ITMI972741A1

ITMI972741A1 - Procedimento di impiego del gene nimi per conferire alle piante resistenza alle malattie

Info

Publication number: ITMI972741A1
Application number: IT97MI002741A
Authority: IT
Inventors: John Andrew Ryals; Kay Ann Lawton; Scott Joseph Uknes; Henry-York Steiner; Michelle Denise Hunt; Leslie Bethards Friedrich
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 1999-06-11
Also published as: BR9714398A; NL1007779A1; AU727179B2; EP0944728A1; CA2273189A1; IT1298472B1; FR2757875A1; NL1007779C2; AU5663198A; WO1998026082A1; JP2001505774A

Description

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE INDUSTRIALE

La presente invenzione in generale riguarda una resistenza alle malattie ad ampio spettro in piante, ivi compreso il fenomeno di una resistenza acquisita sistemica (SAR). Più in particolare, la presente invenzione riguarda l'espressione ricombinante di forme di tipo selvaggio e di forme alterate del gene NIM1, che è coinvolto nella cascata di trasduzioni di segnali che porta a SAR in modo da creare piante transgeniche aventi una resistenza alle malattie ad ampio spettro. La presente invenzione riguarda inoltre l'espressione a livello elevato del gene NIM1 clonato in piante transgeniche che hanno una resistenza alle malattie ad ampio spettro.

Le piante vengono costantemente attaccate da una grande varietà di organismi patogeni che comprendono virus, batteri, funghi e nematodi. Le piante da coltura sono particolarmente vulnerabili poiché esse di solito vengono coltivate sotto forma di monocolture geneticamente uniformi; quando la malattia colpisce, le perdite possono essere gravi.

Tuttavia per la massima parte le piante hanno loro meccanismi innati propri di difesa contro gli organismi patogeni. Una variazione naturale della resistenza agli organismi patogeni delle piante è stata identificata da allevatori e tecnici patologi di piante e si è originata in molte piante da coltura. Questi geni naturali di resistenza alle malattie spesso realizzano elevati livelli di resistenza verso i patogeni oppure di immunità contro i patogeni.

La resistenza acquisita sistemica (SAR) è un componente del sistema complesso che le piante utilizzano per difendersi dagli agenti patogeni (Hunt e Ryals, Crit. Rev. in Plant Sci . 15, 583-606 (1996), incorporato qui come riferimento nella sua completezza; Ryals et al., Plant Celi 8, 1809-1819 (1996), incorporato qui come riferimento nella sua completezza. Vedere inoltre il Brevetto U.S. No.

5.614.395, qui incorporato qui come riferimento nella sua completezza). La SAR è un aspetto particolarmente importante di risposte ai patogeni delle piante poiché essa è una resistenza sistemica inducibile contro i patogeni, contro un ampio spettro di agenti infettivi che comprendono virus, batteri e funghi. Quando il percorso di trasduzione del segnale SAR viene bloccato, le piante diventano più sensibili agli agenti patogeni che normalmente provocano malattia ed essi diventano anche sensibili nei confronti di certi agenti infettivi che normalmente non provocherebbero malattia. (Gaffney et al., Science 261, 754-756 (1993), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Delaney et al., Science 266, 1247-1250 (1994) incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Delaney et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 92, 6602-6606 (1995), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Delaney, Plant Phys. 113, 5-12 (1997), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Bi et al., Plant J. 8, 235-245 (1995), .incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Mauch-Mani e Slusarenko, Plant Celi 8, 203-212 (1996), incorporato qui come riferimento nella sua interezza). Queste osservazioni stanno ad indicare che il percorso di trasduzione del segnale SAR è critico per mantenere la salute delle piante.

Concettualmente, la risposta SAR può venire suddivisa in due fasi. Nella fase di inizio, l'infezione patogena viene riconosciuta e viene liberato un segnale che si sposta attraverso il floema verso tessuti distanti. Questo segnale sistemico viene percepito da cellule bersaglio che reagiscono mediante espressione di geni SAR e di resistenza alla malattia. La fase di mantenimento di SAR si riferisce al periodo di tempo che è compreso tra settimane fino all'intera vita della pianta, durante il quale la pianta è in uno stato quasi costante e la resistenza alle malattie viene conservata (Ryals et al., 1996).

Sembra che un accumulo di acido salicilico (SA) sia necessario per la trasduzione del segnale SAR. Le piante che non possono accumulare SA a causa del trattamento con inibitori specifici, a causa di una repressione epigenetìca di fenilalanina ammonia-liasi oppure a causa di una espressione transgenica di salicilato-idrossilasi che degrada in particolare SA, non possono quindi indurre l'espressione del gene SAR oppure resistenza alle malattie (Gaffney et al., 1993; Delaney et al., 1994; Mauchi-Mani e Slusarenko 1996; Maher et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 91, 7802-7806 (1994), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Pallas et al., Plani J. 10, 281-293 (1996), incorporato qui come riferimento) . Sebbene sia stato suggerito che SA potrebbe servire come il segnale sistemico questa ipotesi attualmente è controversa e fino ad ora tutto ciò che è dato per certo è che se SA non si può accumulare, allora la trasduzione del segnale SAR viene bloccata (Pallas et al., 1996; Shulaev et al., 1995 Plant Celi 7, 1691-1701 (1995), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Vernooij et al., Plant Celi 6, 959-965 (1994), incorporato qui come riferimento nella sua interezza) .

Recentemente, Arabidopsis è emersa come un sistema modello per studiare la SAR (Uknes et al., Plant Celi 4, 645-656 (1992), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Uknes et al., Mol . Plant -Ni crobe Interact. 6, 692-698 (1993), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Cameron et al., Plant J. 5, 715-725 (1994), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Mauch-Mani e Slusarenko, Mol . Plant-Microbe Interact.

7, 378-383 (1994), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Dempsey e Klessig, Bulletln de L 'Institut Pasteur 93, 167-186 (1995), incorporato qui come riferimento nella sua interezza). E' stato dimostrato che la SAR può venire attivata in Arabidopsis sia mediante agenti patogeni che mediante agenti chimici come SA, acido 2, 6-dicloroisonicotinico (INA) ed estere S-metilico dell'acido benzo (1,2,3)tiadiazol-7-carbotioico (BTH) (Uknes et al., 1992; Vernooij et al., Mol . Plant-Microbe Interact. 8, 228-234 (1995), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Lawton et al., Plani J. 10, 71-82 (1996), incorporato qui come riferimento nella sua interezza). Dopo trattamento con INA oppure con BTH oppure con una infezione patogena, almeno tre geni di proteine correlate alla patogenesi (PR), ossia, PR-1, PR-2 e PR-5 vengono indotti in modo coordinato insieme con l’instaurarsi della resistenza (Uknes et al., 1992, 1993). Nel tabacco, nelle migliori specie caratterizzate, un trattamento con un agente patogeno oppure-con un composto immunizzante induce l'espressione di almeno nove serie di geni (Ward et al., Plant Celi 3, 1085-1094 (1991), incorporato qui come riferimento nella sua interezza). Sono state create piante transgeniche resistenti alle malattie trasformando le piante con diversi geni SAR (Brevetto U.S. No. 5.614.395).

E’ stato isolato un certo numero di mutanti di Arabidopsis che hanno una trasduzione del segnale SAR modificato (Delaney, 1997). Il primo di questi mutanti è costituito dai cosiddetti mutanti Isd (malattia che simula lesioni) e acd2 (accelerated celi death - morte della cellula accelerata) (Dietrich et al., Celi 77, 551-563 (1994), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Greenberg et al., Celi 77, 551-563 (1994), incorporato qui come riferimento nella sua interezza). Questi mutanti hanno tutti un certo grado di formazione di lesioni necrotiche spontanee sulle loro foglie, elevati livelli di SA, un accumulo di mRNA per i geni SAR ed una resistenza alle malattie aumentata in modo significativo. Sono stati isolati e caratterizzati almeno sette differenti mutanti Isd (Dietrich et al., 1994; Weymann et al., Plani Celi 7, 2013-2022 (1995), incorporato qui come riferimento nella sua interezza). Un'altra classe interessante di mutanti sono i mutanti cim (constitutive immunity - immunità costitutiva) (Lawton et al., 1993) "La biologia molecolare di una resistenza acquisita sistemica" in Mechanisms of Defence Responses in Plants, B. Fritig e M. Legrand, eds (Dordrecht, Olanda; Kluwer Academic Publishers), pagine 422-432 (1993), incorporato qui come riferimento nella sua interezza). Vedere inoltre la Domanda di Brevetto Internazionale PCT WO 94/16077, le quali entrambe vengono incorporate qui come riferimento completamente nelle loro interezze. Come i mutanti Isd e acd2, i mutanti cim hanno una elevata espressione dei geni SA e SAR e una elevata resistenza, però contrariamente a Isd oppure ad acd2, non presentano lesioni rivelabili sulle loro foglie. Il cprl (constitutive expresser of PR genes espressore costitutivo di geni PR) può essere un tipo di mutante cim; tuttavia, poiché la presenza di lesioni microscopiche sulle foglie di cprl non è stata esclusa, il cprl potrebbe essere un tipo di mutante Isd {Bowling et al., Plant Celi 6, 1845-1857 (1994), incorporato qui come riferimento nella sua interezza).

Sono stati inoltre isolati mutanti che sono bloccati nel segnalare SAR. ndrl (non-race-specific disease resistance - resistenza alle malattie non specifica di razze) è un mutante che consente la crescita sia di Pseudomonas syringae contenente diversi geni di avirulenza e anche isolati normalmente avirulenti di Peronospora parasitica (Century et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 92, 6597-6601 (1995), incorporato qui come riferimento nella sua interezza). Evidentemente questo mutante viene bloccato precocemente nella segnalazione di SAR. nprl (nonexpresser of PR genes - non espressore di geni PR) è un mutante che non può indurre l'espressione del percorso di segnalazione di SAR dopo trattamento con INA (Cao et al., Plant Celi 6, 1583-1592 (1994), incorporato qui come riferimento nella sua interezza) . I mutanti eds (enhanced disease susceptibility - sensibilità aumentata alle malattie) sono stati isolati in base alla loro capacità di sostenere infezioni batteriche dopo inoculazione di una bassa concentrazione di batteri (Glazebrook et al., Genetics 143, 973-982 (1996), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Parker et al., Plant Celi 8, 2033-2046 (1996), incorporato qui come riferimento nella sua interezza). Certi mutanti eds sono molto simili come fenotipo a nprl, e, recentemente, si è dimostrato che ed$5 ed eds53 sono allelici rispetto a nprl (Glazebrook et al., 1996). niml (noninducible immunity - immunità non inducibile) è un mutante che sostiene la crescita di P. parasitica (ossia, l'agente causale della malattia della muffa lanuginosa) dopo trattamento con INA (Delaney et al., 1995; Domanda di Brevetto Internazionale PCT WO 94/16077). Sebbene niml possa accumulare SA dopo infezione di patogeni, esso non può indurre l'espressione del gene SAR oppure una resistenza alle malattie il che suggerisce che la mutazione blocca il percorso a valle di SA. niml viene inoltre compromesso nella sua capacità di rispondere a INA oppure BTH, il che suggerisce che il blocco esiste a valle dell'azione di questi composti chimici (Delaney et al., 1995; Lawton et al., 1996). Recentemente, sono stati isolati e caratterizzati due geni allelici di Arabidopsis, i cui mutanti sono responsabili per i fenotipi rispettivamente niml e nprl (Ryals et al., Plant Celi 9, 425-439 (1997), incorporato qui come riferimento nella sua interezza; Cao et al., Celi 88, 57-63 (1997), incorporato qui come riferimento nella sua interezza) . Il prodotto del gene NIM1 di tipo selvaggio è coinvolto nella cascata di trasduzione di segnale che porta sia a SAR che alla resistenza alla malattia gene per gene in Arabidopsis (Ryals et al., 1997). Ryals et al., 1997 inoltre riferiscono l'isolamento di cinque ulteriori alleli di niml che presentano uno spettro di fenotipi da debolmente compromessi nell'espressione del gene PR~1 chimicamente indotto e nella resistenza ai funghi fino a molto fortemente bloccato. La trasformazione del gene NPR1 di tipo selvaggio in mutanti nprl non soltanto ha complementato le mutazioni, ripristinando la possibilità di risposta di induzione SAR rispetto alla espressione del gene PR e resistenza alle malattie ma inoltre ha resto le piante transgeniche più resistenti ad una infezione provocata da P. syringae in assenza di induzione di SAR (Cao et al., 1997) .

Percorsi di trasduzione dei segnale NF-KB/IKB I percorsi di segnalazione NF-κΒ/ϊκΒ sono stati implicati in risposte di resistenza alle malattie in un ampio spettro di organismi dalla Drosophila fino ai mammiferi. Nei mammiferi, la trasduzione del segnale NF-κΒ/ΙκΒ può venire indotta da un certo numero di differenti stimoli che comprendono l’esposizione di.cellule ad un lipopolisaccaride, ad un fattore di necrosi dei tumori, alla interleuchina 1 (IL-1), oppure ad una infezione da virus (Baeuerle e Baltimore, Celi 87, 13-20 (1996); Baldwin, Annu. Rev. Immunol . 14, 649-681 (1996)). Il percorso attivato porta alla sintesi di un certo numero di fattori coinvolti in risposte di infiammazione e in risposte immunitarie come IL-2, IL-6, IL-8 e un fattore che stimola colonie di granulociti/macrofagi (deMartin et al., Gene 152, 253-255 (1995)). In studi su topi transgenici, l'abbattimento della trasduzione del segnale NF-κΒ/ΙκΒ porta ad una risposta immunitaria imperfetta che comprende una sensibilità aumentata ad agenti patogeni come batteri e virus (Beg e Baltimore, Science 274, 782-784 (1996); Van Antwerp et al., Science 274, 7872-789 (1996); Wang et al., Science 274, 784-787 (1996); Baeuerle e Baltimore (1996)). In Arabidopsis, la SAR è funzionalmente analoga ad una infiammazione in quanto i processi di resistenza normali vengono potenziati dopo attivazione della SAR che porta ad una aumentata resistenza alle malattie (Bi et al., 1995; Cao et al., 1994; Delaney et al., 1995; Delaney et al., 1994; Gaffney et al., 1993; Mauch-Mani e Slusarenko, 1996; Delaney, 1997). Inoltre, l’inattivazione del percorso porta ad una aumentata sensibilità nei confronti di agenti patogeni costituiti da batteri, virus e funghi. E’ interessante il fatto che è stato riportato che SA blocca l'attivazione di NF-κΒ in cellule di mammiferi (Kopp e Ghosh, Science 265, 956-959 (1994)), mentre SA attiva la trasduzione del segnale in Arabidopsis. L'infezione batterica di Drosophila attiva una cascata di trasduzioni di segnali che porta alla sintesi di un certo numero di proteine antifungo come cercoprin B, defensin, diptericin e drosomycin (Ip et al., Celi 75, 753-763 (1993); Lemaitre et al., Celi 86, 973-983 (1996)). Questa induzione dipende dal prodotto del gene di omologhi dorsal e dif, due NF-κΒ, e viene espresso da cactus, un omologo I-κΒ nella mosca. Mutanti che hanno una diminuita sintesi delle proteine antifungo e antibatteri presentano una resistenza alle infezioni drasticamente diminuita.

Nonostante molte ricerche e nonostante l'impiego di misure di protezione delle colture sofisticate e intensive che comprendono la trasformazione genetica di piante, perdite dovute a malattia ogni anno ammontano a miliardi di dollari. Pertanto vi è una necessità continua di sviluppare nuove misure di protezione delle colture sulla base della conoscenza sempre crescente della base genetica della resistenza alle malattie in piante.

Le definizioni che seguono favoriscono la comprensione della presente invenzione.

Cellula di pianta: l'unità strutturale e fisiologica di piante, costituita da un protoplasto e dalla parete cellulare. Il termine "cellula di pianta" si riferisce a qualsiasi cellula che è parte di una pianta oppure è derivata da una pianta. Alcuni esempi di cellule comprendono cellule differenziate che sono parte di una pianta vivente; cellule differenziate in coltura; cellule non differenziate in coltura; le cellule di un tessuto indifferenziato come callo oppure tumori; cellule differenziate di semi, embrioni, elementi di propagazione e polline.

Tessuto di pianta: un gruppo di cellule vegetali organizzate in una unità strutturale e funzionale.

Viene incluso qualsiasi tessuto di una pianta presente nelle piante oppure in coltura. Questo termine comprende, senza limitazione, piante intere, organi di piante, semi di piante, coltura di tessuti e qualsiasi gruppo di cellule vegetali organizzate in unità strutturali e/o funzionali. L'impiego di questo termine insieme con un qualsiasi tipo specifico di tessuto vegetale oppure in assenza di esso, come elencato sopra oppure altrimenti compreso da questa definizione non intende essere esclusivo di qualsiasi altro tipo di tessuto vegetale.

Protoplasto : una cellula vegetale senza parete cellulare.

Pianta discendente: una pianta di una generazione successiva derivata in modo sessuato oppure in modo asessuato che comprende ma senza limitazione, piante di discendenza.

Pianta transgenica: una pianta nella quale è incorporato in modo stabile DNA ricombinante nel suo genoma.

DNA ricombinante: qualsiasi molecola di DNA formata collegando segmenti di DNA di origini differenti e prodotte per mezzo della tecnologia del DNA ricombinante.

Tecnologia del DNA ricombinante: tecnologia che produce il DNA ricombinante in vitro e trasferisce il DNA ricombinante in cellule dove esso può venire espresso oppure propagato (vedere Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Ed. Juo, CRC Press, Boca Raton (1996)), per esempio, trasferimento di DNA in un protoplasto (protoplasti) oppure in una cellula (in cellule) in diverse forme, che comprendono per esempio, (1) DNA semplice in forme circolare, lineare oppure superaw olta, (2) DNA contenuto in nucleosomi oppure cromosomi oppure loro nuclei o parti, (3) DNA legato sotto forma di complesso oppure associato con altre molecole, (4) DNA incluso in liposomi, sferoplasti, cellule oppure protoplasti oppure (5) DNA trasferito da organismi diversi dell'organismo ospite (ex. Agrobacterium tum efiaciens) . Questi e altri diversi metodi per introdurre il DNA ricombinante in cellule sono noti nel settore e possono venire utilizzati per produrre cellule transgenìche oppure piante transgeniche della presente invenzione.

La tecnologia del DNA ricombinante comprende anche metodi di ricombinazione omologa descritti in Treco et al., WO 94/12650 e Treco et al., WO 95/31560 che possono venire applicati per fare aumentare l'attività di perossidasi in una pianta monocotiledone. In modo specifico, regioni regolatrici (ex. promotori) possono venire introdotte nel genoma di piante per fare aumentare l'espressione della perossidasi endogena.

Come tecnologia del DNA ricombinante è incluso anche l'inserimento di una sequenza che codifica perossidasi priva di segnali di espressione selezionati in una pianta monocotiledone e che valuta la pianta monocotiledone transgenica per una aumentata espressione di perossidasi dovuta a sequenze di controllo endogene nella pianta monocotiledone. Ciò porterebbe come risultato ad un aumento nel numero di copie di sequenze che codificano perossidasi all'interno della pianta.

Viene definito che l'inserimento iniziale del DNA ricombinante nel genoma della pianta R° non viene realizzato mediante metodi di coltura di piante tradizionali ma piuttosto mediante metodi tecnici come qui descritti. Dopo l'inserimento iniziale, i discendenti transgenici possono venire propagati adottando metodi di coltura essenzialmente tradizionali.

Gene chimerico: una molecola di DNA che contiene almeno due parti eterologhe, per esempio parti derivate da sequenze di DNA preesistenti che non sono associate nei loro stati pre-esistenti, queste sequenze essendo state generate preferibilmente utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante.

Cassetta di espressione: una molecola di DNA che comprende un promotore e un terminatore tra i quali si può inserire una sequenza codificante.

Sequenza codificante: una molecola di DNA che, quando viene trascritta e tradotta, porta come risultato alla formazione di un polipeptide oppure di una proteina.

Gene : una regione cromosomica separata che comprende una sequenza di DNA regolatore responsabile per il controllo di una espressione, ossia trascrizione e traduzione e di una sequenza codificante che viene trascritta e tradotta in modo da ottenere un polipeptide differente oppure una proteina differente.

La presente invenzione descrive l'identificazione, l'isolamento e la caratterizzazione del gene NIM1, che codifica una proteina coinvolta nella cascata di trasduzione del segnale sensibile a induttori biologici e chimici che porta ad una resistenza acquisita sistemica nelle piante.

Quindi la presente invenzione descrive una molecola di DNA isolata (gene NIM1) che codifica una proteina NIM1 coinvolta nella cascata di trasduzione del segnale che porta ad una resistenza acquisita sistemica nelle piante.

Entro l'ambito della presente invenzione, viene descritta una molecola di DNA che codifica la proteina NIM1 che ibridizza nelle seguenti condizioni con il clone BAC-04, Deposito ATCC No. 97543: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2/ 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C. In una forma di realizzazione particolarmente preferita il gene NIM1 è contenuto all'interno del clone BAC-04, Deposito ATCC No. 97543.

Viene inoltre descrìtta una molecola di DNA che codifica la proteina NIM1 che ibridizza nelle seguenti condizioni ad un cosmide D7, Deposito ATCC No. 97736: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C. In una forma di realizzazione particolarmente preferita il gene NIM1 è compreso all'interno del cosmide D7, Deposito ATCC No. 97736.

Il gene NIM1 qui descritto può venire isolato da una pianta dicotiledone come Arabidopsis, tabacco, cetriolo oppure pomodoro. Come alternativa il gene NIM1 può venire isolato da una pianta monocotiledone come mais, frumento oppure orzo.

Viene descritta inoltre una proteina NIM1 codificata che comprende la sequenza di amminoacidi riportata in SEQ ID NO:3. Viene inoltre descritta la sequenza che codifica il gene NIM1 che ibridizza nelle seguenti condizioni con la sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:2: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaPO^, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti {XI) a 55°C. In una forma di realizzazione particolarmente preferita la sequenza che codifica il gene NIM1 comprende la sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:2.

La presente invenzione descrive inoltre un gene chimerico che comprende un promotore attivo nelle piante collegato in modo operativo ad una sequenza che codifica il gene NIM1, un vettore ricombinante che comprende tale gene chimerico in cui il vettore è in grado di venire trasformato stabilmente in un ospite e descrive anche un ospite trasformato in modo stabile con tale vettore. Preferibilmente l'ospite è una pianta come una delle seguenti colture importanti dal punto di vista agricolo: riso, frumento, orzo, segale, mais, patate, carote, patate dolci, barbabietola da zucchero, fagioli, piselli, cicoria, lattuga, cavolo, cavolfiore, broccoli, rape, rafano, spinaci, asparagi, cipolle, aglio, melanzane, pepe, sedano, carote, melopopone, zucca, zucchini, cetrioli, mele, pere, cotogne, meloni, susine, ciliegie, pesche, "nectarine", albicocche, fragole, uva, lamponi, more, ananasso, avocado, papaia, mango, banana, soia, tabacco, pomodori, sorgo e canna da zucchero .

In una forma di realizzazione particolarmente preferita, la proteina NIM1 viene espressa in una pianta trasformata in corrispondenza di livelli più elevati rispetto ai livelli presenti in una pianta di tipo selvaggio.

La presente invenzione riguarda inoltre un metodo per conferire un fenotipo CIM ad una pianta trasformando la pianta con un vettore ricombinante che contiene un gene chimerico che di per sè comprende un promotore attivo in piante, collegato in modo operativo ad una sequenza che codifica il gene NIM1 in cui la proteina NIM1 codificata viene espressa nella pianta trasformata in corrispondenza di quantità più elevate rispetto che nella pianta di tipo selvaggio.

Inoltre la presente invenzione riguarda un metodo per attivare una resistenza acquisita sistemica in una pianta trasformando la pianta con un vettore ricombinante che comprende un gene chimerico che di per sè contiene un promotore attivo in piante, collegato in modo operativo ad una sequenza che codifica il gene NIM1 in cui la proteina NIM1 codificata viene espressa nella pianta trasformata in corrispondenza di quantità più elevate rispetto che in una pianta di tipo selvaggio.

Inoltre la presente invenzione riguarda un metodo per conferire una resistenza alle malattie ad ampio spettro ad una pianta trasformando la pianta con un vettore ricombinante che contiene un gene chimerico che di per sè contiene un promotore attivo in piante, collegato in modo operativo ad una sequenza che codifica il gene NIM1 in cui la proteina NIM1 codificata viene espressa nella pianta trasformata in corrispondenza di livelli più elevati rispetto ai livelli presenti in una pianta di tipo selvaggio.

Un altro aspetto della presente invenzione utilizza sia la conoscenza che il percorso SAR in piante presenta paralleli funzionali con lo schema di regolazione NF-κΒ/ΙκΒ in mammiferi e mosche, come anche la scoperta che il prodotto del gene NIM1 è un omologo strutturale del fattore di trasduzione del segnale in mammiferi IKB sottoclasse a. Sono state descritte mutazioni di IKB che agiscono come superrepressori o negativi-dominanti dello schema di regolazione di NF-κΒ/ΙκΒ. La presente invenzione comprende forme alterate del gene N1M1 di tipo selvaggio (SEQ NO:2) che agiscono come regolatori negativi-dominanti del percorso di trasduzione del segnale SAR. Queste forme alterate di NIM1 conferiscono il fenotipo opposto in piante trasformate con esso come il mutante niml ; ossia piante trasformate con forme alterate di NIM1 presentano una espressione del gene SAR costitutivo e un fenotipo CIM.

La presente invenzione comprende inoltre molecole di DNA che ibridizzano con una molecola di DNA secondo l'invenzione come qui in precedenza definita però preferibilmente con una sonda di oligonucleotidi ottenibile da detta molecola di DNA che comprende una porzione contigua della sequenza codificante per dette forme alterate di NIM1 avente una lunghezza di almeno 10 nucleotidi, in condizioni moderatamente rigorose.

I fattori che influiscono sulla stabilità degli ibridi determinano la rigorosità della ibridazione. Un tale fattore è la temperatura di fusione Tm che può venire facilmente calcolata secondo la formula descritta in DNA PR0BES, George H. Keller e Mark M. Manak, Macmillan Publishers Ltd, 1993, Sezione uno: Molecular Hybridization Technology; pagina 8 e seguenti .

La temperatura di ibridazione preferita è compresa nell’intervallo di circa 25°C al disotto della temperatura di fusione calcolata Tm e preferibilmente nell'intervallo di circa 12-15°C al disotto della temperatura di fusione calcolata Tm e nel caso di oligonucleotidi si trova nell'intervallo di circa 5-10°C al disotto della temperatura di fusione Tm.

In una forma di realizzazione della presente invenzione, il gene NIM1 viene alterato in modo che il prodotto codificato abbia alanine invece di serine nelle posizioni degli amminoacidi corrispondenti alle posizioni 55 e 59 della sequenza di amminoacidi NIM1 di Arabidopsis di tipo selvaggio (SEQ ID NO:3). Un esempio di una forma di realizzazione preferita di questa forma alterata del gene MIMI che porta come risultato a cambiamenti di questi residui di serine in residui di alanine viene presentato in SEQ ID NO:22. Una forma negativa dominante esemplificativa della proteina NIM1 con alanine al posto di serine in corrispondenza delle posizioni degli amminoacidi 55 e 59 viene mostrata in SEQ ID NO:23. La presente invenzione comprende inoltre forme alterate di alleli di NIM1, in cui la sequenza codificante di un tale allele ibridizza in condizioni rigorose moderate con la sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:22, particolarmente preferite sono le seguenti condizioni: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in èXSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (X1) a 55°C. In queste forme di realizzazione, alleli di NIM1 che ibridizzano con la SEQ ID NO:22 nelle condizioni di cui sopra vengono alterati in modo che il prodotto codificato contiene alanine invece di serine nelle posizioni degli amminoacidi che corrispondono alle posizioni 55 e 59 di SEQ ID NO:22.

In un'altra forma, di realizzazione della presente invenzione, il gene NIM1 viene alterato in modo che il prodotto codificato ha una parte troncata N-terminale che rimuove i residui di lisina che possono servire come siti potenziali di ubiquitinazione oltre alle serine in corrispondenza delle posizioni degli amminoacidi che corrispondono alle posizioni 55 e 59 della proteina di tipo selvaggio. Un esempio di una forma di realizzazione preferita di questa forma alterata del gene NIM1 che codifica un prodotto del gene avente una delezione N-terminale viene presentata in SEQ ID NO:24. Una forma negativadominante esemplificativa della proteina NIM1 con una delezione N-terminale viene mostrata in SEQ ID NO:25. La presente invenzione comprende inoltre forme alterate di alleli di NIM1 in cui la sequenza codificante di un tale allele ibridizza in condizioni moderatamente rigorose con la sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:24; particolarmente preferite sono le seguenti condizioni: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (X1) a 55°C. In queste forme di realizzazione, alleli di NIM1 che ibridizzano con SEQ ID NO:24 nelle condizioni di cui sopra vengono alterati in modo che il prodotto codificato ha una delezione N-terminale che rimuove residui di Lisina che possono servire come siti potenziali di ubiquitinazione oltre alle serine presenti in corrispondenza delle posizioni degli amminoacidi che corrispondono alle posizioni 55 e 59 del prodotto del gene di tipo selvaggio.

Ancora in un'altra forma di realizzazione della presente invenzione, ilgene NIM1 viene alterato in modo che il prodotto codificato ha una parte troncata C-terminale che si ritiene dia come risultato una stabilità intrinseca aumentata bloccando la fosforilazione costitutiva di residui di serina e treonina nel terminale C del prodotto del gene di tipo selvaggio. Un esempio di una forma di realizzazione preferita di questa forma alterata del gene NIM1 che codifica un prodotto del gene avente una delezione C-terminale, viene presentata nella SEQ ID NO:26. Una forma negativa dominante esemplificativa della proteina NIM1 con una delezione C-terminale viene mostrata nella SEQ ID NO:27. La presente invenzione inoltre comprende forme alterate di alleli di NIM1 in cui la sequenza codificante di un tale allele ibridizza in condizioni rigorose moderate con la sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:26; particolarmente preferite sono le seguenti condizioni: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (X1) a 55°C. In queste forme di realizzazione, gli alleli di NIM1 che ibridizzano con SEQ ID NO:26 nelle condizioni di cui sopra vengono alterati in modo che il prodotto codificato ha una delezione C-terminale che rimuove i residui di serina e treonina.

Ancora in un'altra forma di realizzazione della presente invenzione il gene NIM1 viene alterato in modo che il prodotto codificato ha sia una delezione N-terminale che una parte troncata C-terminale che realizza i vantaggi delle due forme di realizzazione dell'invenzione descritte sopra. Una forma di realizzazione preferita dell'invenzione è una forma alterata della proteina NIM1 che ha una parte troncata N-terminale di amminoacidi corrispondenti approssimativamente alle posizioni degli amminoacidi da 1 a 125 della SEQ ID NO:2 ed una parte troncata C-terminale di amminoacidi che corrispondono approssimativamente alle posizioni degli amminoacidi 522-593 di SEQ ID NO:3.

Un esempio di una forma di realizzazione preferita di questa forma alterata del gene NIM1 che codifica un prodotto del gene avente una delezione sia N-terminale che C-terminale viene presentato nella SEQ ID NO:28. Una forma negativa-dominante esemplificativa della proteina NIM1 con una delezione C-terminale viene mostrata in SEQ ID NO:29. La presente invenzione comprende inoltre forme alterate di alleli di NIM1 in cui la sequenza codificante di un tale allele ibridizza in condizioni moderatamente rigorose alla sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:28; particolarmente preferite sono le seguenti condizioni: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04/ pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (X1) a 55°C. In queste forme di realizzazione, gli alleli di NIM1 che ibridizzano con la SEQ ID NO:28 nelle condizioni di cui sopra vengono alterate in modo che il prodotto codificato abbia una delezione N-terminale che rimuove residui di lisina che possono servire come siti potenziali di ubiquìtinazione oltre alle serine in corrispondenza delle posizioni degli amminoacidi che corrispondono alle posizioni 55 e 59 del prodotto del gene di tipo selvaggio e anche una delezione C-terminale nella quale vengono rimossi i residui di serina e treonina.

