性になる(Gaffney et al.,Science 261,754-756(1993),出典明示によ
りその全体を本明細書の一部とする;Delaney et al.,Science 266,1247-1250
(1994),出典明示によりその全体を本明細書の一部とする;Delaney et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 92,6602-6606(1995),出典明示によりその全体を本
明細書の一部とする;Delaney,Plant Phys.113,5-12(1997),出典明示により
その全体を本明細書の一部とする;Bi et al.,Plant J.8,235-245(1995),出
典明示によりその全体を本明細書の一部とする;Mauch-Mani and
Slusarenko,Plant Cell 8,203-212(1996),出典明示によりその全体を本明細
書の一部とする)。これらの所見は、SARシグナル伝達経路が植物の健常状態
を維持するのに重要であることを示している。
概念的に、SAR応答は、2段階に分けることができる。初期段階では、病原
体感染が認められ、シグナルが放出されて、篩部により遠位組織へと伝えられる
。この全身性シグナルが標的細胞に知覚されると、標的細胞はSAR遺伝子およ
び病害抵抗性の両方を発現するという反応を示す。SARの維持段階は、数週か
ら植物の寿命全体までの期間で表し、その間、植物は準定常状態にあって、病害
抵抗性を維持している(Ryals et al.,1996)。
SARシグナル伝達にはサリチル酸(SA)の蓄積が必要であるらしい。特異的
にSAを分解する、特定の阻害剤での処置や、フェニルアラニンアンモニア-リ
アーゼの後成的抑制、またはサリチル酸ヒドロキシラーゼのトランスジェニック
発現によりSAを蓄積できない植物は、SAR遺伝子発現または病害抵抗性も誘
導できない(Gaffney et al.,1993;Delaney et al.,1994;Mauch-Mani and Slus
arenko 1996;Maher et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,7802-7806(1994)
,出典明示によりその全体を本明細書の一部とする;Pallas et al.,Plant J.
10,281-293(1996),出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。SAは
全身性シグナルとして働くこともあると言われてきたが、このことは現在論争中
であり、これまでで確かになったのは、SAが蓄積できないならばSARシグナ
ル伝達はブロックされるということだけである(Pallas et al.,1996;Shulaev e
t al.,Plant Cell 7,1691-1701(1995),出典明示によりその全体を本明細書の
一部とする;Vernooij et al.,Plant Cell 6,959-965(1994),出典明示により
その全体を本明細書の一部とする)。
最近、シロイヌナズナ(Alabidopsis)がSAR研究用のモデル系として浮上し
てきた(Uknes et al.,Plant Cell 4,645-656(1992),出典明示によりその全体
を本明細書の一部とする;Uknes et al.,Mol.Plant-Microbe Interact.6,69
2-698(1993),出典明示によりその全体を本明細書の一部とする;Cameron et al
.,Plant J.5,715-725(1994),出典明示によりその全体を本明細書の一部とす
る;Mauch-Mani and Slusarenko,Mo.Plant-Microbe Interact.7,378-
383(1994),出典明示によりその全体を本明細書の一部とする;Dempsey and Kle
ssig,Bulletin de L'Institut Pasteur 93,167-186(1995),出典明示によりそ
の全体を本明細書の一部とする)。SARはシロイヌナズナにおいて、病原体お
よび化学薬品、例えば、SA、2,6-ジクロロイソニコチン酸(INA)およびベ
ンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル(BTH)の
両方により活性化され得ることが明らかになっている(Uknes et al.,1992;Vern
ooij et al.,Mol.Plant-Microbe Interact.8,228-234(1995),出典明示によ
りその全体を本明細書の一部とする;Lawton et al.,Plant J.10,71-82(1996
),出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。INAまたはBTHでの
処置または病原体感染の後、少なくとも3種の病原関連(PR)タンパク質遺伝子
、即ち、PR-1、PR-2およびPR-5が抵抗性の出現に付随して同等に誘導
される(Uknes et al.,1992,1993)。最も詳しく特性化されているタバコでは、
病原体または免疫化合物で処置すると、少なくとも9組の遺伝子の発現が誘導さ
れる(Ward et al.,Plant Cell 3,1085-1094(1991),出典明示によりその全体
を本明細書の一部とする)。病害抵抗性のトランスジェニック植物は、植物を様
々なSAR遺伝子で形質転換させることにより作られる(米国特許第5,614,
395号)。
SARシグナル伝達を改変した多数のシロイヌナズナ変異体が単離されている
(Delaney,1997)。これらの変異体の第1番目は、いわゆるlsd(病変擬態病lesio
ns simulating disease)変異体およびacd2(加速細胞死accelerated cell death
)である(Dietrich et al.,Cell 77,565-577(1994),出典明示によりその全体
を本明細書の一部とする;Greenberg et al.,Cell 77,551-563(1994),出典明
示によりその全体を本明細書の一部とする)。これらの変異体は全て、その葉上
にある程度の自発的壊死病変が形成され、高レベルのSA、SAR遺伝子用のm
RNA蓄積、および顕著に高い病害抵抗性を持つ。少なくとも7種の異なるlsd
変異体が単離され、特性化されている(Dietrich et al.,1994;Weymann et al.
,Plant Cell 7,2013-2022(1995),出典明示によりその全体を本明細書の一部
とする)。その他の対象となる変異体クラスは、cim(構成的免疫constitutive im
munity)変異体である(Lawton et al.,“The molecular
biology of systemic aquired resistance”in Mechanisms of Defence Respons
es in Plants,B.Fritig and M.Legrand,eds(Dordrecht,The Netherlands:K
luwer Academic Publishers),pp.422-432(1993),出典明示によりその全体を
本明細書の一部とする)。出典明示によりその全体を本明細書の一部とした国際
PCT出願WO94/16077も参照。lsd変異体やacd2同様、cim変異体は、
高いSAおよびSAR遺伝子発現および抵抗性を持つが、lsdまたはacd2とは反
対に、その葉に検出可能な病変が現れない。cpr1(PR遺伝子の構成的発現体co
nstitutive expresser of PR genes)は、cim変異体の1種であると言えるが、cp
r1の葉上に微視的病変が存在することは無視できないので、cpr1はlsd変異体
の1種であるかもしれない(Bowling et al.,Plant Cell 6,1845-1857(1994),
出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)。
SARシグナル形成においてブロックされる変異体も単離されている。ndr1(
非-種特異的病害抵抗性non-race-specific disease resistance)は、様々な非毒
性遺伝子を含有するPseudomonas syrjngaeと普通は非毒性のPeronospora parasi
tica単離物の両方を増殖させる変異体である(Century et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 92,6597-6601(1995),出典明示によりその全体を本明細書の一部
とする)。明らかに、この変異体は、SARシグナル形成において早期にブロッ
クされる。npr1(PR遺伝子の非発現体nonexpresser of PR genes)は、INA
処置後にSARシグナル形成経路の発現を誘導できない変異体である(Cae et al
.,Plant Cell 6,1583-1592(1994),出典明示によりその全体を本明細書の一部
とする)。eds(高い病害感受性enhanced disease susceptibflity)変異体は、低
濃度細菌植菌後の細菌感染を持続させるその能力に基づき単離されている(Glaze
brook et al.,Genetics 143,973-982(1996),出典明示によりその全体を本明
細書の一部とする;Parker et al.,Plant Cell 8,2033-2046(1996),出典明示
によりその全体を本明細書の一部とする)。ある種のeds変異体は表現型がnpr1
と非常に類似しており、また最近、eds5およびeds53はnpr1の対立遺伝子で
あることが示された(Glazebrook et al.,1996)。nim1(非誘導性免疫noninduci
ble immunity)は、INA処置後のP.parasitica(即ち、露菌病の原因となるも
の)増殖を持続させる変異体である(Delaney et al.,1995;
WO94/16077)。nim1は、病原体感染後にSAを蓄積できるが、SAR遺伝子発現
または病害抵抗性を誘導することはできず、これは、この変異がSAの下流にあ
る経路をブロックすることを示唆している。nim1は、INAまたはBTHに応
答する能力も損ねており、これは、ブロックがこれらの化学薬品作用の下流にあ
ることを示唆している(Delaney et al.,1995;Lawton et al.,1996)。
近年、2つのシロイヌナズナ対立遺伝子が単離および特性化されており、その
変異体は、それぞれnim1およびnpr1表現型を担う(Ryals et al.,Plant Cell
9,425-439(1997),出典明示によりその全体を本明細書の一部とする;Cao et a
l.,Cell 88,57-63(1997),出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)
。野生型NIM1遺伝子産物は、シロイヌナズナにおいてSARと遺伝子毎の(g
ene-for-gene)病害抵抗性の両方を導くシグナル伝達カスケードに関与している(
Ryals et al.,1997)。Ryals et al.,1997は、化学的に誘導されたPR−1遺
伝子発現および真菌抵抗性が少し損なわれたものから非常に強力にブロックされ
たものまでのある範囲の表現型を示すnim1の更に5つの対立遺伝子の単離につ
いても報告している。野生型NPR1遺伝子をnpr1変異体内に形質転換すると
、その変異が補足されてPR-遺伝子発現や病害抵抗性に関するSAR誘発の応
答性が回復しただけでなく、そのトランスジェニック植物はまたSAR誘発の不
在下でもP.syringa感染に対して一層抵抗性になった(Cao et al.,1997)。
NF-κB/IκBシグナル伝達経路は、キイロショウジョウバエから哺乳動物
までのある範囲の生物体における病害抵抗性応答に関係している。哺乳動物では
、細胞をリポ多糖類、腫瘍壊死因子、インターロイキン1(IL-1)またはヴイ
ルス感染に曝すなど、多種の刺激によってNF-κB/IκBシグナル伝達を誘導
することができる(Baeuerle and Baltimore,Cell 87,13-20(1996);Baldwin,A
nnu.Rev.Immunol.14,649-681(1996))。経路が活性化されると、炎症および
免疫応答に関与する多数の因子、例えば、IL-2、IL-6、IL-8および顆
粒球/マクロファージコロニー刺激因子が合成される(deMartin et al.,Gene 15
2,253-255(1995))。トランスジェニックマウス研究では、NF-κB/IκBシ
グナル伝達のノックアウトは、細菌およびウイルス病原体に対する感受性の増強
などの不完全な免疫応答をもたらす(Beg and Baltimore,Science 274,782-
784(1996);Van Antwerp et al.,Science 274,787-789(1996);Wang et al.,
Science 274,784-787(1996);Baeuerle and Baltimore(1996))。シロイヌナズ
ナでは、正常な抵抗性プロセスがSAR活性化後に強化されて高い病害抵抗性を
もたらす点で、SARは炎症と類似している(Bi et al.,1995;Cao et al.,199
4;Delaney et al.,1995;Delaney et al.,1994;Gaffney et al.,1993;Mauch-M
ani and Slusarenko 1996;Delaney,1997)。更に、この経路の不活性化は、細菌
、ウイルスおよび真菌病原体に対する感受性の増強をもたらす。興味深いことに
、哺乳動物細胞においてSAはNF-κB活性化をブロックする(Kopp and Ghosh
,Science 265,956-959(1994))一方で、シロイヌナズナにおいてはSAはシグ
ナル伝達を活性化することが報告されている。キイロショウジョウバエの細菌感
染は、シグナル伝達カスケードを活性化し、セルクロピンB、デフェンシン、ジ
プテルシンおよびドロソマイシンなどの多数の抗真菌タンパク質の合成をもたら
す(Ip et al.,Cell 75,753-763(1993);Lemaitre et al.,Cell 86,973-983(1
996))。この誘導は、2種のNF-κB相同体であるdorsalおよびdifの遺伝子産
物に左右されるものであり、ハエのIκB相同体であるcactusに代表される。抗
真菌および抗菌タンパク質の合成を低減させる変異体は、感染に対する抵抗性を
劇的に弱めた。
多くの研究や、植物の遺伝子形質転換を含む高性能で集中的な農産物防御法の
使用にもかかわらず、病害による損失は依然として毎年数10億ドルある。その
ため、植物病害抵抗性の遺伝子ベースの逓増的理解に基づく新規の農産物防御法
の開発に対しては継続的な需要がある。
上記を考慮して、本発明の好ましい態様は、免疫調節化植物に殺菌剤を適用す
ることによって得られた相乗的病害抵抗性により、植物を病原体攻撃から防御す
る新規の方法に関する。免疫調節化植物は、SARを活性化し、典型的には、野
生型以上のSAR遺伝子発現を示すようなものであるので、“SAR-オン”植
物と呼ぶ。本発明の方法に使用する免疫調節化植物には、少なくとも3種の:植
物にBTH、INAまたはSAなどのSAR化学誘導物質を適用する;植物をS
AR遺伝子および/または病害抵抗性表現型の構成的発現に基づいて選択する、
選択的育種により;または機能的形態のNIM1遺伝子などの1以上のSAR遺
伝子で形質転換させることにより植物体を遺伝子操作する、という方法で得るこ
とができる。免疫調節化植物に適用する殺菌剤は、常用の殺菌剤、例えば、殺真
菌剤メタラキシルや、選択的育種または遺伝子操作により得られた免疫調節化植
物に適用するならば、SARの化学誘導物質であるBTH、INAまたはSAな
どの殺菌剤のいずれでもよい。
免疫調節は植物にあるレベルの病害抵抗性を与える。同様に、殺菌剤の適用も
植物にあるレベルの病害抵抗性を与える。免疫調節と殺菌剤塗布を併用すれば、
その結果、病害抵抗性を与える個々の方法により提供される制御レベルを加算し
たレベルの制御がもたらされると予想される。しかしながら、免疫調節化植物に
殺菌剤を同時に適用すると、病害抵抗性は、予想外にも相乗的に高められ、即ち
、病害抵抗性レベルは予想した加算レベルの病害抵抗性よりも大きかった。
従って、本発明は、免疫調節化植物の栽培と、それに対する適量の常用殺菌剤
の適用に関する。特に好ましい本発明の実施態様は、NIM1遺伝子またはその
相同体または変種の機能的形態を含有し、かつ発現するように遺伝子操作した植
物に関する。
本発明の方法は、免疫調節または殺菌剤塗布のいずれか単独で達成されるより
も大きな病原体制御をもたらす。免疫調節は植物にあるレベルの病害抵抗性を与
える。同様に、殺菌剤の適用は植物にあるレベルの病害抵抗性を与える。免疫調
節と殺菌剤塗布を併用すれば、その結果、病害抵抗性を与える個々の方法により
提供される制御レベルを加算したレベルの制御がもたらされると予想される。し
かしながら、免疫調節化植物に殺菌剤を同時適用すると、病原性病害の制御は予
想外にも相乗的に高められ、即ち、病害制御レベルは予想した加算レベルの病害
抵抗性よりも大きかった。
より大きい病害抵抗性のほかに、本発明の別の利点は、本発明の方法により提
供される病害抵抗性レベルを達成するのに必要な殺菌剤の量が、通常の野生型植
物に使用するのに必要な量よりも少ないという点である。この結果、殺菌剤の経
済費用は低下し、またある種の殺菌剤の毒性に起因する有害環境の発生機会も低
くなる。更に、免疫調節と殺菌剤塗布の効果を組合せることにより植物を防御す
る発明的方法により、抗病原性作用の持続時間が長くなり、全体的に農産物収穫
量が高くなる。本方法のその他の利点は、病原体制御作用の2つの併用様式が互
いに全く異なるため、抵抗性が生じる恐れを効果的に防ぐという点である。
このように、本発明は、相乗的病害抵抗性により病原体攻撃から植物を防御す
る方法であって、下記段階:
(a)第1レベルの病害抵抗性を持つ免疫調節化植物を提供し;
(b)該免疫調節化植物に第2レベルの病害抵抗性を与える少なくとも1種の殺
菌剤を適用し;
(c)該殺菌剤を該免疫調節化植物に適用することにより、相乗的に増強された
、第1および第2レベルの病害抵抗性の総和よりも大きい第3レベルの病害抵抗
性を与える、
を含む方法に関する。
好ましいのは、該免疫調節化植物が構成的免疫(cim)変異体植物である本発明
の方法である。
特に好ましいのは、該cim変異体植物が下記段階:
(a)病変擬態表現型を欠く正常表現型の非感染植物におけるSAR遺伝子の発
現を評価し、
(b)ウイルス、細菌、または真菌感染なしで、SAR遺伝子を構成的に発現す
る非感染植物を選択する
に従い、植物集団から選択される、本発明の方法である。
また、該免疫調節化植物が病変擬態変異体植物である本発明の方法も好ましい
。
特に好ましいのは、該病変擬態変異体植物が下記段階:
(a)病変擬態表現型を持つ非感染植物におけるSAR遺伝子の発現を評価し、
(b)ウイルス、細菌、または真菌感染なしで、SAR遺伝子を構成的に発現す
る非感染植物を選択する
に従い、植物集団から選択される、本発明の方法である。
また、該免疫調節化植物が植物中でのSAR遺伝子の組換え発現により得られ
るものである本発明の方法も好ましい。
特に好ましいのは、該SAR遺伝子がNIM1遺伝子の機能的形態である、本
発明の方法である。
より好ましいのは、該NIM1遺伝子が全身性獲得抵抗性をもたらすシグナル
伝達カスケードに関わるNIM1タンパク質をコードする、本発明の方法である
。
とりわけ好ましいのは、該NIM1タンパク質が配列番号2に記載のアミノ酸
配列からなる、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該NIM1遺伝子が下記の条件で配列番号1に記載の
コード配列とハイブリダイズする、本発明の方法である:1%BSA;520m
M NaPO4、pH7.2;7%ラウリル硫酸ナトリウム塩;1mM EDTA;
250mM塩化ナトリウム中、55℃で、18−24時間ハイブリダイゼーショ
ンし、6×SSCで15分間(×3)、3×SSCで15分間(×1)、55℃で洗
浄する。
とりわけ好ましいのは、該NIM1遺伝子が配列番号1に記載のコード配列と
、穏やかなストリンジェント条件でそのコード配列とハイブリダイズする全ての
DNA分子を含む、本発明の方法である。特に好ましいのは、該SAR遺伝子が
、SARシグナル伝達経路の優性ネガティブレギュレーターとして作用するNI
M1タンパク質の変化形態をコードする、本発明の方法である。
より好ましいのは、該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号2の55位
および59位に対応するアミノ酸位置でセリンの代わりにアラニンを持つ、本発
明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号8に示
したアミノ酸配列からなる、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該DNA分子が配列番号7に示したヌクレオチド配列
と、穏やかなストリンジェント条件でそのヌクレオチド配列とハイブリダイズす
る全てのDNA分子からなる、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該DNA分子が、下記の条件で配列番号7に記載のヌ
クレオチド配列にハイブリダイズする、本発明の方法である:1%BSA;52
0mM NaPO4、pH7.2;7%ラウリル硫酸ナトリウム塩;1mM EDT
A;250mM塩化ナトリウム中、55℃で、18−24時間ハイブリダイゼー
ションし、6×SSCで15分間(×3)、3×SSCで15分間(×1)、55℃
で洗浄する。
より好ましくは、該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号2のアミノ酸
位置1−125にほぼ対応するアミノ酸のN-末端トランケーションを持つ、本
発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号10に
示すアミノ酸配列からなる、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該DNA分子が、配列番号9に示すヌクレオチド配列
と、穏やかなストリンジェント条件でそのヌクレオチド配列とハイブリダイズす
る全てのDNA分子からなる、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該DNA分子が、下記の条件で配列番号9に記載のヌ
クレオチド配列にハイブリダイズする、本発明の方法である:1%BSA;52
0mM NaPO4、pH7.2;7%ラウリル硫酸ナトリウム塩;1mM EDT
A;250mM塩化ナトリウム中、55℃で、18−24時間ハイブリダイゼー
ションし、6×SSCで15分間(×3)、3×SSCで15分間(×1)、55℃
で洗浄する。
とりわけ好ましいのは、該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号2のア
ミノ酸位置522−593にほぼ対応するアミノ酸のC-末端トランケーション
を持つ、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号12に
示すのアミノ酸配列からなる、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該DNA分子が、配列番号11に示すヌクレオチド配
列と、穏やかなストリンジェント条件でそのヌクレオチド配列とハイブリダイズ
する全てのDNA分子からなる、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該DNA分子が、下記の条件で配列番号11に記載の
ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、本発明の方法である:1%BSA;5
20mM NaPO4、pH7.2;7%ラウリル硫酸ナトリウム塩;1mM ED
TA;250mM塩化ナトリウム中、55℃で、18−24時間ハイブリダイゼ
ーションし、6×SSCで15分間(×3)、3×SSCで15分間(×1)、55
℃で洗浄する。
より好ましくは、該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号2のアミノ酸
位置1−125にほぼ対応するアミノ酸のN-末端トランケーションと、配列番
号2のアミノ酸位置522−593にほぼ対応するアミノ酸のC-末端トランケ
ーションを持つ、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号14に
示すアミノ酸配列からなる、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該DNA分子が、配列番号13に示すヌクレオチド配
列と、穏やかなストリンジェント条件でそのヌクレオチド配列とハイブリダイズ
する全てのDNA分子からなる、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該DNA分子が下記の条件で配列番号13に示すヌク
レオチド配列にハイブリダイズする、本発明の方法である:1%BSA;520
mM NaPO4、pH7.2;7%ラウリル硫酸ナトリウム塩;1mM EDTA
;250mM塩化ナトリウム中、55℃で、18−24時間ハイブリダイゼーシ
ョンし、6×SSCで15分間(×3)、3×SSCで15分間(×1)、55℃で
洗浄する。
より好ましくは、該NIM1タンパク質の変化形態が、実質的に配列番号2の
アミノ酸位置103−362にほぼ対応するアンキリンモチーフからなる、本発
明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号16に
示すアミノ酸配列からなる、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該DNA分子が、配列番号15に示すヌクレオチド配
列と、穏やかなストリンジェント条件でそのヌクレオチド配列とハイブリダイズ
する全てのDNA分子からなる、本発明の方法である。
とりわけ好ましいのは、該DNA分子が下記の条件で配列番号15に記載のヌ
クレオチド配列にハイブリダイズする、本発明の方法である:1%BSA;52
0mM NaPO4、pH7.2;7%ラウリル硫酸ナトリウム塩;1mM EDT
A;250mM塩化ナトリウム中、55℃で、18−24時間ハイブリダイゼー
ションし、6×SSCで15分間(×3)、3×SSCで15分間(×1)、55℃
で洗浄する。
本明細書に開示した適応範囲の標的農産物の例には、これらに限定されないが
、
下記の植物種を含む:穀類(トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラ
スムギ、イネ、モロコシ属および関連農産物);ビート(砂糖ダイコンおよび飼料
用ビート);ナシ状果、石果および小果樹(リンゴ、西洋ナシ、プラム、モモ、ア
ーモンド、サクランボ、イチゴ、ラズベリーおよびブラックベリー);マメ科植
物(インゲンマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、ダイズ);油科植物(ナタネ、マス
タード、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマシ油植物、カカオ豆、ア
メリカホドイモ);キュウリ植物(大粒インゲンマメ、キュウリ、メロン);繊維
植物(綿、亜麻、麻、ジュート);カンキツ果物(オレンジ、レモン、グレープフ
ルーツ、マンダリン);野菜(ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ、
ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガイモ、パプリカ);クスノキ科(アボカド、
シナモン、樟脳);またはタバコ、ナッツ、コーヒー、サトウキビ、茶、ブドウ
、ホップ、バナナおよび天然ゴム植物、並びに、観賞植物(草花、低木、広葉樹
および針葉樹などの常緑樹)。このリストは、なんら限定を表すものではない。
本発明の方法を用いて、広範囲の植物病原体に対して抵抗性を与えることがで
き、それらの病原体には、下記のものがあるが、これらに限定されない:ウイル
スまたはウイルイド、例えば、タバコまたはキュウリモザイクウイルス、輪紋ウ
イルスまたは壊疽ウイルス、ペラルゴニューム葉巻ウイルス、ムラサキツメクサ
斑紋ウイルス、トマト低木楼化ウイルスおよび同様のウイルス類;子嚢菌、例え
ば、Venturia、Podosphaera、Erysiphe、Monolinia、Mycosphaerella、およびUn
cinula属;担子菌、例えば、Hemileia、RhizoctoniaおよびPuccinia属由来もの
;不完全な真菌、例えば、Botrytis、Helminthosposrium、Rhynchosporium、Fus
arium(即ち、F.monoliforme)、Septoria、Cercospora、Alternaria、Pyricular
ia、Pseudocercosporella(即ち、P.herpotrichoides)属;卵菌類の真菌、例え
ば、Phytophthora(即ち、P.parasitica)、Peronospora(即ち、P.tabacina)、Br
emia、PythiumおよびPlasmopara;並びに、他の真菌、例えば、Scleropthora ma
crospora、Sclerophthora rayissiae、Sclerospora graminicola、Peronosclero
spora sorghi、Peronosclerospora philippinensis、Peronosclerospora saccha
ri、Peronosclerospora maydis、Physopella zeae、Cercospora zeae-maydis、C
olletotrichum graminicola、Gibberella zeae、
Exserohilm turcicum、Kabatiellu zeaeおよびBipolaris maydis;細菌、例えば
、Pseudomonas syringae、Pseudomonas tabaciおよびErwinia stewartii;アリ
マキなどの昆虫、例えば、Myzus persicae;および鱗翅目の昆虫、例えばHeliot
hus種;および線虫、例えばMeloidogyne incognita。
免疫調節化植物の入手
免疫調節化植物を入手するための下記の一般的な方法である3種全ては、Ryal
s et al.,(1996)に記載のSARシグナル伝達経路モデルに全て適合するので、
関連がある。病害抵抗性を得るためにSARシグナル伝達経路を活性化する際、
3種類の経路のどれを採用しても、同じセットのSAR遺伝子が“オン”に変わ
り、下記病害抵抗性成果が得られる。この3種類の経路の違いは、経路中のどの
点でSARがオンに変わるかという点のみに関係しており、最終成果はこれら3
種類の経路間で同じである。そのため、1経路を経て得られた免疫調節化植物に
関して観察された分析および成果を推定の基礎として、別の経路を経て得られた
免疫調節化植物にも当てはまる。
A.全身性獲得抵抗性の化学的誘発物質の塗布
免疫調節化植物を入手するための第1の経路は、SARを誘発する能力のある
化学品を植物に塗布することを伴う。特に強力なSARの化学誘発物質は、ベン
ゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル(BTH)など
のベンゾチアジアゾールである。レギュレーターとしてさらに使用されるベンゾ
チアジアゾールの誘導体は、米国特許第5,523,311および5,614,395に記述されて
おり、これらは出典明示により本明細書に組込まれている。様々な農作物におい
て、広い範囲の病害に対し、現場で防御を与えるBTH-誘発SARは、Freidri
ch et al.,Plant Journal 10(1),61-70(1996)、Lawton et al.,Plant Journa
l 10(1),71-82(1996)およびGorlach et al.,Plant Cell 8,629-643(1996)に
、詳細に記載されており、これらは出典明示により本明細書に組込まれている。
本発明の方法用に、免疫調節化植物を入手するために使用できる他のSAR化学
誘発物質は、2,6-ジクロロイソニコチン酸(INA)およびその低
級アルキルエステルなどのイソニコチン酸化合物を含み、サリチル酸化合物(S
A)も同様である。適当なINAおよびSA化合物の例は、米国特許第5,614,395
に叙述されている。
B.構成的免疫(CIM)変異体植物の育種
免疫調節化植物を入手する第2の経路は、SAR遺伝子の構成的発現および/
または病害抵抗性表現型に基づいた選択的育種プログラムである。多くのデータ
が、SAR遺伝子の発現と、全身性獲得抵抗性自身との間の密着した相互関係を
示している(Ward et al.(1991)、Uknes et al.(1992)、Uknes et al.(1993)、La
wton,et al.(1993)およびAlexander et al(1993)PNAS USA 90,7327-7331、参照
文献)。シロイヌナズナでは、十分に特徴化されたSAR遺伝子の例はPR-1、
PR-2およびPR-5であり、PR-1は最小のバックグラウンドで最も高レベ
ルで発現される。
SAR遺伝子を構成的に発現する植物を同定および選出するために、SAR遺
伝子の発現を検出するノーザン分析を行う。Uknes et al.(1992)で叙述されてい
るように、知られたSAR DNA配列をクロスハイブリダイゼーション実験に
利用することができる。核酸配列のハイブリダイゼーションおよびクローニング
の方法は当業者によく知られている(例えばMolecular Cloning,A Laboratory M
anual,2nd Edition,Vol.1-3,Sambrook et al.(eds.)Cold Spring Harbor La
boratory Press(1989)およびその中に引用されている文献参照)。構成的にSA
R遺伝子を発現するSARシグナル伝達変異体の少なくとも2種類が単離されて
いる。第1の種類は、“lsd”変異体(lsd=病変擬似病(lesion simulating dis
ease))として呼ばれており、“I型cim”変異体とも言われる。WO94/16077参
照。、lsd(I型cim)変異体は、葉上に自発的病変を形成し、高濃度のSA、
高レベルのPR-1、PR-2およびPR-5mRNAを蓄積し、真菌および細菌
性病原体に対して抵抗性である(Dietrich et al.,1994、Weymann et al.,1995
)。第2の種類は“cim”(cim=構成的免疫:constitutive immunity)変異体とし
て呼ばれており、“II型cim”変異体とも言われている。WO94/16077参照。c
im変異体は、自発的病変を除くlsd変異体の特徴全てを持つ。つまり、
cim変異体は、見たところ表現型的には正常である。
一旦、SAR遺伝子を構成的に発現する植物個体を選出すれば、それらを育種
プログラムに利用してSAR遺伝子の構成的発現および病原体の抵抗性を植物系
列に組み込むことができる。さらに交雑するための子孫個体は、植物育種の業者
によく知られている手法で、SAR遺伝子の発現および病害抵抗性、ならびに生
産と品質に重要な別の特徴に基づいて選択される。例えば、lsd変異体は病変
形成および壊死を示すので、正常な表現型のcim変異体は、育種プログラムお
よび本発明の方法用に好ましいが、所望ならばlsd変異体を使用してもよい。
C.SAR遺伝子による植物の形質転換
免疫調節化植物を入手するための第3の経路は、SAR遺伝子、好ましくはN
IM1遺伝子の機能形態で植物形質転換するものである。
1.野生型NIM1遺伝子の組換え発現
NIM1の野生型(配列番号:1)の組換え過発現は、病害抵抗性表現型をもつ
トランスジェニック植物をもたらす。出典明示により本明細書に組込まれている
、同時-係属中米国特許出願番号08/880,179参照。活性NIM1タンパク質のレ
ベル増加により、BTH、INAおよびSAなどの誘発性化学品による化学的誘
発と同じ病害抵抗性効果が生じる。好ましくは、NIM1遺伝子の発現は、野生
型植物中のNIM1遺伝子の発現レベルの少なくとも2倍を上回るレベルであり
、さらに好ましくは、野生型発現レベルの少なくとも10倍を上回るレベルであ
る。“組換えDNA技術”と題されるより下記の項は、野生型レベルより高いレ
ベルでトランスジェニック植物において、野生型NIM1遺伝子を組換え的に発
現させるのに使用できるプロトコルについて述べている。あるいは、Cao,et al.
