JP2001505774A

JP2001505774A - 植物に耐病性を付与するためのｎｉｍ１遺伝子の使用方法

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Publication number: JP2001505774A
Application number: JP52624898A
Authority: JP
Inventors: アンドリューリアルス，ジョン; アンロートン，ケイ; ジョゼフウクネス，スコット; シュタイナー，ヘンリー−ヨーク; デニーズハント，ミッシェル; ベザーズフリードリヒ，レスリー
Original assignee: ノバルティスアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2001-05-08
Also published as: WO1998026082A1; AU727179B2; NL1007779A1; NL1007779C2; IT1298472B1; AU5663198A; EP0944728A1; FR2757875A1; BR9714398A; CA2273189A1; ITMI972741A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、SAR経路のキー成分であり、そして化学的及び生物学的インジューサーに関して、植物においてSAR遺伝子発現及び広範囲の耐病性の誘発を可能にする遺伝子(NIM１と命名される)の位置及び特徴化に関する。そのNIM１遺伝子生成物は哺乳類シグナル伝達因子ＩκＢサブクラスαの構造的相同体である。本発明は全身性後天性(SAR)シグナル伝達経路の優性−陰性レギュレーターとして作用するNIM１の変更されたNIM１を供給するためにこの発見を活用する。NIM１のこの変更された形は、NIM１の変更された形により形質転換された植物においてnim１変異体として反対の表現型を付与し、すなわちトランスジェニック植物は構成的なSAR遺伝子発現及び構成的免疫性(CIM)表現型を示す。本発明はさらに、植物においてNIM１遺伝子を過剰発現するための形質転換ベクタ一及び工程にも関する。このようにして創造されたトランスジェニック植物は広範囲の耐病性を有する。本発明はさらに、NIM１遺伝子の変更された形をコードするDNA分子、そのようなDNA分子を含む発現ベクター、及びそれにより形質転換された植物及び植物細胞にも関する。本発明はさらに、形質転換ベクター、及び植物においてNIM１遺伝子を過剰発現するための方法に関する。植物においてNIM１遺伝子の過剰発現を生成するためのベクター及び方法が開示される。本発明はまた、NIM１遺伝子生成物の変更された形をコードするDNA分子により前記植物を形質転換することによって、植物においてSARを活性化し、そして植物にCIM表現型及び広い範囲の耐病性を付与することを含んで成る。

Description

【発明の詳細な説明】植物に耐病性を付与するためのNIM１遺伝子の使用方法本発明は、一般的に、植物における広範囲の耐病性、たとえば全身性後天性耐性(Systemic Acquired Resistance；SAR)の現象に関する。より詳しくは、本発明は、広範囲の耐病性を有するトランスジェニック植物を創成するためにSARに導びくシグナル伝達カスケード(Signal Transduction Cuscade)に包含されるNIM １遺伝子の野生型及び変更された形の組換え発現に関する。本発明はさらに、広範囲の耐病性を有するトランスジェニック植物におけるクローン化されたNIM１遺伝子の高レベル発現にも関する。植物は、広範囲の種類の病原性生物、たとえばウィルス、細菌、真菌類及び線中類により、絶えず攻撃されている。収穫植物は、遺伝的に均等な単一培養物として通常成長せしめられるので、特に攻撃されやすく；疾病が攻撃する場合、損失が深刻となる。しかしながら、ほとんどの植物は、病原性生物に対する防御のためのそれら自体の先天的な機構を有する。植物病原体に対する耐性についての天然の変動性が、植物育種家及び病理学者により同定されており、そして多くの収穫物植物中に産み出されている。それらの耐病性遺伝子は、しばしば、病原体に対して高レベルの耐性又は免疫性を提供する。全身性後天性耐性(SAR)は、病原体からそれら自体を防御するために使用される複雑系植物の１つの成分である（Hunt and Ryals，Crit．Rev．in Plant Sci ．15，583-606(1996)；Ryalsなど.，Plant Cell 8，1809-1819(1996)；アメリカ特許第5,614,395号を参照のこと；それらは完全に引用により本明細書に組込まれる）。 SARは、広範囲の感染物、たとえばウィルス、細菌及び真菌類に対しての病原体誘発性全身性耐性であるので、植物−病原体応答の特に重要な観点である。SAR シグナル伝達経路がブロックされる場合、植物は、通常、疾病を引き起こす病原体に対してより敏感になり、そしてそれらはまた、通常疾病を引き起こさないいくつかの感染物に対しても敏感になる（Gaffneyなど.，Science 261，754-756(1 993)；Delaneyなど.，Science 266，1247-1250(1994)；Delaneyなど.，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA92，6602-6606(1995)；Delaney，Plant Phys．113，5-12(19 97)；Biなど．，Plant J．8，235-245(1995)；Mauch-Mani and Slusarenko，Pla nt Cell 8，203-212(1996)；それらは、完全に引用により本明細書に組込まれる）。それらの観察は、SARシグナル伝達経路が植物健康の維持のために決定的であることを示唆する。概念的には、SAR応答は、２つの局面に分けられ得る。開始局面においては、病原体感染が認識され、そして遠隔の組織に篩部放射組織を通して移動するシグナルが放出される。この全身性シグナルは、SAR遺伝子及び疾病耐性の両者の発現により反応する標的細胞により受けとめられる。SARの維持局面は数週間〜植物の全生命の期間を意味し、この間、植物は凝似定常状態（quasi steady state ）で存在し、そして耐病性が維持される(Ryalsなど.，1996)。サリチル酸（SA）蓄積がSARシグナル伝達のために必要とされると思われる。特定の阻害物質による処理、フェニルアラニンアンモニアーリアーゼの後成的な抑制、又はSAを特異的に分解するサリチル酸ヒドロキシラーゼのトランスジェニック発現のためにSAを蓄積することができない植物はまた、SAR遺伝子発現又は耐病性のいづれかを誘発することができない（Gaffneyなど.，1993；Delaneyなど.，1994；Mauch-Mani and Slusarenko 1996；Maherなど.，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 91，7802-7806(1994)；Pallasなど.，Plant J．10 ，281-293(1996)；それらは完全に、引用により本明細書中に組込まれる）。SA は全身性シグナルとして作用することが示されているが、これは現在、論争上であり、そして今日まで、確かに知られていることは、SAが蓄積できない場合、SA Rシグナル伝達がブロックされることである（Pallasなど.，1996；Shalaevなど. ，1995 Plant Cell 7，1691-1701(1995)；Vernooijなど.，Plant Cell 6，959-9 65(1994)；それらは完全に、引用により本明細書中に組込まれる。最近、アラビドプシス(Arabidopsis)がSARを研究するためのモデル系として明らかになっている（Uknesなど.，Plant Cell 4，645-656(1992)；Uknesなど.，M ol．Plant-Microbe Interact．6，692-698(1993)；Cameronなど.，Plant J．5， 715-725（1994）；Mauch Mani and Slusarenko，Mol．Plant-Microbe Interact ．7，378-383(1994)；Dempsey and Klessig，Bulletin de L'Institut Pasteur 93，167-186(1995)；それらは完全に、引用により本明細書中に組込まれる）。S ARは病原体及び化学物質、たとえば２，６−ジクロロイソニコチン酸(INA)及びベンゾ（１，２，３）チアジアゾール−７−チオカルボン酸Ｓ−メチルエステル (BTH)によりアラビドプシスにおいて活性化され得ることが示されている(UkneS など.，1992；Vernooijなど.，Mol．Plant-Microbe Interact．8，228-234(1995 )；Lawtonなど.，Plant J．10，71-82(1996)；それらは全体的に、引用により本明細書中に組込まれる。INAもしくはBTHのいづれかによる処理、又は病原体感染に続いて、少なくとも３種の病因−関連（Pathogenesis-Relaled；PR）タンパク質遺伝子、すなわちPR−１，PR−２及びPR−５が耐性の開始と同時に、調和して誘発される(Uknesなど.，1992，1993)。タバコ、すなわち最もよく特徴づけられた種においては、病原体又は免疫化化合物による処理が少なくとも９組の遺伝子の発現を誘発する（Wardなど.，Plant Cell 3，1085-10 94(1991)；これは全体的に、引用により本明細書中に組込まれる）。種々のSAR 遺伝子により植物を形質転換することによって、耐病性トランスジェニック植物が創成されて来た（アメリカ特許第5,614,395号）。 SARシグナル伝達を修飾している多くのアラビドプシスの変異体が単離されている(Delaney，1997)。それらの変異体の最初のものは、いわゆる1sd(lesions s imulating diseases)(疾患模倣損傷)変異体及びacd２(accelerated cell death) (促進された細胞死)である（Dietrichなど.，Cell 77，551-563(1994)；Greenbe rgなど.，Cell 77，551-563(1994)；それらは全体的に、引用により本明細書中に組込まれる）。それらの変異体はすべて、それらの葉上にいくらかの程度の自発的壊死性病変、SAのレベルの上昇、SAR遺伝子のためのmRNA蓄積、及び耐病性の有意な増強を有する。少なくとも７種の異なった1sd変異体が単離され、そして特徴づけられている（Dietrichなど.，1994；Weymannなど.，Plant Cell 7，2 013-2022(1995)；それらは全体的に引用により本明細書中に組込まれる）。もう１つの興味ある種類の変異体は、cim(constitutive immunity)(構成的免疫性)変異体である（Lawtonなど.，1993“The molecular biology of systemic acquire d resistance”in Mechanisms of Defence Responses in Plants，B．Fritig an d M．Legrant，eds(Dordrecht，The Netherlands：Kluwer Academic Publishers )，pp．422-432(1993)；それは全体的に引用により本明細書中に組込まれる）。また、PCT国際特許出願WO94/16077号（引用により本明細書中に組込まれる）も参照のこと。1sd変異体及びacd２のように、cim変異体は高められたSA及びSAR遺伝子発現及び耐性を有するが、しかし1sd又はacd２に比較して、それらの葉上に検出できる損傷を示さない。cpr１（PR遺伝子の構成的発現体）はcim変異体型であるが；しかしながら、cpr１の葉上の顕微鏡的な損傷の存在が除外されていないので、cpr１は1sd変異体型であり得る（Bowlingなど.，Plant Cell 6，1845-1857(1994)；引用により本明細書中に組込まれる）。 SARシグナル伝達がブロックされている変異体もまた単離されている。ndr１（非品種特異的耐病性）は、種々の無毒性遺伝子含有プソイドモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）及びペロノスポラ・パラシチカ（Peronospora parasi tica）の通常無毒性の単離物の両者の増殖を可能にする変異体である（Century など.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92，6597-6601(1995)；引用により本明細書中に組込まれる）。明らかに、この変異体では、SARシグナル伝達がブロックされている。npr１（PR遺伝子の非発現体）は、INA処理に続いて、SARシグナル化経路の発現を誘発できない変異体である（Caoなど.，Plant Cell 6，1583-159 2(1994)；引用により本明細書中に組込まれる）。eds(増強された疾病敏感性)変異体が、低細菌濃縮物の接種に続いて細菌感染を維持するそれらの能力に基づいて単離されている（Glazebrookなど.，Genetics 143，973-982(1996)；Parkerなど.，Plant Cell 8，2033-2046(1996)；それらは引用により本明細書中に組込まれる）。一定のeds変異体は、npr１と表現型的に非常に類似し、そして最近、ed s５及びeds53はnpr１に対して対立遺伝子的であることが示されている(Glazebro okなど.，1996)。nim１（非誘発性免疫性）は、INA処理に続いてＰ．パラシチカ（すなわち、べと病の原因物質）を維持する変異体である（Delaneyなど.，1995 ；PCT国際特許出願WO94/16077）。nim１遺伝子は病原体感染に続いてSAを蓄積できるけれども、それはSAR遺伝子発現又は耐病性を誘発することができず、このことは、その突然変異がSAの下流の経路をブロックすることを示唆する。nim１はまた、INA又はBTHに対して応答するその能力を低められ、このことは、そのブロックがそれらの化学物質の作用の下流に存在することを示唆する(Dalaneyなど.，1995；Law tonなど.，1996)。最近、２種の対立遺伝子アラビドプシス遺伝子が単離され、そして特徴づけられ、それらの変異体は、それぞれnim１及びnpr１表現型を担当できる（Ryalsなど.，Plant Cell 9，425-439（1997）；Caoなど.，Cell 88，57-63(1997)；それらは引用により本明細書に組込まれる）。野生型NIM１遺伝子生成物は、アラビドプシスにおいてSAR及び遺伝子−対−遺伝子耐病性の両者を導びくシグナル伝達カスケードに包含される(Ryalsなど.，1997)。Ryalsなど.，(1997)はまた、化学的に誘発されたPR−１遺伝子発現及び菌類耐性において、弱く損なわれたもの〜非常に強くブロックされた広範囲の表現型を示す、nim１の５種の追加の対立遺伝子の単離を報告する。npr１変異体への野生型NPR１位の形質転換は、突然変異を補完してPR−遺伝子発現及び耐病性に関するSAR誘導の応答を回復するのみならず、またSAR誘導の存在下でＰ．シリンガエによる感染に対してトランスジェニック植物をより耐性にした(Caoなど.，1997)。 NF−κＢ／ＩκＢシグナル伝達経路 NF−κＢ／ＩκＢシグナル経路は、ドロソフィラ（ショウジョウバエ）〜哺乳類の広範囲の生物における耐病性応答に関係している。哺乳類において、NF−κ Ｂ／ＩκＢシグナル伝達は、リポ多糖、腫瘍壊死因子、インターロイキン１（IL −１）、又はウィルス感染への細胞の暴露を包含する多くの異なった刺激により誘導され得る (Baeuerle and Baltimore，Cell 87，13-20(1996)；Baldwin，Annu．Rev．Immun ol．14，649-681(1996))。活性化された経路は、炎症及び免疫応答に関与する多くの因子、たとえばIL−２，IL−６，IL−８及び顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子の合成を導びく(deMartinなど.，Geme 152，253-255(1995))。トランスジェニックマウス研究においては、NF−κＢ／ＩκＢシグナル伝達のノックアウトが、細菌及びウィルス病原体に対する増強された感受性を包含する防御免疫応答を導びく（Beg and Baltiomre，Science 274，782-784(1996)；Van Antwerp など.，Science 274，787-789(1996)；Wangなど.，Science 274，784-787(1996) ；Baeuerle and Baltimore(1996)）。アラビドプシスにおいては、SAR活性化が増強された耐病性を導びくのに続いて通常の耐性過程が増強されることにおいて、SARは炎症に対して機能的に類似する(Biなど.，1995；Caoなど.，1994；Delan eyなど.，1995；Delaneyなど.，1994；Gaffneyなど.，1993；Mauch-Mani and Sl usarenko，1996；Delaney，1997)。さらに、前記経路の不活性化は、細菌、ウィルス、及び真菌類病原体に対する増強された感受性を導びく。興味あることには、SAは哺乳類細胞においてNF−κＢ活性化をブロックすることが報告されているが(Kopp and Ghosh，Science 265，956-959(1994))，SAはアラビドプシスにおいてシグナル伝達を活性化する。ショウジョウバエの細菌感染は、シグナル伝達カスケードを活性化して多くの抗菌タンパク質、たとえばセルクロピンＢ、デフェンシン、ジプテリシン及びドロソマイシンの合成を導びく（Ipなど.，Cell 75， 753-763(1993)；Lemaitreなど.，Cell 86，973-983(1996)）。この誘導は、ハエにおいて、dorsal及びdif、すなわちNF−κＢ相同体の遺伝子生成物に依存し、そしてcactus、すなわちＩκＢ相同体により抑制される。抗真菌及び抗細菌タンパク質の合成を低めた変異体は、感染に対する耐性を劇的に低めた。多くの研究、及び精巧且つ集中的な収穫物−保護、たとえば植物の遺伝子形質転換の使用にもかかわらず、疾病による損失は毎年、相変わらず多額のままである。従って、植物における耐病性のための遺伝的基礎の永続的に高まる理解に基づいて新規の収穫物保護基準を開発する連続した必要性が存在する。次の定義は、本発明の理解を助けるであろう。植物細胞：プロトプラスト及び細胞壁から成る、植物の構造的及び生理学的単位。用語“植物細胞”とは、植物の一部又は植物に由来する部分のいづれかであるいづれかの細胞を意味する。細胞のいくつかの例は、生存植物の一部である分化された細胞；培養物における分化された細胞；培養物における未分化細胞；未分化組織、たとえばカルス又は腫瘍の細胞；種子、胚、胎芽及び花粉の分化された細胞を包含する。植物組織：構造的及び機能的単位に構成される植物細胞のグループ。プランター又は培養物中の植物のいづれかの組織。この用語は、完全な植物、植物器官、植物種子、組織培養物、及び構造的及び／又は機能的単位に構成される植物細胞のいづれかのグループを包含するが、但しそれらだけには限定されない。上記に列挙されるような、又は他方では、この定義により包含される、いづれかの特定タイプの植物組織と共、又は不在下でのこの用語の使用は、いづれかの他のタイプの植物組織を排除することを意図しない。プロトプラスト：細胞壁を有さない植物細胞。子孫植物：子孫植物（但しこれだけには限定されない）を包含する、有性生殖的に又は無性生殖的に誘導された後世代植物。トランスジェニック植物：そのゲノムに安定して組込まれた組換えDNAを有する植物。組換えDNA：異なった源からのDNAセグメントを連結することによって形成され、そして組換えDNA技法を用いて生成されたいづれかのDNA分子。組換えDNA技法：組換えDNAをインビトロで生成し、そして発現され又は増殖され得る組換えDNAを細胞中に移送する技法（Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology，Ed．Juo，CRC Press，Boca Raton(1996)を参照のこと）。たとえばこれは、種々の形、たとえば（１）環状、線状又は超らせん形での裸のDNA、（２）ヌクレオソームもしくは染色体、又は核もしくはそれらの一部に含まれるDNA、（３）他の分子と共に複合体化された又は会合したDNA、（４）リポソーム、スフェロプラスト、細胞又はプロトプラストに封入されたDNA、又は（５）宿主生物以外の生物（たとえばアグロバクテリウム・ツメフィアシエンス（Agrobacterium tumefiaciens）から移送されたDNAの形でのプロトプラスト又は細胞中へのDNAの移送を包含する。細胞中に組換えDNAを導入するそれらの及び他の種々の方法は、当業界において知られており、そして本発明のトランスジェニック細胞又はトランスジェニック植物を生成するために使用され得る。組換えDNA技法はまた、単子葉植物においてペルオキシダーゼ活性を高めることに適用され得る、Trecoなど.，WO94/12650及びTrecoなど.，WO95/31560に記載される相同組換え法を包含する。特に、調節領域（たとえばプロモーター）は、内因性ペルオキシダーゼの発現を高めるために植物ゲノム中に導入され得る。選択された発現シグナルを欠いているペルオキシダーゼコート配列の単子葉植物中への挿入、及び単子葉植物における内因性制御配列によるペルオキシダーゼの高められた発現についてのトランスジェニック単子葉植物のアッセイがまた、組換えDNA技法として包含される。これは、植物内のペルオキシダーゼコード配列のコピー数の上昇をもたらす。Ｒ^o植物のゲノム中への組換えDNAの初期挿入は、従来の植物育種方法によってよりも、むしろ本明細書に記載されるような技術的方法により達成されるものとして定義される。初期挿入に続いて、トランスジェニック子孫は、従来の育種方法を用いて増殖され得る。キメラ遺伝子：少なくとも２つの異種部分、たとえば好ましくは、組換えDNA 技法を用いて生成された、それらの既存の状態において結合されていない既存の DNA配列に由来する部分を含むDNA分子。発現カセット：プロモーター及びターミネーターを含んで成りその間にコード配列が挿入され得たDNA分子。コード配列：転写され、そして翻訳される場合、ポリペプチド又はタンパク質の形成をもたらすDNA分子。遺伝子：発現、すなわち転写及び翻訳の制御を担当する調節DNA配列、並びに個別のポリペプチド又はタンパク質を提供するために転写されそして翻訳されるコード配列を含んで成る個別の染色体領域。本発明は、植物において全身性後天性耐性を導びく生物学的及び化学的誘導物質に反応性のシグナル伝達カスケードに関与するタンパク質をコードするNIM１遺伝子の同定、単離／及び特徴化を記載する。従って、本発明は、植物において全身性後天性耐性を導びくシグナル伝達カスケードに関与されるNIM１タンパク質をコードする単離されたDNA分子(NIM１遺伝子)を開示する。本発明の範囲内においては、クローンBAC−04（ATCC寄託番号第 97543号に次の条件でハイブリダイズするNIM１タンパク質をコードするDNA分子が記載される：１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、及び６×SSCで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。特に好ましい態様においては、NIM１遺伝子がクローンBAC−04（AT CC寄託番号第97543号）内に含まれる。さらに、コスミドＤ７（ATCC寄託番号第97736号）に次の条件下でハイブリダイズするNIM１タンパク質をコードするDNA分子が記載される：１％のBSA；520mM のNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、及び６×SSCで1 5分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。特に好ましい態様においては、NIM１遺伝子は、コスミドＤ７（ATCC寄託番号第97736号）内に含まれる。本明細書に記載されるNIM１遺伝子は、双子葉植物、たとえばアラビドプシス、タバコ、キュウリ又はトマトから単離され得る。他方では、NIM１遺伝子は、単子葉植物、たとえばトウモロコシ、小麦又は大麦から単離され得る。配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んで成るコードされたNIM１タンパク質がさらに記載される。配列番号２に示されるコード配列に次の条件下でハイブリダイズするNIM１遺伝子コード配列がさらに記載される：１％のBSA；520mMのN aPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウムにおける55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、及び６×SSCで15 分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。特に好ましい態様において、NIM１遺伝子コード配列は、配列番号２に示されるコード配列を含んで成る。本発明はまた、NIM１遺伝子コード配列に作用可能に連結された、植物中で活性的なプロモーターを含んで成るキメラ遺伝子、そのようなキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクター（ここで、前記ベクターは宿主を安定して形質転換することができる）、及びそのようなベクターにより安定して形質転換された宿主を記載する。好ましくは、宿主は、植物、たとえば次の農業経済学的に重要な収穫物の１つである：米、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、インゲン豆、エンドウ豆、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、カボチャ、ズキニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラーズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシ及びサトウキビ。特に好ましい態様において、NIM１タンパク質は、形質転換された植物において、野生型植物においてよりも高レベルで発現される。本発明はまた、NIM１遺伝子コード配列に作用可能に連結された、植物中で活性的なプロモーターをそれ自体含んで成るキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクターにより植物を形質転換することによって、植物にCIM表現型を付与する方法にも向けられ、ここでコードされたNIM１タンパク質は、野生型植物においてよりも高レベルで、形質転換された植物において発現される。さらに、本発明は、NIM１遺伝子コード配列に作用可能に連結された、植物中で活性的なプロモーターをそれ自体含んで成るキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクターにより植物を形質転換することによって、植物における全身性後天性耐性を活性化するための方法にも向けられ、ここでコードされたNIM１タンパク質は、野生型植物においてよりも高レベルで、形質転換された植物において発現される。さらに、本発明は、NIM１遺伝子コード配列に作用可能に連結された、植物中で活性なプロモーターをそれ自体含んで成るキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクターにより植物を形質転換することによって、植物に広範囲の耐病性を付与する方法にも向けられ、ここでコードされたNIM１タンパク質は、野生型植物においてよりも高レベルで、形質転換された植物において発現される。本発明のもう１つの観点は、植物におけるSAR経路が哺乳類及びハエにおいてN F−κＢ／ＩκＢ調節スキームに対して機能的類似性を示すとの認識、及びNIM１遺伝子生成物が哺乳類シグナル伝達因子ＩκＢサブクラスαの構造的相同体であるとの発見の両者を利用する。NF−κＢ／ＩＫＢ調節スキームの超−レプレッサー(Super-repressor)又は優性−陰性体(dominant-regative)として作用する、ＩＫＢの突然変異が記載されている。本発明は、SARシグナル伝達経路の優性−陰性調節体として作用する、野生型NIM１遺伝子（配列番号２）の変更された形を包含する。NIM１のそれらの変更された形は、nim１変異体としてそれにより形質転換された植物の反対の表現型を付与し；植物、すなわち変更された形のNIM１により形質転換された植物は構成的SAR遺伝子発現及びCIM表現型を示す。上記に定義されるような本発明のDNA分子に、但し好ましくは、少なくとも10 個の長さのヌクレオチドの前記変更された形のためのコード配列の連続した部分を含んで成る、前記DNA分子から得られるオリゴヌクレオチドプローブに、適度な緊縮条件下でハイブリダイズするDNA 分子もまた、本発明により包含される。ハイブリッドの安定性に影響を及ぼす因子は、ハイブリダイゼーションの緊縮性を決定する。１つのそのような因子は、DNA PROBES，George H．Keller and M ark M．Manak，Macmillan Publishers Ltd，1993，Section １：Molecular Hybr idization Technology；page ８ ffに提供される式に従って容易に計算され得る溶融温度Ｔ_mである。好ましいハイブリダイゼーション温度は、計算された溶融温度Ｔ_mよりも約25 ℃低い範囲、及び好ましくは計算された溶融温度Ｔ_mよりも約12〜15℃低い範囲であり、そしてオリゴヌクレオチドの場合、その溶融温度Ｔ_mよりも約５〜10℃ 低い範囲である。本発明の１つの態様において、NIM１遺伝子は、コードされた生成物が野生型アラビドプシスNIM１アミノ酸配列（配列番号３）の位置55及び59に対応するアミノ酸位置におけるセリンの代わりにアラニンを有するように変更される。アラニン残基へのそれらのセリン残基の変化をもたらすNIM１遺伝子のこの変更された形の好ましい態様の例が、配列番号22に示される。アミノ酸位置55及び59でセリンの代わりにアラニンを有するNIM１タンパク質の典型的な優性−陰性形が、配列番号23に示される。本発明はまた、NIM１の対立遺伝子の変更された形も包含し、ここでそのような対立遺伝子のコード配列は、適度な緊縮条件、特に次の条件下で、配列番号22に示されるコード配列にハイブリダイズする：１％のBSA ；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mM の塩化ナトリウム中55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、並びに６×SS Cで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。それらの態様において、上記条件下で配列番号22にハイブリダイズするNIM１の対立遺伝子は、コードされた生成物が配列番号22の位置55及び59に対応するアミノ酸位置におけるセリンの代わりにアラニンを有するよう変更される。本発明のもう１つの態様において、NIM１遺伝子は、コードされた生成物が、野生型タンパク質の位置55及び59に対応するアミノ酸位置でのセリンに加えて、可能性あるユビキチン化部位として作用することができるリシン残基を除去するＮ−末端切断を有するよう変更される。Ｎ−末端欠失を有する遺伝子生成物をコードする、NIM１遺伝子のこの変更された形の好ましい態様の例は、配列番号24 に示される。Ｎ−末端欠失を有するNIM１タンパク質の典型的な優性−陰性(domi nant regative)形が、配列番号25に示される。本発明はまた、NIM１の対立遺伝子の変更された形も包含し、ここでそのような対立遺伝子のコード配列は、適度な緊縮条件、特に次の条件下で、配列番号24に示されるコード配列にハイブリダイズする：１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、並びに６×SSCで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。それらの態様において、上記条件下で配列番号24にハイブリダイズするNIM１の対立遺伝子は、コードされた生成物が、野生型遺伝子生成物の位置55 及び59に対応するアミノ酸位置でのセリンに加えて、可能性あるユビキチン化部位として作用することができるリシン残基を除去するＮ−末端欠失を有するよう変更される。本発明のさらにもう１つの態様においては、NIM１遺伝子は、コードされた生成物がＣ−末端切断を有するよう変更され、この切断は、野生型遺伝子生成物のＣ−末端におけるセリン及びトレオニン残基の構成的リン酸化をブロックすることによって、増強された固有の安定性をもたらすと思われる。