Ancora in un'altra forma di realizzazione della presente invenzione, il gene NIM1 viene alterato in modo che il prodotto codificato è costituito essenzialmente soltanto dai settori di anchirina del prodotto del gene di tipo selvaggio. Si preferisce una molecola di DNA isolata, in cui detta forma alterata della proteina NIM1 è costituita essenzialmente da unità ricorrenti di anchirina che corrispondono approssimativamente alle posizioni degli amminoacidi 103-362 della SEQ ID NO:3. Un esempio di una forma di realizzazione preferita di questa forma alterata del gene NIM1, che codifica i settori di anchirina, viene presentato in SEQ ID NO:30. Una forma negativa-dominante esemplificativa della proteina NIM1 costituita essenzialmente soltanto dai settori di anchirina viene mostrata in SEQ ID NO:31. La presente invenzione comprende anche forme alterate di alleli di NIM1, in cui la sequenza codificante di un tale allele ibridizza in condizioni rigorose moderate con la sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:30; particolarmente preferite sono le seguenti condizioni: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaPO4, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (X1) a 55°C. In queste forme di realizzazione, gli alleli di NIM1 che ibridizzano con SEQ ID NO:30 nelle condizioni di cui sopra vengono alterati in modo che il prodotto codificato è costituito essenzialmente dai settori di anchirina del prodotto del gene di tipo selvaggio.

Così la presente invenzione riguarda molecole di DNA che codificano forme alterate del gene NIM1, come quelle descritte sopra e tutte le molecole di DNA che ibridizzano con esse adottando condizioni moderatamente rigorose.

La presente invenzione comprende anche il gene chimerico che contiene un promotore . attivo nelle piante collegato in modo operativo ad una delle forme alterate descritte sopra del gene NIM1, un vettore ricombinante che comprende tale gene chimerico in cui il vettore è in grado di venire stabilmente trasformato in una cellula ospite e anche una cellula ospite trasformata in modo stabile con tale vettore. Preferibilmente la cellula ospite è una pianta, cellule di piante e discendenti di esse per esempio di una delle seguenti colture importanti dal punto di vista agricolo: riso, frumento, orzo, segale, mais, patate, carote, patate dolci, barbabietola da zucchero, fagioli, piselli, cicoria, lattuga, cavolo, cavolfiore, broccoli, rapa, rafano, spinaci, asparagi, cipolle, aglio, melanzana, pepe, sedano, carota, melopopone, zucca, zucchini, cetrioli, mele, pere, cotogne, meloni, prugne, ciliege, pesche, "nectarine", albicocche, fragole, uva, lamponi, more, ananasso, avocado, papaia, mango, banana, soia, tabacco, pomodori, sorgo e canna da zucchero.

La presente invenzione riguarda anche un metodo per conferire un fenotipo CIM ad una pianta trasformando la pianta con un vettore ricombinante che contiene un gene chimerico che di per sè contiene un promotore attivo nelle piante collegato in modo operativo ad una delle forme alterate descritte sopra del gene NIM1 in cui la forma negativa-dominante codificata della proteina NIM1 viene espressa nella pianta trasformata e conferisce alla pianta il fenotipo CIM.

Inoltre la presente invenzione riguarda un metodo per attivare una resistenza acquisita sistemica in una pianta trasformando la pianta con un vettore ricombinante che comprende un gene chimerico che di per sè contiene un promotore attivo in piante collegato in modo operativo ad una delle forme alterate descritte sopra del gene NIM1 in cui la forma negativa-dominante codificata della proteina NIM1 viene espressa nella pianta trasformata e attiva una resistenza acquisita sistemica nella pianta.

Inoltre, la presente invenzione riguarda un metodo per conferire una resistenza alle malattie ad ampio spettro ad una pianta trasformando la pianta con un vettore ricombinante che contiene un gene chimerico che di per sè contiene un promotore attivo nelle piante collegato in modo operativo ad una delle forme alterate descritte sopra del gene NIM1 in cui la forma negativa-dominante codificata della proteina MIMI viene espressa nella pianta trasformata e conferisce alla pianta una resistenza alle malattie ad ampio spettro.

Ancora in un altro aspetto, la presente invenzione riguarda un metodo di screening per un gene NIM1 coinvolto nella cascata di trasduzione del segnale che porta ad una resistenza acquisita sistemica in una pianta, che consiste nell'analizzare una teca genomica oppure una teca di cDNA ottenuta da detta pianta con una sequenza codificante NIM1 che ibridizza nelle seguenti condizioni alla sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:2: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C. Ulteriori oggetti compresi dall'invenzione sono: Una molecola di DNA isolata secondo l'invenzione in cui detta forma alterata della proteina NIM1 presenta alanine invece di serine in posizioni di amminoacidi che corrispondono alle posizioni 55 e 59 di SEQ ID NO:3, in cui detta molecola di DNA ibridizza nelle seguenti condizioni con la sequenza di nucleotidi riportata in SEQ ID NO:22: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C.

Una molecola di DNA isolata secondo l'invenzione in cui detta forma alterata della proteina NIM1 ha una zona troncata N-terminale di amminoacidi corrispondenti approssimativamente alle posizioni degli amminoacidi 1-125 della SEQ ID NO:3, in cui detta molecola di DNA ibridizza nelle seguenti condizioni con la sequenza di nucleotidi riportata in SEQ ID NO:24: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaPO^, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C.

Una molecola di DNA isolata secondo l'invenzione in cui detta forma alterata della proteina NIM1 ha una zona troncata C-terminale di amminoacidi corrispondenti approssimativamente alle posizioni degli amminoacidi 522-593 della SEQ ID NO:3, in cui detta molecola di DNA ibridizza nelle seguenti condizioni con la sequenza di nucleotidi riportata in SEQ ID NO:26: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C.

Una molecola di DNA isolata secondo l'invenzione in cui detta forma alterata della proteina NIM1 è costituita dalla sequenza di amminoacidi mostrata in SEQ ID NO:28, in cui detta molecola di DNA ibridizza nelle seguenti condizioni con la sequenza di nucleotidi riportata in SEQ ID NO:28: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C.

Una molecola di DNA isolata secondo l'invenzione in cui detta forma alterata della proteina NIM1 è costituita essenzialmente da unità ricorrenti di anchirina corrispondenti approssimativamente alle posizioni degli amminoacidi 103-362 della SEQ ID NO:3, in cui detta molecola di DNA ibridizza nelle seguenti condizioni con la sequenza di nucleotidi riportata in SEQ ID NO:30: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C.

Una forma alterata di un gene NINI secondo l’invenzione che è stata costruita mediante mutagenesi .

L'impiego di una molecola di DNA isolata secondo l'invenzione per attivare una resistenza acquisita sistemica in una cellula vegetale, in una pianta e nei suoi discendenti.

L'impiego di una molecola di DNA isolata secondo l'invenzione per conferire una resistenza alle malattie ad ampio spettro ad una cellula vegetale, ad una pianta e a suoi discendenti.

L'impiego di una molecola di DNA isolata secondo l'invenzione per conferire un fenotipo CIM ad una cellula vegetale, ad una pianta e a suoi discendenti.

L'impiego di piante resistenti e di loro discendenti secondo l'invenzione per incorporare nelle linee di piante tramite coltivazione un tratto di resistenza alle malattie.

L'impiego di varianti del gene NIM1 per conferire resistenza alle malattie e attivare l'espressione del gene SAR in piante trasformate con esse.

Un metodo per produrre una forma alterata del gene NIM1 .

Un metodo per produrre discendenti transgenici di una pianta transgenica originaria che comprende una molecola di DNA isolata che codifica una forma alterata di una proteina NIM1 secondo l'invenzione che consiste nel trasformare detta pianta di partenza con una molecola di un vettore ricombinante secondo l'invenzione e trasferire la caratteristica ai discendenti di detta pianta transgenica originaria che comporta tecniche note di coltura di piante.

Un metodo di produzione di una molecola di DNA che comprende una porzione di DNA che contiene una porzione di DNA che codifica una forma alterata di una proteina NIM1, il metodo consistendo

(a) nel preparare una sonda di nucleotidi in grado di ibridizzare in modo specifico con una forma alterata di un gene NIM1 oppure di mRNA in cui detta sonda comprende una porzione contigua della sequenza codificante per una forma alterata di un NIM1 avente una lunghezza di almeno 10 nucleotidi;

(b) nell'analizzare altre forme alterate di una sequenza che codifica NIM1 in popolazioni di frammenti di DNA genomici clonati oppure di frammenti di cDNA provenienti da un organismo scelto impiegando la sonda di nucleotide preparata secondo lo stadio (a); e

(c) nell'isolare e far moltiplicare una molecola di DNA che comprende una porzione di DNA che contiene una porzione di DNA che codifica una forma alterata di una proteina NIM1 .

Un metodo per isolare una molecola di DNA che comprende una porzione di DNA che contiene una forma alterata di una sequenza NIM1, il quale metodo consiste

(a) nel preparare una sonda di nucleotidi in grado di ibridizzare in modo specifico con una forma alterata di un gene NIM1 oppure di mRNA in cui detta sonda comprende una porzione contigua della sequenza codificante per una forma alterata di una proteina NIM1 da una pianta avente una lunghezza di almeno 10 nucleotidi;

(b) nell'analizzare altre forme alterate di sequenze NIM1 in popolazioni di frammenti di DNA genomici clonati oppure di frammenti di cDNA provenienti da un organismo scelto impiegando la sonda di nucleotide preparata secondo lo stadio (a); e

(c) nell'isolare una molecola di DNA che comprende una porzione di DNA che contiene una forma alterata del gene NIM1.

Un metodo per produrre piante transgeniche che esprimono livelli più elevati rispetto al tipo selvaggio del gene NIM1 oppure di loro varianti funzionali e loro mutanti.

Un metodo per produrre piante transgeniche che esprimono livelli più elevati rispetto al tipo selvaggio del gene NIM1 oppure loro varianti funzionali e loro mutanti in cui l'espressione del gene NIM1 corrisponde ad un livello che è di almeno due volte superiore rispetto al livello di espressione del gene NIM1 in piante di tipo selvaggio.

Un metodo per produrre piante transgeniche che esprimono livelli più elevati rispetto al tipo selvaggio del gene NIM1 oppure loro varianti funzionali e loro mutanti in cui l'espressione del gene NIM1 corrisponde ad un livello che è di almeno dieci volte superiore rispetto al livello di espressione del gene NIM1 in piante di tipo selvaggio .

Il Fenotipo Mutante nim

La presente invenzione riguarda piante mutanti e anche geni isolati da esse che sono difettive nella loro normale risposta ad una infezione patogena in quanto essi non esprimono geni associati con SAR. Questi mutanti vengono indicati come mutanti nim (sta per immunità non inducibile) e sono "sensibili alle malattie in modo universale" (UDS) a causa del fatto che sono sensibili a molti ceppi e a molti patotipi di organismi patogeni della pianta ospite e inoltre sono sensibili nei confronti di organismi patogeni che normalmente non infettano la pianta ospite ma che normalmente infettano altri ospiti. Tali mutanti possono venire selezionati trattando semi oppure un altro materiale biologico con agenti mutageni e quindi selezionando le piante discendenti per il fenotipo UDS trattando le piante discendenti con induttori chimici noti (per esempio INA) di SAR e quindi infettando le piante con un patogeno noto. I mutanti non inducibili sviluppano gravi sintomi della malattia in queste circostanze mentre le piante di tipo selvaggio vengono indotte dal composto chimico ad una resistenza acquisita sistemica. I mutanti nim possono venire ugualmente selezionati da popolazioni mutanti generate mediante mutagenesi prodotta da composti chimici e da irradiazione, come anche da popolazioni generate mediante inserimento di T-DNA e mediante mutagenesi indotta da trasposone. Tecniche per generare linee di piante mutanti sono ben note nel settore.

I mutanti nim rappresentano utili indicatori per la valutazione della gravità della malattia in prove di patogenesi in campo dove il fenotipo della resistenza naturale delle piante cosiddette di tipo selvaggio (ossia non mutanti) può variare e pertanto non fornisce uno standard affidabile di sensibilità. Inoltre, le piante nim hanno l’ulteriore utilità per esaminare i transgeni di resistenza alla malattia candidati. Utilizzando una linea nim come ricevente per i transgeni, il contributo del transgene alla resistenza alla malattia è valutabile direttamente su un livello di base di sensibilità. Inoltre le piante nim sono utili come strumenti per comprendere le interazioni tra patogeno e pianta. Le piante ospiti nim non sviluppano una risposta sistemica ad un attacco di organismi patogeni e lo sviluppo non inibito dell'organismo patogeno è un sistema ideale nel quale studiare la sua interazione biologica con L'ospite .

Poiché le piante ospiti nim possono essere sensibili agli agenti patogeni anche al difuori dello spettro di infettività dell'ospite che normalmente essi attaccano, queste piante hanno anche una utilità significativa nello studio molecolare, genetico e biologico di interazioni tra ospite e patogeno. Inoltre il fenotipo UDS di piante nim le rende anche utili per lo screening di fungicidi. Mutanti nim selezionati in un particolare ospite hanno una utilità notevole per lo screening di fungicidi impiegando quell'ospite e gli agenti patogeni dell'ospite. Il vantaggio risiede nel fenotipo UDS del mutante che supera i problemi che si incontrano con ospiti che sono sensibili in modo differenziato a differenti agenti patogeni e a differenti patotipi oppure che sono anche resistenti a certi agenti patogeni e a certi patotipi.

I mutanti nim inoltre hanno utilità per lo screening di fungicidi contro una serie di patogeni e di patotipi impiegando un ospite eterologo, ossia un ospite che normalmente può non essere entro lo spettro di infettività delle specie dell'ospite di un particolare patogeno. Così la sensibilità di mutanti nim di Arabidopsis nei confronti di patogeni di altre specie (per esempio specie di piante da coltura) facilita efficaci procedimenti di screening di fungicidi per composti contro importanti agenti patogeni di piante da coltura.

Il Mutante niml di A rabidopsis thaliana Un mutante di Arabidopsis thaliana denominato niml (noninducible immunity - immunità non inducibile) che sostiene la crescita di P. parasi tica (ossia, l'agente che provoca la malattia della muffa lanuginosa) dopo trattamento con INA viene descritto in Delaney et al., 1995. Sebbene niml possa accumulare SA dopo infezione con l'agente patogeno, non possono venire indotte nè una espressione del gene SAR nè una resistenza alla malattia, e ciò suggerisce che la mutazione blocca il percorso a valle di SA. Il niml viene anche compromesso nella sua capacità di rispondere a INA oppure a BTH, il che suggerisce che il blocco esiste a valle dell'azione di questi composti chimici (Delaney et al., 1995; Lawton et al·., 1996). Questo primo mutante niml di Arabidopsis (qui indicato niml-1) è stato isolato da 80.000 piante di una popolazione di Arabidopsis ecotipo Issilewskija (Ws-0) marcato con T-DNA spruzzando piante dì due settimane con INA 0,33 mM a cui si è fatta seguire l'inoculazione con P. parasi tica (Delaney et al., 1995). Le piante che hanno sostenuto la crescita del fungo dopo trattamento con INA sono state selezionate come mutanti presunti. Sono stati isolati altri cinque mutanti (qui indicati niml 1-2, nim1 -3, nim1 -4, niml -5, e niml -6) da 280.000 piante M2 da una popolazione Ws-0 sottoposta a mutagenesi con etil metansolfonato (EMS).

Per determinare se i mutanti erano dominanti oppure recessivi, le piante Ws-0 sono state usate come donatori di polline per l'incrocio con ciascuno di questi mutanti. Le piante F1 sono state quindi valutate per la loro capacità di sostenerela crescita del fungo dopo trattamento con INA. Come viene mostrato nella Tabella 3 degli Esempi, tutte le piante F1 niml -11 , niml -2,1 niml -3, nim1 4, e niml-6 erano del tipo selvaggio come fenotipo il che sta ad indicare una mutazione recessiva in ciascuna linea. Il niml -5 presentava il fenotipo nim in tutte e 35 le piante F1, il che sta ad indicare che questo particolare mutante è dominante. Per la verifica, si è effettuato un incrocio inverso impiegando niml-5 come donatore di polline per fertilizzare piante Ws-0. In tutti i casi tutte e 18 le piante Fi erano fenotipicamente nim, il che conferma il carattere dominante della mutazione niml-5.

Per determinare se le mutazioni nim1 -2 fino a niml -6 erano alleliche rispetto alla mutazione nim1 -1 caratterizzata in precedenza, si è usato polline ottenuto da niml -1 per fertilizzare le piante nim1 -2 fino a niml -6. Poiché niml -1 portava una resistenza alla canamicina, i discendenti Fi sono stati identificati per mezzo della resistenza all'antibiotico. In tutti i casi, le piante F1 resistenti alla canamicina erano nim, il che sta ad indicare che esse erano tutte alleliche rispetto al mutante niml -1 . Poiché il mutante niml -5 è dominante ed evidentemente omozigote per la mutazione, era necessario effettuare un test di complementazione di niml -1 nella generazione F2. Se niml-1 e nim1 -5 erano allelici, allora ci si sarebbe dovuto aspettare che tutte le piante F2 avessero un fenotipo nim. Altrimenti, ci si sarebbe dovuto aspettare che 13 delle 16 piante F2 avessero un fenotipo nim. Su 94 piante, 88 sostenevano chiaramente la crescita del fungo dopo trattamento con INA. Sei piante hanno presentato un fenotipo associato di macchioline nere sulle foglie che è una reminiscenza di un fenotipo che simula lesioni e hanno sostenuto una scarsa crescita dei funghi dopo trattamento con INA. Poiché niml-5 porta una mutazione a punti nel gene NIM1 (vedi di seguito) si considera che esso è un allele niml .

Per determinare la resistenza relativa dei differenti alleli niml, ciascun mutante è stato analizzato per la crescita di P. parasitica in normali condizioni di crescita e dopo pre-trattamento con SA, con INA oppure con BTH. Come viene mostrato nella Tabella 1, durante una crescita normale nim -1, 1 niml-2, niml-3, niml -4, e niml -6 hanno sostenuto tutti circa la medesima velocità di crescita del fungo che era alquanto maggiore rispetto al controllo WS-0. L’eccezione era costituita dalle piante nim 1-5 in cui la crescita del fungo è stata ritardata di parecchi giorni rispetto sia agli altri mutanti niml che rispetto al controllo Ws-0, però eventualmente tutte le piante niml-5 sono state distrutte dal fungo. Dopo trattamento con SA, i mutanti potevano venire raggruppati in tre classi: nim1-4 e niml-6 presentavano una crescita del' fungo relativamente rapida; piante nim1 -1, nim1 -2, nim1 -3 presentavano una velocità alquanto minore nella crescita del fungo; e la crescita del fungo in piante niml-5 era anche più lenta rispetto a quella dei controlli Ws-0 non trattati. Dopo trattamento o con INA oppure con BTH, sembrava che i mutanti rientrassero nelle tre classi in cui nim1 -4 era il più gravemente compromesso nella sua capacità di limitare la crescita del fungo dopo trattamento chimico; niml -1, niml -2, nim1-3 e niml -6 erano tutti moderatamente compromessi; e niml-5 era soltanto leggermente compromesso. In questi esperimenti, il Ws-0 non sosteneva la crescita del fungo dopo trattamento con INA oppure con BTH. Così, per quel che riguarda l'inibizione della crescita del fungo dopo trattamento chimico, i mutanti rientrano in tre classi, niml -4 essendo il più gravemente compromesso, niml-1, niml-2, niml -3 e niml-6 presentando una inibizione intermedia del fungo e niml-5 aveva una resistenza nei confronti del fungo soltanto leggermente compromessa.

Si è anche utilizzato l'accumulo di PR-1 mRNA come criterio per caratterizzare i differenti alleli niml. RNA è stato estratto da piante 3 giorni dopo trattamento con acqua oppure con una sostanza chimica oppure 14 giorni dopo inoculazione con un fungo compatibile (isolato di P. parasitica Emwa). Il blot su gel di RNA nella Figura 3 mostra che il PR-1 mRNA si è accumulato in livelli elevati dopo trattamento delle piante di tipo selvaggio con SA, INA oppure BTH oppure dopo infezione con P. parasitica. Nelle piante Nim1 -1, nim1 -2, e nim1 -3, l'accumulo di PR-1 mRNA è stato drasticamente ridotto rispetto al tipo selvaggio dopo trattamento chimico. Il PR-1 mRNA è stato anche diminuito dopo infezione con P. parasitica, però vi era ancora un certo accumulo in questi mutanti. Nelle piante niml -4, e nim1 -6, l'accumulo di PR-1 mRNA era diminuito più drasticamente rispetto che in altri alleli dopo trattamento chimico (evidente in esposizioni più lunghe) e quantità significativamente minori di PR-1 mRNA si sono accumulate dopo infezione con P. parasitica, confermando l'ipotesi che questi potrebbero essere alleli niml particolarmente forti. Interessante è il fatto che l'accumulo di PR-1 mRNA era aumentato nel mutante niml -5, però soltanto blandamente indotto dopo trattamento chimico oppure dopo infezione con P. parasitica. In base all'accumulo di PR-1 mRNA e all'infezione da funghi i mutanti rientrano nelle tre classi: alleli fortemente compromessi ( nim1 -4 e nim1-6); alleli moderatamente compromessi ( nim1 -1 , nim1-2, e nim1 -3) ; e un allele debolmente compromesso ( niml -5).

Mappatura a Struttura Fine della Mutazione niml Per determinare la posizione approssimativa nella mappa di NIM1, 74 piante con fenotipo nim F2 ottenute da un incrocio tra niml -1 (Ws-0) e Landsberg erecta (Ler) sono state identificate per la loro sensibilità verso P. parasitica e per la mancanza di accumulo di PR-1 mRNA dopo trattamento con INA. Dopo avere esaminato un certo numero di marcatori del polimorfismo con lunghezza della sequenza semplice (SSLP) (Bell ed Ecker 1994), si è trovato che nim1 è situato circa 8,2 centimorgan (cM) da ngal28 e 8,2 cM da ngalll sul braccio inferiore del cromosoma 1. Nell'analisi successiva, si è trovato che nim1-1 è situato tra ngalll e circa 4 cM dal marcatore SSLP ATHGENEA.

Per la mappatura a struttura fine, 1138 piante nim ottenute da una popolazione F2 derivata da un incrocio tra nim1-1 e LerDP23 sono state identificate in base alla loro capacità di accumulare PR-1 mRNA e in base alla loro capacità di sostenere una crescita del fungo dopo trattamento con INA. Il DNA è stato estratto da queste piante ed è stato valutato per il carattere zigotico sia su ATHGENEA che su ngalll. Come viene mostrato nelle Figure 5A-5D, si sono identificati 93 cromosomi ricombinanti tra ATHGENEA e nim1 che davano una distanza genetica di circa 4,1 cM (93 su 2276), e sono stati identificati 239 cromosomi ricombinanti tra ngalll e nim1, il che sta ad indicare una distanza genetica di circa 10,5 cM (239 su 2276) . Ricombinanti informativi nell’intervallo tra ATHGENEA e ngalll sono stati ulteriormente analizzati utilizzando l'analisi del polimorfismo in base alla lunghezza di frammenti amplificati (AFLP) (Vos et al., 1995).

Inizialmente, 10 marcatori AFLP tra ATHGENEA e ngalll sono stati identificati e questi sono stati usati per costruire una mappa a bassa risoluzione della regione (Figura 5A). I marcatori AFLP W84.2 (1 cM da niml) e W85.1 (0,6 cM da nim1) sono stati usati per isolare cloni di cromosomi artificiali di lievito (YAC) ottenuti dalla teca CIC (per Centre d'Etude du Polymorphisme Humain, INRA e CNRS) (Creusot et al., 1995).Due cloni YAC, CIC12H07 e CIC12F04, sono stati identificati con W84.2 e due cloni YAC, CIC7E03 e CIC10G07 (dati non mostrati) sono stati identificati con il marcatore W85.1. Tuttavia, si è stabilito che vi era una interruzione tra le due serie di cloni YAC fiancheggianti. Da questo punto di vista, cromosomi artificiali batterici (BAC) e cloni PI che si sovrapponevano a CIC12H07 e CIC12F04 sono stati isolati e sono stati mappati, e si sono quindi realizzati tre stadi mobili sequenziali che prolungavano il "contig" BAC/P1 verso NIM1 (Liu et al., 1995; Chio et al., 1995) . In corrispondenza di diverse volte durante lo spostamento, si sono sviluppati nuovi AFLP che erano specifici per cloni BAC oppure PI e questi sono stati usati per determinare se il gene NIM1 era stato incrociato. Si è stabilito che NIM1 era stato incrociato quando si sono isolati i cloni BAC e PI che hanno dato origine ai due marcatori AFLP, L84.6a e L84.8. Il marcatore AFLP, L84.6a trovato sui cloni P1, Pl-18, Pl-17, e Pl-21 hanno identificato tre ricombinanti e L84.8 trovato sui cloni P1, P1-20, P1-22, Pl-23, e P1-24 e i cloni BAC, BAC-04, BAC-05, e BAC-06 hanno identificato un ricombinante. Poiché questi cloni si sovrappongono formando un largo contig (>100 kb), e comprendono marcatori AFLP che fiancheggiano niml, il gene è stato localizzato sul contig. I cloni BAC e P1 che comprendevano il contig sono stati usati per generare otto ulteriori marcatori AFLP, che dimostravano che nim1 era localizzato tra L84.Y1 e L84.8, che rappresenta una interruzione di circa 0,09 cM.

Si è costruita una teca di cosmidi nel vettore cosmide T-DNA compatibile con Agrobacterium , pCLDQ4541 impiegando DNA ottenuto da BAC-06, BAC-04, e P1-18. E' stato sviluppato un contig di cosmide usando marcatori AFLP derivati da questi cloni. La mappatura fisica ha dimostrato che la distanza fisica tra L84.Y1 e L84.8 era maggiore di 90 kb, per cui si è ottenuta una distanza da genetica a fisica approssimativamente di 1 megabase per cM. Per facilitare la successiva identificazione del gene NIM1 , si è determinata la sequenza di DNA di BAC-04.

Isolamento del Gene NIM1

Per identificare quali cosmidi contenevano il gene NIM1, i 12 cosmidi elencati nella Tabella 4 degli Esempi sono stati trasformati in nim1 -1, e i trasformanti sono stati valutati per la loro capacità di complementare il fenotipo mutante. Si è trovato che tutti i cosmidi D5, E1 e D7 compìementavano niml-1, come è stato determinato per mezzo della capacità dei trasformanti di accumulare PR-1 mRNA dopo trattamento con INA. Le estremità di questi cosmidi sono state sequenziate e si è trovato che erano localizzate sulla sequenza del DNA di BAC-04. Vi erano 9.918 coppie di basi nella regione del DNA in comune con D7 e D5 che conteneva il gene NIM1. Come è dimostrato nella Figura 5D, in questa sequenza da 10 kb si sono identificate quattro regioni del gene presunte. La regione 1 poteva codificare potenzialmente una proteina di 19.105 D, la regione 3 poteva codificare una proteina di 44.554 D, e la regione 4 poteva codificare una proteina di 52.797 D. La regione 2 aveva quattro schemi di lettura aperti di differenti dimensioni localizzati vicini tra di loro, il che suggerisce un gene con tre introni. Un'analisi effettuata adottando il programma NetPlantGene (Hebsgaard et al., 1996) ha indicato una elevata probabilità che gli schemi di lettura aperti potessero venire collegati tra di loro per formare uno schema di lettura aperto grande che codifica una proteina da 66.039 D.

Per controllare quale regione del gene contenesse il gene NIM1, blot di gel contenenti RNA isolato da tessuto di foglie di Ws-0 e di differenti mutanti niml dopo trattamento con acqua oppure con composti chimici sono stati analizzati con DNA derivato da ciascuna delle quattro regioni del gene. In questi esperimenti si è avuto cura di marcare le sonde fino ad una attività specifica elevata e le autoradiografie sono state esposte per più di una settimana. Nell'esperienza passata della Richiedente, queste condizioni potrebbero identificare RNA in corrispondenza di concentrazioni di circa una copia per cellula. L'unica regione del gene che ha prodotto RNA rivelabile era la regione 2 del gene. Come viene mostrato nella Figura 7, il mRNA identificato dalla sonda della regione 2 del gene è stato indotto mediante trattamento con BTH di piante di tipo selvaggio, ma non in una qualsiasi delle piante mutanti. Inoltre, l'accumulo di RNA era elevato in tutte le piante dopo infezione con P. parasitica, il che sta ad indicare che questo particolare gene viene indotto dopo infezione con un agente patogeno.

Per stabilire ulteriormente la regione del gene che codifica NIM1, la sequenza del DNA di ciascuna delle quattro regioni del gene è stata determinata per ciascuno degli alleli niml e le si è confrontate con la corrispondente regione del gene di Ws-0. Non sono state messe in evidenza mutazioni tra WS-0 e gli alleli mutanti nelle regioni del gene 3 oppure 4 e si è trovato soltanto un singolo cambiamento nella regione 1 del gene nel mutante niml -6. Tuttavia, si è trovata una mutazione di una singola coppia di basi in ciascuno degli alleli relativi a Ws-0 per la regione 2. La sequenza del DNA della regione 2 del gene viene mostrata nella Figura 6. Come viene mostrato nella Tabella 5 e nella Figura 6, in nim1-1, una singola adenosina è inserita in corrispondenza della posizione 3579 e ciò provoca uno spostamento dello schema che porta come risultato ad un cambiamento in 7 amminoacidi e una delezione di 349 amminoacidi. In niml -2, vi è una transizione citidina in timidina in corrispondenza della posizione 3763 che cambia una istidina in una tirosina. In niml-3, viene cancellata una singola adenosina in corrispondenza della posizione 3301 provocando uno spostamento dello schema che ha alterato 10 amminoacidi e ha cancellato 412 amminoacidi dalla proteina prevista. In modo interessante, sia niml-4 che niml-5 hanno una transizione guanosina in adenosina in corrispondenza della posizione 4160 che cambia una arginina in una lisina e in niml-6 vi è una transizione citosina in timidina che porta come risultato ad un codone di arresto che provoca la delezione di 255 amminoacidi dalla proteina prevista. Sebbene la mutazione in niml -4 e niml -5 alteri il sito di "splice" del donatore consenso per il mRNA, l'analisi RT-PCR indica che questa mutazione non porta ad una alterazione dello "splicing" di mRNA (dati non mostrati).

Omologhi di NIM1

Si è usata la sequenza del DNA della regione 2 del gene in una ricerca Blast (Altschul et al., 1990) e si è identificato un appaiamento esatto con la sequenza tag (EST) T22612 espressa in Arabidopsis e appaiamenti significativi con gli EST del riso S2556, S2861, S3060 e S3481 (vedi Figura 8). Si è usata una sonda di DNA che copre le coppie di basi da 2081 fino a 3266 per analizzare una teca di cDNA di Arabidopsis e si sono isolati 14 cloni che corrispondono alla regione 2 del gene. Dalla sequenza del cDNA, la Richiedente ha potuto confermare la posizione delle zone di delimitazione esone/introne mostrate nella Figura 6. Si è effettuata una rapida amplificazione delle estremità di cDNA mediante una reazione a catena con polimerasi (RACE) impiegando RNA ottenuto da piante Ws-0 trattate con INA e si è determinato che il probabile sito di inizio della trascrizione era il A in corrispondenza della posizione 2588 nella Figura 6.

Impiegando il cDNA di NIM1 come sonda, omologhi di NIM1 di Arabidopsis possono venire identificati e possono venire isolati tramite screening di teche genomiche oppure di teche di cDNA ottenute da differenti piante come le seguenti piante dì coltura, senza essere limitati a queste: riso, frumento, orzo, segale, mais, patate, carote, patate dolci, barbabietola da zucchero, fagioli, piselli, cicoria, lattuga, cavolo, cavolfiore, broccoli, rape, rafano, spinaci, asparagi, cipolle, aglio, melanzane, pepe, sedano, carote, melopopone, zucca, zucchini, cetrioli, mele, pere, cotogne, meloni, susine, ciliegie, pesche, "nectarine", albicocche, fragole, uva, lamponi, more, ananasso, avocado, papaia, mango, banana, soia, tabacco, pomodori, sorgo e canna da zucchero. Tecniche standard per realizzare ciò comprendono uno screening di ibridazione di teche di DNA in piastre (o placche oppure colonie; vedere per esempio Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) e amplificazione mediante PCR impiegando inneschi di oligonucleotidi (vedere per esempio Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications eds., Academic Press (1990)). Gli omologhi identificati vengono introdotti con tecniche di ingegneria genetica nei vettori di espressione elencati di seguito e vengono trasformati nelle colture elencate sopra. Si valutano i trasformanti per la resistenza alle malattie aumentata impiegando i relativi patogeni della pianta da coltura da esaminare.

Per esempio, omologhi di NIM1 nei genomi di cetriolo, pomodoro, tabacco, mais, frumento e orzo sono stati rivelati mediante analisi blot del DNA. DNA genomico è stato isolato da cetrioli, pomodori, tabacco, mais, frumento e orzo, è stato sottoposto a digestione di restrizione con gli enzimi BamHI, HindlII, XbaI, oppure SAII, è stato separato mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,83⁄4 ed è stato trasferito su una membrana di nailon mediante blotting capillare. Dopo reticolazione con UV per fissare il DNA, la membrana è stata ibridizzata in condizioni di bassa rigorosità [(1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio) a 55°C per 18-24 ore] con cDNA di NIM1 di Arabidopsis thaliana 32P-radiomarcato. Dopo ibridazione i blot sono stati lavati in condizioni di bassa rigorosità [6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C; 1XSSC è 0,15 M di NaCl, 15 mM di Na-citrato (pH 7,0) e sono stati esposti ad una pellicola per raggi X per visualizzare bande che corrispondono a NIM1.

