NL1007779C2 - Werkwijzen voor het toepassen van het NIM1-gen om resistentie tegen ziekten te verlenen aan planten. - Google Patents

Description

Werkwijzen voor het toenassen van het NIM1-gen om resistentie tegen ziekten te verlenen aan planten.

De onderhavige uitvinding betreft in het algemeen resistentie tegen ziekten in 5 planten met een breed werkingsspectrum, met inbegrip van het verschijnsel van systemisch verworven resistentie (SAR). Meer in het bijzonder betreft de onderhavige uitvinding de recombinante expressie van wild-type en gewijzigde vormen van het NIMl-gen, dat betrokken is bij de signaaltransductiecascade die leidt tot SAR, voor het verschaffen van transgene planten met een resistentie tegen ziekten met een breed 10 werkingsspectrum. De onderhavige uitvinding betreft verder expressie op hoog niveau van het gekloneerde NIMl-gen in transgene planten die ziekteresistentie met breed werkingsspectrum hebben.

Planten worden constant belast door een groot aantal verschillende pathogene organismen, waaronder virussen, bacteriën, fungi en nematoden. Gewasplanten zijn in 15 het bijzonder kwetsbaar daar ze doorgaans worden geteeld als genetisch-uniforme monoculturen; wanneer een ziekte toeslaat kunnen de verliezen ernstig zijn. De meeste planten hebben echter hun eigen natuurlijke verdedigingsmechanismen tegen pathogene organismen. Natuurlijke variatie in resistentie tegen plantenpathogenen is door plantenkwekers en pathologen erkend en in een groot aantal gewasplanten 20 ingekweekt. Deze natuurlijke ziekteresistentiegenen verschaffen vaak hoge niveaus van resistentie tegen, of immuniteit, tegen pathogenen.

Systemisch verworven resistentie (SAR) is een component van het complexe systeem dat planten gebruiken om zichzelf te verdedigen tegen pathogenen (Hunt en Ryals, Crit. Rev. in Plant Sci. 15, 583-606 (1996), hierin in het geheel door 25 verwijzing opgenomen; Ryals et al., Plant Cell 8, 1809-1819 (1996), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen. Zie tevens Amerikaans octrooischrift 5.614.395, hierin in het geheel door verwijzing opgenomen). SAR is een bijzonder belangrijk aspect van de reaches van planten tegen pathogenen daar het een door pathogenen agentia, systemische resistentie tegen een breed spectrum van infecterende invloeden 30 verschaft, waaronder virussen, bacteriën en fungi. Wanneer de route van de SAR-signaaltransductie geblokkeerd wordt, worden planten gevoeliger voor pathogenen die doorgaans ziekte veroorzaken, en worden zij tevens gevoelig voor sommige infecterende agentia die doorgaans geen ziekte zouden veroorzaken (Gaffney et al., 1007779 2

Science 261, 754-756 (1993), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Delaney et al., Science 266, 1247-1250 (1994), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Delaney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6602-6606 (1995), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Delaney, Plant Phys. 113, 5-12 (1997), 5 hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Bi et al., Plant J. 8, 235-245 (1995), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Mauch-Mani en Slusarenko, Plant Cell 8, 203-212 (1996), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen). Deze waarnemingen geven aan dat de SAR-signaaltransductieroute kritiek is voor het handhaven van de gezondheid van de plant.

10 Gezien als concept, kan de SAR-respons in twee fasen worden onderverdeeld.

In de initiatiefase wordt een infectie met een pathogeen herkend en wordt een signaal afgegeven dat door het floeem naar verafgelegen weefsels gaat. Dit systemische signaal wordt waargenomen door doelcellen, die reageren door expressie van zowel SAR-genen als ziekteresistentie. De handhavingsfase van SAR betreft de tijdspanne, 15 uiteenlopend van weken tot de gehele levensduur van de plant, gedurende welke de plant in een quasi stabiele toestand verkeert, en de resistentie tegen ziekte behouden blijft (Ryals et al., 1996).

Ophoping van salicylzuur (SA) lijkt vereist te zijn voor SAR-signaaltransductie. Planten die SA niet kunnen ophopen, door behandeling met specifieke remmers, 20 epigenetische repressie van fenylalanine-ammonialyase, of transgene expressie van salicylaathydroxylase, dat SA specifiek afbreekt, kunnen noch SAR-genexpressie noch ziekteresistentie induceren (Gaffney et al., 1993; Delaney et al., 1994; Mauch-Mani en Slusarenko 1996; Maher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7802-7806 (1994) , hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Pallas et al., Plant J. 10,

25 281-293 (1996), hierin door verwijzing opgenomen). Hoewel gesuggereerd is dat SA

als het systemische signaal dient, is dit op dit moment omstreden, en tot op heden is alleen bekend dat wanneer SA niet kan ophopen, de SAR-signaaltransductie geblokkeerd wordt (Pallas et al., 1996; Shulaev et al., 1995, Plant Cell 7, 1691-1701 (1995) , hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Vemooij et al., Plant Cell 6, 30 959-965 (1994), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen).

Recent is Arabidopsis naar voren gekomen als een modelsysteem voor het bestuderen van SAR (Uknes et al., Plant Cell 4, 645-656 (1992), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Uknes et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 6, 692-698 1007779 3 (1993), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Cameron et al., Plant J. 5, 715-725 (1994), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Mauch-Mani en Slusarenko, Mol. Plant-Microbe Interact. 7, 378-383 (1994), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Dempsey en Klessig, Bulletin de L’Institut Pasteur 93, 167-5 186 (1995), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen). Het is aangetoond dat SAR in Arabidopsis kan worden geactiveerd door zowel pathogenen als chemicaliën, zoals SA, 2,6-dichloorisonicotinezuur (INA) en benzo(l,2,3)thiadiazool-7-carbothionzuur S-methylester (BTH) (Uknes et al., 1992; Vemooij et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 8, 228-234 (1995), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; 10 Lawton et al., Plant J. 10, 71-82 (1996), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen). Volgend op behandeling met INA of BTH of op infectie met een pathogeen worden ten minste drie met pathogenese verbandhoudende (PR) eiwitgenen, namelijk PR-1, PR-2 en PR-5, tegelijk geïnduceerd met het ontstaan van resistentie (Uknes et al., 1992, 1993). In de tabaksplant, het meest bekende species, 15 induceert behandeling met een pathogeen of een immuniserende verbinding de expressie van ten minste negen reeksen van genen (Ward et al., Plant Cell 3, 1085-1094 (1991), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen). Transgene ziekte-resistente planten zijn verkregen door het transformeren van planten met verschillende SAR-genen (Amerikaans octrooischrift 5.614.395).

20 Een aantal Arabidopsis mutanten met gemodificeerde SAR-signaaltransductie (Delaney, 1997) zijn geïsoleerd. De eerste van deze mutanten zijn de zogenaamde Isd ("lesions stimulating disease") mutanten en acdl ("accelerated cell death") mutanten (Dietrich et al., Cell 77, 551-563 (1994), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Greenberg et al., Cell 77, 551-563 (1994), hierin in het geheel door 25 verwijzing opgenomen). Deze mutanten vertonen alle een zekere mate van spontane vorming van necrotische lesies op hun bladeren, verhoogde niveaus aan SA, mRNA ophoping voor de SAR-genen, en aanzienlijk verhoogde resistentie tegen ziekten. Ten minste zeven verschillende /.«/-mutanten zijn geïsoleerd en gekarakteriseerd (Dietrich et al., 1994; Weymann et al., Plant Cell 7, 2013-2022 (1995), in het geheel hierin 30 door verwijzing opgenomen). Een andere interessante groep mutanten zijn cim ("constitutive immunity") mutanten (Lawton et al., 1993 "The molecular biology of systemic aquired resistance" in "Mechanisms of Defence Responses in Plants", B. Fritig en M. Legrand, eds (Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic 1 007779 4

Publishers), pp. 422-432 (1993), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen).

Zie tevens de Internationale PCT aanvrage WO 94/16077, die beide hierin in het geheel door verwijzing zijn opgenomen. Evenals /sd-mutanten en acd2, vertonen cim mutanten verhoogde SA en SAR-genexpressie en resistentie, maar in tegenstelling tot 5 Isd of acd2, vertonen zij geen waarneembare lesies op hun bladeren, cprl ("constitutive expresser of PR genes") kan een type chn-mutant zijn; echter, omdat de aanwezigheid van microscopische lesies op de bladeren van cprl niet is uitgesloten, kan cprl een type Isd mutant zijn (Bowling et al., Plant Cell 6, 1845-1857 (1994), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen).

10 Ook zijn mutanten geïsoleerd die geblokkeerd zijn in de SAR-signalering. ndrl ("non-race-specifïc disease resistance) is een mutant die groei van zowel Pseudomonas syringae dat verschillende avirulentiegenen bevat, alsook normaal avirulente isolaten van Peronospora parasitica mogelijk maakt (Century et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6597-6601 (1995), hierin in het geheel door verwijzing 15 opgenomen). Klaarblijkelijk is deze mutant vroeg in de SAR-signalering geblokkeerd. nprl ("nonexpresser of PR genes") is een mutant die de expressie van de SAR-signaairoute niet kan induceren na behandeling met INA (Cao et al., Plant Cell 6, 1583-1592 (1994), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen), eds ("enhanced disease susceptibility") mutanten zijn geïsoleerd op basis van hun vermogen bacteriële 20 infectie te ondersteunen volgend op enting met een lage concentratie aan bacteriën (Glazebrook et al., Genetics 143, 973-982 (1996), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Parker et al., Plant Cell 8, 2033-2045 (1996), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen). Bepaalde eifc-mutanten hebben een fenotype dat sterk lijkt op nprl, en recent is aangetoond dat eds5 en eds52 allelisch zijn met nprl 25 (Glazebrook et al., 1996). niml ("noninducible immunity") is een mutant die de groei van P. parasitica (dat wil zeggen de veroorzaker van donsige meeldauwziekte) ondersteunt na behandeling met INA (Delaney et al., 1995; Internationale aanvrage WO 94/16077). Hoewel niml SA kan ophopen na infectie met een pathogeen, kan het niet SAR-genexpressie of ziekteresistentie induceren, hetgeen suggereert dat de 30 mutatie de route stroomafwaarts van SA blokkeert, niml is tevens beperkt in zijn vermogen te reageren op INA of BTH, hetgeen suggereert dat de blokkade stroomafwaarts van de werking van deze chemicaliën ligt (Delaney et al., 1995; Lawton et al., 1996).

1 n - q 5

Recent zijn twee allele Arabidopsis genen geïsoleerd en gekarakteriseerd, waarvan de mutanten verantwoordelijk zijn voor respectievelijk de niml- en nprl-fenotypen (Ryals et al., Plant Cell 9, 425-439 (1997), hierin in het geheel door verwijzing opgenomen; Cao et al., Cell 88, 57-63 (1997), hierin in het geheel door 5 verwijzing opgenomen). Het wild-type MM7-genproduct is betrokken bij de signaaltransductiecascade die leidt tot zowel SAR als gen-voor-gen-ziekteresistentie in Arabidopsis (Ryals et al., 1997). Ryals et al., 1997 vermelden tevens het isoleren van vijf verdere allelen van niml die verschillende fenotypen vertonen uiteenlopend van in geringe mate beperkt in chemisch geïnduceerd PR-1 genexpressie en resistentie 10 tegen fungi tot zeer sterk geblokkeerd. Transformatie van het wild-type NPR1 gen in nprl mutanten vult niet alleen de mutaties aan, hetgeen de reactie van SAR-inductie ten aanzien van PR-genexpressie en ziekteresistentie herstelt, maar maakte tevens de transgene planten resistenter tegen infectie met P. syringae in afwezigheid van SAR-inductie (Cao et al., 1997).

15 NF-kB/IkB sienaaltransductieroutes NF-κΒ/ΙκΒ signaalroutes zijn vermeld als betrokken bij ziekteresistentie-reacties in een groot aantal verschillende organismen, uiteenlopend van Drosophila tot 20 zoogdieren. In zoogdieren kan NF-κΒ/ΙκΒ signaaltransductie worden geïnduceerd door een groot aantal verschillende prikkels, waaronder blootstelling van de cellen aan lipopolysaccharide, tumomecrosisfactor, interleukine 1 (IL-1), of virusinfectie (Baeuerle en Baltimore, Cell 87, 13-20 (1996); Baldwin, Annu. Rev. Immunol. 14, 649-681 (1996)). De geactiveerde route leidt tot de synthese van een aantal 25 verschillende factoren die betrokken zijn bij ontstekings- en immuunreacties, zoals IL-2, IL-6, IL-8 en granulocyt/macrofaagkolonie stimulerende factor (deMartin et al., Gene 152, 253-255 (1995)). Bij onderzoek in transgene muizen leidt het uitschakelen van NF-κΒ/ΙκΒ signaaltransductie tot een aangetaste immuunrespons, waaronder verhoogde gevoeligheid voor bacteriële en virale pathogenen (Beg en Baltimore, 30 Science 274, 782-784 (1996); Van Antwerp et al., Science 274, 787-789 (1996); Wang et al., Science 274, 784-787 (1996); Baeuerle en Baltimore (1996)). In Arabidopsis is SAR functioneel analoog aan ontsteking, in zoverre dat normale resistentieprocessen worden gepotentieerd na SAR activatie hetgeen leidt tot 1007779 6 verhoogde resistentie tegen ziekten (Bi et al., 1995; Cao et al., 1994; Delaney et al., 1995; Delaney et al., 1994; Gaffney et al., 1993; Mauch-Mani en Slusarenko 1996; Delaney, 1997). Verder leidt inactivering van de route tot verhoogde gevoeligheid voor bacteriële, virale en schimmelpathogenen. Het is opmerkelijk dat van SA is 5 vermeld dat het NF-κΒ activering in zoogdiercellen blokkeert (Kopp en Ghosh, Science 265, 956-959 (1994)), terwijl SA signaaltransductie in Arabidopsis activeert. Bacteriële infectie van Drosophila activeert een signaaltransductiecascade die leidt tot de synthese van een aantal tegen fungi gerichte eiwitten zoals cercropine B, defensine, diptericine en drosomycine (lp et al., Cell 75, 753-763 (1993); Lemaitre et 10 al., Cell 86, 973-983 (1996)). Deze inductie is afhankelijk van het genproduct van dorsal en dif twee NF-κΒ homologen, en wordt onderdrukt door cactus, een IkB homoloog in de vlieg. Mutanten met een verminderde synthese van de tegenfungi en tegen bacteriën gerichte eiwitten hebben een zeer sterk verlaagde weerstand tegen infectie.

15 Ondanks veel onderzoek naar en het gebruik van hoogstaande en intensieve gewasbeschermingsmaatregelen, waaronder de genetische transformatie van planten, lopen de door ziekte veroorzaakte verliezen jaarlijks nog steeds in de miljarden dollars. Er is derhalve een voortdurende behoefte aan het ontwikkelen van nieuwe maatregelen voor het beschermen van gewassen, gebaseerd op het steeds toenemende 20 begrip van de genetische basis van resistentie tegen ziekten in planten.

De volgende definities zullen bijdragen aan het begrip van de onderhavige uitvinding.

Plantencel: de structurele en fysiologische eenheid van planten, omvattende een protoplast en een celwand. Het begrip "plantencel" verwijst naar iedere cel die deel 25 uitmaakt van, of afgeleid is van, een plant. Sommige voorbeelden van cellen omvatten gedifferentieerde cellen die deel uitmaken van een levende plant; gedifferentieerde cellen in kweek; niet-gedifferentieerde cellen in kweek; de cellen van niet-gedifferentieerde weefsels zoals callus of tumoren; gedifferentieerde cellen van zaden, embryo’s, propagules en pollen.

30 Plantenweefsel: een groep plantencellen die zijn georganiseerd tot een structurele en functionele eenheid. Ieder weefsel van een plant in planta of in kweek wordt omvat. Deze term omvat, maar is niet beperkt tot, gehele planten, organen van planten, plantenzaden, weefselkweek en alle groepen plantencellen die zijn 1007779 7 georganiseerd tot structurele en/of functionele eenheden. Het gebruik van dit begrip in samenhang met, of in afwezigheid van, ieder specifiek type plantenweefsel zoals hierboven vermeld of anderszins omvat door deze definitie is niet bedoeld om enig ander type plantenweefsel uit te sluiten.

5 Protoplast: een plantencel zonder celwand.

Nakomelingplant: een sexueel of asexueel afgeleide plant van een toekomstige generatie, hetgeen omvat, maar niet is beperkt tot, planten van het nageslacht.

Transgene plant: een plant met een stabiel ingebracht recombinant DNA in het genoom ervan.

10 Recombinant DNA: ieder DNA molecuul dat is gevormd door het samenvoegen van DNA-segmenten van verschillende bronnen en dat is geproduceerd onder toepassing van recombinant DNA-technologie.

Recombinant DNA-technoloeie: technologie die recombinant DNA in vitro verschaft en het recombinant DNA tot in cellen overbrengt, waar het tot expressie 15 kan worden gebracht of kan worden vermenigvuldigd (zie, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Ed. Juo, CRC Press, Boca Raton (1996)), bijvoorbeeld, overdracht van DNA tot in protoplast(en) of cel(len) in verschillende vormen, waaronder, bijvoorbeeld, (1) naakt DNA in cirkelvormige, lineaire of superopgerolde vormen, (2) DNA dat is omvat in nucleosomen of chromosomen of 20 kernen of delen hiervan, (3) DNA dat is gecomplexeerd of geassocieerd met andere moleculen, (4) DNA dat is omvat in liposomen, sferoplasten, cellen of protoplasten of (5) DNA dat is overgebracht van organismen anders dan het gastheerorganisme (bijvoorbeeld Agrobacterium tumefiaciens). Deze en andere verschillende methoden voor het inbrengen van het recombinante DNA in cellen zijn bekend in het vakgebied 25 en kunnen worden gebruikt voor het produceren van de transgene plantencellen of transgene planten volgens de onderhavige uitvinding.

Recombinant DNA-technologie omvat tevens de homologe recombinatietechnieken die zijn beschreven in Treco et al., WO 94/12650 en Treco et al., WO 95/31560, die kunnen worden gebruikt voor het verhogen van de 30 peroxidaseactiviteit in een monocotiele plant. Meer specifiek kunnen regelende gebieden (bijvoorbeeld promotors) worden ingebracht in het plantengenoom voor het versterken van de expressie van het endogene peroxidase.

Tevens omvat de recombinant DNA-technologie het inbrengen van een 1007779 8 sequentie, die voor een peroxidase codeert en die geen geselecteerde expressiesignalen omvat, in een monocotiele plant en het onderzoeken van de transgene monocotiele plant op toegenomen expressie van peroxidase, zoals veroorzaakt door endogene regelsequenties in de monocotiele plant. Dit zou leiden tot 5 een toename van het kopieergetal van de voor peroxidase coderende sequenties in de plant.

Het oorspronkelijke inbrengen van het recombinante DNA in het genoom van de R° plant wordt niet gedefinieerd als bereikt door traditionele methoden voor het kweken van planten, maar eerder als technische werkwijzen zoals hierin beschreven. 10 Volgend op het oorspronkelijke inbrengen kunnen de transgene afstammelingen worden doorgekweekt onder toepassing van in wezen traditionele kweektechnieken.

Chimeer gen: een DNA-molecuul dat ten minste twee heterologe delen omvat, dat wil zeggen delen die zijn afgeleid van reeds bestaande DNA-sequenties die in hun eerdere toestand geen verband met elkaar hielden, waarbij deze sequenties bij 15 voorkeur zijn verschaft met behulp van recombinant DNA-technologie.

Expressiecassette: een DNA-molecuul dat een promotor en een terminator omvat, waartussen een coderende sequentie kan zijn ingevoegd.

Coderende sequentie: een DNA-molecuul dat, wanneer het aan transcriptie en translatie wordt onderworpen, resulteert in de vorming van een polypeptide of eiwit. 20 Gen: een discreet chromosomaal gebied dat een regelende DNA-sequentie omvat die verantwoordelijk is voor het regelen van de expressie, dat wil zeggen transcriptie en translatie, en een coderende sequentie die aan transcriptie en translatie wordt onderworpen voor het verschaffen van een specifiek polypeptide of eiwit.

De onderhavige uitvinding omvat het identificeren, isoleren en karakteriseren 25 van het NIM1 -gen, dat codeert voor een eiwit dat betrokken is bij de signaaltransductiecascade als reactie op biologische of chemische inductiemiddelen die leidt tot systemisch verworven resistentie in planten.

De onderhavige uitvinding beschrijft derhalve een geïsoleerd DNA molecuul (NIM1 -gen) dat codeert voor een NIM1 eiwit dat betrokken is bij de signaal 30 transductie cascade die leidt tot systemisch verworven resistentie in planten.

Binnen het gebied van de onderhavige uitvinding wordt een DNA-molecuul beschreven dat voor het NIM1 eiwit codeert en dat onder de volgende omstandigheden hybridiseert met kloon BAC-04, ATCC deponeringsnummer 97543 : 1007779 k 9 hybridisatie 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 750 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten. (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C. Volgens een in het bijzonder de voorkeur verdienende uitvoeringsvorm is het N1M1-gen omvat 5 opgenomen in cosmide D7, ATCC deponeringsnummer 97736.

Het hierin beschreven NIM1-gen kan worden geïsoleerd uit een dicotyle plant zoals Arabidopsis, tabak, komkommer, of tomaat. Alternatief kan het NIMl-gen worden geïsoleerd uit een monocotyle plant zoals maïs, tarwe of gerst.

Verder wordt een gecodeerd NIM1 eiwit beschreven dat de in SEQ ID nr. 3 10 weergegeven aminozuursequentie omvat. Ook wordt de coderende sequentie van het NIMl-gen beschreven, die onder de volgende omstandigheden met de coderende sequentie vermeld in SEQ ID nr. 2 hybridiseert: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 15 minuten (X3) 3XSSC (XI) bij 55°C. Volgens een in het bijzonder de voorkeur verdienende uitvoeringsvorm omvat de voor het NIMl-gen coderende sequentie de in SEQ ID nr. 2 vermelde coderende sequentie.

De onderhavige uitvinding omschrijft tevens een chimeer gen, dat een in planten werkzame promotor omvat die op werkzame wijze is verbonden met een voor 20 het NIMl-gen coderende sequentie, een recombinante vector die een dergelijk chimeer gen omvat, waarbij de vector in staat is op stabiele wijze tot in een gastheer getransformeerd te worden, alsook een gastheer die op stabiele wijze met een dergelijke vector is getransformeerd. De gastheer is bij voorkeur een plant, zoals één van de in de landbouw belangrijke gewassen: rijst, tarwe, gerst, rogge, mais, 25 aardappel, wortel, zoete aardappel, suikerbiet, bonen, doperwten, chicorei, sla, kool, bloemkool, broccoli, raap, radijs, spinazie, asperge, ui, knoflook, aubergine, peper, selderij, wortel, pompoen, in het bijzonder Cucurbita pepo, zucchini, komkommer, appel, peer, kweepeer, meloen, pruim, kers, perzik, nectarine, abrikoos, aardbei, druif, framboos, ananas, avocado, papaya, mango, banaan, soja, tabak, tomaat, sorghum of 30 suikerriet.

Volgens een in het bijzonder de voorkeur verdienende uitvoeringsvorm wordt het NIM1 eiwit in een getransformeerde plant bij hogere niveaus tot expressie gebracht dan in een wild-type plant.

1007779 •r 10

De onderhavige uitvinding is tevens gericht op een werkwijze voor het overbrengen van een CIM-fenotype in een plant door het transformeren van de plant met een recombinante vector, welke een chimeer gen omvat dat als zodanig een in planten werkzame promotor omvat en die op werkzame wijze is verbonden met een 5 coderende sequentie voor een NIMJ-gen, waarbij het gecodeerde NIM1 eiwit in de getransformeerde plant bij hogere niveaux tot expressie wordt gebracht dan een wild-type plant.

De onderhavige uitvinding is verder gericht op een werkwijze voor het activeren van systemisch verworven resistentie in een plant door het transformeren 10 van de plant met een recombinante vector, welke een chimeer gen omvat dat als zodanig een in planten werkzame promotor omvat die op werkzame wijze is verbonden met een coderende sequentie voor een NIMJ-gen, waarbij het gecodeerde NIM1 eiwit in de getransformeerde plant bij hogere niveaux tot expressie wordt gebracht dan in een wild-type plant.

15 Verder is de onderhavige uitvinding gericht op een werkwijze voor het overdragen van ziekteresistentie met een breed werkingsspectrum tot in een plant door het transformeren van de plant met een recombinante vector, welke een chimeer gen omvat dat als zodanig een in planten werkzame promotor omvat die op werkzame wijze is verbonden met een coderende sequentie voor een NIM]-gen, 20 waarbij het gecodeerde NIM1 eiwit in de getransformeerde plant bij hotere niveaux tot expressie wordt gebracht dan in een wild-type plant.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding maakt gebruik van zowel het inzicht dat de SAR-route in planten qua functie vergelijkbaar is met het NF-kB/1kB regelschema in zoogdieren en vliegen, alsook de ontdekking dat het NIM1-genproduct 25 een structurele homoloog is van de signaaltransductiefactor IkB subklasse α in zoogdieren. Mutaties van IkB die werken als super-repressors of dominant-negatieven van het NF-κΒ/ΙκΒ regelingsschema zijn beschreven. De onderhavige uitvinding omvat gewijzigde vormen van het wild-type NIM1-gen (SEQ nr.: 2) die werkzaam zijn als dominant-negatieve regulatoren van de SAR-signaaltransductieroute. Deze 30 gewijzigde vormen van NIM1 verlenen aan planten die daarmee getransformeerd zijn het tegengestelde fenotype als de NIM1 mutant; planten, dat wil zeggen planten die getransformeerd zijn met gewijzigde vormen van NIM1, vertonen constitutieve SAR genexpressie en een CIM fenotype.

1 007779 k 11

Tevens omvat door de onderhavige uitvinding zijn DNA-moleculen die hybridiseren met een DNA-molecuul volgens de onderhavige uitvinding zoals hierboven gedefinieerd, maar bij voorkeur met een oligonucleotidetestreeks die verkrijgbaar is uit een dergelijk DNA-molecuul en dat een aansluitend gedeelte van 5 de coderende sequentie van deze gewijzigde vormen van NIM1 omvat met een lengte van ten minste 10 nucleotiden, onder matig strenge omstandigheden.

Factoren die de stabiliteit van hybriden beïnvloeden bepalen de striktheid van de hybridisatie. Een dergelijke factor is de smelttemperatuur Tm die eenvoudig kan worden berekend volgens de formule die wordt vermeld in DNA PROBES, 10 George H. Keller en Mark M. Manak, Macmillan Publishers Ltd., 1993, Section one: Molecular Hybridization Technology; pagina 8 e.v.

De bij voorkeur toegepaste hybridisatietemperatuur is in het traject van ongeveer 25°C onder de berekende smelttemperatuur Tm en bij voorkeur in het traject van ongeveer 12-15°C onder de berekende smelttemperatuur Tm , en in het geval van 15 een oligonucleotide in het traject van ongeveer 5-10°C onder de smelttemperatuur Tm.

Volgens een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding wordt het NIMJ-gen zodanig gewijzigd dat het hierdoor gecodeerde product alanineresten in plaats van serineresten heeft op de aminozuurposities die overeenkomen met posities 55 en 59 van de wild-type Arabidopsis NIM1 aminozuursequentie (SEQ ID nr.: 3). Een 20 voorbeeld van een voorkeursuitvoeringsvorm van deze gewijzigde vorm van het NIM1-gen, die leidt tot verandering van deze serineresten in analineresten, is weergegeven in SEQ ID nr.: 22. Een als voorbeeld gegeven dominant-negatieve vorm van het NIM1 eiwit met alanineresten in plaats van serineresten op aminozuurposities 55 en 59 is weergegeven in SEQ ID nr.: 23. De onderhavige uitvinding omvat tevens 25 gewijzigde vormen van allelen van NIM1, waarbij de coderende sequentie van een dergelijke alleel onder matig strenge omstandigheden hybridiseert met de coderende sequentie die is weergegeven in SEQ ID nr.: 22, in het bijzonder de voorkeur verdienen de volgende omstandigheden: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2 ; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 30 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen met 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C. In deze uitvoeringsvormen zijn allelen van NIM1 die onder de bovenstaande omstandigheden met SEQ ID nr.: 22 hybridiseren zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product alanineresten in plaats van 1007779 12 serineresten heeft op de aminozuurposities die overeenkomen met posities 55 en 59 van SEQ ID nr.: 22.

Volgens een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is het NIMJ-gen zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product een N-eindstandig 5 verwijderd gedeelte heeft, waardoor lysineresten worden verwijderd die kunnen dienen als mogelijke ubiquitineringsplaatsen naast de serineresten op de aminozuurposities die overeenkomen met posities 55 en 59 van het wild-type eiwit. Een voorbeeld van een voorkeursuitvoeringsvorm van deze gewijzigde vorm van het NIM1-gen, die codeert voor een genproduct met een N-terminale deletie, is 10 weergegeven in SEQ ID nr.: 24. Een als voorbeeld gegeven dominant-negatieve vorm van het NIM1 eiwit met een N-eindstandige deletie is weergegeven in SEQ ID nr.

25. De onderhavige uitvinding omvat verder gewijzigde vormen van allelen van NIM1, waarbij de coderende sequentie van een dergelijke alleel hybridiseert onder mildstrikte omstandigheden met de coderende sequentie die is weergegeven in SEQ 15 ID nr.: 24; in het bijzonder de voorkeur verdienen de volgende omstandigheden: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C. In deze uitvoeringsvormen zijn allelen van NIM1 die onder de bovengenoemde 20 omstandigheden met SEQ ID nr.: 24 hybridiseren zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product een N-eindstandige deletie heeft waardoor lysineresten worden verwijderd die kunnen dienen als mogelijke ubiquitineringsplaatsen naast de serineresten op de aminozuurposities die overeenkomen met posities 55 en 59 van het wild-type genproduct.

25 In weer een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is het ΜΛ/7-gen zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product een C-eindstandig verwijderd gedeelte heeft, waarvan wordt aangenomen dat het leidt tot versterkte intrinsieke stabiliteit door het blokkeren van de constitutieve fosforylatie van serine-en treonineresten bij het C-uiteinde van het wild-type genproduct. Een voorbeeld van 30 een voorkeursuitvoeringsvorm van deze gewijzigde vorm van het N1M1-gen, die codeert voor een genproduct met een C-eindstandige deletie, is weergegeven in SEQ ID nr.: 26. Een als voorbeeld gegeven dominant-negatieve vorm van het NIM1 eiwit met een C-eindstandige deletie is weergegeven in SEQ ID nr.: 27. De onderhavige 1007779 13 uitvinding omvat tevens gewijzigde vormen van allelen van NIM1, waarbij de coderende sequentie van een dergelijke alleel onder matig strenge omstandigheden hybridiseert met de in SEQ ID nr.: 26 weergegeven coderende sequentie: in het bijzonder de voorkeur verdienen de volgende omstandigheden: hybridisatie in 1% 5 BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C. In deze uitvoeringsvormen worden allelen van NIM1 die onder de bovengenoemde omstandigheden met SEQ ID nr.: 26 hybridiseren zodanig gewijzigd dat het 10 gecodeerde product een C-eindstandige deletie heeft waardoor serine- en treonineresten worden verwijderd.

In weer een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding wordt het NIMl-gen zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product zowel een N-eindstandig verwijderd gedeelte als een C-eindstandig verwijderd gedeelte heeft, hetgeen de 15 voordelen van beide hierboven beschreven uitvoeringsvormen van de uitvinding verschaft .

Een bij voorkeur toegepaste uitvoeringsvorm van de uitvinding is een gewijzigde vorm van het NIMl-gen dat een N-eindstandig verwijderd gedeelte van aminozuren heeft die overeenkomen met bij benadering aminozuurposities 1-125 van 20 SEQ ID nr.: 2 en een C-eindstandig verwijderd gedeelte van aminozuren dat overeenkomt met bij benadering aminozuurposities 522-593 van SEQ ID nr.: 3.

Een voorbeeld van een voorkeursuitvoeringsvorm van deze gewijzigde vorm van het NIMl-gen, die codeert voor een genproduct met zowel een N-eindstandige als een C-eindstandige deletie, is weergegeven in SEQ ID nr.: 28. Een als voorbeeld 25 gegeven dominant-negatieve vorm van het NIM1 eiwit met een C-eindstandige deletie is weergegeven in SEQ ID nr.: 29. De onderhavige uitvinding omvat tevens gewijzigde vormen van allelen van NIM1, waarin de coderende sequentie van een dergelijk alleel onder matig strenge omstandigheden hybridiseert met de in SEQ ID nr.: 28 weergegeven coderende sequentie; in het bijzonder de voorkeur verdienen de 30 volgende omstandigheden: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C. In de bovenstaande uitvoeringsvormen zijn 1007779 14 allelen van NIM1 die onder de bovenstaande omstandigheden met SEQ ID nr.: 28 hybridiseren zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product zowel een N-eindstandige deletie heeft, waardoor lysineresten woden verwijderd die kunnen dienen als mogelijke ubiquitineringsplaatsen naast de serineresten bij de aminozuurposities die 5 overeenkomen met posities 55 en 59 van het wild-type genproduct, alsook een C-eindstandige deletie, waardoor serine- en treonineresten worden verwijderd.

In weer een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is het ATM/-gen zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product in wezen slechts uit de "ankyrin" domeinen van het wild-type genproduct bestaat. De voorkeur verdient een 10 geïsoleerd DNA-molecuul, waarin de gewijzigde vorm van het NIM1 eiwit in wezen bestaat uit ankyrin motieven die overeenkomen met bij benadering de aminozuurposities 103-362 van SEQ ID nr.: 3. Een voorbeeld van een voorkeursuitvoeringsvorm van deze gewijzigde vorm van het ATM/-gen, die codeert voor de ankyrin domeinen, is weergegeven in SEQ ID nr.: 30. Een als voorbeeld 15 gegeven dominant-negatieve vorm van het NIM1 eiwit bestaat in wezen uit uitsluitende ankyrin domeinen en is getoond in SEQ ID nr.: 31. De onderhavige uitvinding omvat tevens gewijzigde vormen van allelen van NIM1, waarin de coderende sequentie van een dergelijke alleel onder matig strenge omstandigheden hybridiseert met de in SEQ ID nr.: 30 weergegeven coderende sequentie; in het 20 bijzonder de voorkeur verdienen de volgende omstandigheden: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaPO„, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout, 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C. In deze uitvoeringsvormen worden allelen van NIM1 die onder de bovenstaande 25 omstandigheden hybridiseren met SEQ ID nr.: 30 zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product in wezen uitsluitend uit de ankyrindomeinen van het wild-type genproduct bestaat.

Derhalve betreft de onderhavige uitvinding DNA-moleculen die coderen voor gewijzigde vormen van het NIM1-gen, zoals de hierboven beschreven, en alle DNA-30 moleculen die hiermee onder matig strenge omstandigheden hybridiseren.

De onderhavige uitvinding omvat tevens een chimeer gen dat een in planten werkzame promotor omvat die op werkzame wijze is verbonden met één van de bovenstaande gewijzigde vormen van het ATM/-gen, een recombinante vector die een 1007779 15 dergelijk chimeer gen omvat, waarbij de vector in staat is stabiel te worden getransformeerd tot in een gastheercel, alsook een gastheercel die op stabiele wijze met een dergelijke vector is getransformeerd. De gastheercel is bij voorkeur een plant, plantencellen, of de afstammelingen hiervan, bijvoorbeeld van een van de 5 onderstaande in de landbouw belangrijke gewassen: rijst, tarwe, gerst, rogge, maïs, aardappel, wortel, zoete aardappel, suikerbiet, bonen, doperwten, chicorei, sla, kool, bloemkool, broccoli, raap, radijs, spinazie, asperge, ui, knoflook, aubergine, peper, selderij, wortel, pompoen, in het bijzonder Cucurbita pepo, zucchini, komkommer, appel, peer, kweepeer, meloen, pruim, kers, perzik, nectarine, abrikoos, aardbei, druif, 10 framboos, ananas, avocado, papaya, mango, banaan, soja, tabak, tomaat, sorghum of suikerriet.

De onderhavige uitvinding is tevens gericht op een werkwijze voor het overdragen van een CIM fenotype naar een plant door het transformeren van de plant met een recombinante vector, welke een chimeer gen bevat dat als zodanig een in 15 planten werkzame promotor omvat die op werkzame wijze is verbonden met een van de bovenstaande gewijzigde vormen van het NIMl-gen, waarbij de gecodeerde dominant-negatieve vorm van het ΜΛ/7-gen in de getransformeerde plant tot expressie wordt gebracht en de plant van een CIM fenotype voorziet.

De onderhavige uitvinding is verder gericht op een werkwijze voor het 20 activeren van systemisch verworven resistentie in een plant door het transformeren van de plant met een recombinante vector die een chimeer gen omvat, welke als zodanig een in planten werkzame promotor omvat die op werkzame wijze is verbonden met een of meer van de bovenstaande gewijzigde vormen van het NIM1-gen, waarbij de gecodeerde dominant-negatieve vorm van het NIM1 eiwit in de 25 getransformeerde plant tot expressie wordt gebracht en systemisch verworven resistentie in de plant activeert.

Tevens is de onderhavige uitvinding gericht op een werkwijze voor het overbrengen van ziekte resistentie met een breed werkend spectrum aan een plant door het transformeren van de plant met een recombinante vector die een chimeer 30 gen omvat, welke als zodanig een in planten werkzame promotor omvat die op werkzame wijze is verbonden met een van de bovenstaande gewijzigde vormen van het NIMJ-gen, waarbij de gecodeerde dominant-negatieve vorm van het NIM1 eiwit in de getransformeerde plant tot expressie wordt gebracht en de plant van een 1007779 16 ziekteresistentie met breed werkingsspectrum voorziet.

Volgens weer een ander aspect is de onderhavige uitvinding gericht op een werkwijze voor het onderzoeken op de aanwezigheid van een NIM1-gen dat betrokken is bij de signaaltransductiecascade die leidt tot systemisch verworven 5 resistentie in een plant, omvattende het aftasten van een genomische of cDNA bibliotheek van de plant aan een testreeks van een NIM1 coderende sequentie die onder de volgende reeks omstandigheden met de in SEQ ID nr.: 2 weergegeven coderende sequentie hybridiseert: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C 10 gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C.

Verdere aspecten die worden omvat door de uitvinding zijn:

Een geïsoleerd DNA-molecuul volgens de uitvinding waarin de hiervoor genoemde gewijzigde vorm van het NIM1 eiwit alanineresten in plaats van 15 serineresten omvat op de aminozuurposities die overeenkomen met posities 55 en 59 van SEQ ID nr.: 3, waarbij het DNA-molecuul onder de volgende omstandigheden met de in SEQ ID nr.: 22 weergegeven nucleotidesequentie hybridiseert: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC 20 gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C.

Een geïsoleerd DNA-molecuul volgens de uitvinding waarin de gewijzigde vorm van het NIM1 eiwit een N-eindstandige afknotting van aminozuren heeft die overeenkomt met bij benadering aminozuurposities 1-125 van SEQ ID nr.: 3, waarbij het DNA-molecuul onder de volgende omstandigheden met de in SEQ ID nr.: 24 25 weergegeven nucleotidesequentie hybridiseert: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C.

Een geïsoleerd DNA-molecuul volgens de uitvinding waarin de gewijzigde 30 vorm van het NIM1 -gen een C-eindstandige afknotting van aminozuren heeft die bij benadering overeenkomt met aminozuurposities 522-593 van SEQ ID nr.: 3, waarbij het DNA-molecuul onder de volgende omstandigheden met de in SEQ ID nr.: 26 weergegeven nucleotidesequentie hybridiseert: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM

1007779 17

NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C.

Een geïsoleerd DNA-molecuul volgens de uitvinding, waarin de gewijzigde 5 vorm van het NIM1 eiwit de in SEQ ID nr.: 28 weergegeven aminozuursequentie omvat, waarbij DNA-molecuul onder de volgende omstandigheden met de in SEQ ID nr.: 28 weergegeven nucleotidesequentie hybridiseert: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 10 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C.

Een geïsoleerd DNA-molecuul volgens de uitvinding, waarin de gewijzigde vorm van het NIM1 eiwit in wezen bestaat uit ankyrinmotieven die overeenkomen met bij benadering aminozuurposities 103-362 van SEQ ID nr.: 3, waarbij het DNA-molecuul onder de volgende omstandigheden met de in SEQ ID nr.: 30 weergegeven 15 nucleotidesequentie hybridiseert: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C.

Een gewijzigde vorm van het ATM/-gen volgens de uitvinding, die is 20 geconstrueerd door mutagenese.

Het gebruik van een geïsoleerd DNA-molecuul volgens de uitvinding voor het activeren van systemisch verworven resistentie in een plantencel, in plant of de nakomelingen hiervan.

Gebruik van een geïsoleerd DNA-molecuul volgens de uitvinding voor het 25 verlenen van ziekteresistentie met een breed werkingsspectrum aan een plantencel, een plant of de nakomelingen hiervan.

Het gebruik van een geïsoleerd DNA-molecuul volgens de uitvinding voor het verlenen van een CIM-fenotype aan een plantencel, een plant of de nakomelingen hiervan.

30 Het gebruik van resistente planten en de nakomelingen hiervan volgens de uitvinding voor het opnemen van de eigenschap van ziekteresistentie in plantenlijnen door kweken.

Het gebruik van varianten van het MM/-gen voor het verlenen van 1007779 18 ziekteresistentie en het activeren van SAR-genexpressie in hiermee getransformeerde planten.

Een werkwijze voor het produceren van een gewijzigde vorm van een NIM1- gen.

5 Een werkwijze voor het produceren van transgene nakomelingen van een transgene ouderplant, die een geïsoleerd DNA-molecuul bevatten dat codeert voor een gewijzigde vorm van een NIM1 eiwit volgens de uitvinding, omvattende het transformeren van de ouderplant met een recombinant vectormolecuul volgens de uitvinding en het overdragen van de eigenschap aan de nakomelingen van de 10 transgene ouderplant door middel van bekende plantenkweektechnieken.

Een werkwijze voor het produceren van een DNA-molecuul dat een DNA-gedeelte omvat dat een DNA-deel bevat dat codeert voor een gewijzigde vorm van een NIM1 eiwit (a) het verschaffen van een nucleotide testreeks die in staat is specifiek te 15 hybridiseren met een gewijzigde vorm van een N1M1-gen of mRNA, waarbij de testreeks een aaneensluitend gedeelte van de coderende sequentie van een gewijzigde vorm van een NIMl met een lengte van ten minste 10 nucleotiden omvat; (b) het onderzoeken van populaties van gekloneerde genomische DNA-fragmenten of cDNA-fragmenten uit een gekozen organisme op de aanwezigheid van 20 andere gewijzigde vormen van een NIMl coderende sequentie onder toepassing van de nucleotide testreeks die verkregen is bij stap (a); en (c) het isoleren en vermenigvuldigen van een DNA-molecuul dat een DNA-gedeelte omvat dat een DNA-deel bevat dat codeert voor een gewijzigde vorm van een NIM1 eiwit.

25 Een werkwijze voor het isoleren van een DNA-molecuul dat een DNA-gedeelte omvat dat een gewijzigde vorm van een NIMl sequentie bevat omvattende (a) het verschaffen van een nucleotide testreeks die in staat is specifiek te hybridiseren met een gewijzigde vorm van een NIMl-gen of mRNA, waarbij de testreeks een aaneensluitend gedeelte van de coderende sequentie van een gewijzigde 30 vorm van een NIMl eiwit uit een plant omvat met een lengte van ten minste 10 nucleotiden; (b) het onderzoeken van populaties van gekloneerde genomische DNA-fragmenten of cDNA-fragmenten uit een gekozen organisme op de aanwezigheid van 307779 19 andere gewijzigde vormen van NIM1 sequenties onder toepassing van de nucleotide testreeks die verkregen is bij stap (a); en (c) het isoleren van een DNA-molecuul dat een DNA-gedeelte omvat dat een gewijzigde vorm van een NIM1-gen bevat.

5 Een werkwijze voor het verschaffen van transgene planten die grotere hoeveelheden van het NIMJ-gen tot expressie brengen dan het wild-type, of functionele varianten en mutanten van het N1M1-gen tot expressie brengen.

Een werkwijze voor het verschaffen van transgene planten die grotere hoeveelheden van het NIM1-gen tot expressie brengen dan het wild-type, of 10 functionele varianten en mutanten van het NIM1 -gen tot expressie brengen, waarbij de expressie van het ΜΛ/7-gen op een niveau is dat ten minste twee maal zo hoog is als het expressieniveau van het NIM1-gen in wild-type planten.

Een werkwijze voor het verschaffen van transgene planten die grotere hoeveelheden van het NIM1 -gen tot expressie brengen dan het wild-type, of 15 functionele varianten en mutanten van het NJM1 -gen tot expressie brengen, waarbij de expressie van het NIM1 -gen op een niveau is dat ten minste tien maal zo hoog is als het expressieniveau van het NIMl-gen in wild-type planten.

Het nim mutante fenotype 20 De onderhavige uitvinding betreft mutante planten, als ook hieruit geïsoleerde genen, die tekort schieten in hun normale reactie tegen infecties met pathogenen, in zoverre dat zij geen genen tot expressie brengen die samenhangen met SAR. Deze mutanten worden aangeduid als nwi-mutanten (voor "non-inducible immunity") en zijn "universal disease susceptible" (UDS) daar zij gevoelig zijn voor veel stammen 25 en pathotypen van pathogenen van de gastheerplant en tevens voor pathogenen die de gastheerplant doorgaans niet infecteren, maar normaal andere gastheren infecteren. Dergelijke mutanten kunnen worden geselecteerd door zaden of ander biologisch materiaal met mutagene middelen te behandelen en de als afstammeling verkregen planten te selecteren op het UDS-fenotype door de als afstammeling verkregen 30 planten te behandelen met bekende chemische middelen die SAR induceren (bijvoorbeeld INA) en vervolgens de planten met een bekende pathogeen te infecteren. Niet-induceerbare mutanten ontwikkelen ernstige ziekteverschijnselen onder deze omstandigheden, terwijl wild-type planten door de chemische verbinding 1007779 20 geïnduceerd worden tot systemisch verworven resistentie, mm-mutanten kunnen evenzeer worden geselecteerd uit mutante populaties die zijn verkregen door chemische mutagenese of door mutagenese onder bestraling, alsook uit populaties die zijn gegenereerd door het invoegen van T-DNA en door transposon-geïnduceerde 5 mutagenese. Technieken voor het genereren van mutante plantenlijnen zijn in het vakgebied algemeen bekend.

mm-mutanten verschaffen nuttige indicatiemiddelen voor het evalueren van belasting door een ziekte tijdens in het veld uitgevoerde pathogeneseproeven waarbij het natuurlijke weerstandsfenotype van de zogenaamde wildtype (dat wil zeggen de 10 niet-mutante) planten uiteen kunnen lopen en derhalve niet een betrouwbare standaard voor de gevoeligheid kunnen verschaffen. Verder kunnen nim planten ook worden toegepast bij onderzoek naar mogelijke transgenen met ziekteresistentie. Door een bestaande m'm-hjn als ontvanger voor transgenen te gebruiken, kan de bijdrage van het transgen aan de ziekteresistentie direct worden bepaald ten opzichte van een 15 basisniveau van gevoeligheid. Verder kunnen nim-planten worden gebruikt als een hulpmiddel bij het doorgronden van plant-pathogeen interacties, mm-gastheerplanten geven geen systemische reactie na aanval door een pathogeen, en de ongehinderde ontwikkeling van het pathogeen is een ideaal systeem voor het onderzoeken van de biologische interactie hiervan met de gastheer.

20 Daar m'm-gastheerplanten tevens gevoelig kunnen zijn voor pathogenen buiten het gastheer-traject waar zij doorgaans binnen vallen, hebben deze planten tevens wezenlijke bruikbaarheid in het moleculaire, genetische en biologische onderzoek van gastheer-pathogeeninteracties. Verder maakt het UDS-fenotype van mm-planten deze tevens bruikbaar bij het beproeven van fungiciden. Mm-mutanten die zijn 25 geselecteerd in een specifieke gastheer hebben aanzienlijke bruikbaarheid bij het beproeven van fungiciden onder toepassing van deze gastheer en pathogenen voor deze gastheer. Dit voordeel is gelegen in het UDS-fenotype van de mutant, dat de problemen ondervangt die worden ondervonden met gastheren die differentieel gevoelig zijn voor verschillende pathogenen en pathotypen, of zelfs resistent zijn 30 tegen sommige pathogenen of pathotypen.

nim-mutanten hebben verder bruikbaarheid bij het beproeven van fungiciden tegen een spectrum aan pathogenen en pathotypen onder toepassing van een heterologe gastheer, dat wil zeggen een gastheer die onder normale omstandigheden 1007779 21 niet binnen het gastheertraject van een specifieke pathogeen valt. Zo vergemakkelijkt de gevoeligheid van m'm-mutanten van Arabidopsis voor pathogenen van andere soorten (bijvoorbeeld gewasplantensoorten) werkzame procedures voor het beproeven van fungiciden tegen gewasplanten.