(1997)に叙述されているように、病症抵抗性植物を生産するために、植物を野生
型NPR1遺伝子によって形質転換させることもできる。
2.NIM1遺伝子の変化形態の組換え発現
本発明の方法で使用する免疫調節化植物は、NIM1遺伝子の変化形態の組
換え発現によりつくることができ、それは、植物中のSAR経路は、機能相同体
を哺乳類のやハエのNFκB/lκB調節機構と機能的相似性を示すという認識と、N
IM1遺伝子産物は、哺乳類シグナル伝達因子lκBサブクラスαの構造相同体で
あるという発見の両方を活用してNIM1遺伝子を変化させることによる。出典
明示により本明細書に組込まれている、同時-係属中PCT出願“METHODS OF US
ING THE NIM1 GENE TO CONFER DISEASE RESISTANCE IN PLANTS”参照。
NIM1遺伝子の配列(配列番号:1)はBLAST探索に使用され、NIM1
遺伝子の配列中でかなり高度に保存された1ドメインの、スペクトリン、アンキ
リン、NF-κBおよびlκBなどのたくさんのタンパク質でみられるアンキリン
ドメインに対する相同性に基づいてマッチが同定された(Michael and Bennett,
Trends Cell Biol.2,127-129(1992))。NIM1タンパク質(配列番号:2)と7
0の知られているアンキリン含有タンパク質の2つ1組目視観察を実施すると、
転写レギュレーターのlκBαクラスのメンバーとの著しい類似性が見られた(Ba
euerle and Baltimore 1996;Baldwin 1996)。図1で示すとおり、NIM1タン
パク質(配列番号:2)は、マウス、ラットおよびブタのlκBαタンパク質(それ
ぞれの配列番号:3,4および5)と、重要な相同性を共有している。NIM1は
、タンパク質全長中のいたるところに、アンキリンドメイン(図1中で破線で示
す)、2アミノ末端セリン(NIM1のアミノ酸55および59)、一対のリジン(
NIM1のアミノ酸99および100)および酸性C末端を含む、lκBαのいく
つかの重要な構造ドメインを含む。全体的に、NIM1およびlκBαは、その
残基の30%の同一性および残基の50%の保存性置換を共有する。このように
、このタンパク質を通して、lκBαとNIM1の間には、相同性があり全体の
類似性は80%である。
シグナル伝達においてlκBαタンパク質が機能する1つの方法は、シトソル
転写因子NF-κBに結合し、それが核へ侵入して標的遺伝子の転写を変更するの
阻止することによる(Baeuerle and Baltimore,1996;Baldwin,1996)。NF-κB
の標的遺伝子は、抗ウイルス性、抗菌性または細胞死反応を含む、いくつかの細
胞プロセスを調節(活性化または阻害)する(Baeuerle and Baltimore,1996)。シ
グナル伝達経路が活性化されると、lκBαは二つのセリン残基(マウスlκB
αのアミノ酸32および36)をリン酸化される。これは2重リジン(マウスlκ
Bαの21および22のアミノ酸)でのユビキチン化をプログラム化するものであ
る。ユビキチン化後、NF-κB/lκB複合体は、lκBαが分解し、NF-κBが
核に放出されるというプロテオソームを経て行く。
lκBα機能中で重要なリン酸化セリン残基は、NIM1においてアミノ酸3
5から84の保存配列の大きなブロックに保存される(図1)。lκBαでは、2
重リジンが、このタンパク質のN末端方向にある約15アミノ酸に位置するのと
は対照的に、NIM1では、2重リジンはC末端方向にある約40アミノ酸に位
置する。さらに、高度の相同性が、基礎代謝回転速度において重要と示されてい
るセリン/トレオニン豊富カルボキシ末端領域中のNIM1とlκBαの間に存在
する(Sun et al.,Mol.Cell.Biol.16,1058-1065(1996))。本発明によると、
構造的相同性の分析およびlκBαの機能として重要であると知られている成分
の存在に基づき、NIM1はlκBαに似た機能であり、植物遺伝子レギュレー
ション調節において類似の効果を持つことが予想される。
を取り扱う野生型NIM1遺伝子を含む植物は、化学的誘導物質で処置すると
、より多くのNIM1遺伝子産物(lκB相同体)を持つか、またはNIM1遺伝
子産物(lκB相同体)のリン酸化がより少ないのではないかと予想される。本モ
デルによれば、植物NF-κB相同体は核から締め出され、SAR遺伝子発現およ
び抵抗性反応が起こる結果となる。nim1変異体植物中には、非機能性NIM
1遺伝子産物が存在する。それゆえ、本モデルによれば、NF-κB相同体は自由
に核へ行き、抵抗性およびSAR遺伝子発現を抑制する。
本発案と一致して、サリチル酸で処置した動物細胞では、その核内でのlκB
の安定性/発生量の増加および活性NF-κBの減少がみられる(Kopp and Ghosh,
1994)。lκBの変異は、スーパーレプレッサーまたは優性ネガティブとして働く
ことが知られている(Britta-Mareen Traenckner et al.,ENBO 14:2876-2883(19
95)、Brown et al.,Science 237:1485-1488(1996)、Molecular and Cellular B
iology 15:2809-2818(1995)、Waang et al.,Science 274:784-787(1996))。l
κBのこれらの変異体形態はNF-κBと結合するが、リン酸化またはユビキチン
化されず、それゆえ分解されない。NF-κBはlκBと結合した
ままであり、核内へ移動することができない。
上述の点から、SARシグナル伝達経路の優性ネガティブレギュレーターとし
て挙動するNIM1の変化形態を作ることができる。NIM1の優性ネガティブ
形態によって形質転換された植物は、nim1変異体植物として反対の表現型を
もち、なぜならNIM1の変化形態によって形質転換された植物は、構成性SA
R遺伝子発現、およびそれゆえにCIM表現型を示す、;すなわちトランスジェ
ニック植物は免疫調節されているからである。NIM1遺伝子がSARシグナル
伝達経路中で保持する位置により、本明細書中で特に開示したもの以外にも多く
の遺伝子変化の結果、SAR遺伝子の構成的発現およびそれゆえにCIM表現型
が生じることが予想される。“組換えDNA技術”と題される下記の項は、野生
型より高いレベルで、遺伝形質を転換された植物内でNIM1遺伝子の変化形態
を、組換え的に発現するのに使用できるプロトコルについて述べている。以下に
、SARシグナル伝達経路の優性ネガティブレギュレータとして挙動するNIM
1遺伝子の変化形態について述べる。
a.セリン残基55および59をアラニン残基へ変更:
ヒトlκBα中のセリン残基のリン酸化は、lκBαの刺激活性化分解とそれに
よるNF-κBの活性化に必要とされる。ヒトlκBα中のセリン残基(S32およ
びS36)のアラニン残基への突然変異誘発は、刺激により誘発されるリン酸化
を抑制し、従ってlκBαプロテオソーム媒介分解をブロックする(Traenckner e
t al.,1995;Brown et al.,1996;Brockman et al.,1995 Wang et al.,1996)
。このlκBαの変化形態は、細胞質中でNF-κBを保持し、それによって下流
のシグナル形成事象をブロックすることにより優性ネガティブ形態として機能で
きる。。図1に示すNIM1とlκBの間のアミノ酸配列比較に基づけば、NIM
1(配列番号:2)中のセリン55(S55)および59(S59)は、ヒトlκBαの
S32およびS36と相同である。NIM1の優性ネガティブ形態を構築するた
めに、アミノ酸位置の55および59のセリンをアラニン残基へ突然変異させる
。そのため、好ましい実施態様では、コード化した生成物が、シロイヌナズナNI
M1アミノ酸配列(配列番号:2)の55および59位に相当するアミノ
酸位置でセリンの代わりにアラニンを持つよう、NIM1遺伝子を変える。
b.N末端欠失
リン酸化部位S32およびS36と同様にユビキチン化リジン残基K21およ
びK22を含む、ヒトlκBαのアミノ酸1-36(Brockman et al.,1995;Sun e
t al.,1996)または1-72(Sun et al.,1996)の欠失は、トランスフェクショ
ンしたヒト細胞培養物において優性ネガティブlκBα表現型をもたらす。NI
M1遺伝子産物の最初の125アミノ酸のN末端欠失により、上述したS55お
よびS59の推定リン酸化部位と同様に、ユビキチン化部位として作用する8つ
のリジン残基が除去される。好ましい実施態様では、コード化した生成物が、天
然のシロイヌナズナNIM1アミノ酸配列(配列番号:2)と比較して、最初のおよ
そ125アミノ酸を欠いているように、NIM1遺伝子を変える。
c.C末端欠失
ヒトlκBαのアミノ酸261-317の欠失は、C末端中のセリンおよびトレ
オニン残基の構成性リン酸化をブロックし、本来備わっている安定性の強化をも
たらす。このlκBαの変化形態は、優性ネガティブ形態として機能すると予想
される。セリンおよびトレオニンが豊富な領域は、NIM1のC末端中、アミノ
酸522-593に存在する。したがって、好ましい実施態様では、コード化し
た生成物は、天然シロイヌナズナNIM1アミノ酸配列(配列番号:2)と比べて
、アミノ酸522-593を含むそのC末端の一部を欠いているようにNIM1遺
伝子を変える。
d.N末端/C末端欠失キメラおよびアンキリンドメイン
NIM1遺伝子産物の変化形態は、C末端およびN末端セグメント欠失または
キメラの結果として生産される。本発明のまた別の実施態様では、NIM1遺伝
子由来のアンキリンドメインを含む構築物が準備される。
3.別のSAR遺伝子の組換え発現
本発明の方法に使用される免疫調節化植物は、Ward et al.(1991)で叙述され
ている、様々なSAR遺伝子の組換え発現によって創ることも可能である。例と
して、1つ以上のPR-タンパク質遺伝子の過発現によって作られる病害抵抗性
稙物について叙述されている、米国特許第5,614,395を参照。それは特にNIM1
遺伝子の形態の組換え発現について言及しているが、“組換えDNA技術”と題
される下記の項、野生型より高いレベルで、トランスジェニック植物においてP
R-タンパク質遺伝子等の別のSAR遺伝子を組換え的に発現させるのにも使用
できる、プロトコルについて述べている。
組換えDNA技術
SAR遺伝子発現を高めることによって植物に病害抵抗性を与える、この野生
型または変化形態NIM1遺伝子は、通常の組換えDAN技術を用いて、植物細
胞中へ組み込むことができる。一般にこれは、上述NIM1の選択された形態を
コードするDNA分子を、当業者に知られている標準のクローニング手法を使用
して、DNA分子が異種(すなわち通常なら存在しない)である発現システムへ挿
入することを含む。このベクターは、挿入したタンパク質-コード配列の転写お
よび翻訳に必要な要素を含む。プラスミド、バクテリオファージウイルス、およ
び別の修飾されたウイルスといった、当業者に知られているたくさんのベクター
系を使用することができる。適切なベクターは、ラムダベクター系λgtl1、λg
tl0およびCharon4等のウイルスベクター、プラスミドベクター、例えばpBl 12
1、pBR 322、pACYC 177、pACYC 184、pAR群、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pU
C19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNA11、および別の類似系などを含む
が、これらに限られるものではない。発現システムの成分を、発現を強めるため
に修飾することもできる。例えば、先端を切った配列、ヌクレオチド置換または
別の修飾を使用することもできる。本明細書中で述べるこの発現システムは、実
質的には適切な条件において農産物植物細胞を形質転換するのに使用できる。N
IM1遺伝子の選択形態が、トランスジェニック植物中でSARを活性化するよ
うに、形質転換細胞は植物全体のなかで再生させることができる。
A.植物発現カセットの構築
トランスジェニック植物中で、発現させた遺伝子配列を、最初に、植物中で発
現可能な適切なプロモーターの後の、発現カセット中に集める。発現カセットは
、導入遺伝子の発現のために必要なまたは選択される、別のどんな配列も含むこ
とができる。このような配列は、転写ターミネーター、発現を増強するための外
来配列、例えば、イントロン、生命維持に必要な配列、および遺伝子産物を特定
の細胞小器官および細胞区画へターゲッティングする配列等を含むが、上述に限
られるものではない。次いでこれらの発現カセットは、下記に示すとおり、植物
形質転換ベクターへ容易に移転させることができる。下記は、典型的な発現カセ
ットの様々な成分についての叙述である。
1.プロモーター
発現カセットに使用されるプロモーターの選択は、トランスジェニック植物内
の、導入遺伝子の空間的または時間的発現パターンを決定する。選択したプロモ
ーターは、特定の細胞種(葉表皮性細胞、葉肉細胞、根皮層細胞など)または特定
の組織または器官(例えば根、葉、または花)中で導入遺伝子を発現させるので、
その選択によって、遺伝子産物の望ましい蓄積位置が反映される。あるいは、選
択したプロモーターは、様々な誘導条件のもとで、遺伝子の発現を制御し得る。
プロモーターはその強度、すなわち転写を助長する能力で変わる。利用する宿主
細胞に応じて、多くの適当なプロモーターのうち1つを使用する。以下は、発現
カセットに使用できるプロモーターの、非制限的な例である。
a.構成的発現、CaMV 35Sプロモーター:
プラスミドpCGN1761の構築物は、公開特許出願EP 0 392 225に叙述されており
(実施例23)、出典明示により本明細書に組込まれている。pCGN1761は、“2重
”CaMV 35Sプロモーターおよびtm1転写ターミネーターを含み、そのプロモータ
ーとターミネーターの間にユニークEcoR1部位があり、また、pUC型バックボーン
を持つ。現存するEcoR1部位に加えてNot1およびXho1部位を含む修飾されたポリ
リンカーをもつpCGN1761誘導体を構築する。この誘導体を、pCGN1761ENXと
呼ぶ。pCGN1761ENXは、トランスジェニック植物中、35Sプロモーターの制御下の
発現を目的とするポリリンカーの範囲内で、cDNA配列または遺伝子配列(細
菌ORF配列を含む)をクローニングするのに有用である。そのような構築物の3
5Sプロモーター遺伝子配列tm1ターミネーターカセット全体を、下記の形質転換
ベクターへ移動させる、プロモーターに対し5'側の、HindIII、Sph1、SaII、お
よびXba1位、およびターミネーターに対し3'側のXba1、BamH1、およびBgII部位
によって摘出できる。さらに、2重35Sプロモーター断片は別のプロモーターで
置換するため、HindIII、Sph1、SaII、Xba1、またはPst1での5'切除、およびポ
リリンカー制限部位(EcoR1、Not1、またはXho1)のいずれかに伴う3'切除によっ
て除去できる。もし所望すれば、クローニング部位周辺を、翻訳を高めるような
配列の導入でにより修飾することができる。これは過発現を望むときに特に有効
である。例えば、pCGN1761ENXは、出典明示により本明細書に組込まれている、
米国特許第5,639,949の実施例37に叙述と同様に、翻訳開始部位の最適化によ
って修飾される。
b.化学的/病原体調節可能なプロモーター下での発現
pCGN1761ENXの2重35Sプロモーターを、適当な高い発現レベルをもたらすよう
に選択した別のプロモーターと置き換えることができる。例として、米国特許第
5,614,395記述の化学的調節可能なプロモーターのひとつを、2重35Sプロモータ
ーと置き換えることができる。選択したプロモーターは、好ましくは、制限酵素
によってその供給源から摘出するが、代わりに、適切な末端制限部位を持つプラ
イマーでPCR増幅してもよい。PCR増幅行うなら、その場合は、このプロモ
ーターを再配列して、標的ベクター中で、増幅プロモーターのクローニング後の
増幅エラーを検査した方がよい。化学的/病原体調節可能なタバコPR-1aプロモー
ターは、プラスミドpCIB1004(構築は、出典明示により本明細書に組込まれてい
るEP 0 322 104の実施例21を参照)から切断し、プラスミドpCGN1761ENX(Uknes
st al.,1992)へ移す。pCIB1004はNco1で切断し、得られた線状断片の3'突出
部をT4 DNAポリメラーゼによる処置で平滑末端にする。次いで断片をHindI
II切断し、得られたPR-1aプロモーター含有断片をゲル精製し、2重35S
プロモーターを取り除いておいたpCGN1761ENX中でクローニングした。これはXho
1での切断およびT4ポリメラーゼによる平滑末端化、次いでHindIIIでの切断、お
よびラージベクター-ターミネーター含有断片を単離してこの中に、pCIB1004プ
ロモーター断片をクローニングすることによってなされる。これにより、PR-1a
プロモーターおよびtm1ターミネーターを持つpCGN1761ENX誘導体、およびユニー
クEcoR1およびNot1部位を持つ介在ポリリンカーを産出する。この選択されたコ
ード配列を、このベクター内へ挿入することもでき、続いてこの融合生成物(す
なわちプロモーター-遺伝子-ターミネーター)を選択された形質転換ベクター(以
下に記述するものを含む)へ移すことができる。米国特許第5,523,311および5,61
4,395で開示されている、ベンゾチアジアゾール、イソニコチン酸、およびサリ
チル酸化合物等の、様々な化学的レギュレーターを、本発明により形質転換した
植物中で選択したコードの配列の発現を引き起こすために使用することができる
。
c.構成的発現、アクチンプロモーター
アクチンの数種のアイソフォームは、ほとんどの細胞型で発現することが知ら
れており、それゆえにアクチンプロモーターは、構成性のプロモーターとして適
するものである。とりわけ、イネAct1遺伝子由来のプロモーターがクローニング
され、特性化されている(McElroy et al.Plant Cell 2:163-171(1990))。この
プロモーターの1.3kbフラグメントは、イネプロトプラスト中で発現するのに必
要な調節エレメント全てを含むことが見出された。さらに、Act1プロモーターに
基づく非常に多くの発現ベクターが、単子葉植物で使用するために具体的に構築
されている(McElroy et al.Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))。これらはA
ctl-イントロン1、Adh15フランキング配列、およびAdh1-イントロン1(トウモロ
コシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来)およびCaMV 35S配列由来の配列を
組み込んでいる。最も高い発現を示すベクターは、35SとAct1イントロンの融合
物、またはAct15'フランキング配列およびAct1イントロンの融合物であった。(
GUSリポーター遺伝子)の開始ATGあたりの配列の最適化もまた、発現を強
める。McElroy et al.(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))叙述の、プロモ
ーター発現カセットは、遺伝子発現用に容易に修飾でき、単子葉植物の宿主での
使用に特に適している。例えば、プロモータ含有フラグメントを、McElroy構成
から取り除き、pCGN1761ENX中の2重35Sプロモーターと置き換えて使用し、これ
を次いで、特定の遺伝子配列の挿入に利用する。このように構築した融合遺伝子
は、その後適当な形質転換ベクターへ移すことができる。別の報告では、第1の
イントロンを持つイネAct1プロモーターも、培養大麦細胞で高度の発現を導くこ
とがわかっている(Chibbar et al.Plant Cell Rep.12:506-509(1993))。
d.ユビキチンプロモーターの構成的発現
ユビキチンは、たくさんの細胞形態中に累積すると知られている、もうひとつ
の遺伝子産物であり、そのプロモーターは、トランスジェニック植物(例えばヒ
マワリ-Binet et al.Plant Science 79:87-94(1991)およびトウモロコシ-Chris
tensen et al.Plant Molec.Biol.12:619-632(1989))で使用される数種類から
クローニングされている。トウモロコシユビキチンプロモーターは、トランスジ
ェニック単子葉植物系で開発され、その配列および単子葉植物の形質転換用に構
成されたベクターは、、出典明示により本明細書に組込まれている特許公開物EP
0 342 926(Lubrizolへ)に開示されている。Taylor et al.(Plant Cell Rep.12
:491-495(1993))は、トウモロコシユビキチンプロモーターおよび第1のイント
ロン、およびマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントを介して導入すると
き多くの単子葉植物の細胞懸濁液におけるの高活性を含むベクター(pAHC25)につ
いて記載している。ユビキチンプロモーターはトランスジェニック植物、特に単
子葉植物での遺伝子発現に適している。適したベクターはpACH25誘導体または、
適切なユビキチンプロモーターおよび/またはイントロン配列の導入により修飾
した本明細書中に叙述されている形質転換ベクターのいずれかである。
e.根特異的発現
遺伝子発現の別のパターンは根発現である。適切な根プロモーターは、de Fra
mond(FEBS 290:103-106(1991))および公開特許出願EP 0 452 269(出典明
示により本明細書に組込まれている)に記述されている。このプロモーターは、
選択された遺伝子の挿入や、続くプロモーター-遺伝子-ターミネーターカセット
全体の、対象となる形質転換ベクターへの移入のために、pCGN1761ENX等の適切
なベクターに移される。
f.創傷誘発プロモーター
創傷誘発プロモーターもまた、遺伝子発現に適切である。このようなプロモー
ターの多くが記載されており(例えば、Xu et al.Plant Molec.Biol.22:573-5
88(1993)、Logemann et al.Plant Cell 1:151-158(1989)、Rohrmeier & lehle
,Plant Molec.Biol.22:783-792(1993)、Firek et al.Plant amolec.Biol.22
:129-142(1993)、Warner et al.Plant J.3:191-201(1993))、およびこれら
全てが本発明での使用に適している。Logemann et al.は、双子葉植物のジャガ
イモwunl遺伝子の5'上流配列について叙述している。Xu et al.は、双子葉植物
ジャガイモ(pin2)由来の創傷誘発プロモーターは、単子葉植物イネ中で活性であ
ると示している。さらに、Rohrmeier & Lehleは、創傷誘発し、かつ通常の技術
を使用する同起源のプロモーター(cognate promoter)を単離するときに使用でき
るトウモロコシWiplcDNAのクローニングについて述べている。同様に、Firek
et al.およびWarner et al.は、局部的創傷および病原体侵入部位で発現する、
単子葉植物アスパラガス由来の創傷誘発遺伝子について述べている。クローニン
グ技術の使用は、当分野でよく知られており、これらのプロモーターを、適切な
ベクターへ移し、本発明に適する遺伝子へ融合させ、植物創傷部位でこれらの遺
伝子を発現させるのに使用することができる。
g.髄優先の発現
出典明示により本明細書に組込まれている特許出願WO93/07278に、トウモロコ
シtrpA遺伝子で、髄細胞で優先的に発現されるものの単離について叙述されてい
る。転写開始から1726bpまで伸長するこの遺伝子配列およびプロモーターを
述べている。標準の分子生物学的技術を使用して、このプロモーターまたはその
部分を、35Sプロモーターの代わりとなって、髄優先の方法で、外来の遺伝
子の発現を制御するのに使用できるpCGN1761のようなベクターへ移すことができ
る。実際、髄優先のプロモーターまたはその部分を含む断片を、いずれのベクタ
ーにも移すことができ、トランスジェニック植物で有利なように修飾できる。
h.葉特異的発現
ホスホエノールカルボキシラーゼ(PEPC)をコードするトウモロコシ遺伝子
は、Hudspeth & Grula(Plant Molec Biol 12:579-589(1989))によって述べられ
ている。標準の分子生物学的技術を使用して、この遺伝子のためのプロモーター
を、トランスジェニック植物の葉特異的な方法で、いずれの遺伝子の発現を制御
するのに使用することができる。
2.転写ターミネーター
様々な転写ターミネーターは、発現カセットにおいて利用可能である。これら
は導入遺伝子およびその正確なポリアデニル化以外に、転写の終了を担う。適切
な転写ターミネーターは、植物中で機能することが知られたものであり、CaMV 3
5Sターミネーター、tm1ターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーターお
よびエンドウrbcS E9ターミネーターを含む。これらは単子葉植物および双子葉
植物両方で使用可能である。
3.発現の増強または調節のための配列
転写単位内からの遺伝子発現を増強するたくさんの配列が見いだされており、
これらの配列を、本発明の遺伝子と共に使用してトランスジェニック植物におけ
るその発現を増強することができる。
様々なイントロン配列が、特に単子葉植物細胞で、発現を増強させると示され
ている。例えば、トウモロコシAdh1遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞内
へ導入されると、その同起源のプロモーターのもとで、野生型遺伝子の発現を顕
著に増強することが分かっている。イントロン1は特に効果的であることが分か
っており、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との、融合
構築物中で発現を増強した(Callis et al.Genes Develop.1:1183-
1200(1987))。同様の実験系で、トウモロコシbronze1遺伝子のイントロンは発現
増強において、類似の効果を有していた。イントロン配列は、植物形質転換ベク
ター中へ、一般的には非翻訳リーダーの範囲内へごく普通に組み込まれる。
ウイルス由来のたくさんの非翻訳リーダー配列もまた、発現を増強することが
知られており、これらは双子葉植物で特に効果的である。とりわけ、タバコモザ
イクウイルス(TMV:“W配列”)、トウモロコシクロロシス斑点ウイルス(MC
MV)およびアルファルファモザイクウイルス(AMV)由来のリーダー配列は、
発現を増強するのに有効であることが示されている(例えば、Gallie et al.Nuc
l.Acids Res.15:8693-8711(1987)、Skuzeski et al.Plant Molec.Biol.15:
65-79(1990))
4.細胞内の遺伝子産物のターゲッティング
遺伝子産物をターゲッティングする様々なメカニズムが植物に存在することが
知られており、これらのメカニズムの機能を制御する配列は細部に髄って、特性
化されている。例えば、葉緑体への遺伝子産物のターゲッティングは、種々のタ
ンパク質のアミノ末端にあるシグナル配列によって制御されており、これは、葉
緑体の移入の際に切断されて成熟タンパク質をもたらす(例えば、Comai et al.