Si possono anche usare inoltre i tag di sequenza espressi (EST) identificati con somiglianza per il gene NIM1 come gli EST di riso descritti sopra per isolare omologhi. Gli EST di riso possono essere particolarmente utili per isolare omologhi dì NIM1 da altre piante monocotiledoni.

Gli omologhi possono venire ottenuti anche mediante PCR. In questo metodo, si effettuano confronti tra omologhi noti (per esempio riso e Arabidopsis) . Le regioni con elevata somiglianza di amminoacidi e di DNA oppure con identità vengono quindi usate per produrre inneschi per PCR. Una volta che una regione adatta viene identificata, si preparano inneschi per quella regione con una diversità di sostituzioni nella posizione del codone 3-. La reazione PCR viene effettuata da cDNA oppure da DNA genomico in svariate condizioni standard. Quando è evidente una banda, essa viene clonata e/o sequenziata per determinare se essa è un omologo di NIM1 .

Espressione a Livello Elevato di NIM1 che Conferisce una Resistenza alle Malattie in Piante La presente invenzione riguarda anche la produzione di piante transgeniche che esprimono livelli del gene NIM1 più elevati rispetto al tipo selvaggio oppure riguarda loro varianti funzionali e loro mutanti, e che hanno una resistenza alle malattie ad ampio spettro. In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, l'espressione del gene NIM1 avviene in corrispondenza di un livello che è almeno doppio rispetto al livello di espressione del gene NIM1 in piante di tipo selvaggio e preferibilmente è almeno dieci volte superiore rispetto al livello di espressione delle piante di tipo selvaggio. Una espressione a livello elevato del gene NIM1 simula gli effetti di composti induttori in quanto essa dà origine a piante con un fenotipo di immunità costitutiva (CIM).

Vengono descritti diversi metodi per produrre piante che iperesprimono il gene NIM1 e che pertanto hanno un fenotipo CIM. Un primo metodo consiste nel selezionare piante trasformate che hanno un'espressione a livello elevato di NIM1 e pertanto un fenotipo CIM a causa dell'effetto del sito di inserzione. La Tabella 6 mostra i risultati della analisi di diversi trasformanti per stabilire la resistenza ad una infezione provocata da funghi. Come si può vedere da questa Tabella, un certo numero'di trasformanti ha presentato una crescita del fungo minore rispetto alla crescita normale e parecchi trasformanti non hanno presentato affatto alcuna crescita del fungo visibile. RNA è stato preparato da campioni raccolti ed è stato analizzato come descritto in Delaney et al., 1995. Slot sono stati ibridizzati alla sonda del gene di Arabidopsis PR-1 (Uknes et al., 1992). Tre linee hanno presentano una induzione precoce dell'espressione del gene PR-1 in quanto il PR-1 mRNA era evidente 24 oppure 48 ore dopo il trattamento con il fungo. Queste tre linee hanno presentato inoltre una resistenza nei confronti dell'infezione del fungo.

Inoltre, vengono descritti metodi per costruire vettori di trasformazione delle piante che comprendono un promotore costitutivo attivo sulle piante, come il promotore CaMV 35S, collegato in modo operativo ad una regione codificante che codifica una proteina NIM1 attiva. Elevati livelli della proteina NIM1 attiva producono il medesimo effetto di resistenza alla malattia di una induzione chimica con sostanze chimiche inducenti come BTH, INA, e SA.

Il Gene NIM1 è un Omologo di ΙκΒα Il gene NIM1 è un componente fondamentale del percorso della resistenza acquisita sistemica (SAR) in piante (Ryals et al., 1996). Il gene NIM1 è associato con l'attivazione di SAR mediante induttori chimici e biologici e insieme con tali induttori è necessario per la SAR e per l'espressione del gene SAR. La localizzazione del gene NIM1 è stata determinata mediante analisi di biologia molecolare del genoma di piante mutanti note per il fatto che portano il gene nim1 mutante che realizza la estrema sensibilità delle piante ospiti ad una grande varietà di agenti patogeni e le rende incapaci di rispondere agli agenti patogeni e agli induttori chimici di SAR.

Il gene NIM1 di tipo selvaggio di Arabidopsis è stato mappato e sequenziato (SEQ ID N0:2). Il prodotto del gene NIM1 di tipo selvaggio (SEQ ID NO:3) è coinvolto nella cascata di trasduzione del segnale che porta alla SAR e alla resistenza alla malattia gene per gene in Arabidopsis (Ryals et al., 1997). Una iperespressione ricombinante della forma di tipo selvaggio di NIM1 dà origine a piante con un fenotipo di immunità costitutiva (CIM) e quindi conferisce resistenza alle malattie in piante transgeniche. Livelli aumentati della proteina MIMI attiva producono il medesimo effetto di resistenza alla malattia della induzione chimica con sostanze chimiche inducenti come BTH, INA, e SA.

La sequenza del gene MIMI (SEQ ID N0:2) è stata usata in ricerche BLAST, e si sono identificati appaiamenti in base ad una omologia di un settore piuttosto altamente conservato nella sequenza del gene MIMI con settori di anchirina trovati in un certo numero di proteine come spettrine, anchirine, NF-κΒ e IKB (Michaely e Bennett, Trends Celi Biol . 2, 127-129 (1992)). Oltre alla unità ricorrente di anchirina, tuttavia, l'analisi al computer convenzionale non ha messo in evidenza altre forti omologie, ivi compresa una omologia con ΙκΒα.

Nonostante gli errori dei programmi del computer, si sono effettuate ispezioni visive in doppio tra la proteina NIM1 (SEQ ID NO:3) e 70 proteine contenenti anchirina note e si sono trovate strette somiglianze con membri della classe ΙκΒα di regolatori della trascrizione (Baeuerle e Baltimore 1996/ Baldwin 1996) . Come viene mostrato nella Figura 9, la proteina NIM1 (SEQ ID NO:3) ha in comune una omologia significativa con proteine ΙκΒα provenienti da topi, ratti e maiali (SEQ ID NI: 18, 19, e 20, rispettivamente).

NIM1 contiene parecchi settori strutturali importanti di ΙκΒα attraverso l'intera lunghezza della proteina, che comprendono settori di anchirina (indicata con una sottovalutazione tratteggiata nella Figura 9), due serine ammino-terminali (amminoacidi 55 e 59 di NIM1 ) , una coppia di lisine (amminoacidi 99 e 100 in NIM1) e un terminale C acido. In totale, MIMI e ΙκΒα hanno in comune una identità in corrispondenza del 30% dei residui e sostituzioni conservative in corrispondenza del 50% dei residui. Così vi è una omologia tra IKBCC e NIM1 attraverso le proteine, con una somiglianza globale di 80%.

Un modo in cui la proteina ΙκΒα funziona nella trasduzione del segnale consiste nel collegarsi al fattore di trascrizione citosolico NF-κΒ e impedire che esso entri nel nucleo e alteri la trascrizione di geni bersaglio (Baeuerle e Baltimore, 1996; Baldwin, 1996) . I geni bersaglio di NF-κΒ regolano (attivano oppure inibiscono) diversi procedimenti cellulari, ivi comprese risposte antivirali, antimicrobiche e risposte di distruzione di cellule (Baeuerle e Baltimore, 1996). Quando viene attivato il percorso di trasduzione del segnale, ΙκΒα viene fosforilato in corrispondenza di due residui di serìna (amminoacidi 32 e 36 di ΙκΒα. di topo). Ciò programma una ubiquitinazione in corrispondenza di una lisina doppia (amminoacidi 21 e 22 di ΙκΒα di topo). Dopo ubiquitinazione, il complesso NF-κΒ/ΙκΒ viene fatto passare attraverso il proteosoma in cui ΙκΒα viene degradato e NF-κΒ viene liberato nel nucleo.

I residui di serina fosforilati importanti nella funzione di ΙκΒα vengono conservati in NIM1 all'interno di un grande blocco contiguo di sequenza conservata dagli amminoacidi 35 fino a 84 (Figura 9). Contrariamente a ΙκΒα, in cui la doppia lisina è situata circa 15 amminoacidi verso il terminale N della proteina, in NIM1 una doppia lisina è situata in corrispondenza di circa 40 amminoacidi verso l'estremità terminale C. Inoltre, esiste un elevato grado di omologia tra NIM1 e IKBGC nella regione carbossi-terminale ricca in serina/treonina che come si è dimostrato è importante nella velocità di turnover basale (Sun et al., Mol . Celi . Biol . 16, 1058-1065 (1996)). Secondo la presente invenzione che si basa sull'analisi di una omologia strutturale e sulla base della presenza di elementi noti per essere importanti per la funzione ΙκΒα, si prevede che NIM1 funzioni come ΙκΒα avendo effetti analoghi sulla regolazione dei geni delle piante.

Le piante che contengono il gene NIM1 di tipo selvaggio quando vengono trattate con sostanze chimiche induttrici si prevede che abbiano una maggiore quantità del prodotto del gene NIM1 (omologo di IKB) oppure abbiano una minore fosforilazione del prodotto del gene NIM1 (omologo di ΙκΒ). Secondo questo modello, il risultato consiste nel fatto che l’omologo di NF-κΒ di piante viene tenuto fuori dal nucleo e si lascia che avvengano l'espressione del gene SAR e le risposte di resistenza. Nelle piante mutanti nim1 è presente un prodotto del gene NIM1 non funzionale. Pertanto secondo questo modello l'omologo di NF-κΒ è libero di andare verso il nucleo e di reprimere la resistenza e l'espressione del gene SAR.

In conformità con questa idea, cellule animali trattate con acido salicilico presentano una stabilità aumentata/una quantità abbondante di IKB e una diminuzione di NF-κΒ attivo nel nucleo (Kopp e Ghosh, 1994). Sono note mutazioni di IKB che agiscono come super-repressori o come negativi-dominanti (Britta-Mareen Traenckner et al., EMBO 14: 2876-2883 (1985); Brown et al.; Science 267: 1485-1488 (1996); Brockman et al., Molecular and Cellular Biology 15: 2809-2818 (1995); Wang et al., Science 274: 784-787 (1996)). Queste forme mutanti di IKB si legano a NF-κΒ, però non vengono fosforilate oppure ubiquitinate e pertanto non vengono degradate. NF-KB rimane legato a IKB e non può muoversi nel nucleo.

Forme Alterate del Gene NIM1 Tenendo conto di quanto detto sopra, la presente invenzione comprende forme alterate di NIM1 che agiscono come regolatori negativi-dominanti del percorso di trasduzione del segnale SAR. Piante trasformate con queste forme negative-dominanti di NIM1 hanno il fenotipo opposto rispetto alle piante mutanti niml in quanto le piante trasformate con forme alterate di NIM1 presentano una espressione del gene SAR costitutiva e pertanto un fenotipo CIH. A causa della posizione il gene NIM1 sostiene il percorso di trasduzione del segnale SAJR, ci si aspetta che un certo numero di alterazioni apportate al gene, oltre a quelle descritte qui in modo specifico, darà come risultato una espressione costitutiva di geni SAR e pertanto un fenotipo CIM.

Una fosforilazione di residui di serina in ΙκΒα umano è necessaria per una degradazione attivata da uno stimolo di ΙκΒα attivando così NF-κΒ. Una mutagenesi dei residui di serina (S32 e S36) in IKBOC umano in resìdui di alanina inibisce la fosforilazione indotta da uno stimolo, bloccando così una degradazione mediata da proteosomi di ΙκΒα (Traenckner et al., 1995; Brown et al., 1996; Brockman et al., 1995; Wang et al, 1996). Questa forma alterata di ΙκΒα. può funzionare come forma negativa-dominante per trattenere NF-κΒ nel citoplasma bloccando così eventi di segnalazione a valle. Sulla base di un confronto delle sequenze di amminoacidi tra NIM1 e IKB mostrato nella Figura 9, le serine 55 (S55) e 59 (559) in NIM1 (SEQ ID NO:3) sono omologhe a S32 e S36 in ΙκΒα, umano. Per costruire forme negative-dominanti di NIM1, le serine in corrispondenza delle posizioni degli amminoacidi 55 e 59 vengono trasformate mediante mutagenesi in residui di alanina. Così in una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, il gene NIM1 viene alterato in modo che il prodotto codificato presenta alenine invece di serine nelle posizioni degli amminoacidi corrispondenti alle posizioni 55 e 59 della sequenza di amminoacidi NIM1 di Arabidopsis . La presente invenzione comprende inoltre piante transgeniche resistenti alle malattie trasformate con una tale forma alterata del gene NIM1 e anche metodi per usare questa forma alterata del gene NIM1 per conferire una resistenza alle malattie e attivare una espressione del gene SAR in piante trasformate con esso.

La delezione degli amminoacidi 1-36 (Brockman et al., 1995; Sun et al., 1996) oppure 1-72 (Sun et al., 1996) di IkBa umano che comprende una ubiquinazione dei residui di lisina K21 e K22 e anche una fosforilazione dei siti S32 e S36, porta come risultato ad un fenotipo IkBa negativo-dominante in colture di cellule umane transinfettate.Una delezione N-terminale dei primi 125 amminoacidi del prodotto del gene NIM1 rimuoverà otto residui di lisina che potrebbero servire come siti di ubiquinazione e anche siti di fosforilazione presunti in corrispondenza di S55 e S59 come indicato sopra. Così, in una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, il gene NIM1 viene alterato in modo che il prodotto codificato è mancante di circa i primi 125 amminoacidi in confronto alla sequenza di amminoacidi NIM1 naturale di Arabidopsis . La presente invenzione comprende inoltre piante transgeniche resistenti alle malattie con una tale forma alterata del gene NIM1 e anche metodi per usare questa forma alterata del gene NIM1 per conferire una resistenza alle malattie e una espressione del gene SAR attivata in piante trasformate con esso.

Una delezione degli amminoacidi 261-317 di IkBa umano può portare come risultato ad una stabilità intrinseca aumentata mediante bloccaggio della fosforilazione costitutiva di residui di serina e treonina nel terminale C. Si prevede che questa forma alterata di ΙκΒα funzioni come una forma negativadominante. Una regione ricca in serina e treonina è presente negli amminoacidi 522-593 in corrispondenza del terminale C di NIM1.. Così in una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, il gene NIM1 viene alterato in modo che il prodotto codificato sia mancante approssimativamente della sua porzione C-terminale che comprende gli amminoacidi 522-593 in confronto alla sequenza di amminoacidi di NIM1 naturale di Arabidopsis. La presente invenzione comprende inoltre piante transgeniche resistenti alla malattia trasformate con una tale forma alterata del gene NIM1 e anche metodi per utilizzare questa forma alterata del gene NIM1 per conferire una resistenza alle malattie e per attivare una espressione del gene SAR in piante trasformate con esso.

In un’altra forma di realizzazione della presente invenzione, vengono prodotte forme alterate del prodotto del gene NIM1 come risultato di delezioni dei segmenti C-terminali e N-terminali oppure come risultato di chimere. In un'altra forma di realizzazione della presente invenzione, vengono messi a disposizione costrutti che comprendono i settori di anchirina provenienti dal gene NIM1. La presente invenzione comprende piante transgeniche resistenti alle malattie trasformate con tali chimere di NIM1 oppure costrutti di anchirina e riguarda anche metodi per usare queste varianti del gene NIM1 per conferire resistenza alle malattie e per attivare l'espressione del gene SAR in piante trasformate con esso.

La presente invenzione riguarda molecole di DNA che codificano forme alterate del gene MIMI come quelle descritte sopra, vettori di espressione che contengono tali molecole di DNA e piante e cellule vegetali trasformate con essi. L'invenzione riguarda inoltre metodi di attivazione di SAR in piante e metodi per conferire alle piante un fenotipo CIM e una resistenza alle malattie a spettro ampio trasformando le piante con molecole di DNA che codificano forme alterate del prodotto del gene NIM1. La presente invenzione comprende inoltre piante trasformate con una forma alterata del gene NIM1 .

Resistenza alle Malattie

La iperespressione del gene NIMl di tipo selvaggio in piante e l'espressione delle forme alterate del gene NIMl in piante porta come risultato ad una immunità verso un ampio gruppo di agenti patogeni delle piante che comprendono, senza che si abbia una limitazione, virus oppure viroidi, per esempio il virus del mosaico del tabacco oppure dei cetrioli, il virus delle macchie ad anello o virus della necrosi, il virus che provoca l'arricciamento delle foglie di pelargonio, il virus delle striature del trifoglio rosso, il virus dell'arresto della crescita cespugliosa di pomodori e virus simili; funghi, per esempio Phythophthora pazasitica e Peronospora tabacina; batteri, per esempio Pseudomonas syringae e Pseudomonas tabaci; insetti come afidi, per esempio Myzus persicae; e lepidotteri, per esempio Heliothus spp.; e nematodi, per esempio Meloidcgyne incogni ta . I vettori e i metodi dell'invenzione sono utili contro numerosi organismi che provocano malattie che comprendono senza alcuna limitazione, le muffe lanuginose come Scleropthora macrospora, Sclerophthora rayissiae, Sclerospora graminicola ; Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora sacchari e Peronosclerospora maydis; ruggini come Pucci nia sorphi, Pucci ni a polysora e Physopella zeae; altri funghi come Cercospora zeae-maydis, Colletotrichum graminicola, Fusarium monoliforme, Gibherella zeae, Exserohilum turcicum, Kabatiellu zeae, Erysiphe graminis, Septoria e Bipolaris maydis ; e batteri come Erwinia stewartii .

I metodi della presente invenzione possono venire utilizzati per conferire resistenza alle malattie ad una grande varietà di piante, ivi comprese gimnosperme, monocotiledoni e dicotiledoni. Sebbene la resistenza alle malattie possa venire conferita a qualsiasi pianta che rientra entro queste ampie classi, è particolarmente-utile in piante di coltura importanti dal punto di vista agricolo, come riso, frumento, orzo, segale, mais, patate, carote, patate dolci, barbabietola da zucchero, fagioli, piselli, cicoria, lattuga, cavolo, cavolfiore, broccoli, rape, rafano, spinaci, asparagi, cipolle, aglio, melanzane, pepe, sedano, carote, melopopone, zucca, zucchini, cetrioli, mele, pere, cotogne, meloni, susine, ciliegie, pesche, "nectarine", albicocche, fragole, uva, lamponi, more, ananasso, avocado, papaia, mango, banana, soia, tabacco, pomodori, sorgo e canna da zucchero. Le cellule trasformate possono venire rigenerate in piante intere in modo tale che il gene conferisce resistenza alla malattia alle piante transgeniche intatte. Il sistema di espressione può venire modificato in modo che il gene della resistenza alle malattie venga espresso in modo continuo o in modo costitutivo.

Tecnologia del DNA Ricombinante La molecola del DNA NIM1 oppure frammento del gene NIM1 che conferisce resistenza alle malattie a piante consentendo la induzione di un’espressione del gene SAR oppure della forma alterata del gene NIM1 che conferisce resistenza alle malattie alle piante aumentando l'espressione del gene SAR può venire incorporata in cellule vegetali oppure in cellule batteriche adottando la tecnologia del DNA ricombinante convenzionale. In generale, questa comporta l’inserimento della molecola del DNA compresa entro la SEQ ID N0:1 oppure una sua variante funzionale oppure una molecola che codifica una delle forme alterate di NIM1 descritte sopra in un sistema di espressione rispetto al quale la molecola del DNA è eterologa {ossia normalmente non è presente). La molecola del DNA eterologa viene inserita nel sistema di espressione o vettore in opportuno orientamento e in uno schema di lettura corretto. Il vettore contiene gli elementi necessari per la trascrizione e per la traduzione delle sequenze che codificano la proteina inserite. Si possono usare numerosi sistemi vettori noti nel settore, come plasmidi, virus di batteriofagi e altri virus modificati. Adatti vettori comprendono senza alcuna limitazione, vettori virali come i sistemi di vettori lambda Xgtll, XgtlO e Charon 4; vettori plasmidi come

altri sistemi simili. La sequenza che codifica NIM1 e le sequenze alterate che codificano NIM1 qui descritte possono venire clonate nel vettore adottando procedimenti di clonazione standard nel settore come descritti da Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).

Allo scopo di ottenere una efficace espressione del gene oppure del frammento del gene della presente invenzione, nel vettore di espressione deve essere presente un promotore che darà come risultato un sifficiente livello di espressione o sufficiente espressione costitutiva. La RNA-polimerasi normalmente si lega al promotore e fa iniziare la trascrizione di un gene. I promotori hanno una loro intensità variabile, ossia la capacità di promuovere la trascrizione. A seconda del sistema di cellule ospiti utilizzato, si può usare uno qualsiasi di numerosi promotori adatti. I componenti della cassetta di espressione possono venire modificati per fare aumentare l'espressione. Per esempio, si possono utilizzare sequenze troncate, sostituzioni di nucleotidi oppure altre modificazioni. Le cellule vegetali trasformate con tali sistemi di espressione modificati allora presentano una iperespressione o espressione costitutiva dei geni necessari per l'attivazione di SAR.

A. Costruzione di Vettori di Trasformazione delle Piante

Per la trasformazione delle piante sono disponibili numerosi vettori di trasformazione e i geni di questa invenzione possono venire usati insieme con tali vettori. La scelta del vettore dipenderà dalla tecnica di trasformazione preferita e dalla specie bersaglio per la trasformazione. Per certe specie bersaglio, si possono preferire differenti marcatori di selezione costituiti da antibiotici oppure erbicidi. I marcatori di selezione usati in modo routinario nella trasformazione comprendono il gene nptll che conferisce resistenza alla canamicina e ad antibiotici correlati (Hessing & Vierra, Gene _19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304 : 184-187 (1983)), il gene bar, che conferisce resistenza all'erbicida, fosfinotricina (White et al., Nucl. Acids Res 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appi. Genet. 79 625-631 (1990)), il gene hph, che conferisce resistenza all'antibiotico igromicina (Biochinger &. Diggelmann, Mol. Celi. Biol. 4/. 2929-2931), e il gene dhfr, che conferisce resistenza al metatrexato (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)), e il gene EPSPS, che conferisce resistenza al glifosato (Brevetti U.S.Ni.4.940.935 e 5.188.642).

1. Vettori Adatti per la Trasformazione di Agrobacterium

Per la trasformazione in cui si usa Agrobacterium tumefaciens sono disponibili molti vettori. Questi tipicamente portano almeno una sequenza di delimitazione T-DNA e comprendono vettori come pBINl9 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)) e pXYZ. Di seguito, viene descritta la costruzione di due vettori tipici.

I vettori binari pCIB200 e pCIB2001 che vengono usati per la costruzione di vettori ricombinanti da usare con Agrobacterium vengono costruiti nel modo seguente. pTJS75kan viene creato mediante digestione con Nari di pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164: 446-455 (1985)) consentendo una recisione del gene della resistenza alla tetraciclina a cui si fa seguire l'inserimento di un frammento Acci proveniente da pUC4K che porta un NPTII (Messing & Vierra, Gene 19_: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology _14: 266-276 (1990)). I linker Xhol vengono legati al frammento EcoRV di PCIB7 che contiene i margini T-DNA sinistro e destro, un gene chimerico- nos/nptll selezionabile per le piante e il polilinker pUC (Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)), e il frammento sottoposto a digestione con Xhol viene clonato in pTJS75kan sottoposto a digestione con SalI per creare -pCIB200 (vedere anche EP 0.332.104, esempio 19). Il pCIB200 contiene i seguenti siti di restrizione del polilinker unici:

polilinker di ulteriori siti di restrizione. I siti di restrizione unici nel polilinker di pCIB2001 sono

siti di restrizione unici contiene anche una selezione della canamicina vegetale e batterica, bordi di T-DNA sinistro e destro per una trasformazione mediata da Agrobacterium, la funzione trfA derivata da RK2 per la mobilizzazione tra E. coli e altri ospiti, e le funzioni OriT e OriV anch'esse provenienti da RK2. Il polilinker di pCIB2001 è adatto per la clonazione di cassette di espressione di piante contenenti i loro propri segnali regolatori.

b. e suoi Derivati di Selezione per la

Igromicina:

Il vettore binario pCIBlO contiene un gene che codifica la resistenza alla canamicina per la selezione in piante e sequenze limite destra e sinistra di T-DNA e contiene incorporate sequenze provenienti dal plasmide ad ampio spettro di infettività pRK252 che consente che esso si replichi sia in E. coli che in Agrobacterium. La sua costruzione viene descritta in Rothstein et al. (Gene 53: 153-161 (1987)). Si costruiscono diversi derivati di pCIB10 che contengono incorporato il gene per la igromicina B fosfotransferasi descritto da Gritz et al. (Gene 25: 179-188 (1983)). Questi derivati consentono la selezione di cellule di piante transgeniche soltanto su igromicina (pCIB743), oppure su igromicina e canamicina (pCIB715, pCIB717).

2. Vettori Adatti per la Trasformazione non in Agrobacterium

La trasformazione senza l'impiego di Agrobacterium tumefaciens supera la necessità di sequenze di T-DNA nel vettore di trasformazione scelto e di conseguenza si possono utilizzare vettori mancanti di queste sequenze oltre ai vettori come quelli descritti sopra che contengono le sequenze T-DNA. Tecniche di trasformazione che non si basano su Agrobacterium comprendono una trasformazione tramite bombardamento di particelle, assorbimento dì protoplasti (per esempio PEG ed elettroporazione) e microiniezione. La scelta del vettore dipende ampiamente dalla selezione preferita per la specie che viene trasformata.

a. pCIB3064:

pCIB3064 è un vettore derivato da pUC adatto per tecniche di trasferimento diretto del gene in combinazione con la selezione mediante l'erbicida basta (oppure fosfinotricina). Il plasmide pCIB246 comprende il promotore CaMV 35S in fusione operativa con il gene GUS di E. coli e il terminatore della trascrizione CaMV 35S e viene descritto nella domanda pubblicata PCT WO 93/07278. Il promotore 35S di questo vettore contiene due sequenze 5' ATG del sito di inizio. Questi siti vengono mutati adottando tecniche di PCR standard in modo tale da rimuovere i ATG e generare i siti di restrizione SspI e PvuII. I nuovi siti di restrizione sono 96 e 37 bp distanti dal sito Sali unico e 101 e 42 bp distanti dal sito di inizio effettivo. Il derivato che si ottiene di pCIB246 viene indicato pCIB3025. Il gene GUS viene quindi reciso da pCIB3025 mediante digestione con Sali e Sacl, i terminali vengono resi piatti e vengono di nuovo legati per generare il plasmide pCIB3060. Si ottiene il plasmide pJIT82 dal John Innes Centre, Norwich e il frammento Smal da 400 bp che contiene il gene bar proveniente da Streptomyces viridochromogenes viene reciso e viene inserito nel sito Hpal di pCIB3060 (Thompson et al., EMBO J: 6: 2519-2523 (1987)). Questo ha generato pCIB3064, che comprende il gene bar sotto il controllo del promotore e del terminatore CaMV 35S per la selezione sull'erbicida, un gene per la resistenza alla ampicillina (per la selezione in E. coli) e un polilinker con i siti unici Sphl, PstI, HindlII, e BamHI. Questo vettore è adatto per la clonazione di cassette di espressione di piante che contengono i loro propri segnali regolatori.

b. pS0G19 e pSOG35:

pSOG35 è un vettore di trasformazione che utilizza la diidrofolato reduttasi (DFR) del gene di E. coli come marcatore selezionabile che conferisce resistenza al metotrexato. Si adotta la PCR per amplificare il promotore 35S (-800 bp), l'introne 6 ottenuto dal gene Adhl del mais (-550 bp) e 18 bp della sequenza leader non traslata GUS ottenuta da pSOGlO. Un frammento da 250 bp che codifica il gene della diidrofolato reduttasi di tipo II di E. coli viene anch'esso amplificato mediante PCR e questi due frammenti di PCR vengono riuniti con un frammento SacI-PstI ottenuto da pB1221 (Clontech) che contiene lo scheletro del vettore pUC19 e il terminatore della nopalina sintasi. La riunione di questi frammenti genera pSOG19 che contiene il promotore 35S in fusione con la sequenza dell'introne 6, il leader GUS, il. gene DHFR e il terminatore della nopalina sintasi. La sostituzione del leader GUS in pSOG19 con la sequenza leader derivata dal virus della muffa clorotica del mais (MCMV) genera il vettore pSOG35. pSOG19 e pSOG35 portano il gene pUC per la resistenza alla ampicillina e hanno i siti HindlII, Sphl, PstI ed EcoRI disponibili per la clonazione di sostanze estranee .

B. Requisiti per la Costruzione di Cassette di Espressione di Piante

Le sequenze dei geni destinate per l'espressione in piante transgeniche vengono dapprima riunite in cassette di espressione dietro un adatto promotore del livello di espressione elevato e a monte di un adatto terminatore della trascrizione. Queste cassette di espressione possono quindi venire facilmente trasferite nei vettori di trasformazione delle piante descritti sopra.

1. Selezione del Promotore

La selezione del promotore usato in cassette di espressione determinerà il modello di espressione spaziale e temporale deltransgene nella pianta transgenica. Promotori selezionati esprimeranno transgeni in tipi specifici di cellule (come cellule epidermiche delle foglie, cellule del mesofillo, cellule della corteccia delle radici) oppure in tessuti oppure organici specifici (per esempio radici, foglie o fiori) e la selezione rifletterà la posizione desiderata di accumulo del prodotto del gene NIM1 oppure del prodotto del gene NIM1 alterato. Come alternativa, il promotore selezionato può dirigere una espressione del gene sotto un promotore indotto dalla luce oppure un altro promotore regolato nel tempo.

a. Espressione Costitutiva, il Promotore CaMV 35S :

La costruzione del plasmide pCGN1761 viene descritta nella domanda di brevetto pubblicata EP 0.392.225 (esempio 23) che viene qui incorporata come riferimento. Il pCGN1761 contiene il "doppio" promotore 35S e il terminatore della trascrizione tml con un sito EcoRI unico tra il promotore e il terminatore e ha uno scheletro di tipo pUC. Si costruisce un derivato di pCGN17 61 che ha un polilinker modificato che comprende i siti Noti e Xhol oltre al sito esistente EcoRI. Questo derivato viene denominato pCGN1761ENX. pCGN1761ENX è utile per la clonazione di sequenze di cDNA oppure di sequenze del gene (che comprendono sequenze ORF microbiche) all'interno del suo polilinker per la loro espressione sotto il controllo del promotore 35S in piante transgeniche. L'intera cassetta promotore 35S-sequenza del gene-terminatore tml di una tale costruzione può venire recisa mediante i siti

terminatore per trasferire i vettori di trasformazione come quelli descritti sopra. Inoltre il frammento del doppio promotore 35S può venire rimosso mediante recisione in 5' con HindlII, Sphl, Sali, XbaI, oppure PstI, e mediante recisione in 3' con uno qualsiasi dei siti di restrizione del polilinker ( EcoRI , Noti, oppure Xhol) per la sostituzione con un altro promotore.

b. Modificazione di per Rendere Ottimale il Sito di Inizio della Traduzione: Per una qualsiasi delle costruzioni qui descritte, si possono effettuare modifiche intorno ai siti di clonazione mediante introduzione di sequenze che possono aumentare la traduzione. Ciò è particolarmente utile quando si desidera una iperespressione.

p viene scisso con Sphl, viene

trattato con T4 DNA-polimerasi e viene di nuovo sottoposto a legatura distruggendo così il sito Sphl situato in 5' rispetto al doppio promotore 35S. Ciò genera il vettore

viene scisso con EcoRI e viene collegato ad un adattatore molecolare riassociato della sequenza 5'-

(SEQ ID NI: 12 e 13). Ciò genera il vettore pCGNSENX, che contiene incorporata la sequenza di inizio della traduzione nella pianta quasi ottimizzata TAAA-C adiacente all'ATG che di per sè è parte di un sito Sphl che è adatto per la clonazione di geni eterologhi in corrispondenza della loro metionina di inizio. A valle del sito Sphl, vengono conservati i siti EcoRI, Noti, e Xhol.