Ｃ−末端欠失を有する遺伝子生成物をコードする、NIM１遺伝子のこの変更された形の好ましい態様の例は、配列番号26に示される。Ｃ−末端欠失を有するNIM１タンパク質の典型的な優性−陰性形は、配列番号27に示される。本発明はまた、NIM１の対立遺伝子の変更された形も包含し、ここでそのような対立遺伝子のコード配列は、適度な緊縮条件、特に好ましくは次の条件下で、配列番号26に示されるコード配列にハイブリダイズする：１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA ；250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、並びに６×SSCで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。それらの態様において、上記条件下で配列番号26にハイブリダイズするNIM１の対立遺伝子は、コードされた生成物がセリン及びトレオニン残基を除去するＣ−末端欠失を有するよう変更される。本発明のさらにもう１つの態様において、NIM１遺伝子は、コードされた生成物が本発明の両上記態様の利点を提供する、Ｎ−末端欠失及びＣ−末端切断の両者を有するよう変更される。本発明の好ましい態様は、配列番号２のアミノ酸位置１〜125にほぼ対応するアミノ酸のＮ末端切断、及び配列番号３のアミノ酸位置522〜593にほぼ対応するアミノ酸のＣ末端切断を有するNIM１タンパク質の変更された形である。Ｎ−末端及びＣ−末端欠失の両者を有する遺伝子生成物をコードする、NIM１遺伝子のこの変更された形の好ましい態様の例は、配列番号28に示される。Ｃ− 末端欠失を有するNIM１タンパク質の典型的な優性−陰性形は、配列番号29に示される。本発明はまた、NIM１の対立遺伝子の変更された形も包含し、ここでそのような対立遺伝子のコード配列は、適度な緊縮条件、特に好ましくは次の条件下で、配列番号28に示されるコード配列にハイブリダイズする：１％のBSA；520 mMのNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、並びに６×SS Cで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。それらの態様において、上記条件下で配列番号28にハイブリダイズするNIM１の対立遺伝子は、コードされた生成物が野生型遺伝子生成物の位置55及び59に対応するアミノ酸残基でのセリンに加えて可能性あるユビキチン化部位として作用できるリシン残基を除去するＮ−末端欠失、及びセリン及びトレオニン残基を除去するＣ−末端欠失の両者を有するよう変更される。本発明のさらにもう１つの態様において、NIM１遺伝子は、コードされた生成物が野生型遺伝子生成物のアンキリン(ankyrin)ドメインのみから実質的に成るよう変更される。単離されたDNA分子が好ましく、ここで前記NIM１タンパク質の変更された形は、配列番号３のアミノ酸位置103〜362にほぼ対応するアンキリンモチーフから実質的に成る。アンキリンドメインをコードする、NIM１遺伝子のこの変更された形の好ましい態様の例は、配列番号30に示される。NIM１タンパク質の典型的な優性−陰性形は、配列番号31に示されるアンキリンドメインのみから実質的に成る。本発明はまた、NIM１の対立遺伝子の変更された形も包含し、ここでそのような対立遺伝子のコード配列は、適度な緊縮条件、特に好ましくは次の条件下で、配列番号30に示されるコード配列にハイブリダイズする：１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA； 250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、並びに６×SSCで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。それらの態様において、上記条件下で配列番号30にハイブリダイズするNIM１の対立遺伝子は、コードされた生成物が野生型遺伝子生成物のアンキリンドメインから実質的に成るよう変更される。従って、本発明は、NIM１遺伝子の変更された形、たとえば上記のものをコードするDNA分子、及び適度な緊縮条件下でそれとハイブリダイズするすべてのDNA 分子に関する。本発明はまた、NIM１遺伝子の上記変更された形の１つに作用可能に連結された、植物中で活性的なプロモーターを含んで成るキメラ遺伝子、そのようなキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクター（ここで、前記ベクターは宿主を安定して形質転換することができる）、及びそのようなベクターにより安定して形質転換された宿主細胞を包含する。好ましくは、宿主細胞は、植物、植物細胞及びその子孫たとえば次の農業経済学的に重要な収穫物の１つである：米、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、インゲン豆、エンドウ豆、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、カボチャ、ズキニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラーズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシ及びサトウキビ。本発明はまた、NIM１遺伝子の上記変更された形の１つに作用可能に連結された、植物中で活性的なプロモーターをそれ自体含んで成るキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクターにより植物を形質転換することによって、植物にCIM表現型を付与する方法にも向けられ、ここでNIM１タンパク質のコードされた優性−陰性形は、形質転換された植物において発現され、そして植物にCIM表現型を付与する。さらに、本発明は、NIM１遺伝子の上記変更された形の１つに作用可能に連結された、植物中で活性なプロモーターをそれ自体含んで成るキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクターにより植物を形質転換することによって、植物における全身性後天性耐性を活性化するための方法にも向けられ、ここでNIM１タンパク質のコードされた優性−陰性形が形質転換された植物においては、発現され、そして植物における全身性後天性耐性を活性化する。さらに、本発明は、NIM１遺伝子の上記変更された形の１つに作用可能に連結された、植物中で活性なプロモーターをそれ自体含んで成るキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクターにより植物を形質転換することによって、植物に広範囲の耐病性を付与する方法にも向けられ、ここでNIM１タンパク質のコードされた優性−陰性形は形質転換された植物において発現され、そして植物に広範囲の耐病性を付与する。さらにもう１つの観点において、本発明は、植物において全身性後天性耐性を導びくシグナル伝達カスケードに関与するNIM１遺伝子のスクリーニング方法に向けられ、ここで前記方法は、次の組の条件下で、配列番号２に示されるコード配列にハイブリダイズするNIM１コード配列により、前記植物からのゲノム又はc DNAライブラリーをプローブすることを含んで成る：１％のBSA；520mMのNaPO₄， pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、並びに６×SSCで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。本発明により包含されるさらなる対象は次のものである：前記NIM１タンパク質の変更された形が配列番号３の位置55及び59に対応するアミノ酸位置においてセリンの代わりにアラニンを有する本発明の単離されたDN A分子、ここでこのDNA分子は次の条件下で、配列番号22に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする：１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、並びに６×SSCで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。前記NIM１タンパク質の変更された形が配列番号３のアミノ酸位置１〜125にほぼ対応するアミノ酸のＮ−末端切断を有する、本発明の単離されたDNA分子、ここでこのDNA分子は次の条件下で、配列番号24に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする：１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、並びに６×SSCで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃ で（Ｘ１）の洗浄。前記NIM１タンパク質の変更された形が配列番号３のアミノ酸位置522〜593にほぼ対応するアミノ酸のＣ−末端切断を有する、本発明の単離されたDNA分子、ここで前記DNA分子は次の条件下で、配列番号26に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする：１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、並びに６×SSCで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55 ℃で（Ｘ１）の洗浄。前記NIM１タンパク質の変更された形が配列番号28に示されるアミノ酸配列を含んで成る、本発明の単離されたDNA分子、ここで前記DNA分子は次の条件下で、配列番号28に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする：１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、並びに６×SSCで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。前記NIM１タンパク質の変更された形が配列番号３のアミノ酸位置103〜362にほぼ対応するアンキリン(ankyrin)モチーフから実質的に成る、本発明の単離されたDNA分子、ここで前記DNA分子は次の条件下で、配列番号30に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする：１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％のラウリル硫酸ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム中での55℃で18 〜24時間のハイブリダイゼーション、並びに６×SSCで15分間、（Ｘ３）３×SSC で15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄。突然変異誘発により構成された、本発明のNIM１遺伝子の変更された形。植物細胞、植物及びその子孫において全身性後天性耐性を活性化するためへの本発明の単離されたDNA分子の使用。植物細胞、植物及びその子孫に広範囲の耐病性を付与するためへの本発明の単離されたDNA分子の使用。植物細胞、植物及びその子孫にCIM表現型を付与するためへの本発明の単離されたDNA分子の使用。育種を通して植物系中に耐病性特性を組込むためへの本発明の耐性植物及びその子孫の使用。 NIM１遺伝子により形質転換された植物において耐病性を付与し、そしてSAR遺伝子発現を活性化するためへのNIM１遺伝子の変異体の使用。 NIM１遺伝子の変更された形を生成するための方法。本発明のNIM１タンパク質の変更された形をコードする単離されたDNA分子を含んで成るトランスジェニック親植物のトランスジェニック子孫を生成するための方法、ここでこの方法は、前記親植物を、本発明の組換えベクター分子により形質転換し、そして既知の植物育種技法を用いて、前記トランスジェニックの親植物の子孫に前記形質をトランスファーすることを含んで成る。 NIM１タンパク質の変更された形をコードするDNA部分を含むDNA部分を含んで成るDNA分子を生成するための方法；ここで前記方法は、（ａ）NIM１遺伝子の変更された形又はmRNAに特異的にハイブリダイズすることができるヌクレオチドプローブを調製し、ここで前記プローブは少なくとも10 個の長さのヌクレオチドの変更された形のためのコード配列の隣接した部分を含んで成り；（ｂ）段階（ａ）に従って調製されたヌクレオチドプローブを用いて、クローン化されたゲノムDNAフラグメント又はcDNAフラグメントの集団中のNIM１コード配列の他の変更された形についてプローブし；そして（ｃ）NIM１タンパク質の変更された形をコードするDNA部分を含むDNA部分を含んで成るDNA分子を単離し、そして増加させることを含んで成る。 NIM１配列の変更された形を含むDNA部分を含んで成るDNA分子を単離するための方法；ここでこの方法は、（ａ）NIM１遺伝子の変更された形又はmRNAに特異的にハイブリダイズすることができるヌクレオチドプローブを調製し、ここで前記プローブは少なくとも10 個の長さのヌクレオチドの、植物からのNIM１タンパク質の変更された形のためのコード配列の隣接した部分を含んで成り；（ｂ）段階（ａ）に従って調製されたヌクレオチドプローブを用いて、クローン化されたゲノムDNAフラグメント又はcDNAフラグメントの集団中のNIM１配列の他の変更された形についてプローブし；そして（ｃ）NIM１遺伝子の変更された形を含むDNA部分を含んで成るDNA分子を単離する；ことを含んで成る。 NIM１遺伝子、又はその機能的変異体及び変異体を野生型レベル以上に発現するトランスジェニック植物を生成する方法。 NIM１遺伝子、又はその機能的変異体及び変異体を野生型レベル以上に発現するトランスジェニック植物を生成する方法、ここで前記NIM１遺伝子の発現は、野生型植物におけるNIM１遺伝子の発現レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで存在する。 NIM１遺伝子、又はその機能的変異体及び変異体を野生型レベル以上に発現するトランスジェニック植物を生成する方法、ここで前記NIM１遺伝子の発現は、野生型植物におけるNIM１遺伝子の発現レベルよりも少なくとも10倍高いレベルで存在する。 nim変異体表現型本発明は、SARに関係する遺伝子を発現しないことにおいて、病原体感染に対するそれらの正常な応答に欠陥がある変異体植物、及びそれから単離された遺伝子に関する。それらの変異体は、nim変異体（非誘導性免疫性について）として言及され、そして宿主植物の病原体の多くの株及び病原型に対しての、そしてまた、宿主植物を通常感染しないが、しかし通常、他の宿主を感染する病原体に対しての、それらの感受性のために“普遍的疾病感受性”(UDS)であり得る。そのような変異体は、種子又は他の生物学的材料を突然変異誘発剤により処理し、そしてSARの既知化学的誘発剤(たとえば INA)により子孫植物を処理し、そして次に既知の病原体によりその植物を感染せしめることによって、UDS表現型について子孫植物を選択することによって、選択され得る。非誘導性変異体はそれらの環境下で重度の疾病症候を進行せしめ、他方野生型植物は化学的物質により全身性後天性耐性に誘導される。nim変異体は、化学的及び照射突然変異誘発により生成される変異体集団から、及びＴ−DN A挿入及びトランスポゾン−誘発された突然変異誘発により生成された集団から同様に選択され得る。変異体植物系を生成するための技法は、当業界において良く知られている。 nim変異体は、現場病因試験における疾病圧力の評価の有用なインジケーターを提供し、ここでいわゆる野生型（すなわち、非変異体）の天然の耐性表現型は変化し、そして従って、信頼できる感受性の標準を提供しない。さらに、nim植物は、候補体耐病性トランスジーンの試験のための追加の有益性を有する。トランスジーンのための受容体としてnimストック系を用いて、耐病性へのトランスジーンの寄与が基本レベルの感受性に対して直接的に評価できる。さらに、nim 植物は、植物−病原体相互作用の理解において手段として有用である。nim宿主植物は病原体攻撃に対する全身性応答を開始せず、そして病原体の変わらない成長が、宿主とのその生物学的相互作用を研究するための理想的系である。 nim宿主植物はまた、それらが通常存在する宿主範囲外の病原体に対しても感受性であり、それらの植物はまた、宿主−病原体相互作用の分子、遺伝子及び生物学的研究において有意な有益性を有する。さらに、nim植物のUDS表現型はまた、それらを殺カビ剤スクリーニングのために有益性にもなる。特定の宿主において選択されたnim変異体は、その宿主及び宿主の病原体を用いての殺カビ剤のスクリーニングのための相当な有益性を有する。異なる病原体及び病原型に対して差別的に敏感であり、又はいくつかの病原体もしくは病原型に対して耐性でさえある宿主により遭遇される問題を回避する利点が、変異体のUDS 表現型に存在する。 nim変異体は、異種宿主、すなわち特定病原体の宿主範囲内に通常存在しない宿主を用いての、広範囲の病原体及び病原型に対する殺カビ剤のスクリーニングのためのさらなる有益性を有する。従って、他の種（たとえば収穫物植物種）の病原体に対するアラビドプシスのnim変異体の感受性は、収穫物植物の重要な病原体に対する化合物についての有効な殺カビ剤スクリーニング方法を促進する。アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)nim１変異体 INA処理に続いて、Ｐ．パラシチカ（P．parasitica）(すなわち、べと病の原因物質)増殖を維持する、nim１（非誘発性免疫性）と呼ばれるアラビドプシス・タリアナ変異体は、Delaneyなど.，1995に記載される。nim１は病原体感染に続いて蓄積するが、SAR遺伝子発現は誘発されず、このことは、突然変異がSAの下流の経路をブロックすることを示唆する。nim１はまた、INA又はBTHに応答するその能力を低め、このことは、ブロックがそれらの化学物質の作用の下流に存在することを示唆する(Delaneyなど.，1995；Lawtonなど.，1996)。この最初のアラビドプシスnim１変異体（ここで、nim１−１と命名する）が、発芽後２週目の植物に、0.33mMのINAを噴霧し、続いてＰ．パラシチカを接種することによって、Ｔ−DNA標識されたアラビドプシス生態型イシレウスキジャ（Issilewskija）（Ws−Ｏ）集団の80,000個の植物から単離された(Delaneyなど.，1995)。INA処理の後、菌類増殖を維持する植物が推定上の変異体として選択された。５種の追加の変異体（ここで、nim１−２，nim１−３，nim１−４，nim１−５、及びnim １−６と命名される）が、エチルメタンスルホネート(EMS)−突然変異誘発されたWs−Ｏ集団からの280,000Ｍ₂植物から単離された。変異体が優性であるか又は劣性であるかを決定するために、Ws−Ｏ植物が、それらの変異体の個々に交雑するための花粉ドナーとして使用された。次に、Ｆ₁ 植物が、INA処理に続いて菌類増殖を維持するそれらの能力について評価された。例の表３に示されるように、すべてのnim１−１，nim１−２，nim１−３，nim １−４及びnim１−６Ｆ₁植物は表現型的に野生型であり、個々の系統において劣性突然変異を示す。nim１−５は、すべての35のＦ₁植物においてnim表現型を示し、このことは、この特定の変異体が優性であることを示す。確認のために、相互交雑（reciprocal cross）が、Ws−Ｏ植物を受精するために花粉ドナーとして nim１−５を用いて実施された。この場合、18個すべてのＦ₁植物は表現型的にni mであり、nim１−５突然変異の優性を確証した。 nim１−２〜nim１−６突然変異が前に特徴づけられたnim１−１突然変異に対して対立形質であるかどうかを決定するために、nim１−１からの花粉が、nim１ −２〜nim１−６を受精するために使用された。nim１−１はカナマイシンに対する耐性を担持するので、Ｆ₁子孫が抗生物質耐性により同定された。すべての場合、カナマイシン耐性Ｆ₁植物はnimであり、このことは、それらがnim１−１変異体に対してすべて対立形質であることを示す。nim１−５変異体は優性であり、そして明らかに突然変異のためにホモ接合性であるので、Ｆ₂世代におけるnim １−１相補性を分析することが必要である。nim１−１及びnim１−５が対立形質である場合、すべてのＦ₂植物はnim表現型を有することが予測される。そうでない場合、16本のＦ₂植物のうち13本は、nim表現型を有することが予測された。94 本の植物のうち、88本は、INA処理に続いて、菌類増殖を明確に維持した。６本の植物は、損傷模擬表現型を示す葉上の黒色小斑点の関連表現型を示し、そしてINA処理に続いて、菌類の増殖をほとんど維持しなかった。nim１−５はNIM１遺伝子に点突然変異を担持するので（下記参照のこと）、それはnim１対立遺伝子であると思われる。異なったnim１対立遺伝子の相対的強さを決定するために、個々の変異体が、正常な増殖条件下で及びSA，INA又はBTHのいづれかによる前処理に続いて、Ｐ．パラシチカの増殖について分析された。表１に示されるように、正常な増殖の間、nim１−１，nim１−２，nim１−３，nim１−４及びnim１−６のすべては、Ws −Ｏ対照よりもいく分、早い、菌類増殖のほぼ同じ速度を維持した。但し、菌類増殖が他のnim１変異体及びWs−Ｏ対照の両者に関して数日、遅延される例外が存在したが、しかし結果的にはすべてのnim１−５植物が菌類に対して負けた。S A処理に続いて、変異体は次の３種のクラスにグループ分けされ得た：nim１−４及びnim１−６は比較的早い菌類増殖を示し；nim１−１，nim１−２，nim１−３植物は菌類増殖のいく分、遅い速度を示し；そしてnim１−５植物における菌類増殖は未処理のWs−Ｏ対照においてよりもさらに遅かった。INA又はBTH処理に続いて、変異体は３種のクラスに分類されると思われ、ここでnim１−４が化学物質処理に続いて菌類増殖を制限する能力を最とも強く弱められ；nim１−１，nim １−２，nim１−３及びnim１−６はすべて、適度に弱められ；そしてnim１−５は単にわずかに弱められた。それらの実験においては、Ws−Ｏは、INA又はBTH処理に続いて、菌類増殖を維持しなかった。従って、化学物質処理に続く菌類増殖の阻害に関して、変異体は、最とも強く弱められるnim１−４、菌類の中間ぐらいの阻害を示すnim１−１，nim１−２，nim１−３及びnim１−６、及び単にわずかに低められた菌類耐性を有するnim１−５の３種のクラスに分類される。 PR−１ mRNAの蓄積はまた、異なったnim１対立遺伝子を特徴づけるための基準としても使用された。RNAを、水又は化学物質処理の３日後、又は適合する菌類（Ｐ．パラシチカ(P．parasitica)単離物Emwa）による接種の14日後、植物から抽出した。図３におけるRNAゲルブロットは、PR−１ mRNAがSA，INA又はBTHによる野生型植物の処理、又はＰ．パラシチカによる感染に続いて、高レベルで蓄積したことを示す。nim１−１，nim１−２、及びnim１−３植物においては、PR− １ mRNA蓄積は、化学物質処理の後、野生型に比較して、劇的に減じられた。PR −１ mRNAはまた、Ｐ．パラシチカ感染に続いて減じられたが、しかしそれらの変異体にはいくらかの蓄積がまだ存在した。nim１−４及びnim１−６植物においては、PR−１ mRNA蓄積は、化学物質処理に続いて（より長い暴露から明らかである）、他の対立遺伝子においてよりも、より劇的に減じられ、そして有意に低いPR−１ mRNAがＰ．パラシチカ感染に続いて蓄積し、このことは、それらが特に強いnim１対立遺伝子であり得た認識を支持する。興味あることには、PR−１ mRNA蓄積はnim１−５変異体において高められたが、しかし化学物質処理又はＰ．パラシチカ感染に続いて単に軽く減じられた。PR−１ mRNA蓄積及び菌類感染の両者に基づいて、変異体は次の３種のクラスに分類される：強く弱められた対立遺伝子(nim１−４及びnim１−６)；適度に弱められた対立遺伝子(nim１−１， nim１−２、及びnim１−３)；及び弱く弱められた対立遺伝子(nim１−５)。 nim１突然変異の精巧な構造マッピング NIM１についての大まかな地図位置を決定するために、nim１−１（Ws−Ｏ）とランドスベルグエレクタ（Lendsberg erecta）(Ler)との間の交雑からの74本のＦ₂nim表現型植物が、INA処理に続いて、Ｐ．パラシチカに対するそれらの感受性及びPR−１ mRNAの蓄積の欠乏について同定された。多くの単純な配列長多型現象（SSLP）マーカー（Bell and E cker，1994）を試験した後、nim１は、染色体１の低いアーム上で、nga128から約8.2cM及びnga111から8.2cMに位置することが見出された。続く分析においては、nim１−１は、nga111とSSLPマーカーATHGENEAから約４cMの位置との間に存在することが見出された。精巧な構造マッピングのために、nim１−１とLerDP23との交雑に由来するＦ₂ 集団からの1138本のnim植物が、INA処理に続いて、PR−１ mRNAを蓄積するそれらの無能性及び菌類増殖を維持するそれらの能力の両者に基づいて同定された。 DNAが、それらの植物から抽出され、そしてATHGENEA及びnga111の両者で接合性について評価された。図５Ａ−５Ｄに示されるように、93個の組換え染色体がAT HGENEAとnim１との間に同定され、これは約4.1cMの遺伝距離（2276中93）を付与し、そして239個の組換え染色体がnga111とnim１との間に同定され、これは約10 .5cMの遺伝距離(2276中239)を示す。ATHGENEA〜nga111間における有益な組換え体がさらに、増幅されたフラグメントの長さの多型現象（AFLP）分析を用いて分析された(Vosなど.，1995)。始めに、ATHGENEAとnga111との間の10個のAFLPマーカーが同定され、そしてそれらがその領域の低い解決地図を構成するために使用された（図５Ａ）。AFLPマーカーＷ84.2(nim１から１cM)及びＷ85.1(nim１から0.6cM)が、CIC(Centre d'Et ude du Polymorphisme Humain，INRA and CNRS)ライブラリー(Creusotなど.，19 95)から酵母人工染色体(YAC)クローンを単離するために使用された。２種のYAC クローン、すなわちCIC12H07及びCIC12F04がＷ84.2により同定され、そして２種のYACクローンCIC7E03及びCIC10G07（データは示されていない）がＷ85.1マーカーにより同定された。しかしながら、２種の組のフランキングYACクローン間にギャップが存在することが決定された。この点から、細菌人工染色体(BAC)、及びCIC12H07及びCIC12F04をオーバーラップするＰ１クローンが同定され、そしてマッピングされ、そして次に、NIM１の方にBAC／Ｐ１contigを拡張する連続的移動段階が実施された(Liuなど.，1995；Ch ioなど.，1995)。その移動の間、種々の時間で、BAC又はＰ１クローンに対して特異的である新規AFLPが展開され、そしてそれらが、NIM１遺伝子が交差されたかどうかを決定するために使用された。NIM１は、両AFLPマーカーＬ84.6a及びＬ 84.8を生ぜしめるBAC及びＰ１クローンが単離される場合、交差されたことが決定された。Ｐ１クローンＰ１−18，Ｐ１−17及びＰ１−21上で見出されたAFLP マーカーＬ84.6ａは３種の組換え体を同定し、そしてＰ１クローンＰ１−20，Ｐ１−22，Ｐ１−23及びＰ１−24、及びBACクローンBAC−04，BAC−05及びBAC− 06上で見出されたＬ84.8は１つの組換え体を同定した。それらのクローンは大きなcontig(＞100kb)を形成するためにオーバーラップし、そしてnim１を端に有するAFLPマーカーを含むので、その遺伝子はcontig上に位置した。そのcontigを含んで成るBAC及びＰ１クローンは、nim１が約0.09cMのギャップを表わす、Ｌ84.Y 1とＬ84.8との間に位置することを示した８個の追加のAFLPマーカーを生成するために使用された。コスミドライブラリーが、BAC−06，BAC−04及びＰ１−18を用いて、アグロバクテリウム−適合性Ｔ−DNAコスミドベクターpCLD04541において構成された。コスミドcontigが、それらのクローンに由来するAFLPマーカーを用いて展開された。物理的マッピングは、Ｌ84.Y1とＬ84.8との間の物理的距離が90kbよりも大きいことを示し、このことは、１cM当たり約１メガ残基の物理的距離を遺伝距離に提供した。NIM１遺伝子の後での同定を促進するために、BAC−04のDNA配列が決定された。 NIM１遺伝子の単離コスミドがNIM１遺伝子を含むか否かを同定するために、例の表４に列挙される12個のコスミドがnim１−１中に形質転換され、そして形質転換体が変異体表現型を補完するそれらの能力について評価された。コスミドＤ５，Ｅ１及びＤ７はすべて、INA処理に続いてPR−１ mRNAを蓄積する形質転換体の能力により決定される場合、nim１−１を補完することが見出された。それらのコスミドの末端が分離され、そしてBAC−04のDNA配列に基づいて位置することが見出された。NI M１遺伝子を含むＤ７及びＤ５により共有されるDNA領域に9,918個の塩基対が存在した。図５Ｄに示されるように、４個の推定上の遺伝子領域がこの10−kb配列に同定された。領域１は、潜在的に19,105Ｄのタンパク質をコードし、領域３は 44,554Ｄのタンパク質をコードし、そして領域４は52,797Ｄのタンパク質をコードする。領域２は、一緒に密接して位置する種々のサイズの４種の読み取り枠を有し、これは３種のイントロンを有する遺伝子を示唆する。Net Plant Geneプログラム（Hebsgaardなど.，1996）を用いての分析は、読み取り枠が66,039Ｄのタンパク質をコードする大きな読み取り枠を形成するために一緒にスプライシングされ得た高い確立を示した。遺伝子領域がNIM１遺伝子を含むことを確かめるために、水又は化学物質処理に続いて、Ws−Ｏ及び異なったnim１変異体の葉組織から単離されたRNAを含むゲルブロットが、４種の遺伝子領域の個々に由来するDNAによりプローブされた。それらの実験においては、プローブを高い比活性にラベルすることに注意が払われ、そしてオートラジオグラフが１週以上もの間、照射された。本発明者の過去の実験において、それらの条件は、細胞当たり約１つのコピーの濃度でDNAを同定することができた。検出できるRNAを生成する唯一の遺伝子領域は、遺伝子領域２であった。図７に示されるように、遺伝子領域２により同定されるmRNAは、野生型植物のBTH処理により誘発されたが、しかし変異体のいづれにおいても誘発されなかった。さらに、RNA蓄積は、Ｐ．パラシチカ感染に続いて、すべての植物において高められた、このことは、この特定の遺伝子が、病原体感染に続いて、誘発されることを示す。 NIM１をコードする遺伝子領域をさらに確立するために、４種の遺伝子領域の個々からのDNA配列がnim１対立遺伝子の個々について決定され、そしてWs−Ｏからのその対応する遺伝子領域に比較された。突然変異は、Ws−Ｏと遺伝子領域３又は４のいづれかにおける変異体対立遺伝子との間に検出されず、そして単一の変化のみが、nim１−６変異体における遺伝子領域１に見出された。しかしながら、単一の塩基対突然変異が、領域２のためのWs−Ｏに関しての対立遺伝子の個々に見出された。遺伝子領域２のDNA配列は図６に示される。表５及び図６に示されるように、nim１−１においては、単一のアデノシンが、７個のアミノ酸の変更及び349個のアミノ酸の欠失をもたらすフレームシフトを引き起こす位置357 9で挿入される。nim１−２においては、ヒスチジンをチロシンに変更する位置37 63でシチジン対チミジン変異が存在する。nim１−３においては、単一のアデノシンが、予測されるタンパク質から10個のアミノ酸を変更し、そして412個のアミノ酸を欠失するフレームシフトを引き起こす位置3301で欠失されている。興味あることには、nim１−４及びnim１−５の両者は、アルギニンをリシンに変更する位置4160でグアノシン対アデノシン変異を有し、そしてnim１−６においては、予測されるタンパク質からの255個のアミノ酸の欠失を引き起こす停止コドンをもたらすシトシン対チミジン変異が存在する。nim１−４及びnim１−５における突然変異はmRNAのためのコンセンサスドナースプライス部位を変更するが、RT−PCR分析は、この突然変異がmRNAスプライシングの変更を導びかないことを示す（データは示されていない）。 NIM１相同体遺伝子領域２のDNA配列がBlast研究(Altschulなど.，1990)に使用され、そしてアラビドプシス発現された配列標識(EST)T22612と正確に適合し、そして米EST Ｓ2556，Ｓ2861，Ｓ3060及びＳ3481との有意な適合を同定した（図８を参照のこと）。