J.Biol.Chem.263:15104-15109(1988))。これらのシグナル配列を、異種遺伝
子産物と融合させると異種産物の葉緑体への移入をもたらすことができる(Van d
en Broeck,et al.Nature 313:358-363(1985))。適切なシグナル配列をコード
するDNAは、RUBISCOタンパク質、CABタンパク質、EPSPシンタ
ーゼ酵素、GS2タンパク質および、葉緑体局在することが知られているほかの
多くのタンパク質をコードするcDNAsの5'末端から単離した。米国特許第5
,639,949の実施例37中“Expression With Chloroplast Targeting”表題の部
分を参照。
別の遺伝子産物は、ミトコンドリアおよびペルオキシソームなどの別の細胞小
器官に局在している(例えば、Unger et al.Plant Molec.Biol.13:411-418(19
89))。これらの生成物をコードするcDNAsもまた、異種遺伝子産物のこれら
の細胞小器官へのターゲッティングを、もたらすよう操作する。このような
配列の例は、ミトコンドリアの核-コード化ATPアーゼおよび特定アスパラギ
ン酸塩アミノトランスフェラーゼアイソフォームである。標的とする細胞タンパ
ク質体はRogers et al.らによって叙述されている(Proc.Natl.Acad.Sci USA 82
:6512-6516(1985))。
加えて、遺伝子産物の別の細胞画分へのターゲッティングをひき起こす配列が
、特性化されている。アミノ末端配列は、ER、アポプラストに対するターゲッテ
ィング、およびアリューロン細胞からの細胞外分泌を担う(Koehler & Ho,Plant
Cell 2:769-783(1990))。加えてアミノ末端配列は、カルボキシ末端配列ととも
に遺伝子産物の空胞ターゲッティング(vacuolar targeting)を担う(Shinshi et
al.Plant Molec.Biol.14:357-368(1990))。
上述した適切な標的化配列を対象となる導入遺伝子配列へ融合することによっ
て、導入遺伝子産物をどの細胞小器官または細胞区画へも導くことが可能になる
。葉緑体ターゲッティングの場合、例えば、RUBISCO遺伝子、CAB遺伝
子、EPSPシンターゼ遺伝子またはGS2遺伝子由来の葉緑体シグナル配列は
、フレーム内で導入遺伝子のアミノ末端ATGと融合させる。選択されたシグナ
ル配列は、知られている切断部位を含み、また構築された融合体は、切断に必要
な切断部位の後ろのアミノ酸も考慮に入れるべきである。ある事例では、この要
件は、切断部位と導入遺伝子ATGの間に少数のアミノ酸を添加するか、または
代わりに導入遺伝子配列のなかで何種類かのアミノ酸を置換することによって満
たされる。葉緑体移入用に構築した融合体は、Barlett et al.著、Edelmann et
al.(Eds.)Methods in Chloroplast Molecular Biology,Elsevier pp 1081-1
091(1982)およびWasmann et al.Mol.Gen.Genet.205:446-453(1986)に叙述さ
れている技術を使用して、インビトロ転写構築物のインビトロ翻訳、続くインビ
トロ葉緑体摂取により葉緑体摂取効果について検査することができる。これらの
構築技術は当分野でよく知られており、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム
にも同様にあてはまる。
細胞ターゲッティングに対する上述のメカニズムは、その同起源のプロモータ
ーに関してだけでなく、異種プロモーターに関しても利用できるので、標的シグ
ナルを導くプロモーターとは異なる発現パターンを持つプロモーターの転写レギ
ュレーション下で、特異的な細胞ターゲッティングという目的も達成できる。
B.植物形質転換ベクターの構築
植物形質転換に利用できるたくさんの形質転換ベクターは、植物形質転換分野
の当業者には知られており、本発明に適切な遺伝子はそのようなベクターととも
に使用できる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換の標的
種によって変わる。ある標的種では、異なる抗生物質のまたは除草剤の選択マー
カーが好ましい。形質転換で通常使用される選択マーカーは、カナマイシンおよ
び関連抗生物質に対する抵抗性を与えるnptII遺伝子(Messing & Vierra.Gene 1
9:259-268(1982)、Bevan et al.,Nature 304:184-187(1983))、除草剤フォスフ
ィノスリシンに対する抵抗性を与えるbar遺伝子(White et al.,Nucli.Acide R
es 18:1062(1990)、Spencer et al.Theor.Appl Genet 79:625-631(1990))、抗
生物質のハイグロマイシンに対する抵抗を与えるhph遺伝子(Blochinger & Diggl
mann,Mol Cell Bio 4:2929-2931)、メタトレキセートに対する抵抗性を与えるd
hfr遺伝子(Bourouis et al.,EMBO J.2(7))、およびグリフォセートに対する抵
抗性を与えるEPSPS遺伝子(米国特許第4,940,935および5,188,642)を含む。
1.アグロバクテリウム形質転換に適したベクター
たくさんのベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用して形
質転換に利用できる。これらは典型的に、少なくとも1つのT-DNA境界配列
を運搬し、pBIN19(Bevan.Nucl.Acids Res.(1984))およびpXYZなどのベクター
を含む。以下に、アグロバクテリウム形質転換に適切な2つの典型的なベクター
の構築について述べる。
a.pCIB200およびpCIB2001
バイナリーベクターpCIB200およびpCIB2001は、アグロバクテリウムとともに
使用するために、組換えベクターの構築に使用され、次の方法で構築される。
pTJS75kanは、pTJS75のNarl消化して(Schmidhauser & Helinski,J.Basteriol
.164
:446-455(1985))、テトラサイクリン抵抗遺伝子を摘出し、次いでNPTIIを運
搬するpUC4K由来のAccl断片の挿入させることにより作られる(Messing & Vierra
,Gene 19:259-268(1982):Bevan et al.,Nature 304:184-187(1983):McBride e
t al.,Plant Molecular Biology 14:266-276(1990))。Xho1リンカーを、左およ
び右T-DNA境界配列、植物選択性nos/nptIIキメラ遺伝子およびpUCポリリン
カーを含むPCIB7のEcoR1断片に連結させ(Rothstein et al.,Gene 53:153-161(1
987))、およびXho1消化断片を、Sa11消化pTJS75kan中でクローニングしてpCIB20
0をつくる(EP 0 332 104、実施例19参照)。pCIB200は次のユニークポリリンカ
ー制限部位:EcoR1、Sst1、Kpn1、BgIII、Xba1、およびSaIIを含む。
pCIB2001は、別の制限部位のポリリンカーへの挿入によりつくられる。pCIB2001
のポリリンカー中のユニーク制限部位は、EcoR1、Sst1、Kpn1、BgIII、Xba1、Sa
11、Mlu1、Bc11、Avr11、Apa1、Hpa1、およびStu1である。pCIB20011ま、これら
のユニーク制限部位を含む以外に、植物および細菌のカナマイシン選択、アグロ
バクテリウム介在形質転換用の左および右のT-DNA境界、EcoR1と別の宿主間
との起動のためのRK2-誘導trfA機能、およびRK2由来のoriTおよびoriV機能も持
つ。このpCIB2001ポリリンカーは、自身の調節シグナルを含む植物発現カセット
のクローニングに適当である。
b.pCIB10およびそのハイグロマイシン選択誘導体
このバイナリーベクターpCIB10は、植物選択用のカナマイシン抵抗性をコード
する遺伝子、およびT-DNA右および左の境界配列を含み、Ecoliおよびアグロ
バクテリウム両方の中で複製できる広い宿主範囲プラスミドpRK252由来の配列を
組み込む。その構築は、Rothsrein et al.(Gene 53:153-161(1987))で述べられ
ている。pCIB10のウイルス誘導体は、Gritz et al.(Gene 25:179-188(1983))叙
述のハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼに対する遺伝子を組み込むこ
とにより構築される。これらの誘導体は、ハイグロマイシンのみ(pCIB743)また
はハイグロマイシン酸またはカナマイシン(pCIB715、pCIB717)に対するトランス
ジェニック植物細胞の選択を容易にする。
2.非アグロバクテリウム形質転換に適したベクター
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用しない形質転換は、選択した形
質転換ベクター中にT-DNAを必要とせず、それゆえに上述したT-DNA配列
を含むようなベクターのほかにこれらの配列を欠くベクター利用することができ
る。アグロバクテリウムによらない形質転換技術は、粒子衝撃、プロトプラスト
取り込み(例えばPEGおよびエレクトロポレーション)およびマイクロインジェク
ション経由の形質転換を含む。ベクターの選択は、形質転換対象となる種類を好
ましく選択するかどうかに大きく依存する。以下に、非アグロバクテリウム形質
転換に適する典型的なベクターの構築について述べる。
a.pCIB3064
pCIB3064は、除草剤バスタ(またはフォスフィノスリシン)による選択と併用す
る、直接遺伝子導入技術に適したpUC由来のベクターである。このプラスミドpCI
B264は、E.coli GUS遺伝子と作動可能に融合させたCaMV35Sプロモーターおよび
CaMV35S転写ターミネーターを含み、PCT公開出願WO93/07278に叙述されている。
このベクターの35Sプロモーターは、開始部位の5'に2つのATG配列を含む。
これらの部位は、通常のPCR技術を用いてATGを取り除くような方法で、変
異させ、Ssp1およびPvu11の制限部位をつくる。この新しい制限部位は、ユニー
クSaII部位から96および37塩基対、および実際の開始部位から101および
42塩基対離れている。得られたpCIB246の誘導体は、pCIB3025と呼ぶ。このGUS
遺伝子は次いで、SaIIおよびSac1消化してpCIB3025より摘出し、平滑末端化し、
再度連結させて、プラスミドpCIB3060を作る。プラスミドpJIT82は、John Innes
Centre,Norwichより入手し、Streptomyces viridochromogene由来の、bar遺伝
子を含む400bpSma1フラグメントを摘出し、pCIB3060のHpa1部位へ挿入する(T
hompson et al.EMBO J 6:2519-2523(1987))。こうして、除草剤選択のためのCa
MV 35Sプロモーターおよびターミネーターの制御下のbar遺伝子、アンピシリン
抵抗性の遺伝子(E.coliでの選択用)、およびユニーク部位Sph1、ベクターは、
自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適し
ている。
b.pSOG19およびpSOG35
pSOG35は、メトトレキセートに対する抵抗性を付与する選択マーカーとしてE
.coli遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DFR)を利用する、形質転換ベクターで
ある。PCRを使用して、35Sプロモーター(800bp)、トウモロコシAdh1遺伝子由来
のイントロン6(550bp)、およびpSOG10由来のGUS非翻訳リーダー配列18bpを増
幅する。E.coliジヒドロ葉酸レダクターゼII型遺伝子をコードする250bp断
片もまたPCRによって増幅され、これら2つのPCR断片は、pUC19ベクターバック
ボーンおよびノパリンシンターゼターミネーターを含むpB1221(Clontech)由来の
Sac1-Pst1断片と組み合わせる。これらのフラグメントを合わせて、イントロン6
配列と融合した35Sプロモーター、GUSリーダー、DHFR遺伝子およびノパリンシン
ターゼターミネーターを含むpSOG19をつくる。pSOG19中のGUSリーダーを、トウ
モロコシクロロシス斑ウイルス(MCMV)由来のリーダー配列と置換して、ベクター
pSOG35をつくる。pSOG19およびpSOG35は、アンピシリン抵抗性のpUC遺伝子を運
び、外来の物質のクローニングに利用できるHindIII、Sph1、Pst1およびEcoR1部
位を持つ。
C.形質転換
一旦、対象のコード配列が、発現系でクローニングされると、それは植物細胞
内で形質転換される。植物の形質転換および再生の方法は、当分野でよく知られ
ている。例えば、Tiプラスミドベクターは、外来のDNAの搬入や、直接DNA
取り込み、リポゾーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、
およびマイクロプロジェクタイルにも利用される。加えて、アグロバクテリウム
属の細菌は、植物細胞を形質転換するのに利用できる。以下は、双子葉類および
単子葉類植物両方を形質転換させる代表的な技術の説明である。
1.双子葉植物の形質転換
双子葉植物の形質転換は当分野によく知られており、アグロバクテリウムに基
づくの技術およびアグロバクテリウムを必要としない技術を含む。非アグロバク
テリウム技術は、プロトプラストまたは細胞による、外来遺伝物質の直接摂取を
伴う。これは、PEGまたはエレクトロポレーション介在摂取、粒子衝撃介在搬
入、またはマイクロインジェクションによって達成できる。これらの技術の例は
、Paszkowski et al.,EMBO J 3:2717-2722(1984)、Potrykus et al.,Mol.Gen
.Genet.199:169-177(1985)、Reich et al.,Biotechnology 4:1001-1004(1986
)、およびKlein et al.,Nature 327:70-73(1987)によって叙述されている。い
ずれの事例でも、形質転換細胞を、当分野で知られている標準の技術を使用して
完全な植物へと再生させる。
アグロバクテリウム介在形質転換は、形質転換能率が高く、多くの異なる種に
広く利用できるので、双子葉植物の形質転換に好ましい技術である。アグロバク
テリウム形質転換は、典型的に、対象の外来DNA(例えばpCIB200またはpCIB20
01)を運ぶバイナリーベクターを、宿主アグロバクテリウム株の共存するTiプラ
スミド上にまたは染色体上(例えばpCIB200またはpCIB2001の菌株CIB542(Uknes e
t al.,Plant Cell 5:159-169(1993)))のいずれかにあるvir遺伝子の補足に頼る
、適切なアグロバクテリウム株へ転移させる必要がある。アグロバクテリウムに
対する組換えバイナリーベクターの転移は、組換えバイナリーベクターをもつE
.coli、pRK2013等のプラスミドをもつヘルパーE.coli株、および標的アグロバ
クテリア株に対して組換えバイナリーベクターを起動させることができるもの、
を使用して、3世代交配によって行われる。かわりに、組換えバイナリーベクタ
ーを、DNA形質転換によってアグロバクテリウムへ転移させ
組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常、植物の外植
片とアグロバクテリウムとの共培養を必要とし、当分野でよく知られているプロ
トコルは下記である。形質転換された組織は、バイナリープラスミドT-DNA
境界間に存在する、抗生物質または除草剤抵抗性マーカーを入れた、選択培地上
で再生させる。
植物細胞を遺伝子で形質転換させる別の方法は、植物組織および細胞で不活性
または生物学的に活性な粒子のねじ込み(propelling)を伴う。この技術は、すべ
てSanford et al.の米国特許第4,945,050、5,036,006および5,100,792で叙述さ
れている。一般的に、この方法で、細胞で不活性または生物学的に活性な粒子を
細胞の外側表面を貫通して、その内部に組み込ませるのに効果的な条件下でねじ
込む。不活性粒子を利用するときは、粒子を標的遺伝子含有ベクターでコーティ
ングすることにより、ベクターを細胞へ導入できる。あるいは、ベクターを粒子
の通った跡にそって細胞内へ運ぶ、標的細胞をベクターで取り囲んでもよい。生
物学的に活性な粒子(例えば、乾燥イースト細胞、乾燥細菌またはバクテリオフ
ァージ、それぞれ導入しようとするDNAを含む)もまた、植物細胞組織中へね
じ込む(propel)ことができる。
2.単子葉植物の形質転換
ほとんどの単子葉植物の形質転換は、今は慣用となっている。好ましい技術は
、PEGまたはエレクトロポレーション技術を使用するプロトプラストへの直接
的な遺伝子導入、およびカルス組織への粒子衝撃を含む。形質転換は、単一DN
A種または複数のDNA種(すなわち、同時形質転換)を用いて行われ、これらの
技術両方は、本発明の使用に適している。同時形質転換は、ベクターを完全に構
築しなくてもよく、対象遺伝子や選択マーカーの同一連鎖群に属さない遺伝子座
をもつトランスジェニック植物をつくり、次世代で選択マーカーを取り外すこと
が可能であるという利点を持つ。しかし、同時形質転換を使用することの不利点
は、別のDNA種がゲノム内に組み込まれる頻度が100%より低い(Schocher
et al.Biotechnology 4:1093-1096(1986))。
特許出願EP 0 292 435、EP 0 392 225、およびWO 93/07278には、トウモロコ
シの精粋近交系からのカルスおよびプロトプラストの調製、PEGまたはエレク
トロポレーションを使用したプロトプラストの形質転換、および形質転換プロト
プラストからのトウモロコシの再生についての技術が述べられている。Grodon K
ann et al.,(Plant Cell 2:603-618(1990))およびFromm et al.,(Biotechnolo
gy 8:833-839(1990))は、粒子衝撃を使用した、A188誘導トウモロコシ系列の形
質転換技術を公開している。さらに、WO 93/07278およびKoziel et al.(Biotec
hnology 11:194-220(1993))は、粒子衝撃による、トウモロコシの
精粋近交系の形質転換技術を述べている。この技術は、受粉後14から15日の
トウモロコシ穂から切除した1.5から2.5mm長の未成熟のトウモロコシ胚、お
よび衝撃用のPDS-1000Heマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント装置を利
用する。
イネの形質転換は、プロトプラストまたは粒子衝撃を利用する直接遺伝子導入
技術により行うこともできる。プロトプラスト媒介形質転換は、Japonica種やIn
dica種では報告されている(Zhang et al.,Plant Cell Rep 7:379-384(1988);Sh
imamoto et al.Nature 338:274-277(1989);Datta et al.Biotechnology 8:736
-740(1990))。いずれの種も、粒子衝撃を用いて普通に形質転換可能である(Chri
stou et al.Biotechnology 9:957-962(1991))。
特許出願EP0 332 581は、Pooideaeプロトプラストの作製、形質転換
および再分化についての技術を記載している。これらの技術によって、Dactylis
やコムギの形質転換も可能である。更に、コムギ形質転換については、Vasil et
al.(Biotechnology 10:667-674(1992))にC型長期再分化可能カルスの細胞へ
の粒子衝撃を用いる場合が、更にVasil et al.(Biotechnology 11:1553-1558(1
993))およびWeeks et al.(Plant Physiol.102:1077-1084(1993))には未熟胚お
よび未熟胚誘導カルスの粒子衝撃を用いる場合が記載されている。しかしながら
、好ましいコムギ形質転換技術は、未熟胚の粒子衝撃によるコムギの形質転換を
必要とし、遺伝子搬入の前に高スクロースまたは高マルトース段階のいずれかを
含む。衝撃の前に、かなり多数の胚(長さ0.75−1mm)を体細胞胚誘導用に3