Si costruisce un vettore alternativo che utilizza un sito Ncol in corrispondenza dell'ATG di inizio. Questo vettore denominato pCGN1761NENX viene prodotto inserendo un adattatore molecolare riassociato della sequenza 5

in corrispondenza del sito EcoRI di Così il vettore comprende la sequenza quasi ottimizzata TAAACC adiacente all'ATG di inizio che si trova entro il sito Ncol. I siti a valle sono EcoRI, Noti, e Xhol. Prima di questa manipolazione tuttavia i due siti Ncol nel vettore pCGN1761ENX (nelle posizioni a monte della unità del promotore 35S-5') vengono distrutte utilizzando tecniche simili a quelle descritte sopra per Sphl oppure in alternativa adottando una PCR "interno-esterno". Innes et al., PCR Protocols: A guide to Methods and applications. Academic Press, New York (1990). Questa manipolazione può venire valutata per un qualsiasi effetto dannoso possibile sulla espressione inserendo cDNA di qualsiasi pianta oppure una sequenza del gene reporter nel sito di clonazione a cui si fa seguire una analisi di espressione routinaria in piante.

c. Espressione Sotto il Controllo di un Promotore Regolabile Chimicamente/Mediante Patogeno :

Il doppio promotore 35S in pCGN1761ENX può venire sostituito con qualsiasi altro promotore scelto che dia come risultato livelli di espressione opportunamente elevati. A scopo di esempio, un promotore PR-1 chimicamente regolato che viene descritto nel Brevetto U.S. No. 5.614.395, che viene qui incorporato come riferimento nella sua interezza, può sostituire il doppio promotore 35S. Il promotore scelto preferibilmente viene reciso dalla sua origine con enzimi di restrizione, però in alternativa può venire amplificato mediante PCR usando inneschi che portano opportuni siti di restrizione terminali. Se si deve effettuare l'amplificazione mediante PCR, allora il promotore deve venire di nuovo sequenziato per controllare errori di amplificazione dopo la clonazione del promotore amplificato nel vettore bersaglio. Il promotore PR-la del tabacco regolabile chimicamente oppure con un agente patogeno viene scisso dal plasmide pCIB1004 (vedere EP 0.332.104, esempio 21 per la costruzione, il quale brevetto viene qui incorporato come riferimento) e viene trasferito nel plasmide pCGN176lENX (Uknes et al., 1992). Il pCIB1004 viene scisso con Ncol e la ipersporgenza 3' che si ottiene del frammento linearizzato viene resa piatta mediante trattamento con T4 DNA-polimerasi. Il frammento viene quindi scisso con HindlII e il frammento contenente il promotore PR-la che si ottiene viene purificato su gel e viene clonato in pCGN1761ENX dal quale è stato rimosso il doppio promotore 35S. Ciò viene effettuato mediante scissione con Xhol e mediante appiattimento con T4 polimerasi a cui si fa seguire una scissione con HindIII e isolamento del frammento contenente il terminatore-vettore più grande nel quale viene clonato il frammento del promotore pCIB1004. Ciò genera un derivato di pCGN1761ENX con il promotore PR-la e con il terminatore t mi e un polilinker intermedio con siti unici EcoRI e Noti. I geni NIM1 selezionati possono venire inseriti in questo vettore e i prodotti di fusione (ossia promotore-geneterminatore) possono venire successivamente trasferiti in qualsiasi vettore di trasformazione scelto, ivi compresi quelli descritti in questa domanda di brevetto.

Si possono impiegare diversi regolatori chimici per indurre una espressione della sequenza che codifica NIM1 nelle piante trasformate secondo l'invenzione. Nel contesto della presente invenzione, "regolatori chimici" comprendono sostanze chimiche note per essere induttori per il promotore PR-1 in piante oppure loro derivati simili. Un gruppo preferito di regolatori per il promotore PR-1 si basa sulla struttura del benzo-1,2,3-tiadiazolo (BTH) e comprende, senza limitazione, i seguenti tipi di composti: acido benzo-1,2, 3-tiadiazolcarbossilico, acido benzo-1,2, 3-tiadiazoltiocarbossilico, cianobenzo-1,2,3-tiadiazolo, ammide dell’acido benzoli2,3-tiadiazolcarbossilico, idrazide dell'acido benzo-1,2,3-tiadiazolcarbossilico, acido benzo-1,2,3-tiadiazol-7-carbossilico, acido benzo-1, 2,3-tiadiazol-7-tiocarbossilico, 7-cianobenzo-l,2, 3-tiadiazolo, benzo-1,2,3-tiadiazolcarbossilato in cui il gruppo alchile contiene da uno a sei atomi di carbonio, metilbenzo-1,2, 3-tiadiazol-7-carbossilato, n-propil benzo-1,2,3-tiadiazol-7-carbossilato, benzii benzo-1,2,3-tiadiazol-7-carbossilato, secbutilidrazide dell'acido benzo-1, 2,3-tiadiazol-7-carbossilico, e loro derivati adatti. Altri induttori chimici possono comprendere per esempio acido benzoico, acido salicilico (SA), acido poliacrilico e suoi derivati sostituiti; adatti sostituenti comprendono alchile inferiore, alcossi inferiore, alchiltio inferiore, e alogeno. Ancora un altro gruppo di regolatori per le sequenze di DNA inducibili chimicamente di questa invenzione si basa sulla struttura di un acido piridin-carbossilico come la struttura dell'acido isonicotinico e preferibilmente la struttura dell'acido alogenoisonicotinico. Si preferiscono acidi dicloroisonicotinici e loro derivati, per esempio gli esteri alchilici inferiori. Adatti membri di questa classe di composti regolatori sono per esempio l'acido 2,6-dicloroisonicotinico (INA), e i suoi esteri alchilici inferiori, in particolare l'estere metilico.

d. Espressione Costitutiva, il Promotore Actina:

E' noto che diverse isoforme di actina vengono espresse nella massima parte di tipi di cellule e dì conseguenza il promotore actina rappresenta una buona scelta per un promotore costitutivo. In particolare, il promotore del gene ActI del riso è stato clonato e caratterizzato (McElroy et al., Plant Celi 2: 163-171 (1990)). Si è trovato che un frammento da 1,3 kb del promotore contiene tutti gli elementi regolatori richiesti per l'espressione in protoplasti del riso. Inoltre, sono stati costruiti numerosi vettori di espressione sulla base del promotore ActI in modo specifico per l'impiego in piante monocotiledoni (McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)). Questi contengono incorporati la sequenza fiancheggiante ActJ-introne 1, AdhI 5' e l'introne 1-AdhI (proveniente dal gene dell'alcool deidrogenasi di mais) e la sequenza proveniente dal promotore 35S CaMV. I vettori che presentano la massima espressione sono fusioni di 35S e dell'introne ActI e della sequenza fiancheggiante 5' ActI e dell'introne ActI. La ottimizzazione di frequenze intorno all’ATG di inizio (del gene reporter GUS) ha fatto aumentare l'espressione. Le cassette di espressione del promotore descritte da McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)) possono venire facilmente modificate per l'espressione di geni della cellulasi e sono particolarmente adatte per l'impiego in ospiti monocotiledoni. Per esempio, frammenti contenenti il promotore vengono rimossi dalle costruzioni di McElroy e vengono usati per sostituire il promotore doppio 35S in pCGN1761ENX, che quindi è disponibile per l'inserimento di sequenze specifiche del gene. I geni di fusione così costruiti possono quindi venire trasferiti in adatti vettori di trasformazione. In una relazione separata si è trovato inoltre che il promotore ActI del riso con il suo primo introne dirige una elevata espressione in cellule di orzo sottoposte a coltura (Chibbar et al., Plant Celi Rep.

12: 506-509 (1993)).

e. Espressione Costitutiva, il Promotore Ubiquitina:

La ubiquitina è un altro prodotto del gene noto per accumularsi in molti tipi di cellule e il suo promotore è stato clonato da diverse specie per l'impiego in piante transgeniche (per esempio girasole - Binet et al., Plant Science 79: 87-94 (1991) e mais - Christensen et al., Plant Molec. Biol. _12: 619-632 (1989)). Il promotore di ubiquitina di mais è stato sviluppato in sistemi di monocotiledoni transgeniche e la sua sequenza e i suoi vettori costruiti per la trasformazione di monocotiledoni vengono descritti nella pubblicazione del brevetto EP 0.342.926 (a nome di Lubrizol) il quale brevetto viene qui incorporato come riferimento. Taylor et al. {Plant Celi Rep. _12: 491-495 (1993)) descrivono un vettore (pAHC25) che comprende il promotore della ubiquitina di mais e un primo introne e la sua elevata attività in sospensioni di cellule di numerose piante monocotiledoni quando vengono introdotte tramite un bombardamento di microproiettili. Il promotore ubiquitina è adatto per l'espressione di geni della cellulasi in piante transgeniche, in particolare monocotiledoni. Adatti vettori sono derivati di pAHC25 oppure di uno qualsiasi dei vettori di trasformazione descritti in questa domanda di brevetto, modificati mediante introduzione delle opportune sequenze del promotore di ubiquitina e/o dell 'introne.

f. Espressione Specifica nelle Radici:

Un altro modello di espressione per il gene NIM1 della presente invenzione è costituito dalla espressione nelle radici. Un adatto promotore delle radici viene descritto da de Framond (FEBS 290: 103-106 (1991) ) e anche nella domanda di brevetto pubblicata EP 0.452.269 (a nome di Ciba-Geigy) il quale brevetto viene qui incorporato come riferimento. Questo promotore viene trasferito in un adatto vettore come pCGN1761ENX per l'inserimento di un gene della cellulasi e successivo trasferimento dell'intera cassetta promotore-gene-terminatore in un vettore di trasformazione che interessa.

g. Promotori Inducibili Mediante Lesione:

I promotori inducibili mediante lesione possono anche essere adatti per l'espressione di geni NIM1 dell'invenzione. Numerosi di tali promotori sono stati descritti (per esempio Xu et al., Plant Molec. Biol. 22_: 573-588 (1993), Logemann et al., Plant Celi 1 : 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle,.Plant Molec. Biol. 2/2 : 783-792 (1993), Firek et al., Plant Molec. Biol. 22 : 129-142 (1993), Warner et al., Plant J. 3: 191-201 (1993)) e tutti sono adatti per l'impiego nella presente invenzione. Logemann et al. descrivono le sequenze 5' a monte del gene wunl di patate dicotiledoni. Xu et al. indicano che il promotore inducibile mediante lesioni ottenuto da patate dicotiledoni ( pin2 ) è attivo nel riso monocotiledone. Inoltre Rohrmeier & Lehle descrivono la clonazione di WipI cDNA del mais che viene indotto mediante lesione e che può venire usato per isolare il promotore affine adottando tecniche standard. In modo simile, Firek et al., e Warner et al. hanno descritto un gene indotto mediante lesione ottenuto da A sparagus officìnalis monocotiledone che viene espresso in corrispondenza dei siti della lesione locale e della invasione degli agenti patogeni. Adottando tecniche di clonazione ben note nel settore, questi promotori possono venire trasferiti in adatti vettori, fatti fondere con i geni NIM1 della presente invenzione e possono venire usati per esprimere questi geni in corrispondenza dei siti di lesioni delle piante.

h. Espressione Preferita in Midollo:

La Domanda di Brevetto WO 93/07278 (a nome di Cìba-Geigy) che viene qui incorporata come riferimento descrive l'isolamento del gene trpA del mais che viene espresso in modo preferenziale in cellule di midollo. Vengono presentate la sequenza del gene e il promotore che si estende fino a -1726 bp dall'inizio della trascrizione. Adottando tecniche standard di biologia molecolare, questo promotore oppure sue parti possono venire trasferiti in un vettore come pCGN1761 in cui esso può sostituire il promotore 35S e può venire usato per dirigere l'espressione di un gene estraneo in un modo preferito del midollo. In effetti, i frammenti contenenti il promotore preferito del midollo oppure sue parti possono venire trasferiti in qualsiasi vettore e possono venire modificati per l'impiego in piante transgeniche.

i. Espressione Specifica in Foglie:

E' stato descritto un gene del mais che codifica la fosfoenolcarbossilasi (PEPC) da Hudspeth & Grula (Plant Molec. Biol. 12^ 579-589 (1989)). Adottando tecniche di biologia molecolare il promotore per questo gene può venire usato per dirigere l'espressione di un qualsiasi gene in un modo specifico per le foglie in piante transgeniche.

j. Espressione con "Targeting" di Cloroplasti: Chen & Jagendorf (J. Biol. Chem. 268: 2363-2367 (1993) hanno descritto l'impiego riuscito di un peptide "transit" di cloroplasti per l'introduzione di un transgene eterologo. Questo peptide usato è il peptide transit ottenuto dal gene rbcS proveniente da Nicotiana plumbaginifolia (Poulsen et al., Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)). Impiegando gli enzimi di restrizione DraJ e Sphl. pr Tsp509l e Sphl la sequenza del DNA che codifica questo peptide transit può venire recisa dal plasmide prbcS-8B e può venire manipolata per l'impiego con una qualsiasi delle costruzioni descritte sopra. Il frammento Orai- Sphl si estende da -58 rispetto a rbcS ATG di inizio fino a, e comprende, il primo amminoacido (quindi una metionina) del peptide maturo immediatamente dopo il sito di scissione di import mentre il frammento Tsp509I-SphI si estende da -8 rispetto a rbcS ATG di inizio fino a, e comprende, il primo amminoacido del peptide maturo.

Così, questi frammenti possono venire opportunamente inseriti nel polilinker di una qualsiasi cassetta di espressione scelta che genera una fusione di trascrizione con il leader non tradotto del promotore scelto (per esempio 35S, PR-la, actina, ubiquìtina ecc.), consentendo l'inserimento di un gene NINI in fusione corretta a valle del peptide transit. Costruzioni di questo tipo sono di routine nel settore. Per esempio, mentre l'estremità di Dral è già smussata, il sito 5' Tsp509I può venire reso piatto mediante trattamento con T4 polimerasi, oppure come alternativa può venire legato ad una sequenza del linker oppure dell'adattatore per facilitare la sua fusione con il promotore scelto. Il sito 3' Sphl può venire mantenuto come tale oppure come alternativa può venire legato ad un adattatore di sequenze del linker per facilitare il suo inserimento nel vettore scelto in modo tale da rendere disponibili opportuni siti di restrizione per il successivo inserimento di un gene NIM1 scelto. Idealmente il ATG del sito Sphl viene mantenuto e comprende il primo ATG del gene NIM1 scelto. Chen & Jagendorf realizzano sequenze di consenso per la scissione ideale per 1'import in cloroplasti e in ciascun caso una metionina viene preferita in corrispondenza della prima posizione della proteina matura. In corrispondenza di posizioni successive vi è una maggiore variazione e 1'amminoacido può non essere così critico. In qualsiasi caso, le costruzioni di fusione possono venire valutate per l'efficienza di import in vi tro adottando i metodi descritti da Bartlett et al. (In: Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier pagine 1081-1091 (1982)) e Wasmann et al. (Mol. Gen. Genet.

205: 446-453 (1986)). In modo tipico il sistema migliore può essere quello di generare fusioni usando il gene NIM1 scelto oppure una forma alterata del gene NIM1 senza modificazioni in corrispondenza del terminale amminico e soltanto per incorporare modificazioni quando è evidente che tali fusioni non vengono introdotte in cloroplasti con elevata efficacia, e in questo caso le modificazioni possono venire realizzate secondo la letteratura affermata (Chen & Jagendorf; Wasmann et al.; Ko & Ko, J. Biol.

Chem. 267: 13910-13916 (1992)).

Un vettore preferito viene costruito trasferendo il frammento che codifica il peptide transit Dral-Sphl dal prbcS-8B nel vettore di clonazione pCGN1761ENX/Sph-. Questo plasmide viene scisso con EcoRI e i terminali vengono resi piatti mediante trattamento con T4 DNA-polimerasi. Il plasmide prbcS-8B viene scisso con Sphl e viene sottoposto a legatura ad un adattatore molecolare riassociato avente la sequenza

CGGAATTCCAGCTGGCATG 3 (SEQ ID NI: 16 e 17). Il prodotto che si ottiene viene fosforilato in corrispondenza del terminale 5' mediante trattamento con T4 chinasi. Una successiva scissione con Orai libera il frammento che codifica il peptide transit che viene legato nei siti ex-EcoRI ad estremità piatte del vettore modificato descritto sopra. I cloni orientati con l'estremità 5' dell'inserto adiacente all'estremità 3' del promotore 35S vengono identificati mediante sequenziazione. Questi cloni portano una fusione di DNA della sequenza leader 35S con la sequenza del peptide transit-promotore rbcS-8A che si estende da -58 rispetto al rbcS ATG fino all'ATG della proteina matura, e che comprende in quella regione un sito unico Sphl, e un sito EcoRI creato di recente, e anche i siti esistenti Noti e Xhol di pCGN1761ENX. Questo nuovo vettore viene denominato pCGN!761/CT. Le sequenze del DNA vengono trasferite in pCGN1761/CT in fase mediante amplificazione adottando tecniche PCR e mediante incorporazione di un sito Sphl, NSphl, oppure NlalII in corrispondenza dell'ATG amplificato, che dopo scissione con enzimi dì restrizione usando l'enzima adatto viene sottoposto a legatura in pCGN1761/CT scisso con Sphl. Per facilitare la costruzione, può essere necessario cambiare il secondo amminoacido del prodotto del gene clonato; tuttavia, in quasi tutti i casi l'impiego della PCR insieme con una mutagenesi standard sito-diretta consentirà la costruzione di qualsiasi sequenza desiderata intorno al sito di scissione e alla prima metionina della proteina matura.

Un ulteriore vettore preferito viene costruito sostituendo il doppio promotore 35S di pCGN1761ENX con il frammento BamHI-Sphl di prbcS-8A che contiene il promotore rbcS-8A regolato dalla luce di lunghezza completa da -1038 (rispetto al sito di inizio della trascrizione) fino alla prima metionina della proteina matura. Il pCGN1761 modificato con il Sphl distrutto viene scisso con PstI ed EcoRI e viene trattato con T4 DNA-polimerasi per rendere piatti i terminali. Il prbcS-8A viene scisso con Sphl e viene collegato all'adattatore molecolare riassociato della sequenza descritta sopra. Il prodotto che si ottiene viene fosforilato nel terminale 5' mediante trattamento con T4 chinasi. Una successiva scissione con BamHI libera il peptide transit-promotore che contiene un frammento che viene trattato con T4 DNA-polimerasi per rendere piatto il terminale BamHI. Il frammento del peptide transit-promotore così generato viene clonato nel vettore pCGN1761ENX preparato, per cui si genera una costruzione che comprende il promotore rbcS-8A e il peptide transit con un sito Sphl situato in corrispondenza del sito di scissione per l'inserimento di geni eterologhi. Inoltre, a valle del sito Sphl vi sono siti di clonazione EcoRI (ricreato), Noti, e Xhol. Questa costruzione viene denominata pCGN1761rbcS/CT.

Si possono effettuare manipolazioni simili per utilizzare altre sequenze che codificano il peptide transit di cloroplasti GS2 da altre sorgenti (monocotiledoni e dicotiledoni) e da altri geni. Inoltre procedimenti simili possono venire seguiti per realizzare un "targeting" in altri compartimenti subcellulari come i mitocondri.

2. Terminatoci della Trascrizione

Sono disponibili svariati terminatoci della trascrizione per l'impiego in cassette di espressione. Questi sono responsabili per la terminazione della trascrizione oltre il transgene e una sua corretta poliadenilazione . Opportuni terminatoci di trascrizione sono quelli che sono noti per il fatto che funzionano in piante e comprendono il terminatore CaMV 35S, il terminatore tml, il terminatore della nopalina-sintasi e il terminatore rbcS E9 di piselli. Questi possono venire usati sia in piante monocotiledoni che dicotiledoni.

3. Sequenze per Fare Aumentare oppure per Regolare l'Espressione

Si è trovato che numerose sequenze aumentano l'espressione del gene all'interno dell'unità di trascrizione e queste sequenze possono venire usate insieme con i geni di questa invenzione per aumentare la loro espressione in piante transgeniche.

Si è dimostrato che diverse sequenze di introni fanno aumentare l'espressione, in particolare in cellule monocotiledoni, Per esempio, si è trovato che gli introni del gene AdhI del mais fanno aumentare in modo significativo l'espressione del gene di tipo selvaggio sotto il controllo del suo promotore affine quando vengono introdotti in cellule di mais. Si è trovato che l'introne 1 è particolarmente efficace e fa aumentare l'espressione in costrutti di fusione con il gene della cloramfenicolo acetiltransferasi (Callis et al., Genes Develop.1 : 1183-1200 (1987)). Nel medesimo sistema sperimentale, l'introne ottenuto dal gene "bronzei" di mais aveva un effetto simile nel fare aumentare l'espressione. Le sequenze dell'introne sono state incorporate in modo routinario in vettori di trasformazione delle piante, in modo tipico entro il leader non tradotto.

E' anche noto che un certo numero di sequenze leader non tradotte derivate da virus fanno aumentare l'espressione e queste sono particolarmente efficaci in cellule dicotiledoni. Si è dimostrato che in modo specifico sequenze leader ottenute dal virus del mosaico del tabacco (TMV, la "sequenza W"), il virus della muffa clorotica del mais (MCMV), e il virus del mosaico dell'erba medica (AMV) sono efficaci nel fare aumentare l'espressione (per esempio Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)).

4. "Targeting" del Prodotto del Gene all'Interno della Cellula

E' noto che nelle piante esistono svariati meccanismi per "targeting" prodotti del gene e le sequenze che controllano il funzionamento di questi meccanismi sono state caratterizzate in certi dettagli. Per esempio, il targeting di prodotti del gene al cloroplasto viene controllato per mezzo di una sequenza di segnale trovata in corrispondenza dell'estremità terminale amminica di diverse proteine che viene scissa durante 1'import di cloroplasti per ottenere la proteina matura (per esempio Cornai et al., J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Queste sequenze di segnali possono venire fatte fondere con i prodotti del gene eterologo per realizzare 1'import di prodotti eterologhi nel cloroplasto (van der Broeck et al., Nature 313: 358-363 (1985)). Il DNA che codifica opportune sequenze di segnale può venire isolato dall'estremità 5' dei cDNA che codificano la proteina RUBISCO, la proteina CAB, l'enzima EPSP-sintasi, la proteina GS2 e molte altre proteine che sono note per essere localizzate in cloroplasti.

Altri prodotti del gene sono localizzati in altri organelli come i mitocondri e il perossisoma (per esempio Unger et al., Plant Holec. Biol. 13: 411-418 (1989)). I cDNA che codificano questi prodotti possono anche venire manipolati per effettuare il "targeting" di prodotti del gene eterologhi in questi organelli. Esempi di tali sequenze sono le ATPasì codificate dal nucleo e isoforme specifiche di aspartato ammino transferasi per mitocondri. E' stato descritto il "targeting" di corpi di proteine cellulari da Rogers et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 6512-6516 (1985)).

Inoltre, sono state caratterizzate sequenze che provocano il "targeting" di prodotti del gene in altri compartimenti della cellula. Le sequenze ammino-terminali sono responsabili del targeting dell'ER, l'apoplasto, e della secrezione cellulare di cellule di aleurone (Koehler & Ho, Plant Celi 2: 769-783 (1990)). Inoltre, sequenze ammino-terminali insieme con sequenze carbossì-terminali sono responsabili del "targeting vacuolare" di prodotti del gene (Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 1 A : 357-368 (1990)).

Mediante la fusione delle opportune sequenze targeting descritte sopra a sequenze transgeniche che interessano, è possibile dirigere il prodotto del transgene in qualsiasi compartimento di organelli o cellule. Per il targeting di cloroplasti per esempio, la sequenza di segnale dei cloroplasti originata dal gene RUBISCO, dal gene CAB, dal gene EPSP-sintasi, oppure dal gene GS2 viene fatta fondere in fase con il ATG ammino-terminale del transgene. La sequenza di segnale scelta deve comprendere il sito di scissione noto e la fusione costruita deve tener conto di eventuali amminoacidi dopo il sito di scissione che sono necessari per la scissione. In certi casi questo requisito può venire soddisfatto mediante l'addizione di un piccolo numero di amminoacidi tra il sito di scissione e il ATG del transgene oppure come alternativa la sostituzione di certi amminoacidi all'interno della sequenza del transgene. Le fusioni costruite per 1'import in cloroplasti possono venire esaminate per l'efficacia di assorbimento in cloroplasti mediante traduzione in vitro di costruzioni trascritte in vitro seguite da assorbimento in cloroplasti in vitro adottando tecniche descritte da Bartlett et al., In: Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier pagine 1081-1091 (1982) e Wasmann et al., Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986). Queste tecniche di costruzione sono ben note nel settore e sono parimenti applicabili a mitocondri e a perossisomi.

I meccanismi descritti sopra per il targeting cellulare possono venire utilizzati non soltanto insieme con loro promotori affini, ma anche insieme con promotori eterologhi in modo da realizzare un obiettivo specifico di targeting di cellule sotto la regolazione di trascrizione di un promotore che ha un modello di espressione differente da quello del promotore dal quale deriva il segnale di targeting. C. Trasformazione

Una volta che la sequenza codificante NIM1 è stata clonata in un sistema di espressione, essa viene trasformata in una cellula vegetale. Tessuti vegetali adatti per la trasformazione comprendono i tessuti delle foglie, i tessuti delle radici, i meristemi, e i protoplasti. Il sistema della presente invenzione può venire utilizzato in qualsiasi pianta che possa venire trasformata e rigenerata. Tali metodi per la trasformazione e la rigenerazione sono ben noti nel settore. Metodologie per la costruzione di cassette di espressione di piante e anche per l’introduzione di DNA estraneo in piante vengono descritte in generale nel settore. In generale, per l'introduzione del DNA estraneo in piante vettori dei plasmidi Ti sono stati utilizzati per la cessione di DNA estraneo. Per tale cessione sono stati impiegati anche un assorbimento diretto del DNA, liposomi, elettroporazione, micro-iniezione, e microproiettili. Tali metodi sono stati descritti nel settore. Vedere

per esempio Bilang et al., (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 228: 104-112; Guerche et al., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al., (1987) Theor. Appi. Genet. 75: 30-36; Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al., (1980) Science 208: 1265; Horsch et al., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBìock et al., (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach e Weissbach, eds.) Academic Press, Ine. (1988); e Methods in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielinski, eds.) Academic Press, Ine. (1989). Vedere anche brevetto U.S. No. 5.625.136 che viene qui incorporato come riferimento nella sua interezza. E’ evidente che il metodo di trasformazione dipenderà dalla cellula della pianta da trasformare. Transformation of tobacco, tornato, potato, and Arabidopsis thaliana using a binary Ti vector System. Plant Physiol . 91: 301-305, 1986; Fry, J., Barnason, A., e Horsch, R.B. Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens based vectors. PI . Celi Rep. 6: 321-325, 1987; Block, M.d. Genotype independent leaf disc transformation of potato (Solanum tuberosum) using Agrobacterium tumefaciens. Theor. appi , genet . 76: 767-774, 1988; Deblock, M., Brouwer, D.D., and Tenning, P.

Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and thè Expression of thè bar and neo genes in thè transgenic plants. Plant Physiol . 91: 694-701, 1989; Baribault, T.J., Skene, K.G.M., Cain, P.A., e Scott, N.S. Transgenic grapevines: regeneration of shoots expressing beta-glucoronidase . PI . Celi Rep. 41: 1045-1049, 1990; Hinchee, M.A.W., Newell, C.A., ConnorWard, D.V., Armstrong, T.A., Deaton, W.R., Sato, S.S., e Rozman, R.J., Transformation and regeneration of non-solanaceous crop plants. Stadler. Genet . Symp. 203212.203-212, 1990; Barfield, D.G. e Pua, E.C. Gene transfer in plants of Brassica juncea using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. PI . Celi . Rep. 10: 308-314, 1991; Cousins, Y.L., Lyon, B.R., e Llewellyn, D.J. Transformation of an Australian cotton cultivar: Prospects for cotton improvement through genetic engineering. Aust. J. Plant Physiol . 18: 481-494, 1991; Chee, P.P. e Slightom, J.L. Transformation of Cucumber Tissues by Microprojectile Bombardment Identification of Plants Containing Functional and Nonfunctional Transferred Genes. GENE 118: 255-260, 1992; Christou, P., Ford, T.L., e Kofron, M. The development of a variety-independent gene-transfer method for rice. Trends. Biotechnol . 10: 239-246, 1992; D'Kalluin, K., Bossut, M., Bonne, E., Mazur, B., Leemans, J., e Botterman, J. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants. Bio/Technol . 10: 309-314, 1992; Dhir, S.K., Dhir, S., Savka, M.A., Belanger, F., Kriz, A.L., Farrand, S.K., e Widholm, J.M. Regeneration of Transgenic Soybean (Glycine Max) Plants from Electroporated Protoplasts. Plant Physiol . 99: 81-88, 1992; Ha, S.B., Wu, F.S., e Thorne, T.K. Transgenic turf-type tali fescue (Festuca arundinacea Schreb.) plants regenerated from protoplasts. PI . Celi Rep. 11: 601-604, 1992; Biechi, A.E. Genetic Transformation The New Tool for Wheat Improvement 78th Annual Meeting Keynote Address. Cereal Food World 38: 846-847, 1993; Casas, A.M., Kononowicz, A.K., Zehr, U.B., Tomes, D.T., Axtell, J.D., Butler, L.G., Bressan, R.A., e Hasegawa, P.M. Transgenic Sorghum Plants via Microprojectile Bombardment. Proc. Natacad. Sci . USA 90: 11212-11216, 1993; Christou, P. Philosophy and Practice of Variety Independent Gene Transfer into Recalcitrant Crops. In Vitro Celi . Dev. Biol . -Plant 29P: 119-124, 1993; Damiani, F., Nenz, E., Paolocci, F., e Arcioni, S. Introduction of Hygromycin Resistance in Lotus spp.

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I batteri del genere Agrobacterium possono venire utilizzati per trasformare cellule vegetali. Specie adatte di tale batterio comprendono Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogens . Agrobacterium tumefaciens (per esempio i ceppi LBA4404 oppure EHA105) è particolarmente utile a causa della sua ben nota capacità di trasformare le piante.

1. Trasformazione di Piante Dicotiledoni

Le tecniche di trasformazione per’ piante dicotiledoni sono ben note nel settore e comprendono tecniche basate su Agrobacterium e tecniche che non richiedono Agrobacterium. Le tecniche che non richiedono Agrobacterium comportano l’assorbimento di un materiale genetico esogeno direttamente da parte di protoplasti o cellule. Ciò può venire realizzato mediante assorbimento mediato con PEG oppure elettroporazione, mediante cessione mediata con bombardamento di particelle oppure mediante microiniezione. Esempi di queste tecniche sono descritte in Paszkowski et al., EMBO J. 3^: 2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4^: 1001-1004 (1986), e Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987). In ogni caso le cellule trasformate vengono rigenerate in piante intere adottando tecniche standard note nel settore.

La trasformazione mediata da Agrobacterium è una tecnica preferita per la trasformazione di piante dicotiledoni a causa della sua elevata efficacia di trasformazione e della sua ampia utilità con molte specie differenti. Le molte specie di colture sono trifoglio e pioppo (EP .0.317.511 (cotone), EP 0.249.432 (pomodori, Calgene), WO 87/07299 (Brassica, Calgene), US 4.795.855 (pioppo)). Una trasformazione con Agrobacterium comporta tipicamente il trasferimento del vettore binario che porta il DNA estraneo che interessa (per esempio pCIB200 oppure pCIB2001) in un opportuno ceppo di Agrobacterium che può dipendere dal complemento dei geni vir portati dal ceppo di Agrobacteri um ospite o su un plasmide Ti co-residente oppure su un cromosoma (per esempio il ceppo CIB542 per pCIB200 e pCIB2001 (Uknes et al., Plant Celi _5: 159-169 (1993)). Il trasferimento del vettore binario ricombinante in Agrobacterium viene realizzato mediante un procedimento di appaiamento triparentale impiegando E. coli che porta il vettore binario ricombinante, un ceppo di E. coli helper che porta un plasmide come pRK2013 e che è in grado di mobilizzare il vettore binario ricombinante verso il ceppo di Agrobacteri um bersaglio. Come alternativa, il vettore binario ricombinante può venire trasferito in Agrobacterium mediante trasformazione del DNA (Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1983)).

La trasformazione della specie di piante bersaglio mediante Agrobacterium ricombinante di solito comporta una co-coltura dell 'Agrobacterium con espianti prelevati dalla pianta e segue protocolli ben noti nel settore. Il tessuto trasformato viene rigenerato su un mezzo selezionabile che porta un marcatore della resistenza nei confronti di un antibiotico oppure di un erbicida presente tra le delimitazioni del DNA-plasmide T.binario.