塩基対2081〜3266を含むDNAプローブが、アラビドプシスcDNAライブラリーをスクリーンするために使用され、そして遺伝子領域２に対応する14個のクローンが単離された。そのcDNA配列から、本発明者は、図６に示されるエキソン／イントロン境界の置換を確かめることができた。ポリメラーゼ鎖反応によるcD NA末端の急速な増殖（RACE）が、INA−処理されたWs−Ｏ植物からのRNAを用いて実施され、そして適切な転写開始部位が図６において位置2588でＡであることが決定された。プローブとしてNIM１ cDNAを用いて、アラビドプシスNIM１の相同体を同定し、そして異なった植物、たとえば次の収穫物植物（但し、それらだけには限定されない）からのゲノム又はcDNAライブラリーの、スクリーニングを通して単離された：米、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、インゲン豆、エンドウ豆、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、カボチャ、ズキニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラーズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシ及びサトウキビ。これを達成するための標準の技法は、プレートされたDNAライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング（プラーク又はコロニーのいづれか；たとえば、Sambrookなど.，Molecular C loning ，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)を参照のこと）、及びオリゴヌクレオチドプライマーを用いてのPCRによる増殖（たとえば、Inn isなど.，PCR Protocols ，a Guide to Methods and Applications eds.，Academ ic Press（1990）を参照のこと）を包含する。同定される相同体は、下記に列挙される発現ベクター中に遺伝子的に構築され、そして上記列挙される収穫物中に形質転換される。形質転換体が、試験される収穫物植物の相当する病原体を用いて、増強された耐病性について評価される。たとえば、キュウリ、トマト、タバコ、トウモロコシ、小麦及び大麦のゲノムにおけるNIM１相同体が、DNAブロット分析により検出されている。ゲノムDNAがキュウリ、トマト、タバコ、トウモロコシ、小麦及び大麦から単離され、酵素Ba mHI，HindIII，XbaＩ、又はSalＩにより制限消化され、0.8％のアガロースゲル上で電気泳動分離され、そして細管ブロットによりナイロン膜に移される。DNA を結合するためにUV−架橋に続いて、膜が低い緊縮条件〔（１％のBSA；520mMの NaPO₄，pH7.2；７％の硫酸ラウリル、ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム）、55℃で18〜24時間〕下で、³²Ｐ−放射性ラベルされたアラビドプシスタリアナNIM１ cDNAによりハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションに続いて、ブロットが低い緊縮条件〔６×SSCで15分間、（Ｘ３）３×SSCで15分間、55℃で（Ｘ１）の洗浄；１×SSCは0.15ＭのNaCl， 15mMのクエン酸ナトリウム(pH7.0)である〕下で洗浄され、そしてNIM１に対応するバンドを可視化するためにＸ−線フィルムに照射された。さらに、NIM１遺伝子との類似性により同定される発現された配列標識(EST)、たとえば上記の米ESTがまた、相同体を単離するために使用され得る。米ESTは、他の単子葉植物からのNIM１相同体の単離のために特に有用であり得る。相同体はまた、PCRによっても得られる。この方法においては、既知の相同体間で比較が行なわれる（たとえば、米及びアラビドプシス）。次に、高いアミノ酸及びDNA類似性又は同一性の領域が、PCRプライマーを製造するために使用される。適切な領域が同定されると、第３コドン位置に種々の置換を有する、その領域のためのプライマーが製造される。PCR反応が、種々の標準条件下でcDNA又はゲノムDNAから実施される。バンドが明らかである場合、それはクローン化され、そして／又はそれがNIM１相同体であるかどうかを決定するために配列決定される。 NIM１の過剰発現は植物に耐病性を付与する本発明はまた、NIM１遺伝子、又はその機能的変異株及び変異体を野生型レベルよりも高く発現し、そしてそれにより、広範囲の耐病性を有するトランスジェニック植物の生成にも関する。本発明の好ましい態様においては、NIM１遺伝子の発現は、野生型植物におけるNIM１遺伝子の発現レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで存在する。NIM１遺伝子の過剰発現は、構成免疫性(CIM)表現型を有する植物を生ぜしめることにおいて、インジューサー化合物の効果を模倣する。 NIM１遺伝子を過剰発現し、そしてそれにより、CIM表現型を有する植物を生成するためのいくつかの方法が記載されている。第１の方法は、NIM１の高レベル発現を有し、そして従って、挿入部位効果のためにC IM表現型を有する形質転換された植物を選択する。表６は、菌類感染に対する耐性についての種々の形質転換体の試験の結果を示す。この表から見出され得るように、多くの形質転換体は正常よりも低い菌類増殖を示し、そしていくつかの形質転換体は眼に見える菌類増殖をまったく示さなかった。RNAが、Delaneyなど. ，1995に記載されるようにして、集められたサンプルから調製され、そして分析された。ブロットが、アラビドプシス遺伝子プローブPR−１にハイブリダイズされた(Uknesなど.，1992)。３種の系統は、PR−１ mRNAが菌類処理に続いて、24 又は48時間までに明らかになることで、PR−１遺伝子発現の初期誘発を示した。それらの３種の系統はまた、菌類感染に対する耐性を示した。さらに、活性NIM１タンパク質をコードするコード領域に操作可能的に連結される構成植物活性プロモーター、たとえばCaMV 35Ｓプロモーターを含んで成る植物形質転換ベクターを構成するための方法が記載されている。高レベルの活性 NIMIタンパク質は、誘発性化学物質、たとえばBTH，INA及びSAによる化学的誘発と同じ耐病性効果を生成する。 NIM１遺伝子はＩκＢαの相同体である NIM１遺伝子は、植物における全身性後天性耐性(SAR)経路のキー成分である(R yalsなど.，1996)。NIM１遺伝子は、化学的及び生物学的インジューサーによるS ARの活性化に関与され、そしてそのようなインジューサーと共に、SAR及びSAR遺伝子発現のために必要とされる。NIM１遺伝子の位置は、広範囲の種類の病原体に対する高い感受性を宿主植物に与え、そしてそれらを、SARの病原体及び化学的インジューサーに対する応答を不可能にする変異体nim１遺伝子を担持することが知られている変異体植物のゲノムの分子生物学的分析により決定された。アラビドプシスの野生型NIM１遺伝子がマッピングされ、そして配列決定された（配列番号２）。野生型NIM１遺伝子生成物（配列番号３）は、アラビドプシスにおけるSAR及び遺伝子対遺伝子耐病性の両者を導びくシグナル伝達カスケードに関与される(Ryalsなど.，1997)。NIM１の野生型の組換え過剰発現は、構成免疫性(CIM)表現型を有する植物を生ぜしめ、そして従って、トランスジェニック植物に耐病性を付与する。活性NIM１タンパク質の高められたレベルは、誘発性化学物質、例えばBTH，INA及びSAによる化学的誘発と同じ耐病性効果を生成する。 NIM１遺伝子の配列（配列番号２）は、BLAST研究に使用され、そして多くのタンパク質、例えばスペクトリン、アンキリン、NF−κＢ及びＩκＢに見出されるアンキリンドメインに対する、NIM１遺伝子配列における１つのかなり高く保存されたドメインの相同性に基づいて、適合性が同定された(Michaely and Bennet t，Trends Cell Biol．2，127-129(1992))。しかしながら、アンキリンモチーフ以上に、従来のコンピューター分析は、他の強い相同性、たとえばＩκＢαに対する相同性を検出しなかった。コンピュータープログラムの欠点にかかわらず、 NIM１タンパク質（配列番号３）と70個の既知のアンキリン含有タンパク質との間の対称式の(pair-wise)可視診査が実施され、そして著しい類似性が転写レキュレーターのＩκＢαクラスのメンバーに見出された（Baeuerle and Baltimore 1996；Baldwin 1996）。図９に示されるように、NIM１タンパク質（配列番号３）は、マウス、ラット及びブタからのＩκＢαタンパク質（配列番号18，19、及び20）と有意な相同性を共有する。 NIM１は、タンパク質の完全な長さを通してＩκＢαのいくつかの重要な構造ドメイン、たとえばアンキリンドメイン（図９においてダッシュの下線により示される）、２つのアミノ−末端セリン(NIM１のアミノ酸55及び59)、一対のリシン(NIM１におけるアミノ酸99及び100)、及び酸性Ｃ− 末端を含む。全体的に、NIM１及びＩκＢαは、残基の30％での同一性、及び残基の50％での保存性置換を共有する。従って、80％の全体的な類似性を伴って、タンパク質を通してＩκＢαとNIM１との間に相同性が存在する。ＩκＢαタンパク質がシグナル伝達において機能する１つの手段は、細胞質ゾル転写因子NF−κＢに結合し、そして核へのその侵入及び標的遺伝子の転写の変更を阻止することによってである（Baeuerle and Baltimore，1996；Baldwin，1 996）。NF−κＢの標的遺伝子は、いくつかの細胞工程、たとえば抗ウィルス、抗微生物及び細胞死応答を調節する（活性化又は阻害する）（Baeuerle and Bal timore，1996）。シグナル伝達経路が活性化される場合、ＩκＢαは２つのセリン残基（マウスＩκＢαのアミノ酸32及び36）でリン酸化される。これは、２個のリシン（マウスＩκＢαのアミノ酸21及び22）でのユビキチン化をプログラムする。ユビキチン化に続いて、NF−κＢ／ＩκＢ複合体がプロテオソームを通して経路を定められ、ここでＩκＢαが分解され、そしてNF−κＢが核に開放される。ＩκＢα機能において重要なリン酸化されたセリン残基は、アミノ酸35〜84からの保存された配列の大きな連続したブロック内のNIM１に保存される（図９）。２つのリシンがタンパク質のＮ−末端側に向かって約15個のアミノ酸位置に位置するＩκＢαとは対照的に、NIM１において、２つのリシンはＣ−末端側に向かって約40個のアミノ酸位置に位置する。さらに、高い程度の相同性が、基本的な回転率において重要であることが示されているセリン／トレオニンに富んでいるカルボキシ末端領域において、NIM１とＩκＢαとの間に存在する（Sunなど.，Mol．Cell．Biol．16，1058-1065(1996)）。ＩκＢ α機能のために重要であることが知られている要素の構造的相同性の分析及びその存在に基づく本発明によれば、NIM１はＩκＢαのように機能することが予測され、すなわち植物遺伝子調節に対して類似する効果を有する。インジューサー化学物質により処理される場合、野生型NIM１遺伝子を含む植物は、より多くのNIM１遺伝子生成物（ＩκＢ相同体）又はNIM１遺伝子生成物（ＩκＢ相同体）の低いリン酸化を有することが予測される。このモデルによれば、その結果は、植物NF−κＢ相同体が核の外に維持され、そしてSAR遺伝子発現及び耐性応答が生ぜしめられることである。nim１変異植物においては、非機能的NIM１遺伝子生成物が存在する。従って、このモデルによれば、NF−κＢ相同体は、核に自由に進行し、そして耐性及びSAR遺伝子発現を自由に抑制する。この考えと一致すれば、サリチル酸により処理された動物細胞は、核において、ＩκＢの高められた安定性／多量性、及び活性NF−κＢの低下を示す（Kopp a nd Ghosh，1994）。超−リプレッサー又は優性−陰性体として作用する、ＩκＢの突然変異は知られている(Britta-Mareen Traencknerなど.，EMBO 14：2876-28 83（1995）；Brownなど.，Science 267：1485-1488(1996)；Brockmanなど.，Mol ecular and Cellular Biology 15：2809-2818(1995)；Wangなど.，Science 274 ：784-787(1996))。ＩκＢのそれらの変異形は、NF−κＢに結合するが、しかしリン酸又はユビキチン化されず、そして従って分解されない。NF−κＢはＩκＢに結合されたまま存続し、そして核中に移動し得ない。 NIM１遺伝子の変更された形上記観点において、本発明は、SARシグナル伝達経路の優性−陰性レギュレーターとして作用する、NIM１の変更された形を包含する。NIM１のそれらの優性陰性形により形質転換された植物は、NIM１の変更された形により形質転換された植物が構成SAR遺伝子発現及び従ってCIM表現型を示すことで、nim １変異体植物として反対の表現型を有する。NIM１遺伝子がSARシグナル伝達経路に持続するこの見解のために、本明細書に特別に開示される変更の他に、遺伝子への多くの変更が、SAR遺伝子及び従って、CIM表現型の構成発現をもたらすであろう。ヒトＩκＢαにおけるセリン残基のリン酸化が、ＩκＢαの刺激活性化された分解、それによるNF−κＢの活性化のために必要とされる。ヒトＩκＢαにおけるセリン残基のアラニン残基への突然変異誘発は、刺激−誘発されたリン酸化を阻害し、従って、ＩκＢαプロテオソーム−介在性分解をブロックする(Traenck nerなど.，1995；Brownなど.，1996；Brockmanなど.，1995；Wangなど.，1996) 。ＩκＢαのこの変更された形は、細胞質にNF−κＢを保持し、それにより下流のシグナル化現象をブロックすることによって優性−陰性形として機能することができる。図９に示されるNIM１とＩκＢとの間のアミノ酸比較に基づけば、NIM １（配列番号３）におけるセリン55（Ｓ55）及び59（Ｓ59）は、ヒトＩκＢαにおけるＳ32及びＳ36と相同である。NIM１の優性−陰性形を構成するために、アミノ酸位置55及び59でのセリンがアラニン残基に突然変異誘発される。従って、本発明の好ましい態様においては、NIM１遺伝子は、コードされた生成物がアラビドプシスNIM１アミノ酸配列の位置55及び59に対応するアミノ酸位置においてセリンの代わりにアラニンを有するよう変更される。本発明はまた、そのような NIM１遺伝子の変更された形により形質転換された耐病性トランスジェニック植物、及び形質転換された植物に耐病性を付与し、そしてSAR 遺伝子発現を活性化するためへの前記NIM１遺伝子のこの変更された形を用いる方法も包含する。ユビキチン化リシン残基Ｋ21及びＫ22、及びリン酸化部位Ｓ32及びＳ36を包含する、ヒトＩκＢαのアミノ酸１〜36(Brockmanなど.，1995；Sunなど.，1996) 又は１〜72(Sunなど.，1996)の欠失は、トランスフェクトされたヒト細胞培養物において優性−陰性ＩκＢα表現型をもたらす。NIM１遺伝子生成物の最初の125 個のアミノ酸のＮ−末端欠失は、上記で論ぜられたＳ55及びＳ59でユビキチン化部位及び推定上のリン酸化部位として作用する８個のリシン残基を除去するであろう。従って、本発明の好ましい態様においては、NIM１遺伝子は、コードされた生成物が生来のアラビドプシスNIM１アミノ酸配列に比較して、最初の125個のアミノ酸をほぼミッシングするよう変更される。本発明はまた、そのようなNIM １遺伝子の変更された形により形質転換された耐病性トランスジェニック植物、及び形質転換された植物に耐病性を付与し、そしてSAR遺伝子発現を活性化するためへのNIM１遺伝子のこの変更された形の使用方法も包含する。ヒトＩκＢαのアミノ酸261〜317の欠失は、そのＣ−末端におけるセリン及びトレオニンの構成リン酸化をブロックすることによって、増強された固有の安定性をもたらすことができる。ＩκＢαのこの変更された形は、優性−陰性形として機能することが予測される。セリン及びトレオニンに富んでいる領域は、NIM １のＣ−末端におけるアミノ酸522〜593で存在する。従って、本発明の好ましい態様においては、NIM１遺伝子は、そのコードされた生成物が、生来のアラビドプシスNIM１アミノ酸配列に比較して、アミノ酸522〜593を包含するそのＣ−末端部分をほぼミッシングするよう変更される。本発明はまた、そのようなNIM１遺伝子の変更された形により形質転換された耐病性トランスジェニック植物、及びその形質転換された植物に耐病性を付与し、そしてSAR遺伝子発現を活性化するためへのNIM１遺伝子のこの変更された形の使用方法も包含する。本発明のもう１つの態様においては、NIM１遺伝子生成物の変更された形がＣ −末端及びＮ−末端セグメントの欠失又はキメラ化の結果として生成される。本発明のさらにもう１つの態様においては、NIM１遺伝子からのアンキリンドメインを含んで成る構造体が供給される。本発明は、そのようなNIM１キメラ又はアンキリン構造体により形質転換された耐病性トランスジェニック植物、及びその形質転換された植物に耐病性を付与し、そしてSAR遺伝子発現を活性化するためへのNIM１遺伝子のそれらの変異体の使用方法を包含する。本発明は、NIM１遺伝子の変更された形、たとえば上記の形をコードするDNA分子、そのようなDNA分子を含む発現ベクター、及びそれにより形質転換された植物及び植物細胞に関する。本発明はまた、NIM１遺伝子生成物の変更された形をコードするDNA分子により植物を形質転換することによって、植物においてSARを活性化し、そして植物にCIM表現型及び広範囲の耐病性を付与する方法にも関する。本発明はさらに、NIM１遺伝子の変更された形により形質転換された植物にも関する。耐病性植物における野生型NIM１遺伝子の過剰発現、及び植物におけるNIM１遺伝子の変更された形の発現は、広範囲の次の植物病原体に対しての免疫性をもたらす：ウィルス又はウイロイド、たとえばタバコ又はキュウリモザイクウィルス、輪紋病ウィルス又は壊死ウィルス、ペラルゴニウム(Pelargonium)葉巻きひげウィルス、レッドクローバー斑点ウィルス、トマト低木矯化病ウィルス及び同様のウィルス；菌類、たとえばフィトプソラ・パラシチカ（Phythophthora parasitica）及びペロノスポラ・タバシナ(Peronospora tabacina)；細菌、たとえばプソイドモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）及びプソイドモナス・タバシ(Pseudomonas t abaci)；昆虫、たとえばアリマキ、たとえばミズス・ペルシカエ(Myzus persica e)；及び鱗翅類、たとえばヘリオサスspp．(Heliothus spp.)；及び線虫類、たとえばメロイドジネ・インコグニタ（Meloidogyne incognita）(但し、それらだけには限定されない)。本発明のベクター及び方法は、次のような多くの病原生物に対して有用である：べと病菌、たとえばスクレロプソラ・マクロスポラ(Scl eropthora macrospora)、スクレロプソラ・ライザイアエ(Sclerophthora rayiss iae)、スクレロスポラ・グラミニコラ(Sclerospora graminicola)、ペロノスクレロスポラ・ソルギ（Peronosclerospora sorghi）、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス（Peronosclerospora philippinensis）、ペロノスクレロスポラ・サカリ（Peronosclerospora sacchari）及びペロノスクレロスポラ・マイジス (Peronosclerospora maydis)；サビ病菌、たとえばプシニア・ソルフィ(Puccini a sorphi)、プシニア・ポリソラ（Puccinia polysora）及びフィソペラ・ゼアエ (Physopella zeae)；他の菌類、たとえばセルコスポラ・ゼアエーマイジス（Cer cospora zeae-maydis）、コレトトリカム・グラミニコラ（Colletotrichum gram inicola）、フサリウム・モノリホルム（Fusarium monoliforme）、ギベレラ・ゼアエ(Gibberella Zeae)、エクセロヒラム・ツルシカム（Exserohilum turcicu m）、カバチエル．ゼアエ(Kabatiellu zeae)、エリシフェ・グラミニス(Erysiph e graminis)、セプトリア（Septoria）及びビポラリス・マイジス(Bipolaris ma ydis)；及び細菌、たとえばエルウイナ・ステワルチ（Erwinia stewartii）(但し、それらだけには限定されない)。本発明の方法は、広範囲の種類の植物、たとえば裸子植物、単子葉植物及び双子葉植物に対して耐病性を付与するために使用され得る。耐病性は３種の広いクラス内に分類されるいづれかの植物に対して付与され得るが、それは特に次のような農業経済学的に重要な収穫植物において有用である：米、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、インゲン豆、エンドウ豆、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、カボチャ、ズキニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラーズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシ及びサトウキビ。形質転換された細胞は、その遺伝子が損なわれていないトランスジェニック植物に対して耐病性を付与するよう完全な植物に再生され得る。その発現システムは、耐病性遺伝子が連続的又は構成的に発現されるよう修飾され得る。組換えDNA技法 SAR遺伝子発現の誘発を可能にすることによって植物に耐病性を付与するNIM１ DNA分子又は遺伝子フラグメント、又はSAR遺伝子発現を増強することによって植物に耐病性を付与するNIM１遺伝子の変更された形が、従来の組換えDNA技法を用いて、植物又は細菌細胞に組込まれ得る。一般的に、これは、配列番号１内に含まれるDNA分子、又はその機能的変異体、又は上記NIM１の変更された形の１つをコードする分子を、前記DNA分子が異種である（すなわち、通常存在しない）発現システム中に挿入することを包含する。異種DNA分子は、正しい配向で及び正しく読み取り枠と整合して、発現システム又はベクター中に挿入される。ベクターは、挿入されたタンパク質コードの配列の転写及び翻訳のための必要な要素を含む。当業界において知られている多数のベクターシステム、たとえばプラスミド、バクテリオファージウィルス及び他の修飾されたウィルスが使用され得る。適切なベクターは、ウィルスベクター、たとえばλベクター系λgt11，λgt10及びカロンチ；プラスミドベクター、たとえばpBI121，pBR3 22，pACYC177，pACYC184，pARシリーズ、pKK223-3，pUC8，pUC9，pUC18，pUC19 ，pLG339，pRK290，pKC37，pKC101，pCDNAII；及び他の類似するシステムを包含するが、但しそれらだけには限定されない。本明細書に記載されるNIM１コード配列、及び変更されたNIM１コード配列は、Maniatisなど.，Molecular Cloning ：A Laboratory Manual ，Cold Spring Laboratory，Cold Spring Harbor，New Y ork（1982）により記載のようにして、標準のクローニング方法を用いてベクター中にクローン化され得る。本発明の遺伝子又は遺伝子フラグメントの効果的な発現を得るためには、十分な発現レベル又は構成発現をもたらすであろうプロモーターが発現ベクターに存在すべきである。RNAポリメラーゼは通常、プロモーターに結合し、そして遺伝子の転写を開始せしめる。プロモーターは、それらの強さ、すなわち転写を促進する能力において異なる。使用される宿主細胞系に依存して、多くの適切なプロモーターのいづれか１つが使用され得る。発現カセットの成分は、発現を高めるために修飾され得る。たとえば、切断された配列、ヌクレオチド置換、又は他の修飾が使用され得る。次に、そのような修飾された発現システムにより形質転換された植物細胞は、SARの活性化のために必要な遺伝子の過剰発現又は構成発現を示す。Ａ．植物形質転換ベクターの構成多くの形質転換ベクターが植物形質転換のために利用でき、本発明の遺伝子は、いかなるベクターとも結合させて利用できる。そしてベクターの選択は、好ましい形質転換技法及び形質転換のための標的物種に依存するであろう。一定の標的物種のためには、異なった抗生物質又は除草剤選択マーカーが好ましい。形質転換に通常、使用される選択マーカーは、カナマイシン及び関連する抗生物質に対する耐性を付与するnpt11遺伝子（Messing & Vierra，Gene 19：259-268(1982 )；Bevanなど.，Nature 304：184-187(1983)）、除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するbar遺伝子（Whiteなど.，Nucl．Acids Res．18：1062(1990) ；Spencerなど．Theor．Appl．Genet 79：625-631(1990)）、抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与するhph遺伝子（Biochinger & Diggelmann，Mol Cell Biol 4：2929-2931）、及びメタトレキセートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子(Bourouisなど.，EMBO J．2(7): 1099-1104(1983))、並びにグリホサートに対する耐性を付与するEPSPS遺伝子（アメリカ特許第4,940,935号及び第5,188,642号）を包含する。１．アグロバクテリウム形質転換のために適切なベクター多くのベクターが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium t umefaciens)を用いての形質転換のために利用できる。それらは、典型的には、少なくとも１つのＴ−DNAボーダー配列を担持し、そしてベクター、たとえばpBI N19（Bevan，Nucl．Acids Res．(1984)）及びpXYZを含む。下記に、２種の典型的なベクターの構成が記載される。ａ．pCIB200及びpCIB2001：二元ベクターpCIB200及びpCIB2001が、アグロバクテリウムと共に使用するための組換えベクターの構成のために使用され、そして次の態様で構成される。pT JS75kanが、テトラサイクリン−耐性遺伝子の切り出し、続いて、NPTIIを担持するpUC4K（Messing & Vierra，Gene 19：259-268(1982)；Bevanなど.，Nature 30 4 ：184-187(1983)；McBrideなど.，Plant Molecular Biology 14：266-276(1990 )）からのAcclフラグメントの挿入を可能にする、pTJS75(Schmidhauser & Helin ski，J．Bacteriol．164：446-455(1985))のNarＩ消化により創造される。XhoＩリンカーが、左及び右Ｔ−DNAボーダー、植物選択nos／nptIIキメラ遺伝子及びp UCポリリンカーを含むPCIB7のEcoRＶフラグメントに連結され(Rothsteinなど.， Gene 53：153-161(1987))、そしてXhoＩ−消化されたフラグメントがpCIB200を創造するためにSalＩ−消化されたpTJS75kan中にクローン化される（また、EP03 32104の例19を参照のこと）。pCIB200は次のユニークポリリンカー制限部位を含む：EcoRＩ，SstＩ，KpnＩ，BglＩ，XbaＩ及びSalＩ。pCIB2001は、追加の制限部位のポリリンカー中への挿入により創造されるpCIB20０の誘導体である。pCIB 2001のポリリンカー中のユニーク制限部位は、EcoRＩ，SstＩ，KpnＩ，BglII，X baＩ，SalＩ，MluＩ，BclＩ，AvrII，ApaI，HpaＩ、及びStuＩである。pCIB2001 は、それらのユニーク制限部位を含む他に、また、植物及び細菌カナマイシン選択、アグロバクテリウム介在の形質転換のための左及び右Ｔ−DNAボーダー、Ｅ．コリと他の宿主との間の移動のためのRK２−由来のtrfA機能、及びまたRK２からのOriT及びOriV機能を有する。pCIB2001ポリリンカーは、それら自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングのために適切である。ｂ．pCIB10及びそのヒグロマイシン選択誘導体：二元ベクターpCIB10は、植物における選択のためのカナマイシン耐性をコードする遺伝子、及びＴ−DNA右及び左ボーダー配列を含み、そしてＥ．コリ及びアグロバクテリウムの両者における複製を可能にする広い宿主範囲のプラスミドpR K252からの配列を組込む。その構成は、Rothsteinなど．(Gene 53：153-161(198 7))により記載されている。Gritzなど．(Gene 25：179-188(1983))により記載されるヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼのための遺伝子を組込むpCIB10 の種々の誘導体が構成される。それらの誘導体は、ヒグロマイシンのみ(pCIB743 )、又はヒグロマイシン及びカナマイシン（pCIB715，pCIB717）に基づいてのトランスジェニック植物細胞の選択を可能にする。２．非アグロバクテリウム形質転換のための適切なベクターアグロバクテリウムツメファシエンスの使用しないでの形質転換は、選択された形質転換ベクターにおけるＴ−DNA配列のための必要条件を回避し、そして結果的に、それらの配列を欠いているベクターが、ベクター、たとえばＴ−DNA 配列を含む上記ベクターの他に、使用され得る。アグロバクテリウムに依存しない形質転換技法は、粒子衝撃、プロトプラスト摂取（たとえばPEG及びエレクトロポレーション）、及びマイクロインジェクションを通しての形質転換を包含する。ベクターの選択は、形質転換される種についての好ましい選択に非常に依存する。ａ．pCIB3064： pCIB3064は、除草剤basta(又はホスフィノトリシン)による選択と組合して、直接的な遺伝子トランスファー技法のために適切なpUC−由来のベクターである。プラスミドpCIB246は、Ｅ．コリ GUS遺伝子への操作的融合におけるCaMV 35 Ｓプロモーター及びCaMV35Ｓ転写ターミネーターを含んで成り、そしてPCT公開番号WO93/0 7278号に記載される。このベクターの35Ｓプロモーターは、開始部位の５’側の２つのATG配列を含む。それらの部位は、ATGを除去し、そして制限部位SspＩ及びPvuIIを生成するような手段で、標準のPCR技法を用いて突然変異誘発される。新規制限部位は、ユニークSalＩ部位から96及び37bp及び実際の開始部位から101 及び42bp離れている。pCIB246のその得られる誘導体は、pCIB3025として命名される。次に、GUS遺伝子が、SalＩ及びSacＩによる消化によりpCIB3025から切り出され、末端がブラント化され、そして再連結され、プラスミドpCIB3060が生成される。プラスミドpJIT82が、John Innes Gentre，Norwichから得られ、そしてストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）からのbar遺伝子を含む400bpのSmaＩフラグメントが切り出され、そしてpCIB3060 のHpaＩ部位中に挿入される（Thompsonなど.，EMBO J ６：2519-2523(1987)）。これは、CaMV 35Ｓプロモーター及びターミネーターの制御下での除草剤選択のためのbar遺伝子、アンピシリン耐性のための遺伝子（Ｅ．コリにおける選択のための）、及びユニーク部位SphＩ，PstＩ，HindIII及びBamHＩを有するポリリンカーを含んで成るpCIB3064を生成した。このベクターは、それら自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングのために適切である。ｂ．pSOG19及びpSOG35： pSOG35は、メトトレキセートに対する耐性を付与する選択マーカーとしてＥ．コリ遺伝子ジヒドロフォレートレダクターゼ(DFR)を利用する形質転換ベクターである。PCRが、35Ｓプロモーター（約800bp)、トウモロコシ Adh１遺伝子からのイントロン６（約550bp）、及びpSOG10からのGUS非翻訳リーダー配列18bpを増幅するために使用される。