5

De Arabidopsis thaliana niml mutant

Een Arabidopsis thaliana mutant die niml ("noninducible immunity") wordt genoemd en die de groei van P. parasitica (de voornaamste oorzaak van donzige meeldauwziekte) mogelijk maakt na behandeling met INA, wordt beschreven in 10 Delaney et al., 1995. Hoewel niml SA kan ophopen na infectie met een pathogeen kan noch SAR genexpressie noch ziekteresistentie worden geïnduceerd, hetgeen suggereert dat de mutatie de route stroomafwaarts van SA blokkeert, niml is tevens beperkt in zijn vermogen te reageren op INA of BTH, hetgeen suggereert dat de blokkade stroomafwaarts van de inwerking van deze chemicaliën valt (Delaney et al., 15 1995; Lawton et al., 1996). De eerste Arabidopsis niml mutant (hieronder aangeduid als niml-1) werd geïsoleerd uit 80.000 planten van een met T-DNA gemarkeerd Arabidopsis ecotype Issilewskija (Ws-0) populatie door het besproeien van twee weken oude planten met 0,33 mM INA gevolgd door enten met P. parasitica (Delaney et al., 1995). Planten die de groei van fungiciden ondersteunden na 20 behandeling met INA werden geselecteerd als mogelijke mutanten. Vijf verdere mutanten (hieronder aangeduid als niml-2, niml-3, niml-4, niml-5 en niml-6) werden geïsoleerd uit 280.000 M2 planten van een met ethylmethaansulfonaat (EMS) gemutageniseerde Ws-0 populatie.

Om te bepalen of de mutanten dominant of recessief waren werden Ws-0 25 planten gebruikt als stuifmeeldonors voor het kruisen van ieder van deze mutanten.

De F, planten werden ingedeeld aan de hand van hun vermogen schimmelgroei te ondersteunen na behandeling met INA. Zoals blijkt uit tabel 3 van de voorbeelden waren alle niml-1, niml-2, niml-3, niml-4 en niml-6 F, planten voor wat betreft hun fenotype van het wild-type, hetgeen een recessieve mutatie in iedere lijn aangeeft.

30 niml-5 vertoonde het wm-fenotype in alle 35 F, planten, hetgeen aangeeft dat deze specifieke mutant dominant is. Ter bevestiging werd de omgekeerde kruising uitgevoerd waarbij niml-5 als de stuifmeeldonor werd gebruikt voor het bevruchten van de Ws-0 planten. Hierbij waren alle 18 F, planten fenotypisch nim, hetgeen de 1007779 22 dominantie van de niml-5 mutatie bevestigt.

Om te bepalen of de niml-2 tot en met niml-6 mutaties allelisch waren met de hiervoor gekarakteriseerde niml-1 mutatie werd stuifmeel van niml-1 gebruikt voor het bevruchten van niml-2 tot en met niml-6. Daar niml-1 resistentie tegen 5 kanamycine droeg, werden de F, nakomelingen geïdentificeerd aan de hand van resistentie tegen antibiotica. In alle gevallen waren de kanamycine-resistente F, planten nim, hetgeen aangeeft dat zij allelisch zijn met de niml-1 mutant. Omdat de niml-5 mutant dominant is en klaarblijkelijk homozygoot voor de mutatie, was het noodzakelijk niml-1 complementatie in de F2 generatie te analyseren. Als niml-1 en 10 niml-5 allelisch zijn, zou te verwachten zijn dat alle F2 planten een m'm-fenotype vertonen. Zo niet, dan zou te verwachten zijn dat 13 van 16 F2 planten een nim-fenotype vertonen. Van 94 planten ondersteunden 88 planten duidelijk groei van schimmel na behandeling met INA. Zes planten vertoonden een hiermee samenhangend fenotype van zwarte vlekken op de bladeren die deden denken aan een 15 lesie-nabootsend fenotype en deze ondersteunden weinig groei van schimmel na behandeling met INA. Daar niml-5 een puntmutatie in het N1M1-gen draagt (zie hieronder), wordt het geacht een niml alleel te zijn.

Om de relatieve sterkte van de verschillende niml allelen te bepalen, werd iedere mutant onderzocht op de groei van P. parasitica onder normale 20 groeiomstandigheden en na voorafgaande behandeling met SA, INA of BTH. Zoals blijkt uit tabel 1 ondersteunen, onder normale groei, niml-1, niml-2, niml-3, niml-4 en niml-6 alle bij benadering dezelfde mate van schimmelgroei, die enigszins sneller was dan de Ws-0 controle. De uitzondering waren de niml-5 planten, waarin de groei van schimmel met verschillende dagen was vertraagd vergeleken met zowel de andere 25 niml mutanten als de Ws-0 referentie, maar uiteindelijk gingen ook alle niml-5 planten ten onder aan de schimmel. Na behandeling met SA konden de mutanten in drie klassen worden ingedeeld: niml-4 en niml-6 planten vertoonden een in verhouding snelle schimmelgroei; niml-I, niml-2, niml-3 planten vertoonden een enigszins geringere mate van schimmelgroei; en de schimmelgroei in niml-5 planten 30 was zelfs geringen dan in de onbehandelde Ws-0 referenties. Na behandeling met INA of BTH leken de mutanten tevens in drie klassen te vallen, waarbij niml-4 het sterkst werd beperkt in zijn vermogen schimmelgroei tegen te gaan na chemische behandeling; niml-1, niml-2, niml-3 en niml-6 alle matig waren beperkt; en niml-5 1 007779 23 slechts in geringe mate was beperkt. In deze proeven ondersteunde Ws-0 geen schimmelgroei na behandeling met INA of BTH. Derhalve, ten aanzien van de remming van schimmelgroei na chemische behandeling, vallen de mutanten in drie klassen, waarbij niml-4 het sterkst beperkt is, niml-1, niml-2, niml-3 en niml-6 een 5 matige remming van de schimmel vertoonden, en niml-5 een slechts in geringe mate beperkte weerstand tegen schimmels vertoonde.

De vorming van PR-1 mRNA werd tevens gebruikt als een maatstaf voor het classificeren van de verschillende niml allelen. RNA werd onttrokken aan planten 3 dagen na behandeling met water of chemicaliën, of 14 dagen na enten met een 10 verenigbare schimmel (P. parasitica isolaat Emwa). De RNA gel vlek in figuur 3 laat zien dat PR-1 mRNA in grote gehalten werd gevormd na behandeling van wild-type planten met SA, INA of BTH of infectie met P. parasitica. In de niml-1, niml-2 en wW-i-planten, was de vorming van PR-1 mRNA zeer sterk verminderd ten opzichte van het wild-type na behandeling met chemicaliën. PR-1 mRNA was tevens 15 verminderd na infectie met P. parasitica, maar er was nog steeds enige mate van ophoping in deze mutanten. In de niml-4 en niml-6 planten was de vorming van PR-1 mRNA na behandeling met chemicaliën nog sterker verminderd dan in de andere allelen (zoals blijkt uit langere blootstellingen) en werd aanzienlijk minder PR-1 mRNA gevormd na infectie met P. parasitica, hetgeen de het idee ondersteunt dat 20 deze in het bijzonder sterke niml allelen zouden kunnen zijn. Het is interessant dat PR-1 mRNA vorming was toegenomen in de niml-5 mutant, maar slechts in geringe mate werd geïnduceerd na chemische behandeling of infectie met P. parasitica. Gebaseerd op zowel PR-1 mRNA vorming als schimmel infectie, vallen deze mutanten in drie klassen: aanzienlijk beperkte allelen (niml-4 en niml-6)·, matig 25 beperkte allelen (niml-1, niml-2 en niml-3)·, en een zwak beperkte alleel (niml-5).

In kaart brengen van de fiine structuur van de niml mutatie

Om een ruwe positie voor NIM1 te bepalen werden 74 F2 nïm-fenotypeplanten uit een kruising tussen niml-1 (Ws-0) en Landsberg erecta (Ler) geïdentificeerd aan 30 de hand van hun gevoeligheid voor P. parasitica en het ontbreken van het ophopen van PR-1 mRNA na behandeling met INA. Na het bepalen van een aantal eenvoudige sequenti el engte polymorfisme (SSLP) markeringingen (Bell en Ecker 1994), werd 1007779 24 gevonden dat niml zich op ongeveer 2.8 centimorgans (cM) van nga 128 en 8,2 cM van ngalll op de lagere arm van chromosoom 1 bevindt. In een hieropvolgende analyse werd gevonden dat niml-1 zich tussen ngal 11 en ongeveer 4 cM van de SSLP markering ATHGENEA bevindt.

5 Voor het in kaart brengen van de fijne structuur werden 1138 nim planten uit een F2 populatie uit kruising tussen niml-1 en LerDP23 geïdentificeerd op basis van zowel hun onvermogen PR-1 mRNA op te hopen, als hun vermogen schimmelgroei te ondersteunen na behandeling met ΓΝΑ. DNA werd aan deze planten onttrokken en onderzocht op zygositeit bij zowel ATHGENEA en ngal 11. Zoals blijkt uit figuren 10 5A-5D werden tussen ATHGENEA en niml 93 recombinante chromosomen geïdentificeerd, hetgeen een genetische afstand van ongeveer 4,1 cM (93 van 2276) aangeeft, en werden tussen ngal 11 en niml 239 recombinante chromosomen geïdentificeerd, hetgeen een genetische afstand van ongeveer 10,5 cM (239 van 2276) aangeeft. Informatieve recombinanten in het interval van ATHGENEA tot ngal 11 15 werden verder geanalyseerd onder toepassing van geamplificeerd fragmentlengte polymorfisme (AFLP) analyse (Vos et al., 1995).

Aanvankelijk werden 10 AFLP markeringingen tussen ATHGENEA en ngal 11 geïdentificeerd en deze werden gebruikt voor het construeren van een kaart met lage resolutie van het gebied (figuur 5A). De AFLP markerings W84.2 (1 cM van niml) 20 en W85.1 (0,6 cM van niml) werden gebruikt voor het isoleren van gist artificieel chromosoom (YAC)-klonen uit de CIC (voor "Centre d’Etude du Polymorphisme Humain, INRA en CNRS") bibliotheek (Creusot et al., 1995). Twee YAC klonen, CIC12H07 en CIC12F04, werden geïdentificeerd met W84.2 en twee YAC-klonen CIC7E03 en CIC10G07 (resultaten niet weergegeven) werden geïdentificeerd met de 25 W85.1 markering. Echter, hierbij werd bepaald dat er een onderbreking lag tussen de twee reeksen flankerende YAC-klonen. Uitgaande van dit punt werden de bacteriële artificiële chromosoom (BAC) en PI klonen die overlap vertoonden met CIC12H07 en CIC12F04 geïsoleerd en in kaart gebracht, en drie opeenvolgende verplaatsingsstappen werden uitgevoerd om het BAC/P1 contig naar N1M1 uit te 30 breiden (Liu et al., 1995; Chio et al., 1995). Op verschillende tijden gedurende het verplaatsen werden nieuwe AFLPs ontwikkeld die specifiek waren voor BAC of PI klonen, en deze werden gebruikt om te bepalen of het NIM 1-gen was ingekruist. Hierbij werd bepaald dat NIM1 was ingekruist wanneer BAC en PI klonen werden 1 007 77 9 25 geïsoleerd die zowel AFLP-markering L84.6a als AFLP-markering L84.8 vertoonden. De AFLP-markering L84.6a die wordt gevonden op PI klonen PI-18, PI-17, en Pl-21 identificeerde drie recombinanten, en markering L84.8 die werd gevonden op PI klonen PI-20, PI-22, PI-23 en PI-24, en BAC-klonen, BAC-04, BAC-05, en BAC-5 06 identificeerde één recombinant. Omdat deze klonen overlappen en zo een groot aaneensluitend gebied (>100 kb) vormen, en AFLP markeringen omvat die niml flankeren, bevond het gen zich in het aaneensluitende gebied. De BAC en PI klonen die het aaneensluitende gebied omsluiten werden gebruikt voor het genereren van acht verdere AFLP-markeringen, waaruit blijkt dat niml zich tussen L84.Y1 en L84.8 10 bevindt, hetgeen een onderbreking van ongeveer 0,09 cM aangeeft.

Een cosmide bibliotheek werd geconstrueerd in de met Agrobacterium-verenigbare T-DNA-cosmidevector pCLD04541, onder toepassing van DNA van BAC-06, BAC-04 en PI-18. Een cosmide contig werd ontwikkeld onder toepassing van AFLP-markeringen die van deze klonen waren afgeleid. Fysiek in kaart brengen 15 liet zien dat de fysieke afstand tussen L84.Y1 en L84.8 groter was dan 90 kb, hetgeen een genetische tot fysieke afstand van ongeveer 1 megabase per cM aangeeft. Om de latere identificatie van het NIMl-gen te vergemakkelijken, werd de DNA-sequentie van BAC-04 bepaald.

20 Isolatie van het NIMl-zen

Om de cosmiden die het NIMl-gen bevatten te identificeren, werden de 12 in tabel 4 van de Voorbeelden vermelde cosmiden getransformeerd tot niml-1, waarna de transformanten werden beoordeeld op hun vermogen het mutante fenotype aan te vullen. Cosmiden D5, El en D7 bleken allen niml-1 aan te vullen, zoals bepaald 25 door het vermogen van transformanten PR-1 mRNA op te hopen na behandeling met INA. De sequenties van de uiteinden van deze cosmiden werden bepaald en bleken zich op de DNA-sequentie van BAC-04 te bevinden. Er bevonden zich 9.918 baseparen in het DNA-gebied dat gemeenschappelijk was aan D7 en D5 en dat het N1M1-gen bevatte. Zoals blijkt uit figuur 5D, werden vier mogelijke gengebieden in 30 deze 10-kb sequentie geïdentificeerd. Gebied 1 zou mogelijk een eiwit van 19,105 D kunnen coderen, gebied 3 zou een eiwit van 44,554 D kunnen coderen en gebied 4 zou een eiwit van 52,797 D kunnen coderen. Gebied 2 had vier open afleesramen van verschillende grootte dicht op elkaar, hetgeen een gen met drie introns suggereert.

1 0 07 7 7 9 26

Analyse onder toepassing van het NetPlantGene programma (Hebsgaard et al., 1996) gaf aan dat er een hoge waarschijnlijkheid is dat het open afleesraam zou kunnen worden samengesplitst voor het vormen van één groot open afleesraam dat codeert voor een eiwit van 66,039 D.

5 Om te bepalen welk gengebied het NIM1-gen bevatte, werden gelvlekken met RNA dat was geïsoleerd uit bladweefsel van Ws-0 en van de verschillende niml mutanten na behandeling met water of chemicaliën, onderzocht met testreeksen van DNA van ieder van de vier gengebieden. In deze proeven werd er op gelet dat testreeksen tot een hoge specificiteit werden gemarkeerd en dat de autoradiografische 10 afbeeldingen gedurende meer dan 1 week werden blootgesteld. Volgens eerdere ervaringen identificeren deze omstandigheden RNA bij concentraties van ongeveer een kopie per cel. Het enige gengebied dat detecteerbaar RNA produceerde was gengebied 2. Zoals getoond in figuur 7, werd het mRNA dat werd geïdentificeerd door de testreeks voor gengebied 2, geïnduceerd door behandeling met BTH van 15 wild-type planten, maar niet in een van de mutanten. Verder nam de vorming van RNA in alle planten toe na infectie met P. parasitica, hetgeen aangeeft dat dit specifieke gen wordt geïnduceerd na infectie met een pathogeen.

Om het gengebied dat codeert voor NIM1 nader te bepalen, werd voor ieder van de niml allelen de DNA-sequentie van ieder van de vier gengebieden bepaald en 20 deze werd vergeleken met het overeenkomstige gengebied voor Ws-0. Geen mutaties werden waargenomen tussen Ws-0 en de mutante allelen in gengebied 3 of gengebied 4 en slechts een enkele verandering werd gevonden in gengebied 1 in de niml-6 mutant. Echter, een mutatie van een enkel basepaar werd gevonden in ieder van de allelen ten opzichte van Ws-0 voor gebied 2. De DNA-sequentie van gengebied 2 is 25 getoond in figuur 6. Zoals blijkt uit tabel 5 en uit figuur 6, is in niml-1 een enkele adenosine ingevoegd bij positie 3579, hetgeen een verschuiving van afleesraam veroorzaakt, hetgeen resulteert in een verandering van zeven aminozuren en een deletie van 349 aminozuren. In niml-2 is er een cytidine-in-thymidine verandering bij positie 3763 waardoor een histidinerest in een tyrosinerest wordt veranderd. In niml-30 3 wordt een enkele adenosinerest verwijderd op positie 3301, hetgeen een verschuiving van afleesraam veroorzaakt waardoor 10 aminozuren worden veranderd en 412 aminozuren worden verwijderd uit het voorspelde eiwit. Het is interessant dat zowel niml-4 als niml-5 een guanosine-tot-adenosine verandering bij positie 4160 1007779 27 hebben, waardoor een argininerest in een lysinerest wordt veranderd, terwijl er in niml-6 een cytosine-tot-thymidine verandering is die resulteert in een stopcodon, hetgeen een deletie van 255 aminozuren uit het voorspelde eiwit veroorzaakt. Hoewel de mutatie in niml-4 en niml-5 de consensus donorsplitsingplaats voor het mRNA 5 verandert, laat RT-PCR analyse zien dat deze mutatie niet leidt tot een wijziging in de mRNA splitsing (resultaten niet weergegeven).

NIM1 homologen

De DNA-sequentie van het gengebied 2 werd gebruikt in een "Blast"-onderzoek 10 (Altschul et al., 1990), waarbij een exacte overeenkomst met de in Arabidopsis tot expressie gebrachte sequentiemarkering (EST) T22612 en aanzienlijke overeenkomst met de rijst ESTs S2556, S2861, S3060 en S3481 (zie figuur 8) werden gevonden.

Een DNA-testreeks die baseparen 2081 tot 3266 omvat werd gebruikt voor het aftasten van een Arabidopsis cDNA bibliotheek, en 14 klonen die overeenkwamen 15 met gengebied 2 werden geïsoleerd. Vanuit de cDNA-sequentie kon de positie van de in figuur 6 getoonde exon/intron grenzen worden bevestigd. Snelle amplificatie van cDNA uiteinden door de polymerase kettingreactie (RACE) werd uitgevoerd onder toepassing van RNA van met INA-behandelde Ws-0 planten en de waarschijnlijke beginplaats van transcriptie werd bepaald bij de A op positie 2588 in figuur 6.

20 Door gebruik te maken van het NIM1 cDNA als een testreeks kunnen homologen van Arabidopsis NIM1 worden geïdentificeerd en geïsoleerd door het aftasten van genomisch of cDNA bibliotheken uit verschillende planten, zoals, maar niet beperkt tot de volgende gewassen: rijst, tarwe, gerst, rogge, mais, aardappel, wortel, zoete aardappel, suikerbiet, bonen, doperwten, chicorei, sla, kool, bloemkool, 25 broccoli, raap, radijs, spinazie, asperge, ui, knoflook, eierplant, peper, selderij, wortel, pompoen, in het bijzonder Cucurbita pepo, zucchini, komkommer, appel, peer, kweepeer, meloen, pruim, kers, perzik, nectarine, abrikoos, aardbei, druif, framboos, ananas, avocado, papaya, mango, banaan, soja, tabak, tomaat, sorghum of suikerriet. Standaard technieken voor het uitvoeren hiervan omvatten onderzoek door 30 hybridisatie van uit geplaatte cDNA-bibliotheken (dat wil zeggen plaques of koloniën; zie Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) en amplificatie door PCR onder toepassing van oligonucleotide basisreeksen (zie bijvoorbeeld Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications 1007779 28 eds., Academic Press (1990)). Geïdentificeerde homologen worden genetisch ingebracht in de onderstaande expressievectoren en tot in de bovengenoemde gewassen getransformeerd. Transformanten worden beoordeeld op verhoogde ziekteresistentie onder toepassing van geschikte pathogenen voor het te onderzoeken 5 gewas.

Zo zijn bijvoorbeeld door toepassing van DNA vlekanalyse NIM1 homologen waargenomen in de genomen van komkommer, tomaat, tabak, maïs, tarwe en gerst. Genomisch DNA is geïsoleerd uit komkommer, tomaat, tabak, maïs, tarwe en gerst, geknipt door restrictie met de enzymen BamHI, HindlII, Xbal of Sail, 10 electroforetisch gescheiden op 0,8% agarosegels en overgebracht naar nylonmembranen door het capillaire vlekvorming. Na verknopen onder Uv-straling voor het fixeren van het DNA, werd het membraan onder matig strenge omstandigheden [(1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; ImM EDTA, 250 mM natriumchloride) bij 55°C gedurende 18-24 uur] 15 gehybridiseerd aan met 32P-radioactief gemarkeerd Arabidopsis thaliana NIMJ cDNA. Na hybridisatie werden de vlekken gewassen onder matig strenge omstandigheden [6XSSC gedurende 15 mintuen (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C; 1XSSC is 0,15M NaCl, 15mM Na-citraat (pH 7,0)] en blootgesteld aan röntgenfilm om de met NIMJ overeenkomende banden zichtbaar te maken.

20 Verder kunnen tot expressie gebrachte sequentiemarkeringen (EST) waarvan gevonden is dat zij overeenkomen met het NIMJ-gen, zoals de hierboven beschreven EST’s van rijst, tevens worden gebruikt voor het isoleren van deze homologen. De EST’s van rijst kunnen in het bijzonder nuttig zijn voor het isoleren van NIMJ homologen uit andere monocotyle planten.

25 Homologen kunnen tevens worden verkregen door PCR. Bij deze werkwijze worden bekende homologen (bijvoorbeeld rijst en Arabidopsis) vergeleken. Gebieden met een hoge mate van overeenkomst of identiteit voor wat betreft aminozuren en DNA worden vervolgens gebruikt voor het maken van PCR-basisreeksen. Wanneer een geschikt gebied is geïdentificeerd worden basisreeksen voor dit gebied gemaakt 30 met verschillende substituties in de derde codonpositie. De PCR-reactie wordt uitgevoerd met cDNA of genomisch DNA onder verschillende standaardomstandigheden. Wanneer een band wordt verkregen, wordt deze gekloneerd en/of wordt de sequentie hiervan bepaald, om te bepalen of het een NIM1 homoloog 1 0 07 77 0 29 is.

Hoge expressie van MM/ voorziet planten van resistentie tegen ziekte

De onderhavige uitvinding betreft tevens de productie van transgene planten die 5 niveaus van het MM7-gen tot expressie brengen die hoger zijn dan in het wild-type, of functionele varianten en mutanten hiervan tot expressie brengen, en hierdoor een ziekteresistentie met breed werkingsspectrum vertonen. In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is de expressie van het MM/-gen bij een niveau dat ten minste tweemaal boven het expressieniveau van het MM/-gen in de 10 wild-type planten ligt, en bij voorkeur tienmaal boven het expressiegehalte van het wild-type. Hoge expressie van het MM/-gen bootst de invloed van inducerende verbindingen na, in zoverre dat het leidt tot planten met een fenotype van constitutieve immuniteit (CIM).

Verschillende methoden voor het produceren van planten die het MM/-gen tot 15 overexpressie brengen en hierdoor een CIM-fenotype vertonen, zijn beschreven. Een eerste methode is het selecteren van getransformeerde planten die een hoge expressie van MM/ hebben en daardoor een CIM-fenotype hebben, veroorzaakt door een insertieplaats- effect. Tabel 6 toont de resultaten van het testen van verschillende transformanten op resistentie tegen schimmelinfectie. Zoals blijkt uit deze tabel 20 vertoonde een aantal van de transformanten minder schimmelgroei dan normaal en vertoonden sommige in het geheel geen zichtbare schimmelgroei. RNA werd bereid uit verzamelde monsters en geanalyseerd zoals beschreven in Delaney et al., 1995. Vlekken werden gehybridiseerd met de Arabidopsis gentestreeks PR-1 (Uknes et al., 1992). Drie lijnen vertoonden vroege inductie van PR-1 genexpressie, in zoverre dat 25 PR-1 mRNA kon worden waargenomen op 24 tot 48 uur na behandeling met de schimmel. Deze drie lijnen vertoonden tevens resistentie tegen schimmelinfectie.

Verder worden werkwijzen beschreven voor het construeren van transformatievectoren van planten die een constitutieve, in planten werkzame promotor, zoals de CaMV 35S promotor, omvatten, welke op werkzame wijze is 30 verbonden met een coderend gebied dat codeert voor een actief NIM1 eiwit. Hoge gehalten van het actieve NIM1 eiwit produceren hetzelfde ziekte-resistentie effect als chemische inductie met inducerende verbindingen zoals BTH, INA en SA.

1007779 30

Het NIMl-een is een homoloog van ΙκΒα

Het NIMl-gen is een sleutelbestanddeel van de systemisch verworven resistentie (SAR) route in planten (Ryals et al., 1996). Het NIMl-gen houdt verband met de activering van SAR door chemische en biologische inducerende factoren, en is in 5 samenhang met dergelijke inducerende factoren vereist voor SAR en SAR

genexpressie. De positie van het NIMl-gen werd bepaald door moleculair biologische analyse van het genoom met mutante planten waarvan bekend is dat zij het mutante niml-gen dragen, hetgeen de gastheerplanten een extreme gevoeligheid voor een groot aantal verschillende pathogenen geeft en het voor hen onmogelijk maakt te 10 reageren op pathogene en chemisch inducerende factoren van SAR. Het wild-type NIMl-gen van Arabidopsis is in kaart gebracht en de sequentie ervan is bepaald (SEQ ID nr.: 2). Het wild-type NIMl-gen product (SEQ ID nr.: 3) is betrokken bij de signaaltri./isductiecascade die leidt tot zowel SAR als gen-voor-gen ziekteresistentie in Arabidopsis (Ryals et al., 1997). Recombinante overexpressie van 15 de wild-type vorm van NIM1 leidt tot planten met een fenotype van constitutieve immuniteit (CIM) en verleent daardoor ziekteresistentie aan transgene planten. Toegenomen niveaus van het actieve NIM1 eiwit produceren hetzelfde ziekteresistentie effect als chemische inductie met inducerende chemicaliën zoals BTH, 1NA en SA.

20 De sequentie van het NIMl-gen (SEQ ID nr.: 2) werd gebruikt in BLAST- onderzoeken, en overeenkomende sequenties werden geïdentificeerd op basis van homologie van een tamelijk hoog geconserveerd domein in de MM/-gensequentie met ankyrin domeinen die werden gevonden in een aantal eiwitten zoals spectrinen, ankyrinen, NF-κΒ en IkB (Michaely en Bennett, Trends Cell Biol. 2, 127-129 25 (1992)). Naast het ankyrin motief werden echter door gebruikelijke computeranalyse geen verdere sterke homologieën waargenomen, waaronder homologie met ΙκΒα. Ondanks de negatieve resultaten die met de computerprogramma’s werden verkregen, werden paarsgewijze visuele inspecties tussen het NIM1 eiwit (SEQ ID nr.: 3) en 70 bekende ankyrin-bevattende eiwitten uitgevoerd, en verrassende overeenkomsten met 30 leden van de ΙκΒα-klasse transcriptieregulatoren (Baeuerle en Baltimore 1996;

Baldwin 1996) werden gevonden. Zoals weergegeven in figuur 1 vertoont het NIM1 eiwit (SEQ ID nr.: 3) een aanzienlijke homologie met ΙκΒα eiwitten uit muis, rat en varken (respectievelijk SEQ ID nrs.: 18, 19 en 20).

1007779 31 NIM1 bevat een aantal belangrijke structurele gebieden van ΙκΒα door de gehele lengte van het eiwit, waaronder ankyrin domeinen (aangegeven door de onderbroken onderstreping in figuur 9), 2-amino-eindstandige serineresten (aminozuren 55 en 59 van NIM1), een paar lysineresten (aminozuren 99 en 100 in 5 NIM1) en een zuur C-eindstandig gedeelte. In het geheel genomen hebben NIM1 en ΙκΝα 30% van de resten gemeen en hebben zij conservatieve vervangingen bij 50% van de resten. Er is derhalve homologie tussen ΙκΒα en NIM1 in de eiwitten, met een totale mate van overeenkomst van 80%.

Een manier waarop de ΙκΒα eiwitten werken in de signaaltransductie is door 10 het binden aan de in het cytosol voorkomende transcriptiefactor NF-κΒ, waardoor voorkomen wordt dat dit de kern binnentreedt en de transcriptie van genen waarop het gericht is wijzigt (Baeuerle en Baltimore, 1996; Baldwin, 1996). De genen waarop NF-κΒ gericht is regelen (activeren of remmen) verschillende cellulaire processen, waaronder antivirale, antimicrobiële en celdodende reacties (Baeuerle en 15 Baltimore, 1996). Wanneer de signaaltransductieroute wordt geactiveerd, wordt ΙκΒα bij twee serineresten (aminozuren 32 en 36 van ΙκΒα in de muis) gefosforyleerd. Dit programmeert ubiquitinering bij een dubbele lysinerest (aminozuren 21 en 22 van muize ΙκΒα). Na ubiquitinering wordt het NF-κΒ/ΙκΒ complex door het proteosoom geleid, waar ΙκΒα wordt afgebroken en NF-κΒ aan de kern wordt afgegeven.

20 De gefosforyleerde serineresten die belangrijk zijn voor ΙκΒα verwerking zijn geconserveerd in NIM1 binnen een groot aaneensluitend blok van geconserveerde sequentie van aminozuren 35 tot 84 (figuur 9). In tegenstelling tot ΙκΒα, waar de dubbele lysinerest zich ongeveer 15 aminozuren in de richting van het N-einde van het eiwit bevindt, is er in NIM1 een dubbele lysinerest die zich ongeveer 40 25 aminozuren naar het C-einde bevindt. Verder bestaat een hoge mate van homologie tussen NIM1 en ΙκΒα in het serine/treonine-rijke carboxyl-eindstandige gebied waarvan is aangetoond dat het belangrijk is in basale omzettingssnelheid (Sun et al., Mol. Cell. Biol. 16, 1058-1065 (1996)). Volgens de onderhavige uitvinding, gebaseerd op de analyse van de structurele homologie en de aanwezigheid van 30 elementen waarvan bekend is dat zij belangrijk zijn voor de werking van ΙκΒα, wordt verwacht dat NIM1 op een zelfde wijze werkzaam is als ΙκΒα, en analoge invloed op de genregulatie in planten heeft.

Van planten die het wild-type NIMl-gcn bevatten, wordt verwacht dat zij meer 1 007779 32 NIM1 -genproduct (ΙκΒ-homoloog) of minder fosfoiylering van het NIM1 -genproduct (ΙκΒ-homoloog) zullen vertonen wanneer zij worden behandeld met inducerende chemicaliën. Overeenkomstig dit model, is het resultaat dat het in de plant voorkomende NF-icB-homoloog uit de kern wordt gehouden, en SAR-genexpressie en 5 resistentiereacties kunnen optreden. In de niml mutante planten is een niet-werkzaam ATM/-genproduct aanwezig. Derhalve, overeenkomstig dit model, is het NF-kB homoloog vrij om de kern binnen te gaan en resistentie en SAR genexpressie te onderdrukken.

Overeenkomstig dit idee vertonen dierlijke cellen die zijn behandeld met 10 salicylzuur verhoogde stabiliteit/voorkomen van IkB en een vermindering van actief NF-κΒ in de kern (Kopp en Ghosh, 1994). Het is bekend dat mutaties van IkB werkzaam zijn als super-repressoren of dominant-negatieven (Britta-Mareen Traenckner et al., EMBO 14: 2876-2883 (1995); Brown et al., Science 267: 1485-1488 (1996); Broekman et al., Molecular and Cellular Biology 15: 2809-2818 (1995); 15 Wang et al., Science 274: 784-787 (1996)). Deze mutante vormen van IkB binden aan NF-κΒ maar zijn niet gefosforyleerd of geubiquitineerd en daardoor niet afgebroken. NF-κΒ blijft gebonden aan het IkB en kan daardoor de kern niet binnengaan.

20 Gewijzigde vormen van de A7M/-gen

Gezien het bovenstaande omvat de onderhavige uitvinding gewijzigde vormen van ATM/ die werkzaam zijn als dominant-negatieve regulatoren van de SAR-signaal transductieroute. Planten die getransformeerd zijn met deze dominant negatieve vormen van ATM/ hebben het tegengestelde fenotype als niml mutante planten, in 25 zoverre dat de planten die met gewijzigde vormen van NIM1 zijn getransformeerd constitutieve SAR genexpressie vertonen en derhalve een CIM-fenotype hebben. Vanwege de plaats die het ATM/-gen in de SAR signaaltransductieroute inneemt, wordt verwacht dat een aantal wijzigingen van het gen, anders dan hierin specifiek worden beschreven, zullen leiden tot constitutieve expressie van SAR-genen, en 30 derhalve tot een CIM-fenotype.

Fosforylering van serineresten in humaan ΙκΒα is vereist voor door prikkels geactiveerde afbraak van ΙκΒα en daardoor voor het activeren van NF-kB. Mutagenese van de serineresten (S32 en S36) in menselijk ΙκΒα tot alanineresten 1007779 33 leidt tot prikkel-geïnduceerde fosforylering, waardoor met het proteosoom-samenhangende ΙκΒα afbraak wordt geblokkeerd (Traenckner et al., 1995; Brown et al., 1996; Broekman et al., 1995; Wang et al., 1996). Deze gewijzigde vorm van ΙκΒα kan werkzaam zijn als een dominant-negatieve vorm doordat het NF-κΒ in het 5 cytoplasma vasthoudt en derhalve stroomafwaarts van de signaalgebeurtenissen blokkeert. Gebaseerd op een vergelijking tussen de aminozuursequenties van NIM1 en IkB zoals weergegeven in figuur 9, zijn serineresten 55 (S55) en 59 (S59) in N1M1 (SEQ ID nr.: 3) homoloog met S32 en S36 in menselijk ΙκΒα. Om dominant-negatieve vormen van NIM1 te construeren, worden de serineresten op 10 aminozuurposities 55 en 59 gemutageniseerd tot alanineresten. Derhalve wordt, volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, het NIMl-gen zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product alanineresten in plaats van serineresten heeft op de aminozuurposities die overeenkomen met posities 55 en 59 van de Arabidopsis NIM1 aminozuursequentie. De onderhavige uitvinding omvat tevens 15 ziekte-resistente transgene planten die getransformeerd zijn met een dergelijke gewijzigde vorm van het N1M1-gen, alsook werkwijzen voor het toepassen van deze gewijzigde vorm van het NIMl-gen voor het verlenen van ziekteresistentie aan, en het activeren van SAR-genexpressie in, planten die hiermee zijn getransformeerd.

Het verwijderen van aminozuren 1-36 (Broekman et al., 1995; Sun et al., 1996) 20 of 1-72 (Sun et al., 1996) van menselijk ΙκΒα, dat ubiquinerings-lysineresten K21 en K.22 alsook fosforyleringsplaatsen S32 en S36 omvat, leidt tot een dominant-negatief ΙκΒα-fenotype in getransfecteerde humane celkweken. Bij een N-eindstandige verwijdering van de eerste 125 aminozuren van het N1M1-genproduct worden acht lysineresten verwijderd die zouden kunnen dienen als ubiquineringsplaatsen en tevens 25 als mogelijke fosforyleringsplaatsen bij S55 en S59 zoals hierboven besproken. Derhalve wordt, volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, het NIMl-gen zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product bij benadering de eerste 125 aminozuren mist, vergeleken met de natuurlijke Arabidopsis NIM1 aminozuursequentie. De onderhavige uitvinding omvat tevens ziekteresistente 30 transgene planten die zijn getransformeerd met een dergelijke gewijzigde vorm van het NIMl-gen, alsook werkwijzen voor het gebruik van deze gewijzigde vorm van het NIMl-gen voor het verlenen van ziekteresistentie aan, en het activeren van SAR-genexpressie in, planten die hiermee zijn getransformeerd.

1 007779 34

Het verwijderen van aminozuren 261-317 van humaan ΙκΒα kan leiden tot verhoogde intrinsieke stabiliteit door het blokkeren van constitutieve fosforylering van serine- en treonineresten in het C-eindstandige gedeelte. Verwacht wordt dat deze gewijzigde vorm van ΙκΒα werkzaam is als een dominant-negatieve vorm. Een 5 gebied dat rijk is in serine- en treonineresten bevindt zich bij aminozuren 522-593 in het C-eindstandige gedeelte van NIM1. Derhalve wordt, volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, het NIM1 zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product bij benadering zijn C-eindstandige gedeelte mist, waaronder aminozuren 522-593, vergeleken met de natuurlijke Arabidopsis 10 NIM1 aminozuursequentie. De onderhavige uitvinding omvat tevens ziekteresistente transgene planten die met een dergelijke vorm van het NIMI-gen zijn getransformeerd, alsook op werkwijzen voor het toepassen van deze gewijzigde vorm van het NIMI-gen voor het verlenen van ziekteresistentie aan, en het activeren van SAR-genexpressie in, planten die hiermee zijn getransformeerd.

15 Volgens een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, worden gewijzigde vormen van het MM7-genproduct verschaft, die het gevolg zijn van het verwijderen van, of de vorming van chimeren bij, C-eindstandige en N-eindstandige gedeelten. Volgens weer een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding worden constructen verschaft die de ankyringebieden van het NIMI-gen bevatten. De 20 onderhavige uitvinding omvat tevens ziekte-resistente transgene planten die met een dergelijk NIM1 chimeer of ankyrinconstruct zijn getransformeerd, alsook werkwijzen voor het toepassen van deze varianten van het NIMI-gen voor het verlenen van ziekteresistentie aan, en het activeren van SAR-genexpressie in, planten die hiermee zijn getransformeerd.

25 De uitvinding omvat tevens werkwijzen voor het activeren van SAR in planten en het verlenen aan planten van een CIM-fenotype en van ziekteresistentie met breed werkingsspectrum door het transformeren van de planten met DNA-moleculen die coderen voor gewijzigde vormen van het MM/-genproduct. De onderhavige uitvinding omvat verder planten die met een gewijzigde vorm van het NIMI-gen zijn 30 getransformeerd.

Ziekteresistentie

De overexpressie van het wild-type NIM1 in planten en de expressie van 1007779 35 gewijzigde vormen van het NIM1 in planten leidt tot immuniteit tegen een groot aantal verschillende plantenpathogenen, waaronder, maar niet beperkt tot, virussen en viro'iden, bijvoorbeeld tabakmozaïekvirus of komkommermozaïekvirus, ringvlekvirus of necrosisvirus, pelargoniumbladkrulvirus, vlekvirus op de rode klaver, virussen die 5 de groei van tomaten beperken, en soortgelijke virussen; fungi, bijvoorbeeld Phythophthora parasitica en Peronospora tabacina; bacteriën, bijvoorbeeld Pseudomonas syringae en Pseudomonas tabaci, insecten zoals bladluizen, bijvoorbeeld Myzus persicae; en lepidoptera, bijvoorbeeld Heliothus spp.; en nematoden, bijvoorbeeld Meloidogyne incognita. De vectoren en werkwijzen van de 10 uitvinding zijn bruikbaar tegen verschillende ziekteveroorzakende organismen waaronder, maar niet beperkt tot, donsachtige meeldauwziekten, zoals Scleropthora macrospora, Scleropthora rayissiae, Sclerospora graminicola, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora sacchari en Peronosclerospora maydis; plantenroesten zoals Puccinia sorphi, Puccinia polysora 15 en Physopella zeae; andere schimmels zoals Cercospora zeae-maydis, Colletotrichum graminicola, Fusarium monoliforme, Gibberella zeae, Exserohilum turcicum, Kabatiellu zeae, Erysiphe graminis, Septoria en Bipolaris maydis; en bacteriën zoals Erwinia stewartii.

De werkwijzen volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden toegepast 20 voor het verlenen van ziekteresistentie aan een groot aantal verschillende planten, waaronder bedektzadigen, monocotyle en dicotyle planten. Hoewel ziekteresistentie kan worden verleend aan iedere plant die binnen deze brede klassen valt, is de uitvinding in het bijzonder nuttig voor toepassing bij in voor de landbouw belangrijke gewasplanten, zoals rijst, tarwe, gerst, rogge, mais, aardappel, wortel, zoete 25 aardappel, suikerbiet, bonen, doperwten, chicorei, sla, kool, bloemkool, broccoli, raap, radijs, spinazie, asperge, ui, knoflook, eierplant, peper, selderij, wortel, pompoen, in het bijzonder Cucurbita pepo, zucchini, komkommer, appel, peer, kweepeer, meloen, pruim, kers, perzik, nectarine, abrikoos, aardbei, druif, framboos, ananas, avocado, papaya, mango, banaan, soja, tabak, tomaat, sorghum of suikerriet. 30 Getransformeerde cellen kunnen tot gehele planten worden geregenereerd, zodanig dat het gen ziekteresistentie aan de gehele transgene planten verleent. Het expressiesysteem kan worden aangepast zodat de ziekteresistentie continu of constitutief tot expressie wordt gebracht.

.1 007 7:: 36

Recombinant DNA-technoloeie

Het NIM1 DNA molecuul of genfragment dat ziekteresistentie aan planten verleent doordat het inductie van SAR-genexpressie mogelijk maakt, of de gewijzigde vorm van het ΜΛ/7-gen die ziekteresistentie aan planten verleent doordat het de 5 SAR-genexpressie versterkt, kan in planten of bacteriële cellen worden genomen door toepassing van gebruikelijke recombinant DNA-technologie. In het algemeen omvat dit het inbrengen van het DNA-molecuul dat valt binnen SEQ ID nr.: 1, een functionele variant hiervan of een molecuul dat codeert voor een van de hierboven beschreven gewijzigde vormen van NIM1, in een expressiesysteem waarin het DNA-10 molecuul heteroloog is (dat wil zeggen normaal niet aanwezig). Het heterologe DNA-molecuul wordt in een geschikte oriëntatie en een juist afleesraam in het expressiesysteem of in de vector ingebracht. De vector omvat de vereiste elementen voor de transcriptie en de translatie van de ingebrachte, voor een eiwit coderende sequenties. Een groot aantal vectorsystemen die bekend in het vakgebied kunnen 15 worden gebruikt, zoals plasmiden, bacteriofaagvirussen en andere gemodificeerde virussen. Geschikte vectoren omvatten, maar zijn niet beperkt tot, virale vectoren zoals lambda vectorsystemen λgtll, AgtlO en Charon 4; plasmidevectoren zoals pBI121, pBr322, pACYC177, pACYC184, pAR-series, pKK223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pRK290, pKC37, pKClOl, pCDNAII; en soortgelijke 20 systemen. De hierin beschreven NIM1 coderende sequentie en de gewijzigde NIM1 coderende sequentie kunnen in de vector worden gekloneerd door toepassing van standaard kloneringstechnieken uit het vakgebied, zoals beschreven door Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).

25 Om een efficiënte expressie van het gen of genfragment volgens de onderhavige uitvinding te verkrijgen, moet een promotor die leidt tot een geschikt expressieniveau of tot constitutieve expressie in de expressievector aanwezig zijn. Hierbij bindt doorgaans RNA-polymerase aan de promotor en initieert transcriptie van een gen. Promotors verschillen in hun sterkte, dat wil zeggen in hun vermogen als promotor 30 voor transcriptie te dienen. Afhankelijk van het gebruikte gastheercelsysteem, kan ieder van een aantal geschikte promotors worden gebruikt. De bestanddelen van de expressiecassette kunnen worden gemodificeerd voor het verhogen van de expressie. Zo kunnen bijvoorbeeld afgeknotte sequenties, nucleotidesubstituties of andere 1 007779 37 modificaties worden toegepast. Plantencellen die met dergelijke gemodificeerde expressiesystemen zijn getransformeerd, zullen overexpressie of constitutieve expressie vertonen van de genen die vereist zijn voor de activering van SAR.

5 A. Constructie van plantentransformerinesvectoren

Een groot aantal verschillende transformeringsvectoren voor transformeren van planten zijn beschikbaar, en de genen volgens de uitvinding kunnen in combinatie met dergelijke vectoren worden toegepast. De keuze van de vector zal afhangen van de bij voorkeur toegepaste transformeringstechniek en de te transformeren soort. Voor 10 bepaalde te transformeren soorten, kunnen verschillende markeringen voor selectie met antibiotica of herbiciden de voorkeur verdienen. Selectiemarkeringen die veel worden gebruikt bij transformatie omvatten het nptll gen dat resistentie tegen kanamycine en soortgelijke antibiotica verleent (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)), het bar gen, dat resistentie tegen 15 herbicidefosfmotricine verleent (White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al., Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990)), het hph gen, dat resistentie tegen het antibioticum hygromycine verleent (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell. Biol. 4: 2929-2931), en het dhfr gen, dat resistentie tegen methatrexaat verleent (Bourouis et al., EMBO J. 2 (7): 1099-1104 (1983)), en het EPSPS gen, dat 20 resistentie tegen glyfosfaat verleent (Amerikaanse octrooischriften 4.940.935 en 5.188.642).

1. Vectoren voor het transformeren met Agrobacterium.

Een groot aantal vectoren voor transformatie onder toepassing van 25 Agrobacterium tumefaciens zijn beschikbaar. Deze dragen doorgaans ten minste een T-DNA grenssequentie en omvatten vectoren zoals pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)) en pXYZ. Hieronder wordt de constructie van twee typische vectoren beschreven.

30 a. pCIB200 en pCIB2001:

De binaire vectoren pcIB200 en pcIB2001 worden gebruikt voor de constructie van recombinante vectoren voor toepassing met Agrobacterium en worden op de volgende wijze geconstrueerd. pTJS75kan wordt verschaft door knippen van pTJS75 1 0 07 779 38 met Narl (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164: 446-455 (1985)), hetgeen het uitsnijden van een tetracyclineresistentiegen mogelijk maakt, waarna een heel fragment uit pUC4K dat een NPTII draagt wordt ingebracht (Messing & Vierra,

Gene 19: 259-268 (1982): Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983): McBride et al., 5 Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Xhol koppelingsreeksen worden gekoppeld aan het EcoRV-fragment van pCIB7 dat de linker en rechter T-DNA-grensgebieden, een in planten selecteerbaar nos/nptll chimeer gen en de pUC polykoppelingsreeks (Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)) bevat, en het met ΧΛοΖ-geknipte fragment wordt gekloneerd in met Sa/f-geknipt pTJS75kan voor het 10 verschaffen van pCIB200 (zie ook EP-0.332.104, voorbeeld 19). pCIB200 bevat de volgende unieke polykoppelingsrestrictieplaatsen: EcoRl, SstI, Kpnl, Bglll, Xbal en Sail. pCIB2001 is een afgeleide van pCIB200 die is verkregen door het inbrengen in de polykoppelingsreeks van een aantal verdere restrictieplaatsen. Unieke restrictieplaatsen in de polykoppelingsreeks van pCIB2001 zijn EcoRl, SstI, Kpnl, 15 Bglll, Xbal, Sail, Mlul, Bell, Avrll, Apal, Hpal, en Stul. pC!B2001; naast deze unieke restrictieplaatsen, bevat deze tevens in planten en bacteriën werkzame kanamycineselectie, linker en rechter T-DNA-grensgebieden voor transformatie met Agrobacterium, de van RK2-afgeleide trfh werking voor mobilisatie tussen E. coli en andere gastheren, en de eveneens van RK2 afgeleide Oril en OrN functies. De 20 pCIB2001 polykoppelingsreeks is geschikt voor het kloneren van plantenexpressiecassettes die hun eigen regelsignalen bevatten.

b. pCIBlO en hygromycine selectiederivaten hiervan:

De binaire vector pCIBlO bevat een gen dat codeert voor kanamycine 25 resistentie voor selectie in planten, T-DNA rechter en linker grenssequenties, als ook sequenties uit plasmide pRK525 dat een breed gastheertraject heeft, waardoor het in zowel E. coli als Agrobacterium kan vermenigvuldigen. De constructie ervan wordt beschreven door Rothstein et al. (Gene 53: 153-161 (1987)). Verschillende derivaten van pCIBlO die het gen voor hygromycine B fosfotransferase bevatten, zoals 30 omschreven door Gritz et al. (Gene 25: 179-188 (1983)), zijn geconstrueerd. Deze derivaten maken de selectie van transgene plantencellen op alleen hygromycine (pCIB743) of hygromycine en kanamycine (pCIB715, pCIB717) mogelijk.

1 OCT ’’O

39 2. Vectoren geschikt voor transformatie anders dan met Agrobacterium.

Transformatie zonder het gebruik van Agrobacterium tumefaciens vermijdt het vereiste van T-DNA-sequenties in de gekozen transformatievector, zodat ook vectoren die deze sequenties niet bevatten kunnen worden toegepast, naast de hierboven 5 beschreven vectoren die T-DNA-sequenties bevatten. Transformatietechnieken die niet berusten op Agrobacterium omvatten transformatie door beschieten met deeltjes, protoplastopname (bijvoorbeeld PEG en elektroporatie) en microinjectie. De keuze van de vector hangt grotendeels af van de bij voorkeur toegepaste selectie voor de te transformeren soort.