Un altro sistema per trasformare cellule di piante con un gene consiste nello spingere particelle inerti oppure biologicamente attive in corrispondenza di tessuti e cellule della pianta. Questa tecnica viene descritta nei Brevetti ,U.S. Ni. 4.945.050, 5.036.006 e 5.100.792, tutti a n!ome di Sanford et al. In generale, questo procedimento consiste nello spingere particelle inerti oppure biologicamente attive in corrispondenza delle cellule in condizioni efficaci per la penetrazione nella superficie esterna della cellula e in modo da realizzare l'incorporazione al suo interno. Quando si utilizzano particelle inerti, il vettore può venire introdotto nella cellula rivestendo le particelle con il vettore che contiene il gene desiderato. Come alternativa, la cellula bersaglio può venire circondata dal vettore in modo che il vettore viene portato all'interno della cellula sulla scia della particella. Particelle biologicamente attive (per esempio cellule di lievito essiccate, un batterio essiccato oppure un batteriofago, ciascuno contenente DNA che si desidera introdurre) possono venire spinte nel tessuto della cellula della pianta.

2. Trasformazione di monocotiledoni

La trasformazione della massima parte delle specie di monocotiledoni è ora anch'essa diventata una tecnica di routine. Le tecniche preferite comprendono il trasferimento diretto del gene in protoplasti utilizzando tecniche PEG oppure di elettroporazione e un bombardamento di particelle nel tessuto del callo. Le trasformazioni possono venire realizzate con una singola specie di DNA oppure con specie multiple di DNA (ossia co-trasformazione) ed entrambe queste tecniche sono adatte per l'impiego in questa invenzione. Una co-trasformazione può avere il vantaggio di evitare una costruzione completa del vettore e di generare piante transgeniche con loci non collegati per il gene che interessa e il marcatore selezionabile, consentendo l'allontanamento del marcatore selezionabile in generazioni successive e ciò deve venire considerato desiderabile. Tuttavia, un inconveniente dell'impiego di una cotrasformazione è costituito dal fatto che si ha una frequenza inferiore al 100% con la quale le specie di DNA separate vengono integrate nel genoma (Schocher et al., Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)).

Le Domande di Brevetto EP 0.292.435 ([1280/1281] a nome di Ciba-Geigy), EP 0J392.225 (a nome di Ciba-Geigy) e WO 93/07278 (a nome di Ciba-Geigy) descrivono tecniche per la preparazione di callo e protoplasti da una linea affine superiore di mais, la trasformazione di protoplasti adottando .la PEG oppure la elettroporazione e la rigenerazione di piante di mais da protoplasti trasformati. Gordon-Karam et al. (Plant Celi 2: 603-618 (1990)) e Fromm et al. (Biotechnology 833-839 (1990)) hanno pubblicato tecniche per la trasformazione di una linea di mais derivata da A188 utilizzando un bombardamento di particelle. Inoltre, la Domanda di Brevetto WO 93/07278 (a nome di Ciba-Geigy) e Koziel et al. (Biotechnology 11 194-200 (1993)) descrivono tecniche per la trasformazione di linee affini superiori di mais mediante bombardamento di particelle. Questa tecnica utilizza embrioni di mais immaturi aventi una lunghezza di 1,5-2,5 mm recisi da una spiga di mais 14-15 giorni dopo l'impollinazione e impiegando per il bombardamento un dispositivo PDS-lOOOHe Biolistics.

La trasformazione del riso può venire realizzata anche mediante tecniche di trasferimento diretto del gene utilizzando protoplasti oppure un bombardamento di particelle. La trasformazione mediata dai protoplasti è stata descritta per tipi di Japonica e tipi di Indica (Zhang et al., Plant Celi Rep. 379-384 (1988); Shimamoto et al., Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al., Biotechnology _8: 736-740 (1990)). Entrambi i tipi sono anche trasformabili in modo routinario utilizzando il bombardamento con particelle (Christou et al., Biotechnology 9: 957-962 (1991)).

La Domanda di Brevetto EP 0.332.581 (a nome di Ciba-Geigy) descrive tecniche per la generazione, la trasformazione e la rigenerazione di protoplasti di Pooideae. Queste tecniche consentono la trasformazione di Dactylis e di frumento. Inoltre, la trasformazione del frumento è stata descritta da Vasil et al. (Biotechnology 10 667-674 (1992)) utilizzando il bombardamento con articelle in cellule di callo rigenerabile a lungo termine di tipo C e anche da Vasil et al. (Biotechnology 11: 1553-1558 (1993)) e Weeks et al. (Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993)) utilizzando il bombardamento con particelle di embrioni immaturi e di callo derivato da embrioni immaturi. Una tecnica preferita, tuttavia, per la trasformazione del frumento comporta la trasformazione del frumento mediante bombardamento con particelle di embrioni immaturi e comprende uno stadio ad elevato contenuto di saccarosio oppure ad elevato contenuto di maltosio prima della cessione del gene. Prima del bombardamento, un qualsiasi numero di embrioni (aventi una lunghezza di 0,75-1 mia) viene seminato in piastre su un mezzo MS con saccarosio al 3% (Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)) e 3 mg/litro di 2,4-D per la induzione di embrioni somatici e questa fase viene lasciata decorrere al buio. Il giorno scelto per il bombardamento, gli embrioni vengono rimossi dal mezzo di induzione e vengono opposti sul mezzo osmotico (ossia mezzo di induzione con saccarosio oppure maltosio aggiunto nella concentrazione desiderata, in modo tipico 15%). Gli embrioni vengono lasciati subire la plasmolisi per 2-3 ore e quindi vengono bombardati. Venti embrioni per piastra bersaglio costituiscono un numero tipico anche se non è critico. Un plasmide opportuno che porta il gene (per esempio pCIB3064 oppure pSG35) viene fatto precipitare su particelle di oro aventi dimensioni di micrometri utilizzando procedimenti standard. Ciascuna piastra di embrioni viene colpita con il dispositivo ad elio DuPont Biolistics utilizzando una pressione di scoppio di circa 1000 psi impiegando un setaccio da 80 mesh standard. Dopo bombardamento, gli embrioni vengono riportati al buio per circa 24 ore (ancora sul mezzo osmotico). Dopo 24 ore, gli embrioni vengono rimossi dal mezzo osmotico e vengono riportati sul mezzo di induzione in cui essi rimangono per circa un mese prima della rigenerazione. Circa un mese dopo, gli espianti di embrione con il callo embriogenico in fase di sviluppo vengono trasferiti nel mezzo di rigenerazione (MS 1 mg/litro NAA, 5 mg/litro GA), che contiene inoltre l'agente di selezione adatto (10 mg/litro di basta nel caso di pCIB3064 e 2 mg/litro di metotrexato nel caso di pSOG35). Dopo circa un mese, i germogli sviluppati vengono trasferiti in contenitori sterili più grandi noti come "GA7" che contengono MS a concentrazione dimezzata, 2% di saccarosio e la medesima concentrazione dell'agente di selezione. La Domanda di Brevetto 08/147.161 descrive metodi per la trasformazione del frumento e tale domanda viene qui incorporata come riferimento.

Più recentemente, è stata descritta la trasformazione di monocotiledoni impiegando Agrobacterium. Vedere WO 94/00977 e il Brevetto U.S. No. 5.591.616, i quali entrambi vengono qui incorporati come riferimento.

Allevamento

Il frammento di gene isolato della presente invenzione oppure forme alterate del gene NIM1 possono venire utilizzati per conferire una resistenza alle malattie ad una grande varietà di cellule vegetali, ivi comprese quelle di gimnosperme, monocotiledoni e dicotiledoni. Sebbene il gene possa venire inserito in una qualsiasi cellula vegetale che rientra in queste classi ampie, tale tecnica è particolarmente utile in cellule di piante da coltura, come riso, frumento, orzo, segale, mais, patate, carote, patate dolci, barbabietola da zucchero, fagioli, piselli, cicoria, lattuga, cavolo, cavolfiore, broccoli, rape, rafano, spinaci, asparagi, cipolle, aglio, melanzane, pepe, sedano, carote, melopopone, zucca, zucchini, cetrioli, mele, pere, cotogne, meloni, susine, ciliegie, pesche, "nectarine", albicocche, fragole, uva, lamponi, more, ananasso, avocado, papaia, mango, banana, soia, tabacco, pomodori, sorgo e canna da zucchero.

L'espressione a livello elevato del gene NIM1 e di suoi mutanti necessaria per una espressione costitutiva di geni SAR, in combinazione con altre caratteristiche importanti per la produzione e la qualità, può venire incorporata in linee di piante tramite allevamento. Così una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione riguarda un metodo per la produzione di discendenti transgenici di una pianta di partenza transgenica che contiene la molecola di DNA isolata che codifica una forma alterata di una proteina NIM1 secondo l'invenzione che consiste nel trasformare detta pianta originaria con una molecola di un vettore ricombinante secondo l'invenzione e trasferire la caratteristica ai discendenti di detta pianta di partenza transgenica che comporta tecniche di allevamento di piante note.

Sistemi e tecniche di allevamento sono noti nel settore. Vedere per esempio Welsh, J.R., Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981); Crop Breeding, Wood, D.E. (Ed.), American Society of Agronomy Madison, Wisconsin (1983); Mayo, 0., The Theory of Plant Breeding, Seconda Edizione, Clarendon Press, Oxford (1987); Singh, D.P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986); e Wricke e Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter & Co., Berlino (1986).

Propagazione di proprietà genetiche realizzate mediante ingegneria genetica nei semi transgenici e nelle piante transgeniche e mantenimento nelle piante discendenti

Le proprietà genetiche realizzate mediante ingegneria genetica nei semi transgenici e nelle piante transgeniche descritte sopra vengono trasmesse mediante riproduzione sessuale oppure crescita vegetativa e quindi possono venire mantenute e propagate nelle piante discendenti. In generale in tale tecnica di mantenimento e di propagazione si utilizzano metodi di agricoltura noti sviluppati per adattarsi a scopi specifici come aratura, semina oppure raccolta. Si possono anche applicare processi specializzati come colture idroponiche oppure tecnologie in serra. Poiché la coltura in fase di crescita è vulnerabile nei confronti di un attacco e di danni provocati da insetti oppure da infezioni e anche nei confronti di una competizione con piante infestanti, si devono prendere delle precauzioni per controllare i vegetali infestanti, le malattie delle piante, insetti, nematodi e altre condizioni avverse per migliorare la resa. Queste precauzioni comprendono misure meccaniche come aratura del terreno oppure allontanamento di vegetali infestanti e di piante infettate, e anche l'applicazione di composti agrochimici come erbicid, fungicidi, gametocidi, nematocidi, regolatori della crescita, agenti di maturazione e insetticidi. L'impiego di proprietà genetiche vantaggiose delle piante transgeniche e dei semi- transgenici secondo l'invenzione può inoltre venire realizzato in allevamenti di piante che tendono allo sviluppo di piante con proprietà migliorate come resistenza nei confronti di organismi nocivi, erbicidi oppure sollecitazione, valore nutrizionale migliorato, resa aumentata oppure struttura migliorata che provoca una minore perdita dovuta a ripiegamento oppure a distruzione. I diversi stadi di allevamento sono caratterizzati da un intervento dell'uomo ben definito come selezione delle linee da incrociare, impollinazione diretta delle linee di origine oppure selezione di piante discendenti opportune. A seconda delle proprietà desiderate si devono realizzare tecniche differenti, di allevamento. Le tecniche relative sono ben note nel settore e comprendono senza alcuna limitazione, ibridazione, incroci tra specie affini, allevamento con reincrocio, allevamento di molte linee, miscelazione di varietà, ibridazione interspecifica, tecniche aneuploidi, ecc. Le tecniche di ibridazione comprendono inoltre la sterilizzazione di piante in modo da avere piante sterili maschi oppure femmine mediante mezzi meccanici, chimici oppure biochimici. L'impollinazione incrociata di una pianta sterile maschio con polline di una linea differente assicura che il genoma della pianta sterile maschio però della pianta fertile femmina riceva in modo uniforme le proprietà di entrambe le linee di origine. Così, i semi transgenici e piante transgeniche secondo l'invenzione possono venire usati per l'allevamento di lìnee di piante migliorate che per esempio fanno aumentare l’efficacia di metodi convenzionali come trattamento con erbicidi oppure con pesticidi oppure consentono di fare a meno di detti metodi a causa delle loro proprietà genetiche modificate. Come alternativa si possono ottenere nuove colture con una migliore resistenza alle sollecitazioni che a causa della loro "struttura" genetica ottimizzata danno un raccolto di migliore qualità rispetto a prodotti che non sono in grado di sopportare condizioni di sviluppo avverse paragonabili.

Nella produzione di semi la qualità e l'uniformità di germinazione dei semi sono caratteristiche essenziali del prodotto mentre la qualità e la uniformità di germinazione di semi raccolti e posti in commercio dall'agricoltore non sono importanti. Poiché è difficile mantenere una coltura libera da semi di altre colture e di vegetali infestanti, per controllare malattie intrinseche dei semi e per produrre semi con una buona germogliazione, sono state sviluppate tecniche di produzione dei semi abbastanza estese e ben definite da parte dei produttori di semi che vengono praticate nel settore della crescita, del condizionamento e della vendita di semi puri. Così è pratica comune per l'agricoltore acquistare semi dotati di certificato che soddisfano a standard di qualità specifici invece di usare semi raccolti dalla sua coltura. Il materiale di propagazione da usare come semi di solito viene trattato con un rivestimento protettivo che contiene erbicidi, insetticidi, fungicidi, battericidi, nematocidi, molluschicidi o loro miscele. I rivestimenti protettivi usualmente usati contengono composti come captan, carboxin, thiram (TMTD®), methalaxyl (Apron<®>), e pirimiphos-methyl (Actellic ). Se si desidera questi composti sono formulati insieme con ulteriori sostanze-veicolo, tensioattivi oppure sostanze ausiliarie che favoriscono l'applicazione usualmente impiegate nel settore della formulazione per ottenere una protezione contro un danno provocato da organismi nocivi costituiti da batteri, funghi oppure animali. I rivestimenti protettivi possono venire applicati mediante impregnazione del materiale di propagazione con una formulazione liquida oppure mediante rivestimento con una formulazione umida oppure secca combinata. Sono possibili anche altri metodi di applicazione come trattamento diretto sui germogli oppure sui frutti.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione consiste nel mettere a disposizione nuovi metodi di agricoltura -come i metodi esemplificati sopra che sono caratterizzati dall'impiego di piante transgeniche, di un materiale vegetale transgenico, oppure di semi transgenici secondo la presente invenzione.

I semi possono venire forniti in un sacchetto, in un contenitore oppure in un recipiente costituito da un materiale di confezionamento adatto, il sacchetto oppure il contenitore può venire chiuso in modo da contenere i semi. Il sacchetto, il contenitore oppure il recipiente possono essere destinati ad una conservazione dei semi a breve termine oppure a lungo termine oppure per entrambi i casi. Esempi di un adatto materiale di confezionamento comprendono carta come carta kraft, materia plastica rigida oppure flessibile oppure un altro composto polimero, vetro oppure metallo. Preferibilmente il sacchetto, il contenitore oppure il recipiente è costituito da una pluralità di strati di materiali di confezionamento, del medesimo tipo oppure di tipo differente. In una forma di realizzazione, il sacchetto, il contenitore oppure il recipiente è dotato in modo da escludere oppure limitare che acqua ed umidità vengano a contatto con il seme. In un esempio, il sacchetto, il contenitore oppure il recipiente è sigillato, per esempio viene sigillato con calore, in modo da impedire che entrino acqua oppure umidità. In un'altra forma di realizzazione, materiali che assorbono acqua vengono posti tra gli strati di materiale di confezionamento oppure adiacenti a detti strati. Ancora in un'altra forma di realizzazione, il sacchetto, il contenitore oppure il recipiente, oppure il materiale di confezionamento con il quale essi sono costituiti viene trattato in modo da limitare, sopprimere oppure impedire l’attacco di agenti patogeni, una contaminazione oppure altri effetti negativi durante la conservazione o il trasporto dei semi. Un esempio di un tale trattamento è costituito da una sterilizzazione, per esempio con mezzi chimici oppure mediante esposizione ad una radiazione. Nella presente invenzione è compreso un sacchetto di tipo commerciale che contiene semi di una pianta transgenica che contiene almeno una forma alterata di una proteina NIM1 oppure una proteina NIM1 che viene espressa in detta pianta trasformata in corrispondenza di livelli più elevati rispetto alla pianta di tipo selvaggio, insieme con una adatta sostanza-veicolo, e con istruzioni per il suo impiego per conferire alle piante resistenza alle malattie ad ampio spettro.

Resistenza alle Malattie

La valutazione della resistenza alle malattie viene realizzata mediante metodi noti nel settore. Per esempio vedere Uknes et al., (1993) Molecular Plant Microbe Interactions 6: 680-685; Gorlach et al., (1996) Plant Celi 8): 629-643; Alexander et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 7327-7331.

A. Saggio di Resistenza nei Confronti di Phytophthora parasi tica {Stelo nero)

I saggi per stabilire la resistenza nei confronti di Phytophthora parasitica, l'organismo che provoca lo stelo nero, vengono effettuati su piante di 6 settimane fatte crescere come descritto in Alexander et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 7327-7331. Le piante vengono innaffiate, vengono lasciate sgocciolare e quindi vengono inoculate applicando 10 mi di una sospensione di sporangi (300 sporangi/ml) nel terreno. Le piante inoculate vengono tenute in una serra mantenuta ad una temperatura del giorno di 23-25°C, e ad una temperatura della notte di 20-22°C. L'indice di appassimento usato per il saggio è il seguente: 0=nessun sintomo; l=alcuni sintomi di appassimento con turgidità diminuita; 2-chiari sintomi di appassimento, però senza marciume o arresto della crescita; 3=netti sintomi di appassimento con arresto della crescita, ma senza evidente marciume dello stelo; 4=grave appassimento, con marciume degli steli visibile e un certo danno al sistema delle radici; 5=come per 4, però piante quasi distrutte oppure distrutte, e con grave riduzione del sistema delle radici. Tutti i saggi vengono valutati secondo il sistema "blind" su piante disposte secondo un modello casuale.

B. Saggio di Resistenza nei Confronti di Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae pv. tabaci ceppo #551 viene iniettato nelle due foglie inferiori di parecchie piante di 6-7 settimane in una concentrazione di IO6 oppure 3 x 10<6 >per ml in acqua. Sei singole piante vengono valutate per ogni momento. Le piante infettate con Pseudomonas tabaci vengono valutate su una scala di gravità della malattia a 5 punti, 5=100% del tessuto distrutto, 0=nessun sintomo. Si effettua una prova T (LSD) sulle valutazioni per ciascun giorno e i raggruppamenti vengono indicati secondo il valore medio di valutazione della malattia. I valori seguiti dalla medesima lettera in quel giorno di valutazione non sono significativamente differenti dal punto di vista statistico.

C. Saggio di Resistenza nei Confronti di Cercospora nicotianae

Una sospensione di spore di Cercospora nicotianae (ATCC #18366) (100.000-150.000 spore per mi) viene spruzzata fino a quasi gocciolare acqua sulla superficie delle foglie. Le piante vengono mantenute con una umidità del 100% per 5 giorni. Le piante vengono quindi spruzzate con una nebbia di acqua per 5-10 volte al giorno. In ogni momento vengono valutate sei singole piante. L'infezione da Cercospora nicotianae viene valutata su una base di un'area delle foglie in % che presenta sintomi della malattia. Sulle valutazioni per ogni giorno si effettua una prova T (LSD) e i raggruppamenti vengono indicati secondo il valore di valutazione della malattia medio. I valori seguiti dalla medesima lettera in quel giorno di valutazione non sono significativamente differenti dal punto di vista statistico.

D. Saggio di resistenza nei confronti di Peronospora parasitica

I saggi per stabilire la resistenza nei confronti di Peronospora parasitica, vengono effettuati su piante come descritto in Uknes et al., (1993). Le piante vengono inoculate con una sostanza isolata compatibile di P. parasitica spruzzando le piante con una sospensione di conidi (circa 5 x 10 spore per millilitro). Le piante inoculate vengono fatte incubare in condizioni di alta umidità a 17°C in una camera di crescita con un ciclo di giorno di 14 ore/notte di 10 ore. Le piante vengono esaminate in corrispondenza di 3-14 giorni, preferibilmente 7-12 giorni dopo l'inoculazione per la presenza di conidiofori. Inoltre parecchie piante provenienti da ciascun trattamento vengono scelte a caso e vengono colorate con lattofenolo-blu di tripano (Keogh et al., Trans. Br. Mycol . Soc. 74: 329-333 (1980)) per l'esame al microscopio.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

La FIGURA 1 mostra l'effetto di induttori chimici sulla induzione dell'espressione del gene SAR in piante di tipo selvaggio e in piante niml . L'induzione chimica di geni SAR. viene diminuita in piante niml . Acqua, SA, INA oppure BTH vengono applicati a piante di tipo selvaggio (WT) e piante niml . Dopo 3 giorni, da queste piante si prepara RNA e lo si esamina per l'espressione di PR-1, PR-2, e PR-5.

La FIGURA 2 illustra l'espressione di un gene PR-1 in piante Ws-0 e piante niml infettate con un organismo patogeno. L'induzione del patogeno di PR-1 è diminuita in piante niml . Piante di tipo selvaggio (WT) e piante niml vengono inoculate mediante spruzzatura con la razza Emwa di P. parasitica. I campioni vengono raccolti in corrispondenza dei giorni 0, 1, 2, 4, e 6 e il RNA viene analizzato mediante ibridazione blot con una sonda di PR-1 cDNA di A. thaliana per misurare l'accumulo di mRNA di PR-1.

La FIGURA 3 mostra l’accumulo di mRNA di PR-1 in mutanti niml e piante di tipo selvaggio dopo infezione con un agente patogeno oppure dopo trattamento chimico. Le piante contenenti gli alleli niml, niml -1, -2, -3, -4, -5, e -6, e piante Ws-0 (Ws) sono state trattate con acqua (C), con SA, INA, oppure BTH 3 giorni prima dell'isolamento del RNA. Il campione di Emwa è costituito da RNA isolato da piante 14 giorni dopo l’inoculazione con una porzione isolata Emwa di P. parasitica . I blot vengono ibridizzati impiegando come sonda un PR-1 cDNA di Arabidopsis (Uknes et al., 1992).

La FIGURA 4 mostra i livelli di accumulo di SA in piante Ws-0 e in piante niml infettate con P. syringae. Le piante niml accumulano SNA dopo esposizione ad un agente patogeno. Le foglie delle piante di tipo selvaggio e delle piante niml vengono infiltrate con Pst DC3000 (avrRpt2) oppure soltanto con il mezzo di supporto (10 mM di MgCl2) . Dopo 2 giorni, i campioni vengono raccolti dalle piante non trattate, da piante trattate con MgCl2, e da piante trattate con DC3000 (avrRpt2) . 1 campioni trattati con i batteri sono stati separati in foglie primarie (infiltrate) e secondarie (non infiltrate). SA libero e SA totale dopo idrolisi con β-glucosidasi sono stati determinati quantitativamente mediante HPLC. Le barre di errore indicano SD di tre campioni replicati.

Le FIGURE 5A-D presentano una mappa globale con livelli crescenti di risoluzione della regione cromosomica centrata su NIM1 con ricombinanti indicati, inclusi, BAC, YAC e Cosmidi nella regione NIM1 .

(A) Posizione nella mappa di NIM1 sul cromosoma 1. Il numero totale di gameti valutati è 2276.

(B) Cromosoma artificiale di lievito (striato), cromosoma artificiale batterico (BAC), e cloni PI usati per clonare NIM1 .

(C) Cloni di cosmidi che coprono il locus NIM1 . i tre cosmidi che complementano niml -1 vengono mostrati come linee più spesse. (D) Le quattro regioni del gene presunte sul frammento più piccolo del DNA genomico di complementazione. I quattro schemi di lettura aperti che contengono il gene MIMI vengono indicati con le barre aperte. Le frecce indicano la direzione della trascrizione.La numerazione è relativa alla prima base del DNA genomico di Arabidopsis presente nel cosmide D7.

La FIGURA 6 mostra la sequenza di acido nucleico del gene NIM1 e la sequenza degli amminoacidi del prodotto del gene NIM1 ivi comprese variazioni nei diversi alleli. Questa sequenza di acido nucleico che è sul filamento opposto rispetto alla sequenza da 9,9 kb presentata in SEQ ID NO:l, viene presentata anche in SEQ ID NO:2, e la sequenza degli amminoacidi del prodotto del gene NIM1 viene presentata anche in SEQ ID NO:3.

La FIGURA 7 mostra l'accumulo di NIM1 indotto con INA, BTH, SA e con un trattamento con agente patogeno in piante di tipo selvaggio e in alleli mutanti di niml . I bloot di gel del RNA nella Figura 3 sono stati analizzati per l'espressione del RNA impiegando una sonda derivata da 2081 fino a 3266 nella sequenza mostrata nella Figura 6.

La FIGURA 8 è un confronto della sequenza di amminoacidi di regioni Tag della Sequenza Espressa della proteina NIM1 e dei prodotti della proteina cDNA di quattro sequenze del gene del riso (SEQ ID NI: 4-11); i numeri corrispondono alle posizioni degli amminoacidi nella SEQ ID NO:3).

La FIGURA 9 mostra un allineamento di sequenza della sequenza della proteina NIM1 con ΙκΒα ottenuto da topo, ratto e maiale. Le barre verticali (1) sopra alle sequenze indicano l'identità degli amminoacidi tra le sequenze NIM1 e ΙκΒα (valutazione della matrice uguale 1,5); i punti doppi (:) al disopra delle sequenze indicano una valutazione di somiglianza >0,5; punti singoli (.) al disopra delle sequenze) indicano un punteggio di somiglianza inferiore a 0,5 però superiore a 0,0; e una valutazione inferiore a 0,0 indica nessuna somiglianza e non ha alcun indice al disopra delle sequenze (vedere Esempi). Le posizioni dei settori di anchirina ΙκΒα di mammiferi sono state identificate secondo de Martin et al., Gene 152, 253-255 (1995). I punti all'interno di una sequenza indicano divergenze tra le proteine NIM1 e IKBCL. Le cinque porzioni ripetitive di anchirina in ΙκΒα vengono indicate con lineette al disotto della sequenza. Gli amminoacidi vengono numerati riferendosi alla proteina NIMl con divergenze introdotte quando è opportuno. I segni più (+) vengono posti al disopra delle sequenze ogni 10 amminoacidi.

DEPOSITI

Le seguenti molecole dei vettori sono state depositate presso la American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive Rockville, MD 20852, U.S.A. nelle date indicate di seguito:

Il plasmide BAC-04 è stato depositato presso ATCC l'8 Maggio 1996 come ATCC 97543.

Il plasmide Pl-18 è stato depositato presso ATCC il 13 Giugno 1996 come ATCC 97606.

Il cosmide D7 è stato depositato presso ATCC il 25 Settembre 1996 come ATCC 97736.

BREVE DESCRIZIONE DELLE SEQUENZE NELL'ELENCO DELLE

SEQUENZE

SEQ ID NO: 1 - Sequenza genomica da 9919 bp della regione 2 del gene NIM1 nella Figura 5D.

SEQ ID NO: 2 - Sequenza genomica da 5655 bp nella Figura 6 (filamento opposto rispetto a quello della SEQ ID NO:l) che comprende la regione codificante del gene NIM1 di Arabidopsis thaliana di tipo selvaggio. SEQ ID NO: 3 - Sequenza AA della proteina NIM1 di tipo selvaggio codificata da cds della SEQ ID NO.2. SEQ ID NO: 4 - Sequenza AA da 33 a 155 della Figura 8 del riso 1.

SEQ ID NO: 5 - Sequenza AA da 215 a 328 della Figura 8 del riso 1.

SEQ ID NO: 6 - Sequenza AA da 33 a 155 della Figura 8 del riso 2.

SEQ ID NO: 7 - Sequenza AA da 208 a 288 della Figura 8 del riso 2.

SEQ ID NO: 8 - Sequenza AA da 33 a 155 della Figura 8 del riso 3.

SEQ ID NO: 9 - Sequenza AA da 208 a 288 della Figura 8 del riso 3.

SEQ ID NO: 10 - Sequenza AA da 33 a 155 della Figura 8 del riso 4.

SEQ ID NO: 11 - Sequenza AA da 215 a 271 della Figura 8 del riso 4.

SEQ ID NO: 12 - Oligonucleotide.

SEQ ID NO: 13 - Oligonucleotide.

SEQ ID NO: 14 - Oligonucleotide.

SEQ ID NO: 15 - Oligonucleotide.

SEQ ID NO: 16 - Oligonucleotide.

SEQ ID NO: 17 - Oligonucleotide.

SEQ ID NO: 18 è la sequenza di amminoacidi di ΙκΒα di topo presa dalla Figura 8.

SEQ ID NO: 19 è la sequenza di amminoacidi di ΙκΒα di ratto presa dalla Figura 8.

SEQ ID NO: 20 è la sequenza di amminoacidi di ΙκΒα di maiale presa dalla Figura 8.

SEQ ID NO: 21 è la sequenza di cDNA del gene NIM1 di Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NI: 22 e 23 sono rispettivamente la sequenza codificante del DNA e la sequenza degli amminoacidi codificata, di una forma negativa-dominante della proteina NIM1 avente residui di alanina invece di residui di serina in corrispondenza delle posizioni degli amminoacidi 55 e 59.

SEQ ID NI: 24 e 25 sono rispettivamente la sequenza codificante del DNA e la sequenza degli amminoacidi codificata, di una forma negativa-dominante della proteina NIM1 avente una delezione N-terminale.

SEQ ID NI: 26 e 27 sono rispettivamente la sequenza codificante del DNA e la sequenza degli amminoacidi codificata, di una forma negativa-dominante della proteina NIM1 avente una delezione C-terminale.

SEQ ID NI: 28 e 29 sono rispettivamente la sequenza codificante del DNA e la sequenza degli amminoacidi codificata, di una forma alterata del gene NIM1 avente delezioni di amminoacidi sia N-terminali che C-terminali.

SEQ ID NI: 30 e 31 sono rispettivamente la sequenza codificante del DNA e la sequenza degli amminoacidi codificata, del settore di anchirina di NIM1.

SEQ ID NI: da 32 fino a 39 sono inneschi di oligonucleotidi.

ESEMPI

L'invenzione viene illustrata più dettagliatamente per mezzo dei procedimenti dettagliati che seguono delle preparazioni e degli esempi che seguono. Gli esempi sono riportati unicamente a scopo illustrativo e non devono venire considerati come limitanti dell'ambito della presente invenzione.

Tecniche standard del DNA ricombinante e di clonazione molecolare qui utilizzate sono ben note nel settore e vengono descritte da Sambrook, et al., Molecular Cloning, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) e da T.J. Silhavy, M.L. Berman, e da L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e da Ausubel, F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, pubblicato da Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).

A. Caratterizzazione di mutanti niml

Esempio 1 : Linee di piante e ceppi di funghi Arabìdopsis thaliana ecotipo Isilewskija (Ws-O; numero lotto CS 2360) e semi della quarta generazione (T4) derivati da linee trasformate con T-DNA sono stati ottenuti da Ohio State University Arabìdopsis Biological Resource Center (Columbus, OH). Semi della seconda generazione (M2) derivati da piante Ws-0 sottoposte a mutagenesi con etil metan solfonato (EMS) sono state ottenute da Lehle Seeds (Round Rock. TX).

Pseudomonas syringae pv. Tornato (Pst) ceppo DC3000 contenente il gene clonato avrRpt2 [DC3000 ( avrRpt2)] è stato ottenuto da B. Staskawicz, Università della California, Berkeley, varietà patologiche di P. parasi tica e loro origini sono le seguenti: Emwa da E. Holub e I.R. Crute, Horticultural Research Station, East Mailing, Kent; Wela da A. Slusarenko e B. Mauch-Mani, Institut flir Pflanzenbiologie, Zurigo, Svizzera; e Noco da J. Parker, Sainsbury Laboratory, Norwich, Inghilterra. Colture di funghi sono state mantenute sottoponendo a coltura ogni settimana su Arabìdopsis ecotipo Ws-O, Weiningen e Col-0 per varietà patologiche di P. parasitica rispettivamente Emwa, Wela e Noco.

Esempio 2: Screen di mutanti

I semi M2 oppure T4 sono stati fatti crescere sul terreno per 2 settimane sotto la luce di 14 ore al giorno, sono state innaffiate a pioggia con INA O,33 mM (0,25 mg/ml preparato da INA al 25% sotto forma di polvere umidiiicatbile; Ciba, Basilea, Svizzera) e sono stati inoculati 4 giorni dopo mediante spruzzatura di una sospensione di conidi di P. parasi tica contenente 5-10x104 conidiospore per mi di acqua. Questo fungo normalmente è virulento sull'ecotipo Ws-0 di Arabidopsis, a meno che non venga dapprima indotta una resistenza in queste piante con acido isonicotinico (INA) oppure con un composto simile. Le piante sono state tenute in condizioni umide a 18°C per 1 settimana e quindi sono state valutate per la sporulazione del fungo. Le piante che sostenevano la crescita del fungo dopo trattamento con INA sono state selezionate come mutanti presunti.

