CN1954075B - 可诱导启动子 - Google Patents

Abstract

拟南芥NI16是在酵母双杂交筛选中通过它与NIM1蛋白质的相互作用而分离得到的，且编码在植物中参与SAR基因调控的一种蛋白质。NI16在经过苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)处理的过量表达NTM1的植株中受到强烈诱导。本文公开了拟南芥NI16启动子的核酸序列。

Description

可诱导启动子

发明领域

本发明涉及植物的广谱疾病抗性，包括系统获得性抗性(SAR)现象。更具体的说，本发明涉及编码在植物中参与SAR基因表达调控的蛋白质的基因的鉴定、分离、和表征。

发明背景

植物经常受到极其多种致病性生物体的挑战，包括病毒、细菌、真菌、和线虫。农作物特别易受攻击，因为它们通常是作为遗传统一的单作物而种植的；当疾病攻击时，损失可能是惨重的。然而，大多数植物具有其自身天生的针对致病性生物体的防御机制。植物育种家和病理学家已经鉴定了植物病原体抗性的天然变异，并培育到许多农作物中。这些天然疾病抗性基因常常针对病原体提供高水平的抵抗力或免疫性。

系统获得性抗性(SAR)是植物用于防御病原体的复杂系统的一种成分(Hunt和Ryals，1996；Ryals等人，1996)。还可参阅美国专利号5,614,395。SAR是植物-病原体应答的一个特别重要方面，因为其是病原体可诱导的、针对广谱传染因子(包括病毒、细菌、和真菌)的系统抗性。当SAR信号转导途径遭到阻断时，植物变得更加易受通常引起疾病的病原体的影响，而且它们还变得易受通常不会引起疾病的一些传染因子的影响。(Gaffney等人，1993；De l aney等人，1994；Delaney等人，1995；Delaney，1997；Bi等人，1995；Mauch-Mani和Slusarenko，1996)。这些观察结果指示SAR信号转导途径对维持植物健康是至关重要的。

在概念上，SAR应答可分成两个阶段。在起动阶段，病原体感染受到识别，并释放出信号，它经过韧皮部到达远端组织。靶细胞感受到该系统信号，通过表达SAR基因和疾病抗性二者做出反应。SAR的维持阶段指数周至植物整个寿命的一段时间，在此期间植物处于准稳定状态，且疾病抗性得到维持(Ryals等人，1996)。

水杨酸(SA)积累似乎是SAR信号转导所必需的。由于特定移植物的处理、苯丙氨酸氨裂合酶的后生性(e pigenetic)遏制、或特异降解SA的水杨酸羟化酶的转基因表达而不能积累SA的植物，也不能诱导SAR基因表达或疾病抗性(Ga ffney等人，1993；Delaney等人，1994；Mauch-Mani和Slusarenko，1996；Maher等人，1994；Pallas等人，1996)。尽管有人提出SA可能担当系统信号，然而目前仍有争议，而且至今确凿知道的也就是如果SA不能积累，那么SAR信号转导遭到阻断(Pallas等人，1996；Shulaev等人，1995；Vernooij等人，1994)。

最近，拟南芥成为了研究SAR的模式系统(Ukne s等人，1992；Uknes等人，1993；Cameron等人，1994；Mauch-Mani和Slusarenko，1994；Dempsey和K1essig，1995)。已经证明可在拟南芥中由病原体和化学品二者激活SAR，诸如SA、2，6-二氯异烟酸(INA)和苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)(Uknes等人，1992；Vernooij等人，1995；Lawton等人，1996)。在用I NA或BTH处理或者病原体感染后，至少三种发病机理相关(PR)蛋白质基因，即PR-1、PR-2、和PR-5，伴随着抗性发动受到并列诱导(Ukne s等人，1992，1993)。在烟草这种得到最佳表征的物种中，病原体或免疫化合物的处理诱导至少九组基因的表达(Ward等人，1991)。通过用各种SAR基因转化植物已经育成了转基因疾病抗性植物(美国专利号5,614,395)。