Ｅ．コリジヒドロフォレートレダクターゼタイプII遺伝子をコードする250bpのフラグメントがまた、PCRにより増幅され、そしてそれらの２つのPCRフラグメントが、pUC19ベクター主鎖及びノパリンシンターゼターミネーターを含んで成るpB1221（Clontech）からのSacＩ−PstＩフラグメントによりアセンブルされる。それらのフラグメントのアセンブリーは、イントロン６配列と融合する35Ｓプロモーター、GUSリーダー、DHFR遺伝子及びノパリンシンターゼターミネーターを含むpSOG19を生成する。トウモロコシ退録斑点ウィルス（MCMV）からのリーダー配列による、pSOG19におけるGUSリーダーの置換は、ベクターpSOG35を生成する。pSOG19及びpSOG35は、アンピシリン耐性のためのpUC遺伝子を担持し、そして外来性物質のクローニングのために利用できるHin dIII，SphＩ，PstＩ及びEcoRＩ部位を有する。Ｂ．植物発現カセットの構成のための必要条件トランスジェニック植物における発現のために意図される遺伝子配列がまず、適切な高い発現レベルのプロモーターの後ろで及び適切な転写ターミネーターの上流で、発現カセットにアセンブルされる。次に、それらの発現カセットは、上記植物形質転換ベクターに容易にトランスファーされ得る。１．プロモーターの選択発現カセットに使用されるプロモーターの選択は、トランスジェニック植物におけるトランスジーンの空間的及び一時的発現パターンを決定するであろう。選択されたプロモーターは、特定の細胞型（たとえば葉上皮細胞、葉肉細胞、根の皮膚細胞）又は特定の組織又は器官（根、葉又は花）においてトランスジーンを発現し、そしてその選択は、NIM１遺伝子生成物又は変更されたNIM１遺伝子生成物の蓄積の所望する位置に影響を及ぼすであろう。他方では、選択されたプロモーターは、正しく誘発された又は他の一時的に調節されたプロモーター下で遺伝子の発現を駆動することができる。ａ．構成発現、CaMV 35Ｓプロモーター：プラスミドpCGN1761の構成は、引用により本明細書に組込まれる公開された特許出願EP0392225(例23)に記載されている。pCGN1761は、“二重”35Ｓプロモーター、及びtml転写ターミネーター、並びに前記プロモーターとターミネーターとの間のユニークEcoRＩ部位を含み、そしてpUC型主鎖を有する。存在するEcoR Ｉ部位の他に、NotＩ及びXhoＩ部位を含む修飾されたポリリンカーを有する、pC GN176lの誘導体が構成される。この誘導体はpCGN1761ENXと命名される。pCGN176 1ENXは、トランスジェニック植物における35Ｓプロモーターの制御下でのそれらの発現のためにそのポリリンカー内のcDNA配列又は遺伝子配列（微生物ORF配列を含む）のクローニングのために有用である。そのような構成の完全な35Ｓプロモーター遺伝子−tmlターミネーターカセットは、形質転換ベクター、たとえば上記のベクターへのトランスファーのために、プロモーターの５’側のHindIII ，SphＩ，SalＩ、及びXbaＩ部位及びターミネーターの３’側のXbaＩ，BamHＩ及びBglＩ部位により切り出され得る。さらに、二重35Ｓプロモーターフラグメントは、もう１つのプロモーターによる置換のために、HindIII，SphＩ，SalＩ，X baＩ又はPstＩによる５’側切断、及びポリリンカー制限部位（EcoRＩ，NotＩ又はXhoＩ）のいづれかによる３’側切断により除去され得る。ｂ．翻訳開始部位の最適化によるpCGN1761ENXの修飾：本明細書に記載されるいづれかの構成のために、クローニング部位のまわりの修飾が、翻訳を増強することができる配列の導入により行なわれ得る。これは特に、過剰発現が所望される場合に有用である。 pCGN1761ENXがSphＩにより切断され、Ｔ４ DNAポリメラーゼにより処理され、そして再連結され、従って、二重35Ｓプロモーターの５’側に位置するSphＩ部位を破壊する。これは、ベクターpCGN1761ENX／Sph−を生成する。pCGN1761ENX ／Sph−が、EcoRＩにより切断され、そして配列5'-AATTCTAAAGCATGCCGATCGG-3'/ 5'-AATTCCGATCGGCATGCTTTA-3'（配列番号12及び13）のアニーリングされた分子アダプターに連結される。これは、ベクターpCGNSENXを生成し、これは、それらの開始メチオニンで異種遺伝子のクローニングのために適切であるSphＩ部位のそれ自体一部であるATGに隣接する擬似−最適化された植物翻訳開始配列TAAA-C を組込んでいる。SphＩ部位の下流は、EcoRＩ，NotＩ、及びXhoＩ部位が保持されている。開始ATGでNcoＩ部位を用いる他のベクターが構成される。pCGN1761NENXと命名されたこのベクターは、pCGN1761ENX EcoRＩ部位で配列5'-AATTCTAAACCATGGCGAT CGG-3'/5'-AATTCCGATCGCCATGGTTTA-3'（配列番号14及び15）のアニーリングされた分子アダプターを挿入することによって製造される。従って、ベクターは、Nc oＩ部位内に存在する開始ATGに隣接する擬似−最適化された配列TAAACCを含む。下流の部位はEcoRＩ，NotＩ及びXhoＩである。しかしながら、この操作の前、pC GN1761ENXベクターにおける２つのNcoＩ部位(５’側35Ｓプロモーター単位の上流位置での）は、SphＩについて上記に記載される技法に類似する技法を用いて、又は他方では、“inside-outside”PCR，Innesなど.，PCR Protocols：A Guid eto Methods and Application，Academic Press，New York（1990）を用いて、破壊される。この操作は、クローニング部位中へのいづれかの植物cDNA又はレポーター遺伝子配列の挿入、続く植物における通常の発現分析により、発現に対するいづれかの可能な有害な効果についてアッセイされ得る。ｃ．化学的／病原体調節可能プロモーター下での発現： pCGN1761ENXにおける二重35Ｓプロモーターは、適切に高い発現レベルをもたらすであろういづれか他の選択のプロモーターにより置換され得る。例によれば、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第5,614,395号に記載される化学的に調節されたPR−１プロモーターは、二重35Ｓプロモーターを置換することができる。選択のプロモーターは、好ましくは、制限酵素によりその源から切り出されるが、しかし他方では、適切な末端制限部位を担持するプライマーを用いてPCR−増幅され得る。PCR−増幅が開始され、次にプロモーターが、標的ベクターにおける増幅されたプロモーターのクローニングの後、増幅誤差について調べるために再配列決定されるべきである。化学的に／病原体調節可能タバコPR−１ａプロモーターが、プラスミドpC1B1004（構成についてはEP0332104号、例21を参照のこと；引用により本明細書中に組込まれる）から切断され、そしてプラスミドpCGN1761ENX（Uknesなど，1992）にトランスファーされる。pCIB1004がNco Ｉにより切断され、そして得られる線状化されたフラグメントの３’側オーバーハングがＴ４ DNAポリメラーゼによる処理によりブラント化される。次に、フラグメントがHindIIIにより切断され、そして得られるPR−１ａ−プロモーター含有フラグメントがゲル精製され、そして二重35Ｓプロモーターが除去されている pCGN1761ENX中にクローン化される。これはXhoＩによる切断及びＴ４ポリメラーゼによるブラント化、続いて、HindIIIによる切断、及びpCIB1004プロモーターフラグメントがクローン化される大きなベクターターミネーター含有フラグメントの単離により行なわれる。これは、PR−１ａプロモーター及びtmlターミネーター、並びにユニークEcoRＩ及びNotＩ部位を有する介在ポリリンカーを有するpCGN1761ENX誘導体を生成する。選択されたNIM１遺伝子はこのベクター中に挿入され得、そしてその融合生成物（すなわちプロモーター−遺伝子− ターミネーター）が、いづれかの選択された形質転換ベクター、たとえば本出願に記載されるベクターにトランスファーされ得る。種々の化学的レギュレーターが、本発明に従って形質転換された植物における NIM１コード配列の発現を誘発するために使用され得る。本発明の開示において、“化学的レギュレーター”とは、植物におけるPR−１プロモーターのためのインジューサー、又はその密接した誘導体であることが知られている化学物質を包含する。PR−１プロモーターのためのレギュレーターの好ましいグループは、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール(BTH)構造体に基づかれており、そして次のタイプの化合物を包含するが、但しそれらだけには限定されない：ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカルボン酸、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールチオカルボン酸、シアノベンゾ−１，２，３−チアジアゾール、ベンゾ−１，２，３ −チアジアゾールカルボン酸アミド、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカルボン酸ヒドラジド、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−カルボン酸、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−チオカルボン酸、７−シアノベンゾ− １，２，３−チアジアゾール、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカルボキシレート（アルキレート基が１〜６個の炭素原子を含む）、メチルベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−カルボキシレート、ｎ−プロピルベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−カルボキシレート、ベンジルベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−カルボキシレート、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール− ７−カルボン酸sec−ブチルヒドラジド、及びそれらの適切な誘導体。他の化学的インジューサーは、たとえば安息香酸、サリチル酸（SA）、ポリアクリル酸及びそれらの置換された誘導体を包含し；適切な置換基は低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、及びハロゲンを包含する。本発明の化学的に誘発できるDNA配列のためのレギュレーターのさらにもう１つのグループは、ピリジンカルボン酸構造体、たとえばイソニコチン酸構造体及び好ましくはハロイソニコチン酸構造体に基づかれている。好ましいものは、ジクロロイソニコチン酸及びその誘導体、たとえば低級アルキルエステルである。このクラスのレギュレーター化合物の適切なメンバーは、たとえば２，６−ジクロロイソニコチン酸(INA)及びその低級アルキルエステル、特にメチルエステルである。ｄ．構成的発現、アクチンプロモーター：アクチンのいくつかのインフォームは、ほとんどの細胞型において発現されることが知られており、そして結果的に、アクチンプロモーターが構成プロモーターのための良好な選択である。特に、米Actl遺伝子からのプロモーターは、クローン化されており、そして特徴づけられている(McElroyなど，Plant Cell ２：1 63-171(1990))。プロモーターの1.3kbフラグメントは、米プロトプラストにおける発現のために必要とされるすべての調節要素を含むことが見出されている。さらに、Actlプロモーターに基づく多くの発現ベクターが、単子葉稙物への使用のために特別に構成されている(McElroyなど，Mol．Gen．Genet．231：150-160(19 91))。それらは、Actl−イントロン１、Adhl５’フランキング配列及びAdhl−イントロン１（トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から）、並びにCa MV 35Ｓプロモーターからの配列を組込む。最高の発現を示すベクターは、35Ｓ及びActlイントロン、又はActl５’フランキング配列及びActlイントロンの融合体である。開始ATG（GUSレポーター遺伝子の）のまわりの配列の最適化はまた、発現を増強した。McElroyなど．(Mol．Gen．Genet．231：150-160(1991)により記載されるプロモーター発現カセットは、セルラーゼ遺伝子の発現のために容易に修飾され得、そして特に、単子葉植物宿主への使用のために適切である。たとえば、プロモーター含有フラグメントは、McElroy構成から除去され、そして特定の遺伝子配列の挿入のために次に利用できる、pCGN1761ENXにおける二重35Ｓプロモーターを置換するために使用される。次に、このようにして構成された融合遺伝子は、適切な形質転換ベクターにトランスファーされ得る。別の報告においては、その最初のイントロンを有する米Actlプロモーターがまた、培養された大麦細胞において高い発現を方向づけることが見出されている（Chibbarなど.，Plant Cell Rep．12：506-509( 1993)）。ｅ．構成的発現、ユビキチンプロモーター：ユビキチンは、多くの細胞型に蓄積することが知られているもう１つの遺伝子生成物であり、そしてそのプロモーターはトランスジェニック植物(たとえば、ヒマワリ−Binetなど．Plant Science 79：87-94（1991）及びトウモロコシ−Ch ristensenなど.，Plant Molec．Biol．12：619-632(1989))への使用のためにいくつかの種からクローン化されている。トウモロコシユビキチンプロモーターは、トランスジェニック単子葉植物システムにおいて開発され、そして単子葉植物形質転換のために構成されたその配列及びベクターが、引用により本明細書に組込まれる特許公開EP0342926号（Lubrizol）に開示される。Taylorなど．（Plant Cell Rep．12：491-495(1993)）は、トウモロコシユビキチンプロモーター及び第１のイントロンを含んで成るベクター（pAHC25）、及びマイクロプロジェクター衝撃を通して導入される場合、多くの単子葉植物の細胞懸濁液におけるその高い活性を記載する。ユビキチンプロモーターは、トランスジェニック植物、特に単子葉植物におけるセルラーゼ遺伝子の発現のために適切である。適切なベクターは、pAHC25の誘導体、又は適切なユビキチンプロモーター及び／又はイントロン配列の導入により修飾された、本出願に記載される形質転換ベクターのいづれかである。ｆ．根特異的発現：本発明のNIM１遺伝子のための発現のもう１つのパターンは、根発現である。適切な根プロモーターは、de Framond(FEBS 290：103-106(1991))により、及び又は引用により本明細書に組込まれる公開された特許出願EP0452269（Ciba-Geig y）に記載される。このプロモーターは、セルラーゼ遺伝子の導入、及び興味ある形質転換ベクターへの完全なプロモーター−遺伝子−ターミネーターカセットの続くトランスファーのために、適切なベクター、たとえばpCGN1761ENXにトランスファーされる。ｇ．創傷−誘導性プロモーター：創傷−誘導性プロモーターはまた、本発明のNIM１遺伝子の発現のために適切である。多くのそのようなプロモーターは記載されており(たとえば、Xuなど．P lant Molec．Biol．22：573-588（1993）；Logemannなど．Plant Cell １：151- 158（1989）；Rohrmeier & Lehle，Plant Molec．Biol．22：783-792（1993）； Firekなど．Plant Molec．Biol．22：129-142（1993）；Warnerなど．Plant J．３：191-201(1993))、そしてすべては本発明への使用のために適切である。Loge monnなどは、双子葉植物のジャガイモwunl遺伝子の５’側上流配列を記載する。 Xuなどは、双子葉植物ジャガイモ（pin2）からの創傷−誘発性プロモーターが単子葉植物の米において活性的であることを示す。さらに、Rohrmeier & Lehleは、創傷誘発され、そして同起源プロモーターを単離するために使用され得るトウモロコシWipl cDNAの標準技法を用いてのクローニングを記載する。同様に、Firekなど．及びWarnerなどは、局所創傷及び病原体侵入部位で発現される、単子葉植物アスパラガスオフィシナリス(Asparagus officinalis)からの創傷−誘発された遺伝子を記載している。当業界において良く知られているクローニング技法を用いて、それらのプロモーターは、適切なベクターにトランスファーされ得、本発明のNIM１遺伝子に融合され得、そして植物創傷の部位でそれらの遺伝子を発現するために使用され得る。ｈ．髄−好適（Pith-preferred）発現：引用により本明細書に組込まれる特許出願WO93/07278（Ciba-Geigy）は、髄細胞において選択的に発現されるトウモロコシtrpA遺伝子の単離を記載する。転写の開始から−1726bpまで延長する遺伝子配列及びプロモーターが示される。標準の分子生物学的技法を用いて、このプロモーター又はその一部は、ベクター、たとえばpCGN1761にトランスファーされ得、ここでそれは35Ｓプロモーターを置換することができ、そして髄−選択された態様で外来性遺伝子の発現を駆動するために使用され得る。実際、髄−選択されたプロモーター、又はその一部を含むフラグメントは、いづれかのベクターにトランスファーされ得、そしてトランスジェニック植物への有用性のために修飾され得る。ｉ．葉−特異的発現：ホスホエノールキルボキシラーゼ（PEPC）をコードするトウモロコシ遺伝子は、Hudspeth & Grula（Plant MolecBiol 12：579-589(1989)）により記載されている。標準の分子生物学的技法を用いて、この遺伝子のためのプロモーターは、トランスジェニック植物において葉−特異的態様で、いづれかの遺伝子の発現を駆動するために使用され得る。ｊ．クロロプラスト標的化による発現： Chen & Jagendorf(J．Biol．Chem．268:2363-2367（1993）は、異種トランスジーンの取り入れのためへのクロロプラスト輸送ペプチドの好結果をもたらす使用を記載している。使用されるこのペプチドは、ニコチアナプルムバギニホリア(Nicotiana plumbaginifolia)からのrbcS遺伝子からの輸送ペプチドである(Po ulsenなど．Mol．Gen．Genet．205：193-200(1986))。制限酵素DraＩ及びSphＩ、及びTsp5091及びSphＩを用いて、この輸送ぺプチドをコードするDNA配列が、プラスミドprbcS−８Ｂから切り出され、そして上記構成のいづれかと共に使用するために操作される。DraＩ−SphＩフラグメントは、開始rbcS ATGに関する− 58から、取り入れ切断部位の直後の成熟ペプチドの第１アミノ酸（又はメチオニン）（これも含む）まで延長し、そしてTsp5091−SphＩフラグメントは、開始rb cSATGに関する−８から、前記成熟ペプチドの第１アミノ酸（これも含む）まで延長する。従って、それらのフラグメントは、輸送ペプチドの下流で正しく融合してNIM １遺伝子の挿入を可能にしながら、選択されたプロモーター（たとえば35Ｓ、PR −１ａ、アクチン、ユビキチン、等）の未翻訳リーダーへの転写融合を生成するいづれかの選択された発現カセットのポリリンカー中に適切に挿入され得る。この種類の構成は当業界において日常である。たとえば、DraＩ末端はすでにブラント化されているのに対して、５’Tsp5091部位はＴ４ポリメラーゼによりブラント化され、又は他方では、選択されたプロモーターへのその融合を促進するためにリンカー又はアダプター配列に連結され得る。３’SphＩ部位はそれ自体維持され得、又は選択されたNIM１遺伝子の続く挿入のための適切な制限部位を利用できるようにするためのそのような手段で、選択されたベクター中へのその挿入を促進するためにリンカー配列のアダプターに連結され得る。理想的には、SphＩ部位のATGが維持され、そして選択されたNIM１遺伝子の第１のATGを含んで成る。Chen & Jag endorfは、クロロプラスト輸送のための理想的切断のためのコンセンサス配列を供給し、そしてそれぞれの場合、メチオニンが成熟タンパク質の第１の位置では好ましい。続く位置では、一層の変動性が存在し、そしてアミノ酸は決定的でないかも知れない。いづれにせよ、融合体構成は、Bartlettなど．(Edelmannなど．（Eds.）Methods in Chloroplast Molecular Biology，Elsevier pp 1081-109 1（1982）における）及びWasmannなど．（Mol．Gen．Genet．205：446-453(1986 )）により記載される方法を用いて、輸送の効率をインビトロで評価され得る。典型的には、最良のアプローチは、アミノ末端での修飾を伴わないで、選択されたNIM１遺伝子又はNIM１遺伝子の変更された形を用いて融合体を生成することであり、そしてそのような融合体が高い効率で輸送されるクロロプラストでないことが明らかである場合、修飾を導入することであり、この場合、修飾は確立された文献(Chen & Jagendorf；Wasmanなど.；Ko & Ko，J．Biol．Chem．267：13910 -13916(1992))に従って行なわれ得る。好ましいベクターは、クローニングベクターpCGN1761ENX／Sph−に、prbcS− ８ＢからのDraＩ−SphＩ輸送ペプチドコードフラグメントをトランスファーすることによって構成される。このプラスミドがEcoRＩにより切断され、そして末端がＴ４ DNAポリメラーゼによる処理によりブラント化される。プラスミドprbcS −８ＢがSphＩにより切断され、そして配列5'-CCAGCTGGAATTCCG-3'/5'-CGGAATTC CAGCTGGCATG-3'（配列番号16及び17）のアニーリングされた分子アダプターに連結される。その得られる生成物は、Ｔ４キナーゼによる処理により５’−末端がリン酸化される。DraＩによる続く切断は、上記修飾されたベクターのブラント末端ex−EcoRＩ部位中に連結される輸送ペプチドコードフラグメントを開放する。35Ｓプロモーターの３’末端に隣接する挿入体の５’末端により適応されたクローンが、配列決定により同定される。それらのクローンは、rbcS ATGに関する−58から成熟タンパク質のATGまで延長するrbc S−８Ａプロモーター−輸送ペプチド配列への35Ｓリーダー配列のDNA融合体及びこの領域に包含されるユニークSphＩ部位、及び新しく創造されたEcoRＩ部位、並びにpCGN1761ENXの存在するNotＩ及びXhoＩ部位を担持する。この新しいベクターは、pCGN1761／CTと命名される。DNA配列が、PCR技法を用いての増幅、及び適切な酵素による制限酵素切断に続いて、SphＩ−切断されたpCGN1761／CT中に連結される、増幅されたATGでのSphＩ，NSphＩ又はNlaIII部位の組込みによりpC GN1761／CTにトランスファーされる。構成を促進するためには、クローン化された遺伝子の生成物の第２アミノ酸を変更することが必要とされるが、しかしながら、ほとんどすベての場合、突然変異誘発を指図される標準の部位と共にPCRを使用することが、切断部位のまわりのいづれかの所望する配列及び成熟タンパク質の第１のメチオニンの構成を可能にするであろう。さらに好ましいベクターは、−1038（転写開始部に関する）から成熟タンパク質の第１のメチオニンまでの十分な長さの光−調節されたrbcS−８Ａプロモーターを含むprbcS−８AのBamHＩ−SphＩフラグメントによりpCGN1761ENXの二重35Ｓプロモーターを置換することによって構成される。破壊されたSphＩを有する修飾されたpCGN1761がPstＩ及びEcoRＩにより切断され、そしてＴ４ DNAポリメラーゼにより処理され、末端がブラント化される。prbcS−８ＡがSphＩにより切断され、そして上記配列のアニーリングされた分子アダプターに連結される。その得られる生成物が、Ｔ４キナーゼによる処理により５’末端をリン酸化される。BamHＩによる続く切断は、BamHＩ末端をブラント化するためにＴ４ DNAポリメラーゼにより処理されるプロモーター輸送ペプチド含有フラグメントを開放する。このようにして生成されたプロモーター輸送ペプチドフラグメントが調製されたpCGN1761ENXベクター中にクローン化され、異種遺伝子の挿入のための切断部位に位置するSphＩ部位と共にrbcS−8Aプロモーター及び輸送ペプチドを含んで成る構造体を生成する。さらに、SphＩ部位の下流に、EcoRＩ（再創造された）、NotＩ、及びXhoＩクローニング部位が存在する。この構造体をpCGN1761rbcS／CTと命名する。類似する操作が、他の源（単子葉植物及び双子葉植物）からの及び他の遺伝子からの他のGS２クロロプラスト輸送ペプチドコード配列を利用するために取られ得る。さらに、類似する方法に従って、他の非細胞区画、たとえばミトコンドリアへの標的化を達成することができる。２．転写ターミネーター種々の転写ターミネーターが発現カセットへの使用のために利用できる。それらは、トランスジーン及びその正しいアデニル化を越えて転写の停止を担当することができる。適切な転写ターミネーターは、植物において機能することが知られているものであり、そしてCaMV 35Ｓターミネーター、tmlターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター及びエンドウrbcS Ｅ９ターミネーターを包含する。それらは、単子葉植物及び双子葉植物の両者に使用され得る。３．発現の増強又は調節のための配列多くの配列が転写単位内からの遺伝子発現を増強することが見出されており、そしてそれらの配列はトランスジェニック植物におけるそれらの発現を高めるために本発明の遺伝子と共に使用され得る。種々のイントロン配列が特に単子葉植物細胞における発現を増強することが知られている。たとえば、トウモロコシAdhＩ遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞中に導入される場合、その同起源のプロモーター下で野生型遺伝子の発現を有意に増強することが見出された。イントロン１は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を有する融合構造体において、特に効果的であり、そして発現を増強することが見出された（Callisなど.，GenesDevelop．１：1183-1200(1987)）。同じ実験システムにおいて、トウモロコシbronze１遺伝子からのイントロンは、発現の増強において類似する効果を有した。イントロン配列は、植物形質転換ベクター中に、典型的には、非翻訳リーダー内に通常組込まれて来た。ウィルスに由来する多くの非翻訳リーダー配列がまた、発現を増強することが知られており、そしてそれらは特に、双子葉植物細胞において効果的である。特に、タバコモザイクウィルス（TMV，“Ｗ−配列”）、トウモロコシ退録斑点ウィルス（Chlorotic Mottle Virus）（MCMV）及びアルファルファモザイクウィルス(AMV)からのリーダー配列が、発現を増強することにおいて効果的であることが示されている（たとえば、Gallieなど．Nucl．Acids．Res．15：8693-8711（1 987）；Skuzeskiなど．，PlantMolec．Bio．15：65-79(1990)）。４．細胞内の遺伝子生成物の標的化遺伝子生成物を標的化するための種々の機構が植物に存在することが知られており、そしてそれらの機構の機能を制御する配列がいくらか詳細に特徴づけられている。たとえば、クロロプラストへの遺伝子生成物の標的化は、成熟タンパク質を生成するためにクロロプラスト輸送の間に切断される種々のタンパク質のアミノ末端で見出されるシグナル配列により制御される（たとえば、Comaiなど.，J．Biol．Chem．263：15104-15109(1988 )）。それらのシグナル配列は、クロロプラスト中への異種生成物の輸送をもたらすために異種遺伝子生成物に融合され得る(van den Broeckなど．Nature 313 ：358-363(1985))。適切なシグナル配列をコードするDNAが、RUBISCOタンパク質、CABタンパク質、EPSPシンターゼ酵素、GS２タンパク質、及び局在されるクロロプラストであることが知られている多くの他のタンパク質をコードするcDNAの５’末端から単離され得る。他の遺伝子生成物は、他のオルガネラ、たとえばミトコンドリア及びペルオキシソームに局在される（たとえば、Ungerなど，Plant Molec．Biol．13：411-41 8(1989)）。それらの生成物をコードするcDNAはまた、それらのオルガネラへの異種遺伝子生成物の標的化をもたらすために操作され得る。そのような配列の例は、核−コードのATPアーゼ、及びミトコンドリアのための特異的アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼイソフォームである。標的化する細胞タンパク質本体は、Rogersなど．(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82：6512-6516(1985))により記載されている。さらに、他の細胞区画への遺伝子生成物の標的化を引き起こす配列が特徴づけられている。アミン末端配列は、糊粉細胞からのER、アパブラスト及び細胞外分泌物への標的化を担当する(Koehler & Ho，Plant Cell ２：769-783(1990))。さらに、カルボキシ末端配列に関するアミノ末端配列は、遺伝子生成物の液胞標的化を担当している(Shinshiなど．，Plant Molec．Biol．14：357-368(1990))。注目のトランスジーン配列への上記の適切な標的化配列の融合により、いづれかのオルガネラ又は細胞区画へのトランスジーン生成物の指図を可能にする。たとえば、クロロプラスト標的化のためには、RUBISCO遺伝子、CAB遺伝子、EPSPシンターゼ遺伝子、又はGS２遺伝子からのクロロプラストシグナル配列がトランスジーンのアミノ末端ATGに読み取り枠を整合して融合される。選択されたシグナル配列は既知の切断部位を含むべきであり、そして構成される融合体は切断のために必要とされる切断部位の後のいづれかのアミノ酸を考慮すべきである。多くの場合、この必要条件は、切断部位とトランスジーンATGとの間への少数のアミノ酸の付加、又は他方では、トランスジーン配列によるいくつかのアミノ酸の置換により満たされ得る。クロロプラスト輸送のために構成される融合体は、Edel mannなど．（Eds.）Methods in Chloroplast Molecular Biology，Elsevier pp 1081-1091（1982）及びWasmannなど．Mol．Gen．Genet．205：446-453（1986）において、Bartlettにより記載される技法を用いて、インビトロ転写された構造体のインビトロ翻訳によるクロロプラスト摂取、続くインビトロでのクロロプラスト摂取の効能について試験される。それらの構成技法は、当業界において良く知られており、そしてミトコンドリア及びペルオキシソームに均等に適用できる。細胞標的化のための上記機構は、標的化シグナルが由来するプロモーターの発現パターンと異なる発現パターンを有するプロモーターの転写調節下で特定の細胞−標的化目的をもたらすために、それらの同起源のプロモーターに関してのみならず、また異種プロモーターに関しても使用され得る。Ｃ．形質転換 NIM１コード配列が発現システム中にクローン化されると、それは植物細胞中に形質転換される。形質転換のための適切な植物組織は、葉組織、根組織、分裂組織及びプロトプラストを包含する。現システムは、形質転換され、そして再生され得るいづれかの植物において使用され得る。形質転換及び再生のためのそのような方法は当業界において良く知られている。植物発現カセットの構成、及び植物中への外来性DNAの導入のためのそのような方法は一般的に文献に記載されている。一般的に、植物中への外来性DNAの導入のためには、Tiプラスミドベクターが、外来性DNAの供給のために使用されて来た。直接的なDNA摂取、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びマイクロプロジェクションが、そのような供給のためにまた使用されて来た。そのような方法は、文献に公開されている。たとえば、次の文献を参照のこと：Bilang など．（1991）Gene 100：247-250；Scheidなど.，（1991）Mol ．Gen．Genet．2 28：104-112；Guercheなど.