Dopo incubazione in un ambiente ad elevata umidità, le piante con sintomi evidenti di malattia sono state identificate, tipicamente 7 giorni dopo l’infezione. Queste piante non presentavano resistenza al fungo, nonostante l'applicazione del prodotto chimico che induce resistenza ed erano così potenziali piante mutanti nim (immunità non inducibile) . Da 360.000 piante, si sono identificati 75 mutanti nim potenziali.

Queste piante mutanti potenziali sono state isolate dal terreno, sono state poste in condizioni di bassa umidità e sono state lasciate in modo che sviluppassero semi. Le piante derivate da questi semi sono state sottoposte a screening in modo identico per stabilire la sensibilità nei confronti del fungo Emwa, anche in questo caso dopo pretrattamento con INA. Le piante discendenti che presentavano sintomi di infezione sono 'state definite come mutanti nim. Si sono così identificati sei linee nim. Una linea ( niml -1 ) è stata isolata dalla popolazione T-DNA e cinque ( nim1 -2, nim1 -3, nim1 -4, nim1 -5 e nim1 -6) sono state isolate dalla popolazione EMS.

Esempio 3: Resistenza alle malattie di piante niml Acido salicilico (SA) e l'estere S-metilico dell'acido benzo(1,2,3)tiadiazol-7-carbotioico (BTH) sono composti chimici che come INA, inducono una resistenza alle malattie ad ampio spettro (SAR) in piante di tipo selvaggio. Le piante mutanti sono state trattate con SA, INA e con BTH e quindi sono state valutate per stabilire la resistenza nei confronti della Peronospora parasi tica . 'Emwa' isolato da P. Parasi tica è un isolato P.p. ossia compatibile nell'ecotipo Ws. Isolati compatibili sono quelli che sono in grado di provocare la malattia in un particolare ospite. La porzione isolata di P. parasi tica ’Noco' non è compatibile su Ws però è compatibile sull'ecotipo Columbia. I patogeni non compatibili vengono riconosciuti dall'ospite potenziale che stimola una risposta nell'ospite che inibisce lo sviluppo della malattia.

Semi di tipo selvaggio e semi per ciascuno degli alleli numi ( nim1 -1, -2, -3, - 4 , -5, -6) , sono stati seminati su mezzi di crescita MetroMix 300, ricoperti con un foglio di plastica trasparente a forma di cupola e sono stati posti a 4°C al buio per 3 giorni. Dopo 3 giorni di trattamento a 4°C, le piante sono state spostate in un fitotrone per 2 settimane. Approssimativamente, 2 settimane dopo la piantagione le pianticelle germinate avevano prodotto 4 foglie vere. Le piante sono state quindi trattate con acqua, con SA 5 mM, con BTH 300 μΜ oppure con INA 300 μΜ. I prodotti chimici sono stati applicati sotto forma di una nebbia fine in modo da coprire completamente le pianticelle impiegando un 1chromister'. Le piante di controllo trattate con acqua sono state riportate nel fitotrone di crescita mentre le piante trattate con composti chimici sono state tenute in un fitotrone separato però identico. In corrispondenza di 3 giorni dopo l'applicazione dei composti chimici, le piante trattate con acqua e con i composti chimici sono state inoculate con materiale isolato 'Emwa' compatibile. L'inoculazione con ’Noco' è stata effettuata soltanto sulle piante trattate con acqua. Dopo la inoculazione, le piante sono state coperte con un foglio di plastica trasparente a forma di cupola in modo da mantenere l'umidità elevata necessaria per avere una infezione riuscita di P. parasitica e sono state poste in una camera di crescita con temperature di 19°C di giorno/17°C di notte e con cicli di 8 ore di luce/16 ore di buio.

Per determinare la resistenza relativa dei differenti alleli nim 1 ciascun mutante è stato analizzato al microscopio in corrispondenza di diversi momenti dopo inoculazione per stabilire la crescita di P. parasitica in condizioni di crescita normale e dopo preventivo trattamento con SA, con INA oppure con BTH. Sotto ingrandimento, si poteva osservare la sporulazione del fungo in corrispondenza di stadi molto precoci di sviluppo della malattia. Si è determinata la percentuale di piante/vaso che mostrano una sporulazione in corrispondenza dei giorni 5, 6, 7, 11 e 14 dopo inoculazione e inoltre si è registrata la densità della sporulazione.

La tabella 1 mostra, per ciascuna delle linee di piante mutanti niml la percentuale di piante che ha presentato una certa quantità di conidi sulla superficie su almeno una foglia dopo infezione con 'la razza Emwa di P. parasi tica . La P. parasi tica è stata inoculata sulle piante tre giorni dopo il trattamento con acqua oppure con composti chimici. La tabella indica il numero dei giorni dopo infezione nei quali si è valutata la resistenza alla malattia.

Come viene mostrato nella tabella 1, durante una crescita normale, niml -1 , nim1 -2,, nim1 -3, nim1 -4 e nim1 -6 hanno tutti sostenuto circa la medesima velocità di crescita del fungo che era alquanto più rapida rispetto al controllo Ws-0. L'eccezione era rappresentata dalle piante nim1 -5, in cui la crescita del fungo è stata ritardata di parecchi giorni rispetto sia agli altri mutanti nim1 che al controllo Ws-O, però eventualmente tutte le piante niml-5 sono state distrutte dal fungo.

Dopo trattamento con SA, i mutanti potevano venire raggruppati in tre classi: nim1-4 e nim1 -6 hanno presentato una crescita del fungo relativamente rapida; piante nim1 -1 , nim1 -2, niml-3 hanno presentato 1na crescita del fungo alquanto più lenta, e la crescita del fungo nella piante nim1 -5 era ancora più lenta rispetto ai controlli Ws-0 non trattati. Dopo trattamento con INA oppure con BTH, i mutanti rientravano anche nelle tre classi in cui nim1 -4 era il più gravemente compromesso nella sua capacità di limitare la crescita del fungo dopo trattamento con un composto chimico; nim1 -1 , nim1 -2, nim1 -3 e nim1 -6 erano tutti moderatamente compromessi; e nim1 -5 era soltanto leggermente compromesso. In questi esperimenti, Ws-0 non supportava. la crescita del fungo dopo trattamento con INA o con BTH. Così, rispetto all'inibizione di crescita del fungo dopo trattamento con composti chimici, i mutanti rientravano nelle tre classi, nim1 -4 essendo il più gravemente compromesso, niml -1 , nim1 -2, nim1 -3 e nim1 -6 presentavano una inibizione intermedia del fungo e nim1 -5 presentava una resistenza al fungo soltanto leggermente compromessa.

La tabella 2 mostra la valutazione della resistenza alle malattie tramite valutazione dell'infezione dei diversi alleli niml e anche di piante NahG in corrispondenza dei giorni 7 e 11 dopo inoculazione con Peronospora parasitica . WsWT indica la linea originaria di tipo selvaggio Ws in cui si sono trovati gli alleli nim1. 1 diversi alleli nim1 vengono indicati nella tabella e viene indicata anche la pianta NahG.

Una descrizione della pianta NahG è stata precedentemente pubblicata (Delanev et al., Science 266, pg. 1247-1250 (1994). Arabidopsis NahG viene descritta anche nella domanda di brevetto US numero di serie 08/454.876 incorporata qui come riferimento. NahG è un gene proveniente da Pseudomonas putida che codifica un salicilato idrolasi che trasforma l'acido salicilico in catecolo, eliminando così l'accumulo di acido salicilico, un componente della transduzione di segnale necessario per la SAR nelle piante. Così, le piante di Arabidopsis NahG non presentano una SAR normale e quindi esse presentano un sensibilità molto maggiore in generale agli agenti patogeni. Tuttavia, le piante NahG rispondono ancora agli induttori chimici INA e BTH. Le piante NahG pertanto servono come tipo di controllo della sensibilità universale.

Dalla tabella 2 si può vedere che gli alleli niml -4 e niml-6 presentavano le infezionidi Peronospora parasitica più gravi; ciò era più facilmente osservabile in corrispondenza di momenti precoci. Inoltre, l'allele niml-5 ha presentato la massima risposta sia ad INA che a BTH e pertanto è stato considerato l'allele niml più debole. Le piante NahG presentavano una risposta molto buona sia a INA sia a BTH e sembravano molto simili all'allele niml-5. Tuttavia, in tempi tardivi, in corrispondenza del giorno 11 nella tabella, la resistenza alla malattia indotta nelle pianta NagH cominciava a diminuire e pertanto vi era una profonda differenza tra INA e BTH in quanto la resistenza indotta con INA diminuiva molto più rapidamente e più gravemente rispetto alla resistenza indotta nelle piante NahG con BTH. In questi esperimenti si è osservato inoltre che INA e BTH hanno indotto una resistenza molto buona in Ws verso Emwa, e gli alleli nim1 -1 , nim1 -2 e altri alleli niml non presentavano praticamente alcuna risposta verso SA oppure INA rispetto alla resistenza alle malattie.

La mancanza nelle piante niml di capacità di risposta ai prodotti chimici che inducono SAR, SA, INA e BTH implica che la mutazione è a valle del punto di entrata (punti di entrata) per questi composti chimici nella cascata di transduzione del segnale che porta ad una resistenza acquisita sistemica.

Esempio 4: Analisi Northern della espressione del gene SAR Poiché SA, INA e BTH non hanno indotto SAR oppure l'espressione del gene SAR in una qualsiasi delle piante niml , era interessante ricercare se l'infezione patogena potesse indurre una espressione del gene SAR in queste piante come avviene in piante di tipo selvaggio. Così, l'accumulo di mRNA del gene SAR è stato anche utilizzato come criterio per caratterizzare i differenti alleli niml .

Semi di tipo selvaggio e semi per ciascuno degli alleli niml (nim1 -1 , -2, -3, -4, -5, -6) sono stati seminati su mezzi di crescita MetroMix, sono stati ricoperti con un foglio di plastica trasparente a forma di cupola e sono stati posti a 4°C al buio per 3 giorni. Dopo 3 giorni di trattamento a 4°C, le piante sono state portate in un fitotrone per 2 settimane. In corrispondenza di circa due settimane dopo la piantagione, le pianticelle germinate avevano prodotto 4 foglie vere. Le piante sono state quindi trattate con acqua, con SA 5 mM,, con BTH 300 μΜ oppure con INA 300 μΜ. I prodotti chimici sono stati applicati sotto forma di una nebbia fine, in modo da coprire completamente le pianticelle impiegando un 'chromister '. Le piante di controllo trattate con acqua sono state riportate nel fitotrone di crescita mentre le piante trattate chimicamente sono state tenuta in un fitotrone separato però identico. In corrispondenza di 3 giorni dopo l'applicazione del composto chimico,, le piante trattate con acqua e trattate chimicamente sono state inoculate con sostanza isolata Emwa compatibile. La inoculazione con Noco è stata effettuata soltanto su piante trattate con acqua. Dopo inoculazione, le piante sono state ricoperte con un foglio di plastica chiaro a forma di cupola in modo da mantenere una umidità elevata richiesta per una infezione effettiva di P. parasi tica e sono state poste in una camera di crescita con temperature di 19°C durante il giorno/ 17°C durante la notte e con cicli di 8 ore di luce/16 ore di buio. Il RNA è stato estratto dalle piante 3 giorni dopo il trattamento con acqua<' >oppure con un composto chimico, oppure 14 giorni dopo inoculazione con la sostanza isolata Emwa di P. parasitica . Il RNA è stato frazionato in base alle dimensioni mediante elettroforesi su gel di agarosio ed è stato trasferito su membrane GeneScreen Plus (DuPont).

Le figure 1-3 presentano diversi blot di gel di RNA che indicano che SA, INA e BTH non hanno indotto nè SAR nè espressione del gene SAR in piante niml . Nella figura 1, blot replicati sono stati ibridizzati con sonde del gene di Arabidopsis PR-1, PR-2 e PR-5 come descritto in Uknes et al . , (1992). Al contrario, nel caso di piante di tipo selvaggio composti chimici non hanno indotto l'accumulo di RNA da uno qualsiasi di questi 3 geni SAR in piante

Come viene mostrato nella figura 2, l'infezione da parte del patogeno (Emwa) di piante Ws-0 di tipo selvaggio ha indotto una espressione del gene PR-1 entro 4 giorni dopo l'infezione. Tuttavia, in piante niml-1, l'espressione del gene PR-1 non è stata indotta fino a 6 giorni dopo l'infezione ed il livello era diminuito rispetto al tipo selvaggio in quel momento<'>. Così, dopo infezione con un agente patogeno, l'espressione del gene PR-1 in piante niml -1 è stata ritardata ed era minore rispetto al tipo selvaggio.

Il blot di gel di RNA riportato nella figura 3 mostra che mRNA di PR-1 si accumula in corrispondenza di livelli elevati dopo trattamento di piante di tipo selvaggio con SA, INA oppure con BTH oppure dopo infezione con P. parasitica . Nelle piante niml -1 , niml -2 e niml -3, 1'accumulo di mRNA di PR-1 era drasticamente diminuito rispetto al tipo selvaggio dopo trattamento chimico. Il mRNA di PR-1 era anche minore dopo infezione con P. parasi tica però vi era ancora un certo accumulo in questi mutanti. Nelle piante niml -4 e niml -6, l'accumulo di mRNA di PR-1 era più gravemente ridotto rispetto agli altri alleli dopo trattamento chimico (evidente in esposizioni più lunghe) e PR-1 mRNA significativamente minore si era accumulato dopo infezione con P. parasi tica il che conferma l'idea che questi sono alleli niml particolarmente forti. L'accumulo di mRNA di PR-1 è aumentato nel mutante nim1 -5, ma soltanto blandamente indotto dopo trattamento con composti chimici oppure dopo infezione con P. parasi tica . In base all'ac-cumulo di PR-1 mRNA e in base all'infezione del fungo, si è stabilito che i mutanti rientrano nelle tre classi; alleli gravemente compromessi ( nim1 -4 e nim1 -6) , alleli moderatamente compromessi ( nim -1 ,1 nim1 -2 e niml -13) , e un allele debolmente compromesso (niml-5).

Esempio5:Determinazionedell'accumulodiSA inpiante niml L'infezione di piante di tipo selvaggio con agenti patogeni che provocano una reazione necrotica porta all'accumulo di SA nei tessuti infettati. Il SA endogeno è necessario per la trasduzione del segnale nel percorso che porta a SAR, poiché una mancanza del SA endogeno porta ad una diminuzione nella resistenza alle malattie. Ciò definisce un accumulo di SA come un marcatore nel percorso che porta a SAR (Gaffney et al, 1993, Science 261, 754-756). Il fenotipo di piante niml indica una interruzione in un componente del percorso SAR a valle di SA e a monte della induzione del gene SAR.

Le piante niml sono state esaminate per la loro capacità di accumulare SA dopo infezione con agenti patogeni. Pseudomonas syringae di pomodori ceppo DC 3000, che porta il gene avrRpt2 è stato iniettato in foglie di piante niml di 4 settimane. Le foglie sono state raccolte dopo 2 giorni per analizzare il contenuto di SA come descritto da Delaney et al, 1995, PNAS 92^ 6602-6606. Questa analisi ha dimostrato che le piante niml avevano accumulato elevati livelli di SA in foglie infettate, come viene mostrato nella figura 4. Le foglie non infettate avevano accumulato anche esse SA però non con i medesimi livelli delle foglieinfettate in modo simile a quanto è stato osservato in A rabidopsis di tipo selvaggio. Ciò sta ad indicare che la mutazione nim nella mappa è situata a valle del marcatore SA nel percorso di trasduzione del segnale. Inoltre, si è dimostrato che INA e BTH (inattivi in piante niml ) stimolano un componente nel percorso SAR a valle di SA (Vernooij et al. (1985); Friedrich, et al. (1996); e Lawton, et al. (1996)). Inoltre, come descritto sopra, SA applicato in modo esogeno non ha protetto piante nim da una infezione con Emwa.

Esempio 6: Analisi genetica

Per determinare il carattere dominante dei diversi mutanti che presentano il fenotipo niml, polline proveniente da piante di tipo selvaggio è stato trasferito negli stimmi di niml -1 , -2, - 3 , -4, -5, -6. Se la mutazione è dominante, allora si osserverà il fenotipo niml nelle risultanti piante FI. Se la mutazione è recessiva, allora le piante FI che si ottengono presenteranno un fenotipo di tipo selvaggio .

I dati presentati nella tabella 3 mostrano che quando niml -l r -2, -3, -4 e -6 sono stati incrociati con il tipo selvaggio, le piante FI che si ottengono presentavano il fenotipo di tipo selvaggio. Così, queste mutazioni sono recessive. Al contrario, i discendenti FI di tipo selvaggio incrociato con niml -5 presentavano tutti il fenotipo niml il che sta ad indicare che questa è una mutazione dominante. Dopo trattamento con INA, non si è osservata alcuna sporulazione di P. parasitica su piante di tipo selvaggio, mentre le piante FI hanno sostenuto la crescita ed una certa sporulazione di P. parasitica . Tuttavia, il fenotipo niml in queste piante FI era meno forte rispetto a quello osservato quando niml -5 era omozigote.

Per determinare l'atletismo, il polline proveniente da piante mutanti nim1 -1 resistenti alla canamicina è stato trasferito negli stimmi di niml -2, · -3, -4, -5, -6. I semi ottenuti dall'incrocio sono stati piantati su piastre Murashige-Skoog B5 contenenti canamicina in concentrazione di 25 μg/ml per verificare l'origine ibrida del seme. Le piante (FI) resistenti alla canamicina sono state trasferite nel terreno e sono state valutate per il fenotipo niml . Poiché i discendenti FI dell'incrocio del mutante nim1-5 con il tipo selvaggio Ws presenta un fenotipo nim1, si è effettuata anche l'analisi di niml-5 X nim1 -1 F2.

Come mostrato in tabella 3, tutte le piante FI ottenute presentavano il fenotipo niml . Così, la mutazione nel niml -2 , - 3 , -4 r -5, -6 non è stata complementata con il niml -1 ; queste piante rientrano tutte nel medesimo gruppo di complementazione e pertanto sono alleliche. I discendenti F2 dall'incrocio niml -5 X nim1 -1 presentavano anche essi il fenotipo niml confermando .che niml -5 è un allele niml .

a Numero di piante con elevato accumulo di PR-1 mRNA e assenza di P. parasi tica dopo trattamento con INA Numero di piante senza accumulo di PR-1 mRNA e presenza di P. parasi tica dopo trattamento con INA Tipo selvaggio indica il ceppo Ws-0 di tipo seivaggio .

B. Mappatura della mutazione nìm1

La mappatura della mutazione nim1 viene descritta esaurientemente e dettagliatamente nella domanda di brevetto U. S . della Richiedente NO . di serie 08/173.559 depositata il 27 dicembre 1996 che viene incorporata qui come riferimento nella sua interezza Esempio 7: Identificazione di marcatori nel locus NIM1 e mappatura genetica del locus NIM1

Per determinare una posi zione approssimativa

nella mappa per NIM1 , 74 piante F2 nim provenienti da un incrocio tra nim1 -1 (Ws-O) e Landsberg erecta (Ler) sono state identificate per la loro sensibilità a P. parasi tica e per la mancanza di accumulo di PR-1 mRNA dopo trattamento con INA. Utilizzando marcatori di polimorfismo semplice per la lunghezza della sequenza (SSLP) (Belle e Ecker 1994), si è stabilito che niml -1 si trova circa 8,2 centimorgan (cM) da nga 128 e 8,2 cM da nga 111 sul braccio inferiore del cromosoma 1. Inoltre, si è determinato che niml -1 si trova tra nga 111 e circa 4 cM dal marcatore SSLP, ATHGENEA (figura 5A).

Per una mappatura a struttura fine 1138 piante nim provenienti da una popolazione F2 derivata da un incrocio tra niml -1 e Ler DP23 sono state identificate in base sia alla loro capacità di accumulare PR-1 mRNA che in base alla loro capacità di sostenere la crescita del fungo dopo trattamento con INA. Il DNA è stato estratto da queste piante ed è stato valutato per il carattere zigotico in corrispondenza sia di ATHGENEA che in corrispondenza di nga 111. Come viene mostrato nella figura 5A, 93 cromosomi ricombinanti sono stati identificati tra ATHGENEA e niml-1, ottenendo una distanza genetica di circa 4,1 cM (93 su 2276), e 239 cromosomi ricombinanti sono stati identificati tra nga 111 e niml -1, il che sta ad indicare una distanza genetica di circa 10,5 cM (239 su 2276). Ricombinanti informativi nell'intervallo tra ATHGENEA e ngalll sono stati ulteriormente analizzati adottando una analisi di polimorfismo sulla lunghezza di un frammento amplificato (AFLP) (Vos et al., 1995).

I marcatori AFLP compresi tra ATHGENEA e ngalll sono stati identificati e sono stati usati per costruire una mappa a bassa risoluzione della regione (figure 5A e 5B). I marcatori AFLP, W84.2 (1 cM da niml-2) e W85.1 (0,6 cM da niml -1) sono stati usati per isolare cloni del cromosoma artificiale di lievito (YAC) ottenuto dalla biblioteca CIC (for Centre d'Etude du Polymorphisme Humain, INRA and CNRS) (Creusot et al., 1995). Due cloni YAC, CIC12H07 e CIC12F04 sono stati identificati con W84.2 e due cloni YAC CIC7E03 e CIC10G07 sono stati identificati con il marcatore W85.1 (figura 5B). Per collegare a ponte il 'gap' tra le due serie di cloni YAC fiancheggianti, cloni di cromosoma artificiale batterico (BAC) e PI che si sovrapponevano a CIC12H07 e CIC 12F04 sono stati isolati e sono stati mappati e si sono effettuati stadi di spostamento sequenziale estendendo il contig BAC/P1 verso NIM1 (figura 5C; Liu et al., 1995; Chio et al., 1995). Durante lo spostamento si sono sviluppati nuovi AFLP che erano specifici per il cloni BAC oppure PI e questi sono stati usati per determinare se il gene NIM1 era stato incrociato. NIM1 era stato incrociato quando si sono isolati i cloni BAC e PI che hanno dato origine ai due marcatori AFLP, L84.6a e L84.8. Il marcatore AFLP, L84.6a trovato su cloni PI, Pl-18, Pl-17 e Pl-21 hanno identificato tre ricombinanti e L84.8 trovato su cloni PI, Pl-20, Pl-22, Pl-23 e Pl-24 e cloni BAC, BAC-04, BAC-05 e BAC-06 hanno identificato un ricombinante. Poiché questi cloni si sovrapponevano per formare un grande contig (>100 kb), e comprendevano marcatori AFLP che fiancheggiavano niml, si è determinato che il gene era localizzato sul contig. I cloni BAC e PI che comprendevano il contig sono stati usati per generare ulteriori marcatori AFLP che dimostravano che il niml era localizzato tra L84.Y1 e L84.8, che rappresenta un gap di circa 0,09 cM.

C.Isolamentodelgene NIM1

Esempio8:Costruzionediuncontigcosmide

Si è costruita una teca di cosmidi della regione NIM1 nel vettore cosmide T-DNA compatibile con Agrobacteriura, pCLD04541 impiegando DNA purificato con CsC1 ottenuto da BAC-06, BAC-04 e Pl-18. I DNA dei tre cloni sono stati mescolati in quantità equimolari e sono stati parzialmente sottoposti a digestione con l'enzima di restrizione Sau3a. I frammenti da 20-25 kb sono stati isolati utilizzando un gradiente di saccarosio, sono stati riuniti e sono stati completati con dATP e dGTP. Il plasmide pCLD04541 è stato usato come vettore-cosmide del T-DNA. Questo plasmide contiene un replicone basato su pRK290 ad ampio spettro di adattabilità per l'ospite, un gene di resistenza alla tetraciclina per una selezione batterica, ed il gene nptll per la selezione su piante. Il vettore è stato scisso con Xhol ed è stato completato con dCTP e dTTP. I frammenti preparati sono stati quindi legati nel vettore. La miscela di legatura è stata impaccata e trasdotta nel ceppo di E. coli XL-1 blu MR (Stratagene). I trasformanti ottenuti sono stati valutati per la ibridazione con i cloni BAC-04, BAC-06 e Pl-18 ed i cloni positivi sono stati isolati. Il DNA del cosmide è stato isolato da questi cloni ed il DNA stampo è stato preparato impiegando i ECs EcoRI/Msel é HindlII/Msel. I modelli di impronta AFLP ottenuti sono stati analizzati per determinare l'ordine dei cloni dei cosmidi. Si è selezionata una serie di 15 cosmidi semi-sovrapponenti che circondavano la regione nim (figura 5D). I DNA del cosmide sono stati quindi sottoposti a restrizione con EcoRI, PstI, BssHII e SgrAI. Ciò ha consentito la valutazione delle dimensioni dell'inserto del cosmide e la verifica delle sovrapposizioni tra i diversi cosmidi come è stato determinato mediante 'fingerprinting' di AFLP.

La mappatura fisica ha dimostrato che la distanza fisica tra L84.Y1 e L84.8 era >90 kb, ottenendo una distanza da genetica a fisica di ~ 1 megabase per cM. Per facilitare l'identificazione del gene NIM1, è stata determinata la sequenza del DNA di BAC-04.

Esempio9:Identificazionediunclonechecontieneilgene NIM1 I cosmidi generati da cloni che circondano la regione NIM1 sono stati fatti muovere in Agrobacterium tumefaciens AGL-1 tramite trasferimento coniugato in un appaiamento tri-parentale con il ceppo helper HB101 (pRK2Q13). Questi cosmidi sono stati quindi usati per trasformare una linea di Arabidopsis niml-1 sensibile alla canamicina utilizzando una infiltrazione sotto vuoto (Bechtold et al., 1993; Mindrinos et al., 1994). I semi ottenuti da piante infiltrate sono state raccolti e sono stati lasciati germinare su piastre di agar GM contenenti 50 mg/ml di canamicina come agente di selezione. Soltanto le pianticelle che sono state trasformate con DNA del cosmide potevano detossificare l'agente di selezione e sopravvivere. Le pianticelle che sono sopravvissute alla selezione sono state trasferite nel terreno circa 2 settimane dopo la piantagione e sono state esaminate per il fenotipo niml come descritto di seguito. Le piante trasformate che non avevano più il fenotipo niml identificavano un cosmide (cosmidi) contenente un gene NIM1 funzionale.

Esempio 10:complementazionedelfenotipo nim 1 Le piante trasferite nel terreno sono state fatta crescere in un fitotrone per circa una settimana dopo il trasferimento. Si è applicato INA 300 μΜ sotto forma di una nebbia fine per coprire completamente le piante impiegando un 'chromister' Dopo due giorni, le foglie sono state raccolte per l'estrazione del RNA e per l'analisi dell'espressione di PR-1. Le piante sono state quindi spruzzate con Peronospora parasitica (Emwa isolato) e sono state fatte crescere in condizioni di umidità elevata in una camera 'di crescita con temperature di 19°C durante il giorno/17°C durante la notte e cicli di 8 ore di luce/16 ore di buio. Da otto a dieci giorni dopo l'infezione con il fungo, le piante sono state valutate e sono state classificate positive oppure negative per la crescita del fungo. Le piante Ws e nim1 sono state trattate nel medesimo modo in modo che servissero come controlli per ciascun esperimento.

Il RNA totale è stato estratto dal tessuto raccolto impiegando un tampone di estrazione Lici/ fenolo (Verwoerd, et al. 1989). I campioni di RNA sono stati fatti muovere su gel di agarosio/formaldeide e sono stati trasportati 'blotted' su membrane GeneScreen Plus (DuPont). I blot sono stati ibridizzati con una sonda di PR-1 cDNA <32>P-marcata. I blot ottenuti sono stati esposti ad una pellicola per determinare quali trasformanti erano in grado di indurre l'espressione di PR-1 dopo trattamento con INA. I risultati sono riassunti nella tabella 4 che mostra la complementazione del fenotipo niml con i cloni di cosmidi D5, E1 e D7.

Esempio 11: Sequenziazione della regione del gene NIMI

DNA di BACO4 (25 pg, ottenuto da KeyGene) era la sorgente di DNA usato per l'analisi della sequenza, poiché questo BAC era il clone che comprende completamente la regione che ha complementato i mutanti niml . Il DNA di BAC04 è stato tagliato in modo casuale in un nebulizzatore in modo da generare frammenti aventi una lunghezza media di circa 2 kb. Le estremità dei frammenti tagliati sono state sottoposte a riparo ed i frammenti sono stati purificati. Il DNA preparato è stato collegato con pBRKanF4 sottoposto a digestione con EcoRV (un derivato di pBRKabF1 (Bhat 1993)). Le colonie resistenti alla canamicina ottenute sono state selezionate per l'isolamento del plasmide impiegando il sistema Wizard Plus 9600 Miniprep (Promega). I plasmidi sono stati sequenziati adottando il metodo chimico del terminatore di colorante (Applied BioSystems, Foster City, CA) con inneschi destinati a sequenziare entrambi i filamenti dei plasmidi (M13-21 in avanti e T7 inverso, Applied BioSystems). I dati sono stati raccolti su un sequenziatore del DNA ABI377. Le sequenze sono state esposte e sono state assemblate in conting impiegando Sequencher 3.0 (GeneCodes Corp., Ann Arbor, MI), i programmi di assemblaggio del genoma Staden, phred, phrap e crossmatch (Ohil Green, Washington University, St. Louis, HO) e consed (David Gordon, Washington University, St. Louis, MO). Il DNA ottenuto dai cosmidi che si è trovato complementava la mutazione niml -1 è stato sequenziato impiegando inneschi progettati da Oligo 5.0 Primer Analysis Software (National Biosciences, Ine., Plymouth, MN). La sequenziazione del DNA ottenuto da alleli Ws-0 e niml e dai cDNA è stata effettuata essenzialmente come descritto sopra.

Mediante analisi di complementazione si è identificata una regione di circa 9,9 kb definita dalla sovrapposizione di cosmidi E1 e D7 che conteneva la regione niml . Gli inneschi che fiancheggiavano il sito di inserimento del vettore e che erano specifici per lo scheletro del cosmide sono stati progettati impiegando Oligo 5,0 Primer Analysis Software (National Biosciences, Ine.). Il DNA è stato isolato dai cosmidi D7 e E1 impiegando una modifica del metodo con acetato di ammonio (Traynor P.L., 1990. BioTechniques 9(6): 676). Questo DNA è stato direttamente sequenziato adottando il metodo chimico del terminatore di colorante di cui sopra. La sequenza ottenuta ha consentito la determinazione dei punti terminali della regione di complementazione. La regione definita dalla sovrapposizione dei cosmidi E1 e D7 viene presentata come SEQ ID NO. 1.

Si è costruita anche una versione troncata del frammento BamHI-EcoRV ottenendo come risultato un construtto che non conteneva niente della regione del 'gene 3' (figura 5D). A causa della presenza di siti HindlII nella regione Bam-Spe del DNA era necessario il seguente sistema. Il costrutto BamHI-EcoRV è stato completamente sottoposto a digestione con Spel, quindi è stato scisso in due reazioni separate per una doppia digestione. Una porzione è stata sottoposta a digestione con BamHI, l'altra con HindlII. Dai gel di agarosio si sono isolati un frammento BamHI-Spel di 2816 bp ed un frammento HindlII-Spel di 1588 bp (kit di estrazione QiaQuick Gel) e sono stati sottoposti a collegamento con pSGCGOl sottoposto a digestione con BamHI-HindlII. Il DH5a è stato trasformato con la miscela di legatura. Le colonie ottenute sono state valutate per l'inserimento corretto mediante digestione con HindlII dopo preparazione del DNA impiegando Wizard Magic MiniPreps (Promega). Un clone contenente il construtto corretto è stato sottoposto ad elettroporazione nel ceppo GV3101 di Agrobacterium per la trasformazione in piante di Arabidopsis .

Esempio 12:Analisidellasequenzaesub-clonazionedellaregione NIMJ La regione da 9,9 kb contenente il gene NIM1 è stata analizzata per la presenza di schemi di lettura aperti in tutti e sei gli schemi impiegando Sequencher 3.0 e la confezione GCG. Si sono identificate quattro regioni contenenti grandi ORF come geni possibili (regioni dei geni 1-4 nella figura 5D). Queste quattro regioni sono state amplificate mediante PCR dal DNA dell'origine di tipo selvaggio e da sei varianti alleliche niml differenti, niml-1, -2, -3, -4, -5 e -6. Gli inneschi per queste amplificazioni sono stati selezionati impiegando Oligo 5.0 (National Biosciences, Ine.) e sono stati sintetizzati mediante Integrated DNA Technologies, Ine. I prodotti della PCR sono stati separati su gel di agarosio a 1,03⁄4 e sono stati purificati impiegando il kit di estrazione del gel QlAquick. I prodotti di PCR genomici purificati sono stati direttamente sequenziati impiegando gli inneschi usati per l'amplificazione iniziale e con ulteriori inneschi destinati a sequenziare attraverso eventuali regioni non coperte dagli inneschi iniziali. La copertura media per queste regioni del gene era circa 3,5 letture/base.