%スクロースと3mg/2,4-Dを含むMS培地(Murashige & Skoog,Physiologia
Plantarum 15:473-497(1962))上で平板培養し、暗所で発生させる。衝撃を実施
する日に、胚を誘導培地から取り出し、浸透培地(osmoticum)(即ち、所定濃度、
典型的には15%のスクロースとマルトースを加えた誘導培地)上で平板培養し
た。この胚を2−3時間原形質分離させ、次いで衝撃を与えた。標的プレート1
つ当り胚20個が典型的であるが、絶対ではない。標準操作を用いて適切な遺伝
子担持プラスミド(例えば、pCIB3064とpSG35)をマイクロメーター
サイズの金粒子上に沈積させる。標準80メッシュスクリーンを用いてバースト
圧〜1000psiで胚のプレートそれぞれをDuPont Biolisticsま)回復させる。24時間後、胚を浸透培地から取り出し、誘導培地に戻して再
分化まで約1ヶ月の間そのまま維持する。およそ1ヶ月後、体細胞胚増殖カルス
を発生した胚外植体を再分化培地(MS+1mg/リットルNAA、5mg/リットル
GA)に移し、更に適切な選択剤(pCIB3064の場合10mg/lバスタ、pS
OG35の場合2mg/1メトトレキセート)を含める。およそ1ヶ月後、発生した
シュートを、半強度MS、2%スクロース、および同濃度の選択剤を含む“GA
7s”として知られている大きい滅菌容器に移す。
最近では、Agrobacteriumを用いた単子葉植物の形質転換が報告されている。
WO94/00977および米国特許第5,591,616号、いずれも出典明示
により本明細書の一部とする、を参照。
育 種
SAR遺伝子、例えば、NIM1遺伝子の一形態での形質転換により得られた
免疫調節化植物は、単子葉植物や双子葉植物を含む広範囲の植物種の中のいずれ
でもよいが、本発明の方法に使用した免疫調節化植物は、好ましくは、上記の農
業経済的に重要な標的農産物のリストから選択される。生産量と品質に重要な他
の特性と組合せて選択したNIM1遺伝子形態の発現は、育種により植物系列に
組込むことができる。育種法および技術は、当分野では知られている。例えば、
Welsh J.R.,Fundamentals of Plant Genetics and Breeding,John Wiley & S
ons,NY(1981);Crop Breeding,Wood D.R.(Ed.)American Society of Agronom
y Madison,Wisconsin(1983);Mayo O.,The Theory of Plant Breeding,Second
Edition,Clarendon Press,Oxford(1987);Singh,D.P.,Breeding for Resis
tance to Diseases and Insect Pests,Springer-Verlag,NY(1986);and Wricke
and Weber,Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding,Walter d
e Gruyter and Co.,Berlin(1986)参照。
上記のトランスジェニック種子および植物内に組込まれた遺伝的特性は、有性
生殖または栄養繁殖により継代されるため、子孫植物において維持させ、伝搬さ
せることができる。一般にこの維持や伝搬により、既知の農業的方法の用途を耕
作、播種、または収穫などの特定目的に適合するよう発展させることができる。
水耕法または温室技術などの特別な方法も応用できる。生長中の農産物は、昆虫
や感染による攻撃や損傷、並びに、雑草との競合を受けやすいので、収量を増進
するために、雑草、植物病害、昆虫、線虫、および他の有害な条件を制御する方
法をとる。これらの方法には、土壌の耕作や雑草および感染植物の除去などの機
械的方法や、除草剤、殺真菌剤、花粉発育阻止剤、抗線虫薬、生長調節剤、成熟
化剤、および殺虫剤などの農薬の適用がある。
本発明のトランスジェニック植物および種子の有利な遺伝的特性は、更に植物
育種に使用でき、害虫、除草剤またはストレス耐性などの特性の増進した、栄養
価の高い、収量の増した、または倒伏または飛散による損失の低下をもたらす改
善された構造の植物の開発に役立つ。様々な育種段階は、交雑させる系列の選択
、親系列の受粉管理、または適切な子孫植物の選択など、十分に確立されたヒト
の介入を特徴とする。所望の特性に応じて、様々な育種法が採用される。これに
関連した技術は当分野ではよく知られており、ハイブリダイゼーション、近親交
配、戻し交雑育種、多系育種、変種融合(variety blend)、異種間ハイブリダイ
ゼーション、異数体技術等があるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼー
ション技術には、機械的または化学的または生化学的手段による雄性または雌性
不稔性稙物産出のための植物の不稔化も含む。異系列の花粉と雄性不稔植物を他
家受粉すれば確実に、雄性不稔性であるが雌性稔性である植物のゲノムは両方の
親系列の特性を均質に獲得する。そのため、本発明のトランスジェニック種子お
よび植物は、例えば、除草剤または殺虫剤処置などの常法の効果を増大するよう
に、または、その修飾された遺伝的特性により常法を省略できるように改良され
た植物系列の育種にも使用できる。あるいは、ストレス耐性の向上した新規農産
物を得ることもでき、これは最適化された遺伝的“装置”により、比較的不利な
発生条件に耐えることができなかった収穫産物よりも高品質の収穫産物をもたら
す。
種子生産では、種子の発芽良否や均質性が重要な生産品特性であるが、その一
方で農家の収穫および販売する種子の発芽良否や均質性は重要でない。他の農産
物や雑草の種子が混ざっていない状態に農産物を維持するのは困難であるので、
種子の運ぶ病害を制御して、発芽良性の種子を生産するために、純粋種子の生育
、条件付けおよびマーケティングに熟練した種子生産者により、かなり大規模で
十
分に確立された種子生産法が開発されてきた。このように、自作の農産物から採
れた種子を用いる代わりに特定の品質基準に合致した保証付き種子を購入するこ
とは農家にとっては普通の行為である。種子として使用される繁殖物質は、習慣
的に除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫薬、軟体動物駆除剤、またはこ
れらの混合物を含む保護剤コーティングで処置されている。習慣的に使用される
らば、これらの化合物を更に、習慣的に製剤分野で用いられる担体、界面活性剤
、または適用促進補助剤と共に処方して、細菌、真菌または病害動物から保護す
る。保護剤コーティングは、繁殖物質を液体製剤に浸漬したり、混合湿潤または
乾燥製剤でコーティングすることにより適用できる。芽または果実を対象に処置
するようなその他の適用法も可能である。
本発明の更なる態様は、本発明のトランスジェニック植物個体、トランスジェ
ニック植物材、またはトランスジェニック種子の使用を特徴とする上記例示の方
法などの新規農業法を提供することである。
これらの種子は、適切なパッケージング材からなるバッグ、容器または器に入
れてもよく、そのバッグや容器は種子を密封できるものである。バッグ、容器ま
たは器は、種子の短期または長期貯蔵のいずれか、または両方に合うように設計
されたものである。適切なパッケージング材の例には、クラフト紙などの紙、硬
質または軟質のプラスチックまたは他のポリマー材、ガラスまたは金属がある。
望ましくは、このバッグ、容器または器は、同種または異種の多層のパッケージ
ング材からなる。一実施態様では、バッグ、容器または器は水または水分と種子
とが接触するのを排除または制限するために与える。一例では、バッグ、容器ま
たは器は、封止、例えば、加熱封止して、水や水分が入るのを防ぐ。その他の実
施態様では、吸水材をパッケージング材層の間または隣に設置する。更に別の実
施態様では、バッグ、容器または器またはそれを構成するパッケージング材は、
種子の貯蔵または輸送の際の、病害、混入または他の有害作用を制限、抑制また
予防するものとして扱われる。このような処置の一例は、例えば、化学的手段に
よる、または放射線照射による滅菌である。本発明に含まれるのは、形質転換植
物中で、野生型植物よりも高レベルで発現されるNIM1遺伝子またはNIM1
タンパク質の一形態を含むトランスジェニック植物の種子を、適切な担体、並び
に植物に対して広範囲の病害抵抗性を与えるためのその使用についての説明ラベ
ルと共に含む市販のバッグである。
免疫調節化植物への殺菌剤の適用
本明細書に記載のとおり、植物を防御する本発明の方法は、次の2段階を必要
とする:第1に、SAR経路を活性化して免疫調節化植物を提供し、第2に、殺
菌剤をかかる免疫調節化植物に適用して、病害抵抗性を相乗的に高める。
A.常用の殺菌剤
本発明の方法によれば、市販または常用のいずれの殺菌剤も、上記3経路のい
ずれかにより得られた免疫調節化植物に適用できる。適切な殺菌剤の例には、下
記の殺真菌剤があるが、これらに限定されない:4-[3-(4-クロロフェニル)-3
-(3,4-ジメトキシフェニル)アクリロイル]モルホリン(“ジメトモルフ”)(参
照:C.Tomlin(編):The Pesticide Manual,10th edition,Farnhan,UK,1994
,pages 351-352);5-メチル-1,2,4-トリアゾロ[3,4-b][1,3]ベンゾチ
アゾール(“トリシクラゾール”)(参照:C.Tomlin(編):The Pesticide Manual
,10th edition,Farnhan,UK,1994,pages 1017-1018);3-アリルオキシ-1,
2-ベンゾチアゾール-1,1-ジオキシド(“プロボナゾール”)(参照:C.Tomlin(
編):The Pesticide Manual,10th edition,Farnhan,UK,1994,pages 831-83
1);α-[2-(4-クロロフェニル)エチル]-α-(1,1-ジメチルエチル)-1H-1,
2,4-トリアゾール-1-エタノール(“テブコナゾール”)(参照:EP-A-40 345)
;1-[[3-(2-クロロフェニル)-2-(4-フルオロフェニル)オキシラン-2-イル
]メチル]-1H-1,2,4-トリアゾール(“エポキシコナゾール”)(参照:EP-A-1
96038);μ-(4-クロロフェニル)-μ-(1-シクロプロピルエチル)-1H-1,2,
4-トリアゾール-1-エタノール(“シプロコナゾール”)(参照:US-4664696);
5-(4-クロロベンジル)-2,2-ジメチル-1-(1H-1,2,4-トリアゾル-1-イ
ルメチル)-シクロペンタノール(“メトコナゾール”)(参照:EP-A-267778);2-
(2,4-ジクロロフェニル)-3-(1H-1,2,4-トリアゾル-1-イル)-プロピル-
1,1,2,2-テトラフルオロエチル-エーテル
(“テトラコナゾール”)(参照:EP-A-234 242);チル-(E)-2-{2-[6-(2-シア
ノフェノキシ)ピリミジン-4-イルオキシ]フェニル}-3-メトキシアクリレート(
“ICI A 5504”、“アゾキシストロビン”)(参照:EP-A-382 375);メ
チル-(E)-2-メトキシイミノ-2-[α-(o-トリルオキシ)-o-トリル]アセテー
ト(“BAS 490F”、“クレソキシムメチル”)(参照:EP-A-400 417);2-
(2-フェノキシフェニル)-(E)-2-メトキシイミノ-N-メチルアセトアミド)(参
照:EP-A-398692);[2-(2,5-ジメチルフェノキシメチル)-フェニル]-(E)-2
-メトキシイミノ-N-メチルアセトアミド)(参照:EP-A-398 692);(1R,3S/
1S,3R)−2,2-ジクロロ-N-[(R)-1-(4-クロロフェニル)エチル]-1-エチ
ル-3-メチルシクロプロパンカルボキサミド(“KTU 3616”)(参照:EP-A
-341 475);マンガンエチレンビス(ジチオカルバメート)ポリマー亜鉛錯体(“マ
ンゼブ”)(参照:US 2 974 156);1-[2-(2,4-ジクロロフェニル)-4-プロピ
ル-1,3-ジオキソラン-2-イルメチル]-1H-1,2,4-トリアゾール(“プロピ
コナゾール”)(参照:GB-1522657);1-{2-[2-クロロ-4-(4-クロロフェノキ
シ)フェニル]-4-メチル-1,3-ジオキソラン-2-イルメチル)-1H-1,2,4-
トリアゾール(“ジフェノコナゾール”)(参照:GB-209860);1-[2-(2,4-ジ
クロロフェニル)ペンチル-1H-1,2,4-トリアゾール(“ペンコナゾール”)(
参照:GB-1589852);シス-4-[3-(4-tert-ブチルフェニル)-2-メチルプロピ
ル]-2,6-ジメチルモルホリン(“フェンプロピモルフ”)(参照:DE 2752135);
1-[3-(4-tert-ブチルフェニル)-2-メチルプロピル]-ピペリジン(“フェンプ
ロピジン”)(参照:DE 2752135);4-シクロプロピル-6-メチル-N-フェニル-
2-ピリミジンアミン(“シプロジニル”)(参照:EP-A-310 550);(RS)-N-(2
,6-ジメチルフェニル-N-(メトキシアセチル)-アラニンメチルエステル(“メタ
ラキシル”)(参照:GB-1500581);(R)-N-(2,6-ジメチルフェニル-N-(メト
キシアセチル)-アラニンメチルエステル(“R-メタラキシル”)(参照:GB-15005
81);1,2,5,6-テトラヒドロ-4H-ピロロ[3,2,1-ij]キノリン-4-オン(
“ピロキロン”)(参照:GB-1394373);エチル水素ホスホネート(“ホセチル”)(
参照:C.Tomlin(編):The Pesticide Manual,10th edition,Farnhan,UK,19
94,pages 530-532);および水酸化銅(参照:C.Tomlin(編):
The Pesticide Manual,10th edition,Farnhan,UK,1994,pages 229-230)。
選択した殺菌剤は、好ましくは、製剤技術において常用の担体、界面活性剤ま
たは他の適用促進補助剤との組成物の形で防御対象の免疫調節化植物に適用する
。適切な担体および補助剤は、固形または液体であることができ、製剤技術で常
用の物質、例えば、天然のまたは再生した無機物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘
着性付与剤、結合剤または肥料である。
殺菌剤組成物の好ましい適用法は、表土より上に出た植物の部分、特に葉への
適用である(葉面塗布)。適用頻度および割合は、病原体の生物学的および気候的
生存条件によって変わる。しかしながら、植物のその部分を液体製剤に浸漬(例
えば、イネ栽培の場合)すれば、または殺菌剤を固形、例えば顆粒形態で土に入
れれば(土壌適用)、殺菌剤は土壌または水を経て根から植物本体に浸透できる(
全身性作用)。種子を処置するために、塊茎または穀粒を殺菌剤の液剤に浸漬す
るか、またはそれらに既に混合しておいた湿潤または乾燥製剤をコーティングす
ることにより種子に殺菌剤を適用することもできる(コーティング)。更に、特別
な場合では、例えば、芽または果実の房を対象とした処置などの他の適用法も可
能である。
殺菌剤は、非修飾形態でまたは、好ましくは製剤技術で常用の補助剤と共に使
用でき、そのため、既知のやり方で、例えば乳化可能な濃縮物、コーティング可
能なペースト、直接噴霧可能または希釈可能な溶液、希乳化剤、湿潤可能な粉末
、可溶性粉末、粉剤、顆粒に、または例えばポリマー物質内に封入することによ
り、製剤化する。組成物の性質に合わせたスプレー、噴霧、散布、分散、コーテ
ィングまたは注入(pouring)などの適用法が、意図する目的や主要環境に従って
選択される。殺菌剤の有利な適用割合は、普通、有効成分50gから2kg/ha、好
ましくは有効成分100gから1000g/ha、特に有効成分150gから700g/
haである。種子処置の場合、適用割合は種子100kg当り有効成分0.5gから1
000g、好ましくは5gから100gである。
製剤は、既知のやり方、例えば、殺菌剤を増量剤、例えば、溶媒、固形担体、
適切には、界面活性化合物(界面活性剤)と共に均一混合および/または摩砕する
ことにより製造する。
適切な溶媒は、芳香族炭化水素、好ましくは炭素原子8ないし12を含む画分
、例えば、キシレン混合物または置換ナフタレン、フタレート、例えば、ジブチ
ルフタレートまたはジオクチルフタレート、脂肪族炭化水素、例えば、シクロヘ
キサン、またはパラフィン、アルコールおよびグリコールおよびそのエーテルお
よびエステル、例えば、エタノール、エチレングリコール、エチレングリコール
モノメチルまたはモノエチルエーテル、ケトン、例えば、シクロヘキサノン、強
極性溶媒、例えば、N-メチル-2-ピロリドン、ジメチルスルホキシドまたはジ
メチルホルムアミド、並びに、植物油またはエポキシド化植物油、例えば、エポ
キシド化ココナッツ油またはダイズ油、または水である。
例えば、粉剤および分散可能粉末用に使用した固形担体は、普通、天然鉱物増
量剤、例えば、方解石、タルク、カオリン、モンモリロナイトまたはアタパルジ
ャイトである。物理的特性を向上するために、高分散化珪酸または高分散化吸収
性ポリマーを添加するこもできる。適切な顆粒状吸着性担体は、多孔性型であり
、例えば、軽石、煉瓦破片、海泡石またはベントナイトであり、適切な非吸着性
担体は、例えば、方解石または砂である。更に、無機または有機質の予め顆粒状
にした多数の材料、例えば、特に、ドロマイトまたは微粉化植物体が使用できる
。
殺菌剤の性質にもよるが、適切な界面活性化合物は、良好な乳化、分散および
湿潤特性を持つ非イオン性、カチオン性および/またはアニオン性界面活性剤で
ある。用語“界面活性剤”は、界面活性剤の混合物も含むと解釈される。
特に有利な適用促進補助剤もまた、セファリンやレシチン系の天然または合成
のリン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン
、ホスファチジルグリセロールおよびリゾレシチンである。
その農芸化学的組成物は、一般に、有効殺菌性成分0.1から99%、好まし
くは0.1から95%、固形または液体補助剤99.9から1%、好ましくは99
.9から5%、そして界面活性剤0から25%、好ましくは0.1から25%を含
む。
市販品は、好ましくは濃縮物として製剤化されるのに対し、最終消費者は普通
、希釈製剤を使用する。
B.植物活性化殺菌剤
上記第2または第3経路(選択的育種または遺伝子操作)で得られた免疫調節化
植物に適用するならば、その場合、殺菌剤は、ベンゾチアジアゾール化合物、イ
ソニコチン酸化合物、またはサリチル酸化合物などのSARの化学誘導物質(植
物活性化殺菌剤)であることができ、これらは米国特許第5,523,311およ
び5,614,395に記載されている。よって、2つの免疫調節法を同時に使用
する。植物活性化殺菌剤を選択的育種経路または遺伝子操作経路のいずれかで得
られた免疫調節化植物に適用することにより、“免疫外調節(extra-immuno-modu
lation)”が生じ、相乗的に増強される病害抵抗性がもたらされる。
下記のとおり、NIM1を過発現するトランスジェニック免疫調節化植物は、
PR-1遺伝子発現およびP.parasiticaに対する抵抗性により示されるように、
野生型植物と比べ、かなり低容量のBTHに対してかなり迅速に応答した。実施
例35と図3のノーザンブロット参照。NIM1過発現体における病害抵抗性の
相乗的増強は、普通なら効果を生むには全く不十分な濃度であるほんの10μM
のBTH塗布により達成できる。この相互依存性を利用すれば、普通なら植物有
毒性かあるいは望ましくない濃度のSAR誘導性化学品の使用を回避できる。更
に、SAR-誘導性化学品をNIM1過発現体などの既に免疫調節した植物に適
用する時に生じるSAR活性化の時間経過の変更も利用できる。また、所定レベ
ルの植物防御を提供するのに必要なSAR-誘導性化学品量を減らした結果、経
済的利益も認められる。
C.植物活性化殺菌剤に関連する常用の殺菌剤
一層顕著な病害抵抗性を求める場合、常用の殺菌剤と植物活性化殺菌剤の両方
を選択的育種経路または遺伝子操作経路のいずれかにより得られた免疫調節化植
物に適用してもよい。これにより、免疫調節単独、または免疫調節と殺菌剤1種
のみ、または両方の殺菌剤種(常用のものと植物活性化するもの)の同時塗布を経
て得られた病害抵抗性レベルに比べて一層高いレベルの相乗的病害抵抗性がもた
らされる。例えば、実施例19の表35参照。
病害抵抗性評価
病害抵抗性評価は、当分野で知られている方法により実施する。Uknes et al
,(1993)Molecular Plant Microbe Interactions 6:680-685;Gorlach et al.