，（1987）Plant Science 52：111-116；Neuhauseなど.，（1987）Theor ．Appl．Genet．75：30-36；Kleinなど.，（1987）Nature 3 27：70-73；Howellなど.，（1980）Science 208：1265；Horschなど.，（1985）Science 227：1229-1231；DeBlockなど.，（1989）Plant Physiology 91：694-7 01；Methods for Plant Molecular Biology（Weissbach and Weissbach，eds.） Academic Press，Inc．（1988）；及びMethods in Plant Molecular Biology（S chuler and Zielinski，eds.）Academic Press，Inc．(1989)。また、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第5,625,136号も参照のこと。形質転換の方法は、形質転換されるべき植物細胞に依存するであろうことが理解される。さらに次の文献を参照のこと：また、引用により本明細書中に組込まれるアメリカ特許第5,639,949号も参照のこと。アグロバクテリウム属からの細菌は、植物細胞を形質転換するために使用され得る。そのような細菌の適切な種は、アグロバクテリウムツメファシエンス(A grobacterium tumefaciens)及びアグロバクテリウムリゾゲンス(Agrobacteriu m rhizogens)を包含する。アグロバクテリウムツメファシエンス（たとえば、菌株LBA4404又はEHA105）は、植物を形質転換するその良く知られた能力のために特に有用である。１．双子葉植物の形質転換双子葉植物のための形質転換技法は、当業界において良く知られており、そしてアグロバクテリウムに基づく技法、及びアグロバクテリウムを必要としない技法を包含する。非アグロバクテリウム技法は、プロトプラスト又は細胞による外因性遺伝子材料の直接的な摂取を包含する。これは、PEG又はエレクトロポレーション介在摂取、粒子衝撃−介在供給、又はマイクロインジェクションにより達成され得る。それらの技法，の例は、Paszkowskiなど．，EMBO J ３：2717-2722 (1984)；Potrykusなど．，Mol．Gen．Genet．199：169-177(1985)；Reichなど．，Biotechnology ４：1001-1004(1986）；及びKleinなど.，Nature 327：70-73 （1987）により記載される。個々の場合、形質転換された細胞は、当業界において知られている標準の技法を用いて、完全な植物に再生される。アグロバクテリウム介在形質転換は、形質転換のその高い効率、及び多くの異なった種とのその広い利用能力のために、双子葉植物の形質転換のための好ましい技法である。多くの収穫種は、アルファルファ及びポプラーである（EP031751 1(綿)、EP0249432(トマト、Calgeneによる）、WO87/07299（ブラシカ、Calgene による）、アメリカ特許第4,795,855号（ポプラー））。アグロバクテリウム形質転換は典型的には、共有するTiプラスミド又は染色体上の宿主アグロバクテリウム株により担持されるvir遺伝子の相補体に依存する適切なアグロバクテリウム株（たとえばpCIB200及びpCIB2001）のための株CIB542（Uknesなど.，Plant C ell ５：159-169(1993)）への興味ある外来性DNAを担持する二元ベクター（たとえばpCIB200又はpCIB2001）のトランスファーを包含する。アグロバクテリウムへの組換え二元ベクターのトランスファーは、組換え二元ベクターを担持するＥ．コリ、プラスミド、たとえばpRK2013を担持し、そして標的アグロバクテリウム株に組換え二元ベクターを移動することができるヘルパーＥ．コリ株を用いて、三両親対合方法により達成される。他方では、組換え二元ベクターが、DNA形質転換によりアグロバクテリウムトランスファーされ得る（Hofgen & Willmitze r，Nacl．AcidsRes．16：9877(1988)）。組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は通常、植物からの外植片と共にアグロバクテリウムの同時培養を包含し、そして当業界において良く知られているプロトコールに従う。形質転換された組織は、二元プラスミドＴ− DNA境界間に存在する抗生物質又は除草剤耐性マーカーを担持する選択培地上で再生される。遺伝子により植物細胞を形質転換するもう１つのアプローチは、植物組織及び細胞に不活性又は生物学的活性粒子を推進することを包含する。この技法は、アメリカ特許第4,945,050号；第5,036,006号；及び第5, 100,792号（すべて、Sanfordなどによる）に開示される。一般的に、この方法は、細胞の外表面に侵入し、そしてその内部への組込みを付与するのに効果的な条件下で、細胞への不活性又は生物学的活性粒子を推進することを包含する。不活性粒子が使用される場合、ベクターは、所望する遺伝子を含むベクターにより粒子を被覆することによって細胞中に導入され得る。他方では、標的細胞は、ベクターが粒子の跡を追って細胞中に運ばれるよう、ベクターにより取り囲まれ得る。生物学的活性粒子（たとえば、乾燥された酵母細胞、乾燥された細菌又はバクテリオファージ；それぞれ導入されるDNAを含む）がまた、植物細胞組織中に推進され得る。２．単子葉植物の形質転換ほとんどの単子葉植物種の形質転換は現在、日常になって来た。好ましい技法は、PEG又はエレクトロポレーション技法を用いてのプロトプラスト中への直接的な遺伝子トランスファー、及び細胞組織中への粒子衝撃を包含する。形質転換は、単一のDNA種又は複数のDNA種（すなわち、同時形質転換）により行なわれ得、そしてそれらの両技法は、本発明への使用のために適切である。同時形質転換は、完全なベクター構成の回避の利点、及び興味ある遺伝子、及び続く生成における選択マーカーの除去を可能にする、選択マーカーのための連鎖されていない遺伝子座を有するトランスジェニック植物の生成の利点を有する。しかしながら、同時形質転換の使用の欠点は、別々のDNA種がゲノム中に組込まれる頻度が100 ％以下であることである（Schocherなど．Biotechnology ４：1093-1096(1986) ）。特許出願EP0292435(〔1280/1281〕，Ciba-Geigy)，EP0392225（ Ciba-Geigy）及びWO93/07278（Ciba-Geigy）は、トウモロコシの選択された近交系からのカルス及びプロトプラストの調製、PEG又はエレクトロポレーションを用いてのプロトプラストの形質転換、及び形質転換されたプロトプラストからのトウモロコシ植物の再生のための技法を記載する。Gordon-Kammなど．（PlantCe ll ２：603-618(1990)）及びFrommなど．(Blotechnology ８：833-839(1990))は、粒子衝撃を用いてのA188−由来のトウモロコシ系の形質転換のための技法を公開している。さらに、特許出願WO93/07278（Ciba-Geigy）及びKozielなど．（Bi otechnology 11：194-200（1993））は、粒子衝撃によるトウモロコシ選択された近交系の形質転換のための技法を記載する。この技法は、授粉の後14〜15日でのトウモロコシ耳から切除された1.5〜2.5mmの長さの未熟トウモロコシ胚、及び衝撃のためのPDS−1000He Biolistics装置を使用する。イネの形質転換はまた、プロトプラスト又は粒子衝撃を用いる直接的な遺伝子トランスファー技法により行なわれ得る。プロトプラスト−介在形質転換は、ジャポニカ（Japonica）型及びインジカ（Indica）型について記載されている（Zh angなど．Plant Cell Rep ７：379-384（1988）；Shimamotoなど．Nature 338： 274-277（1989）；Dattaなど．Biotechnology ８：736-740(1990)）。両型はまた、粒子衝撃を用いても通常、形質転換できる（Christouなど．Biotechnology ９：957-962(1991)）。特許出願EP0332581(Ciba-Geigy)は、ポイデアエ（Pooideae）プロトプラストの生成、形質転換及び再生のための技法を記載する。それらの技法は、ダクチリス（Dactylis）及び小麦の形質転換を可能にする。さらに、粒子衝撃を用いて、Ｃ型の長期再生可能カルスの細胞中への小麦形質転換がVasilなど．（Biotechno logy 10：667-674(1992)）により記載され、そしてまた、未熟胚及び未熟胚− 由来のカルスの粒子衝撃を用いての小麦形質転換がVasilなど．（Biotechnology 11：1553-1558(1993)）及びWeeksなど．（Plant Physiol．102：1077-1084(199 3)）により記載されている。しかしながら、小麦形質転換のための好ましい技法は、未熟胚の粒子衝撃による小麦の形質転換を包含し、そして遺伝子供給の前、高いスクロース又は高いマルトース段階を包含する。衝撃の前、いづれかの数の胚（0.75〜１mmの長さ）が、３％スクロース、及び暗やみでの進行を可能にする、体細胞胚の誘発のための３mg／ｌの２，４−Ｄを有するMS培地上にプレートされる（Murashiga & Skoog，Physiologia Plantarum 15：473-497(1962)）。衝撃の選択された日、胚が誘発培地から除去され、そしてオスモチカム(Osmoticum) （すなわち、所望する濃度、典型的には15％で添加されるスクロース又はマルトースを有する誘発培地）上に置かれる。胚は２〜３時間、原形質分離を可能にされ、そして次に、衝撃を与えられる。標的プレート当たり20個の胚が典型であるが、しかしそれは決定的ではない。適切な遺伝子担持プラスミド(たとえばpCIB3 064又はpSG35)が、標準の方法を用いて、μｍサイズの金粒子上に沈殿される。胚の個々のプレートが、標準の80メッシュスクリーンを用いて、約1000ps 発射される。衝撃の後、胚は暗室に戻され、約24時間、再生される（オスモチカム上で）。24時間後、胚はオスモチカムから除かれ、そして誘発培地上に戻され、ここでそれらは、再生の前、約１ヵ月間とどまる。約１ヵ月後、成長する胚形成カルスを有する胚外植片が、適切な選択剤（pCIB3064の場合、10mg／ｌのバスタ及びpSOG35の場合、２mg／ｌのメトトレキセート）をさらに含む再生培地（MS ＋１ｍｇ／ｌのNAA，５ｍ／ｌのGA）にトランスファーされる。約１ヵ月後、生長した苗条が、半分の強さのMS，２％のスクロース、及び同じ濃度の選択剤を含む、“GA7s”として知られる大きな滅菌された容器にトランスファーされる。特許出願08/147,161号は、小麦形質転換のための方法を記載し、そしてそれは引用により本明細書に組込まれる。つい最近、アグロバクテリウムを用いての単子葉植物の形質転換が記載されている。WO94/00977号及びアメリカ特許第5,591,616号（両者とも引用により本明細書中に組込まれる）を参照のこと。育種本発明の単離された遺伝子フラグメント又はNIM１遺伝子の変更された形は、広範囲の種類の植物細胞、たとえば裸子植物、単子葉植物及び双子葉植物の細胞に対して耐病性を付与するために使用され得る。その遺伝子はそれらの広い種類内に分類されるいづれかの植物細胞中に挿入され得るが、それは次の収穫物植物の細胞において特に有用である：イネ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、インゲン豆、エンドウ豆、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、カボチャ、ズキニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラーズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシ及びサトウキビ。生成及び品質のために重要な他の特徴と組合して、SAR遺伝子の構成発現のために必要なNIM１遺伝子及びその変異体の過剰発現は、育種を通して植物系中に組込まれ得る。従って、本発明のさらなる態様は、本発明のNIM１タンパク質の変更された形をコードする単離されたDNA分子を含んで成るトランスジェニック親植物のトランスジェニック子孫の生成方法であり、ここで前記方法は、本発明の組換えベクター分子により前記親植物を形質転換し、そして既知の植物育種技法を用いて前記トランスジェニック親植物の子孫に形質をトランスファーすることを含んで成る。育種アプローチ及び技法は当業界において知られている。たとえば、WelshJ.R .，Fundamentals of Plant Genetics and Breeding，John Wiley & Sons，NY（1 981）；Crop Breeding，Wood D.R．（Ed.）American Society of Agronomy Madi son，Wlsconsin（1983）；Mayo O.，The Theory of Plant Breeding，Second Ed ition，Clarendon Press，Oxford（1987）；Singh，D.P.，Breeding for Resist ance to Diseases and InsectPests ，Springer-Verlag，NY（1986）；及びWrick e and Weber，Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding，Walter de Gryter and Co.，Berlin（1986）を参照のこと。トランスジェニック種子及び植物中に構築された遺伝的性質の伝達及び子孫植物における維持：上記トランスジェニック種子及び植物中に構築された遺伝的性質は、有性生殖又は栄養増殖により伝達され、そして従って、子孫植物に維持され、そして増殖される。一般的に、前記維持及び増殖は特定の目的、たとえば耕作、種まき、又は収穫を適合するために開発された既知の農業方法を使用する。特殊化された方法、たとえば水栽培又は温室技法がまた適用され得る。生長する収穫物は昆虫又は感染により引き起こされる攻撃及び損傷、並びに雑草植物による競争に対して無防備であるので、雑草、植物病、昆虫、線虫、及び他の悪条件を制御する処置が取られる。それらは、機械的処置、たとえば土壌の耕作又は雑草及び感染された植物の除去、並びに農薬、たとえば除草剤、殺カビ剤、殺生殖体剤、殺線虫剤、生長調節剤、熟成剤及び殺昆虫剤の適用を包含する。本発明のトランスジェニック植物及び種子の好都合な遺伝的性質が、改良された性質、たとえば害虫、除草剤、又はストレスに対する耐性、改良された栄養価値、高められた収率、又は移し換え又は破壊からの損傷を低くする改良された構造を有する植物の改良を目的とする植物育種に使用される。種々の育種段階、たとえば交雑される系統の選択、親系統の直接的な授粉、又は適切な子孫植物の選択が、十分に定義されたヒト介入により特徴づけられている。所望する性質に依存して、異なった育種処置が取られる。関連する技法は、当業界において良く知られており、そしてハイブリダイゼーション、近親交配、戻し交雑、複数系統交配、品種ブレンド、異種間ハイブリダイゼーション、異数体技法、等を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ハイブリダイゼーション技法はまた、機械的、化学的又は生化学的手段による、雄性又は雌性不稔植物を生成するための植物の滅菌を包含する。異なった系統の花粉による雄性不稔植物の他花受粉は、雌性不稔植物ではなく雄性不稔植物のゲノムが両親系統の性質を均等に得るだろうことを確かにする。従って、本発明のトランスジェニック種子及び植物は、従来の方法、たとえば除草剤又は殺虫剤処理の有効性を高め、又はそれらの修飾された遺伝的性質のために前記方法の免除を可能にする改良された植物系の育種のために使用され得る。他方では、それらの最適化された遺伝的“装置”のために、比較できる悪い生長条件を耐えることができなかった生成物よりも良好な性質の収穫された生成物を生成する、改良されたストレス耐性を有する新規収穫物が得られる。種子生成において、種子の発芽品質及び均等性は必須の生成物特徴であり、ところが農家により収穫され、そして売られている種子の発芽品質及び均等性は重要ではない。他の収穫物及び雑草の種子から収穫物を保護し、種子から生まれる疾病を制御し、そして良好な発芽により種子を生成することは困難であるので、かなり広範で且つ十分に定義された種子生成実施が純粋な種子の生長、条件づけ及び市販を当業界において経験される種子生産者により開発されて来た。従って、農家が彼ら自身の収穫物から収穫された種子を用いる代わりに認定された種子の特定品質の標準を購入することは、通常のことである。種子として使用されるべき増殖材料は、除草剤、殺昆虫剤、殺カビ剤、殺細菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、又はそれらの混合物を含んで成る収穫被膜により通常処理される。習慣的に使用される保護被膜は、化合物、たとえばカプタン、カルボキは、細菌、菌類又は動物害虫により引き起こされる損傷に対する保護を提供するために当業界において習慣的に使用される追加のキャリヤー、界面活性剤又は適用促進アジュバントと共に配合される。その保護被膜は、液体配合物により増殖材料を含浸することによって、又は組合された湿潤又は乾燥配合物により被覆することによって適用され得る。他の適用方法、たとえば芽又は果物への指図された処理方法がまた、可能である。新規の農業用方法、たとえばトランスジェニック植物、トランスジェニック植物材料、トランスジェニック種子の本発明に従っての使用により特徴づけられる上記に例示された方法を提供することが本発明のもう１つの観点である。種子は、適切な包装材料から構成される、種子を含むために密封され得るバッグ、又は容器に供給され得る。それらのバッグ又は容器は、種子の短期又は長期、又は両者の貯蔵のために企画され得る。適切な包装材料の例は、紙、たとえばクラフト紙、硬質又は柔軟なプラスチック又は他のポリマー材料、ガラス又は金属を包含する。所望には、バッグ又は容器は、同じか又は異なったタイプの多くの層の包装材料から構成される。１つの態様において、バッグ又は容器は、水及び湿気の種子との接触を排除し、又は制限するよう供給される。１つの例においては、バッグ又は容器は、水又は湿気の侵入を防ぐために、密封され、たとえばヒートシールされる。もう１つの態様においては、水吸着材料が、包装材料層間に又は隣接して配置される。さらにもう１つの態様において、バッグ、又は容器、又はそれが構成される包装材料は、疾病、汚染、又は種子の貯蔵又は輸送の他の悪影響を制限し、抑制し、又は防ぐために処理される。そのような処理の例は、化学的手段、又は放射線への照射による滅菌である。野生型植物においてよりも高いレベルで前記形質転換された植物において発現される少なくとも１つのNIM１タンパク質の変更された形又はNIM１タンパク質を含んで成るトランスジェニック植物の種子、及び適切なキャリヤー、並びに広い耐病性を植物に付与するためのラベル使用説明書を含んで成る市販のバッグが、本発明により包含される。耐病性耐病性の評価は、当業界において知られている方法により実施される。たとえば、Uknesなど，（1993）Molecular Plant Microbe Interactions ６：680-685 ；Gorlachなど，（1996）Plant Cell ８：629-643；Alexanderなど.，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 90：7327-7331を参照のこと。Ａ．ファイトプソラ・パラシチカ（Phytophthora parasitica）（Blackshank)耐性アッセイファイトプソラ・パラシチカ、すなわちブラックシャンクの原因生物に対する耐性についてのアッセイが、Alexanderなど.，Proc. Natl．Acad．Sci．USA 90：7327-7331に記載のようにして生長せしめられた６週目の植物に対して実施される。植物を水で潤し、十分に排水し、そして次に、土壌に10mlの胞子ノウ懸濁液(300個の胞子ノウ／ml)を適用することによって接種する。接種された植物を、23〜25℃の日中温度、及び20〜22℃の夜間温度で維持される温室に維持する。アッセイのために使用されるしおれ指数は次の通りである：０＝徴候なし；１＝徴候なし；１＝低められた膨張を伴ってのいくらかのしおれの徴候；２＝明確なしおれ徴候、但し腐敗又は発育阻害はない；３＝発育阻害を伴っての明確なしおれ徴候、但し明らかな茎の腐敗は存在しない；４＝眼に見える茎の腐敗及び根システムへのいくらかの損傷を伴っての重度のしおれ；５＝４のようであるが、但し植物は死に近く、又は死亡し、そして根システムの重度の減少を伴う。すべてのアッセイは、ランダム企画で配列された植物に対して盲目的に評点を付けられる。Ｂ．プソイドモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）耐性アッセイプソイドモナス・シリンガエpv．タバチ株#551を、10⁶又は３×10⁶／ml水の濃度でいくつかの６〜７週目の植物の２枚の下部の葉中に注入する。６本の個々の植物を個々の時点で評価する。フソイドモナスタバチにより感染された植物を、次の５点疾病重度規模で評価する：５＝100％の死亡組織、０＝徴候なし。Ｔ −試験(LSD)を個々の日のための評価に対して行ない、そしてグループ分けは、平均疾病評価値の後に示される。評価のその日、同じ文字により追跡される値は、統計学的に有意に異ならない。Ｃ．セルコスポラ・ニコチアナエ(Cercosporanicotianae)耐性アッセイセルコスポラ・ニコチアナエ(ATCC#18366)の胞子懸濁液(100,0 00〜150,000個の胞子／ml）を、葉の表面上に今にも流出するぐらいまで噴霧する。植物を５日間、100％湿度で維持する。その後、植物を、１日当たり５〜10 回、水により噴霧する。６個の個々の植物をそれぞれの時点で評価する。セルコスポラニコチアナエを、疾病徴候基準を示す％葉面積に基づいて評価する。Ｔ −試験(LSD)を個々の日のための評価に対して行ない、そしてグループ分けは、平均疾病評価の後に示される。評価のその日、同じ文字により追跡される値は、統計学的に有意に異ならない。Ｄ．ペロノスポラ・パラシチカ（Peronospora parasitica）耐性アッセイペロノスポラ・パラシチカの耐性についてアッセイを、Uknesなど．(1993)に記載のようにして、植物に対して行なう。植物を、分生子懸濁液（約５×10⁹個の胞子／ml）により噴霧することによってＰ．パラシチカの攻撃性単離物により接種する。接種された植物を、14時間の日中／10時間の夜間サイクルで増殖チャンバーにおいて17℃で湿気条件下でインキュベートする。植物を、分生子柄の存在のために接種の後、３〜14日、好ましくは７〜12日で試験する。さらに、個々の処置からのいくつかの植物をランダムに選択し、そして顕微鏡試験のために、ラクトフェノールートリパンブルー(Keoghなど.，Trans．Br．Mycol．Soc．74： 329-333(1990))により染色する。図面の簡単な説明図１は、野生型及びnim１植物におけるSAR遺伝子発現の誘発に対する化学的誘発剤の効果を示す。SAR遺伝子の化学的誘発は、nim１植物において低められる。水、SA、INA又はBTHが野生型（WT）及びnim１植物に適用される。３日後、RNAがそれらの植物から調製され、そしてPR−１，PR−２及びPR−５の発現について試験される。図２は、病原体−感染されたWs−Ｏ及びnim１植物におけるPR−１遺伝子発現を示す。PR−１の病原体誘発は、nim１植物において低められる。野生型（WT）及びnim１植物がＰ．パラシチカのEmwa品種により噴霧接種される。サンプルが０，１，２，４及び６日で集められ、そしてRNAがPR−１ mRNA蓄積を測定するためにＡ．タリアナPR−１ cDNAプローブによるブロットハイブリダイゼーションにより分析される。図３は、病原体感染又は化学的処理の後、nim１変異体及び野生型植物におけるPR−１ mRNAの蓄積を示す。nim１対立遺伝子nim１−１，−２，−３，−４， −５及び−６、及びWs−Ｏ（Ws）を含む植物が、RNA単離の３日前、水（Ｃ）、S A、INA又はBTHにより処理される。Emwaサンプルが、Ｐ．パラシチカのEmwa単離物による接種の14日後、植物から単離されたRNAから成る。ブロットが、プローブとしてアラビドプシスPR−１ cDNAを用いてハイブリダイズせしめられた。図４は、Ｐ．シリンガエにより感染されたWs−Ｏ及びnim１植物におけるSA蓄積のレベルを示す。nim１植物は、病原体暴露に続いて、SNAを蓄積する。野生型及びnim１植物の葉は、Pst DC3000（avr Rpt2）又はキャリヤー媒体(10mMのMgCl₂ )のみにより浸透される。２日後、サンプルが、未処理の、MgCl₂−処理された、及びDC3000（avr Rpt2）−処理された植物から集められた。細菌−処理されたサンプルは、一次（浸透された）及び二次（浸透されていない）葉に分離された。β−グルコシダーゼによる加水分解に続いて、遊離SA及び合計SAがHPLCにより定量化された。誤差バーは、３種の重複サンプルのSDを示す。図５Ａ〜Ｄは、NIM１領域においてBAC，YAC及びコスミドを示した組換え体上の中心にある染色体領域の上昇するレベルの分離能での全体的な地図を示す。（Ａ）染色体１上のNIM１の地図位置。評点をつけられた配偶子の合計数。（Ｂ）酵母人工染色体（ストライプのある）、細菌人工染色体(BAC)、及びNIM １をクローン化するために使用されるＰ１クローン。（Ｃ） NIM１遺伝子座をカバーするコスミドクローン。nim１−１を補足する３種のコスミドが濃い線として示される。（Ｄ）補足するゲノムDNAの最小フラグメント上の４種の推定上の遺伝子領域。NIM１遺伝子を含んで成る４種の読み取り枠が空白のバーにより示される。矢印は、転写の方向を示す。番号付けは、コスミドＤ７に存在するアラビドプシスゲノムDNAの第１の塩基に対してである。図６は、種々の対立遺伝子における変化を包含する、NIM１遺伝子の核酸配列及びNIM１遺伝子生成物のアミノ酸配列を示す。配列番号１に示される9.9kbの配列として反対の鎖上に存在するこの核酸配列がまた配列番号２に示され、そして NIM１遺伝子生成物のアミノ酸配列がまた配列番号３に示される。図７は、野生型植物及びnim１の変異体対立遺伝子を含む植物におけるINA，BT H，SA及び病原体処理により誘発されたNIM１の蓄積を示す。図３におけるRNAゲルブロットが、図６に示される配列における2081〜3266に由来するプローブを用いることによってRNAの発現のためにプローブされた。図８は、NIM１タンパク質及び４種のイネ遺伝子配列（配列番号４〜11）のcDN Aタンパク質生成物の発現された配列Taq領域のアミノ酸配列比較であり；番号は、配列番号３におけるアミノ酸位置に対応する。図９は、マウス、ラット及びブタからのＩκＢαを有するNIM１タンパク質配列の一列整列配列である。配列上の垂直バー（１）は、NIM１とＩκＢα配列との間のアミノ酸同一性を示し(1.5に等しいマトリックス評点)；配列上の二重ドット（：）は0.5以上の類似性評点を示し；配列上の単一のドット（・）は0.5以下（但し0.0以上）の類似性評点を示し；そして0.0以下の評点は類似性が存在しないことを示し、そして配列上の表示は示されていない（例を参照のこと）。哺乳類ＩκＢαアンキリンドメインの位置は、de Martinなど.，Gene 152，253-25 5（1995）に従って同定された。配列内のドットは、NIM１とＩκＢαタンパク質との間のギャップを示す。ＩκＢαにおける５個のアンキリン反復体は、配列下に点線で示される。アミノ酸は、適切な場所に導入されるギャップを有するNIM １タンパク質に対して番号付けられる。プラスの印（＋）は、10個のアミノ酸ごとに配列上に配置される。寄託物次のベクター分子が、下記に示される日付けで、American Type Culture Coll ection 12301 Parklawn Drive Rockville，MD20852，U.S.A.に寄託された：プラスミド BAC−04がATCC97543として1996年５月８日にATCCに寄託され；プラスミドＰ１−18がATCC97606として1996年６月13日にATCCに寄託され；コスミドＤ７がATCC97736として1996年９月25日にATCCに寄託された。配列表における配列の簡単な説明配列番号１−図５ＤにおけるNIM１遺伝子領域の9919bpのゲノム配列。配列番号２−野生型アラビドプシスタリアナNIM１遺伝子のコード領域を含んで成る図６における5655bpのゲノム配列（配列番号１からの反対鎖）。配列番号３−配列番号２のodsによりコードされる野生型NIM１タンパク質のアミノ酸配列。配列番号４−図８からのイネ−１のアミノ酸配列33−155。配列番号５−図８からのイネ−１のアミノ酸配列215−328。配列番号６−図８からのイネ−２のアミノ酸配列33−155。配列番号７−図８からのイネ−２のアミノ酸配列208−288。配列番号８−図８からのイネ−３のアミノ酸配列33−155。配列番号９−図８からのイネ−３のアミノ酸配列208−288。配列番号10−図８からのイネ−４のアミノ酸配列33−155。配列番号11−図８からのイネ−４のアミノ酸配列215−271。配列番号12−オリゴヌクレオチド。配列番号13−オリゴヌクレオチド。配列番号14−オリゴヌクレオチド。配列番号15−オリゴヌクレオチド。配列番号16−オリゴヌクレオチド。配列番号17−オリゴヌクレオチド。配列番号18は、図８からのマウスＩκＢαアミノ酸配列である。配列番号19は、図８からのラットＩκＢαアミノ酸配列である。配列番号20は、図８からのブタＩκＢαアミノ酸配列である。配列番号21は、アラビドプシスタリアナNIM１遺伝子のcDNA配列である。配列番号22及び23は、アミノ酸位置55及び59でセリン残基の代わりにアラニン残基を有するNIM１タンパク質の優性−陰性形のそれぞれのDNAコード配列及びコードされたアミノ酸配列である。配列番号24及び25は、Ｎ−末端欠失を有するNIM１タンパク質の優性−陰性形のそれぞれのDNAコード配列及びコードされたアミノ酸配列である。配列番号26及び27は、Ｃ−末端欠失を有するNIM１タンパク質の優性−陰性形のそれぞれのDNAコード配列及びコードされたアミノ酸配列である。配列番号28及び29は、Ｎ−末端及びＣ−末端アミノ酸欠失を有するNIM１遺伝子の変更された形のそれぞれのDNAコード配列及びコードされたアミノ酸配列である。配列番号30及び31は、NIM１のアンキリンドメインのそれぞれのDNAコード配列及びコードされたアミノ酸配列である。配列番号32〜39は、オリゴヌクレオチドプライマーである。定義 acd：促進された細胞死変異体植物。 AFLP：増幅されたフラグメントの長さの多型現象。 avrRpt2：プスードモナスシリンガエから単離された無毒性遺伝子Rpt2。 BAC：細菌人工染色体。 BTH：ベンゾ（１，２，３）チアジアゾール−７−チオカルボン酸Ｓ−メチルエステル。 CIM：構成免疫性表現型（SARは構成的に活性される）。 cim：構成免疫性変異体植物。 cM：センチモルガン。 cpr１：PR遺伝子変異体植物の構成発現体。 Col−Ｏ：アラビドプシス生態型コロンビア。 ECs：酵素の組合せ。 Emwa：アラビドプシスのWs−Ｏ生態型において適合できるペロノスポラパラシチカ単離物。 EMS：エチルメタンスルホネート。 INA：２，６−ジクロロイソニコチン酸。 Ler：アラビドプシス生態型ランドスベルグエレクタ。 isd：損傷刺激疾病変異体植物。 nahG：サリチル酸をカテコールに転換するサリチル酸ヒドロキシラーゼプスードモナスプチダ。 NahG：nahG遺伝子により形質転換されたララビドプシス系。 ndr：非−品種−特異的耐病性変異体植物。 nim：非誘発性免疫性変異体植物。 NIM１：SARシグナル伝達カスケートに関与する野生型遺伝子。 NIM１：野生型NIM１遺伝子によりコードされるタンパク質。 nim１：植物に疾病感受性を付与する、NIM１の変異体対立遺伝子；また、NIM１のnim１変異体対立遺伝子を有するアラビドプシスタリアナ植物も言及する。 Noco：アラビドプシスのCol−Ｏ生態型に適合できるペロノスポラパラシチカ単離物。 ORF：読み取り枠。 PCs：プライマーの組合せ。 PR：関連する病因。 SA：サリチル酸。 SAR：全身性後天性耐性。 SSLP：単純な配列の長さの多型現象。 UDS：普遍的な疾病感受性表現型。 Wela：アラビドプシスのWeiningen生態型において適合できるペロノスポラパラシチカ単離物。 Ws−Ｏ：アラビドプシス生態型Issilewskija。 WT：野生型。 YAC：酵母人工染色体。実施例本発明は、次の詳細な方法、調製及び例によりさらに詳細に示される。それらの例は、単に例示的であって、本発明の範囲を制限するものではない。