Le sequenze sono state .manipolate 'edited' e sono state assemblate impiegando Sequencher 3,0. I cambiamenti delle basi specifici per i diversi alleli niml sono stati identificati soltanto nella regione denominata Regione 2 del Gene, come viene mostrato di seguito nella tabella 5 che mostra variazioni della sequenza tra tutti e sei gli alleli niml .

Le posizioni elencate nella tabella si riferiscono alla SEQ ID NO: 1. Tutti gli alleli nim -1 fino a nim1 -6 sono il ceppo WS. Il Columbia-0 rappresenta il tipo selvaggio.

È evidente che il gene NIM1 si trova all'interno della regione 2 del gene poiché vi sono cambiamenti degli amminoacidi oppure alterazioni di sequenza all'interno dello schema di lettura aperto della regione 2 del gene in tutti e sei gli alleli niml . Contemporaneamente, almeno uno degli alleli niml non mostra cambiamenti negli schemi di lettura aperti all'interno delle regioni 1, 3 e .4 del gene. Pertanto, la sola regione del gene all'interno della regione da 9,9 kb che potrebbe contenere il gene NIM1 è la regione 2 del gene.

Il capoverso Ws della tabella 5 indica i cambiamenti nell'ecotipo Ws di Arabidopsis in confronto all'ecotipo Columbia di Arabidopsis. Le sequenze qui presentate si riferiscono all'ecotipo Columbia di Arabidopsis che contengono il gene di tipo selvaggio negli esperimenti qui descritti. I cambiamenti vengono elencati come cambiamenti di amminoacidi all'interno della regione 2 del gene (la regione niml) e vengono elencati come cambiamenti in coppie di basi in altre regioni.

La regione del cosmide contenente il gene niml è stata delineata da un frammento di restrizione BamHl-EcoRV da ~5,3 kb. Il DNA del cosmide ottenuto da D7 e il DNA del plasmide ottenuto da pBlueScriptII(pBSII) sono stati sottoposti a digestione con BamHI e con EcoRV (NEB). Il frammento da 5,3 kb ottenuto da D7 è stato isolato da gel di agarosio ed è stato purificato usando il kit di estrazione QlAquick gel (# 28796, Qiagen). Il frammento è stato sottoposto a legatura durante la notte al pBSII sottoposto a digestione con Bam-EcoRV e la miscela sottoposta a legatura è stata trasformata nel ceppo DH5a di E. coli . Le colonie contenenti l'inserto sono state selezionate, il DNA è stato isolato e si è ottenuta una conferma mediante digestione con HindlII. Il frammento Bam-EcoRV è stato quindi introdotto mediante ingegneria genetica in un vettore binario (pSGCGOl) per la trasformazione in Arabidopsis.

Esempio 13:AnalisiNortherndellequattroregionidelgene I blot Northern identici sono stati preparati da campioni di RNA isolati da linee Ws e niml trattate con acqua, SA, BTH e con INA come descritto in prece-denza in Delaney, et al. (1995). Questi blot sono stati ibridizzati con prodotti di PCR generati dalle quattro regioni del gene identificate nella regione del gene NIM1 da 9,9 kb (SEQ ID NO: 1)..Soltanto la regione del gene contenente il gene NIM1 (regione 2 del gene) presentava una ibridazione rilevabile con i campioni di RNA, iì che sta ad indicare che soltanto la regione NJM1 contiene un gene trascritto rilevabile (figura 5D e tabella 5).

Esempio 14:complementazioneconlaregione2delgene Si è inoltre dimostrato che la regione 2 del gene (figura 5D) conteneva il gene NIM1 funzionale effettuando ulteriori esperimenti di complementazione. Un frammento di DNA genomico BamHI/HindlII contenente la regione 2 del gene è stato isolato dal cosmide D7 ed è stato clonato nel vettore binario pSGCGOl contenente il gene per la resistenza alla canamicina. Il plasmide ottenuto è stato trasformato nel ceppo GV3101 di Agrobacterium e le colonie positive sono state selezionate su canamicina. Il PCR è stato usato per verificare che la colonia selezionata contiene il plasmide. Le piante niml-1 sensibili alla canamicina sono state infiltrate con questo batterio come precedentemente descritto. I semi ottenuti sono stati raccolti e sono stati piantati su agar GM contenente 50 ug/ml di canamicina. Le piante che sono sopravvissute alla selezione sono state trasferite nel terreno e sono state esaminate per la complementazione . Le piante trasformate e piante di controllo Ws e niml sono state spruzzate con INA 300 μΜ. Dopo due gironi, le foglie sono state raccolte per l'estrazione del RNA e per l'analisi dell'espressione di PR-1. Le piante sono state quindi spruzzate con Peronospora parasi tica (Emwa isolato) e sono state fatte crescere come descritto in precedenza. 10 giorni dopo l'infezione con il fungo, le piante sono state esaminate e sono state valutate positive oppure negative per la crescita del fungo. Tutte le 15 piante trasformate come anche i controlli Ws erano negativi per la crescita del fungo dopo trattamento con INA mentre i controlli niml erano positivi per la crescita del fungo. Il RNA è stato estratto ed è stato analizzato come descritto sopra per questi traformanti e per i controlli. I controlli Ws e tutti e 15 i trasformanti hanno presentato l'induzione del gene PR-1 dopo trattamento con INA mentre i controlli niml non presentavano una induzione di PR-1 con INA.

Esempio 15.isolamentodiuncDNA di NIMl Una teca di cDNA di Arabidopsis costruita nel vettore di espressione IYES (Elledge et al., 1991, PNAS 88, 1731-1735) è stata seminata in piastra e si sono effettuati spostamenti ('lift') di placche. I filtri sono stati ibridizzati con un prodotto di PCR <32>P-marcato, generato dalla regione 2 del gene {figura 5D). Da uno screening di circa 150.000 placche si sono identificati 14 positivi. Ciascuna placca è stata purificata e il DNA del plasmide è stato recuperato. Inserti di cDNA sono stati sottoposti a digestione per rimuoverli dal vettore impiegando EcoRI, sono stati purificati su gel di agarosio e sono stati sequenziati. La sequenza ottenuta dal cDNA più lungo viene indicata in SEQ ID N: 2 e nella figura 6. Per confermare che si era ottenuta l'estremità 5' del cDNA, si è usato un kit Gibco BRL 5' RACE seguendo le istruzioni del produttore. I prodotti RACE ottenuti sono stati sequenziati e si è trovato che comprendevano le ulteriori basi indicate nella figura 6. La regione trascritta presente in entrambi i cloni cDNA e rivelati nella RACE viene mostrata con lettere maiuscole nella figura 6. I cambiamenti negli alleli vengono mostrati al di sopra del filamento del DNA. Le lettere maiuscole indicano la presenza della sequenza in un clone di cDNA oppure rivelato dopo RACE PCR.

I medesimi campioni di RNA prodotti negli studi di induzione (figura 3) sono stati anche analizzati mediante sonda, con il gene NIM1 impiegando come sonda un clone di cDNA a lunghezza completa. Nella figura 7 si può vedere che INA ha indotto il gene NIM1 nell'allele Ws di tipo selvaggio. Tuttavia, l'allele della mutazione niml -1 presentava una espressione di livello basale inferiore del gene NIM1 e non era inducibile con INA. Ciò era simile a quello che è stato osservato nell'allele niml -3 e nell’allele niml -6. L'allele niml -2 presentava circa livelli normali nel campione non trattato e presentava una induzione simile a quella del campione di tipo selvaggio come avveniva con l'allele niml -4. Sembrava che l'allele niml-5 presentasse una espressione di livello basale superiore del gene MIMI ed una espressione molto più forte quando veniva indotto con induttori chimici.

D. Omologhi di NIM1

Esempio 16:ricercaBLAST conlasequenza NIMI

E’ stato costruito un allineamento di sequenze multiple impiegando Clustal V (Higgins, Desmond G., e Paul M. Sharp (1989), Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer, CABIOS 5:151-153) come parte del DNA* (1228 South Park Street, Madison Wisconsin, 53715) Lesergene Biocomputing Software package for thè Macintosh (1994). Certe regioni nella proteina NIMI sono omologhe nella sequenza degli amminoacidi a 4 differenti prodotti di proteina del cDNA del riso. Le omologie sono state identificate impiegando le sequenze NIMI in una ricerca GenBank BLAST. I confronti delle regioni di omologia in NIMI e nei prodotti di cDNA del riso vengono mostrati nella figura 8 (vedere anche SEQ ID N: 3 e SEQ ID NO: 4-11). I frammenti della proteina NIMI presetano da 36 a 48% di sequenze di amminoacidi identiche con i quattro prodotti del riso. ;Esempio 17:isolamentodigeniomologhidaaltrepiante ;Impiegando il cDNA di NIMI come sonda, si identificano omologhi di NIMI di Arabidopsis tramite uno screening di teche genomiche o di cDNA ottenute da differenti colture, come, senza limitazione, quelle elencate di seguito nell'esempio 22. Le tecniche standard per realizzare ciò comprendono uno screening di ibridazione di teche di DNA seminato in piastre (o placche oppure colonie; vedere per esempio Sambrook et al . , Molecular Cloning ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) e una amplificazione mediante PCR impiegando inneschi di oligonucleotidi (vedere per esempio Innis et al . , PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications ed., Academic Press (1990)). Omologhi identificati sono stati introdotti geneticamente mediante ingegneria genetica in vettori di espressione e sono stati trasformati nelle colture elencate sopra. I trasformanti vengono valutati per la resistenza alle malattie aumentata, impiegando i relativi agenti patogeni per la pianta da coltura da esaminare. ;Omologhi NIM1 Mei genomi di cetrioli, pomodori, tabacco, mais, frumento e orzo sono stati rivelati mediante analisi blot del DNA. Il DNA genomico è stato isolato da cetrioli, pomodori, tabacco, mais, frumento e orzo, sono stati sottoposti a digestione di restrizione con gli enzimi BamHI, HindlII, XbaI o Sali, sono stati separati mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8% e sono stati trasferiti su membrana di nylon mediante blotting capillare. Dopo reticolazione con UV per fissare il. DNA, la membrana è stata ibridizzata in condizioni di bassa rigorosità lauril solfato, sale di sodio; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio) a 55°C per 18-24 ore]con cDNA di NIM1 di Arabidopsis thaliana <32>P-radiomarcato. Dopo ibridazione i blot sono stati lavati in condizioni di bassa rigorosità [6XSSC per 15 min. (X3)3XSSC per 15 min. di NaCl, 15 mM di citrato di Na e sono stati esposti ad una pellicola a raggi X per visualizzare bande che corrispondono a NIM1 . ;Inoltre, per isolare omologhi si possono usare anche i tag di sequenze espresse (EST) identificati con somiglianza per il gene NIM1 come i EST di riso descritti nell'esempio 16. I EST di riso possono essere particolarmente utili per isolare omologhi di NIM1 da altre piante monocotiledoni. ;Si possono ottenere omologhi mediante PCR. In questo metodo, si effettuano confronti tra omologhi noti (per esempio riso e Arabidopsis). Le regioni con elevata somiglianza oppure con intensità di amminoacidi e di DNA vengono quindi usate per preparare inneschi per PCR. Le regioni ricche in M e W sono le migliori seguite dalle regioni ricche in F, Y, C, H, Q, K ed E poiché questi amminoacidi vengono codificati da un numero limitato di codoni. Una volta che è stata identificata una regione adatta, gli inneschi per quella regione vengono preparati con una differenza di sostituzioni nella 3° posizione del codone. Questa diversità di sostituzione nella 3° posizione può venire determinata a seconda della specie che deve venire caratterizzata. Per esempio, poiché il mais è ricco in GC, si costruiscono inneschi che utilizzano un G oppure un C nella 3° posizione, se è possibile. ;La reazione di PCR viene effettuata da cDNA oppure da DNA genomico in svariate condizioni standard. Quando è evidente una banda essa viene clonata e/o sequenziata per determinare se essa è un omologo di NIM1 . ;E. Espressione a livello elevato di NIMI che conferisce resistenza alle malattie nelle piante ;L'espressione a livello elevato del gene NIMI in piante transgeniche per conferire un fenotipo CIM viene descritta anche nella domanda di brevetto US della Richiedente NO. di serie 08/773.554 depositata il 27 dicembre 1996 che viene incorporata qui come riferimento nella sua interezza. ;Esempio 18: Espressione a livello elevato di NIMl dovuta ad un effetto del sito di inserzione ;Per determinare se uno qualsiasi dei trasformanti descritti sopra nell'esempio 10/tabella 4 aveva una espressione a livello elevato di NIMl a causa dell'effetto del sito di inserzione, trasformanti primari contenenti i cosmidi D7, D5 oppure DI (contenenti il gene NIMl) sono stati 'selfed' ed i semi T2 sono stati raccolti. I semi ottenuti da una linea El, da quattro linee D5 e da 95 linee D7 sono stati seminati nel terreno e sono stati fatti crescere come descritto sopra. Quando le piante T2 avevano almeno quattro foglie vere, una singola foglia è stata raccolta separatamente per ciascuna pianta. Il RNA è stato estratto da questo tessuto ed è stato analizzato per l'espressione di PR-1 e NIMl . Le piante sono state quindi inoculate con P. parasi tica (Emwa) e sono state analizzate per la crescita del fungo in corrispondenza di 3-14 giorni, preferibilmente 7-12 giorni dopo l'infezione. Le piante che presentavano una espressione di NIMl e PR-1 superiore rispetto al normale e che presentavano una resistenza nei confronti del fungo hanno dimostrato che una espressione a livello elevato di NIM1 conferisce un fenotipo CIM. ;La tabella 6 mostra i risultati della prova di diversi trasformanti per la resistenza alla infezione provocata da funghi. Come si può vedere dalla tabella un certo numero di trasformanti ha presentato una crescita dei funghi minore del normale e parecchi non hanno presentato affatto alcuna crescita di funghi visibile. Il RNA è stato preparato dai campioni raccolti ed è stato analizzato come descritto in precedenza (Delaney et al, 1995). I blot sono stati ibridizzati con la sonda del gene di Arabidopsis PR-1 (Uknes et al., 1992). Le linee D7-74, D5-6 e El-1 hanno presentato una precoce induzione dell'espressione del gene PR-1, per cui il mRNA di PR-1 era evidente 24 oppure 48 ore dopo il trattamento con fungo. Queste tre linee hanno dimostrato quindi una resistenza alla infezione da parte dei funghi. ; ;; Le piante sono state trattate con la parte isolata di P. parasitica Emwa e sono state valutate 10 giorni dopo. ;+, crescita del fungo normale ;+/-, crescita del fungo minore rispetto al normale negativa, nessuna crescita del fungo visibile. ;Esempio 19:Espressionedi NIMJ direttada35S Piante che esprimono in modo costitutivo il gene NIM1 vengono generate anche dalla trasformazione di piante di tipo selvaggio Ws oppure Col con il frammento genomico di Arabidopsis BamHI-HindlII (figura 6) clonato in pSGCGOl trasformato nel ceppo GV3101 di Agrobacterium (pMP90, Koncz e Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396). In un altro construtto, il cDNA di NIM1 a lunghezza completa viene clonato nel sito EcoRI di pCGNl761 ENX (Cornai et al, 1990, Plant Mol. Biol. 15, 373-381). Dal plasmide ottenuto si ottiene un frammento XbaI contenente un promotore aumentato 35S di CaMV, il cDNA dì NIM1 nell'orientamento corretto per la trascrizione ed un terminatone tml 3'. Questo frammento viene clonato nel vettore binario pCIB200 e viene trasformato in GV3101. Piante Ws oppure Col vengono infiltrate come descritto in precedenza con ciascuno di questi ceppi trasformati. Il seme che si ottiene viene raccolto e viene saminato su agar GM contenente 50 mg/ml di canamicina. Le pianticelle che sopravvivono vengono trasferite nel terreno e vengono esaminate. ;Esempio 20: Espressione diretta da 35S di NIM1 - Forma di realizzazione alternativa ;Un frammento genomico di Arabidopsis BamHI/ HindlII (figura 6: basi 1249-5655) contenente il promotore NIM1, il gene ed una sequenza a valle clonato in pSGCGOl viene sottoposto a digestione mediante endonucleasi di restrizione con Pstl e le estremità vengono rese piante con T4 polimerasi. Il frammento viene ancora sottoposto a digestione con endonucleasi di restrizione, con Spel ottenendo un frammento da 2162 bp. Il cDNA di NIM1 clonato nel sito EcoRI di pCGN1761ENX (vedere sopra) viene sottoposto a digestione mediante endonucleasi di restrizione con Noti e le estremità vengono rese piatte con T4 polimerasi. Il frammento viene ulteriormente sottoposto a digestione mediante endonucleasi dì restrizione con Spel. Il frammento NIM1 genomico da 2162 bp ottenuto sopra viene sottoposto a legatua con il vettore pCGN1761ENX contenente 91 bp del cDNA di NIM1. La cassetta di trasformazione che comprende il promotore 35S e il terminatore tml viene liberata da pCGN1761ENX mediante parziale digestione di restrizione con XbaI e viene collegata nel sito XbaI di pCIB200 defosforilato. Il plasmide ottenuto viene trasformato in GV3101 e piante Ws oppure Col vengono infiltrate come descritto in precedenza. I semi vengono seminati in piastre e le pianticelle che sopravvivono vengono selezionate come descritto sopra. ;Esempio 21 : Valutazione del fenotipo CIM nei trasformanti di espressione ad elevato livello di NIM1 ;Una foglia ottenuta da ciascun trasformante primario viene raccolta, il RNA viene isolato (Verwoerd et al., 1989, Nuc Acid Res, 2362) e viene esaminato per l'espressione di PR-1 costitutiva e per l'espres-sione NIMI mediante analisi blot del RNA (Uknes et al., 1992). Ciascun trasformante viene valutato per una risposta di resistenza alle malattie aumentata indicativa di una analisi di espressione SAR costitutiva (Uknes .et al., 1992). Sospensioni di conidi da 5-10x10<4 >spore/ml ottenute da due sostanze isolate compatibili di P. parasitica, Emwa e Noco (ossia questi ceppi di funghi provocano malattia rispettivamente sulle piante Ws-0 e Col-0 di tipo selvaggio) vengono preparate ed i trasformanti vengono spruzzati con l'opportuno prodotto isolato a seconda dell'ecotipo del trasformante. Le piante inoculate vengono fatte incubare con umidità elevata per 7 giorni. Le piante vengono valutate per la malattia in corrispondenza del giorno 7 e una singola foglia viene raccolta per l'analisi blot del RNA utilizzando una sonda che fornisce un mezzo per misurare l'infezione del fungo. ;I trasformanti che presentano un fenotipo CIM vengono ammessi alla generazione FI e le piante omozigote vengono identificate. I trasformanti vengono sottoposti ad una serie di prove di resistenza alle malattie. Si effettuano infezioni di funghi con Noco e Ewma e le foglie vengono colorate con blu di lattofenolo per identificare la presenza di ife del fungo come descritto in Dietrich et al., (1994). I trasformanti vengono infettati con un patogeno batterico Pseudomonas syringae DC3000 per valutare lo spettro di resistenza evidente come descritto in Uknes et al., (1993). Le piante non infettate vengono valutate sia per SA libero, che coniugato con glucosio e le foglie vengono colorate con blu di lattofenolo per valutare la presenza di lesioni microscopiche. Le piante resistenti vengono incrociate in modo sessuale con mutanti SAR come NahG e ndrl per stabilire la relazione epistatica del fenotipo di resistenza con altri mutanti e valutare come questi mutanti negativi dominanti di NIM1 possano influire sull'anello di retroazione SA-dipendente. ;Esempio22:Espressionealivelloelevatodi NIM1 inpiantedacoltura Quei costrutti che conferiscono un fenotipo CIM in Col-0 oppure Ws-0 e altri vengono trasformati in piante da coltura per la valutazione. Sebbene il gene NIM1 possa venire inserito in qualsiasi cellula vegetale che rientra in queste ampie classi, esso è particolarmente utile in cellule di piante da coltura come riso, 'frumento, orzo, segale, mais, patate, carote, patate dolci, barbabietola da zucchero, fagioli, piselli cicoria, lattuga, cavolo, cavolfiore, broccoli, rapa, rafano, spinaci, asparagi, cipolla, aglio, melanzana, pepe, sedano, carota, melopopone, zucca, zucchini, cetrioli, mele, pere, cotogne, meloni, susine, ciliegie, pesche, 'nectarine', albicocche, fragole, uve, lamponi, more, ananas, avocado, papaia, mango, banana, soia, tabacco, pomodori, sorgo e canna da zucchero. I trasformanti vengono valutati per stabilire una aumentata resistenza alle malattie. In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, l'espressione del gene NIM1 avviene in corrispondenza di un livello che è almeno doppio rispetto al livello di espressione del gene NIM1 piante di tipo selvaggio e preferibilmente è di dieci volte superiore rispetto al livello di espressione del tipo selvaggio. ;F. Altri impieghi generali di piante con fenotipo nim. ;Esempio23:Impiegodimutanti nim nell'analisidimalattie I mutanti nim vengono sottoposti ad attacco con numerosi agenti patogeni e si trova che sviluppano lesioni maggiori molto più rapidamente rispetto alle piante di tipo selvaggio. Questo fenotipo viene indicato come UDS (ossia sensibilità universale alle malattie) ed è il risultato dei mutanti che non sono in grado di esprimere geni SAR per conferire alle piante una difesa contro agenti patogeni. Il fenotipo UDS di mutanti nim li rende utili come piante di controllo per la valutazione dei sintomi della malattia in linee sperimentali in prove di patogenesi in campo in cui il fenotipo di resistenza naturale di cosiddette linee di tipo selvaggio può variare (ossia nei confronti di differenti agenti patogeni e di differenti patotipi del medesimo agente patogeno). Così, in un campo dove l'infezione naturale da parte di patogeni si basa sulla valutazione della resistenza di linee sperimentali, l’incorporazione nell'esperimento di lìnee di mutanti nim della specie adatta di pianta da coltura consentirebbe una valutazione del livello vero e proprio e dello spettro della gravità dell'agente patogeno, senza la variazione intrinseca nell'impiego di linee non sperimentali. ;Esempio 24: Valutazione dell'utilità di transgeni con lo scopo di valutare la resistenza alle malattie ;Mutanti nim vengono usati come piante ospiti per la trasformazione di transgenì per facilitare la loro valutazione per l'impiego nella resistenza alle malattie. Per esempio, una linea mutante nim di Arabidopsis, caratterizzata dal suo fenotipo UDS, viene usata per successive trasformazioni con geni candidati per la resistenza alle malattie consentendo così una valutazione del contributo di un singolo gene alla resistenza contro il livello di base delle piante mutanti nim UDS. ;Esempio 25: Mutanti nim come strumento per comprendere interazioni tra pianta e agente patogeno ;I mutanti nim sono utili per comprendere interazioni tra pianta e agente patogeno e in particolare per comprendere i processi utilizzati dall'agente patogeno per l'invasione di cellule vegetali. Questo è dovuto al fatto che i mutanti nim non sviluppano una risposta sistemica nei confronti dell'attacco di un agente patogeno e lo sviluppo non contrastato dell'agente patogeno è un ambiente ideale nel quale studiare la una interazione biologica con l'ospite. ;Di ulteriore significato è l'osservazione che il mutante nim ospite può essere sensibile nei confronti di agenti patogeni che normalmente non sono associati con quel particolare ospite, ma invece sono associati con un ospite differente. Per esempio, un mutante nim di Arabidopsis come niml -1 , -2, -3, -4, -5 oppure -6 viene sottoposto ad attacco con un certo numero di agenti patogeni che normalmente infettano soltanto il tabacco e si è trovato che esso è sensibile. Così, la mutazione nim che porta il fenotipo UDS, porta ad una modificazione della sensibilità di adattabilità dell'agente patogeno e ciò ha una utilità significa-tiva nella analisi molecolare, genetica e biochimica dì una interazione tra ospite e agente patogeno. ;Esempio26:Mutanti nim perl'impiegoinunoscreeningdifungicidi I mutanti nim sono particolarmente utili nello screening di nuovi composti chimici per l'attività fungicida. Mutanti nim selezionati in un particolare ospite hanno una notevole utilità per lo screening di fungicidi impiegando quell'ospite e agenti patogeni dell'ospite. Il vantaggio consiste nel fatto che il fenotipo UDS del mutante supera i problemi che si incontrano per il fatto che l'ospite è sensibile in modo differente a differenti patogeni e a differenti patotipi oppure è anche resistente nei confronti di certi agenti patogeni oppure di certi patotipi. A scopo esemplificativo, mutanti nim nel frumento potrebbero venire usati efficacemente per sottoporre a screening fungicidi nei confronti di un'ampia varietà di patogeni e patotipi del frumento poiché i mutanti non svilupperebbero una risposta di resistenza nei confronti del patogeno introdotto e non presenterebbero una resistenza differenziale nei confronti di differenti agenti patogeni che potrebbe richiedere altrimenti l'impiego di linee di frumento multiple, ciascuna opportunamente sensibile ad un particolare agente patogeno da esaminare. I patogeni del frumento di particolare interesse comprendono (senza essere limitati ad essi) Erlsyphe graminis (l'agente che provoca la muffa polverulenta), Rhizoctonia solani (l'agente che provoca 'sharp eyespob'), Pseudocercosporella herpotrichoides (l'agente che povoca 'eyespot'), Puccinina spp. (gli agenti che provocano ruggini), e Septoria nodorum. In modo simile, mutanti nim del mais sarebbero altamente sensibili nei confronti di agenti patogeni del mais e pertanto utili nello screening per fungicidi dotati di attività contro le malattie del mais. ;I mutanti nim hanno inoltre utilità per lo screening di un'ampia varietà di patogeni e di patotipi in un ospite eterologo, ossia in un ospite che normalmente può non essere entro lo spettro di infettività di un particolare patogeno per quella specie ospite e che può essere particolarmente facile da manipolare (per esempio Arabidopsis). A causa del suo fenotipo UDS, l’ospite eterologo è sensibile nei confronti di agenti patogeni di altre specie di piante, ivi comprese specie di piante da coltura importanti dal punto di vista economico. Così, a scopo esemplificativo, il medesimo mutante nim di Arabidopsis potrebbe venire infettato con un agente patogeno del frumento Erisyphe graminis (l'agente che provoca la muffa polverulenta) oppure con un agente patogeno del mais come Helminthosporium maydis e potrebbe venire usato per esaminare l'efficacia di candidati di fungicidi. Un tale sistema rappresenta notevoli miglioramenti nell'efficienza rispetto a procedimenti attualmente usati di screening di singole specie di piante da coltura e differenti varietà di specie di piante da coltura con differenti patogeni e con differenti patotipi che possono essere virulenti in modo differenziale su differenti varietà di piante da coltura. Inoltre, l'impiego di Arabidopsis presenta vantaggi a causa della sua piccola dimensione e a causa della possibilità di effettuare così un maggior numero di prove con risorse limitate di spazio. ;Esempio27:NIM1èunomolgodiΙκΒα ;Si è effettuato un allineamento di sequenze multiple tra i prodotti del gene costituiti da proteine di NIM1 e IkB mediante il quale si è stabilito che il prodotto del gene NIM1 è un omologo di ΙκΒα (figura 9). Si sono effettuate ricerche di omologia di sequenze impiegando BLAST (Atschul et al . , J. Mol . Biol . 215, 403-410 (1990)). L'allineamento di sequenze multiple è stato costruito impiegando Clustal V (Higgins et al., CABIOS 5, 151-153 (1989)) come parte del Lasergene Biocomputing Software package della DNASTAR (Madison, WI). Le sequenze usate nell'allineamento erano NIM1 (SEQ ID NO:3), ΐκΒα di topo (SEQ ID NO:18, banca del gene numero di accesso: 1022734), ΙκΒα di ratto (SEQ ID NO: 19, banca del gene numeri di accesso 57674 e X63594; Tewari et al., Nuclelc Aclds Res. 20, 607 (1992)) e ΙκΒα di maiale (SEQ ID NO:20, banca del gene numero di accesso Z21968; de Martin et al., EMBO J. 12, 2773-2779 (1983); banca del gene numero di accesso 517193, de Martin et al., Gene 152, 253-255 (1995)). I parametri usati nell'analisi Clustal erano una penalità di 'gap' di 10 ed una penalità della lunghezza di 'gap’ di 10. Le distanze di divergenza di evoluzione sono state calcolate impiegando la tabella del peso PAM 250 (Dayhoff et al., "A model of evolutionary change in proteins. Matrices for detecting distant relationships'. In Atlas of Protein Sequence and Structure, voi. 5, suppl. 3, M.O., Dayhoff, ed {National Biomedicai Research Foundation, Washington, D.C.), pg. 345-358 (1978)). Una somiglianza nei residui è stata calcolata impiegando una tabella modificata di Dayhoff (Shwartz and Dayhoff, Ά model of evolutionary change in proteins'. In Atlas of Protein Sequence and Structure, M.O. Dayhoff, ed (National Biomedicai Research Foundation, Washington, D.C.) pg. 353-358 (1979); Gribskov and Burgess, Nucleic Acids res. 14, 6745-6763 (1986)). ;Le ricerche di omologia indicano una somiglianza di NIM1 con settori della anchirina di parecchie proteine che compendono: anchirina, NF-κΒ e ΙκΒ. La migliore omologia globale è verso IKB e molecole correlate (figura 9). NIM1 contiene 2 serine in corrispondenza delle posizioni degli amminoacidi 55 e 59, la serina in corrispondenza della posizione 59 è in un contesto (D/ExxxxxS) ed è conforme come posizione (N-terminalè) con un ruolo in una degradazione inducibile mediata da ubichitina, dipendente dalla fosforilazione. Tutti i IKB hanno queste serine Nterminali e sono necessarie per una inattivazione di IKB e una successiva Cessione di NF-κΒ. Il NIM1 ha settori di anchirina (amminoacidi 262-290 e 323-371). Si ritiene che i settori di anchirina siano coinvolti in interazioni proteina-proteina e siano una caratteristica ubiquitaria di molecole IKB e NF-κΒ-. I terminali C dei IKB possono essere differenti. NIM1 presenta una certa omologia con una regione ricca in QL (amminoacidi 491-499) trovata nei terminali C di certi IKB. ;Esempio 28: Generazione di forme alterate di NIM1 - cambiamenti di residui di serina 55 e 59 in residui di alanina ;La fosforilazione di residui di serina in ΙκΒα umano è necessaria per una degradazione attivata da uno stimolo di ΙκΒα attivando così NF-κΒ. La mutagenesi dei residui dì serina (S32-S36) in ΙκΒα umano in residui di alanina, inibisce una fosforilazione indotta da uno stimolo bloccando così la degradazione di ΙκΒα mediata da protosomi (E. Britta-Mareen Traenckner et al., EMBO J. 14:2876-2883 (1995); Brown et al., Science 267: 1485-1488 (1996); Brockman et al., Molecular and Cellular Biology 15: 2809-2818 (1995); Wang et al., Science 274:784-787 (1996)). ;Questa forma alterata di ΙκΒα funziona come forma negativa dominante per conservare NF-κΒ nel citoplasma bloccando cosi a valle eventi di segnale. Sulla base di confronti di sequenze tra NIM1 e IKB, le serine 55 (S55) e 59 (S59) di NIM1 sono omologhe a S32 e S36 in ΙκΒα umano. Per costruire forme nega-tive-dominanti di NIM1, le serine in corrispondenza delle posizioni degli amminoacidi 55 e 59 mediante mutagenesi vengono trasformate in residui di alanina. Ciò può venire realizzato mediante qualsiasi metodo noto a coloro che sono esperti nel settore, come per esempio impiegando il kit di mutagenesi sito-diretta QuikChange (# 200518: Strategene). ;Impiegando un cDNA di NIM1 a lunghezza completa (SEQ ID NO:21) includendo 42 bp di una sequenza 5’ non tradotta (UTR) e 187 bp di 3' UTR, si può costruire il costrutto sottoposto a mutagenesi secondo le istruzioni del fabbricante impiegando i seguenti inneschi (SEQ ID NO:21, posizioni 192-226): ;; ;; sottolineate indicano le mutazioni. La strategia è la seguente: il cDNA di NIM1 clonato nel vettore pSE936 (Elledge et al., Proc. Nat . Acad. Sci . USA 88:1731-1735 (1991)) viene denaturato e gli inneschi che contengono le basi alterate vengono riassociati· La DNA-polimerasi (Pfu) prolunga gli inneschi mediante spostamento di non filamenti portando come risultato a filamenti circolari intagliati 'nicked'. Il DNA viene sottoposto ad una digestione mediante endonucleasi di restrizione con Dpnl, che taglia soltanto i siti metilati (DNA-stampo non sottoposto a mutagenesi) . Il DNA a doppio filamento circolare che rimane viene trasformato nel ceppo XLl-Blue di E. coli . Plasmidi provenienti dalle colonie che si ottengono vengono estratti e vengono sequenziati per verificare la presenza delle .basi trasformate mediante mutagenesi e per confermare che non sono avvenute altre mutazioni. ;Il cDNA di NIM1 sottoposto a mutagenesi viene sottoposto a digestione con la endonucleasi di restrizione EcoRI e viene clonato in pCGN1761 sotto la regolazione di trascrizione del doppio promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore. La cassetta di trasformazione che comprende il promotore 35S, cDNA di NIM1 e il terminatore tml viene liberata dal pCGN1761 mediante parziale digestione di restrizione con XbaI e viene sottoposta a legatura nel sito XbaI di pCIB200 defosforilato. Le SEQ ID NO:22 e 23 mostrano rispettivamente la sequenza codificante del DNA e la sequenza di amminoacidi codificata di questa forma alterata del gene NIM1. ;La presente invenzione comprende anche forme alterate di alleli di NIM1 in cui la sequenza codificante di un tale allele ibridizza nelle seguenti condizioni con la sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:22: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale di sodio; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore e lavaggio in 6XSSC per 15 min. (X3)3XSSC per 15 min. (X1) a 55°C. In queste forme di realizzazione, gli alleli di NIM1 che ibridizzano con la SEQ ID NO:22 in queste condizioni vengono alterati in modo che il prodotto codificato abbia alanine invece di serine nelle posizioni degli amminoacidi che corrispondono alle posizioni 55 e 59 di SEQ ID NO: 22. ;Esempio29:generazionediformealteratedi NIM1 -delezioneN-terminale La delezione degli amminoacidi 1-36 (Brockman et al., Sun et al.) o 1-72 (Sun et al.) di ΙκΒα umano che comprende K21, K22, S32 e S36 porta come risultato ad un fenotipo ΙκΒα negativo-dominante in colture di cellule umane transinfettate. Una delezione N-terminale di circa i primi 125 amminoacidi del prodotto codificato del cDNA di NIM1 rimuove otto residui di lisina che possono servire come siti potenziali di introduzione di ubiquitina e rimuove inoltre siti presunti di fosforilazione in corrispondenza di S55 e S59 (vedere esempio 2). Questo costrutto di gene alterato può venire prodotto mediante qualsiasi metodo noto a coloro che sono esperti nel settore. Per esempio, adottando il metodo di HO et al . , Gene 77:51-59 (1989), si può generare una forma NIM1 in cui viene cancellato il DNA che codifica circa i primi 125 amminoacidi. I seguenti inneschi producono un prodotto di PCR da 1612 bp (SEQ ID NO:21:418 fino a 2011): 5'-gg aat tca-ATG GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG-3' (SED ID no:34) e 5'-gga att CTA CAA ATC TGT ATA CCA TTG G-3' (SEQ ID NO: 35) in cui il codone di inizio della sintesi è sottolineato (ATG) e la sequenza- linker EcoRI è in lettere minuscole. Nella amplificazione di frammenti si utilizza una miscela di reazione che contiene da 0,1 fino a 100 ng di DNA stampo, 10 mM di Tris pH 8,3/50 mM KC1/2 mM di MgCl2/0,001% di gelatina/0,25 mM per ciascuno di dNTP/0,2 mM di ciascun innesco e 1 unità di rTth DNA polimerasi in un volume finale di 50 ml e si impiega una macchina per PCR di Perkin Elmer Cetus 9600. Le condizioni di PCR sono le seguenti: 94°C per 3 minuti: 35x (94°C 30 secondi: 52°C 1 minuto: 72°C 2 minuti): 72°C 10 minuti. Il prodotto di PCR viene clonato direttamente nel vettore pCR2.1 (Invitrogen). L'inserto generato mediante PCR nel vettore PCR viene liberato mediante digestione con endonucleasi di restrizione impiegando EcoRI e viene sottoposto a legatura nel sito EcoRI di pCGN1761 defosforilato sotto la regolazione di trascrizione del promotore 35S doppio. Il costrutto viene sequenziato per verificare la presenza del ATG di inizio sintetico e per confermare che durante la PCR non sono avvenute altre mutazioni. La cassetta di trasformazione che comprende il promotore 35S, cDNA di NIM1 modificato ed il terminatone tml viene liberata dal pCGN1761ENX mediante parziale digestione di restrizione con XbaI e viene sottoposto a legatura nel sito XbaI di pCIB200. Le SEQ ID NO: 24 e 25 mostrano rispettivamente la sequenza codificante del DNA e la sequenza degli amminoacidi codificata di una forma alterata nel gene NIM1 avente una delezione di amminoacidi N-terminale. ;La presente invenzione comprende anche forme alterate di alleli di ΝΙΜ1 in cui la sequenza codificante di un tale allele ibridizza nelle seguenti condizioni con la sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:24: ubridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3)3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C. In queste forme di realizzazione, gli alleli di MIMI che ibridizzano con SEQ ID NO;24 in queste condizioni vengono alterati in modo che il prodotto codificato ha una delezione N-terminale che rimuove residui di lisina che può servire come siti potenziali di introduzione di ubiquitina oltre alle serine in corrispondenza delle posizioni degli amminoacidi che corrispondono alle posizioni 55 e 59 del prodotto del gene di tipo selvaggio . ;Esempio30:Generazionediformealteratedi NIMJ -DelezioneC-terminale Si ritiene che la delezione degli amminoacidi 261-317 di ΙκΒα umano dia come risultato una stabilità intrinseca aumentata mediante bloccaggio della fosforilazione costitutiva dei residui di serina e treonina nel terminale C. Una regione ricca in serina e treonina è presente in corrispondenza degli amminoacidi 522-593 nel terminale C di NIM1. La regione codificante C-terminale del gene NIM1 può venire modificata cancellando le sequenze di nucleotidi che codificano gli amminoacidi 522-593. Adottando il metodo di Ho et al., (1989), la regione codificante c-terminale e 3' UTR del cDNA di NIM1 (SEQ ID NO:21: 1606-2011) vengono cancellati mediante PCR, generando un frammento da 1623 bp impiegando i seguenti inneschi: (SEQ ID NO:36) (SEQ ;ID NO:37) in cui un codone di arresto sintetico è sottolineato (TGA sul filamento complementare) e le sequenze del linker EcoRI sono in lettere minuscole. I componenti della reazione PCR sono come descritti in precedenza ed i parametri dei cicli sono i seguenti: 94°C 3 minuti: 30x (94°C 30 secondi: 52°C 1 minuto; 72°C 2 minuti); 72°C 10 minuti]. Il prodotto di PCR viene clonato direttamente nel Vettore pCR2.1 (Invitrogen). L'inserto generato mediante PCR nel vettore PCR viene liberato mediante digestione con endonucleasi di restrizione impiegando EcoRI e viene sottoposto a legatura nel sito EcoRI di pCGN1761 defosforilato, che contiene il promotore doppio 35S. Il costrutto viene sequenziato per verificare la presenza del codone di arresto in fase sintetico e per confermare che durante PCR non sono avvenute altre mutazioni. La cassetta di trasformazione che comprende il promotore, il cDNA di NIM1 modificato e il terminatone tml viene liberata da pCGN1761 mediante parziale digestione di restrizione con XbaI e viene sottoposta a legatura nel sito XbaI di pCIB200 defosforilato. Le SEQ ID NO: 26 e 27 mostrano rispettivamente la sequenza codificante del DNA e la sequenza di amminoacidi codificata, di una forma alterata del gene NIM1 avente una delezione di amminoacidi C-terminale. ;La presente invenzione comprende inoltre forme alterate di alleli NIM1 in cui la sequenza codificante di un tale allele ibridizza nelle seguenti condizioni con la sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:26: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaP04, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3)3xSSC per 15 minuti (XI) a 55°C. In queste forme di realizzazione, gli alleli di NIM1 che ibridizzano con SEQ ID N0:26 nelle condizioni indicate sopra vengono alterate in modo che il prodotto codificato ha una delezione C-terminale che rimuove residui di serina e treonina. ;Esempio 31 : Generazione di forme alterate di NIM1 - Chimera di delezione N-terminale/C -terminale ;Una forma di delezione N-terminale e C-terminale di NIM1 viene generata impiegando un sito di restrizione di Kpnl unico in corrispondenza della posizione 819 (SEQ ID NO:21). La forma di delezione N-terminale (esempio 3) viene sottoposta a digestione con endonucleasi di restrizione usando EcoRI/Kpnl e il frammento da 415 bp che corrisponde al terminale N modificato viene recuperato mediante elettroforesi su gel. Parimenti, la forma di delezione C-terminale (esempio 4) viene sottoposta a digesione con endonucleasi di restrizione impiegando EcoRI/Kpnl e il frammento da 790 bp che corrisponde al terminale C modificato viene recuperato mediante elettroforesi su gel. I frammenti vengono sottoposti a legatura a 15°C, vengono sottoposti a digestione con EcoRI per eliminare i concatemeri EcoRI e vengono clonati nel sito EcoRI di pCGN1761 defosforilato. La forma di delezione N/C-terminale di NIM1 si trova sotto la regolazione di trascrizione del promotore 35S doppio. In modo simile viene generata una forma chimerica di NIM1 che è costituita dai siti di fosforilazione presunti sottoposti a mutagenesi S55/S59 (esempio 2) fatti fondere con la delezione C-terminale (esempio 4). Il costrutto viene generato come descritto sopra. I costrutti vengono sequenziati per verificare l'esattezza dei codoni di inizio e di arresto e per confermare che durante la clonazione non sono avvenute mutazioni. Le rispettive cassette di trasformazione che comprendono il promotore 35S, la forma chimerica di MIMI ed il terminatore tml vengono liberate da pCGN1761 mediante parziale digestione con XbaI e vengono sottoposti a legatura nel sito XbaI di defosforilato . Le SEQ ID NO: 28 e 29 mostrano rispettivamente la sequeza codificante del DNA e la sequenza di amminoacidi codificata di una forma alterata del gene NIM1 avente delezioni di amminoacidi sia N-terminali che C-terminali. ;La presente invenzione comprende anche forme alterate di alleli di MIMI in cui la sequenza codificante di un tale allele ibridizza nelle seguenti condizioni con la sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:28: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti per 15 minuti (XI) a 55°C. In queste forme di realizzazione, gli alleli di MIMI che ibridizzano con SEQ ID NO:28 nelle condizioni di cui sopra vengono alterati in modo che il prodotto codificato ha una delezione N-terminale che rimuove residui di lisina che possono servire come siti potenziali di introduzione di ubiquitina oltre alle serine in corrispondenza delle posizioni degli amminoacidi che corrispondono alle posizioni 55 e 59 del prodotto del gene di tipo selvaggio e anche una delezione C-terminale che rimuove residui di serina e treonina. Esempio32:Generazionedialtreformealteratedi NIMl -Settoridianchirina Il NIMl presenta omologia con unità ricorrenti di anchirina in corrispondenza approssimativamente degli amminoacidi 103-362. Adottando il metodo di Ho et al., (1989), la sequenza del DNA che codifica i presunti settori di anchirina (SEQ ID NO:2: 3093-3951) viene amplificata mediante PCR (condizioni: 94°C 3 minuti: 35x (94°C 30 secondi: 62°C 30 secondi: 72 °C 2 minuti): 72°C 10 minuti) dal cDNA di NIMl (SEQ ID NO: 21: 349-1128) impiegando i seguenti inneschi ;; ;; 39) . Il prodotto ottenuto viene sottoposto a digestione con endonucleasi di restrizione impiegando EcoRI e quindi viene inserito nel sito EcoRI di pCGN1761 defosforilato sotto la regolazione di trascrizione del promotore doppio 35S. Il costrutto viene sequenziato per verificare la presenza del codone di inizio sintetico (ATG) di un codone di arresto in fase (TGA) e per confermare che durante la PCR non sono avvenute altre mutazioni. La cassetta di trasformazione che comprende il promotore 35S, settori di anchirina e il terminatore tml viene liberata da pCGN1761 mediante parziale digestione di restrizione con XbaI e viene sottoposta a legatura nel sito XbaI di pCIB200 defosforilato. Le SEQ ID NO: 30 e 31 mostrano rispettivamente la sequenza codi-ficante del DNA e la sequenza degli amminoacidi codificata del settore di anchirina di NIM1. ;La presente invenzione comprende anche forme alterate di allei! di NIM1 in cui la sequenza codificante di un tale allele ibridizza nelle seguenti condizioni con la sequenza codificante riportata in SEQ ID NO:30: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaPO4, pH7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3) 3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C. In queste forme di realizzazione, gli alleli di NIM1 che ibridizzano con SEQ ID NO:30 nelle condizioni di cui sopra vengono alterati in modo che il prodotto codificato è costituito essenzialmente dai settori di anchirina del prodotto del gene di tipo selvaggio. ;Esempio 33: Costruzione di geni chimerici Per aumentare la probabilità di una opportuna espressione spaziale e temporale di forme di NIM1 alterate, un frammento HindiII/BamHI da 4407 bp (SEQ ID NO:2: basi 1249-5655) e/o un frammento EcoRV/BamHI da 5655 bp (SEQ ID NO:2: basi 1-5655) che contiene il promotore NIM1 e il gene vengono usati per la creazione di forme NIM1 alterate negli esempi 28-32 di cui sopra. Sebbene gli stadi di costruzione possano differire, i concetti sono paragonabili a quelli degli esempi precedentemente qui descritti. Una forte iperespressione delle forme alterate potenzialmente può essere letale. Pertanto, le forme alterate del gene NIM1 descritte negli esempi 28-32 possono venire poste sotto la regolazione di promotori diversi dal promotore di NIM1 endogeno che comprendono senza essere limitati il promotore nos oppure una piccola subunità del promotore Rubisco. Parimenti, le forme di NIM1 alterate possono venire espresse sotto la regolazione del promotore che risponde ad agenti patogeni PR-1 (brevetto U.S. NO. ;5.614.395). Tale espressione consente una forte espressione delle forme NIM1 alterate soltanto sotto l'attacco di agenti patogeni oppure in altre condizioni che attivano SAR. Inoltre, la resistenza alle malattie può essere evidente nei trasformanti che esprimono forme di NIM1 alterate sotto la regolazione del promotore PR-1 quando vengono trattati con concentrazioni di composti che attivano SAR (ossia BTH oppure INA) che normalmente non attivano la SAR, attivando così un circuito di retroazione (Weymann et al-, (1995) Plant Celi 7: 2013-2022). ;Esempio 34: Trasformazione di forme alterate del NIM1 in Arabidopsis thaliana ;I costrutti generati (esempi 28-33) vengono fatti muovere in Agrobacterium tumefaciens mediante elettroporazione in un ceppo GV3101. Questi costrutti vengono usati per trasformare gli ecotipi Col-0 e Ws-0 di Arabidopsis mediante infiltrazione sotto vuoto (Mindrinos et al., Celi 78, 1089-1099 (1994)) oppure mediante trasformazione delle radici standard. I semi ottenuti da queste piante vengono raccolti e vengono lasciati germogliare su piastre di agar con canamicina (oppure con un altro antibiotico adatto) come agente di selezione. Soltanto pianticelle che vengono trasformate con DNA del cosmide possono detossificare l'agente di selezione e possono sopravvivere. Le pianticelle che sopravvivono alla selezione vengono trasferite nel terreno e vengono esaminate per il fenotipo CIM (immunità costitutiva). Le piante vengono valutate per le differenze fenotipiche osservabili in confronto a piante di tipo selvaggio. ;Esempio 35. Valutazione del fenotipo CIM in piante trasformate con forme alterate di NIM1 ;Una foglia di ciascun trasformante primario viene raccolta, il RNA viene isolato (Verwoerd et al., 1989, Nuc Acid Res, 2362) e viene esaminato per l'espressione di PR-1 costitutiva mediante analisi blot del RNA (Uknes et al., 1992). Ciascun trasformante viene valutato per una risposta di resistenza aumentata alle malattie che è indicativa di una analisi dell'espressione SAR costitutiva (Uknes et al., 1992). Sospensioni di conidi di 5-10 x IO<4 >spore/ml di parti isolate di due P. parasitica compatibili Emwa e Noco (ossia questi ceppi di fungo provocano malattie rispettivamente nelle piante di tipo selvaggio Ws-0 e Col-O), vengono preparate ed i trasformanti vengono spruzzati con i ceppi isolati opportuni a seconda dell'ecotipo del trasformante. Le piante inoculate vengono fatte incubare con elevata umidità per 7 giorni. Le piante vengono valutate per la malattia in corrispondenza del giorno 7 e si raccoglie una singola foglia per l'analisi blot del RNA impiegando una sonda che fornisce un mezzo per misurare l'infezione del fungo. ;I trasformanti che presentano un fenotipo CIM vengono portati nella generazione TI e le piante omozigote vengono identificate. I trasformanti vengono sottoposti ad una serie di prove di resistenza alla malattia come descritto di seguito. L'infezione da fungo con Noco e con Emwa viene ripetuta e le foglie vengono colorate con blu di lattofenolo per identificare la presenza di ife del fungo come descritto in Dietrich et al-, (1994). I trasformanti vengono infettati con l'agente patogeno batterico Pseudomonas syringae DC3000 per valutare lo spettro di resistenza evidente come descritto in Uknes et al. (1993). Le piante non infettate vengono valutate sia per il SA libero che per il SA coniugato con glucosio e le foglie vengono colorate con blu di lattofenolo per valutare la presenza di lesioni microscopiche . Le piante resistenti vengono incrociate sessualmente con mutanti SAR come NahG (brevetto U.S. NO. 5.614.395) e ndrl per stabilire la relazione epistatica del fenotipo di resistenza con altri mutanti e valutare come questi mutanti negativi-dominanti di NIM1 possano influire sul circuito di retroazione SA-dipendente. ;Esempio36:isolamentodiomologhidi NIM1 Usando il cDNA di NIM1 (SEQ ID NO: 21) come sonda, si identificano omologhi di NIM1 di Arabidopsis mediante uno screening di teche genomiche oppure di teche di cDNA ottenute da differenti colture come, però senza essere limitati, quelli elencati di seguito nell'esempio 11. Le tecniche standard per realizzare ciò comprendono uno screening di ibridazione di teche di DNA seminate in piastre (o placche oppure colonie; vedere per esempio Sambrook et al . , Molecular Cloninq, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) e l'amplificazione mediante PCR usando inneschi di oligonucleotidi (vedere per esempio Innis et al . , PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications ed., Academic Press (1990)). Omologhi identificati vengono geneticamente introdotti nei vettori di espressione e vengono trasformati nelle colture elencate sopra. I trasformanti vengono valutati per una aumentata resistenza alle malattie impiegando i relativi agenti patogeni della pianta da coltura da esaminare. ;Omologhi di NIM1 nei genomi di cetriolo, pomodoro, tabacco, mais, frumento e orzo sono stati messi in evidenza mediante analisi blot del DNA. Il DNA genomico è stato isolato da cetrioli, pomodori, tabacco, mais, frumento e orzo, è stato sottoposto a digestione di restrizione con gli enzimi BamHI, HindlII, Xb<'>al oppure Sali, è stato separato mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8% ed è stato trasferito su una membrana di nylon mediante blotting capillare. Dopo reticolazione con UV per fissare il DNA la membrana è stata ibridizzata in condizioni di bassa rigorosità (1% di BSA; 520mM di NaPO«, pH 7,2; 7% lauril solfato, sale di sodio; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio) a 55°C per 18-24 ore] con cDNA di MIMI di Arabidopsis thaliana 32P-radiomarcato. Dopo ibridazione i blot sono stati lavati in condizioni di bassa rigorosità [6XSSC per 15 minuti (X3)3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C; 1XSSC è 0,15M di NaCl, 15 mM di Na-citrato (pH 7,0)] e sono stati esposti alla pellicola per raggi X per visualizzare le bande che corrispondono a NIM1. ;Inoltre, si possono usare i tag di sequenza espressi (EST) identificati con somiglianza per il gene NIM1, per isolare omologhi. Per esempio, parecchi tag di sequenze, espressi del riso (EST) sono stati identificati con somiglianza per il gene NIM1. Si è costruito un allineamento di sequenza multiplo impiegando Clustal V (Higgins, Desmond G., e Paul M. Sharp (1989), Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer, CABIQS 5:151-153) come parte del DNA* (1228 South Park Street, Madison Wisconsin, 53715) Lesergene Biocomputing Software package for thè Macintosh (1994). Certe regioni della proteina NIM1 sono omologhe nella sequenza degli amminoacidi a 4 differenti prodotti di proteina di cDNA del riso. Le omologie sono state identificate impiegando le sequenze NIM1 in una ricerca GenBank BLAST. I confronti delle regioni di omologia in NIM1 e nei prodotti di cDNA del riso vengono mostrati nella figura 8 (vedere anche SEQ ID N: 3 e SEQ ID NI: 4-11). I frammenti della proteina NIM1 presentano sequenze di amminoacidi identiche per il 36-48% con i quattro prodotti del riso. Questi EST del riso possono essere particolarmente utili per isolare omologhi NIM1 da altre piante monocotiledoni.