已经分离了具有改良SAR信号转导的许多拟南芥突变株(Delaney，1997)。这些突变株中首先是所谓的1sd(模拟疾病的损害)突变株和acd2(细胞死亡加速)(Dietrich等人，1994；Greenberg等人，1994)。这些突变株都具有叶上某种程度的自发坏死损害形成、SA水平升高、SAR基因的mRNA积累、和疾病抗性显著增强。已经分离并鉴定了至少七种不同1sd突变株(Dietrich等人，1994；Weymann等人，1995)。另一类有趣的突变株是cim(组成性免疫性)突变株(Lawt on等人，1993)。还可参阅美国专利号5,792,904和国际PCT申请WO 94/16077。就像1sd突变株和acd2，cim突变株具有升高的SA和SAR基因表达和抗性，但是与1sd或acd2不同，它们在叶上不展示可发觉的损害。cpr1(PR基因的组成性表达株)可能是cim突变株的一种类型；然而，因为没有排除cpr1叶上显微镜可见损害的存在，cpr1可能是1sd突变株的一种类型(Bowling等人，1994)。

还分离了SAR信号遭到阻断的突变株。ndr1(非种特异疾病抗性)是容许含有各种无毒基因的丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)和寄生霜霉(Peronospora parasitica)的通常无毒隔离群二者生长的突变株(Century等人，1995)。显然，这种突变株在SAR信号的早期遭到阻断。npr1(PR基因的不表达株)是在INA处理后不诱导SAR信号途径表达的突变株(Cao等人，1994)。根据其在低细菌浓度接种后支持细菌感染的能力分离了eds(疾病易感性增强)突变株(Glazebrook等人，1996；Parker等人，1996)。某些eds突变株在表型上与nprl非常相似，而且最近证明eds5和eds53是npr1的等位基因(Glazebrook等人，1996)。nim1(非可诱导免疫性)是在INA处理后支持寄生霜霉(即引起霜霉病的媒介)生长的突变株(Delaney等人，1995；美国专利号5,792,904)。尽管nim1能够在病原体感染后积累SA，然而它不能诱导SAR基因表达或疾病抗性，说明突变阻断了SA下游的途径。nim1应答INA或BTH的能力也受到了削弱，说明阻断位于这些化学品的作用下游(Delaney等人，1995；Lawton等人，1996)。

已经分离并鉴定了分别负责nim1和npr1表型的拟南芥等位基因(Rya1s等人，1997；Cao等人，1997)。野生型NIM1基因产物在拟南芥中参与导致SAR和基因-对-基因(gene-for-gene)疾病抗性二者的信号转导级联反应(Ryals等人，1997)。Rya1s等人，1997还报道了nim1的五种其它等位基因，它们显示变化很大的表型，由化学诱导的PR-1基因表达和真菌抗性遭到微弱削弱至非常强烈的阻断。将野生型NPR1基因转化到npr1突变株中不仅补足突变，恢复SAR诱导在PR基因表达和疾病抗性方面的响应性，而且使得转基因植株在缺乏SAR诱导时对丁香假单胞菌的感染更有抗性(Cao等人，1997)。WO 98/06748描述了由拟南芥分离NPR1和由粘性烟草(Nicotianaglutinosa)分离同系物。还可参阅WO 97/49822、WO 98/26082、和WO 98/29537。

尽管进行了许多研究并采用了尖端且精细的农作物保护措施，包括植物的基因转化，由于疾病造成的损失仍然保持每年数十亿美元。因此，持续需要根据对植物中疾病抗性的遗传基础的不断增长的理解来开发新的农作物保护措施。具体而言，长期需要鉴定、分离、和表征在植物中参与导致系统获得性抗性的信号转导级联反应的更多基因。