,(1996)Plant Cell 8:629-643;A1exander et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 90:7327-7331(1993)参照。例えば、数種の代表的な病害抵抗性アッセイを下
記に説明する。
A.Phytophthora parasitica(タバコ疫病)抵抗性アッセイ
タバコ疫病の原因生物であるPhytophthoraparasjtjcaに対する抵抗性のアッセ
イは、Alexander et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7327-7331(1993)に
記載のように生育させた6週齢植物個体にて実施する。植物に水をかけ、十分に
排水させ、次いで、胞子嚢懸濁液10ml(300胞子嚢/ml)を土に適用すること
により植菌する。植菌済み植物を日中温度23−25℃、夜間温度20−22℃
に維持した温室で保存する。このアッセイに使用したしおれ指標(wiltindex)は
次のとおりである:0=兆候なし;1=兆候なし;1=少し萎れた状態で張りが
低下している;2=明らかに萎れているが、腐敗や矯化はない;3=明らかに萎
れて矯化しているが、見たところ茎は腐敗していない;4=重度に萎れており、
茎の腐敗が見られ、根系にも損傷がある;5=4と同様であるが、植物はほぼ死
滅状態かまたは死滅しており、根系も重度に縮小している。全てのアッセイは、
無作為に並べた植物個体にてブラインド評価する。
B.Pseudomonas syringae抵抗性アッセイ
Pseudomonas syringae pv.tabaci株#551をH2O中1ml当り106または3
×106の濃度で6−7週齢植物数体の低部の葉2枚に注射する。植物6個体を
各時点で評価する。Pseudomonas tabaci感染個体は5点病害重篤度規準で評価す
る。5=100%死滅組織、0=兆候なし。日ごとの評価ではT検定(LSD)を
行い、平均病害評点値にてらしてグループ分けする。評価日に同じ文字でつけた
値は、統計学的に有意な相異ではない。
C.Cercospora nicotianae抵抗性アッセイ
Cercospora nicotianae(ATCC#18366)の胞子懸濁液(1ml当り100
,000−150,000胞子)を葉の表面上に今にも表面流去するほど噴霧する
。この植物を湿度100%で5日間維持する。その後、植物に水を1日当り5−
10回、吹付ける。植物6個体を各時点で評価する。Cercospora nicotianaeは
病害兆候基準を示す葉面積%で評価する。日ごとの評価ではT検定(LSD)を行
い、平均病害評点値にてらしてグループ分けする。評価日に同じ文字でつけた値
は、統計学的に有意な相異ではない。
D.Peronospora parasitica抵抗性アッセイ
Peronospora parasiticaに対する抵抗性についてのアッセイは、Uknes et al
,(1993)に記載のとおり、植物個体にて実施する。植物にP.parasiticaの和合性
単離物を分生子懸濁液(1ml当りおよそ5×104胞子)の噴霧により植菌する。
植菌済み植物を生育室にて、湿潤条件下、17℃で日中14時間/夜間10時間
のサイクルでインキュベーションする。植菌後3−14日、好ましくは7−12
日目に分生子柄の存在について植物個体を検査する。更に、各処置ごとの植物か
ら数個体を無作為に選択し、顕微鏡検査用にラクトフェノールトリパンブルーで
染色する(Keogh et al.,Trans.Br.Mycol.Soc.74:329-333(1980))。
図面の簡単な説明
図1は、マウス、ウサギおよびブタ由来のIκBαを持つNIM1タンパク質配
列の配列アラインメント(sequence alignment)である。配列の上の垂直線(|)は
、NIM1とIκBα配列との間のアミノ酸同一性(マトリックススコアは1.5
に等しい)を示し;配列の上の二重点(:)は、類似性スコア>0.5を示し;配列
の上の一重点(・)は、類似性スコア<0.5、但し>0.0を示し;スコア<0.0
のときは、何ら類似性がないことを示し、配列の上にも何も記していない(実施
例参照)。哺乳動物IκBαアンキリンドメインの位置は、de Martin et al.,Ge
ne 152,253-255(1995)により同定された。配列内の小点は、NIM1とIκBα
タンパク質間のギャップを示す。IκBα中の5つのアンキリンリピートは、配
列
の下の破線で示す。アミノ酸は、適切に導入されたギャップを持つNIM1タン
パク質に関して番号付けする。アミノ酸10個毎に配列の上にプラス記号(+)を
付ける。
図2は、NIM1タンパク質(配列番号2のアミノ酸位置に対応する数)とES
Tタンパク質産物(配列番号17−24)の各領域のアミノ酸配列比較である。
図3は、水またはBTH処置した後の野生型およびNIM1過発現系列におけ
るPR-1遺伝子発現の時間経過を示すノーザン分析の結果を表す。RNAは、
実施例に記載のように処置植物から調製して、分析した。“Ws”は、野生型シ
ロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)Ws生態型である。“3A”、“5B”、
“6E”および“7C”は、実施例21に従い生産した個々のNIM1過発現植
物系列である。“0BTH”は水処置であり、“10BTH”は10μM BT
H処置であり、“100BTH”は100μM BTH処置である。“0”は、
ゼロ日対照サンプルであり、“1”、“3”および“5”は、1、3および5日
目のサンプルである。
配列表中の配列の簡単な説明
配列番号1は、野生型シロイヌナズナNIM1遺伝子のコード領域を含む56
55bpゲノム配列である。
配列番号2は、配列番号1のコード領域でコードされる野生型Arabidopsis th
aliana NIM1タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号3は、図1のマウスIκBαアミノ酸配列である。
配列番号4は、図1のラットIκBαアミノ酸配列である。
配列番号5は、図1のブタIκBαアミノ酸配列である。
配列番号6は、シロイヌナズナNIM1遺伝子のcDNA配列である。
配列番号7および8は、それぞれ、アミノ酸位置55および59でセリン残基
の代わりにアラニン残基を持つNIM1タンパク質の優性ネガティブ形態のDN
Aコード配列およびコード化アミノ酸配列である。
配列番号9および10は、それぞれ、N-末端欠失を持つNIM1タンパク質
の優性ネガティブ形態のDNAコード配列およびコード化アミノ酸配列である。
配列番号11および12は、それぞれ、C-末端欠失を持つNIM1タンパク
質の優性ネガティブ形態のDNAコード配列およびコード化アミノ酸配列である
。
配列番号13および14は、それぞれ、N-末端およびC-末端アミノ酸欠失の
両方を持つNIM1遺伝子の変化形態のDNAコード配列およびコード化アミノ
酸配列である。
配列番号15および16は、それぞれ、NIM1のアンキリンドメインのDN
Aコード配列およびコード化アミノ酸配列である。
配列番号17は、図2のイネ-1AA配列33−155である。
配列番号18は、図2のイネ-1AA配列215−328である。
配列番号19は、図2のイネ-2AA配列33−155である。
配列番号20は、図2のイネ-2AA配列208−288である。
配列番号21は、図2のイネ-3AA配列33−155である。
配列番号22は、図2のイネ-3AA配列208−288である。
配列番号23は、図2のイネ-4AA配列33−155である。
配列番号24は、図2のイネ-4AA配列215−271である。
配列番号25から32は、オリゴヌクレオチドプライマーである。
定義
下記の定義は、本発明の理解に役立つものである:
植物細胞: プロトプラストと細胞壁からなる、植物の構造的および生理学
的単位。“植物細胞”の用語は、植物の部分かまたは植物に由
来するもののいずれかのあらゆる細胞を表す。幾つかの細胞例
には、生存植物の部分である分化細胞;培養中の分化細胞;培
養中の非分化細胞;カルスまたは腫瘍などの非分化組織の細胞
;種子、胚、胎芽および花粉の分化細胞がある。
植物組織: 構造的および機能的単位内に組織された植物細胞群。生育中ま
たは培養中のどの組織も含まれる。この用語には、植物体全体
、植物器官、植物種子、組織培養および構造的および/または
機能的単位内に組織されたあらゆる植物細胞群があるが、これ
らに限定されない。上記のあるいはこの定義に含まれる具体的
な植物組織と共に、または具体例なしでこの用語を使用する場
合、
その他の植物組織の排除は意図していない。
プロトプラスト:細胞壁を持たない植物細胞。
子孫植物: 有性または無性的に派生する来世代植物で、後代植物を含むが
これに限定されない。
トランスジェニック植物:そのゲノム内に安定に組込まれた組換えDNAを持
つ植物。
組換えDNA:異種源由来のDNAセグメントと結合することにより形成され
、組換えDNA技術を用いて生産されたあらゆるDNA分子。
組換えDNA技術:インビトロで組換えDNAを生産し、この組換えDNAが
発現し増殖できるような細胞内にそれを移す技術(Concise Dic
tionary of Biomedicine and Molecular Biology,Ed.Juo,
CRC Press,Boca Raton(1996)参照)であり、例えば、DNAを
プロトプラストまたは細胞内に、例えば、(1)環状、直線状ま
たはスーパーコイル状の裸(naked)DNA、(2)ヌクレオソー
ムまたは染色体または核またはその部分に含まれるDNA、(
3)他の分子と複合体形成した、または会合したDNA、(4)
リポソーム、スフェロプラスト、細胞またはプロトプラストに
封入されるDNA、または(5)宿主生物以外の生物体(例えば
、Agrobacterium tumefiaciens)から移されたDNAを含む、
様々な形態で移す。組換えDNAを細胞に導入するこれらの方
法およびその他様々な方法が当分野で知られており、これらを
用いて本発明のトランスジェニック細胞またはトランスジェニ
ック植物を産生できる。
組換えDNA技術はまた、Treco et al.,WO94/12650および
Treco et al.,WO95/31560に記載の相同組換え法も含み、これ
らは、単子葉植物におけるペルオキシダーゼ活性を高めるのに
応用できる。具体的には、調節領域(例えば、プロモーター)を
植物ゲノムに導入して、内生ペルオキシダーゼの発現を高める
ことができる。
組換えDNA技術に含まれるものには、選択発現シグナルを
欠くペルオキシダーゼコード配列の単子葉植物への挿入や、単
子葉植物内の内生制御配列によりペルオキシダーゼの発現を増
大するトランスジェニック単子葉植物アッセイがある。これに
より、植物内でのペルオキシダーゼコード配列のコピー数の増
加がもたらされる。
組換えDNAのRO植物のゲノムへの初期挿入は、従来の植
物育種法では達成されないが、むしろ本明細書に記載の技術法
によれば達成される。初期挿入後は、実質的に従来の育種法を
用いてトランスジェニック子孫を繁殖させることができる。
キメラ遺伝子:元の状態では会合していない少なくとも2つの異種部分、例え
ば、元のDNA配列に由来する部分、を含むDNA分子であり
、これらの配列は、好ましくは組換えDNA技術を用いて作ら
れる。
発現カセット:プロモーターおよびターミネーターを含み、その間にコード配
列が挿入され得る、DNA分子。
コード配列: 転写および翻訳されたときに、ポリペプチドまたはタンパク質
の形成をもたらすDNA分子。
遺伝子: 発現、即ち転写および翻訳の制御を担う調節DNA配列と、転
写および翻訳されて不連続のポリペプチドまたはタンパク質を
与えるコード配列とを含む別個の染色体領域。
acd: 加速細胞死(accelerated cell death)変異体植物
AFLP: 増幅断片長多型。
avrRpt2: Pseudomonas syringaeから単離した非毒性遺伝子Rpt2。
BAC: 細菌性人工染色体
BTH: ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオン酸-S-メチ
ルエステル
CIM: 構成的免疫(Constitutive IMmunity)表現型(SARは構成的に
活性化される)
cim: 構成的免疫変異体植物
cM: センチモルガン
cpr1: PR遺伝子変異体植物の構成的発現体
Col-O: シロイヌナズナ生態型Columbia
ECs: 酵素組合せ
Emwa: シロイヌナズナのWs-O生態型において和合性のPeronospora
parasitica単離物
EMS: スルホン酸エチルメタン
INA: 2,6-ジクロロイソニコチン酸
Ler: シロイヌナズナ生態型Landsberg erecta
lsd: 病変擬態病(lesion simulating disease)変異体植物
nahG: サリチル酸をカテコールに変換するサリチル酸ヒドロキシラー
ゼPseudomonas putida
NahG: nahG遺伝子で形質転換させたシロイヌナズナ系列
ndr: 非-種特異的病害抵抗性(non-race-specific disease resistan
nce)変異体植物
nim: 非誘導性免疫(non-inducible immunity)変異体植物
NIM1: SARシグナル伝達カスケードに関連する、野生型遺伝子
NIM1: 野生型NIM1遺伝子によりコードされるタンパク質
nim1: 植物へ病害感受性を与える、NIM1の変異体対立遺伝子。N
IM1のnim1変異体対立遺伝子を持つ変異体シロイヌナズナ
植物とも呼ぶ。
Noco: シロイヌナズナのCol-O生態型において和合性のPeronospora
parasitica単離物
ORF: オープンリーディングフレーム
PCs: プライマー組合せ
PR: 病原関連
SA: サリチル酸
SAR: 全身性獲得抵抗性
SAR-オン: SARを活性化した免疫調節化植物で、典型的に野生型SAR
遺伝子発現を示し、病害抵抗性表現型を持つ。
SSLP: 単配列長多型。
UDS: 万病感受性表現型
Wela: シロイヌナズナのWeiningen生態型において和合性のPeronospo
ra parasitica単離物
Ws-O: シロイヌナズナ生態型Issilewskija
WT: 野生型
YAC: 酵母人工染色体
実施例
本発明を、下記詳細な手順、製造および実施例により更に詳しく例示説明する
。この実施例は、単なる例示であって、本発明の範囲を限定すると解釈されるも
のではない。
ここで使用する標準的な組換えDNAおよび分子クローニング技術は、当分野
でよく知られており、Sambrook,et al.,Molecular Cloning,eds.,Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)およびT.J.Silh
avy,M.L.Berman,and L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Col
d Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)およびAusubel,F
.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,pub.by Greene Publ
ishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)に記載されている。
I.常用の殺菌剤と全身性獲得抵抗性の化学的誘発物質を植物に同等に
適用することにより達成される相乗的病害抵抗性効果
この組の実施例では、ベンゾチアジアゾールなどのSAR化学的誘発物質の適
用により植物にSARを誘発させた。更に、常用の殺菌剤をこの植物に適用した
。次いで、植物を様々な病原体由来の病圧にかけた。病原に対抗する両方法の組
合せ(誘発性化学品+殺菌剤)により、加算した以上の、即ち、相乗的な病害抵抗
性が生じた。これは、相乗係数(SF)、即ち、予測した(E)効果に対する観測し
た(O)効果の比率として測定した。
有効成分を所定通り組合せた場合に予測される効果(E)は、いわゆる、コルビ
ー(Colby)式で記載でき、下記のように計算できる(Colby,S.R.,“Calculatin
g synergistic and antagonistic responses of herbicide combination”,Weed
s,Vol.15,pages 20-22(1967)):
ppm=スプレー混合物リットル当り有効成分(=a.i.)ミリグラム
X=有効成分p ppmの適用比で有効成分Iにより引き起こされる作用%
Y=有効成分q ppmの適用比で有効成分IIにより引き起こされる作用%
E=有効成分p+q ppmの適用比で有効成分I+IIの予測される効果(加算
作用)
実施例1:オオムギでのErysiphe graminisに対する作用
残余防御作用:高さ約8cmのオオムギ植物個体に水性スプレー混合物(有効成
分最大0.02%)をしずくが落ちるまで噴霧し、3ないし4日後、真菌分生子を
散布した。この感染個体を22℃で温室内に立てておいた。真菌感染は、一般に
、感染後10日で評価した。
全身性作用:高さ約8cmのオオムギ個体に水性スプレー混合物(土壌容量に対
し有効成分最大0.002%)をかけた。スプレー混合物が土面上に出た植物の部
分に接触しないよう用心した。この個体に、3ないし4日後、真菌分生子を散布
した。この感染個体を22℃で温室内に立てておいた。真菌感染は、一般に、感
染後10日で評価した。
表1
オオムギでのErysiphe graminisに対する作用
成分I:ベンゾチアジアゾール-7-カルボン酸
成分II:メトコナゾール
表2
オオムギでのErysiphe graminisに対する作用
成分I:ベンゾチアジアゾール-7-カルボン酸
成分II:テトラコナゾール 表3
オオムギでのErysiphe graminisに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:メトコナゾール
実施例2:Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用
10ないし14日の栽培期間後、キュウリ植物個体に噴霧した。3ないし4日
後、この個体を真菌の胞子懸濁液(1.0×105胞子/ml)に感染させ、高湿度、
温度23℃で30時間インキュベーションした。次いで、インキュベーションを
正常湿度で22℃ないし23℃で継続した。感染後7ないし10日で、真菌侵入
(infestation)に基づき防御作用の評価を行った。
10ないし14日の栽培期間後、試験化合物の湿潤性粉末製剤から調製したス
プレー混合物の土壌塗布によりキュウリ植物個体を処置する。3ないし4日後、
この個体を真菌の胞子懸濁液(1.5×105胞子/ml)に感染させ、高湿度、温度
23℃で30時間インキュベーションした。次いで、インキュベーションを正常
湿度、22℃で継続した。感染後7ないし10日で、真菌侵襲に基づき防御作用
の評価を行った。
表4
Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用/葉面適用
成分I:ベンゾチアジアゾール-7-カルボン酸
成分II:アゾキシストロビン
表5
Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用/土壌塗布
成分I:ベンゾチアジアゾール-7-カルボン酸
成分II:アゾキシストロビン *相乗係数SFは算出できない。
表6
Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用/葉面塗布
成分I:ベンゾチアジアゾール-7-カルボン酸
成分II:クレソキシムメチル
表7
Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用/葉面塗布
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:アゾキシストロビン 表8
Cucumis sativus L.でのColletotrichum lagenariumに対する作用/土壌塗布
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:アゾキシストロビン
実施例3:タバコ植物でのCercospora nicotianaeに対する作用
タバコ植物個体(6週齢)に試験化合物の製剤溶液(濃度:有効成分最大0.02
%)を噴霧した。処置後4日目、個体にCercospora nicotianaeの胞子嚢懸濁液(
150,000胞子/ml)を植菌し、4ないし5日間高湿度で維持し、次いで、更
に正常な昼/夜順序でインキュベーションした。この試験では、真菌に感染した
葉表面からその症状を評価した。
表9
タバコ植物でのCercospora nicotianaeに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:テブコナゾール
表10
タバコ植物でのCercospora nicotianaeに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:シプロコナゾール 表11
タバコ植物でのCercospora nicotianaeに対する作用
成分I:ベンゾチアジアゾール-7-カルボン酸
成分II:フェンプロピモルフ
表12
タバコ植物でのCercospora nicotianaeに対する作用
成分I:ベンゾチアジアゾール-7-カルボン酸
成分II:ジフェノコナゾール
実施例4:イネ植物でのPyricularia oryzaeに対する作用
約2週齢のイネ植物個体を根周辺の土と一緒に、スプレー混合物を満たした容
器内にいれた(有効成分最大0.006%)。96時間後、イネ植物を真菌の分生
子懸濁液で感染させた。感染個体を相対湿度95−100%、24℃で5日間イ
ンキュベーションした後、真菌侵入について評価した。
表13
イネ植物でのPyricularia oryzaeに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:KTU3616
12m2の区画上で、有効成分の湿潤性粉末により調製したスプレー混合物を
イネ植物に噴霧した。感染は自然に起こった。評価のために、真菌に感染した葉
面積を適用後44日目に測定した。下記の結果が得られた:
表14
屋外のイネ植物でのPyricularia oryzaeに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:ピロキロン
約2週齢のイネ植物を根周辺の土と一緒に、スプレー混合物を満たした容器内
にいれた。36日後、真菌侵入を評価した。非処置個体の侵入は、0%の作用に
相当した。
表15
イネ植物でのPyricularia oryzaeに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:トリシクラゾール
実施例5:トウガラシでのColletotrichum sp.(炭疽病)および
Cercospora sp.(斑点病)に対する作用
農産物収穫量における作用:約10m2の土地区画(試験区画:Cikampek,
Java,Indonesia)で、トウガラシ植物個体に、計7回、約7日間隔で1ヘクター
ル当り500−700リットルのスプレー混合物を噴霧した。最初の噴霧から3
日後、この個体に真菌を人工感染させた。
表16
Colletotricumに対する作用:5回目の噴霧後、トウガラシの実における侵入を
査定するこにより評価した。
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:マンゼブ
表17
Cercosporaに対する作用:6回目の噴霧後、葉における侵入を査定するこにより
評価した。
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:マンゼブ
表18
農産物収穫量に対する作用:6回目の噴霧後、トウガラシを収穫した。
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:マンゼブ 実施例6:コムギでのPuccinia reconditaに対する作用
7週齢のコムギ植物個体に、製剤化有効成分または有効成分の組合せから調製
したスプレー混合物をしずくが落ちるまで噴霧した。4日後、処置個体を真菌の
分生子懸濁液で感染させ、その処置個体を続いて相対大気湿度90−100%、
20℃で2日間インキュベーションした。感染後10日で真菌侵入を評価した。
表19
コムギでのPuccinia reconditaに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:プロピコナゾール
表20
コムギでのPuccinia reconditaに対する作用
成分I:ベンゾチアジアゾール-7-カルボン酸
成分II:フェンプロピジン 実施例7:コムギでのErysiphe graminisに対する作用
野外実地試験(10m2)では、増殖期の冬コムギに、湿潤性粉末により調製し
た有効成分のスプレー混合物を噴霧した。感染は自然に起こった。感染後10日
で、真菌侵入を査定した。次の結果が得られた:
表21
コムギでのErysiphe graminisに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:プロピコナゾール
表22
コムギでのErysiphe graminisに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:シプロジニル 実施例8:バナナでのMycosphaerella fijiensisに対する作用
300m2区画のバナナ植物個体40本に、17−19日間隔で、湿潤性粉末
で調製した有効成分のスプレー混合物を計6回噴霧した。感染は自然に起こった
。評価のために、真菌に感染させた葉を測定した。下記の結果が得られた:
表23
バナナでのMycosphaerella fijiensisに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:プロピコナゾール
実施例9:トマトでのAlternaria solaniに対する作用
7m2区画のトマト個体に、7日間隔で、有効成分の湿潤性粉末で調製したス
プレー混合物を計9回噴霧した。感染は自然に起こった。評価のために、真菌に
感染させた葉を測定した。下記の結果が得られた:
表24
屋外のトマトでのAlternaria solaniに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:シプロジニル
実施例10:トマトでのPhytophthora infestansに対する作用
トマト栽培品種“Roter Gnom”に、製剤有効成分または有効成分の組合せから
調製したスプレー混合物をしずくが落ちるまで噴霧した。4日後、処置植物個体
に真菌の分生子懸濁液を噴霧し、続いて相対大気湿度90−100%、18−2
0℃で2日間、キャビネット内でインキュベーションした。感染後5日で真菌侵
入を評価した。下記の結果が得られた:
表25
トマトでのPhytophthora infestansに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:メタラキシル
表26
トマトでのPhytophthora infestansに対する作用
成分I:ベンゾチアジアゾール-7-カルボン酸
成分II:メタラキシル
実施例11:キュウリでのPseudoperonospora cubensisに対する作用
16−19日齢のキュウリ植物個体(“Wisconsin”に、製剤有効成分または有
効成分の組合せから調製したスプレー混合物をしずくが落ちるまで噴霧した。4
日後、処置個体をPseudoperonospora cubenswas(株365、ciba:ml当り最大5
000)の胞子嚢で感染させ、続いて処置個体相対大気湿度70−90%、18
−20℃で1−2日間インキュベーションした。感染後10日で真菌侵入を評価
し、非処置植物での侵入と比較した。下記の結果が得られた:
表27
キュウリでのPseudoperonospora cubensisに対する作用
成分I:ベンゾチアジアゾール-7-カルボン酸
成分II:メタラキシル
実施例12:タバコ植物でのPeronospora tabacinaに対する作用
タバコ植物体(6週齢)に、試験化合物の製剤溶液を噴霧した。処置後4日で、
その個体に真菌の胞子嚢懸濁液を植菌し、高湿度で4ないし5日間維持し、次い
で、正常な昼/夜順序で更にインキュベーションした。この試験では、真菌に感
染した葉表面の症状を評価した。非処置個体の侵入は0%の作用に相当した。
表28
タバコ植物でのPeronospora tabacinaに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:ジメトモルフ
実施例13:シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)での
Peronospora parasiticaに対する作用
それぞれ25%、80%、70%、および25%有効成分(ai)として湿潤性粉
末担体と共に製剤化した殺菌剤メタラキシル、ホセチルおよび水酸化銅、SAR
活性化剤ベンゾ(1,2,3)-チアジアゾール-7-カルボチオン酸S-メチルエステ
ル(BTH)を細かい霧状で3週齢植物個体の葉に適用した。対照としては湿潤性
粉末単独を適用した。3日後、Delany et al.(1995)に記載のように、植物個体
にPeronospora parasitica分生子懸濁液を植菌した。Ws植物には、同等のP.p
arasitica単離物Emwa(1−2×105胞子/ml)を植菌し;Col植物には、同等のP
.parasitica単離物Noco(0.5−1×105胞子/ml)を植菌した。植菌後、各植
物個体にカバーを付けて高湿度を維持し、パーシバル培養室に17℃、昼14時
間/夜10時間のサイクルで置いた(Uknes et al.,1993)。植菌後8日目に組織
を回収した。
12日間、分生子柄の発生を記録するために解剖顕微鏡で観察して、真菌感染
経過を追跡した(Delaney,et al.(1994);Dietrich,et al.(1994))。個々の葉
をラクトフェノールトリパンブルー染色し、葉組織内の真菌増殖を観察した。真
菌増殖は、プライマーNS1とNS2および鋳型としてP.parasitica単離物
Emwa DNAを用いるWhite et al.(1990;PCR Protocols:A guide to Methods an
d Application,315-322)のPCRにより得られたrRNA真菌プローブを用い
て定量した。RNAは、塩化リチウム沈殿、次いでフェノール/クロロホルム抽
出により凍結組織から精製した(Lagrimini et al,1987:PNAS,84:7542-7546)。
サンプル(7.5ug)は、Ausbel et al.(1987)に記載のように、ホルムアルデヒ
ドアガロースゲルによる電気泳動で分離し、ナイロン膜(Hybond-N+,Amersham)
にブロットした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、Church and Gilbert(1
984,PNAS,81:1991-1995)に従った。転写物の相対量は、Phosphor Imager(Mole
cular Dynamics,Sunnyvale,CA)を用いて製造元指導書に従い測定した。剥がし
たフィルターブロットを構成的に発現したb-チューブリン シロイヌナズナcD
NAsでプローブすることにより、サンプル充填物を正規化した。
非処置植物の侵入は、0%の真菌増殖阻害に相当した。下記の結果が得られた:
表29
シロイヌナズナ(Col-0)でのPeronospora parasitica NoCo2に対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:メタラキシル
表30
シロイヌナズナ(Ws)でのPeronospora parasitica Emwaに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:メタラキシル 表31
シロイヌナズナ(Ws)でのPeronospora parasitica Emwaに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:ホセチル
表32
シロイヌナズナ(Ws)でのPeronospora parasitica Emwaに対する作用
成分I:ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸-S-メチルエステル
成分II:水酸化銅
表29から理解できるように、相乗的病害抵抗性効果は、野生型シロイヌナズ
ナCol−0植物で示された。0.01mM BTHまたは0.0001g/Lメタラキ
シルのいずれかをその植物個体に別個に適用しても、なんら真菌増殖阻害は観察
されなかったが、これは、通常ならこれらの濃度では効果をあげるのに不十分だ
からである。しかしながら、これらの化合物の両方を通常なら不十分な濃度で植
物個体に適用すると、40.7%の真菌増殖阻害が観察された。これは明らかに
相乗的作用である。表30−32は、野生型シロイヌナズナWs植物における相
乗的病害抵抗性作用を示す。0.01mM BTHをWs植物に適用すると、20
−30%の真菌増殖阻害しか観察されなかった。しかしながら、BTHおよびメ
タラキシル、ホセチル、または水酸化銅のいずれかを植物個体に同時適用するこ
とにより、相乗的病害抵抗性が観察された。これらの複合的な抗真菌作用は、病
原体制御に必要な殺真菌剤やBTHの有効濃度の低減をもたらし、真菌増殖を抑
制するのに必要な化学用量を下げることができるので、化学品耐性による葉面損
傷負担を緩和する。
II.常用の殺菌剤および/または全身性獲得抵抗性の化学的誘発物質を
構成的免疫(CIM)変異体植物に適用することによる
相乗的病害抵抗性効果
この組の実施例では、正常増殖に際して高濃度のPR-1 mRNAを持つ変異
体植物を同定するために、これらの変異体もまた全身性獲得抵抗性を示すという
見解をもって、高処理量ノーザンブロットスクリーンを展開した。このスクリー
ンの使用により多数の変異体が単離されており、これらはPR-1だけでなくP
R-2およびPR-5 mRNAも蓄積することが示されている(Lawton et al.(1
993);Dietrich et al.(1994);and Weymann et al.(1995))。これらの変異体も
また、高レベルのSAを持ち、病原体感染に対して抵抗性であるので、この方法
によりSARシグナル形質導入変異体を単離できることを確認する。
このスクリーンを用いて2種のSARシグナル形質導入変異体が単離されてい
る。1種は、lsd変異体(lsd=病変擬態病(lesion simulating disease))と呼ぶ
。この種の変異体は、出典明示によりその全体を本明細書の一部とした、WO9
4/16077に開示のように、“I型cim”とも呼ばれる。このlsd種(別名I型
cim)は葉上に自発的病変を形成し、高濃度のSA、高レベルのPR-1、PR-2
およびPR-5mRNAを蓄積し、真菌および細菌病原体に対して抵抗性である(
Dietrich et al.,1994;Weymann et al.,1995)。
第2種はcim(cim=構成的免疫(constitutive immunity))と呼ばれ、下記のよ
うに、自発的病変以外の、lsd変異体の特徴全てを持つ。この第2種(cim)は、W
O94/16077に開示の“II型cim”に相当する。下記のcim3変異体植物系
列は、このcim(II型cim)に分類され、安定で高レベルのSA、SAR遺伝子mR
NAを発現し、広範囲の病害抵抗性を持つという野生型の様相を持った優性変異
である。
実施例14:構成性SAR遺伝子発現によるcim変異体の単離および特性化
1100個体のM2突然変異誘発(EMS)シロイヌナズナ植物をおよそ100
組、Araconトレイ(Lehie Seeds,Roud Rock,TX)にて生育させた。水をやりすぎ
たり、病原体に感染させることのないよう特に注意して、Uknes et al.,1993,
前掲に記載のとおり植物個体を生育させた。要約すると、Metro Mix 360を水で
飽和させ、10リットルバッチで70分間3回オートクレーブにかけた。オート
クレーブ処理毎にこの混合物を入念に撹拌した。種子を20%Clorox中で5分間
表面滅菌し、滅菌水を7回取り替えて洗浄した後に播種した。植込んだ種子を3
−4日間春化処理し、22℃、昼9時間、夜15時間の培養室で生育させた。植
物個体が3ないし4週齢になったら、1、2枚の葉、重量50ないし100mgを
集め、全RNAを迅速ミニRNA調製(Verwoerd et al.(1989)Nuc.Acid.Re
s.17,2362)により単離した。PR-1遺伝子発現は、ノーザンブロット分析(La
grimini et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7542-7546;Ward et
al.,1991)により分析した。植物個体の各組には、非処置のシロイヌナズナCol-
0と2日INA-処置(0.25mg/ml)した対照も含まれた。全ての個体をWeymann
et al.,(1995)に記載のように保持した。
高レベルのPR-1 mRNAを蓄積していると推定される80の変異体を同定
した。後代試験(descendants testing)の後、5個体を選択して更に特性化した
。推定cim変異体は、病原体の不在下または誘発処置なしで高いSAR遺伝子発
現を示した。推定cim変異体の後代試験により、構成性PR-1発現が遺伝性であ
ることを確認した。cim変異体のうち、PR-1を最高かつ最も安定に発現したci
m2およびcim3の2種を更に特性化した。
Columbiaへの戻し交雑では、F1後代同定用のマーカーとして劣性無毛特性を
利用した。花粉が付く(pollen shed)前にCol-gl1花芽を除雄し、直後および翌
日に変異体由来の花粉を塗布した。F1個体を土壌で生育させ、トリコームが存
在するかどうかで他配個体を同定した。
cim2およびcim3を生態型Col-0またはLa-erに交配させた後、大部分のF1
個体が高度にSAR遺伝子を発現することが分かり、これらの特徴は優性である
ことが示された。cim2の場合、全てではないが幾つかのF1個体は、構成性S
AR遺伝子発現を示した。cim2変異体が優性であり、ヘテロ接合体として親個
体に担持されているならば、このような結果が予測されることもある。更に、ci
m2の遺伝子試験は、不完全な浸透度(penetrance)と矛盾しない、F2世代にお
ける継続した変化性の分離を示した。
cim3は、F1世代における1:1分離を示し、その上、高レベルのPR-1m
RNAを発現する2個体のF1が自家受粉してF2集団を形成した。PR-1m
RNA蓄積を評価することにより得られたF2分離は、3.7:1の比率(c2=
1.77;0.5>P>0.1)で、高PR-1 mRNAを持つF2個体93と有意
なPR-1 mRNAを持たないF2個体25を示し、これは、cim3が優性の
単一遺伝子変異であるという仮説と矛盾しない。その後の他配により、cim3が
優性変異として遺伝されることを確認した。
cim3の場合、元のM2個体はそのスクリーンにおいて同一であり、M3集団
は正常な外観であった。しかしながら、cim3個体を自家受粉したところ、最も
良好に発現した系列の中には、稔性の低いものがあった。Col-gl1の戻し交雑の
後、外観および稔性が正常でPR-1を強力に発現する個体が得られた。
最初に同定したとき、cim3はまた、薄くて歪みのある葉を持ち、僅かに矮小
化したように見えた。しかしながら、生態型Col-gl1との交雑から得られたF2
個体は、高SAR遺伝子発現を保持し、野生型植物と区別できなかった。これに
より、矮小化して葉の歪んだ表現型は構成的SAR遺伝子発現に関連しない無関
係の変異によって引き起こされたことが示された。cim3変異表現型はまた、滅
菌条件下で植物個体を生育させた場合にも観察され、よって、PR-1 mRNA
蓄積が病原体によって引き起こされるのではないことが確認された。
実施例15:SAR遺伝子発現
PR-1以外に、他のSAR遺伝子2種、PR-2およびPR-5もまた、cim3
中で高度に発現される。SAR遺伝子発現レベルは子孫間で変化するが、常に非
処置対照よりも10倍以上高く、野生型植物の抵抗性誘発INA(0.25mg/ml)
処置後に得られたレベルと類似した。
実施例16:サリチル酸分析
シロイヌナズナではSAの内生濃度が病原体誘発性壊死の後に増加することが
示されている(Uknes et al.,1993,前掲)。サリチル酸とそのグルコースコンジ
ュゲートは、Uknes et al.,1993に記載のようにして分析した。葉組織を4週齢
のcim3 10個体と対照10個体から集めた。個々の植物個体から葉を集めて、
PR-1遺伝子発現について分析した。PR-1を発現する個体のSAレベルを測
定した。cim3中の遊離SA濃度は、非感染野生型シロイヌナズナよりも3.4倍
高かった(それぞれ、233±35対69±8ng/g新鮮重量)。SAのグルコース
コンジュゲート(SAG)は、cim3では非感染野生型シロイヌナズナよりも13.