10 a. pCIB3064: pCIB3064 is een van pUC-afgeleide vector die geschikt is voor technieken van directe genoverdracht in combinatie met selectie door het herbicide basta (of fosfotricerine). Het plasmide pCIB246 omvat de CaMV 35S promotor, die op 15 werkzame wijze is verbonden met het E. coli GUS gen, en de CaMV 35S transcriptie terminator, en wordt beschreven in de gepubliceerde Internationale aanvrage WO 93/07278. De 35S promotor van deze vector omvat twee ATG sequenties in de 5’-richting ten opzichte van de startpositie. Deze plaatsen zijn door toepassing van standaard PCR-technieken op een zodanige wijze gemuteerd dat de ATG’s zijn 20 verwijderd en de restrictieplaatsen Sspl en PvuII zijn verkregen. De nieuwe restrictieplaatsen zijn 96 en 37 baseparen van de unieke Sail plaats en 101 en 42 baseparen van de feitelijke startpositie verwijderd. Het aldus verkregen derivaat van pCIB246 wordt pCIB3025 genoemd. Het GUS gen wordt vervolgens uitgesneden uit pCIB3025 door knippen met Sail en SacI, waarna de uiteinden stomp worden 25 gemaakt en opnieuw worden gekoppeld voor het verkrijgen van plasmide pCIB3060. Het plasmide pJIT82 wordt verkregen van het John Innes Centre, Norwich, en een 400 bp Smal fragment dat het bar gen van Streptomyces viridochromogenes bevat wordt uitgesneden en in de Hpal plaats van pCIB3060 (Thompson et al., EMBO J 6: 2519-2523 (1987)) ingevoegd. Aldus werd pCIB3064 verkregen, dat het bar gen 30 bevat onder de regeling van de CaMV 35S promotor en terminator voor herbicideselectie, een gen voor ampicillineresistentie (voor selectie in E. coli) en een polykoppelingsreeks met unieke plaatsen Sphl, PstI, HindlII en BamHI. Deze vector is geschikt voor het kloneren van plantenexpressiecassettes die him eigen 1007779 40 regelsignalen bevatten.

b. pSOG19 en pSOG35: pSOG35 is een transformatievector die het E. coli gen dihydrofolaatreductase 5 (DFR), dat resistentie tegen methotrexaat verleent, als een selecteerbare markering gebruikt. PCR wordt gebruikt voor het amplificeren van een 35S promotor (-800 bp), intron 6 uit het maïs Adhl gen (-550 bp) en 18 bp van de GUS niet-getranslateerde leidersequentie van pSOGlO. Een 250-bp fragment dat codeert voor het E. coli dihydrofolaatreductasetype II-gen wordt tevens geamplifïceerd door PCR en deze 10 twee PCR-fragmenten worden samengevoegd met een SacI-Pstl-fragment uit pB1221 (Clontech) dat de ruggegraat van de pUC19-vector en de nopalinesynthaseterminator bevat. Het samenvoegen van deze fragmenten geeft pSOG19 dat de 35S-promotor bevat, samengevoegd met de intron 6-sequentie, de GUS-leidende sequentie, het DHFR-gen en de nopalinesynthaseterminator. Vervangen van de GUS-leidende 15 sequentie in pSOG19 met de leidende sequentie uit "Maize Chlorotic Mottle Virus" (MCMV) geeft de vector pSOG35. pSOG19 en pSOG35 dragen het pUC-gen voor resistentie tegen ampicilline en hebben HindlII, Sphl, PstI en EcoRl plaatsen beschikbaar voor het kloneren van vreemde stoffen.

20 B. Vereisten voor de constructie van plantexpressiecassettes

Gensequenties die bedoeld zijn voor de expressie in transgene planten worden eerst samengevoegd in expressiecassettes achter een geschikte promotor voor expressie op hoog niveau en stroomopwaarts van een geschikte transcriptieterminator. Deze expressiecassettes kunnen vervolgens op eenvoudige wijze in de 25 bovenbeschreven plantentransformatievectoren worden ingebracht.

1. Keuze van de promotor

De keuze van de promotor die in expressiecassettes gebruikt wordt zal het ruimtelijke en tijdsgebonden expressiepatroon van het transgen in de transgene plant 30 bepalen. Bepaalde promotors zullen transgenen in specifieke celtypen (zoals bladepidermiscellen, mesofylcellen, wortelcortexcellen) of in specifieke weefsels of organen (bijvoorbeeld wortels, bladeren of bloemen) tot expressie brengen en de keuze ervan zal overeenstemmen met de beoogde plaats voor de vorming ophopen 1007779 41 van het MM7-genproduct of het gewijzigde NIM1-genproduct. Alternatief kan de gekozen promotor de expressie van het gen onder een licht-geïnduceerde of andere in de tijd geregelde promotor geven.

5 a. Constitutieve expressie, de CaMV 35S promotor:

Constructie van het plasmide pCGN1761 wordt beschreven in de gepubliceerde octrooiaanvrage EP-0.392.225 (voorbeeld 23) die hierin door verwijzing is opgenomen. pCGN1761 bevat de "dubbele" 35S promotor en de tml transcriptieterminator met een unieke EcoRl plaats tussen de promotor en de 10 terminator en heeft een basisketen van het pUC-type. Een derivaat van pCGN1761 wordt geconstrueerd met een gemodificeerde polykoppelingsplaats die naast de bestaande EcoRJ-p\aats Notl en A7?o/-plaatsen bevat. De derivaat wordt aangeduid als pCGN1761ENX. pCGN1761ENX kan worden gebruikt voor het kloneren van cDNA-sequenties of gensequenties (waaronder microbiële ORF-sequenties) binnen zijn 15 polykoppelingsreeks met het oog op de expressie ervan onder de regeling van de 35S-promotor in transgene planten. De gehele 35S promotor-gensequentie-/m/-terminatorcassette van een dergelijke constructie kan worden uitgesneden door HindlII, Sphl, Sail en ATW-plaatsen 5’ ten opzichte van de promotor en Xbal,

BamHl en Bgll plaatsen 3’ ten opzichte van de terminator voor overdracht naar 20 transformatievectoren zoals de hierboven beschreven vectoren. Verder kan het dubbele 35S-promotorfragment worden verwijderd door 5’-uitsnijden met Hindlll, Sphl, Sail, Xbal of Pstl, en 3’-uitsnijden bij ieder van de restrictieplaatsen van de polykoppelingsreeks (EcoRl, Notl of Xhol) voor vervangen door een andere promotor.

25 b. Modificatie van pCGN1761ENX door optimalisering van de translatie-initiatieplaats.

Voor ieder van de hierin beschreven constructies kunnen modificaties rond de kloneringsplaatsen worden gemaakt door het inbrengen van sequenties die translatie 30 kunnen versterken. Dit is in het bijzonder nuttig wanneer overexpressie wenselijk is.

pCGN1761ENX wordt gesplitst met Sphl, behandeld met T4 DNA-polymerase en opnieuw gekoppeld, waardoor de SpAZ-plaats die zich 5’ ten opzichte van de dubbele 35S promotor bevindt wordt verwijderd. Dit geeft vector 1007779 42 pCGN1761ENX/Sph-. pCGN1761ENX/Sph- wordt gesplitst met EcoRI, en gekoppeld aan een tweestrengs moleculaire adaptor met de sequentie 5’-AATTCTAAAGCATGCCGATCGG-3 75 AATTCCGATCGGC ATGCTTTA-3 ’ (SEQ ID nrs.: 12 en 13). Dit geeft de vector pCGNSENX, die de quasi-5 geoptimaliseerde, in planten werkzame translatieinitiatieplaats TAAA-C bevat naast de ATG die zelf deel uitmaakt van een Sphl-plaats die geschikt is voor het kloneren van heterologe genen bij hun initiërende methioninerest. Stroomafwaarts van de Sphl-plaats blijven de EcoRI, Notl en jftoZ-plaatsen behouden.

Een alternatieve vector wordt geconstrueerd, waarin gebruik wordt gemaakt van 10 een NcoI-p\aats bij de initiërende ATG. Deze vector, aangeduid als pCGN1761ENX, wordt verschaft door een tweestrengs moleculaire adaptor met de sequentie 5’-AATTCT AAACCAT GGCGATCGG-375 ’ -AATTCCG ATCGCCATGGTTT A-3 ’ (SEQ ID nrs.: 14 en 15) in te brengen bij de £co/?/-plaats van pCGN1761ENX. De vector omvat derhalve de quasi-geoptimaliseerde sequentie TAAACC naast de 15 initiërende ATG die zich binnen de Ncol-plaats bevindt. Stroomafwaarts gelegen plaatsen zijn EcoRI, Notl en Xhol. Voorafgaand aan deze bewerking worden echter de twee TVcoZ-plaatsen in de pCGN1761ENX vector (bij posities stroomopwaarts van de 5’ gelegen 35S promotoreenheid) verwijderd door toepassing van soortgelijke technieken als hierboven beschreven voor Sphl of alternatief onder toepassing van 20 "binnenste-buiten" PCR (Innes et al. PCR-protocols: A guide to methods and applications, Academic Press, New York (1990)). Hierbij kan worden nagegaan of deze bewerking enige mogelijke nadelige invloed heeft op de expressie, door uit planetn afkomstig cDNA of een reporter gensequentie in de kloneringsplaats in te brengen, gevolgd door routinematige expressieanalyse in planten.

25 c. Expressie onder een chemische regelbare of een pathogenen regelbare promotor:

De dubbele 35S promotor in pCGN1761ENX kan worden vervangen door iedere andere gewenste promotor die tot geschikte hoge expressieniveaus leidt. Bij 30 wijze van voorbeeld kan een chemisch gereguleerde PR-1 promotor, die beschreven wordt in Amerikaans octrooischrift 5.614.395, hierin in zijn geheel door verwijzing opgenomen, de dubbele 35S promotor vervangen. De gekozen promotor wordt bij voorkeur uit zijn bron gesneden door toepassing van restrictie-enzymen, maar 1007779 43 alternatief kan worden geamplificeerd door PCR onder toepassing van basisreeksen die geschikte terminale restrictieplaatsen bevatten. Wanneer PCR-amplificatie wordt uitgevoerd moet de sequentie van de promotor opnieuw worden bepaald om na te gaan of er amplificatiefouten zijn opgetreden na het kloneren van de geamplificeerde 5 vector in de beoogde vector. De chemische/door pathogenen regelbare tabak PR-la promotor wordt afgesplitst uit plasmide pCIB1004 (zie EP-0.332.104, voorbeeld 21 voor de constructie hiervan, die hierbij door verwijzing is opgenomen) en overgebracht naar plasmide pCGN1761ENX (Uknes et al. 1992). pCIB1004 wordt gesplitst met Ncol en het aldus verkregen 3’-uitstekend gedeelte van het 10 gelineariseerde fragment wordt bot gemaakt door behandeling met T4 DNA-polymerase. Het fragment wordt vervolgens gesplitst met Hindlll en het aldus verkregen PR-la-promotor bevattende fragment wordt op een gel gezuiverd en gekloneerd in pCGN!761ENX waar de dubbele 35S promotor uit verwijderd is. Dit wordt uitgevoerd door knippen met Xhol en invullen met T4 polymerase, gevolgd 15 door knippen met Hindlll en isoleren van het grotere vector-terminator bevattende fragment, waarin de pCIB1004 promotor wordt gekloneerd. Dit geeft een pCGN1761ENX derivaat met de PR-la promotor en de tml terminator en een tussengelegen polykoppelingsreeks met unieke EcoRI en Notl plaatsen. Gekozen NI Ml genen kunnen in deze vector worden ingebracht, en de fusieproducten (dat wil 20 zeggen promotor-gen-terminator) kunnen vervolgens naar iedere gekozen transformatievector worden overgebracht, waaronder de in deze aanvrage beschreven vectoren.

Verschillende chemische regelmiddelen kunnen worden toegepast voor het induceren van de expressie van de voor NIM1 coderende sequentie in de planten die 25 volgens de onderhavige uitvinding zijn getransformeerd. In de context van de onderhavige beschrijving omvat het begrip "chemische regelmiddelen" chemicaliën waarvan bekend is dat zij inductiemiddelen zijn voor de PR-1 promotor in planten, of nauw verwante derivaten daarvan. Een bij voorkeur toegepaste groep regelmiddelen voor de PR-1 promotor is gebaseerd op de benzo-l,2,3-thiadiazool(BTH)structuur en 30 omvat, maar is niet beperkt tot, de volgende soorten verbindingen: benzo-1,2,3-thiadiazoolcarbonzuur, benzo-1,2,3-thiadiazoolthiocarbonzuur, cyanobenzo-1,2,3-thiadiazool, benzo-l,2,3-thiadiazoolcarbonzuuramide, benzo-1,2,3-thiadiazoolcarbonzuurhydrazide, benzo-1,2,3-thiadiazool-7-carbonzuur, benzo-1,2,3- 1 007 779 44 thiadiazool-7-thiocarbonzuur, 7-cyanobenzo-1,2,3-thiadiazool, benzo-1,2,3-thiadiazoolcarboxylaat waarin de alkylgroep een tot zes koolstofatomen bevat, methylbenzo-1,2,3-thiadiazool-7-carboxylaat, n-propylbenzo-1,2,3-thiadiazool-7-carboxylaat, benzylbenzo-1,2,3-thiadiazool-7-carboxylaat, benzo-1,2,3-thiadiazool-7-5 carbonzuur sec-butylhydrazide, en geschikte derivaten hiervan. Andere chemische induceermiddelen zijn bijvoorbeeld benzoëzuur, salicylzuur (SA), polyacrylzuur en gesubstitueerde derivaten hiervan; waarbij geschikte substituenten lagere alkylgroepen, lagere alkoxygroepen, lagere alkylthiogroepen en halogeen omvatten. Weer een andere groep regelmiddelen voor de chemische induceerbare DNA-10 sequenties volgens de onderhavige uitvinding is gebaseerd op de pyridinecarboxylzuurstructuur, zoals de isonicotinezuurstructuur en bij voorkeur de haloisonicotinezuurstructuur. De voorkeur verdienen dichloroisonicotinezuren en derivaten hiervan, bijvoorbeeld de lagere alkylesters. Geschikte voordelen van deze reeks regelende verbindingen zijn bijvoorbeeld 2,6-dichloorisonicotinezuur (INA), en 15 de lagere alkylesters hiervan, in het bijzonder de methylester.

d. Constitutieve expressie, de actinepromotor.

Van verschillende isovormen van actine is bekend dat zij in de meeste celtypen tot expressie gebracht worden, waardoor de actinepromotor een goede keus is voor 20 een constitutieve promotor. In het bijzonder is de promotor van het uit rijst afkomstige Actl gen gekloneerd en gekarakteriseerd (McElroy et al. Plant Cell 2: 163-171 (1990)). Van een l,3kb fragment van de promotor werd gevonden dat het alle regelelementen bevat die vereist zijn voor de expressie in rijst- protoplasten. Verder zijn verschillende expressievectoren op basis op de Actl promotor 25 geconstrueerd, in het bijzonder voor toepassing in monocotyle planten (McElroy et al. Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)). Deze omvatten het .4c//-intron 1, Adhl 5' flankerende sequentie en Adhl-intron 1 (uit het maïs-alcoholdehydrogenasegen) en de sequentie van de CaMV 35S promotor. Vectoren die de hoogste expressie vertoonden waren fusies van 35S en het Actl intron of de Actl 5’ flankerende sequentie en het 30 Actl intron. Optimalisering van de sequenties rond het initiërende ATG (van het GUS reportergen) gaf tevens verhoogde expressie. De promotorexpressiecassettes die worden beschreven door McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)) kunnen gemakkelijk worden aangepast voor de expressie van cellulasegenen en zijn 1007779 45 in het bijzonder geschikt voor toepassing in monocotyle gastheren. Zo kunnen bijvoorbeeld promotor-bevattende fragmenten uit de McElroy-constructies worden verwijderd en gebruikt bij het vervangen van de dubbele 35S-promotor in pCGN1761ENX, die dan beschikbaar is voor het inbrengen van specifieke 5 gensequenties. De aldus geconstrueerde fusiegenen kunnen vervolgens naar geschikte transformatievectoren worden overgebracht. In een afzonderlijk rapport is gevonden dat de uit rijst afkomstige ActI-ρτοταοΧοτ met zijn eerste intron hoge expressie in gekweekte gerstcellen geeft (Chibbar et al. Plant Cell Rep. 12: 506-509 (1993)).

10 e. Constitutieve expressie, de ubiquitinepromotor:

Ubiquitine is een ander genproduct waarvan bekend is dat het in veel celtypen wordt gevormd en de promotor ervan is uit verschillende soorten gekloneerd voor toepassing in transgene planten (bijvoorbeeld zonnebloem - Binet et al. Plant Science 79: 87-94 (1991) en maïs - Christensen et al. Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)). 15 De uit maïs afkomstige ubiquitinepromotor is ontwikkeld voor transgene monocotyle systemen en zijn sequentie als ook vectoren voor transformatie van monocotyle planten zijn beschreven in de octrooiaanvrage EP-0.342.926 (van Lubrizol) die hierin door verwijzing is opgenomen. Taylor et al. (Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993)) beschrijven een vector (pACH25) die de uit maïs afkomstige ubiquitinepromotor en 20 het eerste intron hiervan bevat, als ook de hoge activiteit ervan in celsuspensies van verschillende monocotyle planten wanneer het door beschieten met microprojectielen is ingebracht. De ubiquitinepromotor is geschikt voor de expressie van cellulasegenen in transgene planten, in het bijzonder monocotyle planten. Geschikte vectoren zijn derivaten van pACH25 of ieder van de in deze aanvrage beschreven 25 transformatievectoren, aangepast door het inbrengen van de geschikte ubiquitinepromotor en/of intronsequenties.

f. Specifieke expressie in de wortel:

Een verder patroon van expressie voor het NIM1-gen volgens de onderhavige 30 uitvinding is expressie in de wortel. Een geschikte promotor voor expressie in de wortel is beschreven door de Framond (FEBs 290: 103-106 (1991)), als ook in de gepubliceerde octrooiaanvrage EP-0.452.269 (van Ciba-Geigy) die hierin door verwijzing is opgenomen. Deze promotor wordt overgebracht naar een geschikte 1007779 46 vector zoals pCGN1761ENX voor het inbrengen van een cellulasegen en hierop volgende overdracht van de gehele promotor-gen-terminatorcassette naar een beoogde transformatievector.

5 g. Door een verwonding induceerbare promotors:

Door een verwonding induceerbare promotors kunnen ook geschikt worden toegepast bij de expressie van NIM1-genen volgens de uitvinding. Verschillende van dergelijke promotors zijn beschreven (bijvoorbeeld Xu et al. Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1.: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, 10 Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993), Warner et al. Plant J. 3: 191-201 (1993)) en deze zijn alle geschikt voor gebruik bij de onderhavige uitvinding. Logemann et al. beschrijven de 5’-stroomopwaarts gelegen sequenties van het dicotyle aardappel wunl gen. Xu et al. laten zien dat een door een verwonding induceerbare promotor van de dicotyle 15 aardappelplant (pinl) actief is in de monocotyle rijstplant. Verder beschrijven

Rohmeier & Lehle het kloneren van het uit maïs afkomstige Wipl cDNA dat door verwonding wordt geïnduceerd en dat onder toepassing van standaardtechnieken kan worden gebruikt voor het isoleren van de hiermee verband houdende promotor. Op soortgelijke wijze hebben Firek et a\ en Warner et al. een door een verwonding 20 induceerbaar gen van de monocotyle plant Asparagus officinalis beschreven, welk gen tot expressie wordt gebracht bij locale verwondingen en intrusieplaatsen van pathogenen. Onder toepassing van in het vakgebied algemeen bekende kloneringstechnieken kunnen deze promotors naar geschikte vectoren worden overgebracht, aan de NIM1-genen van de onderhavige uitvinding worden gekoppeld, 25 en worden gebruikt voor het tot expressie brengen van deze genen op plaatsen waar planten worden verwond.

h. Pith-voorkeursexpressie:

Octrooiaanvrage WO 93/07278 (van Ciba-Geigy), die hierin door verwijzing is 30 opgenomen, beschrijft het isoleren van het uit maïs afkomstige trpA gen dat bij voorkeur in expressie wordt gebracht in pith-cellen. De gensequentie en promotor tot op -1726 baseparen van de start van de transcriptie worden beschreven. Onder toepassing van standaard moleculair biologische technieken kan deze promotor, of 1007779 47 kunnen delen hiervan, worden overgebracht naar een vector zoals pCGN1761, waarin deze de 35S- promotor kunnen vervangen en kunnen worden gebruikt voor het regelen van de expressie van een vreemd gen, bij voorkeur in pith-cellen. In feite kunnen fragmenten die de pith-voorkeurspromotor of delen hiervan bevatten worden 5 overgebracht naar iedere vector en worden aangepast voor gebruik in transgene planten.

i. Blad-specifieke expressie:

Een uit maïs afkomstig gen dat codeert voor fosfoenolcarboxylase (PEPC) is 10 beschreven door Hudspeth & Grula (Plant Molec Biol 12: 579-589 (1989)). Onder toepassing van standaard moleculair biologische technieken kan de promotor voor dit gen worden gebruikt voor het regelen van de specifieke expressie van ieder gewenst gen in de bladeren van transgene planten.

15 j. Op chloroplasten gerichte expressie:

Chen & Jagendorf (J. Biol. Chem. 268: 2363-2367 (1993) hebben het succesvolle gebruik van een uit chloroplasten afkomstig transitpeptide voor het inbrengen van een heteroloog transgen beschreven. Het gebruikte peptide is het transitpeptide van het rbsS-gen van Nicotiana plumbaginifolia (Poulsen et al. Mol.

20 Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)). Onder toepassing van de restrictie-enzymen Dral en Sphl.pr 7jp509I en Sphl kan de voor dit transitpeptide coderende DNA-sequentie uit het plasmide prbcS-8B worden uitgesneden en worden bewerkt voor toepassing met ieder van de hierboven beschreven constructen. Het Dral-Sphl fragment strekt zich uit van -58 ten opzichte van het initiërende rbcS ATG tot, en met inbegrip van, 25 het eerste aminozuur (tevens een methionine) van het volwaardige peptide direct na de import splitsingsplaats, terwijl het Tsp5091-Sphl fragment zich uitstrekt van -8 ten opzichte van het initiërende rbcS ATG tot, en met inbegrip van, het eerste aminozuur van het volwaardige peptide.

Deze fragmenten kunnen derhalve op geschikte wijze worden ingebracht in de 30 polykoppelingsreeks van iedere gekozen expressiecassette waarbij een transcriptiefusie aan de niet-getranslateerde leidersequentie van de gekozen promotor (dat wil zeggen: 35S, PR-la, actine, ubiquitine etcetera) wordt verkregen, terwijl het tegelijkertijd het inbrengen van een NIMl-gen in een correcte fusie stroomafwaarts van het 1007779 48 transitpeptide mogelijk maakt. Constructies van dit type zijn gebruikelijk in het vakgebied. Bijvoorbeeld, waar het Dral-uiteinde reeds stomp is, kan de 5’ Tsp509I-plaats stomp worden gemaakt door behandeling met T4-polymerase, of alternatief worden gekoppeld aan een koppelingsreeks of adaptorsequentie die de fusie ervan 5 met de gekozen promotor vergemakkelijkt. De 3’ Sphl-plaats kan als zodanig worden gehandhaafd, of kan alternatief worden gekoppeld aan adaptor- of koppelingsequenties voor het vergemakkelijken van het inbrengen ervan in de gekozen vector op een zodanige wijze dat geschikte restrictieplaatsen worden verschaft voor het hieropvolgende inbrengen van een gekozen NIM1-gen. Met 10 bijzondere voorkeur blijft de ATG van de Sphl-plaats behouden en vormt de eerste ATG van het beoogde NIMl-gen. Chen & Jagendorf verschaffen consensus-sequenties voor ideale splitsing van de chloroplasten import, en in alle gevallen verdient een methionine bij de eerste plaats van het volwaardige eiwit de voorkeur. Bij opeenvolgende plaatsen is er een meer variatie en kan het aminozuur niet in een 15 dergelijke mate kritiek zijn. In ieder geval kunnen fusieconstructies in vivo worden beoordeeld voor de efficiëntie van het inbrengen onder toepassing van de werkwijze die wordt beschreven door Bartlett et al. (In: Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier biz. 1081-1091 (1982)) en Wasmann et al. (Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)). Doorgaans is de beste aanpak het genereren 20 van fusies onder toepassing van het gekozen NIMl-gen of de gewijzigde vorm van het NIMl-gen zonder modificaties bij het amino-uiteinde, en alleen dan modificaties op te nemen wanneer het duidelijk is dat dergelijke fusies niet met een hoge efficiëntie in de chloroplasten worden opgenomen, in welk geval modificaties kunnen worden aangebracht overeenkomstig de bekende literatuur (Chen & Jagendorf; 25 Wasman et al.; Ko & Ko. J. Biol. Chem. 267; 13910-13916 (1992)).

Een bij voorkeur toegepaste vector wordt geconstrueerd door het overbrengen van het Dral-Sphl transitpeptide dat codeert voor een fragment van prbcS-SB naar de kloneringsvector pCGN 1761 ENXJSph-. Dit plasmide wordt geknipt met EcoRl en de uiteinden ervan worden stomp gemaakt door behandeling met T4 DNA-polymerase. 30 Plasmide prbcS-SB wordt geknipt met Sphl en gekoppeld aan een tweestrengs moleculaire adaptor met de sequentie 5’-CCAGCTGGAATTCCG-375’-CGGAATTCCAGCTGGCATG-3’ (SEQ ID nrs.: 16 en 17). Het aldus verkregen product wordt 5’-eindstandig gefosforyleerd door behandeling met T4-kinase. Hierop 1 007779 49 volgend splitsen met Dral maakt het fragment dat voor het transitpeptide codeert vrij, waarna het fragment wordt gekoppeld aan de stompgemaakte EcoRl-plaatsen van de hierboven beschreven gemodificeerde vector. Klonen die met het 5’-uiteinde van het ingebrachte gedeelte naar het 3’-uiteinde van de 35S-promotor zijn georiënteerd 5 worden geïdentificeerd door het bepalen van de sequentie. Deze klonen dragen een DNA-fusie van de 35S-leidersequentie aan de ri>cS-8A promotor-transiteiwitsequentie die zich uitstrekt van -58 ten opzichte van de rbcS ATG tot de ATG van het volwaardige eiwit, en hebben in dit gebied een unieke 5ρΛ/-ρlaats, en een nieuw gevormde EcoRl-plaats, alsook de bestaande Notl en ^7io/-plaatsen van 10 pCGN1761ENX. Deze nieuwe vector wordt aangeduid als pCGN1761/CT. DNA-sequenties worden in het juiste afleesraam naar pCGN1761/CT overgebracht door amplificatie onder toepassing van PCR-technieken en het opnemen van een Sphl, NSphl, of Ma///-plaats bij de geamplificeerde ATG, dat na splitsing onder toepassing van het geschikte restrictie-enzym wordt gekoppeld aan het met SpAZ-gesplitste 15 pCGN1761/CT. Om het construeren te vergemakkelijken kan het nodig zijn dat twee aminozuren van het product van het gekloneerde gen te veranderen; echter, in vrijwel alle gevallen zal het gebruik van PCR samen met standaard plaatsgerichte mutagenese de constructie van iedere gewenste sequentie rond de splitsingsplaats en de eerste methioninerest van het volwaardige eiwit mogelijk maken.

20 Een verdere de voorkeur verdienende vector wordt geconstrueerd door het vervangen van een dubbele 35S-promotor van pCGN1761ENX met het BamHI-Sphl fragment van prbcS-ÜA dat de volledige, door licht geregelde rbcS-ÜA promotor van -1038 (ten opzichte van de beginplaats van de transcriptie) tot de eerste methioninerest van het volwaardige eiwit omvat. Het gemodificeerde pCGN1761 met 25 de vernietigde Sphl plaats wordt gesplitst met PstI en EcoRl en behandeld met T4 DNA-polymerase om de uiteinden stomp te maken. prbcS-SA wordt gesplitst met Sphl en gekoppeld aan de tweestrengs moleculaire adaptor met de hierboven beschreven sequentie. Het aldus verkregen product wordt 5’-eindstandig gefosforyleerd door behandeling met T4-kinase. Hierop volgend splitsen met BamHI 30 maakt het fragment dat het promotor-transitpeptide omvat vrij, welk fragment wordt behandeld met T4 DNA-polymerase om de 5am///-uiteinden stomp te maken. Het aldus verkregen promotor-transitpeptidefragment wordt gekloneerd in de bereide pCGN1761ENX-vector, waarbij een constructie wordt verkregen die de rbcS-8A- 1 007779 50 promotor en het transiteiwit bevat met een iSpW-plaats die zich bij de splitsingsplaats voor het inbrengen van heterologe genen bevindt. Verder bevinden zich stroomafwaarts van de Sphl-plaats EcoRl- (opnieuw gevormd), Notl- en Xhoï-kloneringsplaatsen. Het construct wordt aangeduid als pCGN1761rbcS/CT.

5 Soortgelijke bewerkingen kunnen worden uitgevoerd voor het toepassen van sequenties die voor GS2 chloroplast transitpeptide uit andere bronnen (uit monocotyle en dicotyle planten) of uit andere genen coderen. Verder kunnen soortgelijke procedures worden gevolgd voor het richten op andere subcellulaire compartimenten, zoals mitochondria.

10 2. Transcriptieterminatoren.

Verschillende transcriptieterminatoren voor toepassing in expressiecassettes zijn beschikbaar. Ze zorgen voor het beëindigen van de transcriptie na het transgen en de juiste polyadenylering ervan. Geschikte transcriptieterminatoren zijn die waarvan 15 bekend is dat zij in planten werkzaam zijn en omvatten de CaMV 35S-terminator, de tml-terminator, de nopalinesynthaseterminator en de uit de erwt afkomstige rbcS E9-terminator. Deze kunnen zowel in monocotyle planten als in dicotyle planten worden toegepast.

20 3. Sequenties voor het versterken of regelen van de expressie.

Van verschillende sequenties werd gevonden dat zij de genexpressie van binnen uit de transcriptie-eenheid versterken en deze sequenties in samenhang met de genen volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt voor het versterken van hun expressie in transgene planten.

25 Van verschillende intronsequenties is aangetoond dat zij de expressie versterken, in het bijzonder in cellen van monocotyle planten. Zo is bijvoorbeeld gevonden dat de intronen van het uit maïs afkomstige Adhl-gen de expressie van het wild-typegen onder zijn natuurlijke promotor aanzienlijk versterken wanneer zij in maïscellen worden ingebracht. Intron 1 blijkt bijzonder werkzaam te zijn en het versterkt de 30 expressie in fusieconstructies met het chlooramfenicolacetyltransferasegen (Callis et al., Genes Develop. 1:1183-1200 (1987)). In hetzelfde experimentele systeem had het intron van het uit maïs afkomstige bronze 1 gen een soorgelijke werking ten aanzien van het versterken van de expressie. Intronsequenties zijn al vaak opgenomen in 1007779 51 vectoren voor transformeren van planten, doorgaans met de ni et-getranslateerde leidende sequentie.

Van een aantal van virussen afgeleide niet-getranslateerde leidende sequenties is tevens bekend dat zij de expressie versterken, en deze zijn in het bijzonder werkzaam 5 in cellen van dicotyle planten. In het bijzonder is gebleken dat de leidende sequenties van het tabaksmozaïekvirus (TMV, de "W-sequentie"), Maïs Chlorotic Mottle Virus (MCMV) en alfalfamozaïekvirus (AMV) werkzaam te zijn ten aanzien van het versterken van de expressie (zie bijvoorbeeld Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)).

10 4. Het richten van het genproduct binnen de cel.

Het is bekend dat verschillende mechanismen voor het richten van genproducten in planten aanwezig zijn en de sequenties die de werking van deze mechanismen regelen zijn in enige mate van nader gekarakteriseerd. Zo wordt bijvoorbeeld het 15 richten van genproducten op de chloroplast geregeld door een signaalsequentie die zich bij het amino-eindstandige einde van verschillende eiwitten bevindt en die gesplitst wordt gedurende het invoeren in de chloroplast, waarbij het het volwaardige eiwit wordt gevormd (bijvoorbeeld Comai et al. J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Deze signaalsequenties kunnen aan heterologe genproducten worden 20 gekoppeld zodat het heterologe genproduct in de chloroplast wordt ingebracht (van den Broeck et al. Nature 313: 358-363 (1985)). DNA dat voor de geschikte signaalsequenties codeert kan worden geïsoleerd uit het 5’-uiteinde van de cDNA’s die coderen voor het RUBISCO-eiwit, het CAB-eiwit, het EPSP-synthaseenzym, het GS2-eiwit en vele andere eiwitten waarvan bekend is dat zij in de chloroplast zijn 25 gelocaliseerd.

Andere genproducten zijn gelocaliseerd in andere organellen, zoals het mitochondrium en de peroxisoom (zie bijvoorbeeld Unger et al. Plant Molec. Biol.

13: 411-418 (1989)). De cDNA’s die voor deze producten coderen kunnen tevens worden gemanipuleerd voor het bereiken van het richten van de heterologe 30 genproducten op deze organellen. Voorbeelden van dergelijke sequenties zijn de nucleair-gecodeerde ATP-ases en specifieke aspartaataminotransferase-isovormen voor mitochondria. Het richten op cellulaire eiwitlichamen is beschreven door Rogers et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-6516 (1985)).

1007779 52

Verder zijn sequenties gekarakteriseerd die het richten van genproducten op andere celcompartimenten bepalen. Amino-eindstandige sequenties zijn verantwoordelijk voor het richten op het ER, de apoplast, en extracellulaire secretie uit aleuroncellen (Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769-783 (1990)). Verder zijn amino-5 eindstandige sequenties in samenhang met carboxyl-eindstandige sequenties verantwoordelijk voor het richten van genproducten op de vacuole (Shinshi et al.

Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)).

Door geschikte, hierboven beschreven richtsequenties te koppelen aan de van beoogde transgene sequenties is het mogelijk het transgene product op ieder organel 10 of celcompartiment te richten. Voor richten op de chloroplast moet bijvoorbeeld de chloroplastsignaalsequentie van het RUBISCO-gen, het CAB-gen, het EPSP-synthasegen, of het GS2-gen in het juiste afleesraam worden gekoppeld aan het amino-eindstandige ATG van de transgen. De gekozen signaalsequentie moet tevens de bekende splitsingsplaats omvatten, en de geconstrueerde fusie moet tevens de 15 aminozuren na de splitsingsplaats bevatten die vereist zijn voor de splitsing. In sommige gevallen kan aan dit vereiste worden voldaan door een gering aantal aminozuren tussen de splitsingsplaats en het ATG van de transgen toe te voegen, of, alternatief, een aantal aminozuren in de sequentie van de transgen te vervangen.

Fusies die geconstrueerd zijn voor invoeren in de chloroplast kunnen onderzocht 20 worden op hun werkzaamheid ten aanzien van de opname in de chloroplast door in vitro translatie of in vitro tot transcriptie gebrachte constructies gevolgd door in vitro opname in chloroplasten, onder toepassing van de technieken die zijn beschreven door Bartlett et al. In: Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier biz. 1081-1091 (1982) en Wasmann et al. Mol. Gen. Genet. 205: 25 446-453 (1986). Deze constructietechnieken zijn algemeen bekend in het vakgebied en kunnen eveneens worden toegepast op mitochondria en peroxisomen.

De hierboven beschreven mechanismen voor het richten binnen de cel kunnen niet alleen in samenhang met de hiermee verband houdende promotors worden toegepast, maar tegens in samenhang met heterologe promotors, om een specifiek 30 beoogd richten binnen de cel te verkrijgen onder de regeling van de transcriptie door een promotor die een expressiepatroon heeft dat afwijkt van de promotor waarvan het richtingsignaal is afgeleid.

1007779 53 C. Transformatie.

Nadat de voor NIM1-coderende sequentie in een expressiesysteem is gekloneerd, wordt het tot in een plantencel getransformeerd. Plantenweefsels die geschikt zijn voor transformatie omvatten bladweefsel, wortelweefsel, meristemen en 5 protoplasten. Het onderhavige systeem kan worden toegepast in iedere plant die getransformeerd en geregenereerd kan worden. Dergelijk technieken voor transformatie en regeneratie zijn in het vakgebied algemeen bekend. Technieken voor het construeren van in planten werkzame expressiecassettes alsook het inbrengen van vreemd DNA in planten zijn in het vakgebied algemeen beschreven. In het algemeen 10 worden, voor het opnemen van vreemd DNA in planten, Ti-plasmidevectoren toegepast voor het inbrengen van vreemd DNA. Ook directe DNA-opname, liposomen, elektroporatie, micro-injectie en microprojectielen zijn bij het inbrengen ioegepast. Dergelijke technieken zijn beschreven in het vakgebied. Zie bijvoorbeeld Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al., (1991) Mok Gem Genet. 228: 15 104-112: Guerche et al.. Π987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al., (1987)

Theor. Appl. Genet. 75: 30-36; Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al., (1980) Science 208:1265; Horsch et al., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology Weissbach and Weisbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988); en Methods in Plant 20 Molecular Biology (Schuler en Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989). Zie tevens Amerikaans octrooischrift nr. 5.625.136, dat hierin in zijn geheel is opgenomen. Er dient begrepen te worden dat de transformatietechniek zal afhangen van de te transformeren plantencel. Transformation of tobacco, tomato, potato, and Arabidopsis thaliana using a binary Ti-vectorsystem. Plant Physiol. 81:301-305, 1986; 25 Fry, J., Bamason, A., en Horsch, R.B. Transformation of Brassica napus with

Agrobacterium tumefaciens based vectors. Pl.Cell Rep. 6:321-325, 1987; Block, M.d. Genotype independent leaf disc transformation of potato (Solanum tuberosum) using Agrobacterium tumefaciens. Theor. appl. genet. 76:767-774, 1988; Deblock, M., Brouwer, D.D., en Terming, P. Transformation of Brassica napus en Brassica oleracea 30 using Agrobacterium tumefaciens and the Expression of the bar and neo genes in the transgenic plants. Plant Physiol. 91: 694-701, 1989; Baribault, T.J., Skene, K.G.M., Cain, P.A., and Scott, N.S. Transgenic grapevines: regeneration of shoots expressing beta-glucuronidase. Pl.Cell Rep. 41:1045-1049, 1990; Hinchee, M.A.W., Newell, 1 007 779 54 C.A., ConnorWard, D.V., Armstrong, T.A., Deaton, W.R., Sato, S.S., and Rozman, R.J. Transformation and regeneration of non-solanaceous crop plants. Stadler.Genet.Symp. 203212.203-212, 1990; Barfield, D.G. and Pua, E.C. Gene transfer in plants of Brassica juncea using Agrobacterium tumefaciens-mediated 5 transformation. Pl.Cell Rep. 10:308-314, 1991; Cousins, Y.L., Lyon, B.R., en

Llewellyn, D.J. Transformation of an Australian cotton cultivar: prospects for cotton improvement through genetic engineering. Aust. J.Plant Physiol. 18:481-494. 1991; Chee, P.P. en Slightom, J.L. Transformation of Cucumber Tissues by Microprojectile Bombardment Identification of Plants Containing Functional and Nonfunctional 10 Transferred Genes. GENE 118:255-260, 1992; Christou, P., Ford, T.L., and Kofron, M. The development of a variety-independent gene-transfer method for rice. Trends.Biotechnol. 10:239-246, 1992; D’Halluin, K., Bossut, M., Bonne, E., Mazur, B., Leemanr, J., en Botterman, J. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants. Bio/Technol. 10:309-314.

15 1992; Dhir, S.K., Dhir, S., Savka, M.A., Belanger, F., Kriz, A.L., Farrand, S.K. en

Widholm, J.M. Regeneration of Transgenic Soybean (Glycine Max) Plants from Electroporated Protoplasts. Plant Physiol 99:81-88, 1992; Ha, S.B., Wu, F.S., en Thome, T.K. Transgenic turf-type tall fescue (Festuca arundinacea Schreb.) plants regenerated from protoplasts. PI. Cell Rep. 11:601-604, 1992; Blechl, A.E. Genetic 20 Transformation The New Tool for Wheat Improvement 78th Annual Meeting

Keynote Address. Cereal Food World 38:846-847, 1993; Casas, A.M., Kononowicz, A.K., Zehr, U.B., Tomes, D.T., Axtell, J.D., Butler, L.G., Bressan, R.A., and Hasegawa, P.W. Transgenic Sorghum Plants via Microprojectile Bombardment. Proc Natacad Sci USA 90:11212-11216, 1993; Christou, P. Philosphy and Practice of 25 Variety Independent Gene Transfer into Recalcitrant Crops. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 29P: 119-124, 1993; Damiani, F., Nenz, E., Paolocci, F., and Arcioni, S. Introduction of Hygromycin Resistance in Lotus spp Through Agrobacterium Rhizogenes Transformation. Transgenic Res 2:330-335, 1993; Davies, D.R., Hamilton, J., and Mullineaux, P. Transformation of Peas. Pl.Cell Rep. 12:180-183, 30 1993; Dong, J.Z. and Mchughen, A. Transgenic Flax Plants from Agrobacterium

Mediated Transformation Incidence of Chimeric Regenerants and Inheritance of Transgenic Plants. Plant Sci 91:139-148, 1993; Fitch, M.M.M., Manshardt, R.M., Gonsalves, D., and Slightom, J.L. Transgenic Papaya Plants from Agrobacterium 1 0 07 7 7 9 55

Mediated Transformation of Somatic Embryos. Pl.Cell Rep. 12:245-249, 1993; Franklin, C.I. and Trieu, T.N. Transformation of the Forage Grass Caucasian Bluestem via Biolistic Bombardment Mediated DNA Transfer. Plant Physiol 102:167, 1993; Golovkin, M.V., Abraham, M., Morocz, S., Bottka, S., Feher, A., and Dudits, 5 D. Production of Transgenic Maize Plants by Direct DNA Uptake into Embryogenic Protoplasts. Plant Sci 90:41-52, 1993; Guo, G.Q., Xu, Z.H., Wei, Z.M., and Chen, H.M. Transgenic Plants Obtained from Wheat Protoplasts Transformed by Peg Mediated Direct Gene Transfer. Chin Sci Bull 38:2072-2078. 1993; Asano, Y. and Ugaki, M. Transgenic plants of Agrostis alba obtained by electroporationmediated 10 direct gene transfer into protoplasts. PI.Cell.Rep. 13, 1994; Ayres, N.M. and Park, W.D. Genetic Transformation of Rice. Crit Rev Plant Sci 13:219-239, 1994; Barcelo, P., Hagel, C., Becker, D., Martin, A., and Lorz, H. Transgenic Cereal (Tritordeum) Plants Obtained at High Efficiency by Microprojectile Bombardment of Inflorescence Tissue. PLANT J 5:583-592, 1994; Becker, D., Brettschneider, R., and Lorz, H.

15 Fertile Transgenic Wheat from Microprojectile Bombardment of Scutellar Tissue. Plant J 5:299-307. 1994; Biswas, G.C.G., Iglesias, V.A., Datta, S.K., and Potrykus, 1. Transgenic Indica Rice (Oryza Sativa L) Plants Obtained by Direct Gene Transfer to Protoplasts. J Biotechnol 32: 1-10, 1994; Borkowska, M., Kleczkowski, K., Klos, B., Jikubiec, J., and Wielgat, B. Transformation of Diploid Potato with an 20 Agrobacterium Tumefaciens Binary Vector System. 1. Methodological Approach.

Acta Physiol Plant 16:225-230, 1994; Brar, G.S., Cohen, B.A., Vick, C.L., and Johnson, G.W. Recovery of Transfgenic Peanut (Arachis Hypogaea L) Plants from Elite Cultivars Utilizing Accell(R) Technology. Plant J 5:745-753, 1994; Christou, P. Genetic Engineering of Crop Legumes and Cereals Current Status and Recent 25 Advances. Agro Food Ind Hi Tech 5: 17-27, 1994; Chupeau, M.C., Pautot, V., and Chupeau, Y. Recovery of Transgenic Trees after Electroporation of Poplar Protoplasts. Transgenic Res 3: 13-19, 1994; Eapen, S. and George, L. Agrobacterium Tumefaciens Mediated Gene Transfer in Peanut (Arachis Hypogaea L). PI. Cell Rep. 13:582-586, 1994; Hartman, C.L., Lee, L., Day, P.R., and Turner, N.E. Herbicide 30 Resistant Turfgrass (Agrosis Palustris Huds) by Biolistic Transformation. Bid-Technology 12:919923, 1994; Howe, G.T., Goldfarb, B., and Strauss, S.H. Agrobacterium Mediated Transformation of Hybrid Poplar Suspension Cultures and Regeneration of Transformed Plants. Plant Cell Tissue & Orgart Culture 36:59-71, 1 0 0~,7’’q 56 1994; Konwar, B.K. Agrobacterium Tumefaciens Mediated Genetic Transformation of Sugar Beet (Beta Vulgaris L). J Plantbiochem Biotechnol 3:37-41, 1994; Ritala, A., Aspegren, K., Kuiten, U., Salmenkalliomarttila, M., Mannonen, L., Hannus, R., Kauppinen, V., Teeri, T.H., and Enari, T.M. Fertile Transgenic Barley by Particle 5 Bombardment of Immature Embryos. Plant Mol Biol 24:317-325, 1994; Scorza, R., Cordts, J.M., Ramming, D.W., and Emershad, R.L. Transformation of Grape (Vitis Vinifera L) Somatic Embryos and Regeneration of Transgenic Plants. J Cell Biochem:102, 1994; Shimamoto, K. Gene Expression in Transgenic Monocots. Curr Opinbiotechnol 5:158-162, 1994; Spangenberg, G., Wang, Z.Y., Nagel, J., and 10 Potrykus, I. Protoplast Culture and Generation of Transgenic Plants in Red Fescue (Festuca Rubra L). Plant Sci 97:83-94, 1994; Spangenberg, G., Wang, Z.Y., Nagel, J., and Potrykus, I. Gene Transfer and Regeneration of Transgenic Plants in Forage Grasses. J Cell Biochem:102, 1994; Wan, Y.C. and Lemaux, P.G. Generation of Large Numers of Independently Transformed Fertile Barley Plants. Plant Physiol 15 104:3748, 1994; Weeks, J.T., Anderson, O.D., and Blechl, A.E. Stable

Transformation of Wheat (Triticum Aestivum L) by Microprojectile Bombardment. J Cell Biochem:104, 1994; Ye, X.J., Brown, S.K., Scorza, R., Cordts, J., and Sanford, J.C. Genetic Transformation of Peach Tissues by Particle Bombardment. Jamer Sochortsci 199:367-373, 1994; Spangenberg, G., Wang, Z.Y., Nagel, J., and 20 Potrykus, I. Protoplast Culture And Generation Of Transgenic Plants In Red Fescue (Festuca Rubra L). Plant Science 1994 97:83-94, 1995. Zie tevens Amerikaans octrooischrift nr. 5.639.949, hierin in het geheel door verwijzing opgenomen.

Bacteriën van het genus Agrobacterium kunnen worden gebruikt voor het transformeren van plantencellen. Geschikte soorten van deze bacterie omvatten 25 Agrobacterium tumefaciens en Agrobacterium rhizogens. Agrobacterium tumefaciens (dat wil zeggen stammen LBA4404 of EHA105) is in het bijzonder geschikt vanwege zijn algemeen bekende vermogen planten te transformeren.

1. Transformatie van dicotyle planten.

30 Transformatietechnieken voor dicotyle planten zijn algemeen bekend in het vakgebied en omvatten technieken op basis van Agrobacterium en technieken waarbij het gebruik van Agrobacterium niet vereist is. Technieken zonder het gebruik van Agrobacterium omvatten het direct opnemen van exogeen genetisch materiaal door 1007779 57 protoplasten of cellen. Dit kan worden bereikt door overdracht onder invloed van PEG of elektroporatie, toediening door beschieten met deeltjes, of door microinjectie. Voorbeelden van deze technieken worden beschreven door Paszkowski et al., EMBO J 3:2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich 5 et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986), en Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987). In al deze gevallen worden de getransformeerde cellen geregenereerd tot gehele planten onder toepassing van in het vakgebied bekende standaardtechnieken.

Transformatie onder toepassing van Agrobacterium is een bij voorkeur toegepaste techniek voor het transformeren van dicotyle planten vanwege de hoge 10 efficiëntie van transformatie ervan en de brede toepasbaarheid ervan bij een groot aantal verschillende soorten. Verschillende gewassoorten zijn onder andere alfalfa en populier (EP-0.317.511), katoen, EP-0.249.432 (tomaat, van Calgene), WO 87/07299 (Brassica, van Calgene), US-A-4.795.855 (populier)). Transformatie met Agrobacterium omvat doorgaans het overbrengen van de binaire vector die het van 15 beoogde vreemde DNA draagt (bijvoorbeeld pCIB200 of pCIB2001) naar een geschikte Agrobacterium-stam, hetgeen afhankelijk kan zijn van de aanwezige v/rgenen die door de als gastheer gebruikte Agrobacterium-stam op een co-resident Ti-plasmide of chromosomaal gedragen worden (bijvoorbeeld stam CIB542 voor pCIB200 en pCIB2001 (Uknes et al. Plant Cell 5: 159-169 (1993)). Het overdragen 20 van de recombinante binaire vector naar Agrobacterium wordt uitgevoerd door een triparenterale kruisingsprocedure onder toepassing van een E. coli die de recombinante binaire vector draagt, als ook een helpende E. coli stam die een plasmide zoals pRK2013 draagt en die in staat is de recombinante binaire vector naar de beoogde Agrobacterium-stam te mobiliseren. Alternatief kan de recombinante 25 binaire vetor naar Agrobacterium worden overgebracht door DNA-transformatie (Höfgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)).