本発明において使用される標準組換えDNA及び分子クローニング技法は、Sambr ook，など．，Molecular Cloning，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Pres s，Cold Spring Harbor，NY(1989)，T．J．Silhavy，M.L．Berman and L.W．Enq uist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratony，Cold Spring Harbor，NY（1984）、及びAnsubel，F.M．など.，Current Protocols i n Molecular Biology ，pub．Greene Publishing Associ．and Wiley-Interscien ce（1987）により記載される。Ａ．nim１変異体の特徴化例１：植物系及び菌類株アラビドプシス・タリアナ生態型Isilewskija(Ws−Ｏ；貯蔵番号CS2360)及びＴ−DNA−形質転換された系統からの第四世代（Ｔ₄）種子を、Ohio State Unive rsity Arabidopsis Biological Resource Center（Columbus，OH）から得た。エチルメタンスルホネート（EMS）突然変異誘発されたWs−Ｏ植物からの第二世代（Ｍ₂）種子を、Lehle Seeds(Round Rock，TX)から得た。クローン化されたavr Rpt2遺伝子を含むプスードモナスシリンガエpv．トマト(pst)株DC3000〔DC3000（avrRpt2）〕を、B．Sta skawicz，University of California，Berkeleyから得た。Ｐ．パラシチカパソバルス(P．parasiticapathovars)及びそれらの源は次の通りであった：E．Hol ub and I.R．Crute，Horticultural Research Station，East Malling，KentからのEmwa；A．Slusarenko and B．Mauch-Mani，Institut fur P．flanzenbiolog ie，Zurich，SwitzerlandからのWela；及びJ．Parker，Sainsbury Laboratory， Norwich，EnglandからのNoco。菌類培養物は、それぞれＰ．パラシチカパソバルスEmwa，Wela及びNocoのためにアラビドプシス生態型Ws−Ｏ，Weiningen及びC ol−Ｏを毎週、培養することによって維持された。例２：変異体のスクリーンＭ₂又はＴ₄種子を１日当たり14時間の光下で２週間、土壌上で生長せしめ、0. 33mMのINA(湿潤性粉末において25％ INAから製造された0.25mg／ml；Ciba，Base l，Swizerland)により噴霧し、そして水１ml当たり５〜10×10⁴個の分生子柄を含むＰ．パラシチカ分生子懸濁液を噴霧することによって、４日後、接種した。この菌類は、耐性がイソニコチン酸(INA)又は類似する化合物によりそれらの植物に最初に誘発されなければ、アラビドプシスWs−Ｏ生態型に対して通常毒性である。植物を18℃で１週間、湿潤条件下で維持し、そして菌類の胞子形成について評点をつけた。INA処理の後、菌類の増殖を支持する植物を、推定上の変異体として選択した。高い湿度環境下でのインキュベーションに続いて、眼に見える疾病徴候を有する植物を、典型的には、感染の７日後に、同定した。それらの植物は、耐性−誘発化学物質の適用にもかかわらず、菌類に対する耐性を示さず、そして従って、可能性あるnim(非誘発性免疫性)変異体植物であった。360,000の植物から、75の可能性あるnim変異体を同定した。それらの可能性ある変異体植物を平坦部から単離し、低い湿度条件下に配置し、そして種子の結実を可能にした。この種子に由来する植物を、INAによる前処理の後、菌類Emwaに対する感受性について、同一の態様でスクリーンした。感染徴候を示す子孫植物をnim変異体として定義した。このようにして、６本のnim系統を同定した。１つの系統(nim１−１)をＴ−DNA集団から単離し、そして５つの系統(nim１−２，nim１−３，nim１−４，nim１−５及びｎim１−６)をEMS集団から単離した。例３：nim１植物の耐病性サリチル酸（SA）及びベンゾ（１，２，３）チアジアゾール−７−チオカルボン酸Ｓ−メチルエステル(BTH)は、INAと同様、野生型植物に広い範囲の耐病性(S AR)を誘発する化学物質である。変異体植物を、SA，INA及びＢ刊により処理し、そして次に、ペロノスポラパラシチカに対する耐性についてアッセイした。Ｐ．パラシチカ単離物“Emwa”は、Ws生態型において適合できるＰ．パラシチカ単離物である。適合する単離物とは、特定の宿主に対して疾病を引き起こすことができるものである。Ｐ．パラシチカ単離物“Noco”は、Wsに対して不適合性であるが、しかしColumbia生態型に対しては適合できる。不適合性病原体は、疾病の進行を妨げる宿主応答を誘発する可能性ある宿主により認識される。野生型種子、及びnim１対立遺伝子(nim１−１，−２，−３，−４，−５，− ６)の個々のための種子を、MetroMix300生長培地上にまき、透明なプラスチックドームによりカバーし、そして４℃で暗室に３日間、配置した。４℃で３日間の処理の後、植物を２週間、ファイトトロンに移した。種まきの後、約２週間までに、発芽された実生は、４枚の真の葉を生成した。次に、植物を、水、５mMのSA ，300μＭのBTH、又は300μＭのINAにより処理した。化学物質は、クロミスターを用いて、実生を完全に被覆するよう微細噴霧として適用された。水対照植物を生成ファイトロンに戻し、そして化学的に処理された植物は別ではあるが、しかし同一のファイトロンに維持された。化学物質適用の３日後で、水及び化学的に処理された植物を、適合性“Emwa”単離物により接種した。 “Noco”接種は、水処理された植物に対してのみ実施された。接種に続いて、植物を透明なプラスチックドームによりカバーし、好結果をもたらすＰ．パラシチカ感染のために必要とされる高い湿度を維持し、そして19℃の日中／17℃の夜間温度及び８時間の日中／16時間の夜間サイクルを有する生長チャンバーに配置した。異なったnim１対立遺伝子の相対的強さを決定するために、個々の変異体を、通常の増殖条件下でのＰ．パラシチカの増殖のための接種及びSA，INA、又はBTH による前処理に続いて、種々の時点で顕微鏡的に分析した。拡大下で、菌類の胞子形成が疾病進行の非常に初期段階で観察された。接種の後、５，６，７，11及び14日での胞子形成を示す植物／ポットの百分率を決定し、そして胞子形成の密度をまた記録した。表１は、nim１変異体植物系の個々について、Ｐ．パラシチカのEmwa種類による感染の後、少なくとも１つの葉上にいくつかの表面分生子を示した植物の％を示す。Ｐ．パラシチカ水又は化学物質処理の３日後、植物上に接種された。この表は、耐病性が評価される、感染後の日数を示す。表１に示されるように、通常の生長の間、nim１−１，nim１−２，nim１−３，nim１−４及びnim１−６のすべては、Ws−Ｏ対照よりもいく分早い、ほぼ同じ菌類増殖速度を支持した。例外は、菌類増殖が他のnim１変異体及びWs−Ｏ対照の両者に対して数日、遅延されたnim１−５植物であるが、しかし結果的にはすべてのｎim１−５植物は菌類に負けた。 SA処理に続いて、変異体を次の３種のクラスにグループ分けすることができた：nim１−４及びnim１−６は比較的早い菌類増殖を示し；nim１−１，nim１−２，nim１−３植物はいく分遅い速度の菌類増殖を示し；nim１−５植物における菌類増殖は、未処理のWs−Ｏ対照においてよりも遅かった。INA又はBTHのいづれかによる処理に続いて、変異体はまた次の３種のクラスに分類された：nim１−４は化学的処理に続いて、菌類増殖を制限するその能力において最とも重度に弱められ；nim１−１，nim１−２，nim１−３及びnim１−６はすべて中位い弱められ；そしてnim１−５は単にわずかに弱められた。それらの実験において、Ws−Ｏは、INA又はBTH処理に続いて菌類増殖を支持しなかった。従って、化学的処理に続く菌類増殖の阻害に関して、変異体は次の３種の種類に分類された：nim１− ４は最とも重度に弱められ、nim１−１，nim１−２，nim１−３及びnim１−６は中間の菌類阻害を示し、そしてnim１−５は単にわずかに低められた菌類耐性を有する。表２は、ペロノスポラ・パラシチカによる接種の７及び11日で、種々のnim１対立遺伝子及びNahG植物の感染等級に対する耐病性評価を示す。WsW Tは、nim１対立遺伝子が見出されるWs野生型親系統を示す。種々のnim１対立遺伝子が表に示されており、そしてNahG植物がまた示されている。 NahG植物の説明は、これまで公開されている。（Delaneyなど.，Science 266 ，pp．1247-1250(1994)）。NahGアラビドプシスはまた、本明細書に引用により組込まれるアメリカ特許出願番号第08/454,876号にも記載されている。nahGは、サリチル酸をカテコールに転換し、それにより、サリチル酸の蓄積、すなわち植物におけるSARのための必要なシグナル伝達成分の蓄積を排除するサリチル酸ヒドロキシラーゼをコードするプスードモナスプチダからの遺伝子である。従って、NahGアラビドプシス植物は、通常のSARを示さず、そしてそれらは一般的に、病原体に対するより高い感受性を示す。しかしながら、NahG植物は、化学的インジューサ−INA及びBTHに対してまだ応答する。従って、NahG植物は、ある種の普遍的な感受性制御体として作用する。表２から、nim１−４及びnim１−６対立遺伝子は最とも重度のペロノスポラパラシチカ感染を有することが見出され得；これは初期の時点で最とも容易に観察できた。さらに、nim１−５対立遺伝子は、INA及びBTHの両者に対して最大の応答を示し、そして従って、最とも弱いnim１対立遺伝子であると思われた。Nah G植物は、INA及びBTHの両者に対して非常に良好な応答を示し、そしてnim１−５対立遺伝子に非常に類似するように見えた。しかしながら、後期の時点、すなわち表の11日目で、NahG植物に誘発された耐病性が衰え始め、そしてINA−誘発された耐性は、BTHによりNahG植物に誘発された耐性よりも、より早く且つより激しく衰える、INAとBTHとの間の深い差異が存在した。INA及びBTHがEmwaに対する Wsにおいて非常に良好な耐性を誘発し、そしてnim１−１，nim１−２、及び他の nim１対立遺伝子が、耐病性に関して、SA又はINAに対して実質的に応答を示さないことが、それらの実験において見出された。 SAR−誘発性化学物質SA，INA及びBTHに対応する応答性のnim１植物の欠乏は、突然変異が全身性後天性耐性に導びくシグナル伝達カスケードにおいてそれらの化学物質のための侵入点の下流で存在することを意味する。例４：SAR遺伝子発現のノザン分析 SA，INA及びBTHはnim１植物のいづれにおいても、SAR又はSAR遺伝子発現を誘発しなかったので、病原体感染が、野生型植物におけるように、それらの植物においてSAR遺伝子発現を誘発できたかどうかを調査することが興味の対象であった。従って、SAR遺伝子mRNAの蓄積がまた、異なったnim１対立遺伝子を特徴づけるための基準として使用された。野生型種子、及びnim１対立遺伝子(nim１−１，−２，−３，−４，−５，− ６）の個々のための種子を、MetroMix 300生長培地上にまき、透明なプラスチックドームによりおおい、そして３日間、暗室に４℃で配置した。４℃で３日間の処理の後、植物をファイトトロンに２週間、移した。植え付け後、約２週間までに、発芽した実生は４枚の真葉を生成した。次に、植物を、H₂O，５mMのSA，３0 0μＭのBTH、又は300μＭのINAにより処理した。化学物質を、クロミスターを用いて、実生を完全におおうために、細かな噴霧として適用した。水対照植物を、生長ファイトトロンに戻し、そして化学的に処理された植物は、別であるが、しかし同一のファイトトロンに維持された。化学物質の適用後、３日で、水及び化学的に処理された植物を、適合できるEmwa単離物により接種した。Noco接種を、水処理された植物のみに対して実施した。接種に続いて、植物を透明なプラスチックドームによりおおい、好都合なＰ．パラシチカ感染のために必要とされる高い湿度を維持し、そして19℃の日中／17℃の夜間温度、及び８時間の日中／16時間の夜間サイクルを有する生長チャンバーに配置した。RNAを、水又は化学物質処理のいづれかの後３日で、又は適合できるＰ．パラシチカEmwa単離物による接種の後、14日で、植物から抽出した。RNAをアガロースゲル電気泳動によりサイズ−分別し、そしてGeneScreen Plus膜(Du Pont)に移した。図１〜３は、SA，INA及びBTHがnim１植物においてSARもSAR遺伝子発現も誘発しないことを示す種々のRNAゲルブロットを示す。図１においては、複製ブロットが、Uknesなど．(1992)に記載のようにして、アラビドプシス遺伝子プローブP R−１，PR−２及びPR −５にハイブリダイズされた。野生型植物においての場合とは対照的に、化学物質は、nim１−１植物においてそれらの３種のSAR遺伝子のいづれかからのRNA蓄積を誘発しなかった。図２に示されるように、野生型Ws−Ｏ植物の病原体感染（Emwa）は、感染後４日以内にPR−１遺伝子発現を誘発した。しかしながら、nim１−１植物においては、PR−１遺伝子発現は、感染後６日まで誘発されず、そしてそのレベルはその時点で、野生型に対して低められた。従って、病原体感染に続いて、nim１−１植物におけるPR−１遺伝子発現は、野生型に対して、遅延され、そして低められた。図３におけるRNAゲルブロットは、PR−１ mRNAが、SA，INA又はBTHによる、又はＰ．パラシチカによる感染による野生型植物の処理に続いて、高レベルに蓄積することを示す。nim１−１，nim１−２、及びnim１−３植物においては、PR− １ mRNA蓄積は、化学物質処理に続いて、野生型に対して劇的に低められた。PR −１ｍRNAはまた、Ｐ．パラシチカ感染に続いて低められたが、しかしそれらの変異体においては、まだいくらかの蓄積が存在した。nim１−４及びnim１−６植物においては、PR−１ mRNA蓄積が、化学物質処理に続いて、他の対立遺伝子においてよりも、より劇的に低められ（より長い暴露において明らかである）、そして有意に低いPR−１ mRNAがＰ．パラシチカ感染に続いて、蓄積し、これは、それらが特に強いnim１対立遺伝子である認識を支持する。PR−１ mRNA蓄積は、 nim１−５変異体において高められたが、しかし化学物質処理又はＰ．パラシチカ感染に続いては、単に弱く誘発された。PR−１ mRNA蓄積及び菌類感染の両者に基づけば、変異体は、次の３種の種類に分類されることが決定された：重度に弱められた対立遺伝子(nim１−４、及びnim１−６）；中位いに弱められた対立遺伝子(nim１−１，nim１−２、及びnim１−３）；及び弱く弱められた対立遺伝子 (nim１−５)。例５：nim１植物におけるSA蓄積の決定壊死反応を引き起こす病原体による野生型植物の感染は、感染された組織にSA の蓄積を導びく。内因性SAは、その内因性SAの分解が耐病性の低下を導びくので、SAR経路におけるシグナル伝達のために必要とされる。これは、SAR経路においてマーカーとしてSA蓄積を定義する(Gaffneyなど.，1993，Science 261，754-75 6)。nim１植物の表現型は、SA遺伝子誘発の下流及びSARの上流のSAR経路の成分の崩壊を示す。 nim１植物を、病原体感染に続いてのSAを蓄積するそれらの能力について試験した。avr Rpt2遺伝子を担持するプソイドモナスシリンガエトマト株DC 3000を、発芽後４週目のnim１植物の葉中に注射した。葉を、Delaneyなど．1995，PNAS 92，6602-6606により記載されるようにして、SA分析のために、２日後に収穫した。この分析は、nim１植物が、図４に示されるように、感染された葉に高レベルのSAを蓄積したことを示した。感染されていない葉はまた、SAを蓄積したが、しかし感染された葉と同じレベルほどではなく、野生型アラビドプシスに観察されるレベルに類似する。これは、nim突然変異がシグナル伝達経路においてSAマーカーの下流に位置することを示す。さらに、INA及びBTH（nim１植物において不活性）は、SAの下流のSAR経路における成分を剌激することを示されている（V ernooijなど．（1995）；Friedrich，など．(1996)；及びLawton，など．(1996) ）。さらに、上記のように、外因的に適用されたSAは、Emwa感染からnim１植物を保護しなかった。例６：遺伝子分析 nim１表現型を示す種々の変異体の優性を決定するために、野生型植物からの花粉を、nim１−１，−２，−３，−４，−５，−６の柱頭に移した。突然変異が優性である場合、nim１表現型は、その得られるＦ１植物に観察されるであろう。突然変異が劣性である場合、その得られるＦ１植物は野生型表現型を示すであろう。表３に示されるデータは、nim１−１，−２，−３，−４及び−６が野生型と交雑される場合、その得られるＦ１植物は野生型表現型を示したことを示す。従って、それらの突然変異は劣性である。対照的に、nim１−５×野生型のＦ１子孫はすべてnim１表現型を示し、このことは、これが優性突然変異であることを示す。INA処理に続いて、Ｐ．パラシチカ胞子形成は野生型植物上に観察されず、そしてそのＦ１植物は、Ｐ．パラシチカの増殖及び胞子形成を支持した。しかしながら、それらのＦ１植物におけるnim１表現型は、nim１−５がホモ接合性である場合に観察されるよりも弱かった。遺伝子対立性を決定するために、カナマイシン耐性nim１−１変異体植物からの花粉を、nim１−２，−３，−４，−５，−６の柱頭に移した。その交雑から得られる種子を、種子のハイブリッド起源を確かめるために、カナマイシン25μ g／mlで含むMurashige-Skoog Ｂ５プレート上にプレートした。カナマイシン耐性（Ｆ１）植物を土壌に移し、そしてnim１表現型についてアッセイした。Ws野生型とnim１−５変異体の交雑のＦ１子孫はnim１表現型を示すので、nim１−５ ×nim１−１のＦ２の分析をまた実施した。表３に示されるように、得られるＦ１植物のすべては、nim１表現型を示した。従って、nim１−２，−３，−４，−５，−６における突然変異は、nim１−１により補足されず；それらの植物はすべて、同じ相補性グループ内に分類され、そして従って、遺伝子対立性である。nim１−５×nim１−１の交雑からのＦ２子孫はまた、nim１表現型を示し、これはnim１−５がnim１対立遺伝子であることを確かにする。ａ：INA処理の後、高められたPR−１ mRNA蓄積及びＰ．パラシチカの不在を示す植物の数。ｂ：INA処理の後、PR−１ mRNA蓄積の不在及びＰ．パラシチカの存在を示す植物の数。ｃ：野生型は、野生型Ws−Ｏ株を示す。Ｂ．nim１突然変異のマッピング nim１突然変異のマッピングは、1996年12月27日に出願されたアメリカ特許出願番号第08/773,559号（引用により本明細書中に組込まれる）に詳細に記載される。例７：NIM１遺伝子座におけるマーカーの同定及び前記遺伝子座の遺伝子マッピング NIM１についての大まかな地図位置を決定するために、nim１−１（Ws−Ｏ）とランドスベルグエレクタ（Landsberg erecta）（Ler)との間の交雑からの74のＦ₂nim植物を、INA処理に続いて、Ｐ．パラシチカに対するそれらの植物の敏感性及びPR−１ mRNAの蓄積の欠乏について同定した。単純な配列の長さの変形現象（SSLP）マーカー（Bell and Ecker，1994）を用いて、nim１−１は、染色体１の低い方のアーム上で、nga128から約8.2cM及びnga111から8.2cMに存在することが決定された。さらに、nim１−１は、SSLPマーカーATHGENEAから約４cMとnga 111との間に存在することが決定された（図５Ａ）。詳しい構造マッピングのために、nim１−１とLerDP23との交雑に由来するＦ₂ 集団からの1138のnim植物を、INA処理に続いて、PR−１ mRNAを蓄積するそれらの無能性及び菌類の増殖を支持するそれらの能力の両者に基づいて同定した。DN Aをそれらの植物から抽出し、そしてATHGENEA及びnga111の両者で接合性について評点をつけた。図５Ａに示されるように、93の組換え染色体が、約4.1cMの遺伝子距離を付与する、ATHGENEAとnim１−１との間に同定され（2276のうち93）、そして239の組換え染色体がnga111とnim１−１との間に同定され、これは約10 .5cMの遺伝子距離を示す(2276のうち239)。ATHGENEA〜nga111の間隔における有益な組換え体を、増幅されたフラグメントの長さの多形現象（AFLD）分析(Vosなど.，1995)を用いてさらに分析した。 ATHGENEAとnga111との間のAFLPマーカーを同定し、そして前記領域の低い解明度の地図を構成するために使用した（図５Ａ及び５Ｂ）。AFLPマーカーＷ84.2(nim１−１から１cM)及びW85.1(nim１−１から0.6cM)を用いて、CIC （Centre d'Etude du Polymorphisme Humain，INRA and CNRS）ライブラリー(Cr eusotなど.，1995)からの酵母人工染色体(YAC)クローンを単離した。２種のYAC クローン、すなわちCIC12H07及びCIC12F04をＷ84.2により同定し、そして２種の YACクローン、すなわちCIC7E03及びCIC10G07を、W85.1マーカーにより同定した（図５Ｂ）。２組のフランキングYACクローン間のギャップを架橋するために、細菌人工染色体(BAC)、及びCIC12H07及びCIC12F04をオーバーラップするＰ１クローンを単離し、そしてマッピングし、そして連続的移動段階を、NIM１の方にB AC／Ｐ１contigを延長して実施した(図５Ｃ；Liuなど.，1995；Chioなど.，1995 )。BAC又はＰ１クローンに対して特異的である新しいAFLPを、前記移動の間、進行せしめ、そしてそれらを用いて、NIM１遺伝子が交差されたかどうかを決定した。NIM１は、AFLPマーカー、すなわちＬ84.6ａ及びＬ84.8の両者を生ぜしめる、BAC及びＰ１クローンが単離される場合、交差されている。Ｐ１クローン、すなわちＰ１−18，Ｐ１−17及びＰ１−21上に見出されるAFLPマーカーＬ84.6ａは３種の組換え体を同定し、そしてＰ１クローン、すなわちＰ１−20，Ｐ１−22，Ｐ１−23、及びＰ１−24、及びBACクローン、すなわちBAC−04，BAC−05及びBAC −06上に見出されるＬ84.8は１つの組換え体を同定した。それらのクローンは大きなcontig(＞100kb)を形成するためにオーバーラップし、そしてnim１を端に有するAFLPマーカーを含むので、その遺伝子はcontig上に位置することが決定された。前記contigを含む、BAC及びＰ１クローンを用いて、追加のAFLPマーカーを生成し、これは、nim１が約0.09cMのギャップを示す、Ｌ84.Y1とＬ84.8との間に位置することを示した。Ｃ．NIM１遺伝子の単離例８：コスミドcontigの構成 NIM１領域のコスミドライブラリーを、BAC−06，BAC−04、及びＰ１−18からのCsCl−精製されたDNAを用いて、アグロバクテリウム−適合性Ｔ−DNAコスミドベクターpCLD04541において構成した。３種のクローンのDNAを、等モル量で混合し、そして制限酵素Sau3Aにより部分的に消化した。20〜25kbのフラグメントを、スクロスグラジエントを用いて単離し、プールし、そしてdATP及びdGTPによりフィルインした。プラスミドpCLD04541を、Ｔ−DNAコスミドベクターとして使用した。このプラスミドは、広い宿主範囲のpRK290−に基づくレプリコン、細菌選択のためのテトラサイクリン耐性遺伝子、及び植物選択のためのnptII遺伝子を含む。ベクターをXhoＩにより切断し、そしてdCTP及びdTTPによりフィルインした。次に、調製されたフラグメントを、ベクター中に連結した。その連混合物をパッケージし、そしてＥ．コリ株XL１−blue MR(Stratagene)中に伝達した。得られる形質転換体を、BAC04，BAC06及びＰ１−18クローンによるハイブリダイゼーションによりスクリーンし、そして陽性クローンを単離した。コスミドDNAをそれらのクローンから単離し、そして鋳型DNAを、ECs EcoRＩ／MseＩ及びHindII I／MseＩを用いて調製した。得られるAFLPフィンガープリントパターンを、コスミドクローンの順序を決定するために分析した。nim領域を拡張する一組の15の単一オーバーラッピングコスミドを選択した（図５Ｄ）。コスミドDNAをまた、E coRＩ，PstＩ，BssHII及びSgrAＩにより制限した。これは、AFLPフィンガープリンティングにより決定されるように、コスミド挿入体サイズの測定、及び種々のコスミド間のオーバーラップの検証を可能にした。物理的マッピングは、Ｌ84.Y1とＬ84.8との間の物理的距離が＞90kbであることを示し、これはcM当たり−１メガ塩基の物理的距離を遺伝子に付与する。NIM １遺伝子の同定を促進するために、BAC04のDNA配列を決定した。例９：NIM１遺伝子を含むクローンの同定 NIM１領域を拡張するクローンから精製されたコスミドを、ヘルパー株HB101（ pRK2013）との三−親接合における接合性トランスファーを通してアグロバクテリウムツメファシエンスAGL−１中に移動せしめた。次に、それらのコスミドを、真空浸透法(Bechtoldなど.，1993；Mindrinosなど.，1994)を用いて、カナマイシン感受性nim１−１アラビドプシスを形質転換するために使用した。浸透された植物からの種子を収穫し、そして選択剤として50mg／mlのカナマイシンを含むGM寒天プレート上で発芽せしめた。コスミドDNAにより形質転換された苗木のみが、選択剤を解毒し、そして生存することができた。その選択を生存した実生を、プレートした約２週間後、土壌に移し、そして下記のようにして、nim１表現型について試験した。nim１表現型をもはや有さない形質転換された植物は、機能的NIM１遺伝子を含むコスミドを明らかにした。例10：nim１表現型の相補性土壌に移された植物を、移行後、約１週間、ファイトトロンにおいて生長せしめた。300μｍのINAを、微細噴霧としてクロミスターを用いて適用し、植物を完全におおった。２日後、RNA抽出及びPR−１発現分析のために、葉を収穫した。次に、植物にペロノスポラパラシチカ（単離物Emwa）を噴霧し、そして19℃の日中／17℃の夜間温度及び８時間の日中／16時間の夜間サイクルを有する生長チャンバーにおいて、高い湿度条件下で増殖せしめた。菌類感染に続いて８〜10日後、植物を評価し、そして菌類増殖について陽性か又は陰性かを評点をつけた。Ws及びnim１植物を、個々の実験のための対照として作用するよう、同じ手段で試験した。全RNAを、LiCl／フェノール抽出緩衝液（Verwoerd）など．1989）を用いて、集められた組織から抽出した。RNAサンプルをホルムアルデヒドアガロースゲル上で試験し、そしてGeneScreen Plus（Du Pont）膜にブロットした。ブロットを、³²Ｐ−ラベルされたPR−１ cDNAプローブによりハイブリダイズせしめた。その得られるブロットをフィルムに暴露し、形質転換体が、INA処理の後、PR−１発現を誘導することができたことを決定した。その結果は表４に要約されており、その表は、コスミドクローンＤ５，Ｅ１及びＤ７によるnim１表現型の相補性を示す。 NA−適用できない。例11：NIM１遺伝子領域の配列決定 BAC04 DNA(25μｇ；KegGeneから得られた)は、このBACがnim１変異体を補足した領域を完全に包含するクローンであるので、配列分析のために使用されるDNA 源であった。BAC04 DNAを、ネブライサーによりランダムに剪断し、約２kbの平均長さのフラグメントを生成した。剪断されたフラグメントの末端を修復し、そしてフラグメントを精製した。調製されたDNAを、EcoRＶ−消化されたpBRKan Ｆ４（pBRKan_F1の誘導体(Bhat 1993)）により連結した。得られるカナマイシン耐性コロニーを、Wizard Plus 9600 Miniprep Sy stem(Promega)を用いて、プラスミド単離のために選択した。プラスミドを、プラスミドの両鎖を配列決定するよう企画されたプライマー（Ｍ13〜21前方及びＴ７逆方向、Applied BioSystems）と共に、色素ターミネーター化学(Applied Bio Systems，Foster City，CA)を用いて配列決定した。AB1377 DNA配列に対するデータを集めた。配列を、Sequencher 3.0(GeneCodesCorp.，AnnArbor，Ml)，Stad enゲノムアセンブリープログラム、phred．phrap及びcrossmatch（Phil Green， Washington University，St．Louis，MO）、及びConsed(David Gordon，Washing ton University，St Louis，MO)を用いて、編集し、そしてcontigs中にアセンブリーした。nim１−１突然変異を補足することが見出されたコスミドからのDNAを、Oligo 5.0 Primer Analysis Software（National Biosciences，Ins.，Plymou th，MN）により企画されたプライマーを用いて配列決定した。Ws−Ｏ及びnim１対立遺伝子及びcDNAからのDNAの配列決定を、実質的に上記のようにして行なった。コスミドＥ１及びＤ７のオーバーラップにより定義される約9.9kbの領域を、n im１領域を得るために、相補性分析により同定した。ベクターの挿入部位を端に有し、そしてコスミド主鎖に対して特異的であるプライマーを、Oligo 5.0 Prim er Analysis Software（National Biosciences，Inc.）を用いて、企画した。DN Aを、酢酸アンモニア方法（Traynor，P.L.，1990，BioTechniques 9（6）：676 ）の変法を用いて、コスミドＤ７及びＥ１から単離した。このDNAを、上記Dye T erminator化学を用いて、直接的に配列決定した。得られた配列は、相補性領域の終点の決定を可能にした。コスミドＥ１及びＤ７のオーバーラップにより定義される領域は、配列番号１として示されている。 BamHＩ−EcoRＶフラグメントの切断された型をまた構成し、“遺伝子３”領域を含まない構造体をもたらした（図５Ｄ）。次のアプローチが、DN AのBam−Spe領域におけるHindIII部位の存在のために必要であった。BamHＩ−Ec oRＶ構造体をSpeＩにより完全に消化し、次に、二重消化のために２つの別々の反応に分離した。１のアリコートをBamHＩにより消化し、他をHindIIIにより消化した。2816bpのBamHＩ−SpeＩフラグメント、及び1588bpのHindIII−SpeＩフラグメントを、アガロースゲルから単離し（QioQuick Gel抽出キット）、そして BamHＩ−HindIII消化されたpSGCG01に連結した。DH５αを、その連結混合物により形質転換した。得られるコロニーを、Wizard Magic MiniPreps(Promega)を用いて、DNAの調製に続いてのHindIIIによる消化により正しい挿入体についてスクリーンした。正しい構造体を含むクローンを、アラビドプシス植物の形質転換のためにアグロバクテリウム株GV3101中にエレクトロポレートした。例12：NIM１領域の配列分析及びサブクローニング NIM１遺伝子を含む9.9kb領域を、Sequencher 3.0及びGCGパッケージを用いて、すべての６個の枠において読取り枠の存在について分析した。大きなORFを含む４つの領域を、可能な遺伝子として同定した（図５Ｄにおける遺伝子領域１〜４）。それらの４つの領域を、野生型親及び６種の異なったnim１対立遺伝子変異体nim１−１，−２，−３，−４，−５及び−６のDNAからPCR増幅した。それらの増幅のためのプライマーを、Oligo 5.0(National Biosciences，Inc.)を用いて選択し、そしてIntegrated DNA Technologies，Inc．により合成した。PCR 生成物を1.0％アガロースゲル上で分離し、そしてQIAquick Gel Extraction Kit を用いて精製した。精製されたゲノムPCR生成物を、初期増幅のために使用されるプライマーを用いて、及び初期プライマーによりカバーされないいづれかの領域を通して配列決定するよう企画された追加のプライマーにより、直接的に配列決定した。それらの遺伝子領域のための平均有効範囲は、約3.5の読取り／塩基であった。配列を、Sequencher 3.0を用いて、編集し、そしてアセンブリーした。種々の nim１対立遺伝子に対して特異的な塩基変化が、nim１対立遺伝子のすべての６種間での配列の変動を示す下記表５に示されるように、領域企画された遺伝子領域２においてのみ同定された。