1倍高かった(それぞれ、4519±473対344±58ng/g新鮮重量)。これ
らのSAおよびSAGの増加レベルは、病原体感染組織またはcpr変異体の
いずれかについて報告されているレベルに匹敵する。
実施例17:病害抵抗性
シロイヌナズナの露菌病の原因であるPeronospora parasitica(NoCo2)に対
する抵抗性についてcim3を評価した。cim3(PR-1 RNA発現により確認し
た)30個体と対照(生態型Columbia)30個体、それぞれ約4週齢のものに、Ukn
es,et al.,1992,前掲に記載のとおり、P.parasiticaを植菌した。7日後、K
eogh et al.(1980)Trans.Br.Mycol.Soc.74,329-333とKoch and Slusare
nko(1990)Plant Cell 2,437-445に記載のとおり、各個体の胞子形成について
分析するため、トリパンブルーで染色して、真菌構造を可視化した。野生型(Col
-0)植物は菌糸、分生子、卵胞子の増殖を持続させたが、INA(0.25mg/ml)
で処置した野生型植物とcim3植物はなんら真菌増殖を示さなかった。cim3媒介
抵抗性は、典型的には、小グループの死亡細胞として病原体感染部位にみられる
。このタイプの抵抗性は、lsd変異体(Dietrich et al.,1994,前掲;Weymann et
al.,1995,前掲)またはSARを誘発させた野生型植物(Uknes et al.,1992,
前掲)でみられるものと類似する。時折、cim3植物では中間の抵抗性表現型が観
察され、菌糸先端を追うように壊死の跡があった。この壊死の跡は、低用量のS
AまたはINAで処置した野生型植物でみられるものと類似する(Uknes et al.
,1992,前掲;Uknes et al.,1993,前掲)。しかしながら、cim3植物では胞子形
成は全くみられないが、対照植物は全て胞子形成を示した。非植菌cim3葉では
、トリパンブルーで染色しても自発的病変はなんら観察されなかった。
真菌病原体P.parasiticaに対する抵抗性以外に、cim3は、細菌病原体Pseudo
monas syringae DC3000による感染に対しても抵抗性であった。6週齢の野生型(
±INA処置)およびcim3植物にP.syringae DC3000の懸濁液を植菌し、感染葉
から抽出した細菌の増殖を経時監視することにより病害の進行を追跡した。0日
目または2日目のCol-0、Col-0+INAおよびcim3の細菌力価の相異は、統
計学的には有意でなかった。しかしながら、4日目までに、野生型とcim3植物
との間の細菌増殖において31倍の減少があった(P<0.003;Sokal and Roh
lf,1981)。各植物個体の病害症状については可視的にも検査した。野生
型植物由来の葉は、初期感染範囲以外にも病害症状が広く蔓延した重度のクロロ
シスであった。反対に、INAで前処理した野生型植物またはcim3植物のいず
れかは、ほとんど病害症状がなかった。
この実施例の場合、Pseudomonas syringae pv.トマト株DC3000の培養物は、リ
ファムピシン(50μg/ml)を加えたキングB培地(寒天平板または液体)にて28
℃で増殖させた(Walen et al.,(1991),Plant Cell 3,49-59)。一晩培養した
ものを10mM MgCl2に1ml当り細胞2−5×105の密度まで希釈および懸濁
させ、シロイヌナズナの葉に注射した。注射は、28ゲージの針で葉の中ほどに
小孔を作り、次いで、希釈細菌溶液およそ250μlを1ccシリンジで注射する
ことにより実施した。様々な時点で、それぞれの処置植物10個体から、#1コ
ルクボーラーで無作為に切り貫いた3個のリーフディスク(leaf punch)からなる
10の無作為サンプルを得た。3個のリーフディスクを10mM MgCl2300μ
lと共にエッペンドルフ管に入れ、乳鉢で磨り潰した。得られた細菌懸濁液を適
切に希釈し、リファムピシン(50μg/ml)を加えたキングのB培地で平板培養し
、28℃で4日間増殖させた。細菌コロニーを数え、、データをステューデント
t検定分析にかけた(Sokal and Rohlf(1981),Biometry,2nd ed.New York:W.
H.Freeman and Company)。
この実施例の場合も、2,6-ジクロロイソニコチン酸(INA)を、湿潤性粉末
に製剤化した25%有効成分として滅菌希釈水に懸濁させた(0.25mg/ml、3
25μM;Kessmann et al.,(1994)Annu.Rev.Phytopathol.32,439-59)。
全ての植物個体に水またはINA溶液を今にも流れだすほど噴霧した。
実施例18:SAR遺伝子発現および病害抵抗性におけるSAの役割
cim3におけるSA、SAR遺伝子発現と抵抗性との関係を調査するため、サ
リチル酸ヒドロキシラーゼ(nahG)遺伝子を発現するシロイヌナズナ植物個体で
交雑を行った(Delaney et al.,1994)。これらの“NahG植物”は、Agrobacteri
um媒介形質転換を用いて35S制御化nahG遺伝子をシロイヌナズナ内に形質転
換することによって作った。Huang,H.Ma,H.(1992)Plant Mol.Biol.Rep
.10,372-383、出典明示により本明細書の一部とする;Gaffney,et
al.,(1993)Science 261,754-756、出典明示により本明細書の一部とする;
およびDelaney et al.(1994)Science 266,1247-1250、出典明示により本明
細書の一部とする、参照。Col-nahGシロイヌナズナは、優性nahG遺伝子以外に
優性カナマイシン耐性遺伝子を持つので、Col-nahGを花粉ドナーとして使用し
た。F1種子に水を30分間含ませ、次いで、10%Clorox、0.5%ツイーン
20中5分間表面滅菌し、滅菌水で十分に洗浄した。種子を25mg/mlカナマイ
シン含有発芽培地(KOHと共に0.5g/L2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸
で緩衝化した10g/Lショ糖含有GM、ムラシゲおよびスクーグ培地、pH5.
7)で平板培養し、F1個体を選択した。Valvekens et al.(1988)Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 85,5536-5540参照。18日後にカナマイシン耐性F1個体を
土に移す。ノーザンブロット分析により全ての実験においてnahG遺伝子の存在
とPR-1発現を確認した。
cim3変異体とnahG表現型の両方が優性であるため、2つの遺伝子間の上位性
は、F1個体で分析できた。cim3×nahG交雑由来のF1個体70をPR-1お
よびnahG遺伝子発現について分析した。mRNA発現のノーザンブロット分析
において、nahG遺伝子の存在はSAR遺伝子発現の抑制と相関した。得られた
F2分離体(segregant)中のPR-1 mRNAを評価することにより、各F1に
おけるcim3の存在を確認した。
cim3変異が病害抵抗性に関し、nahGより上位であるかどうかを測定するため
、nahGの存在およびPR-1 mRNAの不在について確認されているcim3×na
hG交雑由来のF1個体5を自家受粉させ、20−30個のF2種子を植えた。
nahGの存在およびPR-1mRNAの発現は、このF2集団由来の各個体にて分
析し、その後、P.parasitica(NoCo2)で攻撃してその病害感受性を評価した。c
im3により与えられる病害抵抗性は、nahG遺伝子の存在によって排除され、こ
のことは、nahGがSAR遺伝子発現および病害抵抗性表現型についてcim3より
上位であることを示す。
実施例19:殺菌剤および/またはBTHをcim変異体に
適用することにより獲得される相乗的病害抵抗性
病原体植菌の3日前に、湿潤性粉末担体で有効成分(ai)25%として処方した
全身性獲得抵抗性の化学的誘発物質BTH(ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7
-カルボチオン酸-S-メチルエステル)(Metraux et al.,1991)および/または有
効成分25%として処方した殺菌剤メタラキシル(CGA48988)または湿潤
性粉末単独を微細ミストとして4週齢植物個体の葉に適用した。植物個体に和合
性病原体Peronospora parasitica NoCo2の分生子懸濁液(1.8×105胞子/ml)
を植菌した。植菌後、植物個体にカバーをかけて高湿度を保ち、Percival培養室
に17℃、昼14時間/夜10時間のサイクルで置いた(Uknes et al.,1993)。
植菌後8日で、組織を集めた。
真菌増殖は、White et al.(1990;PCR Protocols:A guide to Methods and Ap
plication,315-322)のPCRにより得られたrRNA真菌プローブを用いて測
定した。凍結組織からフェノール/クロロホルム抽出、次いで塩化リチウム沈殿
によりRNAを精製した(Lagrimini et al.,1987:PNAS,84:7542-7546)。Ausbe
l et al.(1987)に記載のようにして、サンプル(7.5ug)をホルムアルデヒドア
ガロースゲルでの電気泳動により分離し、ナイロン膜(Hybond-N+,Amersham)へ
ブロットした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄はChurch and Gilbert(1984
,PNAS,81:1991-1995)に従った。転写物の相対量は、Phosphor Imager(Molecul
ar Dynamics,Sunnyvale,CA)とその製造元指示書に従い測定した。剥がしたフ
ィルターブロットを構成的に発現されたb-チューブリン シロイヌナズナcDN
Aでプローブすることにより、サンプル充填物を正規化した。非処置植物個体の
侵入は、0%の真菌増殖阻害に相当した。
メタラキシル単独、“植物活性化剤”BTH単独、またはメタラキシルとBT
Hの両方を上記cim3変異体に適用すると、加算した以上の、即ち相乗的な病害
抵抗性効果を生んだ。この効果は、予測(E)された効果に対する観察された(O)
効果の比率である相乗係数(SF)として測定した。下記の結果が得られた:
表33
シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用
成分I:cim3変異
成分II:メタラキシルwt=野生型Col-0
ND=測定されず
表34
シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用
成分I:cim3変異
成分II:BTH
wt=野生型Col-0
ND=測定されず
表35
シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用
成分I:cim3変異
成分II:BTHとメタラキシル(M)
wt=野生型Col-0
ND=測定されず
上の表から理解できるように、相乗的病害抵抗性効果は、cim3植物において
メタラキシル単独の適用、BTH単独の適用、およびメタラキシルおよびBTH
の併用塗布の場合で示された。例えば、非処置cim3植物では、非処置野生型植
物に対して真菌増殖阻害12.5%であり、このことは、cim3変異体における構
成性SAR遺伝子発現が病害抵抗性に相関することを表している。しかしながら
、表30に示されているように、メタラキシルを0.0001g/l(普通なら効果
を上げるには不十分な濃度)で免疫調節化(SAR-オン)cim3植物植物に適用す
る
と、観測される真菌増殖阻害レベルは57.8%まで増加した。これらのデータ
から算出した相乗係数4.6は、明らかに、殺菌剤を免疫調節化植物に適用する
ことにより相乗効果が達成されたことを示す。
表31に与えたデータは、相乗性がBTHなどの全身性獲得抵抗性の化学的誘
発物質を免疫調節化(SAR-オン)cim3植物植物に適用しても達成されることを
示す。例えば、野生型植物では、0.03mM濃度のBTHは、普通なら、効果
的な病害抵抗性を付与するには不十分であり、ほんの20.8%の真菌増殖阻害
を与える程度である。しかしながら、cim3植物では、この普通なら不適当なB
HT濃度でも、効果的な推奨濃度の0.1mM BTHで得られる阻害レベルとほ
ぼ同程度に高い73.1%の真菌増殖阻害を与えた。表31のデータから算出し
た相乗係数2.2は、明らかに、この相乗効果がBTHを既に他の手段で免疫調
節しておいた植物に適用すると達成されることを示す。
病害抵抗性における効果は、BTHとメタラキシルをcim3植物に併用適用す
るとより一層劇的であった。上記実施例13(表29)に記載のように、野生型植
物において、0.01mM BTHまたは0.0001g/lメタラキシルのいずれか
を別個に適用しても、これらの濃度は普通なら効果を生むには不十分であるため
、なんら真菌増殖阻害は達成されない。しかしながら、これらの化合物両方を普
通なら不十分な濃度で植物個体に塗布すると、野生型植物では相乗効果である4
0.7%の真菌増殖阻害が観測された。cim3植物では、0.01mM BTHおよ
び0.0001g/lメタラキシルの同時塗布により、100%の真菌増殖阻害がも
たらされ、明らかに更に一層の相乗的作用を示している。
このように、免疫調節化cim植物と、普通なら不十分な低濃度の化学品とを併
用した病害抵抗性の獲得は有利であり、農業分野の当業者ならば明らかである。
本明細書に示した相乗性を利用すれば、普通ならば毒性であるか、または望まし
くない濃度の化学品の使用を回避できる。更に、植物を所定レベルまで防御する
のに必要な化学品量が減った結果として、経済的利益も実感できる。
III.常用の殺菌剤および/または全身性獲得抵抗性の化学的誘発物質を
NIM1遺伝子の各形態を含むトランスジェニック植物に
適用することによる、相乗的病害抵抗性効果
NIM1遺伝子は、植物における全身性獲得抵抗性(SAR)経路のキイ成分で
ある(Ryals et al.,1996)。NIM1遺伝子は、化学的および生物学的誘発物質
によるSARの活性化と関連しており、かかる誘発物質と共に、SARおよびS
AR遺伝子発現にとって必要である。NIM1遺伝子の所在は、宿主植物に広範
囲の病原体に対する極度の感受性を付与して、病原体およびSARの化学的誘発
物質に応答できないようにする、変異体nim1遺伝子を持つことが知られている
変異体植物ゲノムの分子生物学的分析により測定されている。野生型NIM1遺
伝子産物(配列番号2)は、シグナル伝達カスケードに関与して、シロイヌナズナ
におけるSARと遺伝子毎の(gene-for-gene)病害抵抗性の両方を導く(Ryals et
al.,1997)。NIM1の野生型形態の組換え過発現が構成的免疫(CIM)表現
型の免疫調節化植物を生じさせ、そうしてトランスジェニック植物中に病害抵抗
性を付与する。増加レベルの活性NIM1タンパク質は、BTH、INAおよび
SAなどの誘発性化学品による化学的誘発と同程度の病害抵抗性効果を生む。同
時係属中米国出願08/880,179、出典明示により本明細書の一部とする、
参照。
更に、NIM1遺伝子産物は、哺乳動物シグナル伝達因子IκBサブクラスα
の構造的相同体であることが示されている(Ryals et al.,1997)。IκBの変異
は、NF-κB/IκBレギュレーション機構のスーパーレプレッサーまたは優性
ネガティブとして働くと記載されている。よって、NIM1の変化形態はSAR
シグナル伝達経路の優性ネガティブレギュレーターとして働く。これらのNIM
1の変化形態は、nim1変異体としてその変化形態により形質転換させた植物に
おいて反対の表現型を付与する。即ち、NIM1の変化形態で形質転換させた免
疫調節化植物は、構成性SAR遺伝子発現とCIM表現型を示す。同時係属中の
PCT出願“METHODS OF USING THE NIM1 GENE TO CONFER DISEASE RESISTANCE
IN PLANTS”、出典明示により本明細書の一部とする、参照。
実施例20:野生型NIM1遺伝子を含有する
コスミドクローンによる植物の形質転換
コスミドD7(ATCC97736として1996年9月25日、ATCCに
寄託)はNIM1遺伝子領域にわたるクローンから作られているため、野生型N
IM1遺伝子(配列番号1)を含む。コスミドE1もNIM1遺伝子領域にわたる
クローンから作られているため、野生型NIM1遺伝子(配列番号1)も含む。米
国特許出願08/880,179に記載のように、コスミドD7およびE1をヘル
パー株HB101(pRK2013)との三親交配(tri-parental mating)におけ
る接合伝達によりAgrobacterium tumefaciens AGL-1に移した。次いで、こ
れらのコスミドを用いて真空浸透(vacuum infiltration)によりカナマイシン感
受性nim1変異体シロイヌナズナ系列を形質転換した(Mindrinos et al.,1994,
Cell 78,1089-1099)。浸透化植物(infiltrated plants)の種子を集め、選択因
子として50mg/mlカナマイシンを含むGM寒天平板で発芽させた。平板培養か
らおよそ2週間後に選択に耐えた実生を土に移した。
土に移した植物個体を移転後およそ1週間フィトトロン中で生育させた。植物
全体に完全にかかるよう、霧吹きで300mM INAを微細ミストとして適用
した。2日後、RNA抽出およびPR-1発現分析用に葉を集めた。次いで、こ
の植物にPeronospora parasitica(単離物EmWa)を噴霧し、生育室で高湿度条
件下、昼19℃/夜17℃、明8時間/暗16時間のサイクルで生育させた。真菌
感染後8ないし10日で、真菌増殖についてポジティブであるかネガティブであ
るかを評価し、記録した。Wsおよびnim1植物を各実験の対照とするため、同
様に処置した。
LiCl/フェノール抽出緩衝液を用いて、集めた組織から全RNAを抽出した(Ve
rwoerd et al.,1989,Nuc.Acid.Res.2362)。RNAサンプルをホルムアルデ
ヒドアガロースゲルに流し、GeneScrees Plus(DuPont)膜にブロットした。ブロ
ットを32P-標識PR-1cDNAプローブとハイブリダイズさせた。得られたブ
ロットをフィルムに曝し、どの形質転換体がINA処置後にPR-1発現を誘発
できるかを測定した。
挿入部位(位置)効果によりどのD7およびE1形質転換体もNIM1を過発現
するかどうかを調べるため、D7またはE1コスミドを含有する主要な形質転換
体を自家受粉させ、T2種子を集めた。1つのE1系列と95のD7系列の種子
を土に播種し、上記のように生育させた。T2個体に少なくとも4枚の真葉が出
たら、各個体毎に別々に1枚づつ集めた。RNAをその組織から抽出し、PR-
1およびNIM1発現について分析した。次いで、植物個体にP.parasitica(E
mWa)を植菌し、感染後10日で真菌増殖について分析した。多数の形質転換
体が正常以下の真菌増殖を示し、そのうちの4個体、即ち、系列D7-2、D7-
74、D7-89およびE1−1は目に見える真菌増殖を全く示さなかった。正
常より高いNIM1およびPR-1発現を示し、かつ真菌抵抗性を示した植物個
体は、NIM1の過発現が病害抵抗性を付与することを示している。
実施例21:その天然プロモーター下でのNIM1過発現
NIM1遺伝子を構成的に発現する植物は、1.4kbのプロモーター配列を
含有するBamHI-HindIII NIM1ゲノム断片(配列番号1−塩基1249−56
55)をもつWs野生型植物の形質転換から作られた。この断片をpSGCG0
1内にクローニングし、Agrobacterium株GV3101内に形質転換させた(pM
P90,Koncz and Schell(1986)Mol.Gen.Genet.204:383-396)。Ws植物
を上記のように浸透化(inflated)させた。得られた種子を回収し、50μg/mlカ
ナマイシン含有GM寒天上で平板培養した。生き残った苗木を土に移し、上記の
ように、Peronospora parasitica単離物Emwaに対する抵抗性について試験し
た。選択した植物個体を自家受粉させて、二連続世代について選択し、ホモ接合
性系列を作った。これら数種の系列に由来する種子を土に播種し、一系列当り1
5−18個体を3週間生育させ、誘発性化学品で前処置することなく、Emwa
抵抗性について再度試験した。真菌処置後、およそ24時間、48時間および5
日で、各系列毎に組織を集めてプールし、凍結させた。植物個体は、Emwaに
対する抵抗性について評価したら、植菌後10日まで生育室に残しておいた。
集めたサンプル全てからRNAを調製し、前述のように分析した(Delaney et
al.,1995)。ブロットをシロイヌナズナ遺伝子プローブPR-1にハイブリダイ
ズさせた(Uknes et al.,1992)。分析した13のトランスジェニック系列のうち
5個体は、早期にPR1遺伝子発現誘発を示した。これらの系列の場合、PR-
1 mRNAは、真菌処置後24または48時間まで明らかにそれと分かった。
これら5系列はまた、目に見える真菌増殖を示さなかった。上記のように葉をラ
クトフェノールブルーで染色(Dietrich et al.,1994)して、葉の中に真菌の菌
糸がないことを確かめた。PR-1遺伝子発現は、その他8系列では48時間ま
でに誘発されず、これらの植物個体は、Emwaに対する抵抗性を示さなかった
。
抵抗性系列のサブセットも、Uknes et al.(1993)に記載のように、細菌性病
原体Pseudomonas syringae DC3000に対する抵抗性の増大について試験し、抵抗
性スペクトルを評価した。実験は、実質的にLawton et al.(1996)に記載のよう
にして行った。細菌増殖は、Emwaに対する構成的抵抗性も示した系列では遅
かった。このことは、その天然プロモーター下でNIM1遺伝子を過発現する植
物個体は病原体に対して構成的免疫を持つことを示す。
これらの系列におけるCIM表現型の更なる特徴を評価するために、非感染植
物個体を遊離のグルコースコンジュゲート化サリチル酸について評価し、葉をラ
クトフェノールブルーで染色して、微視的病変の存在について評価した。抵抗性
個体をNahGおよびndr1などのSAR変異体と有性交配させ、他の変異体に対す
る抵抗性表現型の上位関係を確立し、これらのNIM1有性ネガティブ変異体が
どのようにサリチル酸依存性フィードバックループに影響を与え得るかを評価し
た。
実施例22:NIM1の35S制御化過発現
全長NIM1 cDNA(配列番号6)をpCGN1761 ENXのEcoRI部位
にクローニングした(Comai et al.(1990)Plant Mol.Biol.15,373-381)。
得られたプラスミドから、増強CaMV 35Sプロモーター含有Xba1断片、正確な
転写配向のNIM1 cDNAおよびtml3'ターミネーターを得た。この断片を
バイナリーベクターpCIB200内にクローニングし、GV3101内で形質
転換させた。Ws植物は前述のように浸透化させた。得られた種子を集め、50
μg/mlカナマイシン含有GM寒天にて平板培養した。生き残った苗木を土に移し
、上記のように試験した。選択した植物個体を自家受粉させて、二連続世代につ
いて選択し、ホモ接合性系列を作った。試験した58系列のうち9系列は、
化学品前処置なしにEmwaで処置すると、抵抗性を示した。よって、NIM1
cDNAの過発現によっても病害抵抗性植物は生じる。
実施例23:NIM1はIκBαの相同体である
NIM1遺伝子産物がIκBαの相同体であることを測定することにより、N
IM1およびIκBのタンパク質遺伝子産物間の多重配列アラインメント(multi
ple sequence alignment)を実施した(図1)。配列相同性調査は、BLAST(Al
tschul et al.,J.Mol.Biol.215,403-410(1990))を用いて行った。この多重
配列アラインメントは、DNASTAR社(Madison,WI)のLasergeneバイオコン
ピューティング・ソフトウェア・パッケージの一部であるClustal V(Higgins et
al.,CABIOS 5,151-153(1989))を用いて構築した。アラインメントに使用した
配列はNIM1(配列番号2)、マウスIκBα(配列番号3;GenBank受託番号:
1022734)、ラットIκBα(配列番号4;GenBank受託番号:57674
およびX63594;Tewari et al.,Nucleic Acids Res.20,607(1992))およ
びブタIκBα(配列番号5;GenBank受託番号:Z21968;de Martin et a
l.,EMBO J.12,2773-2779(1993);GenBank受託番号517193,de Martin e
t al.,Gene 152,253-255(1995))であった。Clustal分析に使用したパラメータ
ーは、10のギャップペナルティーと10のギャップ長ペナルティーであった。
進化論的分岐距離は、PAM250加重表を用いて算出した(Dayhoff et al.,“A mode
l of evolutionary change in proteins.Matrices for detecting distant rel
ationships.”In Atlas of Protein Sequence and Structure,Vol.5,Suppl.