Transformatie van de beoogde plantensoort door recombinante Agrobacterium omvat doorgaans co-kweken van het Agrobacterium met weefsels van de plant en volgt in het vakgebied algemeen bekende protocollen. Getransformeerd weefsel wordt 30 geregenereerd op selecteerbaar medium dat de tussen de T-DNA grensgebieden van het binaire plasmide aanwezige markering voor resistentie tegen een antibioticum of een herbicide bevat.

Een andere aanpak voor het transformeren van plantencellen met een gen omvat 1007779 58 het beschieten van plantenweefsels en cellen met inerte of biologisch actieve deeltjes. Deze techniek wordt beschreven in de Amerikaanse octrooischriften nrs. 4.945.050; 5.036.006 en 5.100.792, alle van Sanford et al.. In het algemeen omvat deze procedure het afschieten van inerte of biologisch actieve deeltjes op de cellen onder 5 omstandigheden die geschikt zijn voor het doordringen van het buitenoppervlak van de cel, zodanig dat de deeltjes in het binnenste hiervan worden opgenomen. Wanneer inerte deeltjes worden gebruikt kan de vector in de cel worden gebracht door de deeltjes te bekleden met de vector die het gewenste gen draagt. Alternatief kan de beoogde cel worden omgeven door de vector zodat de vector in het kielzog van het 10 deeltje in de cel binnengaat. Biologisch actieve deeltjes (bijvoorbeeld gedroogde gistcellen, gedroogde bacterie of een bacteriofaag, die ieder het in te brengen DNA bevatten) kunnen tevens tot in het plantencelweefsel worden geschoten.

2. Transformatie van monocotyle planten.

15 Ook het transformeren van de meeste soorten monocotyle planten is nu routine geworden. Bij voorkeur toegepaste technieken omvatten het direct overdragen van het gen tot in protoplasten onder toepassing van PEG of elektroporatietechnieken, en beschieten van callusweefsel met deeltjes. Transformaties kunnen met een enkele DNA-soort of met meerdere DNA-soorten (dat wil zeggen co-transformatie) worden 20 uitgevoerd en deze beide technieken zijn geschikt voor toepassing bij de onderhavige uitvinding. Co-transformatie kan het voordeel hebben dat het construeren van complete vectoren wordt vermeden en kan tot transgene planten leiden met niet-gekoppelde plaatsen voor het van belangzijnde gen en de selecteerbare markering, hetgeen het mogelijk maakt de selecteerbare markering in latere generaties te 25 verwijderen, wanneer dit wenselijk wordt geacht. Een nadeel van het gebruik van co-transformatie is echter de frequentie van minder dan 100% waarmee de afzonderlijke DNA-soorten in het genoom worden opgenomen (Schocher et al. Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)).

Octrooiaanvragen EP-0.292.435 ([1280/1281] van Ciba-Geigy), EP-0.392.225 30 (van Ciba-Geigy) en WO 93/07278 (van Ciba-Geigy) beschrijven technieken voor het bereiden van callus en protoplasten uit een ingeteelde maïslijn met hoge kwaliteit, transformatie van protoplasten onder toepassing van PEG of elektroporatie, en het regenereren van de maïsplant uit getransformeerde protoplasten. Gordon-Kamm et al.

1007779 59 (Plant Cell 2: 603-618 (1990)) en Fromm et al. (Biotechnology 8: 833-839 (1990)) hebben technieken gepubliceerd voor het transformeren van de van A188-afgeleide maïslijn onder toepassing van beschieten met deeltjes. Verder beschrijven de octrooiaanvrage WO 93/07278 (van Ciba-Geigy) en Koziel et al. (Biotechnology Π.: 5 194-200 (1993)) technieken voor het transformeren van ingeteelde maïslijnen met hoge kwaliteit door beschieten met deeltjes. Bij deze techniek wordt gebruik gemaakt van onvolwassen maïsembryo’s met een lengte van 1,5-2,5 mm die 14-15 dagen na bestuiven uit een maïsoor zijn afgesneden, alsmede en een PDS-1000He Bolistics inrichting voor het beschieten.

10 Het transformeren van rijst kan tevens worden uitgevoerd door directe genoverdrachtstechnieken en de toepassing van protoplasten of beschieten met deeltjes. Transformatie onder toepassing van protoplasten is beschreven voor Japonica-typen en Indica-typen (Zhang et al. Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimamoto et al. Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al. Biotechnology 8: 736-740 15 (1990)). Beide typen kunnen ook routinematig worden getransformeerd door beschieten met deeltjes (Christou et al. Biotechnology 9: 957-962 (1991)).

Octrooiaanvrage EP-0.332.581 (van Ciba-Geigy) beschrijft technieken voor het genereren, transformeren en regenereren van Pooideaeprotoplasten. Deze technieken maken het transformeren van Dactylis en tarwe mogelijk. Verder is het transformeren 20 van tarwe door het afschieten van deeltjes tot in cellen van op lange termijn regenereerbar callus van type C beschreven door Vasil et al. (Biotechnology J_0: 667-674 (1992)), en door het afschieten van deeltjes op onvolwassen embryo’s en onvolwassen uit embryo’s verkregen callus tevens door Vasil et al. (Biotechnology IT· 1553-1558 (1993)) en Weeks et al. (Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993)).

25 Echter, een bij voorkeur toegepaste techniek voor het transformeren van tarwe omvat het transformeren van tarwe door beschieten met deeltjes van onvolwassen embryo’s en omvat een stap bij een hoog sucrose of hoog maltosegehalte voorafgaand aan het inbrengen van het gen. Voorafgaand aan het beschieten wordt een willekeurig aantal embryo’s (0,75-1 mm in lengte) uitgeplaat op MS-medium met 3% sucrose 30 (Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)) en 3 mg/1 2,4-D voor het induceren van somatische embryo’s, hetgeen in het donker wordt uitgevoerd. Op de dag van het beschieten worden de embryo’s uit het inductiemedium verwijderd en op het osmoticum (dat wil zeggen inductiemedium waaraan sucrose of maltose bij 1 007779 60 de gewenste concentratie is toegevoegd, doorgaans 15%) gebracht. De embryo’s worden gedurende 2-3 uur aan plasmolyse onderworpen en vervolgens beschoten. Twintig embryo’s per als doelwit gebruikte plaat is gebruikelijk, maar niet kritiek. Een geschikt gen-dragend plasmide (zoals pCIB3064 of pSG35) wordt neergeslagen 5 op gouddeeltjes van micrometergrootte onder toepassing van standaardprocedures. Iedere embryo’s bevattende plaat wordt beschoten met het DuPont Biolistics® heliumapparaat bij een afschietdruk van 1000 psi onder toepassing van een standaard 80 mesh scherm. Na beschieten worden de embryo’s opnieuw in het donker gezet zodat zij gedurende ongeveer 24 uur kunnen herstellen (nog steeds op osmoliticum). 10 Na 24 uur worden deeltjes uit het osmoliticum verwijderd en teruggeplaatst in het inductiemedium waar zij gedurende ongeveer een maand verblijven voordat zij worden geregenereerd. Ongeveer een maand later worden de embryo explanten met ontwikkelend embryogeen callus overgebracht naar regeneratiemedium (MS + 1 mg/1 NAA, 5 mg/1 GA) die verder het geschikte selectiemiddel bevat (10 mg/1 basta in het 15 geval van pCIB3064 en 2 mg/1 methotrexaat in het geval van pSOG35). Na ongeveer een maand worden de zich ontwikkelende scheuten overgebracht naar grotere steriele containers die bekend zijn als "GA7s" en die de helft van de sterkte MS, 2% sucrose, en dezelfde concentratie selectiemiddel bevatten. Octrooiaanvrage 08/147.161 beschrijft technieken voor het transformeren van tarwe en is hierin door verwijzing 20 opgenomen.

Recentelijk is het transformeren van monocotyle planten onder toepassing van Agrobacterium beschreven. Zie bijvoorbeeld WO 94/00977 en Amerikaans octrooischrift 5.591.616, die beide door verwijzing hierin zijn opgenomen.

25 Kweken

Het geïsoleerde genfragment volgens de onderhavige uitvinding of gewijzigde vormen van het M/W-gen kunnen worden gebruikt voor het overbrengen van ziekteresistentie naar een groot aantal verschillende plantencellen, waaronder die van bedektzadigen, monocotyle en dicotyle planten. Hoewel het gen in iedere plantencel 30 die binnen deze brede klassen valt kan worden ingebracht, is het in het bijzonder geschikt voor toepassing bij cellen van gewasplanten, zoals rijst, tarwe, gerst, rogge, mais, aardappel, wortel, zoete aardappel, suikerbiet, bonen, doperwten, chicorei, sla, kool, bloemkool, broccoli, raap, radijs, spinazie, asperge, ui, knoflook, eierplant, 1 007779 61 peper, selderij, wortel, pompoen, in het bijzonder Cucurbita pepo, zucchini, komkommer, appel, peer, kweepeer, meloen, pruim, kers, perzik, nectarine, abrikoos, aardbei, druif, framboos, ananas, avocado, papaya, mango, banaan, soja, tabak, tomaat, sorghum of suikerriet.

5 De expressie van het NIM1-gen en mutanten hiervan bij hoog niveau die noodzakelijk is voor constitutieve expressie van SAR-genen, in combinatie met andere kenmerken die van belang zijn voor productie en kwaliteit, kunnen door inkweken in plantenlijnen worden opgenomen. Derhalve omvatten verdere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding een werkwijze voor het produceren 10 van transgene nakomelingen van een transgene ouderplant die een geïsoleerd DNA-molecuul bevat dat codeert voor een gewijzigde vorm van een NIM1-eiwit volgens de onderhavige uitvinding, welke werkwijze omvat het transformeren van de ouderplant met een recombinante vectormolecuul volgens de uitvinding en het overdragen van de eigenschap naar de nakomelingen van transgene ouderplant onder toepassing van 15 bekende plantenkweektechnieken. Methodologieën en technieken voor het kweken zijn in het vakgebied bekend. Zie bijvoorbeeld Welsh, J.R., Fundamentals of Plant Genetics and Breeding. John Wiley & Sons, NY (1981); Crop Breeding. Wood, D.R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wisconsin (1983); Mayo 0., The Theory of Plant Breeding. Second Edition, Clarendon Press, Oxford (1987); Singh,

20 D.P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests. Springer-Verlag, NY

(1986); and Wricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding. Walter de Gruyter and Co., Berlin (1986).

Het vermenigvuldigen van de genetische eigenschappen die aan de transgene zaden 25 en planten ziin verleend en het handhaven ervan in de nakomelingen.

De genetische eigenschappen die aan de hierboven beschreven transgene zaden en planten zijn verleend worden overgedragen door sexuele reproductie of vegetatieve groei en kunnen derhalve worden behouden en vermenigvuldigd in de nakomelingen. In het algemeen wordt bij dit behouden en vermenigvuldigen gebruik gemaakt van 30 bekende landbouwkundige technieken die ontwikkeld zijn voor specifieke doelen, zoals verbouwen, zaaien of oogsten. Gespecialiseerde processen zoals hydroponische technieken of technieken onder glas kunnen tevens worden toegepast. Als het groeiende gewas kwetsbaar is voor aanval en schade door insecten of infecties alsook 1007779 62 voor competitie door onkruid, worden maatregelen genomen voor het bestrijden van onkruid, plantenziekten, insecten, nematoden, en andere nadelige omstandigheden voor het verbeteren van de opbrengst. Deze omvatten mechanische technieken zoals een behandelen van de bodem of het verwijderen van onkruid en geïnfecteerde 5 planten, alsook het gebruik van agrochemicaliën zoals herbiciden, fungiciden, gametociden, nematiciden, groeiregelende middelen, rijpingsmiddelen en insecticiden. De voordelige genetische eigenschappen van de transgene planten en zaden volgens de uitvinding kunnen tevens worden gebruikt in het kweken van planten waarbij het doel is het ontwikkelen van planten met verbeterde eigenschappen zoals tolerantie 10 tegen schadelijke organismen, herbiciden of stress, verbeterde voedingswaarde, verbeterde opbrengst of verbeterde structuur hetgeen leidt tot minder verlies door verstoren of beschadigen. De verschillende kweekstappen worden gekenmerkt door goed gedefinieerd menselijk ingrijpen zoals het selecteren van de te kruisen lijnen, het leiden van de bestuiving van de ouderlijnen of het selecteren van geschikte 15 nakomelingen. Afhankelijk van de gewenste eigenschappen kunnen verschillende kweekmaatregelen worden genomen. De relevante technieken zijn in het vakgebied algemeen bekend en omvatten, maar zijn niet beperkt tot, hybridisatie, inteelt, terugkruiskweken, kweken uit meerdere lijnen, mengen van variëteiten, interspecifieke hybridisatie, aneuploïdetechnieken, en dergelijke.

20 Hybridisatietechnieken omvatten tevens het steriliseren van planten voor het verschaffen van mannelijke of vrouwelijke steriele planten door mechanische, chemische of biochemische technieken. Kruisbestuiving van een mannelijke steriele plant met stuifmeel van een andere lijn verzekert dat het genoom van de mannelijke steriele, maar vrouwelijk vruchtbare plant uniform de eigenschappen van de beide 25 ouderlijnen verkrijgt. Zo kunnen de transgene zaden en planten volgens de uitvinding worden gebruikt voor het kweken van verbeterde plantenlijnen die bijvoorbeeld de effectiviteit van gebruikelijke methoden zoals het behandelen met herbicide of pesticide doen toenemen of het mogelijk maken van dergelijke methoden af te zien vanwege hun gemodificeerde genetische eigenschappen. Alternatief kunnen nieuwe 30 gewassen met verbeterde stresstolerantie worden verkregen die, door hun verbeterde genetische "vermogen", een oogstproduct met betere kwaliteit geven dan producten die niet in staat waren vergelijkbare nadelige omstandigheden tijdens hun ontwikkeling te weerstaan.

1007779 63

Bij de zaadproductie zijn kwaliteit van ontkieming en gelijkmatigheid van zaden essentiële producteigenschappen, terwijl ontkiemingskwaliteit en gelijkmatigheid van zaden die geoogst en verkocht worden door de boer niet belangrijk is. Daar het moeilijk is een gewas vrij te houden van zaden van andere 5 gewassen en van onkruid, voor het tegengaan van door zaadgedragen ziekten en voor het produceren van zaad met goede ontkieming, zijn door zaadproducenten, die alle ervaren zijn in de techniek van het voortbrengen, conditioneren en op de markt brengen van zuiver zaad, zeer uitgebreide en goed gedefinieerde zaadproductiemethoden ontwikkeld. Het is daarom gebruikelijk dat de boer 10 gecertificeerd zaad koopt dat aan bepaalde specifieke kwaliteitseisen voldoet, in plaats van zaad dat hij zaad gebruikt dat geoogst is van zijn eigen gewassen. Voortplantingsmateriaal dat als zaad wordt gebruikt wordt doorgaans behandeld met een beschermende bekleding die herbiciden, insecticiden, fungiciden, bactericiden, nematiciden, mollusciciden of mengsels hiervan omvat. Doorgaans toegepaste 15 beschermende bekledingen omvatten verbindingen zoals captan, carboxin, thiram (TMTD®), methalaxyl (Apron®), en pirimifos-methyl (Actellic®). Indien wenselijk worden deze verbindingen samen met verdere dragers, oppervlakte-actieve stoffen of toepassings-verbeterende adjuvantia geformuleerd, zoals deze doorgaans in het formuleringsvakgebied worden toegepast voor het verschaffen van bescherming tegen 20 schade veroorzaakt door schadelijke bacteriën, fungi of dieren. De beschermende bekledingen kunnen worden opgedragen door het voortplantingsmateriaal te impregneren met een vloeibare formulering of te bekleden met een gecombineerde natte of droge formulering. Andere technieken voor het opdragen zijn ook mogelijk, zoals een behandeling die is gericht op de knoppen of het fruit.

25 Het is een verder aspect van de onderhavige uitvinding dat nieuwe landbouwtechnieken worden te verschaft, zoals de hierboven als voorbeeld gegeven technieken, die worden gekenmerkt door het gebruik van transgene planten, transgeen plantenmateriaal, of transgeen zaad volgens de onderhavige uitvinding.

De zaden kunnen worden verschaft in een zak, houder of vat, die een geschikt 30 verpakkingsmateriaal omvat, waarbij de zak of houder kan worden afgesloten voor het houden van de zaden. De zak, houder of het vat kan ontworpen zijn voor opslag over een kortere of langere tijd, of beide, van het zaad. Voorbeelden van geschikte verpakkingsmaterialen zijn papier, zoals kraftpapier, stijf of buigbaar plastic of een 1007779 64 ander polymeer materiaal, glas of metaal. Bij voorkeur bestaat de zak, de houder of het vat uit meerdere lagen verpakkingsmateriaal, van dezelfde of verschillende typen. Volgens een uitvoeringsvorm wordt de zak, houder of het vat zodanig verschaft dat het in contact komen van het zaad met water en vocht wordt beperkt of wordt 5 uitgesloten. In een voorbeeld is de zak, houder of vat afgesloten, bijvoorbeeld afgesloten door verhitten, zodat voorkomen wordt dat vocht of water binnentreden. Volgens een andere uitvoeringsvorm worden waterabsorberende materialen geplaatst tussen of naast de lagen van het verpakkingsmateriaal. Volgens weer een andere uitvoeringsvorm wordt de zak, houder of het vat, of het verpakkingsmateriaal waaruit 10 deze is vervaardigd, behandeld voor het beperken, onderdrukken of voorkomen van ziekte, verontreiniging of andere nadelige invloeden op de opslag of het transport van het zaad. Een voorbeeld van een dergelijke behandeling is sterilisatie, bijvoorbeeld langs chemische weg of door het blootstellen aan straling. Omvat binnen de onderhavige uitvinding is een zak voor handelsdoeleinden die zaad van een transgene 15 plant omvat, welke ten minste een gewijzigde vorm van een NIM1 -eiwit omvat, of een NIM1-eiwit dat in de getransformeerde plant bij hogere gehalten tot expressie wordt gebracht dan in een wild-type plant, samen met een geschikte drager, en samen met een bijsluiter voor het gebruik hiervan voor het overbrengen van ziekteresistentie met een breed-werkingsspectrum aan planten.

20

Ziekteresistentie

Het beoordelen van een ziekteresistentie wordt uitgevoerd door in het vakgebied bekende methoden. Zie bijvoorbeeld Uknes et al. (1993) Molecular Plant Microbe Interactions 6: 680-685; Gorlach et al., (1996) Plant Cell 8: 629-643; Alexander et 25 al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7327-7331.

A. Assay voor resistentie tegen Phvtophthora parasitica (Zwarte roti.

Assays voor resistentie tegen Phytophthora parasitica, het organisme dat zwarte rot veroorzaakt, wordt uitgevoerd op zes weken oude planten die zijn gekweekt zoals 30 beschreven in Alexander et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7327-7331. De planten wordt water gegeven, waarna men het water goed laat weglopen, en vervolgens geënt door het opbrengen van 10 ml van een sporangiumsuspensie (300 sporangia/ml) aan de bodem. De geënte planten worden wordt in een kas gehouden, 1 007779 65 bij een dagtemperatuur van 23-25°C en een nachttemperatuur van 20-22°C. De aantastingsindex die voor het assay gebruikt wordt is als volgt: 0 = geen symptomen; 1 = geen symptomen; 1 = enige tekenen van aantasting, met verminderde opzwelling; 2 = duidelijke symptomen van aantasting, maar geen rotten of beperking van de 5 groei; 3 = duidelijke symptomen van aantasting met beperking van de groei, maar geen rotten van de stam; 4 = aanzienlijke aantasting, met zichtbaar rotten van de stam en enige schade aan het wortelsysteem; 5 = zoals 4, maar met de planten dood of bijna dood, en met aanzienlijke aantasting van het wortelsysteem. Alle assays worden blind beoordeeld met planten die volgens een willekeurig ontwerp zijn opgesteld.

10 B. Assay voor resistentie tegen Pseudomonas svringae.

Pseudomonas syringae pv. tabaksstam #551 wordt geïnjecteerd in de twee lagere bladen van verschillende 6-7 week oude planten bij een concentratie van 106 of 3 x 106 per ml in H20. Zes afzonderlijke planten worden op ieder tijdstip beoordeeld.

15 De met Pseudomonas tabaci geïnfecteerde planten worden ingedeeld volgens een uit 5 punten bestaande schaal voor de ernst van de aandoening, 5 = 100% dood weefsel, 0 = geen symptomen. Een T-test (LSD) wordt uitgevoerd op de resulaten van iedere dag en de groeperingen worden aangegeven na de gemiddelde ziekte beoordelingswaarde. Waarden die gevolgd worden door dezelfde letter op dezelfde 20 dag van beoordeling zijn statistisch niet significant verschillend.

C. Assay voor resistentie tegen Cercosttora nicotianae.

Een sporensuspensie van Cercospora nicotianae (ATCC #18366) (100.000-150.000 sporen per ml) wordt op het oppervlak van de bladeren gesproeid 25 tot het punt van afdruipen. De planten worden gedurende 5 dagen in 100%’ig vochtigheid gehouden. Daarna worden de planten 5-10 maal per dag beneveld met water. Zes afzonderlijke planten worden op ieder tijdspunt geëvalueerd. Cercospora nicotianae wordt beoordeeld op basis van het percentage van het bladoppervlak dat ziektesymptomen vertoont. Een T-test (LSD) wordt uitgevoerd op de beoordelingen 30 van iedere dag en de groeperingen worden aangegeven na de gemiddelde ziektebeoordelingswaarde. Waarden die op de dag van beoordeling door dezelfde letter worden gevolgd zijn statistisch niet significant verschillend.

1 007779 66 D. Assay voor resistentie tegen Peronosoora parasitica

Assays voor resistentie tegen Peronospora parasitica worden uitgevoerd op planten zoals beschreven door Uknes et al. (1993). De planten worden geënt met een bestrijdbaar isolaat van P. parasitica door deze te besproeien met een suspensie van 5 conidiën (ongeveer 5 x 104 sporen per milliliter). De geënte planten worden in een groeikamer met een cyclus van 14 uur dag/10 uur nacht onder vochtige omstandigheden bij 17°C geïncubeerd. De planten worden 3-14 dagen, bij voorkeur 7-12 dagen, na het enten onderzocht op de aanwezigheid van conidioforen. Verder worden verschillende planten uit iedere behandeling willekeurig geselecteerd en 10 gekleurd met lactofenol-trypaan blue (Keogh et al., Trans. Br. Mycol. Soc. 74: 329-333 (1980)) voor microscopisch onderzoek.

Korte beschrijving van de figuren

Figuur 1 toont de invloed van chemische inducerende factoren op de inductie 15 van SAR-genexpressie in wild-type en «/«//-planten. Chemische inductie van SAR-genen is verminderd in «/«//-planten. Water, SA, INA of BTH wordt opgedragen op wild-type (WT) en niml-planten. Na 3 dagen wordt RNA uit deze planten bereid en onderzocht op expressie van PR-1, PR-2 en PR-5.

Figuur 2 toont PR-1 de genexpressie in met pathogeen geïnfecteerde Ws-0 en 20 «//«/-planten. Inductie van PR-1 door pathogeen is verminderd in «//«/-planten. Wild-type (WT) en «//«/-planten werden door besproeien geënt met het Emwa ras van P.parasitica. Op dagen 0, 1, 2, 4 en 6 werden monster genomen en werd het RNA geanalyseerd door vlekhybridisatie met een A.thaliana PR-1 cDNA testreeks voor het meten van PR-1 mRNA-vorming.

25 Figuur 3 toont de vorming van PR-1 mRNA in niml-mutanten en wild-type planten na infectie met een pathogeen of na chemische behandeling. Planten die de niml-allelen niml-1, -2, -3, -4, -5 en -6 en Ws-0 (Ws) bevatten werden 3 dagen voor het RNA werd geïisoleerd behandeld met water (C), SA, INA of BTH. Het Emwa-monster bestaat uit RNA dat 14 dagen na het enten van het Emwa-isolaat met P.

30 parasitica uit planten werd geïsoleerd. Vlekken werden gehybridiseerd onder toepassing van een Arabidopsis PR-1 cDNA als een testreeks (Uknes et al., 1992).

Figuur 4 toont de gehalten van SA-vorming in Ws-0 en «/«//-planten die waren geïnfecteerd met P. syringae. niml-planten vormen SNA na blootstelling aan een 1007779 67 pathogeen. Bladeren van wild-type en niml-planten worden geïnfiltreerd met Pst DC3000 (avrRpt2) of alleen met dragermedium (10 mM MgCl2). Na 2 dagen werden monsters genomen van de niet-behandelde, de met MgCl2-behandelde en de met DC3000 (avrR/?/2)-behandelde planten. De met bacteriën behandelde monsters 5 werden gescheiden in primaire (geïnfiltreerde) en secundaire (niet-geïnfiltreerde) bladeren. Vrije SA en totale SA na hydrolyse met β-glucosidase werden bepaald door HPLC. Errorstrepen geven de SD van drie gerepliceerde monsters.

Figuren 5A-D tonen een algemene kaart bij toenemende resolutie van het chromosomale gebied rond NIM1 met de aangegeven recombinanten, waaronder 10 BACs, YACs en cosmiden in het ΜΛ/7-gebied.

(A) Kaartpositie van NIM1 op chromosoom 1. Het totaal aantal onderzochte gameten is 2276.

(B) Gist-artificieel chromosoom (gestreept) bacterieel artificieel chromosoom (BAC) en PI-klonen gebruikt voor het kloneren van N1M1.

15 (C) Cosmideklonen die de NIM1-plaats omvatten. De drie cosmiden die tiiml- 1 complementeren zijn weergegeven als dikkere lijnen.

(D) De vier putatieve gengebieden op het smalste fragment van het complementerende genomische DNA. De vier open afleesramen die het NIMl-gen vormen zijn aangegeven door de open strepen. De pijlen geven 20 de richting van de transcriptie aan. De nummering is relatief ten opzichte van de eerste base van het Arabidopsis genomisch DNA dat aanwezig is in cosmide D7.

Figuur 6 toont de nucleïnezuursequentie van het NIM1-gen en de aminozuursequentie van het MM/-genproduct, waaronder veranderingen in de 25 verschillende allelen. Deze nucleïnezuursequentie, die op de tegengestelde streng ligt als de 9,9 kb sequentie die in SEQ ID nr.: 1 is getoond, is tevens aanwezig in SEQ ID nr.: 2, en de aminozuursequentie van het MM/-genproduct is tevens getoond in SEQ ID nr.: 3.

Figuur 7 toont de vorming van NIM1 zoals geïnduceerd door behandeling met 30 INA, BTH, SA en pathogeen in wild-type planten en in mutante allelen van niml. De RNA-gelvlekken in Figuur 3 werden onderzocht op expressie van RNA onder toepassing van een testreeks die was afgeleid van 2081-3266 in de in Figuur 6 getoonde sequentie.

1 007779 68

Figuur 8 is een vergelijking van aminozuursequentie van de Expressed Sequence Tag-gebieden van het NIM1-eiwit en cDNA-eiwitproducten van 4 rijstgensequenties (SEQ ID nrs.: 4-11); de nummers komen overeen met de aminozuurposities in SEQ ID nr.: 3).

5 Figuur 9 is een weergave van een vergelijking van de sequenties van de NIM1- eiwitsequentie met ΙκΒα (muis, rat en varken). Verticale strepen (|) boven de sequenties geven aan dat de aminozuren in de sequenties van NIM1 en ΙκΒα identiek zijn (matrixscore gelijk aan 1.5); dubbele punten (:) boven de sequenties geven een score voor overeenkomst van >0,5 aan; enkele stippen (.) boven de sequenties geven 10 een score in overeenkomst van <0,5 maar >0,0 aan; en een score van <0,0 geeft geen gelijkenis aan en heeft geen merktekens boven de sequenties (zie de voorbeelden). De posities van de zoogdier ΙκΒα-ankyrindomeinen werden geïdentificeerd volgens de Martin et al., Gene 152, 253-255 G995). De punten binnen een sequentie geven onderbrekingen tussen de NIM1 en ΙκΒα-eiwitten aan. De vijf ankyrin herhalende 15 gebieden in ΙκΒα zijn aangegeven door de stippellijn onder de sequentie.

Aminozuren zijn genummerd ten opzichte van het NIM1-eiwit, waarbij onderbrekingen zijn aangegeven waar vereist. Plustekens (+) zijn na iedere 10 aminozuren boven de sequenties geplaatst.

20 Deponerineen

De volgende vectormoleculen zijn gedeponeerd bij de American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive Rockville, MD 20852, USA, op de hieronder aangegeven data:

Plasmide BAC-04 werd bij het ATCC gedeponeerd op 8 mei 1996 als ATCC 97543. 25 Plasmide PI-18 werd gedeponeerd bij het ATCC op 13 juni 1996 als ATCC 97606. Cosmide D7 werd gedeponeerd bij het ATCC op 25 september 1996 als ATCC 97736.

Korte omschrijving van de sequenties in de Hist van sequenties 30 SEQ ID nr.: 1 - de 9919-bp genomische sequentie van het MM/-gengebied 2 in

Figuur 5D.

SEQ ID nr.: 2 - de 5655-bp genomische sequentie in Figuur 6 (tegengestelde streng van SEQ ID nr.: 1), die het coderende gebied van het Arabidopsis thaliana 1007779 69 NIM1-gen omvat.

SEQ ID nr.: 3 - de aminozuursequentie van wild-type NIM1-eiwit zoals gecodeerd door de sequenties van SEQ ID nr.: 2.

SEQ ID nr.: 4 - Rijst-1 aminozuursequentie 33-155 uit Figuur 8.

5 SEQ ID nr.: 5 - Rijst-1 aminozuursequentie 215-328 uit Figuur 8.

SEQ ID nr.: 6 - Rijst-2 aminozuursequentie 33-155 uit Figuur 8.

SEQ ID nr.: 7 - Rijst-2 aminozuursequentie 208-288 uit Figuur 8.

SEQ ID nr.: 8 - Rijst-3 aminozuursequentie 33-155 uit Figuur 8.

SEQ ID nr.: 9 - Rijst-3 aminozuursequentie 208-288 uit Figuur 8 10 SEQ ID nr.: 10 - Rijst-4 aminozuursequentie 33-155 uit Figuur 8.

SEQ ID nr.: 11 - Rijst-4 aminozuursequentie 215-271 uit Figuur 8.

SEQ ID nr.: 12 - Oligonucleotide.

SEQ ID nr.: 13 - Oligonucleotide.

SEQ ID nr.: 14 - Oligonucleotide.

15 SEQ ID nr.: 15 - Oligonucleotide.

SEQ ID nr.: 16 - Oligonucleotide.

SEQ ID nr.: 17 - Oligonucleotide.

SEQ ID nr.: 18 is de muis ΙκΒα-aminozuursequentie van Figuur 8.

SEQ ID nr.: 19 is de rat ΙκΒα-aminozuursequentie van Figuur 8.

20 SEQ ID nr.: 20 is de varkens ΙκΒα-aminozuursequentie van Figuur 8.

SEQ ID nr.: 21 is de cDNA-sequentie van het Arabidopsis thaliana NIM]-gen.

SEQ ID nrs.: 22 en 23 zijn respectievelijk de DNA-coderende sequentie en de gecodeerde aminozuursequentie van een dominant-negatieve vorm van het NIM1-eiwit met alanineresten in plaats van serineresten bij aminozuurposities 55 en 59.

25 SEQ ID nrs.: 24 en 25 zijn respectievelijk de DNA-coderende sequentie en de gecodeerde aminozuursequentie van een dominant-negatieve vorm van het NIM1-eiwit met een N-eindstandige deletie.

SEQ ID nrs.: 26 en 27 zijn respectievelijk de DNA-coderende sequentie en de gecodeerde aminozuursequentie van een dominant-negatieve vorm van het NIM1-30 eiwit met een C-eindstandige deletie.

SEQ ID nrs.: 28 en 29 zijn respectievelijk de DNA-coderende sequentie en de gecodeerde aminozuursequentie van een gewijzigde vorm van het NJMl-gen met zowel N-eindstandige als C-eindstandige aminozuurdeleties.

1007779 70 SEQ ID nrs.: 30 en 31 zijn respectievelijk de DNA-coderende sequentie en de gecodeerde aminozuursequentie van het ankyrindomein van NIM1.

SEQ ID nrs.: 32 tot en met 39 zijn oligonucleotide-basisreeksen.

5 Definities acd: versnelde celdood ("accelerated cell death") mutante plant AFLP: geamplificeerd fragmentlengte polymorfisme avrRpt2: avirulentiegen Rpt2, geïsoleerd uit Pseudomonas syringae BAC: bacterieel artificieel chromosoom 10 BTH: benzo(l,2,3)thiadiazool-7-carbothiozuur S-methylester CIM: fenotype van constitutieve immuniteit (SAR wordt constitutief geactiveerd) cim: mutante plant met constitutieve immuniteit cM: centimorgans 15 cpr\: mutante plant die constitutief PR-gen tot expressie brengt

Col-0: Arabidopsis ecotype Columbia ECs: enzymcombinaties

Emwa: Peronospora parasitica isolaat dat verenigbaar is met het Ws-0-ecotype van Arabidopsis 20 EMS: ethylmethylsulfonaat INA: 2,6-dichloorisonicotinezuur

Ler: Arabidopsis ecotype Landsberg erecta

Isd: mutante plant met lesies simulerende ziekte nahG: salicylaathydroxylase Pseudomonas putida dat salicylzuur in catechol 25 omzet

NaGh\ ArabidopsisA\)x\ die getransformeerd is met het «a/iG-gen ndr: mutante plant met niet-rasspecifieke ziekteresistentie nim: mutante plant met niet-induceerbare immuniteit N1M1: het wild-typegen dat betrokken is bij de SAR*signaaltransductiecascade 30 NIM1: het eiwit dat gecodeerd wordt door het wild-type ΜΛ/7-gen nim}·. mutante allelen van NIM1, die gevoeligheid voor ziekte aan de plant verlenen; verwijst tevens naar mutante Arabidopsis thaliana-planten die de niml mutante alleel van NIM1 bevatten 1007779 71

Noco: Peronospora parasitica isolaat dat verenigbaar is met het Col-O-ecotype van Arabidopsis ORF: open afleesraam PCs: testreekscombinaties 5 PR: aan pathogenese gerelateerd SA: salicylzuur SAR: systemisch verworven resistentie SSLP: simpele sequentielengte polymorfisme UDS: fenotype van universele ziektegevoeligheid 10 Wela: Peronospora parasitica isolaat dat verenigbaar is in het Weiningen ecotype van Arabidopsis Ws-0: Arabidopsis ecotype Issilewskija WT: wild-type YAC: gist-artifideel chromosoom 15

Voorbeelden

De uitvinding wordt nader toegelicht door de volgende gedetailleerde procedures, bereidingen en voorbeelden. De voorbeelden zijn uitsluitend ter illustratie, en moeten niet worden opgevat als een beperking van het gebied van de uitvinding.

20 De hierin toegepaste standaard recombinant-DNA en moleculaire kloneringstechnieken zijn in het vakgebied algemeen bekend en worden beschreven door Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) en door T.J. Silhavy, M.L. Berman, en L.W.

Enquist, Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold 25 Spring Harbor, NY (1984) en door Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, gepubliceerd door Greene Publishing Assoc, en Wiley-Interscience (1987).

A. Karakterisatie van de mm7-mutanten 30

Voorbeeld 1: Plantenliinen en fungusstammen

Arabidopsis thaliana ecotype Isilewskija (Ws-0; stamnummer CS 2360) en vierde generatie (T4) zaden van T-DNA-getransformeerde lijnen werden verkregen 1007779 72 van de Ohio State University Arabidopsis Biological Resource Center (Columbus, OH). Tweede generatie (M2) zaden van met ethylmethaansulfonaat (EMS) gemutageniseerde Ws-O-planten werden verkregen van Lehle Seeds (Round Rock, TX).

5 Pseudomonas syringae pv. Tomato (Pst) stam DC3000 die het gekloneerde avrRpt2-gen bevat [DC3000(avrRpi2)] werd verkregen van B. Staskawicz, University of California, Berkeley. P. parasitica pathovars en hun bronnen waren als volgt: Emwa van E. Holub en I.R. Crute, Horticultural Research Station, East Mailing, Kent; Wela van A. Slusarenko en B. Mauch-Mani, Institut fur Pflanzenbiologie, 10 Zürich, Zwitserland; en Noco van J. Parker, Sainsbury Laboratory, Norwich,

England. Schimmelkweken werden in stand gehouden door wekelijks kweken op Arabidopsis ecotype Ws-0, Weiningen, voor respectievelijk P. parasitica pathovars Emwa, Wela en Noco.

15 Voorbeeld 2: Onderzoek van mutanten

Mr of T4-zaden werden gedurende 2 weken op bodem gekweekt onder 14 uur licht per dag, beneveld met 0,33 mM INA (0,25 mg/ml gemaakt van 25% INA bevochtigbaar poeder; Ciba, Basel, Zwitserland), en vier dagen later geënt door besproeien met een P. parasitica conidiussuspensie die 5-10 x 104 conidioforen per 20 ml water bevatte. Dit fungus is normaal virulent op het Arabidopsis Ws-O-ecotype, tenzij eerst resistentie wordt geïnduceerd in deze planten met isonicotinezuur (INA) of een soortgelijke verbinding. De planten werden gedurende een week onder vochtige omstandigheden bij 18°C gehouden en vervolgens beoordeeld op sporenvorming door het fungus. Planten die groei van het fungus vertoonden na 25 behandeling met INA werden geselecteerd als mogelijke mutanten.

Na incubatie in een omgeving met hoge vochtigheid werden planten met zichtbare ziektesymptomen geïdentificeerd, doorgaans 7 dagen na de infectie. Deze planten vertonen geen resistentie tegen het fungus, ondanks de toepassing van de resistentie-inducerende chemische verbinding en waren derhalve mogelijke nim (niet-30 induceerbare immuniteit) mutante planten. Uit 360.000 planten werden 75 mogelijke nim-mutanten geïdentificeerd.

Deze mogelijk mutante planten werden geïsoleerd uit het veld en onder omstandigheden met lage vochtigheid gebracht, waarna men de plant zaden liet 1 007779 73 vormen. De uit dit zaad verkregen planten werden op een zelfde wijze onderzocht op gevoeligheid voor het fungus Emwa, opnieuw na voorafgaande behandeling met INA. De nakomelingen die symptomen van infectie vertoonden werden gedefinieerd als m'm-mutanten. Aldus werden zes m'm-lijnen geïdentificeerd. Een lijn (niml-1) werd 5 uit de T-DNA-populatie geïsoleerd en vijf (rtiml-2, niml-3, niml-4, niml-5 en niml- 6) uit de EMS-populatie.

Voorbeeld 3: Ziekteresi sten tie van niml-planten

Salicylzuur (SA) en benzo(l,2,3)thiadiazool-7-carbothiozuur-S-methylester 10 (BTH) zijn chemicaliën die, evenals INA, een ziekteresistentie met breed- werkingsspectrum (SAR) in wild-typeplanten kunnen induceren. Mutante planten werden behandeld met SA, INA en BTH en vervolgens onderzocht op resistentie tegen Peronospora parasitica. P. parasitica isolaat "Emwa" is een P.p.-isolaat dat verenigbaar is met het Ws-ecotype. Verenigbare isolaten zijn isolaten die in staat zijn 15 ziekte op een specifieke gastheer te veroorzaken. Het P. parasitica isolaat "Noco" is niet verenigbaar met Ws maar verenigbaar met op het Columbia-ecotype. Niet-verenigbare pathogenen worden door de mogelijke gastheer herkend en veroorzaken een reactie in de gastheer die het ontstaan van de ziekte voorkomt.

Wild-typezaden en zaden voor ieder van de wW-allelen {niml-1, -2, -3, -4, -20 5, -6) werden gezaaid op MetroMix 300 groeimedium, bedekt met een doorzichtige plastic koepel, en gedurende drie dagen in het donker bij 4°C geplaatst. Na 3 dagen behandelen bij 4°C werden de planten gedurende 2 weken overgebracht naar een fytotron. Op ongeveer 2 weken na het naplanten hadden de ontkiemde zaailingen 4 echte bladeren ontwikkeld. De planten werden vervolgens behandeld met H20, 5 mM 25 SA, 300 μΜ BTH of 300 μΜ INA. De chemicaliën werden met behulp van een chromister opgebracht als een fijne nevel zodat zij de zaailingen volledig bedekten. Met water behandelde controleplanten werden opnieuw in het voor het groeien gebruikte fytotron geplaatst terwijl de chemisch behandelde planten in een afzonderlijk maar identiek fytotron werden gehouden. 3 dagen na het opbrengen van 30 de chemicaliën werden de met water en de chemisch behandelde planten geënt met het compatibele "Emwa"-isolaat. Enten met "Noco" werd alleen uitgevoerd op met water behandelde planten. Na het enten werden de planten bedekt met een heldere plastic koepel om de hoge vochtigheid die vereist is voor succesvolle infectie met P.

.1 007779 74 parasitica te behouden en in een groeikamer met een dagtemperatuur van 19°C en een nachttemperatuur van 17°C en een cyclus van 8 uur licht en 16 uur duister geplaatst.

Om de relatieve sterkte van de verschillende «zw/-al leien te bepalen werd 5 iedere mutant op verschillende tijdstippen na het enten microscopisch onderzocht op groei van P. parasitica onder normale groeiomstandigheden en na voorbehandeling met SA, INA of BTH. Onder vergroting kon sporulatie van het fungus worden waargenomen bij zeer vroege stadia van het ontstaan van de ziekte. Het percentage planten/pot dat sporulatie vertoonde op 5, 6, 7, 11 en 14 dagen na het enten werd 10 bepaald en tevens werd de dichtheid van de sporulatie bepaald.

Tabel 1 toont, voor ieder van de «zW-mutante plantenlijnen, het percentage planten dat op ten minste een blad enige conidia op het oppervlak vertoonde na infectie met het Emwa-ras van P. parasitica. P. parasitica werd drie dagen na behandeling met water of chemicaliën op de planten geënt. De tabel toont het aantal 15 dagen na infectie dat de ziekteresistentie werd beoordeeld.

Tabel 1

Percentage infectie - Emwa/referentie

Mutant Dag 0 Dag 5 Dag 6 Dag 7 Dag 11 20 Ws WT 0 10 25 100 90 niml-1 0 75 95 100 100 niml-2 0 30 85 100 100 niml-3 0 30 90 100 100 niml-4 0 80 100 100 100 25 niml-5 0 0 5 100 100 niml-6 0 5 70 80 100

Percentage infectie - Emwa/SA

Mutant Dag 0 Dag 5 Dag 6 Dag 7 Dag 11 1 00^^9 75

Ws WT O 5 30 70 100 niml-1 0 5 95 100 100 niml-2 0 5 95 100 100 niml-3 0 10 90 100 100 5 niml-4 0 75 100 100 100 niml-5 0 0 20 75 100 niml-6 0 80 100 100 100 1007779

Percentage infectie - Emwa/INA

76

Mutant Dag 0 Dag 5 Dag 6 Dag 7 Dag 11

Ws WT 0 0 0 0 0 .. 5 niml-1 0 5 80 100 100 niml-2 0 15 95 100 100 niml-3 0 10 60 100 100 niml-4 0 80 100 100 100 niml-5 0 0 0 5 5 10 niml-6 0 1 50 90 100

Percentage infectie - Emwa/BTH

Mutant Dag 0 Dag 5 Dag 6 Dag 7 Dag 11

Ws WT 0 0 0 0 0 15 niml-1 0 1 5 30 100 niml-2 0 0 25 90 100 niml-3 0 15 70 100 100 niml-4 0 80 100 100 100 niml-5 0 0 1 1 10 20 niml-6 0 1 90 100 100

Zoals blijkt uit tabel 1 vertoonden, onder normale groei, niml-1, niml-2, niml-3, niml-4 en niml-6 alle bij benadering dezelfde mate van schimmelgroei, die iets sneller was dan de Ws-0 controle. De uitzondering waren de niml-5 planten waar 25 schimmelgroei met een aantal dagen was vertraagd vergeleken met zowel de andere «//«/-mutanten als de Ws-0 controle, maar uiteindelijk gingen alle niml-5 planten aan het fungus ten onder.

Na behandeling met SA konden de mutanten in drie groepen worden onderverdeeld: niml-4 en niml-6 vertoonden een relatief snelle fungusgroei; niml-1, 30 niml-2, niml-3 planten vertoonde een iets lagere snelheid van schimmelgroei; en 1 007779 77 schimmelgroei in niml-5 planten was nog langzamer dan in de niet-behandelde Ws-0 controles. Na behandeling met INA of BTH vielen de mutanten eveneens in drie klassen, waarvan niml-4 het meest sterk beperkt was in zijn vermogen schimmelgroei tegen te gaan na chemische behandeling; niml-J, niml-2, niml-3 en niml-6 alle 5 matig beperkt waren; en niml-5 slechts weinig beperkt was. In deze proeven gaf Ws-0 geen schimmelgroei na behandeling met INA of BTH. Derhalve, ten aanzien van het remmen van schimmelgroei na chemische behandeling, vielen de mutanten in drie klassen, waarvan niml-4 het meest beperkt was, niml-1, niml-2, niml-3 en niml-6 een gemiddelde remming van schimmel vertoonden, en niml-5 een slechts in 10 beperkte mate beperkte resistentie tegen het fungus had.

Tabel 2 toont de beoordeling van de ziekteresistentie via classificering van de infectie van de verschillende mmi-allelen alsook van de NahG-planten op 7 en 11 dagen na enten met Peronospora parasitica. WsWt geeft de Ws-wild-type ouderlijn aan waarin de m'm/-allelen werden gevonden. De verschillende niml-allelen zijn 15 aangegeven in de tabel en de NahG-plant is tevens aangegeven.

Een beschrijving van de NahG-plant is eerder gepubliceerd (Delaney et al., Science 266, blz. 1247-1250 (1994)). NahG Arabidopsis is tevens beschreven in de Amerikaanse octrooiaanvrage met serienummer 08/454.876, hierin door verwijzing opgenomen. NahG is een gen van Pseudomonas putida dat codeert voor een 20 salicylaathydroxylase dat salicylzuur in catechol omzet, en derhalve het ophopen van salicylzuur, een noodzakelijk onderdeel van de signaaltransductie voor SAR in planten, tegengaat. Derhalve vertonen NahG Arabidopsisplanten geen normale SAR, en vertonen zij een veel grotere gevoeligheid tegen pathogenen in het algemeen. De NahG-planten reageren echter nog steeds op de chemische inductiemiddelen INA en 25 BTH. NahG-planten dienen derhalve als een algemene referentie voor gevoeligheid.

1007779

Mate van infectie - Emwa/water 78

Tabel 2

Mutant Dag 7 Dag 11

Ws WT 3 3 - 5 niml-1 4 4,5 niml-2 3 4 niml-3 4 4 niml-4 5 5 niml-5 1 3,5 10 niml-6 3 4,5

NahG 4 5

Mate van infectie - Emwa/SA

Mutant Dag 7 Dag 11 15 Ws WT 3 4 niml-1 3 4,5 niml-2 3 4 niml-3 3 4 niml-4 4 5 20 niml-5 3 3 niml-6 4 4,5

NahG 4 5 1 007779

Mate van infectie - Emwa/INA

79

Mutant Dag 7 Dag 11

Ws WT 0 0 niml-1 2,5 4 ' 5 niml-2 4 4 niml-3 3 3,5 niml-4 4 5 niml-5 1 2 niml-6 3 4,5 10 NahG 3 3

Mate van infectie - Emwa/BTH

Mutant Dag 7 Dag 11

Ws WT 0 0 15 niml-1 2,5 4 niml-2 3,5 4 niml-3 3 3,5 niml-4 4 5 niml-5 1,5 2 20 niml-6 3 4

NahG 0 0

Uit Tabel 2 blijkt dat de niml-4 en niml-6 allelen de meest ernstige Peronospora parasitica infecties vertoonden; dit was het meest duidelijk waar te 25 nemen op de vroege tijdstippen. Verder vertoonde de niml-5 alleel de grootste reactie op zowel INA als BTH, zodat dit als de zwakste niml-alleel werd beoordeeld. De NahG-planten vertoonden een zeer goede reactie op zowel INA als BTH en leken zeer sterk op de niml-5-a\\e\en. Echter, op late tijdstippen, dag 11 in de Tabel, begon de geïnduceerde ziekteresistentie in de NahG-planten af te nemen en was er een 30 aanzienlijk verschil tussen INA en BTH, daar de door INA-geïnduceerde resistentie 1007779 80 veel sneller en ernstiger afnam dan de resistentie die door BTH in de NahG-planten was geïnduceerd. Zoals tevens blijkt uit deze proeven induceerden INA en BTH zeer goede resistentie in Ws tegen Emwa en toonden de niml-1, niml-2 en andere niml allelen in wezen geen reactie tegen SA of INA ten aanzien van ziekteresistentie.