表に列挙される位置は、配列番号１に関する。すべての対立遺伝子nim１−１〜nim１−６はWs株である。Columbia−Ｏは、野生型を示す。すべての６種のnim１対立遺伝子における遺伝子領域２の読取り枠内でアミノ酸変化又は配列の変更が存在するので、NIM１遺伝子は遺伝子領域２内に存在することが明らかである。同時に、nim１対立遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子領域１，３及び４内での読取り枠の変化を示さない。従って、NIM１遺伝子を含む9.9kbの領域内の唯一の遺伝子領域は、遺伝子領域２である。表５のWsセクションは、アラビドプシスのColumbia生態型に対してのアラビドプシスのWs生態型における変化を示す。ここに示される配列は、本明細書に記載される実験における野生型を含む、アラビドプシスのColumbia生態型に関する。変化は、遺伝子領域２(NIM１領域)内のアミノ酸変化として列挙され、そして他の領域においては塩基対の変化として列挙される。 nim１遺伝子を含むコスミド領域は、約5.3kbのBamHＩ−EcoRＶ制限フラグメントにより明確にされた。Ｄ７からのコスミドDNA及びpBlueScriptII(pBSII)からのプラスミドDNAを、BamHＩ及びEcoRＶ(NEB)により消化した。Ｄ７からの5.3kb のフラグメントを、アガロースゲルから単離し、そしてQIAquickゲル抽出キット（#28796，Qiagen）を用いて精製した。そのフラグメントを、Bam−EcoRＶ−消化されたpBSIIに一晩、連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｅ．コリ株DH ５αを形質転換した。挿入体を含むコロニーを選択し、そしてHindIIIによる消化により確かめた。次に、Bam−EcoRＶフラグメントを用いて、アラビドプシスの形質転換のための二元ベクター(pSGCG01)を構築した。例13：４種の遺伝子領域のノザン分析同一のノザブロットを、Delaneyなど．(1995)により前に記載されたようにして、水−、SA−、BTH−及びINA−処理されたWs及びnim１系から単離されたRNAサンプルを用いて行なった。それらのブロットを、9.9kbのNIM１遺伝子領域（配列番号１）に同定される４種の遺伝子領域から生成されるPCR生成物によりハイブリダイズせしめた。NIM１遺伝子（遺伝子領域２）を含む遺伝子領域のみが、RNAサンプルとの検出できるハイブリダイゼーションを有し、このことは、NIM１域のみが検出できる転写された遺伝子を含むことを示す（図５Ｄ及び表５）。例14：遺伝子領域２との相補性遺伝子領域２（図５Ｄ）はまた、追加の相補性実験を行なうことにより、機能的NIM１遺伝子を含むことが示された。遺伝子領域２を含むBamHＩ／HindIIIゲノムDNAフラグメントをコスミドＤ７から単離し、そして耐カナマイシンのための遺伝子を含む二元ベクターpSGCG01中にクローン化した。得られるプラスミドを用いて、アグロバクテリウム株GV3101を形質転換し、そして陽性コロニーをカナマイシンに対して選択した。PCRを用いて、選択されたコロニーが前記プラスミドを含むことを確証した。カナマイシン感受性nim１−１植物を、前記のようにして、細菌により浸入せしめた。得られる種子を収穫し、そして50μｇ／mlのカナマイシンを含むGM寒天上に移した。選択に対して生存する植物を土壌に移し、そして相補性について試験した。形質転換された植物及び対照Ws及びnim１植物に、300μｍのINAを噴霧した。２日後、葉をRNA抽出及びPR−１発現分析のために収穫した。次に、植物にペロノスポラパラシチカ（単離物Emwa）を噴霧し、そして前記のようにして増殖せしめた。菌類感染の10日後、植物を菌類増殖に対して陽性であるか又は陰性であるかを評価し、そして評点を取った。15本の形質転換された植物のすべて、及びWs対照は、INA処理に続いての菌類増殖に関しては陰性であり、ところがnim１対照は菌類増殖に関して陽性であった。RNAを、それらの形質転換体及び対照について、上記のようにして、抽出し、そして分析した。Ws対照及びすべての15本の形質転換体は、IN A処理に続いてPR−１遺伝子誘発を示し、ところがnim１対照はINAによるPR−１誘発を示さなかった。例15：NIM１ cDNAの単離 IYES発現ベクター(Elledgeなど，1991，PNAS88，1731-1735)により製造されたアラビドプシスcDNAライブラリーをプレートし、そしてプラークリフトを行なった。フィルターを、遺伝子領域２（図５Ｄ）から生成された³²Ｐ−ラベルされた PCR生成物によりハイブリダイズせしめた。14の陽性を、約150,000のプラークのスクリーンから同定した。個々のプラークを精製し、そしてプラスミドDNAを回収した。cDNA挿入体を、EcoRＩを用いてベクターから消化し、アガロースゲー精製し、そして配列決定した。最長のcDNAから得られた配列は、配列番号２及び図６に示される。cDNAの５’末端が得られたことを確かめるために、GibcoBRL５’ RACEキットを、製造業者の説明書に従って使用した。その得られるRACE生成物を配列決定し、そして図６に示される追加の塩基を含むことを見出した。両cDNAクローンに存在し、そしてRACEに検出される転写された領域は、図６に大文字で示される。対立遺伝子における変化は、そのDNA鎖の上に示される。大文字は、RAC E PCRの後、cDNAクローンにおける又は検出される配列の存在を示す。誘発研究において生成された同じRNAサンプル（図３）をまた、プローブとして十分な長さのcDNAを用いて、NIM１遺伝子によりプローブした。図７においては、INAが野生型Ws対立遺伝子においてNIM１遺伝子を誘発したことが見出され得る。しかしながら、nim１−１突然変異対立遺伝子は、NIM１遺伝子の低い基本レベルの発現を示し、そしてそれはINAにより誘発され得なかった。これは、nim１ −３及びnim１−６対立遺伝子に観察されることに類似した。nim１−２対立遺伝子は、未処理のサンプルにおいてほぼ通常のレベルを示し、そしてnim１−４対立遺伝子のように、野生型サンプルの誘発に類似する誘発を示した。nim１−５対立遺伝子は、NIM１遺伝子の高い基本レベルの発現を示し、そして化学物質誘発剤により誘発される場合、より高いレベルの発現を示すように思えた。Ｄ．NIM１相同体例16：NIM１配列によるBLAST研究複数配列一列整列を、DNA^*(1228 South Park Street，Madison Wisconsin，53 715，Lasergene Biccomputing Software Package for the Macintosh(1994))の一部として、Clustal V(Higgins，Desmond G．and Paul M．Sharp(1989)，Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer，CABIOS ５：151-153)を用いて構成した。NIM１タンパク質の一定の領域が４種の異なったイネcDNAタンパク質生成物に対して、アミノ酸配列において相同である。その相同性は、GenBank BLAST調査において、NIM１配列を用いて同定された。NIM１及びイネcDNA生成物における相同性の領域の比較が図８に示される（また、配列番号３及び４〜11を参照のこと）。NIM１タンパク質フラグメントは、４種のイネ生成物と36〜48％のアミノ酸配列同一性を示す。例17：他の植物からの相同遺伝子の単離プローブとしてNIM１ cDNAを用いて、アラビドプシスNIM１の相同体を、異なった収穫物、たとえば例22に列挙されるようなもの（但し、それらだけには限定されない）からのゲノム又はcDNAライブラリーのスクリーニングを通して同定する。これを達成するための標準の技法は、プレートされたDNAライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング（プラーク又はコロニーのいづれか；たとえば、Sambrookなど.，Molecular Cloning，eds.，Cold Spring Harbor Labor atory Press.（1989）を参照のこと）、及びオリゴヌクレオチドプライマーを用いてのPCRによる増幅（たとえば、Innisなど.，PCR Protocols ，a Guide to Met hods and Applications eds.，Academic Press（1990）を参照のこと）を包含する。同定された相同体は、発現ベクター中に遺伝子的に構築され、そして上記に列挙された収穫物を形質転換する。形質転換体を、試験される収穫物植物の適切な病原体を用いて増強された耐病性について評価した。キュウリ、トマト、タバコ、トウモロコシ、小麦及び大麦のゲノムにおけるNI M１相同体を、DNAブロット分析により検出した。ゲノムDNAを、キュウリ、トマト、タバコ、トウモロコシ、小麦及び大麦から単離し、酵素BamHＩ，HindIII，X baＩ、又はSalＩにより制限消化し、0.8％アガロースゲル上で電気泳動的に分離し、そして細管ブロットによりナイロン膜にトランスファーした。DNAを結合するためにUV−架橋に続いて、膜を、³²Ｐ−放射性ラベルされたアラビドプシスタリアナNIM1 cDNAにより、低い緊縮条件〔（１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％の硫酸ラウリル、ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム）、5 5℃で18〜24時間〕下でハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーションに続いて、ブロットを、低い緊縮条件下で洗浄し〔15分間の６×SSC、15分間の（Ｘ３）３×SSC、55℃で（Ｘ１）；１×SSCは0.15ＭのNaCl，15mMのクエン酸ナトリウム(pH7.0)である〕、そしてNIM１に対応するバンドを可視化するためにＸ−線フィルムに照射した。さらに、NIM１遺伝子に対する類似性により同定される発現された配列標識(ES T)、たとえば例16に記載されるイネESTがまた、相同体を単離するためにも使用され得る。イネESTは、他の単子葉植物からのNIM１相同体の単離のために特に有用である。相同体をPCRにより得ることができる。この方法においては、既知の相同体（たとえばイネ及びアラビドプシス）間での比較を行なう。次に、高いアミノ酸及びDNA類似性又は同一性の領域を、PCRプライマーとして使用する。Ｍ及びＷに富んでいる領域が最良であり、次に、Ｆ，Ｙ，Ｃ，Ｈ，Ｑ，Ｋ及びＥに富んでいる領域が最良である。なぜならば、それらのアミノ酸は制限された数のコドンによりコードされるからである。適切な領域が同定されると、その領域のためのプライマーが第３番目のコドン位置における種々の置換を伴って製造される。その３番目の位置における置換の多様性は、標的化される種々依存して強制され得る。たとえば、トウモロコシはGCに富んでいるので、可能なら、３番目の位置にＧ又はＣを利用するプライマーが企画される。 PCR反応を、種々の標準条件下で、cDNA又はゲノムDNAから実施される。バンドが明らかである場合、それはクローン化され、そしてそれがNIM１相同体であるかどうかを決定するために配列決定される。Ｅ．NIM１の過剰発現が植物に耐病性を付与する CIM表現型を付与するためにトランスジェニック植物におけるNIM１遺伝子の過剰発現がまた、1996年12月27日に出願された本出願人のアメリカ特許出願番号第 08/773,554号（引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。例18：挿入部位効果によるNIM１の過剰発現例10／表４に記載される形質転換体のいづれかが挿入部位効果によるNIM１の過剰発現を有するかどうかを決定するために、Ｄ７，Ｄ５又はＥ１コスミド(NIM １遺伝子を含む)を含む一次形質転換体を、自家受粉せしめ、そしてＴ２種子を集めた。１つのＥ１系、４つのＤ５系及び95のＤ７系からの種子を土壌にまき、そして上記のようにして生長せしめた。Ｔ２植物が少なくとも４枚の真葉を得る場合、一枚の葉を別々に個々の植物から収穫した。RNAをこの組織から抽出し、そしてPR−１及びNIM１発現について分析した。次に、植物をＰ．パラシチカ（Emwa）により接種し、そして感染に続いて、３〜14日、好ましくは７〜12日で、菌類の増殖について分析した。正常よりも高いNIM１及びPR−１の発現を示し、そして耐病性を示す植物は、N IM１の過剰発現がCIM表現型を付与することを示した。表６は、菌類感染に対する耐性についての種々の形質転換体の試験の結果を示す。表から見出されるように、多くの形質転換体は正常よりも低い菌類増殖を示し、そしていくつかはまったく眼に見える菌類増殖を示さなかった。RNAを集められたサンプルから調製し、そして前記記載したようにして分析した（Delaney など．1995）。ブロットを、アラビドプシス遺伝子プローブPR−１（Uknesなど，1992）にハイブリダイズせしめた。Ｄ７−74，Ｄ５−６及びＥ１−１系は、PR −１遺伝子の早期誘発を示し、それにより、PR−１ mRNAは、菌類処理に続いて、24又は48時間までに明らかになった。それらの３種の系統はまた、菌類感染に対する耐性を示した。植物はＰ．パラシチカ単離物Emwaにより処理され、そして10日後、評点を付けられた。＋：正常な菌類の増殖＋／−：正常以下の菌類の増殖 − ：陰性、眼に見えない菌類の増殖例19：その生来のプロモーターのもとでのNIM１の過剰発現 NIM１遺伝子を構成的に発現する植物を、1.4kbのプロモーター配列を含むBam HＩ−HindIII NIM１ゲノムフラグメント（配列番号２−塩基1429〜5655）による Ws野生型植物の形質転換から生成した。前記フラグメントをpSGCG01中にクローン化し、そしてアグロバクテリウム株GV3101(pMP90，Koncz and Schell（1986） Mol．Gen．Genet．204：383-396)を形質転換した。Ws植物に、前記のようにして、菌類を浸入せしめた。得られる種子を収穫し、そして50μｇ／mlのカナマイシンを含むGM寒天上にプレートした。生存する苗木を土壌に移し、そしてペロノスポラパラシチカ単離物Emwaに対する耐性について、上記のようにして試験した。選択された植物を自家受粉し、そしてホモ接合系を生成するために２回の続く世代について選択した。いくつかのそれらの系統からの種子を土壌にまき、そして一列当たり15〜18の植物を３週間、生長せしめ、そして化学物質誘発によるいづれかの前処理を伴わないで、Emwa耐性について再び試験した。菌類処理の約24 時間、48時間及び５日後、個々の系統について、組織を収穫し、プールし、そして凍結した。植物は、それらがEmwaに対する耐性について評点をつけられる場合、接種後10まで、生長チャンバーに存続した。 RNAをすべての集められたサンプルから調製し、そして前記のようにして分析した（Delaneyなど，1995）。ブロットを、アラビドプシス遺伝子プローブPR−1 （Uknesなど，1992）にハイブリダイズせしめた。分析される13のトランスジェニック系のうち５つがPR１遺伝子発現の早期誘発を示した。それらの系統に関しては、PR−１ mRNAは、菌類処理に続いて、24又は48時間までに明らかになった。それらの５つの系統はまた、眼に見える菌類増殖を示さなかった。葉を、Diet richなど，1994により記載のようにして、ラクトフェノールブルーにより染色し、葉における菌類の菌糸の存在を確かめた。PR−１遺伝子発現は、48時間まで、他の８つの系統においては誘発されず、そしてそれらの植物はEmwaに対する耐性を示さなかった。耐性系統のサブセットをまた、細菌病原体プスードモナスシリンガエDC3000に対する高められた耐性について試験し、Uknesなど.(1993)により記載のようにして、明らかな耐性の範囲を評価した。実験は、Lawtonなど.(1996)により実質的に記載されるようにして行なわれた。細菌の増殖は、Emwaに対する構成的耐性をまた示したそれらの系統においては遅かった。これは、その生来のプロモーター下でNIM１遺伝子を過剰発現する植物が、病原体に対する構成的免疫性を有することを示す。それらの系統におけるCIM表現型の追加の特徴を評価するために、感染されていない植物を、遊離及びグルコース−接合されたサリチル酸について評価し、そして葉をラクトフェノールブルーにより染色し、顕微鏡的損傷の存在について評価した。耐性植物を、SAR変異体、たとえばNahG及びndr１を性的に交雑し、他の変異体に対する耐性表現型のエピスタシス関係を確立し、そしてNIM１のそれらの優性陰性変異体がいにかして、サリチル酸−依存性フィードバックループに影響を及ぼすことができるかを評価した。例20：NIM１の35Ｓ駆動された過剰発現十分な長さのNIM１ cDNA(配列番号21)を、pCGN1761ENX(Comaiなど.（1990）Pl ant Mol．Biol．15，373-381)のEcoRＩ部位中にクローン化した。得られるプラスミドから、増強されたCaMV 35Ｓプロモーターを含むXbaＩフラグメント、転写のための正しい配向でのNIM１ cDNA、及びtml ３’ターミネーターを得た。このフラグメントを二元ベクターpCIB200中にクローン化し、そしてGV3101を形質転換した。Ws植物に、前記のようにして浸入せしめた。得られる種子を収穫し、そして50μｇ／mlのカナマイシンを含むGM寒天上にプレートした。生存する苗木を土壌に移し、そして上記のようにして試験した。選択された植物を自家受粉し、そしてホモ接合系を生成するために２回の続く世代について選択した。試験された58の系統のうち９つは、それらが化学物質前処理を伴わないでEmwaにより処理される場合、耐性を示した。従って、NIM１ cDNAの過剰発現はまた、耐病性植物をもたらす。例21：収穫物植物におけるNIM１の高レベル発現 Col−Ｏ又はWs−Ｏ及び他のものにCIM表現型を付与するそれらの構造体を用いて、評価のために、収穫物植物を形質転換する。NIM１遺伝子はそれらの広い種類内に分類されるいづれかの植物細胞中に挿入され得るが、それは、次の収穫物植物細胞において特に有用である：イネ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、インゲン豆、エンドウ豆、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、カボチャ、ズキニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラーズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシ及びサトウキビ。形質転換体を、増強された耐病性について評価する。本発明の好ましい態様において、NIM１遺伝子の発現は、野生型植物におけるNIM１遺伝子の発現レベルの少なくとも２倍、及び好ましくは、野生型発現レベルの10倍であるレベルで存在する。Ｆ．nim表現型植物の他の使用例22：疾病試験へのnim変異体の使用 nim植物は、多くの病原体により攻撃され、そして野生型植物よりも、よりすばやく、より大きな損傷を進行せしめることが見出される。この表現型は、UDS( すなわち、普遍的疾病感受性)として言及され、そして病原体に対する植物防御をもたらすためにSAR遺伝子を発現することを失敗した変異体の結果である。このnim変異体のUDS表現型は、いわゆる野生型系統の天然の耐性表現型が変化できる（すなわち、異なった病原体、及び同じ病原体の異なった病原型に対して）フィールド病因試験における実験系統の疾病徴候の評価のために対照植物としてそれらを有用にする。従って、病原体による天然の感染が、実験系統の耐性を評価することに依存するフィールド環境においては、適切な収穫物植物種のnim変異体系の実験への導入が、非実験系の使用において固有の変動を伴わないで、病原体圧力の真のレベル及び範囲の評価を可能にするであろう。例23：耐病性の目的のためへのトランスジーンの利用性の評価 nim変異体を、耐病性への使用のためのそれらの評価を促進するために、トランスジーンの形質転換のための宿主植物として使用する。たとえば、そのUDS表現型により特徴づけられるアラビドプシスnim変異体系が、耐病性のための候補体遺伝子による続く形質転換のために使用され、従って、UDS nim変異体植物の基本レベルに対する耐性への個々の遺伝子の寄与の評価を可能にする。例24：植物−病原体相互作用を理解する上での手段としてのnim変異体 nim変異体は、植物病原体相互作用を理解する上で、及び植物細胞への侵入のために病原体により利用される工程を理解する上で特に有用である。これは、ni m変異体が病原体攻撃に対する全身性応答を開始せず、そして病原体の衰えていない進行が、宿主とのその生物学的相互作用を研究するための理想的なシナリオであるためである。宿主nim変異体が、その特定の宿主に通常関係しないが、しかし代わりに、異なった宿主に関係する病原体に対して敏感である観察は、さらに有意なことである。たとえば、アラビドプシスnim変異体、たとえばnim１−１，−２，−３，− ４，−５、又は−６は、通常単にタバコを感染する多くの病原体により攻撃され、そして敏感であることが見出されている。従って、UDS表現型を引き起こすnim 突然変異は、病原体−範囲の敏受性の変性を導びき、そしてこれは、宿主−病原体相互作用の分子、遺伝子及び生化学分析に有意な有用性を有する。例25：殺カビ剤スクリーニングに使用するためのnim変異体 nim変異体は、殺カビ活性のための新規化合物のスクリーニングに特に有用である。特定宿主において選択されるnim変異体は、その宿主及びその宿主の病原体を用いての殺カビ剤のスクリーニングのために相当な有用性を有する。この利点は、異なった病原体及び病原型に対して特異的に敏感であるか、又は同じ病原体又は病原型に対して耐性でさえある宿主により遭遇される問題を回避する変異体のUDS表現型にある。例によれば、小麦におけるnim変異体は、その変異体は導入された病原体に対して耐性応答を開始せず、そして特定の病原体に対してそれぞれ適切に敏感である、複数の小麦系の使用を必要とする異なった病原型に対して異なった耐性を示さないので、広範囲の小麦病原体及び病原型に対する殺カビ剤をスクリーンするために効果的に使用され得る。特に興味ある小麦病原体は、エリシフェ・グラミニス（Erisyphe graminis）（ウドンコ病の原因物質)、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）（鋭い眼点の原因物質）、プスードセルコスポレラ・ヘルポトリコイド（Ps eudocercosporella herpotrichoides）(眼点の原因物質)、プシニアspp.（Pucci nia ssp.）（サビ病の原因物質）、及びセプトリアノドラム（Septoria nodor um）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。同様に、トウモロコシの nim変異体は、トウモロコシ病原体に対して非常に敏感であり、そして従って、トウモロコシの疾病に対する活性を有する殺カビ剤のスクリーニングにおいて有用である。 nim変異体は、異種宿主すなわち特定の病原体の宿主種範囲内に通常存在せず、そして操作するのに特に容易である宿主（たとえばアラビドプシス）において広範囲の病原体及び病原型のスクリーニングのためにさらに利用される。そのUD S表現型により、異種宿主は、経済的に重要な収穫物植物種を包含する他の植物種の病原体に対して敏感である。従って、例によれば、同じアラビドプシスnim 変異体は、小麦病原体、たとえばエリシフェ・グラミニス（ウドンコ病の原因物質）又はトウモロコシ病原体、たとえばヘルミンソスポリウム・マイジス(Helmi nthosporium maydis)により感染され得、そして殺カビ剤候補体の効力を試験するために使用され得る。そのようなアプローチは、異なった収穫物植物栽培変種に対して特異的に毒性である異なった病原体及び病原型により、個々の収穫物植物種及び異なった栽培変種をスクリーニングする現在使用される方法よりも、効率において相当の改良点を有する。さらに、アラビドプシスの使用は、その小さなサイズ及びそれにより、制限された資源の空間でのより一層の試験を約束する可能性のために、利点を有する。例26：NIM１はＩκＢαの相同体である NIM１及びＩκＢのタンパク質遺伝子生成物間の複数配列一列整列が行なわれ、それにより、NIM１遺伝子生成物はＩκＢαの相同体であることが決定された（図９）。配列相同性研究は、BLAST（Altschulなど. ，J．Mol．Biol．215，403-410(1990)）を用いて実施された。複数配列一列整列を、DNASTAR（Madison，WI）からのLasergene Biocomputing Softwareパッケージの一部として、Clustal V（Higginsなど.，CABIOS 5，151-153(1989))を用いて構成したＯその一列整列に使用される配列は、NIM１（配列番号３）、マウスＩκＢα(配列番号18、GenBank受託番号：1022734)、ラットＩκＢα(配列番号1 9、GenBank受託番号：57674及びX63594；Tewariなど.，Nucleic Acids Res，20, 607(1992))、及びブタＩκＢα(配列番号20、GenBank受託番号：Z21968；de Mar tinなど.，EMBO J．12，2773-2779（1993）；GenBank受託番号第517193号、de M artinなど.，Gene 152，253-255(1995))であった。Clustal分析に使用されるパラメーターは、10のギャップペナルティ及び10のギャップ長さペナルティであった。進化の分岐距離を、PAM250重量表(Dayhoffなど.，“A model of evolutiona ry change in proteins．Matrices for defecting distant relationships．”I n Atlas of Protein Sequence and Stracture，Vol．5，Suppl．3，M.O.，Dayho ff，ed(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)，pp．3 45-358(1978))を用いて計算した。残基類似性は、改良されたDayhoff表(Schwart z and Dayhoff，“A model of erolutionary change in proteins”。In Atlas of Protein Sequen ce and Stracture，M.O.，Dayhoff，ed(National Biomedica l Research Foundation，Washington，D.C.)，pp．353-358（1979）；Gribskov and Burgess，Nucleic Acids Res．14，6745-6763(1986))を用いて計算された。相同性の研究は、アンキリン、NF−κＢ及びＩκＢを包含する、いくつかのタンパク質のアンキリンドメインに対するNIM１の類似性を示す。最良の全体的な相同性は、ＩκＢ及び関連する分子に対してである（図９）。NIM１はアミノ酸位置55及び59で２つのセリンを含み、位置59でのセリンはリン酸化−依存性、ユビキチン−介在性、誘発性分解における役割と矛盾がない関係（Ｄ／Ｅxxxxx Ｓ）及び位置（Ｎ−末端）で存在する。すべてのＩκＢはそれらのＮ−末端セリンを有し、そしてそれらはＩκＢの不活性化、及びNF− κＢの続く開放のために必要とされる。NIM１はアンキリンドメイン(アミノ酸26 2−290及び323−371)を有する。アンキリンドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用に関与すると思われ、そしてＩκＢ及びNF−κＢ分子のための偏在する特徴である。ＩκＢのＣ末端は類似していないであろう。NIM１はいくつかのＩκＢのＣ−末端に見出されるQLに富んでいる領域(アミノ酸491−499)に対していくらかの相同性を有する。例27：NIM１の変更された形の生成−セリン残基55及び59のアラニン残基への変更ヒトＩκＢαにおけるセリン残基のリン酸化は、ＩκＢαの刺激−活性化された分解のために必要とれさ、それによりNF−κＢを活性化する。ヒトIκＢαにおけるセリン残基（Ｓ32−Ｓ36）のアラニン残基への突然変異誘発は、刺激−誘発されたリン酸化を阻害し、従ってＩκＢαプロテオソーム−介在性分解をブロックする(E．Britta-Mareen Traencknerなど.，EMBO J．14：2876-2883（1995）；Brownなど.，Science 267：1485-1488（1996）；Brockmanなど.，Molecular a nd Cellular Biology 15：2809-2818(1995)；Wangなど.，Science 274：784-787 (1996))。ＩκＢαのこの変更された形は、細胞質にNF−κＢを保持することによって優性陰性形として機能し、それにより下流のシグナル化現象をブロックする。NIM １とＩκＢとの間の配列比較に基づけば、NIM１のセリン55（Ｓ55）及び59（Ｓ59）は、ヒトＩκＢαにおけるＳ32及びＳ36と相同である。NIM１の優性−陰性形を構成するためには、アミノ酸位置55 及び59でのセリンがアラニン残基に突然変異誘発される。これは、当業者に知られているいづれかの方法により、たとえばQuikChange Site Directed Mutagenes is Kit（#200518；Strategene）を用いることによって行なわれ得る。 42bpの５’未翻訳配列(UTR)及び187bpの３'UTRを含む十分な長さのNIM１ cDNA (配列番号21)を用いて、突然変異誘発された構造体が、製造業者の説明書に従って、次のプライマー(配列番号21、位置192−226)を用いて製造され得る：5'-CAA CAG CTT CGA AGC CGT CTT TGA CGC GCC GGA TG-3'（配列番号32）及び5'-CAT C CG GCG CGT CAA AGA CGG CTT CGA AGC TGT TG-3'（配列番号33）、ここで下線を引かれた塩基は突然変異を示す。この方法は次の通りである：ベクターpSE936（ Elledgeなど.，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 88：1731-1735(1991))中にクローン化されたNIM１ cDNAを変性し、そして変更された塩基を含むプライマーをアニーリングする。DNAポリメラーゼ(Pfu)が、ニックドされた環状鎖をもたらす非鎖− 置換によりプライマーを延長する。DNAをDpnＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化にゆだね、メチル化された部位(突然変異されていない鋳型DNA)のみを切断する。残る環状dsDNAを用いて、Ｅ．コリ株XL１−Blueを形質転換する。得られるコロニーからのプラスミドを抽出し、そして配列決定し、突然変異誘発された塩基の存在を確かめ、そして他の突然変異が生じなかったことを確かめる。突然変異誘発されたNIM１ cDNAを、制限エンドヌクレアーゼEcoRＩにより消化し、そしてカリフラワーモザイクウィルスの二重35Ｓプロモーターの転写調節下でpCGN1761中にクローン化する。35Ｓプロモーター、NIM１ cDNA及びtmlターミネーターを含む形質転換カセットを、XbaＩによる部分的制限消化によりpCGN1761から開放し、そしてX baＩ中に連結し、そして脱リン酸化されたpCIB200のXbaＩ部位中に連結する。配列番号22及び23は、NIM１遺伝子のこの変更された形のそれぞれのDNAコード配列及びコードされたアミノ酸配列を示す。本発明はまた、NIM１の対立遺伝子の変更された形を包含し、ここでそのような対立遺伝子のコード配列は配列番号22に示されるコード配列に対して次の条件下でハイブリダイズする：１％ BSA；520m MのNaPO₄，pH7.2；７％の硫酸ラウリル、ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウムにおける55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、及び15分間の６×SSC、15分間の（Ｘ３）３×SSC、55℃での（Ｘ１）の洗浄。それらの態様において、それらの条件下で配列番号22にハイブリダイズするNIM１の対立遺伝子は、コードされた生成物が、配列番号22の位置55及び59に対応するアミノ酸位置においてセリンの代わりにアラニンを有するように変更される。例28：NIM１の変更された形の生成；Ｎ−末端欠失Ｋ21，Ｋ22，Ｓ32及びＳ36を包含する、ヒトＩκＢαのアミノ酸１−36(Brock manなど.，Sunなど.)又は１−72(Sunなど.)の欠失は、トランスフェクトされたヒト細胞培養物において優性−陰性ＩκＢα表現型をもたらす。