3,M.O.,Dayhoff,ed(National Biomedical Research Foundation,Washingto
n,D.C.),pp.345-358(1978))。残基類似性は、修飾Dayhoff表を用いて算出し
た(Schwartz and Dayhoff,“A model of evolutionary change in proteins.”
In Atlas of Protein Sequence and Structure,M.O.Dayhoff,ed(National Bi
omedical Research Foundation,Washington,D.C.)pp.353-358(1979);Gribsko
v and Burgess,Nucleic Acids Res.14,6745-6763(1986))。
相同性調査は、アンキリン、NF-κBおよびIκBを含む数種のタンパク質
のアンキリンドメインに対するNIM1の類似性を示す。最も全体的な相同性は
、IκBおよび関連分子に対するものである(図1)。NIM1はアミノ酸位置5
5および59にセリン2つを含有し、その59位のセリンは、リン酸化依存性ユ
ビキチン媒介誘発性分解での役割に矛盾しない情況(D/ExxxxS)および位置(N
-末端)にある。全てのIκBは、これらのN-末端セリンを持ち、IκBの不活
性化やその後のNF-κBの放出に必要とされる。NIM1はアンキリンドメイ
ン(アミノ酸262−290および323−371)を持つ。アンキリンドメイン
は、タンパク質-タンパク質相互作用に関与すると考えられており、IκBおよ
びNF-κB分子の偏在的特徴である。IκBのC-末端は、類似していなくても
よい。NIM1は、あるIκBのC-末端でみられるQL-豊富領域(アミノ酸4
91-499)にある程度相同性である。
実施例24:NIM1変化形態の作製−
セリン残基55および59のアラニン残基への変化
ヒトIκBにおけるセリン残基のリン酸化は、IκBの刺激活性化分解に必要
とされ、それによってNF-κBを活性化する。ヒトIκBにおけるセリン残基(
S32−S36)のアラニン残基への突然変異誘発は、刺激誘導性リン酸化を阻
害するため、IκBαプロテオソーム媒介分解をブロックする(E.Britta-Maree
n Traenckner et al.,EMBO J.14:2876-2883(1995);Brown et al.,Science 26
7:1485-1488(1996);Brockman et al.,Molecular and Cellular Biology 15:280
9-2818(1995);Wang et al.,Science 274:784-787(1996))。
このIκBαの変化形態は、NF-κBを細胞質中に保持することにより、優
性ネガティブ形態として機能するので、下流のシグナル形成事象をブロックする
。NIM1とIκBとの間の配列比較によれば、NIM1のセリン55(S55)
および59(S59)は、ヒトIκBαにおいて、S32およびS36と相同であ
る。NIM1の優性ネガティブ形態を構築するために、アミノ酸位置55および
59のセリンをアラニン残基へと突然変異誘発させる。これは、当業者には知ら
れているどの方法でも、例えば、クイックチェンジ部位指向性突然変異誘発キッ
ト(#200518:Strategene)を用いて実施できる。
42bpの5'非転写配列(UTR)と187bpの3'UTRを含む全長NIM
1 cDNA(配列番号6)を使えば、その突然変異誘発構築物は、下記のプライ
マー(配列番号6;192−226位):5'-CAA CAG CTT CGA AG
C CGT CTT TGA CGC GCC GGA TG-3'(配列番号25)およ
び5'-CAT CCG GCG CGT CAA AGA CGG CTT CGA A
GC TGT TG-3'(配列番号26)、下線付き塩基は変異を示す、を用いて製
造元指導書により作ることができた。方法は次のとおりである:ベクターpSE
936内でクローニングしたNIM1 cDNA(Elledge et al.,Proc.Nat.A
cad.Sci.USA 88:1731-1735(1991))を変性させ、変化塩基含有プライマーをア
ニーリングする。DNAポリメラーゼ(Pfu)は、ニック形成環状鎖をもたらす非
鎖状置換(non-strand displacement)によりプライマーを伸長させる。DNAをD
pnIでの制限エンドヌクレアーゼ消化し、メチル化部位のみを切断する(非突然
変異誘発化鋳型DNA)。残りの環状dsDNAをE.コリ株XL1-ブルー内に形質
転換させる。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、配列決定して、変異塩
基の存在を立証し、他の変異は起こっていないことを確認する。
突然変異誘発化NIM1 cDNAを制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化し
、カリフラワーモザイクウイルスの二重35Sプロモーターの転写調節下でpC
GN1761内にクローニングした。35Sプロモーター、NIM1 cDNA
およびtmlターミネーターを含む形質転換カセットを、XbaIでの部分制限消化に
よりpCGN1761から解離させ、XbaIに連結させ、脱リン酸化pCIB2
00のXbaI部位に連結させる。配列番号7と8は、NIM1遺伝子のこの変化
形態のDNAコード配列とコード化アミノ酸配列それぞれを示す。
実施例25:NIM1変化形態の作製−N-末端欠失
K21、K22、S32およびS36を含むヒトIκBαのアミノ酸1−36
(Brockman et al.;Sun et al.)または1−72(Sun et al.)の欠失は、トランス
フェクション化ヒト細胞培養物において優性ネガティブIκBα表現型をもたら
す。NIM1 cDNAのコード化産物の先頭のおよそ125アミノ酸のN-末端
欠失により、強力なユビキチン化部位として働き得る8つのリジン残基が除去
され、またS55およびS59の推定リン酸化部位も除去される(実施例2参照)
。この変化遺伝子構築物は、当業者には知られているどの方法でも作ることがで
きる。例えば、Ho et al.,Gene 77:51-59(1989)の方法を用いて、最初のおよそ
125アミノ酸をコードするDNAが欠失しているNIM1形態を作ることがで
きる。次のプライマーにより、1612bp PCR産物(配列番号6:418な
いし2011)を作る:5'-gg aat tca-ATG GAT TCG GTT GTG
ACT GTT TTG-3'(配列番号27)および5'-gga att cTA CAA A
TC TGT ATA CCA TTG G-3'(配列番号28)、合成開始コドンに
は下線(ATG)を付し、EcoRIリンカー配列は小文字である。断片の増幅には、
最終容量50ml中、0.1から100ngの鋳型DNA、10mMトリスpH8.3
/50mM KCl/2mM MgCl2/0.001%ゼラチン/0.25mM各dN
TP/0.2mM各プライマーと、1ユニットrTth DNAポリメラーゼを含む反
応混合物とPerkin Elmer Cetus 9600 PCR機を利用する。PCR条件は、下記
のとおりである:94℃3分:35×(94℃30秒:52℃1分:72℃2分)
:72℃10分。PCR産物はpCR2.1ベクター(Invitrogen)内に直接クロ
ーニングする。PCRベクター中のPCR作製挿入物は、二重35Sプロモータ
ーの転写調節下で、EcoRIを用いる制限エンドヌクレアーゼ消化により解離させ
、脱リン酸化pCGN1761のEcoRI部位に連結させる。構築物の配列を決定
して、合成開始ATGの存在を立証し、その他の変異がPCR中に起こらなかっ
たことを確認する。35Sプロモーター、修飾NIM1 cDNAおよびtmlター
ミネーターを含む形質転換カセットをXbaIでの部分制限消化によりpCGN1
761から解離させ、pCIB200のXbaI部位に連結させる。配列番号9お
よび10は、それぞれ、N-末端アミノ酸欠失を持つNIM1遺伝子の変化形態
のDNAコード配列とコード化アミノ酸配列を示す。
実施例26:NIM1の変化形態の作製−C-末端欠失
ヒトIκBのアミノ酸261−317の欠失は、C-末端におけるセリンおよ
びトレオニン残基の構成性リン酸化をブロックすることにより、本来備わってい
る安定性の増強をもたらすと考えられる。セリンおよびトレオニンに富む領域は
、
NIM1のC-末端のアミノ酸522−593に存在する。NIM1遺伝子のC-
末端コード領域は、アミノ酸522−593をコードするヌクレオチド配列を欠
失することにより修飾できる。Ho et al.(1989)の方法を用いて、NIM1 c
DNAのC-末端コード領域と3'UTR(配列番号6:1606−2011)をP
CRにより欠失させ、次のプライマー:5'-cggaattcGATCTCTTTAAT
TTGTGAATTT C-3'(配列番号29)および5'-ggaattcTCAACAG
TT CATAATCTGGTCG-3'(配列番号30)、合成停止コドンには下
線を付し、EcoRIリンカー配列は小文字である、を用いて1623bp断片を作
製する。PCR反応成分は前述の通りであり、サイクリングパラメーターは次の
とおりである:94℃3分:35×(94℃30秒:52℃30秒:72℃2分)
;72℃10分。PCR産物はpCR2.1ベクター(Invitrogen)内に直接クロ
ーニングする。PCRベクター中のPCR作製挿入物は、EcoRIを用いる制限エ
ンドヌクレアーゼ消化により解離させ、二重35Sプロモーターを含有する脱リ
ン酸化pCGN1761のEcoRI部位に連結させる。構築物の配列を決定して、
合成フレーム内停止コドンの存在を立証し、その他の変異がPCR中に起こらな
かったことを確認する。プロモーター、修飾NIM1 cDNAおよびtmlターミ
ネーターを含む形質転換カセットをXbaIでの部分制限消化によりpCGN17
61から解離させ、pCIB200のXbaI部位に連結させる。配列番号11お
よび12は、それぞれ、C-末端アミノ酸欠失を持つNIM1遺伝子の変化形態
のDNAコード配列とコード化アミノ酸配列を示す。
実施例27:NIM1変化形態の作製−N-末端/C-末端欠失キメラ
NIM1のN-末端およびC-末端欠失形態は、819位のユニークKpnI制限
部位を用いて作製する(配列番号6)。N-末端欠失形態(実施例25)は、EcoRI/
KpnIで制限エンドヌクレアーゼ消化し、修飾N-末端に相当する415bp断片
をゲル電気泳動により回収する。同様にC-末端欠失形態(実施例26)は、EcoR
I/KpnIで制限エンドヌクレアーゼ消化し、修飾N-末端に相当する790bp
断片をゲル電気泳動により回収する。この各断片を15℃で連結させ、EcoRIで
消化して、EcoRIコンカテマーを排除し、脱リン酸化pCGN176
1のEcoRI部位にクローニングする。NIM1のN/C-末端欠失形態は、二重3
5Sプロモーターの転写調節下にある。同様に、C-末端欠失に融合させたS5
5/S59突然変異誘発化推定リン酸化部位(実施例24)からなるNIM1のキ
メラ形態を作る。構築物は上記のようにして作る。構築物の配列を決定し、開始
および停止コドンの適合度(fidelity)を立証し、クローニング中に変異が起こら
なかったことを確認する。35Sプロモーター、NIM1キメラおよびtmlター
ミネーターを含む形質転換カセットをXbaIでの部分制限消化によりpCGN1
761から解離させ、脱リン酸化pCIB200のXbaI部位に連結させる。配
列番号13および14は、それぞれ、N-末端およびC-末端アミノ酸欠失両方を
持つNIM1遺伝子の変化形態のDNAコード配列とコード化アミノ酸配列を示
す。
実施例28:NIM1の変化形態の作製−アンキリンドメイン
NIM1は、およそアミノ酸103−362でアンキリンモチーフとの相同性
を示す。Ho et al.(1989)の方法を用い、推定アンキリンドメインをコードする
DNA配列(配列番号1:3093−3951)を、次のプライマー:5'-ggaatt
caATGGACTCCAACAACACCGCCGC-3'(配列番号31)および
5'-ggaattcTCAACCTTCCAAAGTTGCTTCTGATG-3'(配列
番号32)を使用して、NIM1 cDNA(配列番号6:349−1128)から
PCR増幅する(条件:94℃3分:35×(94℃30秒:62℃30秒:72
℃2分):72℃10分)。得られた産物をEcoRIで制限エンドヌクレアーゼ消化
し、次いで、脱リン酸化pCGN1761のEcoRI部位に二重35Sプロモータ
ーの転写調節下でスプライシングする。構築物の配列を決定して、合成開始コド
ン(ATG)、フレーム内停止コドン(TGA)の存在を立証し、PCR中に他の変
異が起こらなかったことを確認する。35Sプロモーター、アンキリンドメイン
およびtmlターミネーターを含む形質転換カセットをXbaIでの部分制限消化によ
りpCGN1761から解離させ、脱リン酸化pCIB200のXbaI部位に連
結させる。配列番号15および16は、それぞれ、NIM1のアンキリンドメイ
ンのDNAコード配列とコード化アミノ酸配列を示す。
実施例29:キメラ遺伝子の構築
NIM1変化形態の適切な空間的かつ時間的発現の見込みを増加させるために
、NIM1プロモーターおよび遺伝子を含有する4407bp HindIII/BamHI断
片(配列番号1:塩基1249−5655)および/または5655bp EcoRV/Bam
HI断片(配列番号1:塩基1−5655)を使用して、上記実施例24−28の
NIM1変化形態を作製する。構築段階は異なるが、その概念は前述の実施例に
相当する。変化形態の強力な過発現は、潜在的に致死性であるかもしれない。そ
のため、実施例24−28に記載したNIM1遺伝子の変化形態は、内生NIM
1プロモーター以外の、nosプロモーターまたはRubiscoプロモーターの小さいサ
ブユニットを含むがこれらに限定されない、プロモーターの調節下に置くことが
できる。同様に、NIM1変化形態は、病原体応答プロモーターPR-1の調節
下に発現させることができる(米国特許5,614,395)。このような発現に
より、病原体攻撃またはその他のSAR活性化条件下でのみNIM1変化形態を
強力に発現させることができる。更に、病害抵抗性は、通常ならばSARを活性
化しないSAR活性化剤化合物(即ち、BTHまたはINA)の濃度で処置して、
フィードバックループを活性化した場合、PR-1プロモーター調節下でNIM
1変化形態を発現する形質転換体では、はっきりと分かる(Weymann et al.,(1
995)Plant Cell 7:2013-2022)。
実施例30:NIM1の変化形態のシロイヌナズナへの形質転換
作製した構築物(実施例24−29)をGV3101株への電気穿孔法によりア
グロバクテリウム ツメファシエンスへ移す。これらの構築物は、真空浸透(Min
drinos et al.,Cell 78,1089-1099(1994))または標準の根形質転換によりシロ
イヌナズナ生態型Col−0およびWs−0を形質転換するのに使用される。こ
れらの植物の種子を採取し、選択試薬としてカナマイシン(または他の適切な抗
生物質)を用いて寒天プレート上に発芽させる。形質転換された苗木のみが選択
試薬を無毒化して、生存し得る。選択後に残った実生を土壌に移し、CIM(構
成的免疫)表現型について試験する。観察可能な表現型相違について植物個体を
野生型個体と比較評価する。
実施例31:野生型NIM1遺伝子またはNIM1遺伝子の変化形態
により形質転換した植物におけるCIM表現型の評価
各一次形質転換体から1枚の葉を採取し、RNAを単離し(Verwoerd et al.