5 Het gebrek aan reactie van de mm 7-planten tegen de SAR-inducerende chemicaliën SA, INA en BTH impliceert dat deze mutatie zich stroomafwaarts bevinden van de aangrijpingspunt en) van deze chemicaliën in de signaaltransductiecascade die tot systemisch verworven resistentie leidt.

10 Voorbeeld 4: Northemanalvse van SAR-genexpressie

Daar SA, INA en BTH geen SAR, of SAR-genexpressie, in ieder van de niml-planten induceerden, was het van belang te onderzoeken of infectie met een pathogeen SAR-genexpressie in deze planten kon induceren, zoals in de wild-typeplanten. Derhalve werd de vorming van SAR-gen mRNA tevens gebruikt als een 15 maatstaf voor het karakteriseren van de verschillende mm7-allelen.

Wild-typezaden en zaden voor ieder van de m'm7-allelen (niml-l, -2, -3, -4, -5, -6) werden gezaaid op MetroMix 300 groeimedium, bedekt met een doorzichtige plastic koepel, en gedurende drie dagen bij 4°C in het donker gehouden. Na 3 dagen behandelen bij 4°C werden de planten gedurende 2 weken overgebracht naar een 20 fytotron. Ongeveer twee weken na het planten hadden de ontkiemde zaailingen vier echte bladeren ontwikkeld. De planten werden vervolgens behandeld met H20, 5mM SA, 300 μΜ BTH, of 300 μΜ INA. De chemicaliën werden met behulp van een chromister als een fijne nevel opgedragen tot zij de zaailingen volledig bedekten. De met water behandelde referentieplanten werden opnieuw in het groeifytotron geplaatst 25 terwijl de chemisch behandelde planten in een afzonderlijke maar identieke fytotron werden gehouden. Drie dagen na het opbrengen van de chemicaliën werden de met water en de chemisch behandelde planten geënt met het compatibele Emwa-isolaat. Enten met noco werd uitsluitend uitgevoerd op de met water behandelde planten. Na het enten werden de planten bedekt met een doorzichtige plastic koepel voor het 30 behouden van de hoge vochtigheid die vereist is voor succesvolle infectie met P. parasitica en in een groeikamer geplaatst met een dagtemperatuur van 19°C en een nachttemperatuur van 17°C en een cyclus van 8 uur licht en 16 uur donker. 3 dagen na behandeling met water of een chemische behandeling, of 14 dagen na het enten 1 007779 81 met het verenigbare P. parasitica Emwa-isolaat werd RNA uit de planten geëxtraheerd. Het RNA werd naar grootte gefractioneerd door agarose gelelectroforese en opgebracht naar GeneScreenPlus membranen (DuPont).

Figuren 1-3 tonen de verschillende RNA-gelvlekken die laten zien dat SA, INA 5 en BTH SAR noch SAR genexpressie in n/m7-planten induceren. In figuur 1 werden gerepliceerde vlekken gehybridiseerd aan Arabidopsis gentestreeksen PR-1, PR-2 en PR-5 zoals beschreven door Uknes et al. (1992). In tegenstelling tot de wild-typeplanten induceerden de chemicaliën geen RNA-vorming van ieder van deze 3 SAR-genen in niml-1 planten.

10 Zoals blijkt uit Figuur 2 induceerde infectie van de wild-type Ws-O-planten met pathogeen (Emwa) PR-1-genexpressie binnen 4 dagen na infectie. In niml-1 planten was PR-1 -genexpressie echter niet geïnduceerd tot 6 dagen na infectie en was het niveau van expressie op dit tijdstip verminderd ten opzichte van het wild-type. Derhalve, na infectie met pathogeen, was de PR-1-genexpressie in niml-1 planten 15 vertraagd en verminderd ten opzichte van het wild-type.

De RNA gelvlek in Figuur 3 laat zien dat PR-1 mRNA in grote hoeveelheden wordt gevormd na behandeling van de wild-type planten met SA, INA of BTH of infectie door P. parasitica. In de niml-1, niml-2 en niml-3 planten was de vorming van PR-1 mRNA na chemische behandeling sterk verminderd ten opzichte van het 20 wild-type. De vorming van PR-1 mRNA was tevens verminderd na infectie met P. parasitica, maar er was nog steeds enige mate van ophoping in deze mutanten. In de niml-4 en niml-6 planten was PR-1 mRNA-vorming aanzienlijk sterker verminderd dan in de andere allelen na chemische behandeling (zoals blijkt uit langere blootstellingen) en er werd aanzienlijk minder PR-1 mRNA gevormd na infectie met 25 P. parasitica, hetgeen de hypothese ondersteunt dat deze in het bijzonder sterke mm7-allelen zijn. De vorming van PR-1 mRNA was versterkt in de niml-5 mutant, maar werd slechts matig geïnduceerd na chemische behandeling of na infectie met P. parasitica. Gebaseerd op de vorming van PR-1 mRNA en infectie met het fungus werden de mutanten in drie klassen ingedeeld: sterk beperkte allelen (niml-4 en 30 niml-6)·, matig beperkte allelen (niml-1, niml-2 en niml-3)·, en in een geringe mate beperkte allelen (niml-5).

Voorbeeld 5: Bepaling van SA-vormine in m'm7-planten 1007779 82

Infectie van de wild-type planten met pathogenen die een necrotische reactie veroorzaken leidt tot vorming van SA in de geïnfecteerde weefsels. Endogeen SA is vereist voor signaaltransductie in de SAR-route, daar het afbreken van het endogene SA leidt tot een afname van de ziekteresistentie. Dit kenmerkt de vorming van SA als 5 een markering in de SAR-route (Gaffney et al., 1993, Science 261. 754-756). Het fenotype van niml-planten wijst op een verstoring in een component van de SAR-route stroomafwaarts van SA en stroomopwaarts van SAR-geninductie.

nim/-planten werden onderzocht op hun vermogen SA te vormen na infectie met een pathogeen. Pseudomonas syringae tomaatstam DC 3000, die het avrRpt2-gen 10 draagt, werd geïnjecteerd in de bladeren van 4 weken oude niml-planten. De bladeren werden 2 dagen later geoogst voor analyse op SA zoals beschreven door Delaney et al., 1995, PNAS 92, 6602-6606. Deze analyse toonde dat de w/m7-planten hoge niveaus van SA vormden in geïnfecteerde bladeren, zoals weergegeven in Figuur 4. Niet-geïnfecteerde bladeren vormden tevens SA, maar niet in dezelfde 15 hoeveelheden als de geïnfecteerde bladeren, hetgeen vergelijkbaar is met wat is waargenomen in wild-type Arabidopsis. Dit laat zien dat de niml-mutatie zich stroomafwaarts van de SA-markering in de signaaltransductieroute bevindt. Verder is aangetoond dat INA en BTH (niet actief in «iw7-planten) een component in de SAR-route stroomafwaarts van SA stimuleren (Vemooij et al. (1995); Friedrich et al.

20 (1996); en Lawton et al. (1996)). Verder, zoals hierboven beschreven, beschermde exogeen toegepast SA niml -planten niet tegen infectie door Emwa.

Voorbeeld 6: Genetische analyse

Om de dominantie van de verschillende mutanten die het niml-fenotype 25 vertonen te bepalen werd stuifmeel van wild-type planten overgebracht naar de stigmata van niml-1, -2, -3, -4, -5, -6. Als de mutatie dominant zou zijn zou het w'mZ-fenotype worden waargenomen in de aldus verkregen Fl-planten. Als de mutatie recessief zou zijn, zouden de verkregen Fl-planten een wild-type fenotype vertonen.

30 De in Tabel 3 vermelde gegevens laten zien dat wanneer niml-1, -2, -3, -4, en - 6 werden gekruist met het wild-type, de aldus verkregen Fl-planten het wild-type fenotype vertoonden. Derhalve zijn deze mutaties recessief. In tegenstelling hiermee vertoonden de nakomelingen van niml-5 X wild-type F1 alle het m'mf-fenotype, 1007779 83 hetgeen aangeeft dat dit een dominante mutatie is. Na behandeling met INA werd geen P. parasitica sporulatie waargenomen op wild-type planten, terwijl de Fl-planten groei en enige sporulatie van P. parasitica vertoonden. Echter, het rtiml-fenotype in deze F1-planten was minder sterk dan wordt waargenomen wanneer 5 niml-5 homozygoot is.

Om de allelen te bepalen werden pollen van kanamycine-resistente niml-1 mutante planten overgebracht naar de stigma daarvan van nimJ-2, -3, -4, -5 en -6. De uit deze kruising verkregen zaden werden uitgeplaat op Murashige-Skoog B5-platen die 25 pg/ml kanamycine bevatten om de hybride-oorsprong van het zaad te 10 bevestigen. Kanamycine-resistente (Fl) planten werden overgebracht naar bodem en onderzocht op het nim 1 -fenotype. Daar de Fl nakomelingen van de kruising van de niml-5 mutant met het Ws wild-type een mm7-fenotype vertoonden, werd tevens een analyse van niml-5 X niml-l F2 uitgevoerd.

Zoals blijkt uit Tabel 3 vertoonden alle van de aldus verkregen F1-planten het 15 nim 1 -fenotype. Derhalve werd de mutatie in niml-2, -3, -4, -5, -6 niet aangevuld door het niml-1; deze planten vallen derhalve binnen dezelfde complementatiegroep en zijn derhalve allelisch. F2-nakomelingen van de niml-5 X niml-1 kruising vertoonden tevens het nim7-fenotype, hetgeen bevestigd dat niml-5 een mm/-alleel is.

20 1007779 84

Tabel 3. Genetische scheiding van de nim-mutanten

Fenotype

Mutant Generatie Moeder Vader Wild- nimlb type8 niml-1 F1 wild-typec niml-1 24 0 5 F2 98 32 niml-2 FI niml-2 wild-type 3 0 niml-3 F1 niml-3 wild-type 3 0 niml-4 F1 niml-4 wild-type 3 0 niml-5 F1 niml-5 wild-type 0 35 10 F1 wild-type niml-5 0 18 niml-6 F1 niml-6 wild-type 3 0 niml-2 F1 niml-2 niml-1 0 15 niml-3 F1 niml-3 niml-1 0 10 niml-4 F1 niml-4 niml-1 0 15 15 niml-5 F1 niml-5 niml-1 0 14 F2 9 85 niml-6 F1 niml-6 niml-1 0 12 8 Aantal planten met verhoogde vorming van PR-1 mRNA en afwezigheid van P.

20 parasitica na behandeling met INA.

b Aantal planten zonder vorming van PR-1 mRNA en aanwezigheid van P. parasitica na behandeling met INA. c Wild-type geeft de wild-type Ws-0 stam aan.

25 B. In kaart brengen van de mm 7-mutatie

Het in kaart brengen van de mW-mutatie is zeer gedetailleerd beschreven in de Amerikaanse octrooiaanvrage serienummer 08/773.559 van Aanvraagster, ingediend op 27 december 1996, die hierin in het geheel door verwijzing is opgenomen.

1007779 85

Voorbeeld 7: Identificatie van markeringen in. en bepaling van de genetische kaart van, de m>w7-locus

Om een ruwe kaart voor niml te bepalen, werden 74 F2 nim-planten uit een kruising tussen niml-1 (Ws-0) en Landsberg erecta (Ler) geïdentificeerd op basis van 5 hun gevoeligheid voor P. parasitica en het ontbreken van vorming van PR-1 mRNA na behandeling met INA. Onder toepassing van eenvoudige sequentielengte polymorfismen (SSLP) markeringen (Bell en Ecker 1994) werd bepaald dat niml-1 op ongeveer 2,8 centimorgans (cM) van ngal28 en 8,2 cM van ngalll op de lagere arm van chromosoom 1 ligt. Verder werd bepaald dat niml-1 tussen ngal 11 en 10 ongeveer 4 cM van de SSLP markering ATHGENEA ligt. (Figuur 5A).

Voor het in kaart brengen van de fijne structuur werden 1138 nim-planten uit een F2-populatie verkregen uit een kruising tussen niml-1 en Ler DP23 geïdentificeerd op zowel hun onvermogen PR-1 mRNA te vormen als hun vermogen schimmelgroei te ondersteunen na behandeling met INA. DNA werd bij deze planten 15 geëxtraheerd en beoordeeld op zygositeit bij zowel ATHGENEA als ngal 11. Zoals weergegeven in Figuur 5A werden 93 recombinante chromosomen geïdentificeerd tussen ATHGENEA en niml-1, hetgeen een genetische afstand van bij benadering 4,1 cM (93 van 2276) aangeeft, en werden 239 recombinante chromosomen geïdentificeerd tussen ngal 11 en niml-1, hetgeen een genetische afstand van 20 ongeveer 10.5 cM (239 van 2276) aangeeft. Recombinanten die informatie verschaften in het ATHGENEA tot ngal 11 interval werden verder geanalyseerd onder toepassing van geamplificeerde fragmentlengte polymorfisme (AFLP) analyse (Vos et al., 1995).

AFLP markerings tussen ATHGENEA en ngal 11 werden geïdentificeerd en 25 werden gebruikt voor het vervaardigen van een kaart met lage resolutie van het gebied (Figuren 5A en 5B). AFLP-markeringen W84.2 (1 cM van niml-1) en W85.1 (0.6 cM van niml-1) werden gebruikt voor het isoleren van gist-artificiële chromosoom (YAC) klonen uit de CIC (voor: Centre d’Etude du Polymorphisme Humain, INRA en CNRS) bibliotheek (Creusot et al., 1995). Twee YAC klonen, 30 CIC12H07 en CIC12F04 werden geïdentificeerd met W84.2 en twee YAC klonen CIC7E03 en CIC10G07 werden geïdentificeerd met de W85.1 markering (Figuur 5B). Om de ruimte tussen de twee reeksen flankerende YAC klonen te overbruggen werden bacteriële artificiële chromosoom (BAC) en PI klonen die overlap vertoonden 1007779 86 met CIC12H07 en CIC12F04 geïsoleerd en in kaart gebracht, en opeenvolgende verplaatsingsstappen werden uitgevoerd om het BAC/P1 continue gedeelte tot niml uit te breiden (Figuur 5C; Liu et al., 1995; Chio et al., 1995). Gedurende het verplaatsen werden nieuwe AFLP’s ontwikkeld die specifiek waren voor BAC of PI 5 klonen, en deze werden gebruikt om te bepalen of het niml gen was gekruist, niml was gekruist wanneer BAC en PI klonen werden geïsoleerd die zowel AFLP markering L84.6a als L84.8 vertoonden. De AFLP markering L84.6a, zoals gevonden op PI klonen PI-18, PI-17 en PI-21, identificeerde drie recombinanten en L84.8, zoals gevonden op PI klonen PI-20, PI-22, PI-23 en PI-24 en BAC klonen, BAC-10 04, BAC-05 en BAC-06, identificeerde één recombinant. Omdat deze klonen gedeeltelijk overlappen voor het vormen van een groot aaneensluitend gedeelte (>100 kb) en AFLP markeringen omvatten die niml flankeren, werd hieruit afgeleid dat het gen zich binnen het aaneensluitende gedeelte bevindt. De BAC en PI klonen die het aaneensluitende gedeelte vormen werden gebruikt voor het genereren van verdere 15 AFLP markeringen, hetgeen aangeeft dat niml zich tussen L84.Y1 en L84.8 bevindt, hetgeen een gebied van ongeveer 0,09 cM is.

C. Isoleren van het niml gen 20 Voorbeeld 8: Constructie van een cosmide aaneensluitend gedeelte.

Een cosmidebibliotheek van het niml gen werd geconstrueerd in de met Agrobacterium-verenigbare T-DNA cosmidevector pCLD04541 onder toepassing van CsCl-gezuiverd DNA uit BAC-06, BAC-04 en PI-18. De DNA’s van de drie klonen werden in equimolaire hoeveelheden gemengd en werden gedeeltelijk geknipt met het 25 restrictie-enzym Sau3A. De 20-25 kb fragmenten werden geïsoleerd onder toepassing van een saccharosegradiënt, verzameld en ingevuld met dATP en dGTP. Plasmide pCLD04541 werd gebruikt als T-DNA cosmidevector. Dit plasmide bevat een op pRK290 gebaseerd replicon met een breed gastheertraject, een tetracycline-resistentiegen voor bacteriële selectie en het nptll gen voor selectie van de planten.

30 De vector werd geknipt met Xhol en ingevuld met dCTP en dTTP. De bereide fragmenten werden vervolgens in de vector ingebracht. Het koppelingsmengsel werd gepakt en getransduceerd tot in E.coli stam XLl-blue MR (Stratagene). De aldus verkregen transformanten werden beoordeeld door hybridisatie met de BAC04, 1 007779 87 BAC06 en Pl-18 klonen en positieve klonen werden geïsoleerd. Cosmide DNA werd uit deze klonen geïsoleerd en basisstreng DNA werd bereid onder toepassing van de EC’s ECORI/Msel en HindlII/Msel. De aldus verkregen AFLP vingerafdrukpatronen werden geanalyseerd om de volgorde van de cosmideklonen te bepalen. Een reeks 5 van 15 gedeeltelijk overlappende cosmiden die het mm-gebied overbruggen werd geselecteerd (Figuur 5D). De cosmide DNA’s werden tevens geknipt met EcoRI, PstI, BssHII en SgrAI. Dit maakte het inschatten van de grootten van de in de cosmide ingevoegde gedeelten mogelijk en maakte tevens bevestiging mogelijk van de overlappende gedeelten tussen de verschillende cosmiden, zoals bepaald uit de AFLP 10 vingerafdruk.

Fysiek in kaart brengen liet zien dat de fysieke afstand tussen L84.Y 1 en L84.8 >90 kb was, hetgeen een fysieke afstand van ongeveer 1 megabase per cM aangeeft. Om de identificatie van het niml gen te vergemakkelijken werd de DNA sequentie van BAC04 bepaald.

15

Voorbeeld 9: Identificatie van een kloon die het niml-een bevat.

Cosmiden uit klonen die het niml gebied overbruggen werden overgebracht tot in Agrobacterium tumefaciens AGL-1 door conjugatieve overbrenging in een kruising met drie-ouders met de hulpstam HB101 (pRK2013). Deze cosmiden werden 20 vervolgens gebruikt voor het transformeren van een canamicine-gevoelige niml-1 Arabidopsis-Myn onder toepassing van vacuuminfiltratie (Bechtold et al., 1993; Mindrinos et al., 1994). Zaden van de geïnfilteerde planten werden geoogst waarna men het zaad liet ontkiemen op GM agarplaten die 50 mg/ml kanamicine als een selectiemiddel bevatten. Alleen jonge planten die waren getransformeerd met cosmide 25 DNA konden het selectiemiddel ontgiftigen en overleven. Zaailingen die de selectie overleefden werden ongeveer twee weken na het uitplaten overgebracht naar bodem en op de hieronder beschreven wijze op het niml fenotype onderzocht. Getransformeerde planten die niet langer het niml fenotype vertoonden gaven cosmide(n) aan die een werkzaam niml gen bevatten.

30

Voorbeeld 10: Aanvulling van het niml fenotype

Naar bodem overgebrachte planten werden gedurende ongeveer een week na het overbrengen opgekweekt in een fytotron. Onder toepassing van een chromister werd 1007779 88 300μπι ΙΝΑ als een fijne nevel opgedragen om de planten geheel te bedekken. Na twee dagen werden de bladen geoogst voor RNA extractie en PR-l-expressieanalyse. De planten werden vervolgens besproeid met Peronospora parasitica (isolaat Emwa) en onder omstandigheden van hoge vochtigheid gekweekt in een groeikamer met 5 cycli van 19°C dag/17°C nachttemperaturen en 8 uur licht/16 uur donker. Acht tot tien dagen na infectie met het fungus werden de planten onderzocht en positief of negatief beoordeeld voor fungusgroei. Ws en niml planten werden op dezelfde wijze behandeld om te dienen als referenties voor iedere proef.

Totaal DNA werd uit het verzamelde weefsel geëxtraheerd onder toepassing van 10 een LiCl/fenolextractiebuffer (Verwoerd et al., 1989). RNA monsters werden gescheiden op een formaldehyde-agarosegel en als vlekken overgebracht op GeneScreen Plus (DuPont) membranen. De vlekken werden gehybridiseerd met een 32P-gemarkeerde PR-i cDNA testreeks. De aldus verkregen vlekken werden blootgesteld aan een film om te bepalen welke transformanten in staat waren PR-1-15 expressie te induceren na behandeling met INA. De resultaten zijn samengevat in Tabel 4, die afvulling van het niml fenotype door cosmideklonen D5, El en D7 laat zien.

10Ó7779 89

Tabel 4

Kloonnaam Aantal transformanten Totaal aantal planten met door ΓΝΑ geïnduceerd PR-1/totaal aantal onderzochte planten (%) A8 3 0/3 (0%) ' All 8 4/18 (22%) 5 C2 10 1/10(10%) C7 33 1/32 (3%) D2 81 4/49 (8%) D5 6 5/6 (83%)

El 10 10/10 (100%) 10 D7 129 36/36 (100%) E8 9 0/9 (0%) F12 6 0/6 (%) E6 1 0/1 (0%) E7 34 0/4 (0%) 15 WS-controle ( etc. NA 28/28 (100%) niml-1 fenotype-controle NA 0/34 (0%) NA - niet aangeduid.

t 007779 90

Voorbeeld 11: Bepalen van de volgorde van het mmi-geneebied BAC04 DNA (25 pg, verkregen van KeyGene) was de bron van DNA die werd gebruikt voor de sequentieanalyse, daar deze BAC de kloon was die het gebied dat de nim] mutanten aanvult geheel omvatte. BAC04 DNA werd op willekeurige wijze 5 gefragmenteerd in een vemevelaar om fragmenten met een gemiddelde lengte van ongeveer 2 kb te genereren. De uiteinden van de verbroken fragmenten werden hersteld en de fragmenten werden gezuiverd. Gezuiverd DNA werd gekoppeld aan met EcoRV-geknipt pBRKanF4 (een derivaat van pBRKanFI (Bhat 1993)). De aldus verkregen kanamycine-resistente koloniën werden geselecteerd voor isolatie van het 10 plasmide onder toepassing van het Wizard Plus 9600 Miniprep Systeem (Promega). De volgorde van de plasmiden werd bepaald onder toepassing van kleurstof-terminatorchemie (Applied BioSystems, Foster City, CA) met basisreeksen die waren ontworpen voor het bepalen van de volgorde vin de beide strengen van de plasmiden (Ml3-21 voorwaarts en T7 omgekeerd, Applied BioSystems). De gegevens werden 15 verzameld op AB1377 DNA sequencers. De sequenties werden verwerkt en tot aaneensluitende gedeelten samengevoegd onder toepassing van een Sequencher 3.0 (GeneCodes Corp., Ann Arbor, MI), het Staden genome assembly programs, phred, phrap en crossmatch (Phil Green, Washington University, St.Louis, MO) en consed (David Gorden, Washington University, St.Louis, MO). De sequenties van het DNA 20 van de cosmiden waarvan was gevonden dat zij de niml-1 mutatie aanvulden werden bepaald onder toepassing van testreeksen die waren ontworpen door Oligo 5.0 Primer Analysis Software (National Biosciences, Inc., Plymouth, MN). Het bepalen van de sequentie van DNA van Ws-0 en de nimJ allelen en cDNA’s werd in wezen op de hierboven beschreven wijze uitgevoerd.

25 Van een gebied van ongeveer 9,9 kb, dat wordt gedefinieerd door het overlappende gedeelte van cosmiden El en D7, werd door complementatieanalyse bepaald dat het het niml gebied bevat. Testreeksen die de plaats van het inbrengen van de vector flankeerden en die specifiek waren voor de basisketen van het cosmide werden ontworpen onder toepassing van Oligo 5.0 Primer Analysis Software 30 (National Biosciences, Ine.). DNA werd uit cosmiden D7 en El geïsoleerd onder toepassing van een aanpassing van de ammoniumacetaatmethode (Traynor, P.L. 1990. BioTechniques 9(6):676). De sequentie van het DNA werd direct bepaald onder toepassing van Dye Terminator-chemie. De aldus verkregen sequentie maakte het 1007779 91 mogelijk de eindpunten van het aanvullende gebied te bepalen. Het gebied dat wordt gedefinieerd door het overlappende gedeelte van cosmiden El en D7 is weergegeven als SEQ ID NO:l.

Een afgeknotte versie van het BamHl-EcoRV fragment werd tevens 5 geconstrueerd, hetgeen resulteerde in een construct dat geen enkel deel van het "Gene 3" gebied bevatte (Fig. 5D). De volgende aanpak was vereist door de aanwezigheid van HindlII plaatsen in het Bam-Spe gebied van het DNA. Het BamHl-EcoRV construct werd volledig geknipt met Spel en werd vervolgens in twee afzonderlijke reacties gesplitst voor tweevoudig knippen. Eén deel werd geknipt met BamHI, het 10 andere deel met HindlII. Een BamHI-Spel fragment van 2816 bp en een HindlII-Spel fragment van 1588 bp werden geïsoleerd uit agarosegels (Qiaquick Gel extraction kit) en werden gekoppeld aan met BamHI-HindlII-geknipt pSGCGOl. DH5a werd met het koppelingsmengsel getransformeerd. De aldus verkreger koloniën werden onderzocht op het juiste ingevoegde gedeelte door knippen met HindlII gevolgd door 15 bereiding van DNA onder toepassing van Wizard Magic MiniPreps (Promega). Een kloon die het juiste construct bevatte werd door electroporatie ingebracht in Agrobacterium stam GV3101 voor transformatie van Arabidopsis planten.

Voorbeeld 12: Sequentieanalvse en subkloneren van het niml-gebied.

20 Het 9,9 kb gebied dat het niml-gen bevatte werd geanalyseerd op de aanwezigheid van open afleesramen in alle zes de leesramen onder toepassing van het Sequencher 3.0 en het GCG pakket. Vier gebieden die grote ORF’s bevatten werden geïdentificeerd als mogelijke genen (gengebieden 1-4 in Figuur 5D). Deze vier gebieden werden door PCR geamplificeerd uit DNA van de wild-type ouderplant en 25 zes verschillende niml allelische varianten niml-1, -2, -3, -4, -5 en -6. Testreeksen voor deze amplificaties werden geselecteerd onder toepassing van oligo 5.0 (National Biosciences, Ine.) en werden gesysnthetiseerd door Integrated DNA Technologies, Ine.. De PCR-producten werden gescheiden op 1.0% agarosegels en gezuiverd onder toepassing van de QIAquick Gel Extraction Kit. De sequenties 30 van de gezuiverde genomische PCR-producten werden direct bepaald onder toepassing van de testreeksen die waren gebruikt voor de oorspronkelijke amplificatie en met verdere basisreeksen die waren onderworpen om de sequentie te bepalen van gebieden waarvan de sequentie niet kon worden bepaald met de oorspronkelijke 1007779 92 testreeksen. Een gemiddende aflezing voor deze gengebieden was ongeveer 3.5 aflezingen/base.

De sequenties werden verwerkt en samengevoegd onder toepassing van Sequencher 3.0. Veranderingen in de basen die specifiek waren voor de verschillende 5 niml allelen werden alleen in het als "Gengebied 2" aangeduide gebied geïdentificeerd, zoals weergegeven in Tabel 5, die de verschillen in sequenties tussen alle zes de niml allelen weergeeft.

1007779 93

Tabel 5

Gengebied 1 2 (niml) 3 4 (basen 590-1090 (basen 1380-4100) (basen 5870- (basen 8140- 6840) 9210) .. 5 niml-I geen veranderingen t ingébracht op geen geen 2981:verandering van 7AA veranderingen veranderingen en vroegtijdige beëindiging van het eiwit niml-2 geen veranderingen g en a bij 2799: His in Tyr geen geen veranderingen veranderingen niml-3 geen veranderingen deletie van t bij 3261: geen geen verandering van 10AA en veranderingen veranderingen vroegtijdige beëindiging van het eiwit niml-4 geen veranderingen c in t bij 2402: Arg in lys geen geen veranderingen veranderingen niml-3 geen veranderingen c in t bij 2402: Arg in lys geen geen veranderingen veranderingen 10 niml-6 g in a bij 734: asp in g in a bij 2670: Gin in Stop I geen I geen jj lys veranderingen veranderingen WS geen veranderingen a in g bij 1607: lie in Leu t in a bij 5746 t in g bij 8705 (vergeleken a in c bij 2344: intron a in t bij 5751 g in t bij 8729 met t in g bij 2480: Gin in Pro t in a bij 5754 g in g bij 8739

Columbia g in c bij 2894: Ser in Trp c in t bij 6728 g in t bij 8784 ggc verwijderd bij 3449: a in t bij 6815 c in a bij 8789 verlies van Ala t in c bij 6816 c in t bij 8812 c in t bij 3490: Ala in Thr a in g bij 8829 c in t bij 3498: Ser in Asn t in g bij 8856 a in t bij 3873:niet-coderend a in c bij 9004 g in a bij 3992:niet-coderend a in t bij 9011 g in a bij 4026:niet-coderend a in g bij 8461 g in a bij 4061 :niet-coderend 15 RNA Nee Ja Nee Nee waargenomen 1007779 94

De in de tabel vermelde posities betreffen SEQ ID nr.: 1. Alle allelen niml-1 tot niml-6 zijn van de WS-stam. Columbia-0 is het wild-type.

Het is duidelijk dat het niml-gen binnen gengebied 2 ligt, daar er in alle zes de niml-allelen veranderingen in aminozuren of wijzigingen in de sequentie zijn binnen 5 het open afleesraam van gengebied 2. Tegelijkertijd vertoont ten minste een van de m'm/-allelen geen veranderingen in het open afleesraam binnen gengebieden 1, 3 en 4. Derhalve is gengebied 2 het enige gengebied binnen het 9,9 kb-gebied dat het niml gen kan bevatten.

De Ws-sectie van tabel 5 laat de veranderingen in het Ws-ecotype van 10 Arabidopsis ten opzichte van het Columbia-ecotype van Arabidopsis zien. De hierin weergegeven sequenties betreffen het Columbia-ecotype van Arabidopsis, dat in de hierin beschreven proeven het wild-typegen bevat. De veranderingen zijn vermeld als aminozuurveranderingen binnen gengebied 2 (het niml-gebied) en zijn vermeld als veranderingen in baseparen in de andere gebieden.

15 Het cosmidegedeelte dat het niml-gen bevat werd begrensd door een BamHl-

EcoRV restrictiefragment van ongeveer 5,3 kb. Cosmide DNA van D7 en plasmide DNA uit pBlueScriptlI(pBSII) werden geknipt met BamHI en met EcoRV (NEB).

Het 5,3 fragment van D7 werd geïsoleerd uit agarosegels en werd gezuiverd onder toepassing van de QIAquick gelextractiekit (#28796, Qiagen). Het fragment werd 20 gedurende een nacht gekoppeld aan het met Bam-EcoRV-geknipte pBSII en het gekoppelde mengsel werd getransformeerd in de E. coli stam DH5a. Koloniën die het ingebrachte gedeelte bevatten werden geselecteerd, DNA werd geïsoleerd, en dit werd bevestigd door knippen met HindlII. Het Bam-EcoRV-fragment werd vervolgens door manipulatie ingebracht in een binaire vector (pSGCGOl) voor transformatie in 25 Arabidopsis.

Voorbeeld 13: Northem-analvse van de vier gengebieden

Identieke Northem-vlekafdrukken werden gemaakt uit RNA-monsters die waren uit met water-, SA-, BTH- en INA-behandelde Ws- en m‘m/-lijnen waren geïsoleerd, 30 zoals eerder beschreven door Delaney et al. (1995). Deze vlekken werden gehybridiseerd met PCR-producten die waren gegenereerd uit de vier gengebieden die zijn geïdentificeerd in het 9,9 kb mm ƒ-gengebied (SEQ ID nr.: 1). Alleen het gengebied dat het niml-gen bevat (gengebied 2) vertoonde waarneembare hybridisatie 1007779 95 met RNA-monsters, hetgeen aangeeft dat alleen het m'm/-gebied een detecteerbaar, getranscribeerd gen bevat (figuur 5D en tabel 5).

Voorbeeld 14: Complementeren met gengebied 2 5 Verder werd aangetoond, door het doen van verdere complementeringsexperimenten, dat gengebied 2 (figuur 5D) het functionele niml-gen bevat. Een BamHI/HindlII genomisch DNA-fragment dat gengebied 2 bevat werd geïsoleerd uit cosmide D7 en werd gekloneerd in de binaire vector pSGCGOl, die het gen voor kanamycineresistentie bevat. De aldus verkregen plasmide werd 10 getransformeerd in de Agrobacterium-stam GV3101 en positieve koloniën werden geselecteerd op kanamycine. PCR werd gebruikt om te bevestigen dat de geselecteerde kolonie het plasmide bevatte. Kanamycine-gevoelige niml-1 planten werden op de hiervoor beschreven wijze met deze bacteriën geïnfiltreerd. Het aldus verkregen zaad werd geoogst en geplant op GM-agar dat 50 pg/ml kanamycine 15 bevatte. De planten die de selectie overleefden werden overgebracht naar bodem en onderzocht op complementering. Getransformeerde planten en referentie Ws- en «//«/-planten werden besproeid met 300 pm INA. Twee dagen later werden de planten geoogst voor RNA-extractie en PR-1 expressieanalyse. De planten werden vervolgens besproeid met Peronospora parasitica (isolaat Emwa) en op de hierboven 20 beschreven wijze gekweekt. Tien dagen na de infectie met het fungus werden de planten geëvalueerd en positief of negatief beoordeeld op fungusgroei. Alle 15 getransformeerde planten, alsook de Ws-controles, waren negatief voor schimmelgroei na behandeling met INA, terwijl de «//«/-controles positief waren voor fungusgroei. Uit deze transformanten en controles werd RNA geëxtraheerd en 25 op de hierboven beschreven wijze geanalyseerd. Ws-controles en alle 15 transformanten vertoonden inductie van het PR-1 gen na behandeling met INA, terwijl de «//«/-controles geen inductie van PR-1 door INA vertoonden.

Voorbeeld 15: Isoleren van een niml cDNA 30 Een Arabidopsis cDNA bibliotheek, gemaakt in de IYES expressievector (Elledge et al., 1991, PNAS 88, 1731-1735), werd uitgeplaat en de plaques werden verwijderd. Filters werden gehybridiseerd met een uit gengebied 2 verkregen, 32P-gemarkeerd PCR-genproduct (figuur 5D). Uit een onderzoek van ongeveer 150.000 1007779 96 plaques werden veertien positieven geïdentificeerd. Iedere plaque werd gezuiverd en plasmide-DNA werd gewonnen. cDNA ingevoegde gedeelten werden uit de vector geknipt door toepassing van EcoRI en gezuiverd over agarosegel, waarna de sequentie ervan werd bepaald. De sequentie die werd verkregen uit het langste cDNA 5 is weergegeven in SEQ ID nr.: 2 en in figuur 6. Om te bevestigen dat het 5’-uiteinde van het cDNA was verkregen, werd een Gibco BRL 5’ RACE uitrusting toegepast volgens de instructies van de fabricant. De sequenties van de aldus verkregen RACE-producten werden bepaald, waarbij werd gevonden dat deze de verdere in figuur 6 aangegeven basen bevatten. Het aan transcriptie onderworpen gebied dat in beide 10 cDNA-klonen aanwezig is en dat wordt waargenomen in RACE is met hoofdletters aangegeven in figuur 6. Wijzigingen in de allelen zijn boven de cDNA-streng weergegeven. Hoofdletters geven de aanwezigheid van de sequentie in een cDNA-kloon of gedetecteerd na RACE PCR aan.

Dezelfde RNA-monsters als verkregen in de inductieproeven (figuur 3) werden 15 tevens onderzocht met het niml-gen onder toepassing van een cDNA-kloon van volle lengte als een testreeks. Uit figuur 7 kan worden opgemaakt dat INA het niml-gen in de wild-type Ws-allelen induceerde. Echter, de niml-1 mutatieallelen vertoonden een laag basisniveau van expressie van het niml-gen en werden niet geïnduceerd door INA. Dit was vergelijkbaar met wat werd waargenomen in het niml-3 alleel en het 20 niml-6 alleel. De niml-2 alleel vertoonde bij benadering normale niveaus in het niet-behandelde monster en vertoonde een soortgelijke inductie als het wild-typemonster, en dit gold ook voor het niml-4 alleel. Het niml-5 alleel leek een hoger basisniveau van expressie van het niml-gen te vertonen en veel sterkere expressie na inductie met chemische inductiemiddelen.

25 D. n/mV-homologen

Voorbeeld 16: BLAST-onderzoek met de mW-seauentie

Een meervoudige sequentievergelijking werd geconstrueerd onder toepassing 30 van Clustal V (Higgins, Desmond G. en Paul M. Sharp (1989), Fast and sensitive multiple sequence allignments on a microcomputer, CABIOS 5:151-153) als onderdeel van het DNA* (1228 South Park Street, Madison Wisconsin, 53715) Lasergene Biocomputing Software pakket voor de Macintosh (1994). Bepaalde 1007779 97 gebieden van het niml-eiv/it zijn voor wat betreft de aminozuursequentie homoloog met vier verschillende uit rijst afkomstige cDNA-eiwitproducten. De homologieën werden geïdentificeerd onder toepassing van de nim 1-sequenties in een GenBank BLAST onderzoek. Vergelijkingen van de gebieden van homologie in niml en de uit 5 rijst afkomstige cDNA-producten zijn weergegeven in figuur 8 (zie tevens SEQ ID nr.: 3 en SEQ ID nrs.: 4-11). De m'm/-eiwitfragmenten vertonen voor 36-48% identieke aminozuursequenties met de vier rijstproducten.

Voorbeeld 17: Isolatie van homologe genen uit andere planten 10 Onder toepassing van niml cDNA als een testreeks werden homologen van

Arabidopsis niml geïdentificeerd door het aftasten van genomische of cDNA-bibliotheken van verschillende gewassen, zoals, maar niet beperkt, de hieronder in voorbeeld 22 vermelde gewassen. Standaardtechnieken om dit uit te voeren omvatten aftasten door hybridisatie van uitgeplaatte DNA-bibliotheken (plaques of koloniën; zie 15 bijvoorbeeld Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) en amplificatie door PCR onder toepassing van oligonucleotide-basisreeksen (zie bijvoorbeeld Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, eds., Academic Press (1990)). De geïdentificeerde homologen werden genetisch gemanipuleerd tot in de hierin beschreven 20 expressievectoren en tot in de hierboven vermelde gewassen getransformeerd. De transformanten werden geëvalueerd voor verhoogde ziekteresistentie onder toepassing van relevante pathogenen voor de onderzochte gewasplant.

nim 1-homologen werden door DNA-blotanalyse gedetecteerd in de genomen van komkommer, tomaat, tabak, maïs, tarwe en gerst. Genomisch DNA werd 25 geïsoleerd uit komkommer, tomaat, tabak, maïs, tarwe en gerst, geknipt met enzymen BamHI, HindlII, Xbal of Sail, door electroforese op 0,8% agarosegels gescheiden en overgebracht naar nylonmembraan door capillaire vlekvorming. Na UV-verknopen om het DNA te fixeren werd het membraan onder matige strenge omstandigheden [(1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 30 250 mM natriumchloride) gedurende 18-14 uur bij 55°C] gehybridiseerd met 32P-

radioactief gemarkeerd Arabidopsis thaliana niml cDNA. Na hybridisatie werden de vlekken onder matig strenge omstandigheden [6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C; 1XSSC is 0,15 M NaCl, 15 mM

1007779 98 natriumcitraat (pH 7,0)] gewassen en blootgesteld aan röntgenfilm om de banden die overeenkomen met niml zichtbaar te maken.

Verder kunnen tot expressie gebrachte sequentie markeringen (EST) die zijn geïdentificeerd als lijkend op het niml-gen, zoals de in voorbeeld 16 beschreven uit 5 rijst afkomstige EST’s, worden gebruikt voor het isoleren van homologen. De uit rijst afkomstige EST’s kunnen in het bijzonder nuttig zijn voor het isoleren van niml-homologen uit andere monocotyle planten.

Homologen kunnen worden verkregen door PCR. In deze werkwijzen worden vergelijkingen gemaakt tussen bekende homologen (bijvoorbeeld rijst en 10 Arabidopsis). Gebieden met een hoge mate van overeenkomst of identiteit in aminozuren of DNA kunnen vervolgens worden gebruikt voor het maken van PCR-basisreeksen. Gebieden die rijk zijn in M en W zijn het meest bruikbaar, gevolgd door gebieden die rijk zijn in F, Y, C, H, Q, K en E, daar deze aminozuren door een beperkt aantal codons worden gecodeerd. Wanneer eenmaal een geschikt gebied is 15 geïdentificeerd worden basisreeksen voor dit gebied met verschillende substituties op de positie van het derde codon gemaakt. Deze verschillen in substitutie op de derde positie kunnen beperkt worden, afhankelijk van de beoogde soort. Bijvoorbeeld, omdat maïs CG-rijk is, worden basisreeksen onderworpen die een C of een G op de derde positie bevatten, indien mogelijk.

20 Een PCR-reactie wordt uitgevoerd onder verschillende standaardomstandigheden, uitgaande van cDNA of genomisch DNA. Wanneer een band zichtbaar is wordt deze gekloneerd en/of wordt de sequentie hiervan bepaald om vast te stellen of het een m'm/-homoloog is.

25 E. Expressie van niml op een hoog niveau verleend resistentie tegen ziekten aan planten

Expressie op hoog niveau van het niml-gen in transgene planten voor het verlenen van een CIM-fenotype is tevens beschreven in aanvraagsters Amerikaanse octrooiaanvrage met serienummer 08/773.554, ingediend op 27 december 1996, die 30 hierin in het geheel door verwijzing is opgenomen.

Voorbeeld 18: Expressie van niml op hoog niveau door een insertieplaatseffect

Om te bepalen of een van de hierboven in voorbeeld 10/tabel 4 beschreven 1 007779 99 transformanten een hoog niveau van expressie van niml vertoonde door een insertieplaatseffect, werden primaire transformanten die de D7, D5 of El-cosmiden (met het niml-gen) bevatten zelf-gekruist en het T2-zaad werd verzameld. Zaden uit een El-lijn, vier D5-lijnen en 95 D7 lijnen werden uitgezaaid op bodem en op de 5 hierboven beschreven wijze gekweekt. Toen de T2-planten tenminste vier echte bladeren hadden ontwikkeld werd een enkel blad van iedere plant afzonderlijk geoogst. RNA werd uit dit weefsel geëxtraheerd en geanalyseerd op PR-1 en niml-expressie. De planten werden vervolgens geënt met P. parasitica (Emwa) en op 3-14 dagen, bij voorkeur 7-12 dagen, na infectie geanalyseerd op fungusgroei. Uit planten 10 die een hogere niml en PR-1 expressie vertonen dan normaal en resistentie tegen fungus vertonen blijkt dat expressie van niml op een hoog niveau een CIM-fenotype verleent.

Tabel 6 toont de resultaten van het testen van verschillende transformanten op resistentie tegen fungusinfectie. Zoals blijkt uit de tabel vertoonde een aantal 15 transformanten minder fungusgroei dan normaal en vertoonden sommige in het geheel geen zichtbare fungusgroei. RNA werd uit verzamelde monsters bereid en op de hierboven beschreven wijze geanalyseerd (Delaney et al., 1995). Vlekken werden gehybridiseerd met de Arabidopsis gen-testreeks PR-1 (Uknes et al., 1992). Lijnen D7-74, D5-6 en El-1 vertoonden vroege inductie van PR-1 genexpressie, waarbij 20 PR1 mRNA al 24 of 48 uur na behandeling met het fungus aantoonbaar was. Deze drie lijnen vertoonden tevens resistentie tegen fungusinfectie.

1 007 779 100

Tabel 6

Lijn P.parasi- Lijn P.parasi- Lijn P.parasi- ticagroei ticagroei ticagroei D7-2 negatief 52 + 90 + 3 + 53 + 91 + 5 9 + 54 +/- 92 + 11 + 56 + 93 + 12 + 57 + 94 + 13 + 58 + 95 + 14 + 59 + 96 + 10 17 + 60 + 97 + 18 + 61 + 98 +/- 19 + 62 + 100 +/- 20 + 63 + 101 +/- 21 + 64 + 102 +/- 15 22 + 66 + 103 + 23 + 67 + 104 + 24 + 68 + 106 + 25 + 69 + 107 + 28 + 70 + 108 + 20 29 + 71 + 114 +_ 31 + 72 + 115 + 32 + 73 + 118 + 33 + 74 negatief 119 + 34 + 75 + 122 + 25 35 + 77 + 123 + 1007779 101

Tabel 6 (vervolg) 36 + 78 + 124 + 38 + 79 + 125 + • 5 39 + 80 +/- 126 + 42 + 81 + 128 + 43 + 82 + 129 + 46 + 83 + 130 + 47 + 84 + D5-1 + 10 48 + 85 + 2 + 49 + 86 + 4 + 50 + 87 +/- 6 +/- 51 + 89 negatief El-1 negatief 15 Planten werden behandeld met P. parasitica isolaat Emwa en 10 dagen later beoordeeld.

+, normale fungusgroei.

+/-, lagere fungusgroei dan normaal, negatief, geen zichtbare fungusgroei.

20

Voorbeeld 19: Door 35S geleide expressie van niml

Planten die het niml-gen constitutief tot expressie brachten werden tevens gegenereerd uit transformatie van Ws of Col wild-type planten met het BamHI-HindlII Arabidopsis genomisch fragment (figuur 6), gekloneerd in pSCGGOl en 25 getransformeerd in de Agrobacteriumstam GV3101 (pMP90, Koncz en Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396). In een ander construct werd het niml cDNA van volle lengte gekloneerd in de EcoRI-plaats van pCGN1761 ENX (Comai et al., 1990, Plant Mol. Biol. 15, 373-381). Uit het aldus verkregen plasmide werd een Xbal-fragment dat een versterkte CaMV 35S-promotor, het niml-cDNA in de juiste 1007779 102 oriëntatie voor transcriptie en een tml 3’-terminator bevatte, verkregen. Dit fragment werd in de binaire vector pCIB200 gekloneerd en tot in GV3101 getransformeerd.

Ws of Col planten worden op de hierboven beschreven wijze geïnfiltreerd met ieder van deze getransformeerde stammen. Het aldus verkregen zaad werd geoogst en 5 uitgeplaat op 50 mg/ml bevattende GM-agar. De jonge planten die overleven worden overgebracht naar bodem en onderzocht.

Voorbeeld 20: 35S geleide expressie van niml - alternatieve uitvoeringsvorm

Een BamHI/HindlII Arabidopsis genomisch fragment (figuur 6: basen 1249-10 5655) dat de niml-promotor, gen, en stroomwaartse sequentie bevat, gekloneerd in pSGCGOl, wordt geknipt met het restrictie-endonuclease PstI en de uiteinden worden stomp gemaakt met T4-polymerase. Het fragment wordt verder geknipt met het restrictie-endonuclease Spel hetgeen resulteert in een 2162 bp fragment. Het niml cDNA, gekloneerd in de EcoRI-plaats van pCGN1761ENX (zie hierboven), wordt 15 geknipt met het restrictie-endonuclease met Notl en de uiteinden worden stomp gemaakt met T4-polymerase. Dit fragment wordt verder geknipt met het restrictie-endonuclease Spel. Het hierboven verkregen 2162 bp genomisch fragment wordt gekoppeld aan de pCGN1761ENX vector dat 91 bp van het niml cDNA bevat. De transformatiecassette met de 35S-promotor en tml-terminator wordt vrijgemaakt uit 20 pCGN1761ENX door gedeeltelijk knippen met het restrictie-enzym Xbal en gekoppeld in de Xbal-plaats van gedefosforyleerd pCIB200. Het aldus verkregen plasmide wordt getransformeerd in GV3101 en Ws- of Col-planten worden op de hierboven beschreven wijze geïnfiltreerd. De zaden worden uitgeplaat en de jonge plantjemn die overleven worden op de hierboven beschreven wijze geselecteerd.

25

Voorbeeld 21: Beoordeling van het CIM-fenotvpe in de nim 1-transformanten met expressie op hoog niveau

Een blad van iedere primaire transformant wordt geoogst, RNA wordt geïsoleerd (Verwoerd et al., 1989, Nuc. Acid Res., 2362) en onderzocht op 30 constitutieve PR-1 expressie en mm ƒ-expressie door RNA-vlekanalyse (Uknes et al., 1992). Iedere transformant wordt beoordeeld op een verhoogde ziekteresistentiereactie die wijst op constitutieve SAR-expressieanalyse (Uknes et al., 1992). Conidiënsuspensies met 5-10x104 sporen/ml uit twee verenigbare P. parasitica- 1 007779 103 isolaten, Emwa en Noco (dat wil zeggen dat deze fungusstammen ziekte veroorzaken op respectievelijk wild-type Ws-0 en Col-0 planten), worden bereid en transformanten met het geschikte isolaat worden besproeid, afhankelijk van het ecotype van de transformant. Geënte planten worden gedurende 7 dagen onder hoge vochtigheid 5 geïncubeerd. De planten worden op dag 7 op ziekteverschijnselen beoordeeld en een enkel blad wordt geoogst voor RNA-vlekanalyse onder toepassing van een testreeks, hetgeen een middel verschaft voor het meten van de fungusinfectie.