NIM１ cDNAのコードされた生成物のおおよその最初の125個のアミノ酸のＮ−末端欠失は、可能性あるユビキチン化部位として作用することができる８個のリシン残基を除去し、そしてまた、Ｓ55及びＳ59での推定上のリン酸化部位を除去する（例２を参照のこと）。この変更された遺伝子構造体は、当業者に知られているいづれかの手段により生成され得る。たとえば、Hoなど.，Gene 77：51-59（1989）の方法を用いて、おおよその最初の125個のアミノ酸をコードするDNAが欠失するNIM１形が生成され得る。次のプライマーが1612bpのPCR生成物（配列番号21：418〜2011）を生成する：5'-gg aat tca-ATG GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG-3'（配列番号34）及び5'-gga att cTA CAA ATC TGT ATA CCA TTG G-3'（配列番号35）、ここで合成開始コドンは下線が引かれており(ATG)、そしてEcoRＩリンカー配列は２番目の場合に存在する。フラグメントの増幅は、次の成分を含んで成る反応混合物を用いる：0.1〜100ngの鋳型DNA，10mMのトリス(pH8.3)／50mMのKCl／２mMのMgCl₂／ 0.001％のゼラチン／0.25mMの個々のdNTP／0.2mMの個々のプライマー及び１単位のγTth DNAポリメラーゼ（最終体積50ml及びPerkin Elmer Centus 9600 PCR機械の使用）。PCR条件は次の通りである：94℃で３分；35×（94℃，30秒：52℃ で１分：72℃で２分）；72℃で10分。PCR生成物を、pCR2.1ベクター（Invitroge n）中に直接的にクローン化する。PCRベクターにおけるPCR−生成された挿入体を、EcoRＩを用いての制限エンドヌクレアーゼ消化により開放し、そして二重35 Ｓプロモーターの転写調節下で、脱リン酸化されたpCGN1761のEcoRＩ部位中に連結する。構造体を配列決定し、合成開始ATGの存在を確かめ、そして他の突然変異がPCRの間、生じなかったことを確かめる。35Ｓプロモーター、修飾されたNIM １ cDNA及びtmlターミネーターを含む形質転換カセットを、XbaＩによる部分的消化によりpCGN1761ENXから開放し、そしてpCIB200のXbaＩ部位中に連結する。配列番号24及び25は、Ｎ−末端アミノ酸欠失を有するNIM１遺伝子の変更された形のそれぞれのDNAコード配列及びコードされたアミノ酸配列を示す。本発明は、NIM１の対立遺伝子の変更された形を包含し、ここでそのような対立遺伝子のコード配列は配列番号24に示されるコード配列に対して次の条件下でハイブリダイズする：１％ BSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％の硫酸ラウリル、ナトリウム塩；１mMのEDTA ；250mMの塩化ナトリウムにおける55℃18〜24時間のハイブリダイゼーション、及び15分間の６×SSC、15分間の（Ｘ３）３×SSC、55℃での（Ｘ１）の洗浄。それらの態様において、それらの条件下で配列番号24にハイブリダイズするNIM１の対立遺伝子は、コードされた生成物が、野生型遺伝子生成物の位置55及び59に対応するアミノ酸位置でのセリンの他に可能性あるユビキチン化部位として機能するリシン残基を除去するＮ−末端欠失を有するよう変更される。例29：NIM１の変更された形の生成；Ｃ−末端欠失ヒトＩκＢαのアミノ酸261−317の欠失は、Ｃ−末端におけるセリン及びトレオニン残基の構成的リン酸化をブロックすることによって、増強された固有の安定性をもたらすと思われている。セリン及びトレオニンに富んでいる領域は、NI M１のＣ−末端におけるアミノ酸522−593で存在する。NIM１遺伝子のＣ−末端コード領域は、アミノ酸522−593をコードするヌクレオチド配列を欠失することによって修飾され得る。Hoなど.(1989)の方法を用いて、NIM１ cDNAのＣ−末端コード領域及び3'UTR（配列番号21：1606−2011）がPCRにより欠失され、次のプライマーを用いて1623bpのフラグメントを生成される：5'-cggaattcGATCTCTTTAATT TGTGAATTT C-3'（配列番号36）及び5'-ggaattcTCAACAGTT CATAATCTGGTCG-3'（配列番号37）、ここで合成停止コドンは下線が引かれており(相補的鎖上のTGA)、そしてEcoRＩリンカー配列は２番目の場合に存在する。PCR反応成分は前述の通りであり、そしてサイクルパラメーターは次の通りである：94℃で３分；30×（ 94℃，30秒：52℃で１分：72℃で２分）；72℃で10分。PCR生成物を、pCR2.1ベクター（Invitrogen）中に直接的にクローン化する。PCRベクターにおけるPCR− 生成された挿入体を、EcoRＩを用いての制限コドンヌクレアーゼ消化により開放し、そして二重35Ｓプロモーターの転写調節下で、脱リン酸化されたpCGN1761のEcoRＩ部位中に連結する。構造体を配列決定し、合成イン−フレーム停止コドンの存在を確かめ、そして他の突然変異がPCRの間、生じなかったことを確かめる。前記プロモーター、修飾されたNIM１ cDNA及びtmlターミネーターを含む形質転換カセットを、XbaＩによる部分的消化によりpCGN1761から開放し、そして脱リン酸化されたpCIB200のXbaＩ部位中に連結する。配列番号26 及び27は、Ｃ−末端アミノ酸欠失を有するNIM１遺伝子の変更された形のそれぞれのDNAコード配列及びコードされたアミノ酸配列を有する。本発明はまた、NIM１の対立遺伝子の変更された形を包含し、ここでそのような対立遺伝子のコード配列は配列番号26に示されるコード配列に対して次の条件下でハイブリダイズする：１％ BSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％の硫酸ラウリル、ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウムにおける55℃で18〜24 時間のハイブリダイゼーション、及び15分間の６×SSC、15分間の（Ｘ３）３×S SC、55℃での（Ｘ１）の洗浄。それらの態様において、上記の条件下で配列番号 26にハイブリダイズするNIM１の対立遺伝子は、コードされた生成物がセリン及びトレオニン残基を除去するＣ−末端欠失を有するように変更される。例30：NIM１の変更された形の生成；Ｎ−末端／Ｃ−末端欠失キメラ NIM１のＮ−末端及びＣ−末端欠失形を、位置819でのユニークKpnＩ制限部位を用いて生成する（配列番号21）。Ｎ−末端欠失形（例28）を、EcoRＩ／KpnＩにより制限エンドヌクレアーゼ消化し、そして修飾されたＮ−末端に対応する41 5bpのフラグメントをゲル電気泳動により回収する。同様に、Ｃ−末端形（例29 ）を、EcoR Ｉ／KpnＩにより制限エンドヌクレアーゼ消化し、そして修飾されたＣ−末端に対応する790bpのフラグメントをゲル電気泳動により回収する。それらのフラグメントを15℃で連結し、EcoRＩにより消化し、EcoRＩコンカテマーを排除し、そして脱リン酸化されたpCGN1761のEcoRＩ部位中にクローン化する。NIM１のＮ／Ｃ−末端欠失形は、二重35Ｓプロモーターの転写調節下にある。同様に、Ｃ−末端欠失（例29）に融合されたＳ55／Ｓ59突然変異誘発された推定上のリン酸化部位（例27）から成るNIM１のキメラ形を生成する。構造体を上記のようにして生成する。構造体を配列決定し、開始及び停止コドンの適合性を確かめ、そして突然変異がクローニングの間、生じなかったことを確かめる。35Ｓプロモーター、 NIM１キメラ及びtmlターミネーターを含むそれぞれの形質転換カセットを、Xba Ｉによる部分的制限消化によりpCGN1761から開放し、そして脱リン酸化されたpC IB200のXbaＩ部位中に連結する。配列番号28及び29は、Ｎ−末端及びＣ−末端アミノ酸欠失を有するNIM１遺伝子の変更された形のそれぞれのDNAコード配列及びコードされたアミノ酸配列を示す。本発明は、NIM１の対立遺伝子の変更された形を包含し、ここでそのような対立遺伝子のコード配列は配列番号28に示されるコード配列に対して次の条件下でハイブリダイズする：１％ BSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％の硫酸ラウリル、ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウムにおける55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション；及び15分間の６×SSC、15分間の（Ｘ３）３×SSC、 55℃での（Ｘ１）の洗浄。それらの態様において、上記条件下で配列番号28にハイブリダイズするNIM１の対立遺伝子は、コードされた生成物が、野生型遺伝子生成物の位置55及び59に対応するアミノ酸位置でセリンの他に可能性あるユビキチン化部位として作用するリシン残基を除去するＮ−末端欠失、及びセリン及びトレオニン残基を除去するＣ−末端欠失の両者を有するよう変更される。例31：NIM１の変更された形の生成−アンキリンドメイン NIM１は、おおよそのアミノ酸103−362でアンキリン型に対して相同性を示す。Hoなど.(1989)の方法を用いて、推定上のアンキリンドメインをコードするDNA 配列（配列番号２：3093−3951）を、NIM１ cDNA(配列番号21：349−1128)から次のプライマーを用いて、PCR増幅する（条件：94℃で３分：35×（94℃で30秒；62℃で30秒；72℃で２分）：72℃で10分）：5'-ggaattcaATGGACTCCAACAACACCG CCGC-3'（配列番号38）及び5'-ggaattcTCAACCTTCCAAAGTTGCTTCTGATG-3'（配列番号39）。得られる生成物を、EcoRＩにより制限エンドヌクレアーゼ消化し、そして次に、二重35Ｓプロモーターの転写調節下で、脱リン酸化されたpCGN1761のEc oRＩ部位中にスプライスする。その構造体を配列決定し、合成開始コドン(ATG) 及びイン−フレーム停止コドン(TGA)の存在を確かめ、そして他の突然変異がPCR の間、生じなかったことを確かめる。35Ｓプロモーター、アンキリンドメイン、及びtmlターミネーターを含む形質転換カセットを、XbaＩによる部分制限消化によりpCGN1761から開放し、そして脱リン酸化されたpCIB200のXbaＩ部位中に連結する。配列番号30及び31は、NIM１のアンキリンドメインのそれぞれのDNAコード配列及びコードされたアミノ酸配列を示す。本発明は、NIM１の対立遺伝子の変更された形を包含し、ここでそのような対立遺伝子のコード配列は配列番号30に示されるコード配列に対して次の条件下でハイブリダイズする：１％ BSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％の硫酸ラウリル、ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウムにおける55℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、及び15分間の６×SSC、15分間の（Ｘ３）３×SSC 、55℃での（Ｘ１）の洗浄。それらの態様において、上記条件下で配列番号30にハイブリダイズするNIM１の対立遺伝子は、コードされた生成物が、野生型遺伝子生成物のアンキリンドメインから実質的に成るよう変更される。例32：キメラ遺伝子の構成変更されたNIM１形の適切な空間的及び一時的な発現の傾向を高めるために、N IM１プロモーター及び遺伝子を含む、4407bpのHindIII／BamHＩフラグメント（配列番号２：塩基1249−5655）及び／又は5655bpのEcoRＶ／BamHＩフラグメント（配列番号２：塩基１〜5655）を、上記例27〜31における変更されたNIM１形の創造のために使用する。構成段階は異なるが、その概念は本明細書に記載されて来た例に比較できる。変更された形の強い過剰発現は、致死的であるかも知れない。従って、例27〜31に記載されるNIM１遺伝子の変更された形は、内因性NIM１プロモーター以外のプロモーターたとえばnosプロモーター、又はRubiscoプロモーターの小サブユニット（但し、それらだけには限定されない）の調節下に配置され得る。同様に、変更されたNIM１形は、病原体−応答性プロモーターPR−１の調節下で発現され得る（アメリカ特許第5,614,395号）。そのような発現は、病原体の攻撃又は他のSAR−活性化条件下でのみ、変更されたNIM１形の強い発現を可能にする。さらに、耐病性は、SARを通常活性化しないSAR活性化因子化合物 (すなわちBTH又はINA)の濃縮物により処理される場合、PR−１プロモーター調節下で変更されたNIM１形を発現し、それによりフィードバックループを活性化する形質転換体において明らかであり得る（Weymannなど.，(1995)Plant Cell ７：2013-2022）。例33：NIM１の変更された形を用いてのアラビドプシス・タリアナの形質転換生成された構造体（例27〜32）を、株GV3101中へのエレクトロポレーションにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス中に移動せしめる。それらの構造体を用いて、真空浸入法（Mindrinosなど.，Cell 78，1089-1099(1994)）又は標準の根形質転換法により、アラビドプシス生態型Col−Ｏ及びWs−Ｏを形質転換する。それらの植物からの種子を収穫し、そして選択剤としてカナマイシン（又は他の適切な抗生物質）を含む寒天プレート上で発芽せしめる。コスミドDNAにより形質転換される苗木のみは、選択剤を解毒し、そして生存することができる。その選択を生存する実生を土壌に移し、そしてCIM(構成免疫性)表現型について試験する。植物を、野生型植物に比較して、観察できる表現型の差異について評価する。例34：NIM１の変更された形により形質転換された植物におけるCIM表現型の評価個々の一時形質転換体からの葉を収穫し、RNAを単離し(Verwoerdなど.，1989 ，Nuc．Acid Res.，2362)、そしてRNAブロット分析により構成的PR−１発現について試験する(Uknesなど.，1992)。個々の形質転換体を、構成的SAR発現分析(Uk nesなど.，1992)の表示である増強された耐病性応答について評価する。２種の適合できるＰ．パラシチカ単離物、すなわちEmwa及びNoco（すなわち、それらの菌類株はそれぞれ、野生型Ws−Ｏ及びCol−Ｏ植物に対して疾病を引き起す）からの５〜10×10⁴個の胞子／mlの分生子懸濁液を調製し、そして形質転換体に、前記適切な単離物を、形質転換体の生態型に依存して噴霧する。接種された植物を、高湿度下で７日間インキュベートする。植物を７日目で、疾病等級化し、そして一枚の葉を、菌類感染を測定するための手段を提供するプローブを用いて、 RNAブロット分析のために収穫する。 CIM表現型を示す形質転換体を、Ｔ１世代に取り、そしてホモ接合性植物を同定する。形質転換体を、下記のように一式の耐病性試験にゆだねる。Noco及びEmwaによる菌類感染をくり返し、そして葉を、Dietrichなど.，(1994 )に記載のようにして、ラクトフェノールブルーにより染色し、菌類菌子の存在を同定する。形質転換体を、Uknesなど.(1993)に記載のようにして、細菌病原体プスードモナスシリンガエDC3000により感染せしめ、耐性の範囲を評価する。感染されなかった植物を、遊離及びグルコース−接合されたSAについて評価し、そして葉をラクトフェノールブルーにより染色し、顕微鏡的損傷の存在について評価する。耐性植物を、SAR変異体、たとえばNahG（アメリカ特許第5,614,395号）及びndr１により性的に交雑し、他の変異体に対する耐性表現型のエピスタシス関係を確立し、そしてNIM１のそれらの優性−陰性変異体がSA−依存性フィードバックループにいかにして影響を及ぼすかを評価する。例35：NIM１相同体の単離プローブとしてNIM１ cDNA(配列番号21)を用いて、アラビドプシスNIM１の相同体を、異なった収穫物、たとえば例36に列挙されるもの（但し、それらだけには限定されない）からのゲノム又はcDNAライブラリーのスクリーニングを通して同定する。これを達成するための標準の技法は、プレートされたDNAライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング（プラーク又はコロニーのいづれか；たとえば、Sambrookなど.，Molecular Cloning，eds.，Cold Spring Harbor L aboratory Press，(1989)を参照のこと）、及びオリゴヌクレオチドプライマーを用いてのPCRによる増幅（たとえば、Innisなど.，PCR Protocols ，a Guide to Methods and Applications eds.，Academic Press（1990）を参照のこと）を包含する。同定された相同体を、発現ベクター中に遺伝子的に構築し、そして上記に列挙される収穫物を形質転換する。形質転換体を、試験される収穫物植物の適切な病原体を用いて、増強された耐病性について評価する。キュウリ、トマト、タバコ、トウモロコシ、小麦及び大麦のゲノムにおけるNI M１相同体を、DNAブロット分析により検出した。ゲノムDNAを、キュウリ、トマト、タバコ、トウモロコシ、小麦及び大麦から単離し、酵素BamHＩ，HindIII，X baＩ、又はSalＩにより制限消化し、0.8％アガロースゲル上で電気泳動的に分離し、そして細管ブロットによりナイロン膜にトランスファーした。DNAを結合するためにUV−架橋に続いて、膜を、³²Ｐ−放射性ラベルされたアラビドプシスタリアナNIM１ cDNAにより、低い緊縮条件〔（１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％の硫酸ラウリル、ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウム）、5 5℃で18〜24時間〕下でハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーションに続いて、ブロットを、低い緊縮条件下で洗浄し〔15分間の６×SSC、15分間の（Ｘ３）３×SSC、55℃で（Ｘ１）；１×SSCは0.15ＭのNaCl，l5mMのクエン酸ナトリウム(pH7.0)である〕、そしてNIM１に対応するバンドを可視化するためにＸ−線フィルムに照射した。さらに、NIM１遺伝子に対する類似性により同定される発現された配列標識(ES T)をまた、相同体を単離するために使用され得る。たとえば、いくつかのイネ発現された配列標識(EST)は、NIM１遺伝子に対する類似性により同定されて来た。複数配列一列整列を、DNA^*(1228 South Park Street，Madison Wisconsin，5371 5，Lasergene Biocomputing Software Package for the Macintosh(1994))の一部として、Clustal V(Higgins，Desmond G．and Paul M．Sharp(1989)，Fast an d sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer，CABIOS 5： 151-153)を用いて構成した。NIM１タンパク質の一定の領域が４種の異なったイネcDNAタンパク質生成物に対して、アミノ酸配列において相同である。その相同性は、GenBank BL AST調査において、NIM１配列を用いて同定された。NIM１及びイネcDNA生成物における相同性の領域の比較が図８に示される（また、配列番号３及び４〜11を参照のこと）。NIM１タンパク質フラグメントは、４種のイネ生成物と36〜48％のアミノ酸配列同一性を示す。それらのイネESTは、他の単子葉植物からのNIM１相同体の単離のために特に有用であり得る。相同体をPCRにより得ることができる。この方法においては、既知の相同体（たとえばイネ及びアラビドプシス）間での比較を行なう。次に、高いアミノ酸及びDNA類似性又は同一性の領域を、PCRプライマーとして使用する。Ｍ及びＷに富んでいる領域が最良であり、次に、Ｆ，Ｙ，Ｃ，Ｈ，Ｑ，Ｋ及びＥに富んでいる領域が最良である。なぜならば、それらのアミノ酸は制限された数のコドンによりコードされるからである。適切な領域が同定されると、その領域のためのプライマーが第３番目のコドン位置における種々の置換を伴って製造される。その３番目の位置における置換の多様性は、標的化される種々依存して強制され得る。たとえば、トウモロコシはGCに富んでいるので、可能なら、３番目の位置にＧ又はＣを利用するプライマーが企画される。 PCR反応を、種々の標準条件下で、cDNA又はゲノムDNAから実施する。バンドが明らかである場合、それはクローン化され、そしてそれがNIM１相同体であるかどうかを決定するために配列決定される。例36：収穫物植物におけるNIM１の変更された形の発現 Col−Ｏ又はWs−ＯにCIM表現型を付与するそれらの構造体を用いて、評価のために、収穫物植物を形質転換する。他方では、前述の例における収穫物から単離された、変更された生来のNIM１遺伝子も、それぞれの収穫物中に元に戻す。NIM１遺伝子はそれらの広い種類内に分類されるいづれかの植物細胞中に挿入され得るが、それは、次の収穫物植物の細胞において特に有用である：イネ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、インゲン豆、エンドウ豆、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、カボチャ、ズキニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラーズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシ及びサトウキビ。形質転換体を、増強された耐病性について評価する。本発明の好ましい態様において、NIM１遺伝子の変更された形の発現は、野生型植物における生来のNIM１遺伝子の発現レベルの少なくとも２倍、及び好ましくは、野生型発現レベルの10倍であるレベルで存在する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／０３４，３８２ (32)優先日平成８年12月27日(1996．12．27) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０３４，７３０ (32)優先日平成９年１月10日(1997．1．10) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０３５，０２１ (32)優先日平成９年１月10日(1997．1．10) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０３５，０２２ (32)優先日平成９年１月10日(1997．1．10) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／８８０，１７９ (32)優先日平成９年６月20日(1997．6．20) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ウクネス，スコットジョゼフアメリカ合衆国，ノースカロライナ 27502，アペックス，パインデールドライブ 1003 (72)発明者シュタイナー，ヘンリー−ヨークアメリカ合衆国，ノースカロライナ 27606，ローリー，アバントリッジロード 1800―103 (72)発明者ハント，ミッシェルデニーズアメリカ合衆国，ノースカロライナ 27514，チャペルヒルズ，ビッカーズロード 361 (72)発明者フリードリヒ，レスリーベザーズアメリカ合衆国，ノースカロライナ 27502，アペックス，ウィックフォードプレイス 4208 【要約の続き】にも関する。本発明はさらに、形質転換ベクター、及び植物においてNIM１遺伝子を過剰発現するための方法に関する。植物においてNIM１遺伝子の過剰発現を生成するためのベクター及び方法が開示される。本発明はまた、NIM１遺伝子生成物の変更された形をコードするDNA 分子により前記植物を形質転換することによって、植物においてSARを活性化し、そして植物にCIM表現型及び広い範囲の耐病性を付与することを含んで成る。

Claims

【特許請求の範囲】１． NIM１タンパク質の変更された形をコードするDNA分子。２．SARシグナル伝達経路の優性−陰性レギュレーターとして作用する請求の範囲第１項記載のDNA分子。３．前述NIM１タンパク質の変更された形が、配列番号３の位置55及び59に対応するアミノ酸位置においてセリンの代わりにアラニンを有する請求の範囲第１項記載のDNA分子。４．前記NIM１タンパク質の前記変更された形が、配列番号23に示されるアミノ酸配列を含んで成る請求の範囲第３項記載のDNA分子。５．前記DNA分子が配列番号22に示されるヌクレオチド配列及びすべてのDNAを含んで成る請求の範囲第４項記載のDNA分子。６．前記NIM１タンパク質の変更された形がNIM１遺伝子生成物の切断された変型である請求の範囲第１項記載のDNA分子。７．前記NIM１タンパク質の変更された形が、配列番号３のアミノ酸位置１〜1 25にほぼ対応するアミノ酸のＮ−末端切断を有する請求の範囲第１項記載のDNA 分子。８．前記NIM１タンパク質の変更された形が、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含んで成る請求の範囲第７項記載のDNA分子。９．前記DNA分子が配列番号24に示されるヌクレオチド配列を含んで成る請求の範囲第８項記載のDNA分子。 10．前記NIM１タンパク質の変更された形が配列番号３のアミノ酸位置522〜59 3にほぼ対応するアミノ酸のＣ−末端切断を有する請求の範囲第１項記載のDNA分子。 11．前記NIM１タンパク質の変更された形が配列番号27に示されるアミノ酸配列を含んで成る請求の範囲第10項記載のDNA分子。 12．前記DNA分子が配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含んで成る請求の範囲第11項記載のDNA分子。 13．前記NIM１タンパク質の変更された形が、配列番号２のアミノ酸位置１〜1 25にほぼ対応するアミノ酸のＮ−末端切断、及び配列番号３のアミノ酸位置522 〜593にほぼ対応するアミノ酸のＣ−末端切断を有する請求の範囲第１項記載のD NA分子。 14．前記NIM１タンパク質の変更された形が配列番号29に示されるアミノ酸配列を含んで成る請求の範囲第13項記載のDNA分子。 15．前記DNA分子が配列番号28に示されるヌクレオチド配列を含んで成る請求の範囲第14項記載のDNA分子。 16．前記NIM１タンパク質の変更された形が配列番号３のアミノ酸位置103〜36 2にほぼ対応するアンキリンモチーフから実質的に成る請求の範囲第１項記載のD NA分子。 17．前記NIM１タンパク質の変更された形が、配列番号31に示されるアミノ酸配列を含んで成る請求の範囲第16項記載のDNA分子。 18．前記DNA分子が配列番号30に示されるヌクレオチド配列を含んで成る請求の範囲第17項記載のDNA分子。 19．前記DNA分子が、配列番号22，24，26，28及び30から成る群から選択されたヌクレオチドに対して、次の条件：１％のBSA；520mMのNaPO₄，pH7.2；７％の硫酸ラウリル、ナトリウム塩；１mMのEDTA；250mMの塩化ナトリウムにおける55 ℃で18〜24時間のハイブリダイゼーション、及び15分間の６×SSC、15分間の（Ｘ３）３×SSCにおける55℃での（Ｘ１）洗浄下でハイブリダイズする請求の範囲第１項記載のDNA分子。 20．請求の範囲第１〜19のいづれか１項記載のDNA分子に操作可能に連結される、植物において活性的なプロモーターを含んで成るキメラ遺伝子。 21．宿主細胞中に安定して形質転換され得る、請求の範囲第20項記載のキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクター。 22．請求の範囲第21項記載の組換えベクターにより植物を形質転換することを含んで成る、植物のSARを活性化するための方法であって、前記NIM１タンパク質の変更された形が前記形質転換された植物において発現され、そして前記植物においてSARを活性化することを特徴とする方法。 23．請求の範囲第21項記載の組換えベクターにより植物を形質転換することを含んで成る、植物に広範囲の耐病性を付与するための方法であって、前記NIM１タンパク質の変更された形が前記植物において発現され、そして前記植物に広範囲の耐病性を付与することを特徴とする方法。 24．請求の範囲第21項記載の組換えベクターにより植物を形質転換することを含んで成る、植物にCIM表現型を付与するための方法であって、前記NIM１タンパク質の変更された形が前記形質転換された植物において発現され、そして前記植物にCIM表現型を付与することを特徴とする方法。 25．請求の範囲第21項記載のベクターにより安定して形質転換された宿主細胞。 26．植物細胞である請求の範囲第25項記載の宿主細胞。 27．広範囲の耐病性を有する請求の範囲第19項記載のキメラ遺伝子を含んで成る、植物、植物細胞及びそれらの子孫。 28．植物において全身性後天性耐性を導びくシグナル伝達カスケードに関与するNIM１タンパク質が、野生型植物においてよりも高いレベルで、形質転換された植物において発現される、植物、植物細胞及びそれらの子孫。 29．前記植物が裸子植物、単子葉植物及び双子葉植物から成る群から選択される請求の範囲第27又は28項記載の植物、植物細胞及びそれらの子孫。 30．前記植物収穫物植物である請求の範囲第27又は28項記載の植物、植物細胞及びそれらの子孫。 31．前記植物が、米、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、インゲン豆、エンドウ豆、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、カボチャ、ズキニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラーズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシ及びサトウキビから成る群から選択される請求の範囲第27又は28項記載の植物、植物細胞及びそれらの子孫。 32．植物細胞、植物及びそれらの子孫にCIM表現型を付与するための方法であって、植物において全身性後天性耐性を導びくシグナル伝達カスケードに関与するNIM１タンパク質をコードするDNA分子に操作可能的に連結される、植物において活性的なプロモーターを含んで成るキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクターにより前記植物を形質転換することを含んで成り、ここで前記ベクターが宿主中に安定して形質転換され得、そして前記NIM１タンパク質が野生型植物においてよりも高いレベルで、前記形質転換された植物において発現されることを特徴とする方法。 33．植物細胞、植物及びそれらの子孫において全身性後天性耐性を活性化するための方法であって、植物において全身性後天性耐性を導びくシグナル伝達カスケードに関与するNIM１タンパク質をコードするDNA分子に操作可能的に連結される、植物において活性的なプロモーターを含んで成るキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクターにより前記植物を形質転換することを含んで成り、ここで前記ベクターが宿主中に安定して形質転換され得、そして前記NIM１タンパク質が野生型植物においてよりも高いレベルで、前記形質転換された植物において発現されることを特徴とする方法。 34．植物細胞、植物及びそれらの子孫に広い範囲の耐病性を付与するための方法であって、植物において全身性後天性耐性を導びくシグナル伝達カスケードに関与するNIM１タンパク質をコードするDNA分子に操作可能的に連結される、植物において活性的なプロモーターを含んで成るキメラ遺伝子を含んで成る組換えベクターにより前記植物を形質転換することを含んで成り、ここで前記ベクターが宿主中に安定して形質転換され得、そして前記NIM１タンパク質が野生型植物においてよりも高いレベルで、前記形質転換された植物において発現されることを特徴とする方法。 35．請求の範囲第20項記載のキメラ遺伝子を含んで成るトランスジェニック植物又はその子孫の農業方法への使用。 36．野生型植物においてよりも高いレベルで、形質転換された植物において発現される少なくとも１つのNIM１タンパク質の変更された形又はNIM１タンパク質を含んで成るトランスジェニック植物の種子、及びSARシグナル伝達経路の優性 −陰性レギュレーターとして作用するのに十分な量での適切なキャリヤー、並びに植物に広範囲の耐病性を付与するためへの使用のための表示使用説明書を含んで成る商業用バッグ。