,1989,Nuc Acid Res,2362)、RNAブロット分析(Uknes et al.,1992)に
より構成的PR−1発現について試験する。構成的SAR発現分析の指標となる
病害抵抗性反応の増強について各形質転換体を試験をする(Uknes et al.,1992
)。2つの和合性P.parasitica単離物、EmwaおよびNoco(すなわち、これらの真
菌株は野生型Ws−0およびCol−0植物にそれぞれ病害をおこす)から5−
10×104胞子/mlの分生子懸濁液を準備し、形質転換体にその生態型に応じた
適切な単離物を噴霧する。植菌ずみ植物を高湿度で7日間インキュベーションす
る。植物は7日目に罹病するとし、真菌感染測定法を提供するプローブを用いた
RNAブロット分析のため1枚の葉を採取した。
CIM表現型を示す形質転換体をT1世代とし、ホモ接合性個体を同定する。
形質転換体を下記のような一連の病害抵抗性試験に付す。NocoおよびEmwaによる
真菌感染を繰り返し、Dietrich et al.,(1994)に記載のような真菌菌糸の存在
を同定するためにラクトフェノールブルーで葉を染色する。細菌病原体Pseudomo
nas syringae DC3000で形質転換体を感染させ、Uknes et al.(1993)に記載のよ
うな抵抗性スペクトルを評価する。遊離のおよびグルコースコンジュゲートした
SAの両方について非感染植物を評価し、微細な病変の存在を評価するためにラ
クトフェノールブルーを用いて葉を染色する。抵抗性植物個体をSAR変異体、
例えばNahG(米国特許第5,614,395号)およびndl1と有性交雑し、他の変異体に
対する抵抗性表現型の上位関係を確認し、これらのNIM1の優性ネガティブ変
異体がどのようにSA依存フィードバックループに影響するか評価する。
実施例32:NIM1相同体の単離
シロイヌナズナ由来の全NIM1遺伝子に対して、または好ましくは、そのコ
ード配列の隣接部分を少なくとも長さ約10ヌクレオチド含むシロイヌナズナN
IM1遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドプローブに対して適度なストリンジ
ェント条件下でハイブリダイズするNIM1相同体は入手可能である。ハイブリ
ッドの安定性に影響を与える要因により、ハイブリダイゼーションのストリン
ジェンシーが決まる。このような要因の一つは、融解温度Tmであり、DNA PROBE
S,George H.Keller and Mark M.Manak,Macmillan Publishers Ltd,1993,S
ection one:Molecular Hybridization Technology;page 8 ffに記載の式に従っ
て容易に計算できる。好ましいハイブリダイゼーション温度は、計算した融解温
度Tmから下約25℃の範囲であり、好ましくは計算した融解温度Tmから下約1
2−15℃の範囲であり、オリゴヌクレオチドの場合は、計算した融解温度Tm
から下約5−10℃の範囲である。
NIM1 cDNA(配列番号6)をプローブとして使用して、限定するわけ
ではないが、例えば下記実施例33のような異なる農産物由来のゲノムまたはc
DNAライブラリーをスクリーニングすることによってシロイヌナズナNIM1
の相同体を同定する。これを成し遂げる標準技法には、平板培養したDNAライ
ブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング(プラークまたはコロニーの
いずれか;参照、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,eds.,Cold S
pring Harbor Laboratory Press.(1989))およびオリゴヌクレオチドプライマー
を使用したPCRによる増幅(参照、例えば、Innis et al.,PCR Protocols ,a Guide to Methods and Applications
eds.,Academic Press(1990))がある。
同定した相同体を、本明細書の発現ベクター内へ遺伝子操作し、および上記の農
産物内に形質転換する。試験対象の農産物個体の関連病原体を使用して、形質転
換体の増強病害抵抗性について評価する。
キュウリ、トマト、タバコ、トウモロコシ、小麦、大麦のゲノムにおけるNI
M1相同体はDNAブロット分析により検出されている。ゲノムDNAをキュウ
リ、トマト、タバコ、トウモロコシ、小麦、大麦から単離し、酵素BamHI、HindI
II、XbaIまたはSaIIにより制限消化し、0.8%アガロースゲル上で電気泳動に
より分離させ、毛管ブロッティングによりナイロン膜に吸着させる。DNAを固
定させるために紫外線照射した後、低ストリンジェンシー条件[(1%BSA;
520mM NaPO4、pH7.2;7%ラウリル硫酸ナトリウム塩;1mM ED
TA;250mM塩化ナトリウム)55℃で18−24時間]で32P放射標識した
シロイヌナズナNIM1 cDNAと膜をハイブリダイズする。ハイブリダイゼ
ーションの後、ブロットを低ストリンジェンシー条件[55℃で15分間6
×SSC(×3)15分間3×SSC(×1);1×SSCは0.15M NaCl
、15mMクエン酸Na(pH7.0)]で洗浄し、NIM1に対応するバンドを可
視化するためにX線フィルムにさらす。
さらに、NIM1遺伝子との類似性によって同定された発現配列タグ(EST)
を用いて相同体を単離できる。例えば、いくつかのイネ発現配列タグ(EST)
は、NIM1遺伝子との類似性によって同定されてきた。多重複配列アラインメ
ントはDNA*(1228 South Park Street,Madison Wisconsin,53715)Laserge
ne Biocomputing Software package for the Macintosh(1994)の一部としてClus
tal V(Higgins,Desmond G.and Paul M.Sharp(1989),Fast and sensitive mu
ltiple sequence alignments on a microcomputer,CABIOS 5:151-153)を使用し
て構築した。NIM1タンパク質のある領域は、4つの異なるイネcDNAタン
パク質産物とアミノ酸配列において相同性である。相同体をGenBank BLAST調査
におけるNIM1配列を使用して同定した。NIM1の相同性領域とイネcDN
A産物の比較は図2に示す(配列番号2および17−24も参照)。NIM1タ
ンパク質フラグメントは、イネ産物4つと36−48%同一のアミノ酸配列を示
す。これらのイネESTは、他の単子葉植物からNIM1相同体を単離するのに
特に有用であり得る。
相同体はまた、PCRにより得られる。この方法では、既知の相同体(例えば
、イネとシロイヌナズナ)間で比較する。このときアミノ酸およびDNA類似性
または同一性の高い領域PCRプライマーをつくる。アミノ酸残基MおよびWが
豊富な領域が最適であり、アミノ酸残基F、Y、C、H、Q、KおよびEが豊富
な領域がそれに続くが、なぜならこれらのアミノ酸が限られた数のコドンを使っ
てコードされるからである。一旦適当な領域が同定されると、第3コドン位置に
置換多様性をもつその領域のプライマーがつくられる。第3位置における置換の
多様性は標的される種類によってきめられる。例えば、トウモロコシはGCが豊
富であるので、可能であれば第3位置にGまたはCを使用するプライマーを設計
する。PCR反応は様々な標準的条件下でcDNAまたはゲノムDNAから行う
。バンドが現れたら、クローン化および/または配列決定して、NIM1相同体
であるかどうかを測定する。
実施例33:農産物植物におけるNIM1形態の発現
Col-0またはWs-0においてCIM表現型をもたらすこれらの構築物を、評価す
るために農産物稙物に形質転換する。別法として、前述の実施例の農産物から単
離された変化した天然NIM1遺伝子をそれぞれの農産物に戻す。NIM1遺伝
子は、これらの広範な種類の中のいかなる植物細胞にも挿入可能であるが、特に
イネ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ
、テンサイ、豆、エンドウ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッ
コリ、カブ、ラディッシュ、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク
、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、ウリ類(squash)、カボチャ、ズッキー
ニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、カリン、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネ
クタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップ
ル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシお
よびサトウキビなどの農産物植物細胞において有用である。病害抵抗性の増強に
ついて形質転換体を評価する。本発明の好ましい実施態様において、NIM1遺
伝子の発現レベルは、野生型植物における天然NIM1遺伝子の発現レベルの少
なくとも2倍、好ましくは野生型発現レベルの10倍である。
実施例34:NIM1過発現トランスジェニック植物に常用の殺菌剤
を塗布することにより得られる相乗的病害抵抗性
本実施例(6Eおよび7C)で使用された植物系列は、上記実施例21に記載
のように、BamHI-HindIII NIM1ゲノム断片(配列番号1:塩基1249−
5655)を有する野生型シロイヌナズナ植物(生態型Ws)の形質転換から作
った。メタラキシル殺菌剤、ホセチル殺菌剤、水酸化銅殺菌剤は、それぞれ有効
成分25%、80%、および70%で湿潤性粉末担体と共に製造され、細かい霧
として構成的にNIM1遺伝子を発現する3週齢のトランスジェニックWs植物
の葉に塗布する。対照として湿潤性粉末のみを塗布する。3日後、Delaney et a
l.(1995)記載のように、植物にPeronospora parasitica単離物Emwa分生子懸濁液
(1−2×105胞子/ml)を植菌した。植菌後、高い湿度を保っために植物を覆
い、17℃、昼14時間/夜10時間のサイクル(Uknes et al.,1993)でパー
シバル培養室に置いた。接種後8日で、組織を採取した。
分生子柄の発育を記録するために解剖顕微鏡で観察することにより真菌感染の
進行を12日間追跡した(Delaney,et al.(1994);Dietrich,et al.(1994))
。葉組織内の真菌生長を観察するため、個々の葉をラクトフェノールトリパンブ
ルー(Lactophenoltrypan blue)染色した。プライマーNS1およびNS2およ
び鋳型としてP.parasitica EmWa DNAを使用し、White et al(1990;PCR Protoco
ls:A guide to Methods and Application,315-322)に従ってPCRにより得た
rRNA真菌プローブを使用して、真菌生長を定量した。RNAを塩化リチウム
沈殿の後、フェノール/クロロホルム抽出により凍結細胞から精製した(Lagrim
ini et al,1987:PNAS,84:7542-7546)。サンプル(7.5μg)をホルムアルデ
ヒドアガロースゲルによる電気泳動で分離し、Ausbel et al.(1987)に記載のよ
うにナイロン膜(Hybond-N+,Amersham)に吸着させる。ハイブリダイゼーショ
ンおよび洗浄はChurchおよびGilbert(1984,PNAS,81:1991-1995)に従う。転写
物の相対量を、Phosphor Imager(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)を使用し
、メーカーの指示に従って測定する。剥がしたフィルターブロットを構成的に発
現したb-チューブリンシロイヌナズナcDNAでプローブすることによりサンプ
ル充填物を正規化する。非処置個体の侵入は、0%の真菌増殖阻害に相当した。
NIM1過発現植物系列へのメタラキシル、ホセチル、水酸化銅の塗布は、加
算した以上の、すなわち相乗的な病害抵抗性効果をもたらした。この効果を観察
(O)効果と予測(E)効果との比率である相乗係数(SF)として測定した。
結果を下記に示す。
表36
シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用
成分I:NIM1過発現(系列6E)
成分II:メタラキシルwt=野生型Ws
表37
シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用
成分I:NIM1過発現(系列6E)
成分II:ホセチル
wt=野生型Ws
表38
シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用
成分I:NIM1過発現(系列7C)
成分II:ホセチルwt=野生型Ws
表39
シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用
成分I:NIM1過発現(系列6E)
成分II:水酸化銅
wt=野生型Ws
表40
シロイヌナズナでのPeronospora parasiticaに対する作用
成分I:NIM1過発現(系列7C)
成分II:水酸化銅wt=野生型Ws
上記表から分かるように、相乗的病害抵抗性効果は、メタラキシル、ホセチル
および水酸化銅の塗布によりNIM1過発現植物において証明された。例えば、
非処置NIM1植物(系列6E)では、非処置野生型植物に対して10%の真菌
増殖阻害がみられた。これにより、このNIM1過発現体における構成的SAR
遺伝子発現は病害抵抗性と相関していることが明らかである。しかしながら、上
記表37に示すように、5.0g/l(通常なら効果をあげるには不充分な濃度)で
ホセチルを免疫調節化(SAR-オン)NIM1過発現植物に塗布すると、観察
された真菌増殖阻害レベルが93%に上昇した。これらのデータから計算した5
.5という相乗係数は、明らかに免疫調節化(SAR-オン)植物へ殺菌剤を塗布
して相乗効果が得られたことを示している。別の例において、非処置NIM1植
物(系列7C)では、非処置野生型植物に対して14%の真菌増殖阻害が見られ
、
このNIM1過発現体における構成的SAR遺伝子発現が病害抵抗性と相関して
いることを証明している。しかしながら、上記表40に示すように、2.0g/l(
通常なら効果をあげるには不充分な濃度)で水酸化銅を免疫調節化(SAR-オ
ン)NIM1過発現植物に塗布すると、観察された真菌増殖阻害レベルが77%
に上昇した。これらのデータから計算した5.5という相乗係数はさらに、免疫
調節化(SAR-オン)植物へ殺菌剤を塗布して相乗効果が得られたことを示し
ている。
従って、病害抵抗性を得るためにNIM1過発現免疫調節化稙物を、通常なら
非効果的な低濃度の殺菌剤と組み合わせて使用すると、有益であり、これは当農
業関係者には明らかである。通常毒性、さもなくば望ましくない濃度の殺菌剤は
、本明細書で証明された相乗性を利用することにより回避できる。さらに、植物
に所定の防御レベルをもたらすために要する殺菌剤の量を減らすことで、経済的
利益を実現し得る。
実施例35:NIM1過発現トランスジェニック植物にSARの化学誘発
物質を塗布することにより得られる相乗的病害抵抗性
BTHの異なる濃度に対する反応についても野生型Ws系列と比較して、NI
M1核遺伝子DNAフラグメントを含むトランスジェニック植物を自身のプロモ
ーター(実施例21)下に分析した。前述のように各系列からの種子を播き、育
生する。播種後約3週間で、サンプルの葉を各系列(0日対照)から採取し、残
存する葉をH2O、10μM BTHまたは100μM BTHで処置した。追
加のサンプルを処置後1、3および5日目に採取した。3日のサンプルを採取後
、各系列の植物のサブセット(subset)を除去し、上記のようにPeronospora pa
rasitica単離物Emwaで処置した。採取した組織からRNAを準備し、シロイヌナ
ズナPR−1遺伝子プローブを用いてノーザン分析を行った。感染後8日目で真
菌抵抗性について植物を記録した。
WsおよびNIM-過発現系列の4つ(3A、5B、6Eおよび7C)につい
てノーザン分析の結果を図3に示す。野生型Ws系列におけるPR−1遺伝子発
現は、低レベル10μM BTH処置(効果をあげるには通常100−300μ
MのBTH濃度が必要である)後、かろうじて検出できた。この処置からのWs
個体はまた、真菌病原体P.parasitica(Emwa)に感受性であった。しかしながら
、NIM1過発現系列のすべてにおいて、低レベルBTH処置後、PR−1遺伝
子発現に対してより強い応答があった。さらに10μMのBTHで処置したNI
M1−過発現系列の全てがP.parasiticaに対して、完全、またはほぼ完全な抵抗
性を示した。真菌菌糸の存在を同定するために(Dietrich et al.(1994))葉を
ラクトフェノールブルーで染色し、NIM1過発現系列における真菌生長の不存
在を確認した。100μM BTH処置後の葉組織におけるPR−1遺伝子発現
はまた、野生型と比較して、NIM1過発現系列ではより強く、迅速であった。
従って、P.parasiticaに対するPR−1遺伝子発現および抵抗性が示すように、
免疫調節化植物は野生型植物より速く、より低用量のBTHに対して応答し得る
。このデータから、相乗的病害抵抗性は、BTHなどの全身性獲得抵抗性(syst
emic acquired resistance)の化学的誘発物質を、NIM1過発現植物などの免
疫調節化(SAR-オン)植物に塗布することにより得られることが証明された
。
従って、病害抵抗性を得るために、NIM1過発現免疫調節化植物を、通常な
ら非効果的な低濃度のSAR誘発化学物質、例えばBTHと組み合わせて使用す
ることは、有利であり、当農業関係者にも明らかである。通常毒性、さもなけれ
ば望ましくない濃度のSAR誘発化学物質は、本明細書で証明された相乗性を利
用することにより回避できる。さらに、一定レベルの植物防御をもたらすために
要するSAR誘発化学物質の量を減らすことで、経済的利益も実現し得る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M
W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY
,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM
,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,
CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,E
S,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU,ID
,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,
LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,M
G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT
,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,
TJ,TM,TR,TT,UA,UG,UZ,VN,Y
U,ZW
(72)発明者 モリナ・フェルナンデス,アントニオ
スペイン、エ―30540ブランカ、グラン・
ビア18番
(72)発明者 フリードリック,レスリー・ベサーズ
アメリカ合衆国27502ノースカロライナ州
エイペックス、ワイクフォード・プレイ
ス4208番
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.相乗的病害抵抗性により病原体攻撃から植物を防御する方法であって、下 記段階: (a)第1レベルの病害抵抗性を持つ免疫調節化植物を提供し; (b)該免疫調節化植物に第2レベルの病害抵抗性を与える少なくとも1種の殺 菌剤を適用し; (c)該殺菌剤を該免疫調節化植物に適用することにより、相乗的に増強された 、第1および第2レベルの病害抵抗性の総和よりも大きい第3レベルの病害抵抗 性を与える を含んでなる、方法。 2.該免疫調節化植物が、 (a)構成的免疫(cim)変異体植物; (b)病変擬態変異体植物; (c)植物中でのSAR遺伝子の組換え発現により得られるもの; (d)植物にSAR誘導可能な化学物質を適用することにより得られるもの である、請求項1に記載の方法。 3.該cim変異体植物が下記段階: (a)病変擬態表現型を欠く正常表現型の非感染植物におけるSAR遺伝子の発 現を評価し、 (b)ウイルス、細菌、または真菌感染なしで、SAR遺伝子を構成的に発現す る非感染植物を選択する に従い、植物集団から選択される、請求項2に記載の方法。 4.該病変擬態変異体植物が下記段階: (a)病変擬態表現型を持つ非感染植物におけるSAR遺伝子の発現を評価し、 (b)ウイルス、細菌、または真菌感染なしで、SAR遺伝子を構成的に発現す る非感染植物を選択する に従い、植物集団から選択される、請求項3に記載の方法。 5.該SAR遺伝子が、全身性獲得抵抗性をもたらすシグナル伝達カスケード に関わるNIM1タンパク質をコードするNIM1遺伝子の機能的形態で ある、請求項2に記載の方法。 6.該NIM1タンパク質が配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる、請求 項5に記載の方法。 7.該NIM1遺伝子が配列番号1に記載のコード配列からなる、請求項5に 記載の方法。 8.該SAR遺伝子が、SARシグナル伝達経路の優性ネガティブレギュレー ターとして作用するNIM1タンパク質の変化形態をコードする、請求項3に記 載の方法。 9.該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号2の55位および59位に 対応するアミノ酸位置でセリンの代わりにアラニンを持つ、請求項8に記載の方 法。 10.該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号8に示したアミノ酸配列 からなる、請求項9に記載の方法。 11.該DNA分子が配列番号7に示したヌクレオチド配列からなる、請求項 9に記載の方法。 12.該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号2のアミノ酸位置1−1 25にほぼ対応するアミノ酸のN-末端トランケーションを持つ、請求項8に記 載の方法。 13.該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号10に示すアミノ酸配列 からなる、請求項13に記載の方法。 14.該DNA分子が、配列番号9に示すヌクレオチド配列からなる、請求項 13に記載の方法。 15.該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号2のアミノ酸位置522 −593にほぼ対応するアミノ酸のC-末端トランケーションを持つ、請求項8 に記載の方法。 16.該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号12に示すのアミノ酸配 列からなる、請求項15に記載の方法。 17.該DNA分子が配列番号11に示すヌクレオチド配列からなる、請求項 15に記載の方法。 18.該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号2のアミノ酸位置522 −593にほぼ対応するアミノ酸のC-末端トランケーションを持つ、請求項8 に記載の方法。 19.該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号14に示すアミノ酸配列 からなる、請求項18に記載の方法。 20.該DNA分子が配列番号13に示すヌクレオチド配列からなる、請求項 18に記載の方法。 21.該NIM1タンパク質の変化形態が、実質的に配列番号2のアミノ酸位 置103−362にほぼ対応するアンキリンモチーフからなる、請求項8に記載 の方法。 22.該NIM1タンパク質の変化形態が、配列番号16に示すアミノ酸配列 からなる、請求項21に記載の方法。 23.該DNA分子が、配列番号15に示すヌクレオチド配列からなる、請求 項21に記載の方法。 24.該DNA分子が次の:1%BSA;520mM NaPO4、pH7.2 ;7%ラウリル硫酸ナトリウム塩;1mM EDTA;250mM塩化ナトリウ ム中、55℃で、18−24時間ハイブリダイゼーションし、6×SSCで15 分間(×3)、3×SSCで15分間(×1)、55℃で洗浄する;という条件下、 配列番号1、7、9、11、13または15に記載のヌクレオチド配列とハイブ リダイズする、請求項7、11、14、17、20および23のいずれか1項に 記載の方法。 25.該殺菌剤が下記の群から選択される殺真菌剤である、請求項1ないし2 4のいずれかに記載の方法: 4-[3-(4-クロロフェニル)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)アクリロイル] モルホリン(“ジメトモルフ”); 5-メチル-1,2,4-トリアゾロ[3,4-b][1,3]ベンゾチアゾール(“トリ シクラゾール”); 3-アリルオキシ-1,2-ベンゾチアゾール-1,1-ジオキシド(“プロボナゾー ル”); α-[2-(4-クロロフェニル)エチル]-α-(1,1-ジメチルエチル)-1H-1,2 ,4-トリアゾール-1-エタノール(“テブコナゾール”); 1-[[3-(2-クロロフェニル)-2-(4-フルオロフェニル)オキシラン-2-イル ]メチル]-1H-1,2,4-トリアゾール(“エポキシコナゾール”); α-(4-クロロフェニル)-α-(1-シクロプロピルエチル)-1H-1,2,4-トリ アゾール-1-エタノール(“シプロコナゾール”); 5-(4-クロロベンジル)-2,2-ジメチル-1-(1H-1,2,4-トリアゾル-1- イルメチル)-シクロペンタノール(“メトコナゾール”); 2-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(1H-1,2,4-トリアゾル-1-イル)-プロ ピル-1,1,2,2-テトラフルオロエチル-エーテル(“テトラコナゾール”); メチル-(E)-2-{2-[6-(2-シアノフェノキシ)ピリミジン-4-イルオキシ] フェニル}-3-メトキシアクリレート(“ICI A 5504”、“アゾキシスト ロビゾ”); メチル-(E)-2-メトキシイミノ-2-[α-(o-トリルオキシ)-o-トリル]アセ テート(“BAS490F”、“クレソキシムメチル”); 2-(2-フェノキシフェニル)-(E)-2-メトキシイミノ-N-メチルアセトアミ ド); [2-(2,5-ジメチルフェノキシメチル)-フェニル]-(E)-2-メトキシイミノ- N-メチルアセトアミド); (1R,3S/1S,3R)-2,2-ジクロロ-N-[(R)-1-(4-クロロフェニル)エ チル]-1-エチル-3-メチルシクロプロパンカルボキサミド(“KTU 3616 ”); マンガンエチレンビス(ジチオカルバメート)ポリマー亜鉛錯体(“マンゼブ”) ; 1-[2-(2,4-ジクロロフェニル)-4-プロピル-1,3-ジオキソラン-2-イル メチル]-1H-1,2,4-トリアゾール(“プロピコナゾール”); 1-{2-[2-クロロ-4-(4-クロロフェノキシ)フェニル]-4-メチル-1,3-ジ オキソラン-2-イルメチル)-1H-1,2,4-トリアゾール(“ジフェノコナゾー ル”); 1-[2-(2,4-ジクロロフェニル)ペンチル-1H-1,2,4-トリアゾール(“ ペンピコナゾール”); シス-4-[3-(4-tert-ブチルフェニル)-2-メチルプロピル]-2,6-ジメチル モルホリン(“フェンプロピモルフ”); 1-[3-(4-tert-ブチルフェニル)-2-メチルプロピル]-ピペリジン(“フェン プロピジン”);4-シクロプロピル-6-メチル-N-フェニル-2-ピリミジンアミ ン(“シプロジニル”); (RS)-N-(2,6-ジメチルフェニル-N-(メトキシアセチル)-アラニンメチル エステル(“メタラキシル”); (R)-N-(2,6-ジメチルフェニル-N-(メトキシアセチル)-アラニンメチルエ ステル(“R-メタラキシル”); 1,2,5,6-テトラヒドロ-4H-ピロロ[3,2,1-ij]キノリン-4-オン(“ピ ロキロン”);および エチル水素ホスホネート(“ホセチル”)。 26.該殺真菌剤がメタラキシルである、請求項25に記載の方法。 27.該SAR誘導可能な化学が、ベンゾチアジアゾール化合物、イソニコチ ン酸化合物、またはサリチル酸化合物のいずれかである、請求項2ないし26の いずれかに記載の方法。 28.該殺菌剤か、ベンゾチアジアゾール化合物、イソニコチン酸化合物、ま たはサリチル酸化合物である、請求項1ないし26のいずれかに記載の方法。 29.2つの殺菌剤を同時に該免疫調節化植物に適用する、請求項1ないし2 8のいずれかに記載の方法。 30.該殺菌剤の1つが下記の群: 4-[3-(4-クロロフェニル)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)アクリロイル] モルホリン(“ジメトモルフ”); 5-メチル-1,2,4-トリアゾロ[3,4-b][1,3]ベンゾチアゾール(“トリ シクラゾール”); 3-アリルオキシ-1,2-ベンゾチアゾール-1,1-ジオキシド(“プロボナゾー ル”); α-[2-(4-クロロフェニル)エチル]-α-(1,1-ジメチルエチル)-1H-1,2 ,4-トリアゾール-1-エタノール(“テブコナゾール”); 1-[[3-(2-クロロフェニル)-2-(4-フルオロフェニル)オキシラン-2-イル ]メチル]-1H-1,2,4-トリアゾール(“エポキシコナゾール”); α-(4-クロロフェニル)-α-(1-シクロプロピルエチル)-1H-1,2,4-トリ アゾール-1-エタノール(“シプロコナゾール”); 5-(4-クロロベンジル)-2,2-ジメチル-1-(1H-1,2,4-トリアゾル-1- イルメチル)-シクロペンタノール(“メトコナゾール”); 2-(2,4-ジクロロフェニル)-3-(1H-1,2,4-トリアゾル-1-イル)-プロ ピル-1,1,2,2-テトラフルオロエチル-エーテル(“テトラコナゾール”); メチル-(E)-2-{2-[6-(2-シアノフェノキシ)ピリミジン-4-イルオキシ] フェニル}-3-メトキシアクリレート(“ICI A 5504”、“アゾキシスト ロビン”); メチル-(E)-2-メトキシイミノ-2-[α-(o-トリルオキシ)-o-トリル]アセ テート(“BAS 490F”、“クレソキシムメチル”); 2-(2-フェノキシフェニル)-(E)-2-メトキシイミノ-N-メチルアセトアミ ド); [2-(2,5-ジメチルフェノキシメチル)-フェニル]-(E)-2-メトキシイミノ- N-メチルアセトアミド); (1R,3S/1S,3R)-2,2-ジクロロ-N-[(R)-1-(4-クロロフェニル)エ チル]-1-エチル-3-メチルシクロプロパンカルボキサミド(“KTU 3616 ”); マンガンエチレンビス(ジチオカルバメート)ポリマー亜鉛錯体(“マンゼブ”) ; 1-[2-(2,4-ジクロロフェニル)-4-プロピル-1,3-ジオキソラン-2-イル メチル]-1H-1,2,4-トリアゾール(“プロピコナゾール”); 1-{2-[2-クロロ-4-(4-クロロフェノキシ)フェニル]-4-メチル-1,3-ジ オキソラン-2-イルメチル)-2H-1,2,4-トリアゾール(“ジフェノコナゾー ル”); 1-[2-(2,4-ジクロロフェニル)ペンチル-1H-1,2,4-トリアゾール(“ ペンピコナゾール”); シス-4-[3-(4-tert-ブチルフェニル)-2-メチルプロピル]-2,6-ジメチル モルホリン(“フェンプロピモルフ”); 1-[3-(4-tert-ブチルフェニル)-2-メチルプロピル]-ピペリジン(“フェン プロピジン”);4-シクロプロピル-6-メチル-N-フェニル-2-ピリミジンアミ ン(“シプロジニル”); (RS)-N-(2,6-ジメチルフェニル-N-(メトキシアセチル)-アラニンメチル エステル(“メタラキシル”); (R)-N-(2,6-ジメチルフェニル-N-(メトキシアセチル)-アラニンメチルエ ステル(“R-メタラキシル”); 1,2,5,6-テトラヒドロ-4H-ピロロ[3,2,1-ij]キノリン-4-オン(“ピ ロキロン”);および エチル水素ホスホネート(“ホセチル”)、から選択される殺真菌剤であり、も う1つの殺菌剤がベンゾチアジアゾール化合物、イソニコチン酸化合物、または サリチル酸化合物のいずれかである、請求項29に記載の方法。 31.殺真菌剤がメタラキシルであり、もう1つの殺菌剤がベンゾチアジアゾ ール化合物である、請求項30に記載の方法。
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