Transformanten die een CIM-fenotype vertonen worden tot de F1-generatie geleid en homozygote planten worden geïdentificeerd. Transformanten worden 10 onderworpen aan een reeks ziekteresistentieproeven. Fungusinfectie met Noco en Emwa wordt uitgevoerd en bladeren worden gekleurd met lactofenol blauw om de aanwezigheid van hyphae van het fungus te identificeren, zoals beschreven door Dietrich et al. (1994). Transformanten worden geïnfecteerd met het bacteriële pathogen Pseudomonas syringae DC3000 voor het evalueren van het spectrum van 15 aantoonbare resistentie, zoals beschreven door Uknes et al., (1993). Niet-geïnfecteerde planten worden geëvalueerd voor zowel vrije als glucose-geconjugeerde SA en de bladeren worden gekleurd met lactofenol blauw voor het evalueren van de aanwezigheid van microscopische lesies. De resistente planten worden sexueel gekruist met SAR-mutanten zoals NahG en ndrl om de epistatische relatie tussen het 20 resistente fenotype en de andere mutanten te bepalen en te beoordelen hoe deze dominant-negatieve mutanten van niml de SA-afhankelijke terugkoppeling kunnen beïnvloeden.

Voorbeeld 22: Expressie op hoog niveau van niml in gewasplanten 25 Deze constructen, die een CIM-fenotype aan Col-0 of Ws-0 en andere verlenen worden voor beoordeling getransformeerd in gewasplanten. Hoewel het niml-gen in iedere plantencel die binnen deze brede klassen valt kan worden ingebracht, kan het in het bijzonder worden toegepast bij cellen van gewasplanten, zoals rijst, tarwe, gerst, rogge, mais, aardappel, wortel, zoete aardappel, suikerbiet, bonen, doperwten, 30 chicorei, sla, kool, bloemkool, broccoli, raap, radijs, spinazie, asperge, ui, knoflook, eierplant, peper, selderij, wortel, pompoen, in het bijzonder Cucurbita pepo, zucchini, komkommer, appel, peer, kweepeer, meloen, pruim, kers, perzik, nectarine, abrikoos, aardbei, druif, framboos, ananas, avocado, papaya, mango, banaan, soja, tabak, 1 007779 104 tomaat, sorghum of suikerriet. Transformanten worden beoordeeld op verhoogde ziekteresistentie. In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is de expressie van het niml~gen bij een niveau dat ten minste tweemaal hoger is dan het expressieniveau van het niml-gen in de wild-typeplanten, en bij voorkeur tienmaal 5 boven het expressieniveau van het wild-type.

F, Andere algemene toepassingen van planten met het m'm-fenotype

Voorbeeld 23: Het gebruik van mm-mutanten in onderzoek naar ziekten 10 Nim-mutanten worden belast met verschillende pathogenen waarbij blijkt dat zij sneller grotere lesies ontwikkelen dan wild-typeplanten. Dit fenotype wordt UDS (algemene ziektegevoeligheid) genoemd en is een resultaat van de mutanten die niet in staat zijn SAR-genen tot expressie te brengen voor het verschaffen van een verdediging van de plant tegen pathogenen. Het UDS-fenotype van de nim-mutanten 15 maakt deze bruikbaar als referentieplanten voor het beoordelen van ziektesymptomen in experimentele lijnen in in het veld uitgevoerde pathogeneseproeven waar het fenotype van natuurlijke resistentie van de zogenaamde wild-typelijnen uiteen kan lopen (dat wil zeggen tegen verschillende pathogenen en verschillende pathotypen van hetzelfde pathogeen). Derhalve, onder veldomstandigheden waar gebruik wordt 20 gemaakt van natuurlijke infectie door pathogenen voor het beoordelen van de resistentie van experimentele lijnen, kan het opnemen in het experiment van nim-mutante lijnen van de geschikte gewasplantensoort een beoordeling mogelijk maken van het ware niveau en spectrum van de belasting door de pathogeen, zonder de variatie die inherent is aan het gebruik van niet-experimentele lijnen.

25

Voorbeeld 24: Beoordeling van de bruikbaarheid van transgenen voor de doeleinden van ziekteresistentie

Mm-mutanten worden gebruikt als gastheerplanten voor het transformeren van transgenen om hun beoordeling voor toepassing in ziekteresistentie te 30 vergemakkelijken. Zo wordt bijvoorbeeld een Arabidopsis «m?-mutante lijn, gekenmerkt door zijn UDS-fenotype, gebruikt voor hierop volgende transformatie met mogelijke genen voor ziekteresistentie, wat het mogelijk maakt de bijdrage van een afzonderlijk gen aan de resistentie te beoordelen ten opzichte van het basisniveau van 1007779 105 de UDS mm-mutante planten.

Voorbeeld 25: mm-mutanten als een hulpmiddel bii het onderzoeken van plant-pathogeeninteracties.

5 Mm-mutanten kunnen worden gebruikt bij het onderzoeken van plant- pathogeeninteracties, en in het bijzonder voor het doorgronden van de processen die worden toegepast door de pathogeen bij het binnendringen in de plantencellen. Dit is omdat mm-mutanten geen systemische reactie tegen aanval door pathogenen geven, en de niet-geremde ontwikkeling van het pathogeen een ideaal scenario is voor het 10 onderzoek van de biologische interactie ervan met de gastheer.

Van verder belang is de waarneming dat een als gastheer gebruikte mm-mutant gevoelig kan zijn voor pathogenen die normaal niet in verband worden gebracht met deze specifieke gastheer, maar in plaats daarvan verband houden met een andere gastheer. Zo kan bijvoorbeeld een Arabidopsis mm-mutant zoals niml-1, -2, -3, -4, -5 15 of -6 worden belast met een aantal pathogenen die normaal uitsluitend de tabaksplant infecteren, en hiervoor gevoelig blijken te zijn. Op deze wijze kan de mm-mutatie die het UDS-fenotype veroorzaakt leiden tot een verandering van het traject van gevoeligheid tegen pathogenen, hetgeen aanzienlijke toepasbaarheid heeft in de moleculaire, genetische en biochemische analyse van gastheer-pathogeen interactie.

20

Voorbeeld 26: mm-mutanten voor gebruik in funeicide-onderzoek

Mm-mutanten zijn bijzonder nuttig bij het beoordelen van nieuwe chemische verbindingen op fungicide-activiteit. Mm-mutanten die zijn geselecteerd in een specifieke gastheer hebben aanzienlijke bruikbaarheid voor het bepalen van 25 fungiciden onder toepassing van deze gastheer en pathogenen van de gastheer. Het voordeel ligt in het UDS-fenotype van de mutant, dat de problemen ondervangt die kunnen optreden doordat de gastheer in verschillende mate gevoelig is voor verschillende pathogenen en pathotypen, of zelfs resistent is tegen bepaalde pathogenen of pathotypen. Bij wijze van voorbeeld kunnen mm-mutanten in tarwe op 30 effectieve wijze worden gebruikt voor het beoordelen van fungiciden tegen een groot aantal pathogenen en pathotypen in tarwe, daar de mutanten geen resistentiereactie tegen de ingebrachte pathogeen geven en geen differentiële resistentie tegen verschillende pathotypen vertonen, hetgeen anders het gebruik van meerdere 1 007 779 106 tarwelijnen, die ieder voldoende gevoelig is tegen een specifiek te onderzoeken pathogeen, zou vereisen. Tarwepathogenen van bijzonder belang zijn onder andere (maar zijn niet beperkt tot) Erisyphe graminis (het veroorzakende agens van donsachtige meeldauw), Rhizoctonia solani (het veroorzakende agens van "scherpe 5 oogvlekkenziekte"), Pseudocercosporella herpotrichoides (het veroorzakende agens van "oogvlekkenziekte"), Puccinia spp. (de veroorzakende agentia van bladroest) en Septoria nodorum. Op soortgelijke wijze zullen m'm-mutanten van mais zeer gevoelig zijn tegen maispathogenen en derhalve kunnen worden gebruikt bij het bepalen van fungiciden met activiteit tegen ziekten van mais.

10 Mm-mutanten kunnen verder worden gebruikt voor het onderzoeken van een groot aantal verschillende pathogenen en pathotypen in een heterologe gastheer, dat wil zeggen in een gastheer die normaal niet binnen het gastheertraject van een specifiek pathogeen ligt en die het bijzonder gemakkelijk te hanteren is (zoals Arabidopsis). Door de aanwezigheid van het UDS-fenotype is de heterologe gastheer 15 gevoelig voor pathogenen van andere plantensoorten, waaronder gewasplantensoorten van economisch belang. Zo kan bij wijze van voorbeeld dezelfde Arabidopsis nim-mutant kunnen worden geïnfecteerd met een tarwepathogeen zoals Erisyphe graminis (het veroorzakende agens van donsachtige meeldauw) of een maispathogeen zoals Helminthosporium maydis en worden gebruikt voor het bepalen van de werkzaamheid 20 van mogelijke fungiciden. Een dergelijke aanpak geeft aanzienlijke verbeteringen in efficiëntie ten opzichte van de op dit moment toegepaste procedures van het onderzoeken van afzonderlijke gewasplantsoorten en verschillende cultivars van soorten met verschillende pathogenen en pathotypen die differentieel virulent op de verschillende gewasplantencultivars kunnen zijn. Verder heeft het gebruik van 25 Arabidopsis voordelen vanwege zijn geringe grootte, wat het mogelijk maakt meer proeven te doen in beperkte beschikbare ruimte.

Voorbeeld 27: niml is een homoloog van ΙκΒα

Een meervoudige sequentievergelijking tussen de eiwitgenproducten van niml 30 en IkB werd uitgevoerd, waarbij werd vastgesteld dat het w>n7-genproduct een homoloog is van ΙκΒα (figuur 9). Onderzoek naar homologieën in de sequentie werd uitgevoerd onder toepassing van BLAST (Altschul et al., J.Mol.Biol. 215, 403-410 (1990)). De meervoudige sequentievergelijking werd geconstrueerd onder toepassing 1 0 07 7 7 9 107 van Clustal V (Higgins et al., CABIOS 5, 151-153 (1989)) als deel van het Lasergene Biocomputing Software package van DNASTAR (Madison, WI). De in de vergelijking gebruikte sequenties waarin niml (SEC ID nr.: 3), muis ΙκΒα (SEQ ID nr.: 18, GenBank Accession #: 1022734), rat ΙκΒα (SEQ ID nr.: 19) GenBank 5 Accession nummers 57674 en X63594; Tewari et al., Nucleic Acids Res. 20, 607 (1992)), en varkens ΙκΒα (SEQ ID nr.: 20, GenBank toegangsnummer Z21968; de Martin et al., EMBO J. 12, 2773-2779 (1993); GenBank toegangsnummer 517193, de Martin et al., Gene 152, 253-255 (1995)). De parameters die werden toegepast in de "Clustal"-analyse waren een "gap penalty" van 10 en een "gap length penalty" van 10 10. Afstanden van evolutionaire differentiatie werden berekend onder toepassing van de PAM250 gewichtstabel (Dayhoff et al., "A model of evolutionary change in proteins. Matrices for detecting distant relationships." In Atlas of Protein Sequence and Structure, volume 5, supplement 3, M.O., Dayhoff, ed. (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.), biz. 345-358 (1978)). De mate van 15 overeenkomst in residuen werd berekend onder toepassing van een aangepaste

Dayhoff-tabel (Schwartz and Dayhoff, "A model of evolutionary change in proteins." In Atlas of Protein Sequence and Structure", M.O. Dayhoff, ed. (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) biz. 353-358 (1979); Gribskov and Burgess, Nucleic Acids Res. 14, 6745-6763 (1986)).

20 Onderzoek naar homologie geeft een mate van overeenkomst tussen niml en ankyrindomeinen van verschillende eiwitten aan, waaronder: ankyrin, NF-κΒ en IkB. De beste algehele homologie is met IkB en soortgelijke moleculen (figuur 9). niml bevat 2 serineresten bij aminozuurposities 55 en 59, waarbij de serinerest op positie 59 zich in een context (D/ExxxxxS) en in een positie (N-eindstandig) bevindt die 25 constitent is met een rol in een fosforylerings-afhankelijke, door ubiquitine overgebrachte, induceerbare afbraak. Alle IkB’s hebben deze N-eindstandige serineresten en zij zijn vereist voor het inactiveren van IkB en het hieropvolgende vrijkomen van NF-κΒ. niml heeft ankyrindomeinen (aminozuren 262-290 en 323-371). Van ankyrindomeinen wordt gemeend dat zij betrokken zijn bij eiwit-30 eiwitinteractie en dat zij een vereist aspect zijn van IkB en NF-κΒ moleculen. De C-uiteinden van IkB’s kunnen verschillend zijn. niml heeft enige mate van homologie met een QL-rijk gebied (aminozuren 491-499) dat wordt gevonden in de C-eindstandige gedeelte van sommige IkB’s.

1 007 779 108

Voorbeeld 28: Genereren van gemodificeerde vormen van niml - veranderen van de serineresten 55 en 59 in alanineresten

De fosforylering van serineresten is in menselijk ΙκΒα vereist voor de door prikkel geactiveerde afbraak van ΙκΒα, waarbij NF-κΒ wordt geactiveerd.

5 Mutagenese van de serineresten (S32-S36) in menselijk ΙκΒα tot analineresten remt de prikkel-geïnduceerde fosforylering en blokkeert daarmee de met het proteosoom-samenhangende afbraak van ΙκΒα (E. Britta-Mareen Traenckner et al., EMBO J. 14: 2876-2883 (1995); Brown et al., Science 267:1485-1488 (1996); Broekman et al., Molecular and Cellular Biology 15: 2809-2818 (1995); Wang et al., Science 274:784-10 787 (1996)).

Deze gewijzigde vorm van ΙκΒα werkt als een dominant negatieve vorm doordat het NF-κΒ in het cytoplasma vasthoudt, en daardoor stroomafwaarts gelegen signaalgebeurtenissen blckkeert. Gebaseerd op vergelijkingen in sequentie tussen niml en IkB zijn de serineresten 55 (S55) en 59 (S59) van niml homoloog met S32 15 en S36 in menselijk ΙκΒα. Voor het construeren van dominant-negatieve vormen van niml worden de serineresten bij aminozuurposities 55 en 59 gemuteerd tot alanineresten. Dit kan worden uitgevoerd volgens iedere aan de deskundige bekende methode, zoals, bijvoorbeeld, door middel van de QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit (#200518:Stratagene).

20 Onder toepassing van een niml cDNA (SEQ ID nr.: 21) van volle lengte, met inbegrip van de 42 bp van de 5’-niet-getranslateerde sequentie (UTR) en 187 bp van de 3’ UTR, kan het gemuteerde construct worden gemaakt volgens de instructies van de fabrikant onder toepassing van de volgende basisreeksen (SEQ ID nr.: 21, posities 192-226): 5’-CAA CAG CTT CGA AGC CGT CTT TGA CGC GCC GGA TG-3’ 25 (SEQ ID nr.: 32) en 5’-CAT CCG GCG CGT CAA AGA CGG CTT CGA AGC TGT TG-3’ (SEQ ID nr.: 33), waarbij de onderstreepte basen de mutaties aangeven. De strategie is als volgt: het niml cDNA, gekloneerd in vector pSE936 (Elledge et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 1731-1735 (1991)), wordt gedenatureerd en de basisreeksen met de gewijzigde basen worden versmolten. DNA-polymerase (Pfu) 30 vult de basisreeksen aan door niet-streng veiplaatsing hetgeen leidt tot "nicked" kringvormige strengen. DNA wordt onderworpen aan knippen met het restrictie-endonuclease Dpnl, dat alleen gemethyleerde plaatsen knipt (niet-gemutageniseerd templaat-DNA). Het overgebleven cirkelvormige dsDNA wordt getransformeerd in E.

1007779 109 coli stam XL 1-Blue. Plasmiden van de aldus verkregen koloniën worden gewonnen en de sequentie ervan wordt bepaald om de aanwezigheid van de gemuteerde basen te bevestigen en om te bevestigen dat geen andere mutaties waren opgetreden.

Het gemuteerde niml cDNA wordt geknipt met het restrictie-endonuclease 5 EcoRI en gekloneerd in pCGN1761 onder de transcriptieregeling van de dubbele 35S-promotor van het bloemkoolmozaïekvirus. De transformatiecassette, met inbegrip van de 35S-promotor, niml cDNA en tml-terminator, wordt vrijgemaakt uit pCGN1761 door gedeeltelijk knippen met het restrictie-enzym Xbal en gekoppeld tot in de Xbal-plaats van gedefosforyleerd pCIB200. SEQ ID nrs.: 22 en 23 tonen 10 respectievelijk de DNA-coderende sequentie en de gecodeerde aminozuursequentie van deze gewijzigde vorm van het niml-gen.

De onderhavige uitvinding omvat tevens gewijzigde vormen van allelen van niml, waarbij de coderende sequentie van een dergelijke alleel onder de volgende omstandigheden hybridiseert met de in SEQ ID nr. 22 weergegeven coderende 15 sequentie: hybridisatie in 1%BSA; 520 mM NaP04, Ph 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C. In deze uitvoeringsvormen zijn de allelen van niml die onder deze omstandigheden met SEQ ID nr.: 22 hybridiseren zodanig gewijzigd dat het 20 gecodeerde product alanineresten in plaats van serineresten bevat op de aminozuurposities die overeenkomen met posities 55 en 59 van SEQ ID nr.: 22.

Voorbeeld 29: Genereren van gewijzigde vormen van niml - N-eindstandige deletie Deletie van aminozuren 1-36 (Broekman et al.; Sun et al.) of 1-72 (Sun et al.) 25 van menselijk ΙκΒα, dat K21, K22, S32 en S36 omvat, leidt tot een dominant-negatief ΙκΒα-fenotype in getransfereerde humane celkweken. Een N-eindstandige deletie van bij benadering de eerste 125 aminozuren van het gecodeerde product van het niml cDNA verwijdert acht lysineresten die kunnen dienen als mogelijke ubiquitineringsplaatsen en verwijdert tevens mogelijke fosforyleringsplaatsen bij S55 30 en S59 (zie voorbeeld 2). Dit gewijzigde genconstruct kan worden geproduceerd op iedere aan de deskundige bekende wijze. Bijvoorbeeld kan, onder toepassing van de werkwijze van Ho et al., Gene 77:51-59 (1989), een niml -vorm worden gegenereerd waaruit het DNA dat codeert voor bij benadering de eerste 125 aminozuren is 1007779 110 verwijderd. De volgende basisreeksen verschaffen een 1612-bp PCR-product (SEQ ID nr.: 21: 418 tot 2011): 5’-gg aat tca-ATG GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG-3’ (SEQ ID nr.: 34) en 5’-gga att cTA CAA ATC TGT ATA CCA TTG G-3’ (SEQ ID nr.: 35) waarin het synthetische startcodon is onderstreept (ATG) en de EcoRI-5 koppelingssequentie in kleine letters is aangegeven. Bij de amplificatie van deze fragmenten wordt een reactiemengsel gebruikt dat 0,1 tot 100 ng templaat DNA, 10 mM Tris pH 8,3/50 mM KC1/2 mM MgCl2/0,001% gelatine/0,25 mM van iedere dNTP/0,2 mM van iedere basisreeks en 1 eenheid rTth DNA-polymerase bevat in een eindvolume van 50 ml en wordt een Perkin Elmer Cetus 9600 PCR-machine 10 toegepast. De omstandigheden voor PCR zijn als volgt: 94°C 3 minuten: 35x (94°C 30 seconden: 52°C 1 minuut: 72°C 2 minuten): 72°C 10 minuten. Het PCR-product wordt direct tot in de pCR2.1 vector (Invitrogen) gekloneerd. Het door PCR verkregen ingevoegde gedeelte in de PCR-vector wordt vrijgemaakt door knippen met het restrictie-enzym EcoRI en gekoppeld tot in de EcoRI-plaats van gedefosforyleerd 15 pCGN176 onder de transcript!eregeling van de dubbele 35S-promotor. De sequentie van het construct wordt bepaald om de aanwezigheid van het synthetische startcodon ATG te bevestigen en om te bevestigen dat geen verdere mutaties waren opgetreden gedurende de PCR. De transformatiecassette, met inbegrip van de 35S-promotor, het gemodificeerde niml cDNA en tml-terminator, wordt vrijgemaakt uit pCGN1761ENX 20 door gedeeltelijk knippen met het restrictie-enzym Xbal en gekoppeld tot in de Xbal-plaats van pCIB200. SEQ ID nrs.: 24 en 25 tonen respectievelijk de DNA-coderende sequentie en de gecodeerde aminozuursequentie van een gewijzigde vorm van het niml-gen met een N-eindstandig aminozuurdeletie.

De onderhavige uitvinding omvat tevens gewijzigde vormen van allelen van 25 niml, waarbij de coderende sequentie van een dergelijke alleel onder de volgende omstandigheden met de in SEQ ID nr.: 24 weergegeven coderende sequentie hybridiseert: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) 30 bij 55°C. Onder deze omstandigheden zijn de allelen van niml die onder deze omstandigheden met SEQ ID nr.: 24 hybridiseren zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product een N-eindstandige deletie heeft, waardoor lysineresten die kunnen dienen als mogleijke ubiquitineringsplaatsen zijn verwijderd, evenals de 1007779

Ill serineresten bij de aminozuurposities die overeenkomen met posities 55 en 59 van het wild-type genproduct.

Voorbeeld 30: Genereren van gewijzigde vormen van niml - C-eindstandige deletie 5 Gemeend wordt dat het verwijderen van aminozuren 261-317 van humaan ΙκΒα leidt tot verhoogde intrinsieke stabiliteit door het blokkeren van de constitutieve fosforylatie van serine- en treonineresten bij het C-uiteinde. Een gebied dat rijk is aan serine en treonine bevindt zich bij aminozuren 522-593 in het C-uiteinde van niml. Het C-eindstandige coderende gebied van het niml-gtn kan worden gemodificeerd 10 door het verwijderen van de nucleotidensequenties die coderen voor aminozuren 522-593. Onder toepassing van de werkwijze van Ho et al. (1989) worden het C-eindstandige coderende gebied en het 3’UTR van het niml cDNA (SEQ ID nr.: 21: 1606-2011) verwijderd door PCR, waarbij een 1623 bp fragment wordt verkregen, onder toepassing van de volgende grondreeksen: 5’-15 cggaattcGATCTCTTTAATTTGTGAATTT C-3’ (SEQ ID nr.: 36) en 5’-ggaattcTCAACAGTT CATAATCTGGTCG-3’ (SEQ ID nr.: 37) waarin een synthetisch stopcodon onderstreept is (TGA op de complementaire streng) en de EcoRI-koppelingsreeksen in kleine letters zijn weergegeven. De componenten van de PCR-reactie zijn zoals hierboven beschreven en de parameters van de cycli zijn als 20 volgt: 94°C 3 minuten: 30x [(94°C 30 seconden: 52°C 1 minuut: 72°C 2 minuten); 72°C 10 minuten]. Het PCR-product wordt direct tot in de pCR2.1 vector (in vitrogen) gekloneerd. Het door PCR verkregen ingevoegde gedeelte in de PCR-vector wordt vrijgemaakt door knippen met het restrictie-endonuclease EcoRI en gekoppeld tot in de EcoRI-plaats van gedefosforyleerd pCGN1761 dat de dubbele 35S-promotor 25 bevat. De sequentie van het construct wordt bepaald om de aanwezigheid van het synthetische in-frame stopcodon te bevestigen en om te bevestigen dat geen andere mutaties waren opgetreden gedurende PCR. De transformatiecassette, met inbegrip van de promotor, gemodificeerd niml cDNA en tml-terminator, wordt vrijgemaakt uit pCG1761 door gedeeltelijk knippen met het restrictie-enzym Xbal en gekoppeld tot 30 in de Xbal-plaats van gedefosforyleerd pCIB200. SEQ ID nrs.: 26 en 27 tonen respectievelijk de DNA-coderende sequentie en de gecodeerde aminozuursequentie van een gewijzigde vorm van het niml-gen met een C-eindstandige aminozuurdeletie.

De onderhavige uitvinding omvat tevens gewijzigde vormen van allelen van 1 007779 112 niml, waarin de coderende sequentie van een dergelijke alleel onder de volgende omstandigheden met de in SEQ ID nr.: 26 weergegeven coderende sequentie hybridiseert: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, 5 en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C. In deze uitvoeringsvormen zijn allelen van niml die onder de bovenstaande omstandigheden hybridiseren met SEQ ID nr.: 26 zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product een C-eindstandige deletie heeft waardoor serine- en treonineresten worden verwijderd.

10

Voorbeeld 31: Genereren van gewijzigde vormen van niml - chimera met een N-eindstandiee/C-eindstandige deletie

Een N-eindstandige en C-eindstandige deletievorm van niml wordt gegenereerd onder toepassing van een unieke KpnI-restrictieplaats bij positie 819 (SEQ ID nr.: 15 21). De N-eindstandige deletievorm (voorbeeld 3) wordt geknipt met de restrictie-

endonucleasen EcoRI/Kpnl en het 415 bp fragment dat overeenkomt met het N-uiteinde wordt gewonnen door gelelectroforese. Op soortgelijke wijze wordt de C-eindstandige deletievorm (voorbeeld 4) geknipt met de restrictie-endonucleasen EcoRI/Kpnl en wordt het 790 bp-fragment dat overeenkomt met het gemodificeerde 20 C-uiteinde gewonnen door gelelectroforese. De fragmenten worden bij 15°C

gekoppeld, geknipt met EcoRI voor het verwijderen van de EcoRI concatemeren en gekloneerd tot in de EcoRI-plaats van gedefosforyleerd pCGN1761. De N/C-eindstandige deletievorm van niml is onder de transcriptieregeling van de dubbele 35S-promotor. Op soortgelijke wijze wordt een chimere vorm van niml gegenereerd 25 die bestaat uit de S35/S59 gemutageniseerde mogelijke fosforyleringsplaatsen

(voorbeeld 2), gefuseerd aan de C-eindstandige deletie (voorbeeld 4). Dit construct wordt op de hierboven beschreven wijze gegenereerd. De sequenties van de constructen worden bepaald om de betrouwbaarheid van de start- en stopcodons te verzekeren en om te bevestigen dat geen mutaties waren opgetreden gedurende het 30 kloneren. De respectieve transformatiecassettes, met inbegrip van de 35S-promotor, «/w7-chimera en tml-terminator, werden vrijgemaakt uit pCGN1761 door gedeeltelijk knippen met restrictie-enzym Xbal en gekoppeld tot in de Xbal-plaats van gedefosforyleerd pCIB200. SEQ ID nrs.: 28 en 29 tonen respectievelijk de DNA

1007779 113 coderende sequentie en de gecodeerde aminozuursequentie van een gewijzigde vorm van het niml-gen met zowel een N-eindstandige als een C-eindstandige aminozuurdeletie.

De onderhavige uitvinding omvat tevens gewijzigde vormen van allelen van 5 niml, waarbij de coderende sequentie van een dergelijke alleel onder de volgende omstandigheden met de in SEQ ID nr.: 28 weergegeven coderende sequentie hybridiseert: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) 10 bij 55°C. Onder deze omstandigheden zijn allelen van niml die onder de bovenstaande omstandigheden met SEQ ID nr.: 28 hybridiseren zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product zowel een N-eindstandige deletie heeft, waardoor lysineresten worden verwijderd die kunnen dienen als mogelijke ubiquitineringsplaatsen, naast de de serineresten bij aminozuurposities die 15 overeenkomen met posities 55 en 59 van het wild-type genproduct; als een C-eindstandige deletie heeft, waardoor serine- en treonineresten worden verwijderd.

Voorbeeld 32: Genereren van gewijzigde vormen van niml - Ankvrindomeinen niml vertoont homologie met ankyrinmotieven bij -bij benadering- aminozuren 20 103-362. Onder toepassing van de werkwijze van Ho et al. (1989) wordt de DNA- sequentie die codeert voor de mogelijke ankyrindomeinen (SEQ ID nr.: 2: 3093-3951) geamplificeerd door PCR (omstandigheden: 94°C 3 minuten: 35 x (94°C 30 seconden: 62°C 30 seconden: 72°C 2 minuten): 72°C 10 minuten) uit het niml cDNA (SEQ ID nr.: 21: 349-1128) onder toepassing van de volgende basisreeksen: 5’-25 ggaattcaATGG ACT CC AAC AAC ACCGCCGC-3 ’ (SEQ ID nr.: 38) en 5’ ggaattcTCAACCTTCCAAAGTTGCTTCTGATG-3’ (SEQ ID nr.: 39). Het aldus verkregen product wordt geknipt met het restrictie-endonuclease EcoRI en vervolgens gesplitst tot in de EcoRI-plaats van gedefosforyleerd pCGN1761 onder de transcriptieregeling van de dubbele 35S-promotor. De sequentie van het construct 30 wordt bepaald om de aanwezigheid van het synthetische startcodon (ATG) en een in-frame stopcodon (TGA) te bevestigen en om te bevestigen dat geen andere mutaties waren opgetreden gedurende PCR. De transformatiecassette, met inbegrip van de 35S-promotor, ankyrindomeinen en tml-terminator, wordt vrijgemaakt uit pCGN1761 1 007779 114 door gedeeltelijk knippen met het restrictie-enzym Xbal en gekoppeld tot in de Xbal-plaats van gedefosforyleerd pCIB200. SEQ ID nrs.: 30 en 31 tonen respectievelijk de DNA-coderende sequentie en de gecodeerde aminozuursequentie van het ankyrindomein van niml.

5 De onderhavige uitvinding omvat tevens gewijzigde vormen van allelen van niml, waarbij de coderende sequentie van een dergelijke alleel onder de volgende omstandigheden met de in SEQ ID nr.: 30 weergegeven coderende sequentie hybridiseert: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, 10 en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C. In deze uitvoeringsvormen zijn allelen van niml die onder de bovengenoemde omstandigheden met SEQ ID nr.: 30 hybridiseren zodanig gewijzigd dat het gecodeerde product in wezen bestaat uit de ankyrindomeinen van het wild-type genproduct.

15

Voorbeeld 33: Constructie van chimere genen

Om de kans op qua plaats en tijd geschikte expressie van gewijzigde niml-vormen te verhogen, werd een 4407 bp HindlII/BamHI-fragment (SEQ ID nr.: 2: basen 1249-5655) en/of een 5655 bp EcoRV/BamHI-fragment (SEQ ID nr.: 2: basen 20 1-5655) dat de niml-promotor en gen bevat, gebruikt voor het creëren van de gewijzigde niml-vormen in de bovenstaande voorbeelden 28-32. Hoewel de constructiestappen anders kunnen zijn zijn de onderliggende concepten vergelijkbaar met de hierboven beschreven voorbeelden. Sterke overexpressie van de gewijzigde vormen kan mogelijk dodelijk zijn. Derhalve kunnen de in voorbeelden 28-32 25 beschreven gewijzigde vormen van het niml-gen onder de regeling van andere promotors dan de endogene niml promotor worden gebracht, met inbegrip van, maar niet beperkt tot, de «oi-promotor of kleine subeenheid van Rubiscopromotor. Op soortgelijke wijze kunnen gewijzigde niml-\ormen onder de regeling van de pathogeen-responsieve promotor PR-1 tot expressie worden gebracht (Amerikaans 30 octrooischrift 5.614.395). Een dergelijke expressie maakt versterkte expressie van de gewijzigde «//«/-vormen alleen mogelijk onder belasting met een pathogeen of onder andere SAR-activerende omstandigheden. Verder kan resistentie tegen ziekte waarneembaar zijn in transformanten die gewijzigde «//«/-vormen onder regeling van 1007779 115 de PR-1 promotor tot expressie brengen, wanneer zij worden behandeld met concentraties van SAR-activerende verbindingen (dat wil zeggen BTH of INA) die normaal SAR niet activeren, en derhalve een terugkoppelingscyclus activeren (Weymann et al., (1995) Plant Cell 7: 2013-2022).

5

Voorbeeld 34: Transformatie van gewijzigde vormen van het nim] tot in Arabidovsis thaliana

De gegenereerde constructen (voorbeeld 28-33) worden ingebracht in Agrobacterium tumefaciens door electroporatie tot in stam GV3101. Deze constructen 10 worden gebruikt voor het transformeren van Arabidopsis ecotypen Col-0 en Ws-0 door vacuüminfïltratie (Mindrinos et al., Cell 78, 1089-1099 (1994)) of door standaard worteltransformatie. Zaad van deze planten wordt geoogst en tot ontkieming gebracht op agarplaten met kanamycine (of een ander geschikt antibioticum) als selectiemiddel. Alleen jonge planten die getransformeerd zijn met 15 cosmide-DNA kunnen het selectiemiddel ontgiftigen en overleven. Zaailingen die de selectie overleven worden overgebracht naar bodem en onderzocht op een CIM (constitutieve immuniteit) fenotype. Planten worden beoordeeld op waarneembare verschillen in fenotype vergeleken met de wild-typeplanten.

20 Voorbeeld 35: Beoordeling van het CIM-fenotype in planten die zijn getransformeerd met gewijzigde vormen van niml

Een blad van iedere primaire transformant wordt geoogst, RNA wordt geïsoleerd (Verwoerd et al., 1989, Nuc Acid Res, 2362) en onderzocht op constitutieve PR-1 expressie door RNA vlekanalyse (Uknes et al., 1992). Iedere 25 transformant wordt beoordeeld op een verhoogde ziekteresistentiereactie die wijst op constitutieve SAR-expressieanalyse (Uknes et al., 1992). Suspensies van conidiën in met 5-10x104 sporen/ml van twee verenigbare P. parasitica isolaten, Emwa en Noco (dat wil zeggen dat deze fungusstammen ziekte op respectievelijk wild-type Ws-0 en Col-0-planten veroorzaken) worden bereid en transformanten worden met het 30 geschikte isolaat besproeid, afhankelijk van het ecotype van de transformant. Geënte planten worden gedurende 7 dagen onder een hoge vochtigheid geïncubeerd. Planten worden op dag 7 op ziekteverschijnselen beoordeeld en een enkel blad wordt geoogst voor RNA-vlekanalyse onder toepassing van een testreeks, hetgeen een middel 1007779 116 verschaft voor het meten van de fungusinfectie.

Transformanten die een CIM-fenotype vertonen worden tot de Tl-generatie geleid en homozygote planten worden geïdentificeerd. Transformanten worden onderworpen aan een reeks ziekteresistentieproeven zoals hieronder beschreven.

5 Infecteren met fungus Noco en Emwa wordt herhaald en de bladeren worden gekleurd met lactofenol blauw om de aanwezigheid van hyphae van het fungus te identificeren, zoals beschreven in Dietrich et al., (1994). Transformanten worden geïnfecteerd met de bacteriële pathogeen Pseudomonas syringae DC3000 om het spectrum van waarneembare resistentie te beoordelen, zoals beschreven in Uknes et 10 al. (1993). Niet-geïnfecteerde planten worden beoordeeld op zowel vrije als glucose-geconjugeerde SA en planten worden gekleurd met lactofenol blauw om de aanwezigheid van microscopische lesies te bepalen. Resistente planten worden sexueel gekruist met SAR-mutanten zoals NahG (Amerikaans octrooischrift 5.614.395) en ndrl om de epistatische relatie van het resistente fenotype tot andere mutanten te 15 bepalen en te evalueren hoe deze dominant-negatieve mutanten van niml de SA-afhankelijke terugkoppelingscyclus kunnen beïnvloeden.

Voorbeeld 36: Isolatie van niml-homologen

Onder toepassing van het niml cDNA (SEQ ID nr.: 21) als een testreeks 20 worden homologen van Arabidopsis niml geïdentificeerd door het aftasten van genomische of cDNA bibliotheken van verschillende gewasplanten zoals, maar niet beperkt tot, de hierboven in voorbeeld 11 vermelde soorten. Standaardtechnieken voor het uitvoeren hiervan omvatten hybridisatieaftasten van uitgeplaatte DNA bibliotheken (dat wil zeggen plaques of koloniën; zie bijvoorbeeld Sambrook et al., 25 Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) en amplificatie door PCR onder toepassing van oligonucleotide basisreeksen (zie bijvoorbeeld Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications eds., Academic Press (1990)). Geïdentificeerde homologen worden genetisch gemanipuleerd tot in de hierin beschreven expressievectoren en getransformeerd tot in 30 de bovenstaande gewassen. Transformanten worden beoordeeld op verhoogde ziekteresistentie onder toepassing van relevante pathogenen van de te onderzoeken gewasplant.

Door DNA-vlekanalyse zijn nim 1-homologen waargenomen in de genomen van 1007779 117 komkommer, tomaat, tabak, maïs, tarwe en gerst. Genomisch DNA werd geïsoleerd uit komkommer, tomaat, tabak, maïs, tarwe en gerst, geknipt met restrictie-enzymen BamHI, HindlII, Xbal of Sail, electroforetisch gescheiden op 0,8% agarosegels en overgebracht naar nylon membraan door capillaire vlekvorming. Na UV-verknopen 5 om het DNA te fixeren werd het membraan onder matig strenge omstandigheden [(1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride) bij 55°C gedurende 18-24 uur] gehybridiseerd met met 32P-radioactief gemarkeerd Arabidopsis thaliana niml cDNA. Na hybridisatie werden de vlekken onder matig strenge omstandigheden [6XSSC gedurende 15 minuten (X3),

10 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C; 1XSSC is 0,15M NaCl, 15 mM

natriumcitraat (pH 7,0)] gewassen en blootgesteld aan röntgenfïlm om de banden die overeenkomen met niml zichtbaar te maken.

Verder kunnen geïdentificeerde tot expressie gebrachte sequentiemarkeringen (EST’s) die overeenkomst vertonen met het niml-gen worden gebruikt voor het 15 isoleren van homologen. Zo zijn bijvoorbeeld verschillende tot expressie gebrachte sequentiemarkeringen (EST’s) uit rijst geïdentificeerd die lijken op het niml-gen. Een meervoudige sequentievergelijking werd geconstrueerd onder toepassing van Clustal V (Higgins, Desmond G. en Paul M. Sharp (1989), Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer, CABIOS 5:151-153) als deel van het DNA* 20 (1228 South Park Street, Madison Wisconsin, 53715) Lasergene Biocomputing

Software pakket voor de Macintosh (1994). Bepaalde gebieden van het niml-eiwit zijn voor wat betreft de aminozuursequentie homoloog met 4 verschillende uit rijst afkomstige cDNA-eiwitproducten. De homologieën werden geïdentificeerd onder toepassing van de m'wi-sequenties in een GenBank BLAST onderzoek.

25 Vergelijkingen van de gebieden van homologie tussen niml en de rijst cDNA- producten zijn getoond in figuur 8 (zie tevens SEQ 1D nr.: 3 en SEQ ID nrs.: 4-11). De w/w /-eiwitfragmenten vertonen aminozuursequenties die voor 36 tot 48% identiek zijn met de 4 uit rijst verkregen producten. Deze rijst EST’s kunnen in het bijzonder bruikbaar zijn voor het isoleren van nim 1-homologen uit andere monocotyle planten. 30 Homologen kunnen worden verkregen door PCR. In deze werkwijze worden vergelijkingen gemaakt tussen bekende homologen (bijvoorbeeld rijst en Arabidopsis). Gebieden met een hoge mate van overeenkomst of identiteit in aminozuren en DNA worden vervolgens gebruikt voor het maken van PCR- 1007779 118 basisreeksen. Gebieden die rijk zijn in de aminozuurresten M en W zijn het meest geschikt, gevolgd door gebieden die rijk zijn aan de aminozuurresten F, Y, C, H, Q, K en E, omdat deze aminozuren door een beperkt aantal codons worden gecodeerd. Als een geschikt gebied is geïdentificeerd worden grondreeksen voor dit gebied 5 gemaakt met verschillende substituties op de plaats van het derde codon. De diversiteit van substitutie op de derde positie kan worden beperkt, afhankelijk van het beoogde soort. Bijvoorbeeld, omdat maïs GC-rijk is, worden basisreeksen gebruikt die een G of een C op de derde plaats bevatten, indien mogelijk.

De PCR-reactie wordt uitgevoerd met cDNA of genomisch DNA onder een 10 aantal verschillende standaardomstandigheden. Wanneer een band wordt waargenomen wordt deze gekloneerd en/of wordt de sequentie ervan bepaald om te bepalen of het een niml-homoloog is.

Voorbeeld 37: Expressie van gewijzigde vormen van niml in gewasplanten 15 Die constructen die een CIM-fenotype aan Col-0 of Ws-0 verlenen worden voor beoordeling getransformeerd tot in gewasplanten. Alternatief kunnen gewijzigde natieve mm/-genen, die in het vorige voorbeeld uit gewassen zijn geïsoleerd, opnieuw in de respectieve gewassen worden ingebracht. Hoewel het niml-gen in iedere plantencel die binnen deze brede klassen valt kan worden ingebracht, is het 20 bijzonder nuttig in gewasplantencellen zoals rijst, tarwe, gerst, rogge, maïs, aardappel, wortel, zoete aardappel, suikerbiet, bonen, doperwten, chicorei, sla, kool, bloemkool, broccoli, raap, radijs, spinazie, asperge, ui, knoflook, eierplant, peper, selderij, wortel, pompoen, in het bijzonder Cucurbita pepo, zucchini, komkommer, appel, peer, kweepeer, meloen, pruim, kers, perzik, nectarine, abrikoos, aardbei, druif, framboos, 25 ananas, avocado, papaya, mango, banaan, soja, tabak, tomaat, sorghum of suikerriet. Transformanten worden beoordeeld op verhoogde resistentie tegen ziekte. Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is de expressie van het gewijzigde vorm van het niml-gen op een niveau dat ten minste tweemaal boven het expressieniveau van natieve niml-gen in wild-typeplanten ligt, en bij voorkeur 30 tienmaal boven het expressieniveau van het wild-type ligt.

1007779 119

Referenties

De inhoud van ieder van de volgende referenties wordt hierbij door verwijzing in de onderhavige beschrijving opgenomen: 5 Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. en Lipman, D.J. (1990). etc.

J.Mol.Biol. 215, 403-410.

Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., en Struhl, K., eds (1987). Current Protocols in Molecular Biology (New York: 10 J.Wiley and Sons).

Bechtold, N., Ellis, J., en Pelletier, G. (1993). In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences Paris, Serie Sciences De La Vie 316, 494-499.

15

Bell, C, en Ecker, J. (1994). Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map oï Arabidopsis. Genomics 19, 137-144.

Bhat, K. (1993). Generation of a plasmid vector for deletion cloning by rapid 20 multiple site-directed mutagenesis. Gene 134, 83-87.

Bi, Y.M., Kenton, P., Mur, L., Darby, R., en Draper, J. (1995). Hydrogen peroxide does not function downstream of salicylic acid in the induction of PR protein expression. Plant J. 8, 235-245.

25

Bowling, S.A., Guo, A., Cao, H., Gordon, A.S., Klessig, D.F., en Dong, X.I.

(1994). A mutation in Arabidopsis that leads to constitutive expression of systemic acquired resistance. Plant Cell 6, 1845-1857.

30 Cameron, R.K., Dixon, R.A., en Lamb, C.J. (1994). Biologically induced systemic acquired resistance in Arabidopsis thaliana. Plant J. 5, 715-725.

Century, K.S., Holub, E.B., en Staskawicz, B.J. (1995). NDR1, a locus of

100777S

120

Arabidopsis thaliana that is required for disease resistance to both a bacterial and a fungal pathogen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6597-6601.

Chio, S., Creelman, R., J., M., en Wing, R. (1995). Construction and 5 characterization of a bacterial artificial chromosome library of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 13, 124-128.

Creusot, F., Fouilloux, E., Dron, M., Lafleuriel, J., Picard, G., Billaut, A., Le Paslier, D., Cohen, D., Chaboute, M.-E., Durr, A., Fleck, J., Gigot, C., Camilleri, C., 10 Bellini. C., Caboche, M., en Bouchez, D. (1995). The CIC library: a large insert YAC library for genome mapping in Arabidopsis thaliana. Plant J. 8, 763-770.

Delaney, T.P. ('997). Genetic dissection of acquired resistance to disease. Plant Physiology. 113, 5-12.

15

Delaney, T.P., Uknes, S., Vemooij, B., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D., Gaffney, T., Gutrella, M., Kessmann, H., Ward, E., en Ryals, J. (1994). A central role of salicylic acid in plant disease resistance. Science 266, 1247-1250.

20 Delaney, T.P., Friedrich, L., en Ryals, J.A. (1995). Arabidopsis signal transduction mutant defective in chemically and biologically induced disease resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, 6602-6606.

25 Dempsey, D.A., en Klessig, D.F. (1995). Signals in plant disease resistance.

Bulletin de L’Institut Pasteur 93, 167-186.

Dietrich, R.A., Delaney, T.P., Uknes, S.J., Ward, E.R., Ryals, J.A., en Dangl, J.L. (1994). Arabidopsis mutants simulating disease resistance response. Cell 77, 565-30 577.

Friedrich, L., Lawton, K., Ruess, W., Masner, P., Specker, N., Gut Rella, M., Meier, B., Dincher, S., Staub, T., Uknes, S., Metraux, J.P., Kessmann, H., en Ryals, 1 007779 121 J. (1996). A benzothiadiazole derivative induces systemic acquired resistance in tobacco. The Plant Journal 10(1), 61-70.

Elledge, S., Mulligan, J., Ramer, S., Spottswood, M., en Davis, R. (1991). I 5 Yes: A multifunctional cDNA expression vector for the isolation of genes by complementation of yeast and Escherichia coli mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 1731-1735.

Gaffney, T., Friedrich, L., Vemooij, B., Negrotto, D., Nye, G., Uknes, S., 10 Ward, E., Kessmann, H., en Ryals, J. (1993). Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance. Science 261, 754-756.

Greenberg, J.T., Guo, A.L., Klessig, D.F., en Ausubel, F.M. (1994). Programmed cell death in plants-a pathogen-triggered response activated coordinately 15 with multiple defense functions. Cell 77, 551-563.

Hebsgaard, S., Koming, P., Tolstrup, J., Engelbrecht, J., Rouze, P. en Brunak, S. (1996). Spice site prediction in Arabidopsis thaliana pre-mRNA by combining local and global sequence information. Nucleic Acids Res. 24, 3439-3452.

20

Higgins, D.G. en Sharp, P.M. (1989). Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. CABIOS 5, 151-153.

Hunt, M., en Ryals, J. (1996). Systemic acquired resistance signal transduction. 25 Crit. Rev. in Plant Sci. 15, 583-606.

Lawton, K., Uknes, S., Friedrich, L., Gaffney, T., Alexander, D., Goodman, R., Métraux, J.P., Kessmann, H., Ahl-Goy, P., Gut Rella, M., Ward, E., en Ryals, J. (1993). The molecular biology of systemic acquired resistance. In Mechanisms of 30 Defence Responses in Plants B. Fritig en M. Legrand, eds (Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers), biz. 422-432.

1007779 122

Lawton, K.A., Friedrich, L., Hunt, M., Weymann, K., Delaney, T., Kessmann, H., Staub, T., en Ryals, J. (1996). Benzothiadiazole induces disease resistance in Arabidopsis by activation of the systemic acquired resistance signal transduction pathway. Plant J. 10, 71-82.

5

Liu, Y.-G., Mitsukawa, N., Vazquez-tello, A., en Whittier, R. (1995). Generation of a high-quality PI library of Arabidopsis suitable for chromosome walking. Plant J. 7, 351-358.

10 Maher, E.A., Bate, N.J., Ni, W.T., Elkind, Y., Dixon, R.A. en Lamb, C.J.

(1994). Increased disease susceptibility of transgenic tobacco plants with suppressed levels of preformed phenylpropanoid products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7802-7806.

15 Mauch-Mani, B., en Slusarenko, A.J. (1994). Systemic acquired resistance in

Arabidopsis thaliana induced by a predisposing infection with a pathogenic isolate of fusarium oxysporum. Molecular Plant-Microbe Interactions, 7, 378-383.

Mauch-Mani, B. en Slusarenko, A.J. (1996). Production of salicylic acid 20 precursors is a major function of phenylalanine ammonia-lyase in the resistance of Arabidopsis to Peronospora parasitica. Plant Cell 8, 203-212.

Mindrinos, M., Katagiri, F., Yu, G.L. en Ausubel, F. (1994). The Arabidopsis thaliana disease resistance gene rps2 encodes a protein containing a nucleotide- 25 binding site and leucine-rich repeats. Cell 78, 1089-1099.

Pallas, J., Paiva, N., Lamb, C., en Dixon, R. (1996). Tobacco plants epigenetically suppressed in phenylalanine ammonia-lyase expression do not develop systemic acquired resistance in response to infection by tobacco mosaic virus. Plant J.

30 10, 281-293.

Ryals, J.A., Neuenschwander, U.H., Willits, M.G., Molina, A., Steiner, H.Y. en Hunt, M.D. (1996). Systemic acquired resistance. Plant Cell 8, 1809-1819.

1007779 123

Sambrook, J., Fritsch, E.F., en Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor, NY:: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

5 Shulaev, V., Léon, J., en Raskin, I. (1995). Is salicylic acid a translocated signal of systemic acquired resistance in tobacco. Plant Cell 7, 1691-1701.

Uknes, S., Mauch-Mani, B., Moyer, M., Potter, S., Williams, S., Dincher, S., Chandler, D., Slusarenko, A., Ward, E. en Ryals, J. (1992). Acquired resistance in 10 Arabidopsis. Plant Cell 4, 645-656.