Si possono ottenere omologhi mediante PCR. In questo metodo si effettuano confronti tra omologhi noti (per esempio riso e Arabidopsis). Le regioni di somiglianza elevata oppure di identità per gli amminoacidi e per il DNA vengono quindi usate per produrre inneschi per PCR. Le regioni ricche in residui di amminoacidi M e W sono le migliori seguite dalle regioni ricche in residui di amminoacidi F, Y, C, H, Q, K e E poiché questi amminoacidi vengono codificati da un numero limitato di codoni. Quando una regione adatta viene identificata, si preparano inneschi pér quella regione con una diversità di sostituzioni nella 3° posizione del codone. Questa diversità di sostituzione nella 3° posizione può essere ristretta a seconda della specie che viene determinata. Per esempio, poiché il mais è ricco in GC, vengono progettati inneschi che utilizzano un G oppure un C nella 3° posizione se è possibile.

La reazione di PCR viene effettuata da cDNA oppure da DNA genomico in svariate condizioni standard. Quando è evidente una banda, questa viene clonata e/o viene sequenziata per determinare se essa è un omologo di NIM1 .

Esempio 37: Forme alterate di espressione di NIM1 in piante da coltura Questi costrutti che conferiscono un fenotipo CIM in Col-0 oppure Ws-0 vengono trasformati in piante da coltura per la valutazione. Come alternativa, geni NIMI naturali alterati isolati dalle colture nell'esempio precedente vengono portati di nuovo nelle rispettive colture. Sebbene il gene NIMI possa venire inserito in qualsiasi pianta che rientra entro queste ampie classi, esso è particolarmente utile in cellule di piante da coltura come riso, frumento, orzo, segale, mais, patate, carote, patate dolci, barbabietola da zucchero, fagioli, piselli cicoria, lattuga, cavolo, cavolfiore, broccoli, rapa, rafano, spinaci, asparagi, cipolla, aglio, melanzana, pepe, sedano, carota, melopopone, zucca, zucchini, cetrioli, mele, pere, cotogne, meloni, susine, ciliegie, pesche, 'nectarine', albicocche, fragole, uva, lamponi, more, ananas, avocado, papaia, mango, banana, soia, tabacco, pomodori, sorgo e canna da zucchero. I trasformanti vengono valutati per determinare una aumentata resistenza alle malattie. In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, l'espressione della forma alterata del gene NIM1 avviene in corrispondenza di un livello che è almeno doppio rispetto al livello di espressione del gene NIM1 naturale nelle piante di tipo selvaggio e preferibilmente è di dieci volte superiore rispetto al livello di espressione del tipo selvaggio.

CITAZIONI

Le descrizioni di ciascuna delle seguenti citazioni vengono qui espressamente incorporate come riferimento nella presente descrizione:

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(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 1 :

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Una molecola di DNA che codifica una forma alterata di una proteina NIM1.
2. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 1, che agisce come regolatore negativo-dominante del percorso di trasduzione del segnale SAR.
3. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 1, in cui detta forma alterata della proteina NIM1 ha alanine invece di serine nelle posizioni degli amminoacidi che corrispondono alle posizioni 55 e 59 del SEQ ID NO: 3.
4. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 3, in cui detta forma alterata della proteina NIM1 comprende la sequenza di amminoacidi mostrata in SEQ ID NO: 23.
5. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 4, in cui detta molecola di DNA comprende la sequenza di nucleotidi mostrata in SEQ ID NO: 22 e tutto il DNA.
6. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 1 , in cui la forma alterata della proteina NIM1 è una variante troncata del prodotto del gene NIM1.
7. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 1, in cui detta forma alterata dalla proteina NIM1 ha una parte troncata N-terminale di amminoacidi corrispondenti approssimativamente alle posizioni degli amminoacidi 1-125 della SEQ ID NO: 3.
8. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 7, in cui detta forma alterata della proteina NIM1 comprende la sequenza degli amminoacidi mostrata in SEQ ID NO: 25.
9. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 8, in cui detta molecola di DNA comprende la sequenza di nucleotidi mostrata in SEQ ID NO: 24.
10. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 1, in cui detta forma alterata della proteina NIM1 ha una porzione troncata C-terminale di amminoacidi che corrispondono approssimativamente alle posizioni degli amminoacidi 522-593 della SEQ ID NO: 3.
11. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 2, in cui detta forma alterata della proteina NIM1 comprende la sequenza degli amminoacidi mostrata in SEQ ID NO: 27.
12. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 23, in cui detta molecola di DNA comprende la sequenza di nucleotidi mostrata in SEQ ID NO: 26.
13. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 1, in cui detta forma alterata della proteina NIM1 ha una porzione troncata N-terminale di amminoacidi corrispondente approssimativamente alle posizioni degli amminoacidi 1-125 di SEQ ID NO: 2 e una porzione troncata C-terminale di amminoacidi corrispondente approssimativamente alle posizioni degli amminoacidi 522-593 di SEQ ID NO: 3.
14. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 13, in cui detta forma alterata della proteina NIM1 comprende la sequenza degli amminoacidi mostrati in SEQ ID NO: 29.
15. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 14, in cui detta molecola di DNA comprende la sequenza di nucleotidi mostrata in SEQ ID NO: 28.
16. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 1, in cui detta forma alterata della proteina NIM1 è costituita essenzialmente da unità ricorrenti di anchirina che corrispondono approssimativamente alle posizioni degli amminoacidi 103-362 di SEQ ID NO: 3.
17. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 16, in cui detta forma alterata della proteina NIM1 comprende la sequenza degli amminoacidi mostrata in SEQ ID NO: 31.
18. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 17, in cui detta molecola di DNA comprende la sequenza di nucleotidi mostrata in SEQ ID NO: 30.
19. La molecola di DNA secondo la rivendicazione 1, in cui detta molecola,di DNA ibridizza nelle seguenti condizioni con una sequenza di nucleotidi scelta dal gruppo costituito da SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 E SEQ ID NO: 30: ibridazione in 1% di BSA; 520 mM di NaPO4, pH 7,2; 7% di lauril solfato, sale sodico; 1 mM di EDTA; 250 mM di cloruro di sodio a 55°C per 18-24 ore, e lavaggio in 6XSSC per 15 minuti (X3)3XSSC per 15 minuti (XI) a 55°C.
20. Un gene chimerico che comprende un promotore attivo in piante collegato in modo operativo alla molecola del DNA secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 19.
21. Un vettore ricombinante che contiene il gene chimerico della rivendicazione 20, in cui detto vettore è in grado di venire trasformato in modo stabile in una cellula ospite.
22. Un metodo per attivare SAR in una pianta, che consiste nel trasformare la pianta con il vettore ricombinante secondo la rivendicazione 21 in cui detta forma alterata della proteina NIM1 viene espressa in detta pianta trasformata e attiva la SAR in detta pianta.
23. Un procedimento per conferire ad una pianta una resistenza alla malattie ad ampio spettro, che consiste nel trasformare la pianta con il vettore ricombinante secondo la rivendicazione 21 in cui detta forma alterata della proteina NIM1 viene espressa in detta pianta trasformata e conferisce a detta pianta un resistenza alle malattie ad ampio spettro.
24. Un metodo per conferire ad una pianta un fenotipo CIM che consiste nel trasformare la pianta con il vettore ricombinante secondo la rivendicazione 21, in cui detta forma alterata della proteina NIMl viene espressa in detta pianta trasformata e conferisce a detta pianta un fenotipo CIM.
25. Una cellula ospite stabilmente trasformata con il vettore secondo la rivendicazione 21.
26. La cellula ospite secondo la rivendicazione 25 che è una cellula vegetale.
27. Una pianta, cellule di piante e loro discendenti che contengono il gene chimerico della rivendicazione 19 che hanno un ampio spettro di resistenza alle malattie.
28. Una pianta, cellule di una pianta e loro discendenti, in cui una proteina NIMl coinvolta nella cascata di trasduzione del segnale che porta ad una resistenza <' >acquisita sistemica in piante viene espressa in detta pianta trasformata in corrispondenza di livelli superiori rispetto a quelli di una pianta di tipo selvaggio.
29. Una pianta, cellule di piante e loro discendenti secondo la rivendicazione 27 oppure 28, in cui detta pianta viene scelta dal gruppo costituito da gimnosperme, monocotiledoni e dicotiledoni.
30. Una pianta, cellule di una pianta e loro discendenti secondo la rivendicazione 27 oppure 28, in cui detta pianta è una pianta da coltura.
31. Una pianta, cellule di una pianta e loro discendenti secondo la rivendicazione 27 oppure 28, in cui detta pianta viene scelta da gruppo costituito da riso, frumento, orzo, segale, mais, patate, carote, patate dolci, barbabietola da zucchero, fagioli, piselli cicoria, lattuga, cavolo, cavolfiore, broccoli, rapa, rafano, spinaci, asparagi, cipolla, aglio, melanzana, pepe, sedano, carota, melopopone, zucca, zucchini, cetrioli, mele, pere, cotogne, meloni, susine, ciliegie, pesche, 'nectarine', albicocche, fragole, uva, lamponi, more, ananas, avocado, papaia, mango, banana, soia, tabacco, pomodori, sorgo e canna da zucchero.
32. Un procedimento per conferire un fenotipo CIM ad una cellula di una pianta, ad una pianta e a loro discendenti, che consiste nel trasformare la pianta con il vettore ricombinante che contiene il gene chimerico che comprende un promotore attivo in piante collegato in modo operativo con la molecola di DNA che codifica una proteina NIM1 coinvolta nella cascata di trasduzione del segnale che porta ad una resistenza acquisita sistemica in piante, in cui detto vettore è in grado di venire trasformato stabilmente in un ospite, in cui detta proteina NIM1 viene espressa in detta pianta trasformata in corrispondenza di livelli superiori rispetto a quelli di una pianta di tipo selvaggio.
33. Un procedimento per attivare una resistenza acquisita sistemica in una cellula di una pianta, in una pianta e in loro discendenti, che consiste nel trasformare la pianta con il vettore ricombinante che comprende il gene chimerico che contiene un promotore attivo in piante collegato in modo operativo alla molecola di DNA che codifica una proteina NIM1 coinvolta nella cascata di trasduzione del segnale che porta ad una resistenza acquisita sistemica nelle piante, in cui detto vettore è in grado di venire trasformato stabilmente in un ospite, in cui detta proteina NIM1 viene espressa in detta pianta trasformata <' >in corrispondenza di livelli più elevati rispetto a quelli che si hanno in una pianta di tipo selvaggio.
34 . Un procedimento per conferire una resistenza alle malattie ad ampio spettro ad una cellula di una pianta, ad una pianta e a loro discendenti, che consiste nel trasformare la pianta con il vettore ricombinante che contiene un gene chimerico che comprende un promotore attivo in piante collegato in modo operativo alla molecola del DNA che codifica una proteina NIM1 coinvolta nella cascata di trasduzione del segnale che porta ad una resistenza acquisita sistemica nelle piante, in cui detto vettore è in grado di venire trasformato stabilmente in un ospite, in cui detta proteina NIM1 viene espressa in detta pianta trasformata in corrispondenza di livelli più elevati rispetto a quelli di una pianta di tipo selvaggio.
35. Impiego di una pianta transgenica o di suoi discendenti che comprendono un gene chimerico secondo la rivendicazione 20 in un processo di agricoltura.
36. Un sacchetto commerciale che contiene semi di una pianta transgenica che comprende almeno una forma alterata di una proteina NIM1 oppure una proteina NIM1 che viene espressa in detta pianta trasformata <'>in corrispondenza di livelli più elevati rispetto ai livelli di una pianta di tipo selvaggio insieme con una adatta sostanza-veicolo in una quantità sufficiente ad agire come regolatore negativo-dominante del percorso di trasduzione del segnale SAR, insieme con un foglio di istruzioni per il loro impiego per conferire alle piante una resistenza alle malattie ad ampio spettro.