Uknes, S., Winter, A.M., Delaney, T., Vemooij, B., Morse, A., Friedrich, L., Nye, G., Potter, S., Ward, E. en Ryals, J. (1993). etc. in Ai abidopsis. Mol. Plant-Microbe Interact. 6, 692-698.

15

Vemooij, B., Friedrich, L., Goy, P.A., Staub, T., Kessmann, H., en Ryals. J.

(1995). 2,6-dichloroisonicotinic acid-induced resistance to pathogens without the accumulation of salicylic acid. Molecular Plant-Microbe Interactions 8, 228-234.

20 Vemooij, B., Friedrich, L., Morse, A., Reist, R., Kolditz-Jawhar, R., Ward, E„

Uknes, S., Kessmann, H. en Ryals, J. (1994). Salicylic acid is not the translocated signal responsible for inducing systemic acquired resistance but is required in signal reduction. Plant Cell 6, 959-965.

25 Verwoerd, B., Dekker, M. en Hoekema, A. (1989). A small-scale procedure for the rapid isolation of plant RNAs. Nucleic Acids Res. 17, 2362.

Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Homes, M., Frijters, A., Pot, J., Pelema, J., Kuiper, M. en Zabeau, M. (1995). AFLP: a new 30 technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23, 4407-4414.

1007779 124

Ward, E.R., Uknes, S.J. Williams, S.C., Dincher, S.S., Wiederhold, D.L., Alexander, D.C., Ahl-Goy, P., Metraux, J.P. en Ryals, J.A. (1991). Coordinate Gene Activity in Response to Agents That Induce Systemic Acquired Resistance. Plant Cell 3, 1085-1094.

5

Weymann, K., Hunt, M., Uknes, S., Neuenschwander, U., Lawton, K., Steiner, H.Y., en Ryals, J. (1995). Suppression and restoration of lesion formation in Arabidopsis lsd mutants. Plant Cell 7, 2013-2022.

1007779 125

SEQUENTIELIJST

(1) ALGEMENE INFORMATIE: (i) AANVRAAGSTER:

(A) NAAM: Novartis AG

(B) STRAAT: Schwarzwaldallee 215 (C) PLAATS: Basel (E) LAND: Switzerland (F) POSTCODE (ZIP): 4002 (G) TELEFOON: +41 61 69 11 11 (H) TELEFAX: + 41 61 696 79 76 (I) TELEX: 962 991 (v) COMPUTER LEESBARE VORM: (A) MEDIUM: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (ii) TITEL VAN DE UITVINDING: WERKWIJZEN VOOR HET TOEPASSEN VAN HET NIM1-GEH OM RESISTENTIE TEGEN ZIEKTEN TE VERLENEN AAN PLANTEN.

(lil) AANTAL SEQUENTIES: 39 (2) INFORMATE VOOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 9919 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECUUL: DNA (genomisch)

(iii) HYPOTHETISCH: NEE

(iv) ANTI-SENSE: NEE

(xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:1: TGATCATGAA TTGCGTGTAG GGTTGTGTTT TAAAGATAGG GATGAGCTGA AGAAGGCGGT 60 1 007 779 126 GGACTGGTGT TCCATTAGAG GGCAGCAAAA GTGTGTAGTA CAAGAGATTG AGAAGGACGA 120 GTATACG1TT AAATGCATCA GATGGAAATG CAA17GGTCG CGTCGGGCAG ATTGAATAGA 180 AGAACATGGA CHGHAAGA TAACTAAGTG TAGTTGGTCC ACATACTTGT TGTTCTATTA 240 AGCCGGAAAA CTTCAACTTG TAATTTGCAG CAGAAGAGAT TGAGTGTCTG ATCAGGGTAC 300 AACCCACTCT AACAGCAGAG TTGAAAAGTT TGGTGACATG CTTAAAACTT CAAAGCTGCG 360 GGCAGCAGAA CAGGAAGTAA TCAAAGATCA GAGTTTCAGA GTATTGCCTA AACTAATTGG 420 CTGCATTTCA CTCATCTAAT GGGCTACTTG TGGACTGCAA TATGAGCTTT TCCCTAATCC 480 TGAATTTGCA TCCTTCGGTG GCGCGTITTG GGCGTTTCCA CAGTCCATTG AAGGGTTTCA 540 ACACTGTAGA CCTCTGATCA TAGTGGATTC AAAAGACHG AACGGCAAGT ACCCTATGAA 600 ATTGATGATT TCCTCAGGAC TCGACGCTGA TGATTGCTTT TTCCCGCHG CCTTTCCGCT 660 TACCAAAGAA GTGTCCACTG ATAGTTGGCG TTGGTTTCTC ACTAATATCA GAGAGAAGGT 720 AACACAAAGG AAAGACGTTT GCCTCGTCTC CAGTCCTCAC CCGGACATAG π60Τ6ΠΑΤ 780 TAACGAACCC GGATCACTGT GGCAAGAACC TTGGGTCTAT CACAGGTTCT GTCTGGATTG 840 TTTTTGCTTA CAATTCCATG ATATTTTTGG AGACTACAAC CTGGTGAGCC TTGTGAAGCA 900 GGCTGGATCC ACAAGTCAGA AGGAAGAATT TGATTCCTAC ATAAAGGACA TCAAAAAGAA 960 GGACTCAGAA GCTCGG.AAAT GGTTAGCCCA ATTCCCTCAA AATCAGTGGG CTCTGGCTCA 1020 TGACCAGTGG TCGGAGATAT GGAGTCATGA CGATAGAAAC AGAAGATTTG AGGGCAATTT 1080 GTGAAAGCTT TCAGTCTCTT GGTCTATCAG TGACAGCGAA CGCACCTGCA CATGTGGGAA 1140 GTiTCAATCG AAGAAGTTTC CATGTATGCA CCCAGAAATG GTGCAAAGGA TTGTTAACTT 1200 GTGTCATTCA CAAATGTTGG ATGCAATGGA GCTGACTAGG AGAATGCACC HACACGCCC 1260 ACTCAGTGn CTCTTATCTC TAGACCTGAA ACTAACTTGC TGTGTAATTC GAGTTACAAA 1320 AGGTTAAAGG AAGAATTAGG AAGATACATA TAACATGAAT GHGCCAGAA GTTCAGGGAA 1380 CTTGAATAH CTmGGTTC TTGGTGGAAA ATATCCAACA GATGAACAAT TTGACATTAT 1440 1007779 127 TTCACACTTT GATTCTAGCA ACTCTGTAAC ACCATCATGG GTTATTGTTG ATGTACATAA 1500 ATATATATTA CAAATCTGTA TACCATTGGT TCAAATTGTT ACAACATTTG TTTGAAGCAC 1560 ACCTGCAGCA ATAATACACA GGATGCAAAA CGAAGAGCGA AACTATATGA CGCCAACGAT 1620 AGACATAAAC AGTTACAGTC ATCATGAAAA CAGAATTATA TGGTACAGCA AAAATTACAC 1680 TAAGAGGCAA GAGTCTCACC GACGACGATG AGAGAGTTTA CGGTTAGACC TCITTCCACC 1740 GGTTGATTTC GATGTGGAAG AAGTCGAATC TGTCAGGGAC GAATTTCCTA ATTCCAAATT 1800 GTCCTCACTA AAGGCOTCT HAGTGTCTC TTGTATTTCC ATGTACCTTT GCTTCTHTG 1860 TAGTCGTTTC TCAGCAGTGT CGTCHCTCC GCAAGCCAGT TGAGTCAAGT CCTCACAGTT 1920 CATAATCTGG TCGAGCACTG CCGAACAGCG CGGGAAGAAT CGTTTCCCGA GTTCCACTGA 1980 TGATAAAAAA AACAAGGTCA GACAGCAAGT AACAAAACCA TGTTTAAAGA TCATTTAGTT 2040 TTGTTTTTTG TGATAAGGAG TCCGATGAAG TGGGTGAGAA TCCATACCGG TTTTAGAAAG 2100 CGCTTTTAGT CTACTTTGAT GCTCTTCTAG GATTCTGAAA GGTGCTATCT TTACACCCGG 2160 TGATGTTCTC TTCGTACCAG TGAGACGGTC AGGCTCGAGG CTAGTCACTA TGAACTCACA 2220 TGTTCCCTTC ATTTCGGCGA TCTCCATTGC AGCTTGTGCT TCCGHGGAA AAAGACGTTG 2280 AGCAAGTGCA ACTAAACAGT GGACGACACA AAGAATAGH ATCATTAGTT CACTCAGTTT 2340 CCTAATAGAG AGGACATAAA TTTAATTCAA ACATATAAGA AATAAGACTT GATAGATACC 2400 TCTATTTTCA AGATCGAGCA GCGTCATCH CAATTCATCG GCCGCCACTG CAAAAGAGGG 2460 AGGAACATCT CTAGGAATTT GTTCTCG1TT GTCTTCnGC TCTAGTATTT CTACACATAG 2520 TCGGCCTTTG AGAGAATGCT TGCATTGCTC CGGGATATTA TTACATTCAA CCGCCATAGT 2580 GGCTTGTTTT GCGATCATGA GTGCGGTTCT ACCTTCCAAA GTTGCTTCTG ATGCACTTGC 2640 ACCTTTTTCC AATAGAGATA GTATCAAHG TGGCTCCTTC CGCATCGCAG CAACATGAAG 2700 CACCGTATAT CCCCTCGGAT TCCTATGGTT GACATCGGCA AGATCAAGTT TTAAAAGATC 2760 TGTTGCGGTC TTCACAnGC AATATGCAAC AGCGAAATGA AGAGCACACG CATCATCTAG 2820 1007779 128 ATTGGTGTGA TCCTCTTTCA AAAGCAACTT GACTAACTCA ATATCATCCG AGTCAAGTGC 2880 CTTATGTACA HCGAGACAT GTTTCTTTAC TTTAGGTACC TCCAAACCAA GCTCTTTACG 2940 TCTATCAATT ATCTCTTTAA CAAGCTCTTC CGGCAATGAC TTTTCAAGAC TAACCATATC 3000 TACATTAGAC TTGACAATAA TCTCTTTACA TCTATCCAAT AGCTTCATAC AAGCTTTACC 3060 ACATATATTA GCAAGCTTGA GTATAACCAA TGTGTCCTCT ATAACAACH TGTCTACAAC 3120 GTCCAATAAG TGCCTCTGAA ATACAAATAC AAGTACTCAA GTAAGAACAT ATTCATGAAT 3180 GTGTAACCAT AGCTTAATGC AGATGGTGTT TTACCTGATA GAGAGTAATT AATTCAGGGA 3240 TCTTGAAGAT GAAAGCCAAA TAGAGAACCT CCAACATGAA ATCCACCGCC GGCCGGCAAG 3300 CCACGTGGCA GCAAHCTCG TCTGCGCATT CAGAAACTCC TTTAGGCGGC GGTCTCACTC 3360 TGCTGCTGTA AACATAAGCC AAAACAGTCA CAACCGAATC GAAACCGACT TCGTAATCCT 3420 TGGCAATCTC CTTAAGCTCG AGCTTCACGG CGGCGGTGTT GTTGGAGTCT TTCTCCTTCT 3480 TAGCGGCGGC TAAAGCGCTC HGAAGAAAG AGCHCTCGC TGACAAAACG CACCGGTGGA 3540 AAGAAACTTC CCGGCCGTCG GAGAGAACAA GCTTAGCGTC GCTGTAGAAA TCATCCGGCG 3600 AGTCAAAGAC GGATTCGAAG CTGHGGAGA GCAATTGCAG AGCAGATACA TCAGGTCCGG 3660 TGAGTACTTG TTCGGCGGCC AGATAAACAA TAGAGGAGTC GGTGTTATCG GTAGCGACGA 3720 AACTAGTGCT GCTGATTTCA TAAGAATCGG CGAATCCATC AATGGTGGTG TCCATCAACA 3780 GGTTCCGATG AAHGAAAH CACAAAHAA AGAGATCTCT GCTAATCAAC GAAGAGACCT 3840 TATCAACTGG ATTTGGTTAA AGATCGAAGA TAACCATTGA CGAGCAGAGC CAAGTCAAGT 3900 CAACGAGAGT GGTGGTGAGA TATGAAGAAG CATCCTCGTC CCACGGTTTA CATTTCACCA 3960 AAACCGGTAA ATTTCCAGGA AAGGAATCH TGTCAGAGAT CTTTTnAAA AAGATATAAC 4020 AGGAAGCTAA ACCGGTTCGG GTTATAAATG TTAGTATTTA TACCGGAGAC ATTTTGTGTT 4080 GCTAATTTTT GTATATGAGA AGTTCAATCC GGTTCGGTAA GCCCCTGAAC CAAACTAGAT 4140 TTGGAGATGA TATAAATATA TAAAATTTAT TTTTCATCCG GTTCGTTATT TTCATATAAA 4200 1 007779 129 ΤΑΤΑΤΑΑΑΤΑ ΤΤΑΓΤΤΊ1 IA AATTTAAGAA TTAGATTTAC ATGTGAAAGT TACATTTCTG 4260 mATTTTCT TTGAAGTAAA ATGATAAAGG GAACGTATAT TAAGTTTCAT GCTTTATTCA 4320 CATAAGTTTT GTAATGTATA πΑΤΑΤΤΤπ CGTTTATTGA AAAAGTAATT TTCAGTGTTC 4380 AGCATGTTTA CACTATAAH AAATCAAGTC GAATATTTCC TGGAACTATT CTCCHGITC 4440 TATAGCAAAT GAAAACGCTC TTCACAACAA AATCATTATA GATATAGGAA TAAATTACAT 4500 TAAAAACATG AAAGTCATAA TGAATATATT ΤΓΠΤΑΑΤΤΑ GGATTTGAn TAAAAACAAT 4560 TATTGTATAC ATATAAAAGA CTTCTTTAGT TATTTGCCn CAACTTCTCG TTCTGAATCA 4620 TGCGATAAAT CAGCTTTTTC AATAACTACG ACGTAAAAGC AAATTCATAA CACGTCTAAA 4680 CAAATTTGGC TCATCCTTCA CTTGATTGGT GTTTTCCGGA CTCGATGTTG CTGGAAACTG 4740 AGAAGAAGAA GGAATCTGCA TAATCACCTC TTGGTTCCTC ACCGGTAGAC TCATTTTGTT 4800 GGATCGAAAA CGATCGAGAT CAGAAAATGA AAAGATAGGT TAAAGATGCC TATGAATACA 4860 ACAACGTAAG AHATGHGA ATAAACAGAG TACTTTATAT AGGAGTTATA ATAAGGTAAA 4920 TAAATTATTG CTTTCCGCGT TTTTTACTTT TGTATTTCTT AAATGATAAG TTAAATTAGG 4980 ATAAGATTTG TATGATTTTA AGTAAATTTA CAATAACTCT CTATAACTCA ATAGCATCAC 5040 ATATTTAATT AATTTTACTA ATTATCTTTT GAACAATTTT ATGAAATAGT ΤΤΤΟΤΓΤΑΑ 5100 πΑΑΤΤΤΤπ AAAATGATAT ΑΠΑΤΑΑΑΑΤ TTAATTGAAT CAATCTGATA ΤΑΑΙΤΪ1111 5160 ATCTTCTACC ATCTATTATA G1TGATAAAT AHGTGATAA ACTTTAGATA AACACCCAAT 5220 TGCCAAATAT ΤΤΑΑΤΑΑΑπ HGTGTACCA TGCGTTTTTT HGGAGAATA TATATACGTG 5280 GACAGCATAC CGTACATATA TTGTATAAAA GCTTATAAAA CATAGATACG GGTTATATTG 5340 GTAAGCTATA AATATATGTA AACAATAGTA AGATATTACG TGnGTGTCT AAATATGTGT 5400 TGCTITAGAT ATTATGTATA TCTAATATAT TAAAATATCT TTTATTAACT AATATATTAT 5460 TTAAGAGAGA AAAHGGGAC ACTATTTTCT ATACAGTAAC TGTTTTCAAC TATAAACAGG 5520 AACCCTTGAT ATAATAAAAT AACTAGCCAA AAAATCAGAT TAAATATTCA TAAAACAATG 5580 1007779 130 ITTGGTATTA TTACATAAAC CTAAGAAACA AAATTCAATA TTCCTTTTTA CCHATAAAA 5640 AACAAHAAA CATCACTAGA TATATTTATG CCCCACAATG AGCGAGCCAA TTGAGACTTG 5700 AGACTTGAGA TCCTTGTCAA CTACG1TTGC AITTGTCGGC (ΧΑΙΙΙΓΠΊ TAII Π I 11 I 5760 TTAAAGTGTC GGCCCGTTGC TTCÏÏCCGÏÏ CAGATCAACC CTCTCGTAAT CAGAACAAAA 5820 CGGAAAACAA ACGAAAGAAC AATCAGATCC CTCITTTIIT GCATAAACTA AATTCAACTT 5880 CTCTGCGTTT ATGTTGTAGA GGCAACCACG ATCACTACTA CGAAACAATA CAACGTCGH 5940 GCTTGGAGTC CACGTAATCA AATCTACTCC AATGCTTTTA ATATCTTTCA CTTTAACCCA 6000 CGACTTTTCA AAACTGCTCT HAAAACCCA TAACTCGTGA ACATCTTCTT GATC1TTGTT 6060 TGTCCACTGA CGAATAGCAC CTAGCTTCCC TTCGTATCTG ACTAATCCTG AGAAAACATC 6120 AGAGTTCGGA GTATGGAAGA AGGACCAAGT TTCGGHTTG AGACAAAACC GGATCACATT 6180 GTTGTTCCGT GATATCCAAT GCAAGAACCC CGAAACTTGT ATCGGGTTGG AAAAAATTAA 6240 TCTGTCTGTT TTTGGTAGAC GCAAATTTTC TAATCTCTTC CAGGTAAACG AATCAGAATC 6300 GAAAACTTCG CACATAAAAG TTCTGTGATT CAAATGGTAG ATACCCCGAG ACATACACAT 6360 ACGCCGAGAC TGCGAAAGCC TTTGTATTrT ATACCGGAAA GGGTTCAATC CGATTACCGC 6420 TAAACCCAAT GACATATCCC AACCCTTCAC TTCTGGCTTT GGTATGACCT GATACTGTTT 6480 AGTGGTTGGT TTGAAGACTA TGTATCCACG TGATGGTTTT GTATACTTAA CACAAAGCAA 6540 TATCCCATGA CTTGCATCAC AAGCTTCGAT CITTATCATT CCGGGTGGCA GAAAGTCGAT 6600 GGAGACTCCA TTGTTTTGTA AATCACTCCT CTCATGGACA AAACTGGTTC GAAGTTCGTG 6660 TCCTTTTACT ATGTAGTGH GTATGAAGTA TCCCGAAATA CGAHGGTTC TAAGGAGATT 6720 AAGAHGACA AACCATGACT CGTAGCTTCT CTTGTTGCAC TCTTTATTCA GGAGCCTGAA 6780 TTTTCCGATT TTTGACGCCG GAAGATAAGA AAGAAATTCT TGGATCATGT CTTGATTTAT 6840 CACCGGAGAA CTCATGATCC TGTCGGGAAT AAAGAGATGA GCACGATCAC TGAATGAGAA 6900 ATGAAAAAAT CAGGATCGGT AGAGAACAAC TTATGATGAA TAAAGTGTTT ATATATCCTT 6960 1 007779 131 TCTTTGTTTA AGGAAAGTAT CAAAA1TTGC CTTmCTTC GCTAGTCCTA AAACAAACAA 7020 ATTAACCAAA AGATAAAATC TTTCATGATT AATGTTACTT GTGATACCTT AAGCCAAAAC 7080 TTTATCTTTA GACTTTTAAC CAAATCTACA GTAATTTAAT TGCTAGACTT AGGAAACAAC 7140 ill II11 ΠΙ ACCCAACAAT CTTTGGATrT TAATTGTTTT TTTTTCTACT AATAGATTAA 7200 CAACTCAHA TATAATAATG TTTCTATCAT AATTGACAAT TCTTTCTTrT TAATAAACAT 7260 CCAGCTTGTA TAATAATCCA CAAGTCAATT TCACCATTTT GGCCAATTTA TTTTCTTATA 7320 AAAAHAGCA CAAAAAAGAT TATCATTGTT TAGCAGATTT AATTTCTAAT TAACTTACGT 7380 AATTTCCATT TTCCATAGAT TTATCTTTCT TTTTATTTCC TTAGTTATCT TAGTACTTTC 7440 TTAGFICCT TAGTAATTH AAATTTTAAG ATAATATATT GAAATTAAAA GAAGAAAAAA 7500 AACTCTAGH ATACTTTTGT TAAATGTTTC ATCACACTAA CTAATAATTT TTTTTAGTTA 7560 AATTACAATA TATAAACACT GAAGAAAGTT TTTGGCCCAC ACTTTTTTGG GATCAATTAG 7620 TACTATAGTT AGGGGAAGAT TCTGATTTAA AGGATACCAA AAATGACTAG TTAGGACATG 7680 AATGAAAACT TATAATCTCA ATAACATACA TACGTGTTAC TGAACAATAG TAACATCTTA 7740 CGTGTTTTGT CCATATATTT GTTGCTTATA AATATATTCA TATAACAATG TTTGCATTAA 7800 GCTTTTAAGA AGCACAAAAC CATATAACAA AATTAAATAT TCCTATCCCT ACCAAAAAAA 7860 AAAATTAAAT ATTCCTACAG CClimGAT TATTTTATGC CCTACGTTGA GCCTTGTTGA 7920 CTAGTTTGCA TTTGTCGGTC CATTTCTTCT TCCGTCCAGA TCAACCCTCT CGTAATCAGA 7980 ACAAAAGGGG AAACAAACGT AAGAGGCAAA ATCCTTGTTT GTATGAACTA AGTTTAACH 8040 CTCTGTGTTT AAGTTGTAGA GGCAAACATG ATCCCAACTA GAAAGCATTA CGACGTCGTT 8100 GCTTGGTATC CACGTAATAT GCTCTACTCC AATGCTTTCA ATATCTTTCA CmTTCCCA 8160 CGACTTTTCA AAACTGCTCT TTAAAACCCA TAATCTGTGA ACATCTTCTT GATTGTTGTT 8220 TATCCAGTGA CGAATAACAC CTAGCTTCCC TTCGTAGCTG ACTAACTCTG GGAATAAACC 8280 AACGTTTGGA GTATGTAAGA AAGACCAAGT TTCGGTTTTG GGACATAACC GGATCACATT 8340 1 0 07^ 132 GTGGTTCCAT GATCTCCAAT GCAAGAACCC TGAAGOTGT ACCGGGTTTG AAAGAATTAG 8400 ACCGTCTGTT CTCGGTAGAC GCAAATTTTT TAATCTCTTC CACATAAACG AATCGGAATC 8460 AAAAACTTCG CACGCAAAAG TTCTGAGATT CCGAGTCATA CCAGGCGATT TCGAAAGCCT 8520 AAATATTTTA TACCGGAAAG GCTGCAATCC GGTTACCGTT AGACCTAATG ACTTATCACA 8580 ACTCCTCACT TrTGGGTTTG GTATGATCTG ATACTGUTT GTTGTTGGTT TGCAGACTAT 8640 GTATTCCGGT ATTGGTCTTG TATCATTATA ACAAAGCAAT ATCCCATGAC GTGCATCACA 8700 AGCITTGATC TTTACCTCTC CTTGTGGCAG AAAATCGATG GAGACTCCTT TGTTATCCAA 8760 ATCTCTCCTC TCATGGAAAA AACTGGTATC AAGTTTGTAT CCTCTTTCGT AGCGTTCTAG 8820 GAAGTATCCA ΘΑΟΑΤΑπθΤ TGGHCGATG GAGATTTAGG TTGACAAACC AAGACTCGTA 8880 GCTTCTCTTG TTGCACTCTT TATTGATGAG CCTCAAim CCGATTTCGG ACCCCCGAAG 8940 ATAAGAAAGA ACCTCTTGGA TCGTGTCCTG ATTTATCACC GGAGAACTCA TGATCUATT 9000 GGAAAAAAGA AAGAAAGAGA TGAGCACGAT CAGTGAATGA GATATATAGA AATCAGGATT 9060 GGTAGAGAAC CGACGATGAT GAATATACAA GTGTTTATAA GTATCACAAA nGCCTnTT 9120 CTTCGCTAGT CCCAAAACAA GCAAAHAAC CAAAGATAAA ATCTTCATTA ATGTTTTCCT 9180 TTTTCTTCGC CAGTCCCAGA TAAAAATATA TATAAAATAT TTCATTAGGT TACTTGTAGT 9240 ACCTTGAGCC CAAAGTTTCT CTTTTGACTT TTAACCAAAT TAACAGTAAT TTAATAGCTA 9300 GACTTAGAAA ACAACATTTT GTATATATAT TCTTTGACAT CAAAATTCAA CAATCTTTGG 9360 GTTTCTATAG TGTTTTTTTT CTTATTCTAA TAGATTACCA CTCATTATAT CATATACAAA 9420 GTGTTTCCTT TTCAATCAAC ATCCATITTC TTTAAAAATT AGCAAGTTTG TTCTTATATC 9480 ATCATTCAGC AGATTTCTTA ATTAAACTTA GTGATTTCCA TTTTGCACCT ATATGTTTCT 9540 CTTTCTTAGT TTAGTACTTT AAATTTTCAT ΑΤΑΤΑΤΑΑπ TATTAAAATT AAAAGTAAAA 9600 ACTCCAGTTT AACTTATGTT AAATGTTTCA TCACACTAAA AGAGCAHAA GTAATAAATA 9660

TlTTAGCrn ATGAAAAAAA ATATCAAATC ACTGAAGACA TTÏGTTGGCC TATACTCTAT 9720 1007779 133 TTTTTATTTG GCCAATTAGT AATAGACTAA TAGTAACTCA TATGATATCT CTCTAATTCT 9780 GGCGAAACGA ATATTCTGAT TCTAAAGATA GTAAAAATGA ATTTTGATGA AGGGAATACT 9840 ATTTCACACA CCTAGAAAGA GTAAGGTAGA AACCTTTTIT TTTTTGGTCA GATTCTTGTA 9900 TCAAGAAGTT CTCATCGAT 9919 (2) INFORMATE VOOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 5655 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECUUL: DNA (genomisch)

(iii) HYPOTHETISCH: NEE

(iv) ANTI-SENSE: NEE

(ix) BIJZONDER ASPECT: (A) NAAM/TEKEN: exon (B) PLAATS: 2787..3347 (D) VERDERE INFORMATIE: /product= "1ste exon van ΝΙΜΓ (ix) BIJZONDER ASPECT: (A) NAAM/TEKEN: exon (B) LOCATIE: 3427..4162 (D) VERDERE INFORMATIE: /product= "2de exon van ΝΙΜΓ' (ix) BIJZONDER ASPECT: (A) NAAM/TEKEN: exon (B) PLAATS: 4271..4474 (D) VERDERE INFORMATIE: /product= "3de exon van NIM1" (ix) BIJZONDER ASPECT: (A) NAAM/TEKEN: exon (B) PLAATS: 4586..4866 (D) VERDERE INFORMATIE: /product= "3de exon van NIM1" (ix) BIJZONDER ASPECT:

(A) NAAM/TEKEN: CDS

(B) PLAATS: samenvoegen (2787..3347, 3427..4162. 4271..4474.

1 O 07 7 7 q 134 4586..4866) (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:2: .. TGTGATGCAA GTCATGGGAT ATTGCTTTGT GTTAAGTATA CAAAACCATC ACGTGGATAC 60 ATAGTCTTCA AACCAACCAC TAAACAGTAT CAGGTCATAC CAAAGCCAGA AGTGAAGGGT 120 TGGGATATGT CATTGGG1TT AGCGGTAATC GGA1TGAACC CTTTCCGGTA TAAAATACAA 180 AGGCTTTCGC AGTCTCGGCG TATGTGTATG TCTCGGGGTA TCTACCATTT GAATCACAGA 240 ACmTATGT GCGAAGTTTT CGATTCTGAT TCGTTTACCT GGAAGAGAH AGAAAATTTG 300 CGTCTACCAA AAACAGACAG ATTAATTTTT TCCAACCCGA TACAAGTTTC GGGGTTCTTG 360 CATTGGATAT CACGGAACAA CAATGTGATC CGGiTTTGTC TCAAAACCGA AACTTGGTCC 420 TTCTTCCATA CTCCGAACTC TGATGTTTTC TCAGGATTAG TCAGATACGA AGGGAAGCTA 480 GGTGCTATTC GTCAGTGGAC AAACAAAGAT CAAGAAGATG TTCACGAG17 ATGGGTTTTA 540 AAGAGCAGn TTGAAAAGTC GTGGGTTAAA GTGAAAGATA TTAAAAGCAT TGGAGTAGAT 600 TTGATTACGT GGACTCCAAG CAACGACGTT GTATTGTTTC GTAGTAGTGA TCGTGGTTGC 660 CTCTACAACA TAAACGCAGA GAAGTTGAAT TTAGTTTATG CAAAAAAAGA GGGATCTGAT 720 TGTTCTTTCG mGTTTTCC GTTTTGTTCT GATTACGAGA GGGTTGATCT GAACGGAAGA 780 AGCAACGGGC CGACACTTTA AAAAAAAAAT AAAAAAAATG GGCCGACAAA TGCAAACGTA 840 GTTGACAAGG ATCTCAAGTC TCAAGTCTCA ATTGGCTCGC TCAHGTGGG GCATAAATAT 900 ATCTAGTGAT GTTTAATTGT TTTTTATAAG GTAAAAAGGA ATATTGAATT TTGTTTCTTA 960 GG1TTATGTA ATAATACCAA ACATTGTTTT ATGAATATTT AATCTGA1TT TTTGGCTAGT 1020 ΤΑΓΠΤΑΤΤΑ TATCAAGGGT TCCTGTTTAT AGTTGAAAAC AGTTACTGTA TAGAAAATAG 1080 TGTCCCAATT TTCTCTCTTA AATAATATAT TAGTTAATAA AAGATATTTT AATATAHAG 1140 ATATACATAA TATCTAAAGC AACACATATT TAGACACAAC ACGTAATATC TTACTATTGT 1200 HACATATAT TTATAGCTTA CCAATATAAC CCGTATCTAT GTTTTATAAG CTTTTATACA 1260 1007779 135 ATATATGTAC GGTATGCTGT CCACGTATAT ATATTCTCCA AAAAAAACGC ATGGTACACA 1320 AAATTTATTA AATATTTGGC AAHGGGTGT TTATCTAAAG TTTATCACAA TATTTATCAA 1380 CTATAATAGA TGGTAGAAGA TAAAAAAA1T ATATCAGATT GATTCAAHA ΑΑΤΤΓΤΑΤΑΑ 1440 ΤΑΤΑΤΟΑΠΤ TAAAAAATTA AHAAAAGAA AACTATTTCA TAAAATTGTT CAAAAGATAA 1500 HAGTAAAAT TAAHAAATA TGTGATGCTA HGAGHATA GAGAGTTATT GTAAAITTAC 1560 TTAAAATCAT ACAAATCTTA TCCTAATTTA ΑΟπΑΤΟΑΠ TAAGAAATAC AAAAGTAAAA 1620 AACGCGGAAA GCAATAATTT ATTTACCTTA TTATAACTCC TATATAAAGT ACTCTGTTTA 1680 TTCAACATAA TCTTACGTTG TTGTATTCAT AGGCATCTTT AACCTATCTT TTCATTTTCT 1740 GATCTCGATC GTTTTCGATC CAACAAAATG AGTCTACCGG TGAGGAACCA AGAGGTGATT 1800 ATGCAGATTC CTTCTTCTTC TCAG1TTCCA GCAACATCGA GTCCGGAAAA CACCAATCAA 1860 GTGAAGGATG AGCCAAATTT GTTTAGACGT GTTATGAATT TGCTTTTACG TCGTAGTTAT 1920 TGAAAAAGCT GATTTATCGC ATGATTCAGA ACGAGAAGTT GAAGGCAAAT AACTAAAGAA 1980 GTCTTTTATA TGTATACAAT AATTGTTTTT AAATCAAATC CTAATTAAAA AAATATATTC 2040 ATTATGACTT TCATGTTTTT AATGTAA1TT ATTCCTATAT CTATAATGAT TTTGTTGTGA 2100 AGAGCGTTTT CATTTGCTAT AGAACAAGGA GAATAGTTCC AGGAAATATT CGACTTGATT 2160 TAAHATAGT GTAAACATGC TGAACACTGA AAATTACTTT TTCAATAAAC GAAAAATATA 2220 ATATACATTA CAAAACTTAT GTGAATAAAG CATGAAACTT AATATACGTT CCC1TTATCA 2280 TTTTACTTCA AAGAAAATAA ACAGAAATGT AACTTTCACA TGTAAATCTA ATTCnAAAT 2340 TTAAAAAATA ATATTTATAT ATTTATATGA AAATAACGAA CCGGATGAAA AATAAATTTT 2400 ΑΤΑΤΑΠΤΑΤ ATCATCTCCA AATCTAGTTT GGTTCAGGGG CTTACCGAAC CGGATTGAAC 2460 TTCTCATATA CAAAAATTAG CAACACAAAA TGTCTCCGGT ATAAATACTA ACAHTATAA 2520 CCCGAACCGG TTTAGCTTCC TGTTATATCT TTTTAAAAAA GATCTCTGAC AAAGATTCCT 2580 TTCCTGGAAA TTTACCGGTT TTGGTGAAAT GTAAACCGTG GGACGAGGAT GCTTCTTCAT 2640 1 007779 136 ATCTCACCAC CACTCTCGTT GACTTGACTT GGCTCTGCTC GTCAATGGTT ATCTTCGATC 2700 TTTAACCAAA TCCAGTTGAT AAGGTCTCTT CGTTGATTAG CAGAGATCTC mAATTTGT 2760 GAATTTCAAT TCATCGGAAC CTGTTG ATG GAC ACC ACC ATT GAT GGA TTC GCC 2813

Met Asp Thr Thr lie Asp Gly Phe Ala 1 5 GAT TCT TAT GAA ATC AGC AGC ACT AGT TTC GTC GCT ACC GAT AAC ACC 2861

Asp Ser Tyr Glu lie Ser Ser Thr Ser Phe Val Ala Thr Asp Asn Thr 10 15 20 25 GAC TCC TCT ATT GTT TAT CTG GCC GCC GAA CAA GTA CTC ACC GGA CCT 2909

Asp Ser Ser He Val Tyr Leu Ala Ala Glu Gin Val Leu Thr Gly Pro 30 35 40 GAT GTA TCT GCT CTG CAA TTG CTC TCC AAC AGC TTC GAA TCC GTC TTT 2957

Asp Val Ser Ala Leu Gin Leu Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ser Val Phe 45 50 55 GAC TCG CCG GAT GAT TTC TAC AGC GAC GCT AAG CTT GTT CTC TCC GAC 3005

Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser Asp 60 65 70 GGC CGG GAA GTT TCT πC CAC CGG TGC GTT TTG TCA GCG AGA AGC TCT 3053

Gly Arg Glu Val Ser Phe His Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser Ser 75 80 85 TTC TTC AAG AGC GCT TTA GCC GCC GCT AAG AAG GAG AAA GAC TCC AAC 3101

Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser Asn 90 95 100 105 AAC ACC GCC GCC GTG AAG CTC GAG CTT AAG GAG ATT GCC AAG GAT TAC 3149

Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu He Ala Lys Asp Tyr 110 115 120 GAA GTC GGT TTC GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG GCT TAT GTT TAC AGC 3197

Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser 125 130 135 AGC AGA GTG AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT GAA TGC GCA GAC GAG 3245

Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu 140 145 150 AAT TGC TGC CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG GAT TTC ATG TTG GAG 3293

Asn Cys Cys His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu 1 007779 137 155 160 165 GTT CTC TAT TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT GAA TTA ATT ACT CTC 3341

Val Leu Tyr Leu Ala Phe lie Phe Lys lie Pro Glu Leu He Thr Leu 170 175 180 185 TAT CAG GTAAAACACC ATCTGCATTA AGCTATGGTT ACACATTCAT GAATATGTTC 3397

Tyr Gin TTACTTGAGT ACTTGTAHT GTATTTCAG AGG CAC TTA JIG GAC GTT GTA GAC 3450

Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp 190 195 AAA GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA 3498

Lys Val Val He Glu Asp Thr Leu Val He Leu Lys Leu Ala Asn He 200 205 210 TGT GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT 3546

Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu lie He 215 220 225 GTC AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA 3594

Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu 230 235 240 GAG CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG 3642

Glu Leu Val Lys Glu He He Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu 245 250 255 GTA CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC 3690

Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp 260 265 270 275 TCG GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC 3738

Ser Asp Asp He Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr 280 285 290 AAT CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT 3786

Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn 295 300 305 GTG AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC 3834

Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn 310 315 320 1 007779 138 CAT A6G AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG 3882

His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg 325 330 335 AAG GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA 3930

Lys Glu Pro Gin Leu lie Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala 340 345 350 355 TCA GAA GCA ACT TTG GAA GGT AGA ACC GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA 3978

Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met lie Ala Lys Gin 360 365 370 GCC ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT 4026

Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn lie Pro Glu Gin Cys Lys His 375 380 385 TCT CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA 4074

Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu He Leu Glu Gin Glu Asp Lys 390 395 400 CGA GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC 4122

Arg Glu Gin He Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala 405 410 415 GAT GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT CTT GAA AAT AGA G 4162

Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg 420 425 430 GTATCTATCA AGTCTTATTT CTTATATGTT TGAATTAAAT TTATGTCCTC TCTaTTAGGA 4222 AACTGAGTGA ACTAATGATA ACTATTCTTT GTGTCGTCCA CTGTTTAG π GCA CTT 4278

Val Ala Leu 435 GCT CAA CGT CTT ITT CCA ACG GAA GCA CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC 4326

Ala Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gin Ala Ala Met Glu He Ala 440 445 450 GAA ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC 4374

Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe He Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp 455 460 465 CGT CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT 4422

Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys He Ala Pro 470 475 480 1007779 139 TTC AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA 4470

Phe Arg lie Leu Glu Glu His Gin Ser Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys 485 490 495 ACC G GTATGGATTC TCACCCACTT CATCGGACTC CTTATCACAA AAAACAAAAC 4524

Thr 500 TAAATGATCT TTAAACATGG TTTTGTTACT TGCTGTCTGA CCTTGTTTTT TTTATCATCA 4584 G TG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC 4629

Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu 505 510 515 GAC CAG ATT ATG AAC TGT GAG GAC TTG ACT CAA CTG GCT TGC GGA GAA 4677

Asp Gin lie Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gin Leu Ala Cys Gly Glu 520 525 530 GAC GAC ACT GCT GAG AAA CGA CTA CAA AAG AAG CAA AGG TAC ATG GAA 4725

Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gin Lys Lys Gin Arg Tyr Met Glu 535 540 545 ATA CAA GAG ACA CTA AAG AAG GCC TTT AGT GAG GAC AAT TTG GAA TTA 4773 lie Gin Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu 550 555 560 GGA AAT TCG TCC CTG ACA GAT TCG ACT TCT TCC ACA TCG AAA TCA ACC 4821

Gly Asn Ser Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr 565 570 575 GGT GGA AAG AGG TCT AAC CGT AAA CTC TCT CAT CGT CGT CGG TGA 4866

Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg Arg * 580 585 590 GACTCTTGCC TCTTAGTGTA ATTTTTGCTG TACCATATAA TTCTGTTTTC ATGATGACTG 4926 TAACTGTTTA TGTCTATCGT TGGCGTCATA TAGTTTCGCT CTTCGTTTTG CATCCTGTGT 4986 ATTATTGCTG CAGGTGTGCT TCAAACAAAT GTTGTAACAA TTTGAACCAA TGGTATACAG 5046 ATTTGTAATA TATATTTATG TACATCAACA ATAACCCATG ATGGTGTTAC AGAGTTGCTA 5106 GAATCAAAGT GTGAAATAAT GTCAAATTGT TCATCTGTTG GATATTTTCC ACCAAGAACC 5166 AAAAGAATAT TCAAGTTCCC TGAACTTCTG GCAACATTCA TGTTATATGT ATCTTCCTAA 5226 1 007"“'' 140 TTCTTCCTTT AACCTTTTGT AACTCGMTT ACACAGCMG TTAGTTTCAG GTCTAGAGAT 5286 AAGAGAACAC TGAGTGGGCG TGTAAGGTGC ATTCTCCTAG TCAGCTCCAT TGCATCCAAC 5346 ATTTGTGAAT GACACAAGTT AACAATCCTT TGCACCATTT CTGGGTGCAT ACATGGAAAC 5406 TTCTTCGATT GAAACTTCCC ACATGTGCAG GTGCGTTCGC TGTCACTGAT AGACCAAGAG 5466 ACTGAAAGCT TTCACAAATT GCCCTCAAAT CTTCTGTTTC TATCGTCATG ACTCCATATC 5526 TCCGACCACT GGTCATGAGC CAGAGCCCAC TGATTTTGAG GGAATTGGGC TAACCATTTC 5586 CGAGCTTCTG AGTCCTTCTT TTTGATGTCC TTTATGTAGG AATCAAATTC TTCCTTCTGA 5646 CTTGTGGAT 5655 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 594 aminozuurs (B) TYPE: aminozuur (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: eiwit (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID N0:3:

Met Asp Thr Thr IIe Asp Gly Phe Al a Asp Ser Tyr Glu IIe Ser Ser 15 10 15

Thr Ser Phe Val Al a Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser IIe Val Tyr Leu 20 25 30

Al a Ala Glu Gin Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Al a Leu Gin Leu 35 40 45

Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ser Val Phe Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr 50 55 60

Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His 65 70 75 80

Arq Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Al a 85 90 95 1007779 141

Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu 100 105 110

Glu Leu Lys Glu lie Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val 115 120 125

Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro 130 135 140

Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys 145 150 155 160

Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe lie 165 170 175

Phe Lys He Pro Glu Leu He Thr Leu Tyr Gin Arg His Leu Leu Asp 180 185 190

Val Val Asp Lys Val Val He Glu Asp Thr Leu Val He Leu Lys Leu 195 200 205

Ala Asn He Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys 210 215 220

Glu He He Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser 225 230 235 240

Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu He lie Asp Arg Arg Lys Glu Leu 245 250 255

Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys 260 265 270

Ala Leu Asp Ser Asp Asp He Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu 275 280 285

Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala 290 295 300

Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala 305 310 315 320

Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala 325 330 335

Ala Met Arg Lys Glu Pro Gin Leu He Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly 1007779 142 340 345 350

Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met He 355 360 365

Ala Lys Gin Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn lie Pro Glu Gin 370 375 380

Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu He Leu Glu Gin 385 390 395 400

Glu Asp Lys Arg Glu Gin He Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala 405 410 415

Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg 420 425 430

Val Ala Leu Ala Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gin Ala Ala Met 435 440 445

Glu He Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe He Val Thr Ser Leu 450 455 460

Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys 465 470 475 480

He Ala Pro Phe Arg He Leu Glu Glu His Gin Ser Arg Leu Lys Ala 485 490 495

Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser 500 505 510

Ala Val Leu Asp Gin He Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gin Leu Ala 515 520 525

Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gin Lys Lys Gin Arg 530 535 540

Tyr Met Glu He Gin Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn 545 550 555 560

Leu Glu Leu Gly Asn Ser Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser 565 570 575

Lys Ser Thr Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg 580 585 590 1007779

Arg * 143 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 41 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENG: niet relevant (D) TOPOLOGIE: niet relevant (ii) SOORT MOLECULE: peptide (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID N0:4: I1e Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp I1e Glu Leu Val 15 10 15

Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Al a Leu Al a 20 25 30

Val His Tyr Ala Val Gin His Cys Asn 35 40 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 38 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENG: niet relevant (D) TOPOLOGIE: niet relevant (ii) SOORT MOLECULE: peptide (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:5:

Pro Thr Gly Lys Thr Ala Leu His Leu Al a Ala Glu Met Val Ser Pro 15 10 15 1007779 144

Asp Met Vól Ser Val Leu Leu Asp His His Ala Asp Xaa Asn Phe Arg 20 25 30

Thr Xaa Asp Gly Val Thr 35 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 41 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENG: niet relevant (D) TOPOLOGIE: niet relevant (li) SOORT MOLECULE: peptide (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:6: lie Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp lie Glu Leu Val 15 10 15

Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala 20 25 30

Val His Tyr Ala Val Gin His Cys Asn 35 40 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 27 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENG: niet relevant (D) TOPOLOGIE: niet relevant (ii) SOORT MOLECULE: peptide (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:7:

Arg Arg Pro Asp Ser Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val 1007779 145 15 10 15

Ser Pro Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp Gin 20 25 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 41 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENG: niet relevant (D) TOPOLOGIE: niet relevant (ii) SOORT MOLECULE: peptide (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:8: lie Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp lie Glu Leu Val 15 10 15

Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala 20 25 30

Val His Tyr Ala Val Gin His Cys Asn 35 40 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID N0:9: (l) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 27 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENG: niet relevant (D) TOPOLOGIE: niet relevant (ii) SOORT MOLECULE: peptide (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:9:

Arg Arg Pro Asp Ser Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val 15 10 15 1007779 146

Ser Pro Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp Gin 20 25 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 41 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENG: niet relevant (D) TOPOLOGIE: niet relevant (ii) SOORT MOLECULE: peptide (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:10: lie Arg Arg Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp lie Glu Leu Val 15 10 15

Lys Leu Met Val Met Gly Glu Gly Leu Asp Leu Asp Asp Ala Leu Ala 20 25 30

Val His Tyr Ala Val Gin His Cys Asn 35 40 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:11: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 19 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENG: niet relevant (D) TOPOLOGIE: niet relevant (ii) SOORT MOLECULE: peptide (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:11:

Pro Thr Gly Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val Ser Pro 15 10 15

Asp Met Val 1007779 147 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:12: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 22 baseparen (B) TYPE: nuclei'nezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nucleinezuur (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:12: AATTCTAAAG CATGCCGATC GG 22 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:13: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 21 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nuclei'nezuur (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:13: AATTCCGATC GGCATGCTTT A 21 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:14: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 22 baseparen (B) TYPE: nucleïnezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nucleïnezuur 1007779 148 (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID N0:14: AATTCTAAAC CATGGCGATC GG 22 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:15: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 21 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nucleinezuur (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:15: AATTCCGATC GCCATGGTTT A 21 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:16: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 15 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nucleinezuur (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID N0:16: CCAGCTGGAA TTCCG 15 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:17: 1 007779 149 (i) SEQUENTIEKENMERKEN; (A) LENGTE: 19 baseparen (B) TYPE: nuclei'nezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nuclei'nezuur (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:17: CGGAATTCCA GCTGGCATG 19 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:18: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 314 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENG: niet relevant (D) TOPOLOGIE: niet relevant (ii) SOORT MOLECULE: eiwit (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:18:

Met Phe Gin Pro Ala Gly His Gly Gin Asp Trp Ala Met Glu Gly Pro 15 10 15

Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Val Asp Asp Arg His Asp Ser 20 25 30

Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gin Met Val Lys Glu 35 40 45

Leu Arg Glu He Arg Leu Gin Pro Gin Glu Ala Pro Leu Ala Ala Glu 50 55 60

Pro Trp Lys Gin Gin Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu 65 70 75 80 1 007 779 150

Ala lie lie His Glu Glu Lys Pro Leu Thr Met Glu Val lie Gly Gin 85 90 95

Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gin Asn Asn Leu Gin Gin 100 105 110

Thr Pro Leu His Leu Ala Val He Thr Asn Gin Pro Gly He Ala Glu 115 120 125

Ala Leu Leu Lys Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly 130 135 140

Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gin Gly Cys Leu Ala Ser Val 145 150 155 160

Ala Val Leu Thr Gin Thr Cys Thr Pro Gin His Leu His Ser Val Leu 165 170 175

Gin Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Thr 180 185 190

His Gly Tyr Leu Ala He Val Glu His Leu Val Thr Leu Gly Ala Asp 195 200 205

Val Asn Ala Gin Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala 210 215 220

Val Asp Leu Gin Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly 225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gin Gly Tyr Ser Pro Tyr Gin Leu 245 250 255

Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg He Gin Gin Gin Leu Gly Gin Leu 260 265 270

Thr Leu Glu Asn Leu Gin Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser 275 280 285

Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro Tyr Asp Asp 290 295 300

Cys Val Phe Gly Gly Gin Arg Leu Thr Leu 305 310 1007779 151 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:19: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 314 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENG: niet relevant (D) TOPOLOGIE: niet relevant (i1) SOORT MOLECULE: eiwit (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO: 19:

Met Phe Gin Pro Ala Gly His Gly Gin Asp Trp Ala Met Glu Gly Pro 15 10 15

Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Val Asp Asp Arg His Asp Ser 20 25 30

Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Asp Tyr Glu Gin Met Val Lys Glu 35 40 45

Leu Arg Glu IIe Arg Leu Gin Pro Gin Glu Al a Pro Leu Al a Ala Glu 50 55 60

Pro Trp Lys Gin Gin Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu 65 70 75 80

Ala I1e I1e His Glu Glu Lys Thr Leu Thr Met Glu Val Ile Gly Gin 85 90 95

Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gin Asn Asn Leu Gin Gin 100 105 110

Thr Pro Leu His Leu Ala Val lie Thr Asn Gin Pro Gly Ile Ala Glu 115 120 125

Ala Leu Leu Lys Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly 130 135 140

Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gin Gly Cys Leu Ala Ser Val 145 150 155 160

Ala Val Leu Thr Gin Thr Cys Thr Pro Gin His Leu His Ser Val Leu 1007779 165 170 175 152

Gin Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser lie 180 185 190

His Gly Tyr Leu Gly lie Val Glu His Leu Val Thr Leu Gly Ala Asp 195 200 205

Val Asn Ala Gin Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala 210 215 220

Val Asp Leu Gin Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly 225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gin Gly Tyr Ser Pro Tyr Gin Leu 245 250 255

Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg lie Gin Gin Gin Leu Gly Gin Leu 260 265 270

Thr Leu Glu Asn Leu Gin Thr Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser 275 280 285

Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro Tyr Asp Asp 290 295 300

Cys Val Phe Gly Gly Gin Arg Leu Thr Leu 305 310 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:20: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 314 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENG: niet relevant (D) TOPOLOGIE: niet relevant (ii) SOORT MOLECULE: eiwit (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:20:

Met Phe Gin Pro Ala Glu Pro Gly Gin Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro 1 0 07779 153 15 10 15

Arg Asp Ala Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser 20 25 30

Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gin Met Val Lys Glu 35 40 45

Leu Arg Glu lie Arg Leu Glu Pro Gin Glu Ala Pro Arg Gly Ala Glu 50 55 60

Pro Trp Lys Gin Gin Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu 65 70 75 80

Ala lie He His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Val Arg Gin 85 90 95

Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gin Asn Asn Leu Gin Gin 100 105 110

Thr Pro Leu His Leu Ala Val He Thr Asn Gin Pro Glu He Ala Glu 115 120 125

Ala Leu Leu Glu Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly 130 135 140

Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gin Gly Cys Leu Ala Ser Val 145 150 155 160

Gly Val Leu Thr Gin Pro Arg Gly Thr Gin His Leu His Ser He Leu 165 170 175

Gin Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser He 180 185 190

His Gly Tyr Leu Gly He Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp 195 200 205

Val Asn Ala Gin Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala 210 215 220

Val Asp Leu Gin Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly 225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gin Gly Tyr Ser Pro Tyr Gin Leu 245 250 255 1007779 154

Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg He Gin Gin Gin Leu Gly Gin Leu 260 265 270

Thr Leu Glu Asn Leu Gin Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser 275 280 285

Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro Tyr Asp Asp 290 295 300

Cys Val Leu Gly Gly Gin Arg Leu Thr Leu 305 310 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID N0:21: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 2011 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair

(ii) SOORT MOLECULE: cDNA

(vi) OORSPRONKELIJKE BRON: (A) ORGANISME: Arabidopsis thaliana (ix) BIJZONDER ASPECT: (A) NAAM/TEKEN: diverse aspecten (B) PLAATS: 1..2011 (D) VERDERE INFORMATIE: /noot= "NIM1 cDNA sequentie" (ix) BIJZONDER ASPECT:

(A) NAAM/TEKEN: CDS

(B) PLAATS: 43..1824 (D) VERDERE INFORMATIE: /product= "NIM1 eiwit" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID N0:21: GATCTCTTTA ATTTGTGAAT TTCAATTCAT CGGAACCTGT TG ATG GAC ACC ACC 54

Met Asp Thr Thr 1 ATT GAT GGA TTC GCC GAT TCT TAT GAA ATC AGC AGC ACT AGT TTC GTC 102

He Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu lie Ser Ser Thr Ser Phe Val 5 10 15 20 1 007779 155 GCT ACC GAT AAC ACC GAC TCC TCT ATT GTT TAT CTG GCC GCC GAA CAA 150

Ala Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser He Val Tyr Leu Ala Ala Glu Gin 25 30 35 GTA CTC ACC GGA CCT GAT GTA TCT GCT CTG CAA TTG CTC TCC AAC AGC 198

Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Ala Leu Gin Leu Leu Ser Asn Ser 40 45 50 TTC GAA TCC GTC ITT GAC TCG CCG GAT GAT TTC TAC AGC GAC GCT AAG 246

Phe Glu Ser Val Phe Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr Ser Asp Ala Lys 55 60 65 CTT GTT CTC TCC GAC GGC CGG GAA GTT TCT TTC CAC CGG TGC GTT TTG 294

Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His Arg Cys Val Leu 70 75 80 TCA GCG AGA AGC TCT TTC TTC AAG AGC GCT TTA GCC GCC GCT AAG AAG 342

Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala Ala Ala Lys Lys 85 90 95 100 GAG AAA GAC TCC AAC AAC ACC GCC GCC GTG AAG CTC GAG CTT AAG GAG 390

Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu 105 110 115 ATT GCC AAG GAT TAC GAA GTC GGT TTC GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG 438

He Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu 120 125 130 GCT TAT GTT TAC AGC AGC AGA GTG AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT 486

Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser 135 140 145 GAA TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG 534

Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val 150 155 160 GAT TTC ATG TTG GAG GTT CTC TAT TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT 582

Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe He Phe Lys lie Pro 165 170 175 180 GAA TTA ATT ACT CTC TAT CAG AGG CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC AAA 630

Glu Leu He Thr Leu Tyr Gin Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys 185 190 195 GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA TGT 678

Val Val He Glu Asp Thr Leu Val He Leu Lys Leu Ala Asn He Cys 1 007 779 156 200 205 210 GGT AM GCT TGT ATG MG CTA TTG GAT AGA TGT AM GAG ATT ATT GTC 726

Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu lie lie Val 215 220 225 MG TCT MT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GM MG TCA TTG CCG GM GAG 774

Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu 230 235 240 CTT GTT AM GAG ATA ATT GAT AGA CGT AM GAG CTT GGT TTG GAG GTA 822

Leu Val Lys Glu He lie Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val 245 250 255 260 CCT AM GTA MG AM CAT GTC TCG MT GTA CAT MG GCA CTT GAC TCG 870

Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser 265 270 275 GAT GAT ATT GAG TTA GTC MG TTG CTT TTG AM GAG GAT CAC ACC MT 918

Asp Asp lie Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn 280 285 290 CTA GAT GAT GCG TGT GCT CH CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC MT GTG 966

Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val 295 300 305 MG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AM CTT GAT CTT GCC GAT GTC MC CAT 1014

Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His 310 315 320 AGG MT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG MG 1062

Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys 325 330 335 340 GAG CCA CM TTG ATA CTA TCT CTA TTG GM AM GGT GCA AGT GCA TCA 1110

Glu Pro Gin Leu He Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser 345 350 355 GM GCA ACT TTG GM GGT AGA ACC GCA CTC ATG ATC GCA AM CM GCC 1158

Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met He Ala Lys Gin Ala 360 365 370 ACT ATG GCG GTT GM TGT MT MT ATC CCG GAG CM TGC MG CAT TCT 1206

Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn He Pro Glu Gin Cys Lys His Ser 375 380 385 1007779 157 CTC AAA G6C CGA CTA TGT GTA GAA ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA CGA 1254

Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu He Leu Glu Gin Glu Asp Lys Arg 390 395 400 GAA CAA ΑΠ CCT AGA GAT GTT CCT CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC GAT 1302

Glu Gin lie Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp 405 410 415 420 GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT CTT GAA AAT AGA GTT GCA CTT GCT 1350

Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala 425 430 435 CAA CGT CTT TTT CCA ACG GAA GCA CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC GAA 1398

Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gin Ala Ala Met Glu lie Ala Glu 440 445 450 ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC CGT 1446

Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe He Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg 455 460 465 CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT TTC 1494

Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys He Ala Pro Phe 470 475 480 AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA ACC 1542

Arg He Leu Glu Glu His Gin Ser Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr 485 490 495 500 GTG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC 1590

Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp 505 510 515 CAG ATT ATG AAC TGT GAG GAC TTG ACT CAA CTG GCT TGC GGA GAA GAC 1638

Gin He Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gin Leu Ala Cys Gly Glu Asp 520 525 530 GAC ACT GCT GAG AAA CGA CTA CAA AAG AAG CAA AGG TAC ATG GAA ATA 1686

Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gin Lys Lys Gin Arg Tyr Met Glu He 535 540 545 CAA GAG ACA CTA AAG AAG GCC TTT AGT GAG GAC AAT TTC GAA TTA GGA 1734

Gin Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu Gly 550 555 560 AAT TTC TCC CTG ACA GAT TCG ACT TCT TCC ACA TCG AAA TCA ACC GGT 1782

Asn Leu Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr Gly 1 0 07 779 158 565 570 575 580 GGA MG AGG TCT MC CGT AM CTC TCT CAT CGT CGT CGG TGA 1824

Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg Arg * 585 590 GACTCTTGCC TCTTAGTGTA ATTTTTGCTG TACCATATM TTCTGTTTTC ATGATGACTG 1884 TMCTGTTTA TGTCTATCGT TGGCGTCATA TAGTTTCGCT CTTCGTTTTG CATCCTGTGT 1944 ATTATTGCTG CAGGTGTGCT TCAMCAMT GTTGTMCM TTTGMCCM TGGTATACAG 2004 ATTTGTA 2011 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:22: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 2011 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair

(ii) SOORT MOLECULE: cDNA

(ix) BIJZONDER ASPECT:

(A) NMM/TEKEN: CDS

(B) PLMTS: 43..1824 (D) VERDERE INFORMATIE: /product= "gewijzigde vorm van ΝΙΜΓ /noot= "Serine resten bij aminozuurposities 55 en 59 in het wild-type NIM1 gen product zijn veranderd in alanine resten." (ix) BIJZONDER ASPECT: (A) NMM/TEKEN: diverse_aspecten (B) PLMTS: 205..217 (D) VERDERE INFORMATIE: /noot= "nucleotiden 205 en 217 veranderd van T's naar G's vergeleken met de wild-type sequentie." (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:22: GATCTCTTTA ATTTGTGMT TTCMTTCAT CGGMCCTGT TG ATG GAC ACC ACC 54

Met Asp Thr Thr 1 1 007779 159 Απ GAT GGA TTC GCC GAT TCT TAT GAA ATC AGC AGC ACT AGT TTC GTC 102 lie Asp Gly Phe Al a Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser Thr Ser Phe Val 5 10 15 20 GCT ACC GAT AAC ACC GAC TCC TCT ATT GTT TAT CTG GCC GCC GAA CAA 150

Al a Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu Al a Ala Glu Gin 25 30 35 GTA CTC ACC GGA CCT GAT GTA TCT GCT CTG CAA TTG CTC TCC AAC AGC 198

Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Al a Leu Gin Leu Leu Ser Asn Ser 40 45 50 TTC GAA GCC GTC TTT GAC GCG CCG GAT GAT TTC TAC AGC GAC GCT AAG 246

Phe Glu Ala Val Phe Asp Al a Pro Asp Asp Phe Tyr Ser Asp Ala Lys 55 60 65 CTT GTT CTC TCC GAC GGC CGG GAA GTT TCT TTC CAC CGG TGC GTT TTG 294

Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His Arg Cys Val Leu 70 75 80 TCA GCG AGA AGC TCT TTC TTC AAG AGC GCT TTA GCC GCC GCT AAG AAG 342

Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Al a Ala Ala Lys Lys 85 90 95 100 GAG AAA GAC TCC AAC AAC ACC GCC GCC GTG AAG CTC GAG CU AAG GAG 390

Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Al a Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu 105 110 115 ΑΠ GCC AAG GAT TAC GAA GTC GGT TIC GAT TCG GH GTG ACT GH TTG 438

Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu 120 125 130 GCT TAT GTT TAC AGC AGC AGA GTG AGA CCG CCG CCT AAA GGA GH TCT 486

Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser 135 140 145 GAA TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG 534

Glu Cys Al a Asp Glu Asn Cys Cys His Val Al a Cys Arg Pro Ala Val 150 155 160 GAT HC ATG TTG GAG GH CTC TAT TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT 582

Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe lie Phe Lys lie Pro 165 170 175 180 GAA ΠΑ Απ ACT CTC TAT CAG AGG CAC πΑ TTG GAC GTT GTA GAC AAA 630

Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gin Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys 1 00?77q 185 190 195 160 Gπ GIT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA TGT 678

Val Val lie Glu Asp Thr Leu Val I1e Leu Lys Leu Ala Asn IIe Cys 200 205 210 GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT GTC 726

Gly Lys Al a Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu 11e 11e Val 215 220 225 AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG 774

Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu 230 235 240 CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG GTA 822

Leu Val Lys Glu lie I1e Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val 245 250 255 260 CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC TCG 870

Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser 265 270 275 GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT 918

Asp Asp IIe Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn 280 285 290 CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG 966

Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val 295 300 305 AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT 1014

Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Al a Asp Val Asn His 310 315 320 AGG AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG 1062

Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Al a Ala Met Arg Lys 325 330 335 340 GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA 1110

Glu Pro Gin Leu IIe Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser 345 350 355 GAA GCA ACT TTG GAA GGT AGA ACC GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA GCC 1158

Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Al a Leu Met IIe Ala Lys Gin Al a 360 365 370 1007779 161 ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT TCT 1206

Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn lie Pro Glu Gin Cys Lys His Ser 375 380 385 CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA CGA 1254

Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu lie Leu Glu Gin Glu Asp Lys Arg 390 395 400 GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC GAT 1302

Glu Gin He Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp 405 410 415 420 GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT CTT GAA AAT AGA GTT GCA CTT GCT 1350

Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala 425 430 435 CAA CGT CTT ΉΤ CCA ACG GAA GCA CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC GAA 1398

Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gin Ala Ala Met Glu He Ala Glu 440 445 450 ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC CGT 1446

Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe He Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg 455 460 465 CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT TTC 1494

Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys He Ala Pro Phe 470 475 480 AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA ACC 1542

Arg lie Leu Glu Glu His Gin Ser Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr 485 490 495 500 GTG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC 1590

Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp 505 510 515 CAG ATT ATG AAC TGT GAG GAC TTG ACT CAA CTG GCT TGC GGA GAA GAC 1638

Gin lie Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gin Leu Ala Cys Gly Glu Asp 520 525 530 GAC ACT GCT GAG AAA CGA CTA CAA AAG AAG CAA AGG TAC ATG GAA ATA 1686

Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gin Lys Lys Gin Arg Tyr Met Glu He 535 540 545 CAA GAG ACA CTA AAG AAG GCC TTT AGT GAG GAC AAT TTG GAA TTA GGA 1734

Gin Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu Gly 1007779 162 550 555 560 AAT TTG TCC CTG ACA GAT TCG ACT TCT TCC ACA TCG AAA TCA ACC GGT 1782

Asn Leu Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr Gly ·. 565 570 575 580 GGA AAG AGG TCT AAC CGT AAA CTC TCT CAT CGT CGT CGG TGA 1824

Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg Arg * 585 590 GACTCTTGCC TCTTAGTGTA ATTTTTGCTG TACCATATAA TTCTGTTTTC ATGATGACTG 1884 TAACTGTTTA TGTCTATCGT TGGCGTCATA TAGTTTCGCT CTTCGTTTTG CATCCTGTGT 1944 ATTATTGCTG CAGGTGTGCT TCAAACAAAT GTTGTAACAA TTTGAACCAA TGGTATACAG 2004 ATTTGTA 2011 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:23: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 594 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: eiwit (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:23:

Met Asp Thr Thr He Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser 15 10 15

Thr Ser Phe Val Ala Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu 20 25 30

Al a Ala Glu Gin Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Ala Leu Gin Leu 35 40 45

Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ala Val Phe Asp Al a Pro Asp Asp Phe Tyr 50 55 60

Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His 65 70 75 80

Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Al a 1 0 07 7 79 163 85 90 95

Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu 100 105 110

Glu Leu Lys Glu lie Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val 115 120 125

Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro 130 135 140

Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys 145 150 155 160

Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe lie 165 170 175

Phe Lys He Pro Glu Leu He Thr Leu Tyr Gin Arg His Leu Leu Asp 180 185 190

Val Val Asp Lys Val Val He Glu Asp Thr Leu Val He Leu Lys Leu 195 200 205

Ala Asn He Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys 210 215 220

Glu He He Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser 225 230 235 240

Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu He He Asp Arg Arg Lys Glu Leu 245 250 255

Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys 260 265 270

Ala Leu Asp Ser Asp Asp He Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu 275 280 285

Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala 290 295 300

Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala 305 310 315 320

Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala 325 330 335 1007779 164

Ala Met Arg Lys Glu Pro Gin Leu lie Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly 340 345 350

Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met He 355 360 365

Ala Lys Gin Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn lie Pro Glu Gin 370 375 380

Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu He Leu Glu Gin 385 390 395 400

Glu Asp Lys Arg Glu Gin He Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala 405 410 415

Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg 420 425 430

Val Ala Leu Ala Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gin Ala Ala Met 435 440 445

Glu He Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe He Val Thr Ser Leu 450 455 460

Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys 465 470 475 480

He Ala Pro Phe Arg He Leu Glu Glu His Gin Ser Arg Leu Lys Ala 485 490 495

Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser 500 505 510

Ala Val Leu Asp Gin He Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gin Leu Ala 515 520 525

Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gin Lys Lys Gin Arg 530 535 540

Tyr Met Glu He Gin Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn 545 550 555 560

Leu Glu Leu Gly Asn Leu Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser 565 570 575

Lys Ser Thr Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg 1007779 165 580 585 590

Arg * (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:24: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 1597 baseparen (B) TYPE: nucleïnezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair

(ii) SOORT MOLECULE: cDNA

(ix) BIJZONDER ASPECT:

(A) NAAM/TEKEN: CDS

(B) PLAATS: 1..1410 (D) VERDERE INFORMATIE: /product= "Gewijzigde vorm van NIM1" /noot= "N-eindstandige deletie vergeleken met de wild-type NIM1 sequentie.” (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID N0:24: ATG GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG GCT TAT GTT TAC AGC AGC AGA GTG 48

Met Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val 15 10 15 AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT GAA TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC 96

Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys 20 25 30 CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG GAT TTC ATG TTG GAG GTT CTC TAT 144

His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr 35 40 45 TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT GAA TTA ATT ACT CTC TAT CAG AGG 192

Leu Ala Phe I1e Phe Lys IIe Pro Glu Leu IIe Thr Leu Tyr Gin Arg 50 55 60 CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC AAA GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT 240

His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val 65 70 75 80

1 nri777Q

166 ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA TGT GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG 288 11 e Leu Lys Leu Al a Asn Ile Cys Gly Lys Al a Cys Met Lys Leu Leu 85 90 95 GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT GTC AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT 336

Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser 100 105 110 CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA 384

Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg 115 120 125 CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG GTA CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG 432

Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser 130 135 140 AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC TCG GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG 480

Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu 145 150 155 160 CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT 528

Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His 165 170 175 TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA 576

Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys 180 185 190 CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT AGG AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG 624

Leu Asp Leu Al a Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val 195 200 205 CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA 672

Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu Pro Gin Leu Ile Leu Ser Leu 210 215 220 TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA GAA GCA ACT HG GAA GGT AGA ACC 720

Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr 225 230 235 240 GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA GCC ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT 768

Al a Leu Met Ile Ala Lys Gin Al a Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn 245 250 255 ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT TCT CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA 816 lie Pro Glu Gin Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu 1007779 167 260 265 270 ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA CGA GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT 864 lie Leu Glu Gin Glu Asp Lys Arg Glu Gin IIe Pro Arg Asp Val Pro 275 280 285 CCC TCT TTT GCA GTG GCG GCC GAT GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT 912

Pro Ser Phe Ala Val Al a Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp 290 295 300 CTT GAA AAT AGA GTT GCA CTT GCT CAA CGT CTT TTT CCA ACG GAA GCA 960

Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala 305 310 315 320 CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC GAA ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA 1008

Gin Ala Ala Met Glu He Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe lie 325 330 335 GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC CGT CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA 1056

Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser 340 345 350 CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT TTC AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT 1104

Pro Gly Val Lys lie Ala Pro Phe Arg He Leu Glu Glu His Gin Ser 355 360 365 AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA ACC GTG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC 1152

Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe 370 375 380 CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC CAG ATT ATG AAC TGT GAG GAC TTG 1200

Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp Gin He Met Asn Cys Glu Asp Leu 385 390 395 400 ACT CAA CTG GCT TGC GGA GAA GAC GAC ACT GCT GAG AAA CGA CTA CAA 1248

Thr Gin Leu Ala Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gin 405 410 415 AAG AAG CAA AGG TAC ATG GAA ATA CAA GAG ACA CTA AAG AAG GCC TTT 1296

Lys Lys Gin Arg Tyr Met Glu He Gin Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe 420 425 430 AGT GAG GAC AAT TTG GAA 17A GGA AAT TTG TCC CTG ACA GAT TCG ACT 1344

Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu Gly Asn Leu Ser Leu Thr Asp Ser Thr 435 440 445 10077?n 168 TCT TCC ACA TCG AAA TCA ACC GGT GGA AAG AGG TCT AAC CGT AAA CTC 1392

Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu 450 455 460 TCT CAT CGT CGT CGG TGA GACTCTTGCC TCTTAGTGTA ATTTTTGCTG 1440

Ser His Arg Arg Arg * 465 470 TACCATATAA TTCTGTTTTC ATGATGACTG TAACTGTTTA TGTCTATCGT TGGCGTCATA 1500 TAGTTTCGCT CTTCGTTTTG CATCCTGTGT ATTATTGCTG CAGGTGTGCT TCAAACAAAT 1560 GTTGTAACAA TTTGAACCAA TGGTATACAG ATTTGTA 1597 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID N0:25: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 470 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: eiwit (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:25:

Met Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val 15 10 15

Arq Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys 20 25 30

His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr 35 40 45

Leu Ala Phe lie Phe Lys lie Pro Glu Leu He Thr Leu Tyr Gin Arg 50 55 60

His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val Val He Glu Asp Thr Leu Val 65 70 75 80

He Leu Lys Leu Ala Asn He Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu 85 90 95

Asp Arg Cys Lys Glu He He Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser 100 105 110 1 007779 169

Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu lie lie Asp Arg 115 120 125

Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser 130 135 140

Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp lie Glu Leu Val Lys Leu 145 150 155 160

Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His 165 170 175

Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys 180 185 190

Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val 195 200 205

Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu Pro Gin Leu He Leu Ser Leu 210 215 220

Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr 225 230 235 240

Ala Leu Met He Ala Lys Gin Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn 245 250 255

He Pro Glu Gin Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu 260 265 270

He Leu Glu Gin Glu Asp Lys Arg Glu Gin He Pro Arg Asp Val Pro 275 280 285

Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp 290 295 300

Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala 305 310 315 320

Gin Ala Ala Met Glu He Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe He 325 330 335

Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser 340 345 350

Pro Gly Val Lys He Ala Pro Phe Arg He Leu Glu Glu His Gin Ser 1 007779 170 355 360 365

Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe 370 375 380

Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp Gin lie Met Asn Cys Glu Asp Leu 385 390 395 400

Thr Gin Leu Ala Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gin 405 410 415

Lys Lys Gin Arg Tyr Met Glu lie Gin Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe 420 425 430

Ser Glu Asp Asn Leu Glu Leu Gly Asn Leu Ser Leu Thr Asp Ser Thr 435 440 445

Ser Ser Thr Ser Lys Ser Thr Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu 450 455 460

Ser His Arg Arg Arg * 465 470 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:26: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 1608 baseparen (B) TYPE: nuclei'nezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair

(ii) SOORT MOLECULE: cDNA

(ix) BIJZONDER ASPECT:

(A) NAAM/TEKEN: CDS

(B) PLAATS: 43..1608 (D) VERDERE INFORMATIE: /product= "Gewijzigde vorm van NIM1" /noot= "C-eindstandige deletie vergeleken met wild-type NIM1." (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:26: GATCTCTTTA ATTTGTGAAT TTCAATTCAT CGGAACCTGT TG ATG GAC ACC ACC 54

Met Asp Thr Thr 1 1007779 171 Απ GAT GGA TTC GCC GAT TCT TAT GAA ATC AGC AGC ACT AGT TTC GTC 102 I1e Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser Thr Ser Phe Val 5 10 15 20 GCT ACC GAT AAC ACC GAC TCC TCT ATT GTT TAT CTG GCC GCC GAA CAA 150

Al a Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu Al a Ala Glu Gin 25 30 35 GTA CTC ACC GGA CCT GAT GTA TCT GCT CTG CAA TTG CTC TCC AAC AGC 198

Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Al a Leu Gin Leu Leu Ser Asn Ser 40 45 50 TTC GAA TCC GTC TTT GAC TCG CCG GAT GAT TTC TAC AGC GAC GCT AAG 246

Phe Glu Ser Val Phe Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr Ser Asp Ala Lys 55 60 65 CTT G"T CTC TCC GAC GGC CGG GAA GTT TCT TTC CAC CGG TGC GTT TTG 294

Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His Arg Cys Val Leu 70 75 80 TCA GCG AGA AGC TCT TTC TTC AAG AGC GCT TTA GCC GCC GCT AAG AAG 342

Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Al a Ala Ala Lys Lys 85 90 95 100 GAG AAA GAC TCC AAC AAC ACC GCC GCC GTG AAG CTC GAG CTT AAG GAG 390

Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Al a Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu 105 110 115 ΑΠ GCC AAG GAT TAC GAA GTC GGT TTC GAT TCG GTT GTG ACT GH TTG 438

Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu 120 125 130 GCT TAT GTT TAC AGC AGC AGA GTG AGA CCG CCG CCT AAA GGA GH TCT 486

Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser 135 140 145 GAA TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG 534

Glu Cys Al a Asp Glu Asn Cys Cys His Val Al a Cys Arg Pro Ala Val 150 155 160 GAT HC ATG HG GAG GTT CTC TAT TTG GCT TTG ATC TTC AAG ATC CCT 582

Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Al a Phe lie Phe Lys lie Pro 165 170 175 180 GAA ΠΑ Απ ACT CTC TAT CAG AGG CAC πΑ TTG GAC GTT GTA GAC AAA 630

Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gin Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys 1007779 185 190 195 172 GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA TGT 678

Val Val lie Glu Asp Thr Leu Val lie Leu Lys Leu Ala Asn He Cys 200 205 210 GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT GTC 726

Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu He He Val 215 220 225 AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG 774

Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu 230 235 240 CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA CGT AAA GAG CTJ GGT TTG GAG GTA 822

Leu Val Lys Glu He He Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val 245 250 255 260 CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA CAT AAG GCA CTJ GAC TCG 870

Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser 265 270 275 GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT 918

Asp Asp He Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn 280 285 290 CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG 966

Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val 295 300 305 AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT 1014

Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His 310 315 320 AGG AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG 1062

Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys 325 330 335 340 GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA 1110

Glu Pro Gin Leu He Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser 345 350 355 GAA GCA ACT TTG GAA GGT AGA ACC GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA GCC 1158

Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met He Ala Lys Gin Ala 360 365 370 1 007779 173

ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT TCT

Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn lie Pro Glu Gin Cys Lys His Ser 375 380 385 CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA CGA 1254

Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu lie Leu Glu Gin Glu Asp Lys Arq 390 395 400 GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT CCC TCT ITT GCA GTG GCG GCC GAT 1302

Glu Gin He Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp 405 410 415 420 GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT CTT GAA AAT AGA GTT GCA CTT GCT 1350

Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala 425 430 435 CAA CGT CTT TTT CCA ACG GAA GCA CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC GAA 1398

Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gin Ala Ala Met Glu He Ala Glu 440 445 450 ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC CGT 1446

Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe He Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg 455 460 465 CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT TTC 1494

Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys He Ala Pro Phe 470 475 480 AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA ACC 1542

Arg He Leu Glu Glu His Gin Ser Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr 485 490 495 500 GTG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC 1590

Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp 505 510 515 CAG ATT ATG AAC TGT TGA 1608

Gin He Met Asn Cys * 520 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID N0:27: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 522 aminozuren (B) TYPE: aminozuur 1 007779 174 (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: eiwit (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:27:

Met Asp Thr Thr lie Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser 15 10 15

Thr Ser Phe Val Al a Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu 20 25 30

Al a Ala Glu Gin Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Al a Leu Gin Leu 35 40 45

Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ser Val Phe Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr 50 55 60

Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His 65 70 75 80

Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala 85 90 95

Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu 100 105 110

Glu Leu Lys Glu Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val 115 120 125

Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro 130 135 140

Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys 145 150 155 160

Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile 165 170 175

Phe Lys lie Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gin Arg His Leu Leu Asp 180 185 190

Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu 195 200 205

Ala Asn lie Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys 1007779 210 215 220 175

Glu He lie Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser 225 230 235 240

Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu lie lie Asp Arg Arg Lys Glu Leu 245 250 255

Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys 260 265 270

Ala Leu Asp Ser Asp Asp He Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu 275 280 285

Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala 290 295 300

Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala 305 310 315 320

Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala 325 330 335

Ala Met Arg Lys Glu Pro Gin Leu He Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly 340 345 350

Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met He 355 360 365

Ala Lys Gin Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn He Pro Glu Gin 370 375 380

Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu He Leu Glu Gin 385 390 395 400

Glu Asp Lys Arg Glu Gin He Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala 405 410 415

Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg 420 425 430

Val Ala Leu Ala Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gin Ala Ala Met 435 440 445

Glu He Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe He Val Thr Ser Leu 450 455 460 1 007779 176

Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys 465 470 475 480 lie Ala Pro Phe Arg lie Leu Glu Glu His Gin Ser Arg Leu Lys Ala 485 490 495

Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser 500 505 510

Ala Val Leu Asp Gin He Met Asn Cys * 515 520 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:28: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 1194 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair

(ii) SOORT MOLECULE: cDNA

(ix) BIJZONDER ASPECT:

(A) NAAM/TEKEN: CDS

(B) PLAATS: 1..1194 (D) VERDERE INFORMATIE: /product= "Gewijzigde vorm van NIM1" /noot= "N-eindstandige/C-eindstandige chimera." (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:28: ATG GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG GCT TAT GTT TAC AGO AGC AGA GTG 48

Met Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val 15 10 15 AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT GAA TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC 96

Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys 20 25 30 CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG GAT TTC ATG TTG GAG GTT CTC TAT 144

His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr 35 40 45 TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT GAA TTA ATT ACT CTC TAT CAG AGG 192

Leu Ala Phe He Phe Lys He Pro Glu Leu He Thr Leu Tyr Gin Arg 1007779 177 50 55 60 CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC AAA GTT GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT 240

His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val Val lie Glu Asp Thr Leu Val 65 70 75 80 ATA CTC AAG C1T GCT AAT ATA TGT GGT AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG 288

He Leu Lys Leu Ala Asn lie Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu 85 90 95 GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT GTC AAG TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT 336

Asp Arg Cys Lys Glu He He Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser 100 105 no CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG CTT GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA 384

Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu lie lie Asp Arg 115 120 125 CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG GTA CCT AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG 432

Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser 130 135 140 AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC TCG GAT GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG 480

Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp He Glu Leu Val Lys Leu 145 150 155 160 CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT CTA GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT 528

Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His 165 170 175 TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG AAG ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA 576

Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys 180 185 190 CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT AGG AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG 624

Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val 195 200 205 CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG GAG CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA 672

Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu Pro Gin Leu He Leu Ser Leu 210 215 220 TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA GAA GCA ACT TTG GAA GGT AGA ACC 720

Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr 225 230 235 240 1007779 178 GCA CTC ATG ATC GCA AAA CAA GCC ACT ATG GCG GTT GAA TGT AAT AAT 768

Ala Leu Met lie Ala Lys Gin Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn 245 250 255 ATC CCG GAG CAA TGC AAG CAT TCT CTC AAA GGC CGA CTA TGT GTA GAA 816 lie Pro Glu Gin Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu 260 265 270 ATA CTA GAG CAA GAA GAC AAA CGA GAA CAA ATT CCT AGA GAT GTT CCT 864

He Leu Glu Gin Glu Asp Lys Arg Glu Gin He Pro Arg Asp Val Pro 275 280 285 CCC TCT ITT GCA GTG GCG GCC GAT GAA TTG AAG ATG ACG CTG CTC GAT 912

Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp 290 295 300 CTT GAA AAT AGA GTT GCA CTT GCT CAA CGT CTT ITT CCA ACG GAA GCA 960

Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala 305 310 315 320 CAA GCT GCA ATG GAG ATC GCC GAA ATG AAG GGA ACA TGT GAG TTC ATA 1008

Gin Ala Ala Met Glu lie Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe He 325 330 335 GTG ACT AGC CTC GAG CCT GAC CGT CTC ACT GGT ACG AAG AGA ACA TCA 1056

Val Thr Ser Leu Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser 340 345 350 CCG GGT GTA AAG ATA GCA CCT TTC AGA ATC CTA GAA GAG CAT CAA AGT 1104

Pro Gly Val Lys He Ala Pro Phe Arg He Leu Glu Glu His Gin Ser 355 360 365 AGA CTA AAA GCG CTT TCT AAA ACC GTG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC 1152

Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe 370 375 380 CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC CAG ATT ATG AAC TGT TGA 1194

Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp Gin He Met Asn Cys * 385 390 395 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:29: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 398 aminozuren (B) TYPE: aminozuur 1007779 179 (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: eiwit (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:29:

Met Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val 15 10 15

Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Al a Asp Glu Asn Cys Cys 20 25 30

His Val Al a Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr 35 40 45

Leu Ala Phe I1e Phe Lys lie Pro Glu Leu I1e Thr Leu Tyr Gin Arg 50 55 60

His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val Val I1e Glu Asp Thr Leu Val 65 70 75 80 II e Leu Lys Leu Al a Asn IIe Cys Gly Lys Al a Cys Met Lys Leu Leu 85 90 95

Asp Arg Cys Lys Glu I1e IIe Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser 100 105 110

Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu 11e 11 e Asp Arg 115 120 125

Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser 130 135 140

Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp 11 e Glu Leu Val Lys Leu 145 150 155 160

Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His 165 170 175

Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys 180 185 190

Leu Asp Leu Al a Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val 195 200 205

Leu His Val Al a Ala Met Arg Lys Glu Pro Gin Leu IIe Leu Ser Leu 1 007779 180 210 215 220

Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr 225 230 ' Ala Leu Met He Ala Lys Gin Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn 245 lie Pro Glu Gin Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu 260

Iln , Λ11 p-. r-. p-ι . I vs Arg Glu Gin He Pro Arg Asp Val Pro lie Leu Glu Gin Glu Asp Ly3 285 275

Pro Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp 290 295 300

Leu Glu Asn Arg Val Ala LeU Ala Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala 305 310 13

Gin Ala Ala Met Glu lie Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe lie 325

Val Thr Ser Leu Glu Pro ASP Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser 340

Pro Gly Val Lys lie Ala Pro ^ Ar9 Ile Leu Glu G'“ His G,n Ser 355

Arg Leu Lys Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe 370 375 380

Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp Gin Ile Met Asn Cys * 385 390 395 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:30: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 786 baseparen (B) TYPE: nucleïnezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair

(ii) SOORT MOLECULE: cDNA

1007779 181 (ix) BIJZONDER ASPECT:

(A) NAAM/TEKEN: CDS

(B) PLAATS: 1..786 (D) VERDERE INFORMATIE: /product= "Gewijzigde vorm van NIM1" /noot= "Ankyrin gebieden van NIMl." (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID N0:30: ATG GAC TCC AAC AAC ACC GCC GCC GTG AAG CTC GAG CTT AAG GAG ATT 48

Met Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu lie 15 10 15 GCC AAG GAT TAC GAA GTC GGT TTC GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG GCT 96

Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala 20 25 30 TAT GTT TAC AGC AGC AGA GTG AGA CCG CCG CCT AAA GGA GTT TCT GAA 144

Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu 35 40 45 TGC GCA GAC GAG AAT TGC TGC CAC GTG GCT TGC CGG CCG GCG GTG GAT 192

Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp 50 55 60 TTC ATG TTG GAG GTT CTC TAT TTG GCT TTC ATC TTC AAG ATC CCT GAA 240

Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe He Phe Lys lie Pro Glu 65 70 75 80 TTA ATT ACT CTC TAT CAG AGG CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC AAA GTT 288

Leu He Thr Leu Tyr Gin Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val 85 90 95 GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC AAG CTT GCT AAT ATA TGT GGT 336

Val He Glu Asp Thr Leu Val He Leu Lys Leu Ala Asn He Cys Gly 100 105 110 AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG GAT AGA TGT AAA GAG ATT ATT GTC AAG 384

Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu He He Val Lys 115 120 125 TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG CTT 432

Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu 130 135 140 GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA CGT AAA GAG CTT GGT TTG GAG GTA CCT 480 1 007 779 182

Val Lys Glu IIe lie Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro 145 150 155 160 AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA CAT AAG GCA CTT GAC TCG GAT 528

Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp 165 170 175 GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG AAA GAG GAT CAC ACC AAT CTA 576

Asp IIe Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu 180 185 190 GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT GTT GCA TAT TGC AAT GTG AAG 624

Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys 195 200 205 ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT CTT GCC GAT GTC AAC CAT AGG 672

Thr Ala Thr Asp Leu L eu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg 210 215 220 AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT GTT GCT GCG ATG CGG AAG GAG 720

Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu 225 230 235 240 CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA AAA GGT GCA AGT GCA TCA GAA 768

Pro Gin Leu I1e Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu 245 250 255 GCA ACT TTG GAA GGT TGA 786

Ala Thr Leu Glu Gly * 260 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:31: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 262 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: eiwit (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:31:

Met Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu He 15 10 15 1 007779 183

Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala 20 25 30

Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu 35 40 45

Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp 50 55 60

Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe He Phe Lys lie Pro Glu 65 70 75 80

Leu lie Thr Leu Tyr Gin Arg His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val 85 90 95

Val He Glu Asp Thr Leu Val He Leu Lys Leu Ala Asn He Cys Gly 100 105 110

Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys Glu He He Val Lys 115 120 125

Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu 130 135 140

Val Lys Glu He He Asp Arg Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro 145 150 155 160

Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp 165 170 175

Asp lie Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu 180 185 190

Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys 195 200 205

Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg 210 215 220

Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu 225 230 235 240

Pro Gin Leu He Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu 245 250 255

Ala Thr Leu Glu Gly * 1007779 260 184 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:32: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 35 baseparen (B) TYPE: nuclei'nezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nucleinezuur (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:32: CAACAGCTTC GAAGCCGTCT TTGACGCGCC GGATG 35 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:33: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 35 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nuclelnezuur CA) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:33: CATCCGGCGC GTCAAAGACG GCTTCGAAGC TGTTG 35 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID N0:34: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 32 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nuclelnezuur 1007779 185 (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:34: GGAATTCAAT GGATTCGGTT GTGACTGTiT TG 32 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:35: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 28 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nucleinezuur (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:35: GGAATTCTAC AAATCTGTAT ACCATTGG 28 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID N0:36: (l) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 31 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nucleinezuur (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:36: CGGAATTCGA TCTCTTTAAT TTGTGAATTT C 31 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:37: 1007779 186 (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 29 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nucleinezuur (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:37: GGAATTCTCA ACAGTTCATA ATCTGGTCG 29 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:38: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 31 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nucl ei'nezuur (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NO:38: GGAATTCAAT GGACTCCAAC AACACCGCCG C 31 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:39: (i) SEQUENTIEKENMERKEN: (A) LENGTE: 33 baseparen (B) TYPE: nucleinezuur (C) STRENG: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) SOORT MOLECULE: ander nucleinezuur (A) BESCHRIJVING: /desc = "oligonucleotide" 1007779 187 (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID N0:39: GGAATTCTCA ACCTTCCAAA GTTGCTTCTG ATG 33 - 64 - 1007779

Claims (36)

1. DNA-molecuul, met het kenmerk, dat het codeert voor een gewijzigde vorm 5 van een NIM1-eiwit.

2. DNA-molecuul volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het werkzaam is als een dominant-negatieve regeling van de SAR-signaaltransductieroute.

3. DNA-molecuul volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gewijzigde vorm van het NIM1-eiwit alanineresten in plaats van serineresten heeft op de 10 aminozuurposities die overeenkomen met posities 55 en 59 van SEQ ID nr.: 3.

4. DNA-molecuul volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de gewijzigde vorm van het NIM1-eiwit de in SEQ ID nr.: 23 weergegeven aminozuursequentie omvat.

5. DNA-molecuul volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het DNA- 15 molecuul de in in SEQ ID nr.: 22 weergegeven nucleotidesequentie omvat, alsmede geheel DNA.

6. DNA-molecuul volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gewijzigde vorm van het NIM1-eiwit een afgeknotte versie van het MM7-genproduct is.

7. DNA-molecuul volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gewijzigde 20 vorm van het NIM1-eiwit een N-eindstandige afknotting van aminozuren heeft die bij benadering overeenkomt met aminozuurposities 1-125 van SEQ ID nr.: 3.

8. DNA-molecuul volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de gewijzigde vorm van het NIMl-eiwit de in SEQ ID nr.: 25 weergegeven aminozuursequentie omvat.

9. DNA-molecuul volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het DNA- molecuul de in SEQ ID nr.: 24 weergegeven nucleotidesequentie omvat.

10. DNA-molecuul volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gewijzigde vorm van het NIMl-eiwit een C-eindstandige afknotting van aminozuren heeft die bij benadering overeenkomt met aminozuurposities 522-593 van SEQ ID nr.: 3.

11. DNA-molecuul volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de gewijzigde vorm van het NIMl-eiwit de in SEQ ID nr.: 27 weergegeven aminozuursequentie omvat.

12. DNA-molecuul volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het DNA- 1 007779"» molecuul de in SEQ ID nr.: 26 weergegeven nucleotidesequentie omvat.

13. DNA-molecuul volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gewijzigde vorm van het NIM1-eiwit een N-eindstandige afknotting van aminozuren heeft die bij benadering overeenkomt met aminozuurposities 1-125 van SEQ ID nr.: 2 en een C- 5 eindstandige afknotting van aminozuren heeft die bij benadering overeenkomt met aminozuurposities 522-593 van SEQ ID nr.: 3.

14. DNA-molecuul volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de gewijzigde vorm van het NIM1-eiwit de in SEQ ID nr.: 29 weergegeven aminozuursequentie omvat.

15. DNA-molecuul volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat het DNA- molecuul de in SEQ ID nr.: 28 weergegeven nucleotidesequentie omvat.

16. DNA-molecuul volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gewijzigde vorm van het NIM1-eiwit in wezen uit ankyrinmotieven bestaat die bij benadering overeenkomen met aminozuurposities 103-362 van SEQ ID nr.: 3.

17. DNA-molecuul volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat de gewijzigde vorm van het NIM1-eiwit de in SEQ ID nr.: 31 weergegeven aminozuursequentie omvat.

18. DNA-molecuul volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat het DNA-molecuul de in SEQ ID nr.: 30 weergegeven nucleotidesequentie omvat.

19. DNA-molecuul volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het DNA- molecuul onder de volgende omstandigheden hybridiseert met een nucleotidesequentie die is gekozen uit de groep bestaande uit SEQ ID nr.: 22, SEQ ID nr.: 24, SEQ ID nr.: 26, SEQ ID nr.: 28 en SEQ ID nr.: 30: hybridisatie in 1% BSA; 520 mM NaP04, pH 7,2; 7% laurylsulfaat, 25 natriumzout; 1 mM EDTA; 250 mM natriumchloride bij 55°C gedurende 18-24 uur, en wassen in 6XSSC gedurende 15 minuten (X3) 3XSSC gedurende 15 minuten (XI) bij 55°C.

20. Chimeer gen, met het kenmerk, dat het een in planten werkzame promotor omvat die op werkzame wijze is verbonden met een DNA-molecuul volgens een der 30 conclusies 1-19.

21. Recombinante vector, met het kenmerk, dat deze een chimeer gen volgens conclusie 20 omvat, waarbij de vector op stabiele wijze tot in een gastheercel getransformeerd kan worden. - - <

22. Werkwijze voor het activeren van SAR in een plant, met het kenmerk, dat de plant wordt getransformeerd met een recombinante vector volgens conclusie 21, waarbij een gewijzigde vorm van het NIM1 -eiwit in de getransformeerde plant tot expressie wordt gebracht en SAR in deze plant activeert.

23. Werkwijze voor het verlenen van ziekteresistentie met een breed werkingsspectrum aan een plant, met het kenmerk, dat de plant wordt getransformeerd met een recombinante vector volgens conclusie 21, waarbij een gewijzigde vorm van het NIM1-eiwit in de getransformeerde plant tot expressie wordt gebracht en ziekteresistentie met een breed werkingsspectrum aan deze plant 10 verleent.

24. Werkwijze voor het verlenen van een CIM-fenotype aan een plant, met het kenmerk, dat de plant wordt getransformeerd met een recombinante vector volgens conclusie 21, waarbij een gewijzigde vorm van het NIM1-eiwit in de getransformeerde plant tot expressie wordt gebracht en een CIM-fenotype aan de 15 plant verleent.

25. Gastheercel, met het kenmerk, dat deze op stabiele wijze is getransformeerd met een vector volgens conclusie 21.

26. Gastheercel volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat deze cel een plantencel is.

27. Plant, plantencellen of de nakomelingen hiervan, met het kenmerk, dat deze een chimeer gen volgens conclusie 20 omvatten en ziekteresistentie met een breed werkingsspectrum vertonen.

28. Plant, plantencellen of de nakomelingen hiervan, met het kenmerk, dat een NIM1-eiwit dat betrokken is bij de signaaltransductiecascade die leidt tot systemisch 25 verworven resistentie in planten, in de getransformeerde plant tot expressie wordt gebracht bij hogere niveaus dan in een wild-type plant.

29. Plant, plantencellen of de nakomelingen hiervan volgens conclusie 27 of 28, met het kenmerk, dat de plant wordt gekozen uit de groep omvattende gymnospermen, monocotyle planten en dicotyle planten.

30. Plant, plantencellen of de nakomelingen hiervan volgens conclusie 27 of 28, met het kenmerk, dat de plant een gewasplant is.

31. Plant, plantencellen of de nakomelingen hiervan volgens conclusie 27 of 28, met het kenmerk, dat de plant wordt gekozen uit de reeks omvattende rijst, tarwe, 1007779^ gerst, rogge, mais, aardappel, wortel, zoete aardappel, suikerbiet, bonen, doperwten, chicorei, sla, kool, bloemkool, broccoli, raap, radijs, spinazie, asperge, ui, knoflook, eierplant, peper, selderij, wortel, pompoen, in het bijzonder Cucurbita pepo, zucchini, komkommer, appel, peer, kweepeer, meloen, pruim, kers, perzik, nectarine, abrikoos, 5 aardbei, druif, framboos, ananas, avocado, papaya, mango, banaan, soja, tabak, tomaat, sorghum of suikerriet.

32. Werkwijze voor het verlenen van een CIM-fenotype aan een plantencel, een plant of de nakomelingen hiervan, met het kenmerk, dat de plant wordt getransformeerd met een recombinante vector die een chimeer gen omvat, welk gen 10 een in planten werkzame promotor omvat die op werkzame wijze is gekoppeld aan een DNA-molecuul dat codeert voor een NIM1-eiwit dat betrokken is bij de signaaltransductiecascade die leidt tot systemisch verworven resistentie in planten, waarbij de vector op stabiele wijze tot in een gastheer getransformeerd kan worden, en waarbij het NIM1-eiwit in de getransformeerde plant tot expressie wordt gebracht 15 bij hogere niveaus dan in een wild-type plant.

33, Werkwijze voor het activeren van systemisch verworven resistentie in een een plantencel, een plant of de nakomelingen hiervan, gekenmerkt doordat de plant wordt getransformeerd met een recombinante vector die een chimeer gen omvat, welk gen een in planten werkzame promotor omvat die op werkzame wijze is verbonden 20 met een DNA-molecuul dat codeert voor een NIM1 -eiwit dat betrokken is bij de signaaltransductiecascade die leidt tot systemisch verworven resistentie in planten, waarbij de vector op stabiele wijze tot in de gastheer getransformeerd kan worden, en waarbij het NIM1-eiwit in de getransformeerde plant tot expressie wordt gebracht bij hogere niveaus dan in een wild-type plant.

34. Werkwijze voor het verlenen van ziekteresistentie met een breed werkingsspectrum aan een plantencel, een plant of de nakomelingen hiervan, met het kenmerk, dat de plant wordt getransformeerd met een recombinante vector die een chimeer gen omvat, welk gen een in planten werkzame promotor omvat die op werkzame wijze is verbonden met een DNA-molecuul dat codeert voor een NIM1- 30 eiwit dat betrokken is bij de signaaltransductiecascade die leidt tot systemisch verworven resistentie in planten, waarbij de vector op stabiele wijze tot in een gastheer getransformeerd kan worden, en waarbij het NIM1-eiwit in de getransformeerde plant tot expressie wordt gebracht bij hogere niveaus dan in een HjQT7?sn wild-type plant.

35. Toepassing van een transgene plant of de nakomelingen hiervan in een landbouwkundige werkwijze, waarbij de plant een chimeer gen volgens conclusie 20 omvat.

36. Voor handelsdoeleinden geschikte houder, omvattende zaad van een transgene plant die tenminste een gewijzigde vorm van een NIM1 -eiwit omvat of een NIM1 -eiwit omvat dat in deze getransformeerde plant bij hogere niveaus tot expressie wordt gebracht dan in een wild-type planten, in een hoeveelheid die voldoende is om werkzaam te zijn als een dominant-negatieve regeling van de SAR-10 signaaltransductieroute; samen met een geschikte drager en samen met op de etikettering aangebrachte instructies voor het gebruik hiervan voor het verlenen van ziekteresistentie met een breed werkingsspectrum aan planten. *** J U l' ' ‘