发明概述

本发明着手解决上述长期需要，方法是在双杂交筛选中使用拟南芥NIM1基因作为饵以鉴定与NIM1蛋白质相互作用的植物蛋白质。通过这种筛选可获得新的NI16和NI19基因。通过来自其它植物诸如马铃薯和番茄的总细胞DNA的PCR扩增可获得NI16基因的同系物。NI16基因在用水杨酸(SA)和苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)处理以及接种病原体后受到快速诱导。NI16基因还在经过BTH处理的过量表达NIM1的植物中受到诱导。NI16基因的转基因表达导致发病机理相关(PR)蛋白质PR-1的水平升高。诱导的PR-1量与存在的NI16量有关，即具有最高NI16表达的转基因植株具有最高PR-1水平。认为NI16是SAR应答的必需成分，而且NI16的过量表达激活应答的子集。PR-1在过量表达NI16的nahG和nim1-1植株中也得到升高，这是重要的，因为nim1和nahG两种植株其应答病原体而诱导PR-1的能力通常都是缺陷的。由此，NI16基因编码在植物中参与SAR基因表达调控的蛋白质。NI16基因可在转基因植物中表达，或是单独的或是联合NIM1蛋白质，以增强SAR基因诸如PR-1的表达。

具体而言，本发明致力于包含编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：23之氨基酸序列的序列的分离的核酸分子。

本发明还致力于包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：22之编码区的分离的核酸分子。

本发明还致力于包含编码在植物中参与导致系统获得性抗性的信号转导级联反应的蛋白质的序列的分离的核酸分子，其中所述序列包含20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸区段，其在序列上与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、或SEQ ID NO：22之编码区的相应的连续的20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸区段相同。

本发明还致力于包含编码在植物中参与导致系统获得性抗性的信号转导级联反应的蛋白质的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列可用SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示引物通过聚合酶链式反应由来自植物的总细胞DNA进行鉴定。

本发明还涵盖包含与本发明的编码序列可操作连接的在植物中有活性的启动子的嵌合基因、包含这样的嵌合基因的重组载体，其中该载体能够稳定转化到宿主中、以及用这样的载体稳定转化的宿主。优选的是，所述宿主是植物，诸如下列农业重要农作物之一：稻、小麦、大麦、黑麦、油菜、玉米、马铃薯、胡萝卜、甘薯、甜菜、蚕豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、辣椒、芹菜、西葫芦、南瓜、黄瓜、苹果、梨、榅桲、甜瓜、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱、和甘蔗。

另一方面，本发明提供了NI16启动子的核酸序列。在一个实施方案中，NI16启动子包含SEQ ID NO：24(962bp)。在另一个实施方案中，NI16启动子包含SEQ ID NO：24的片段。例示性的SEQ ID NO：24片段包括但不限于SEQ ID NO：3核苷酸编号863上游的区域(即SEQ IDNO：25)、SEQ ID NO：26(274bp)、和SEQ ID NO：27(544bp)。在另一个实施方案中，NI16启动子包含SEQ ID NO：28(274bp)。

另外本发明涵盖包含与目的基因的编码序列可操作连接的NI16启动子或其片段的嵌合基因，其中所述NI16启动子或其片段在存在化学调节物时调控所述编码序列的转录。在一个优选的实施方案中，所述编码序列编码酶，诸如可测定标志物，由此可在嵌合基因的化学诱导的测定法中观察标志物的表达。在相关方面，本发明还体现为包含上述嵌合基因的重组载体，诸如质粒，以及用这样的嵌合基因稳定转化的植物或植物组织。

序列表中序列的简述

SEQ I D NO：1-拟南芥(Ara bidopsis tha liana)NI16基因的全长

              cDNA序列。

SEQ ID NO：2-由SEQ ID NO：1编码的NI16蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3-拟南芥NI16基因区的基因组DNA序列，包括5＇上

              游启动子序列。

SEQ ID NO：4-马铃薯NI16同系物的全长cDNA序列。

SEQ ID NO：5-由SEQ ID NO：4编码的马铃薯NI16的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6-番茄NI16同系物的部分cDNA序列。

SEQ ID NO：7-由SEQ ID NO：6编码的番茄NI16的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8-由大豆EST AI 495102编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9-由大豆EST AI 461039编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10-由烟草G8-1基因编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11-引物NIM5＇RI。

SEQ ID NO：12-引物NIM 3＇SalI。

SEQ ID NO：13-引物NIMt runc 3＇NcoI。

SEQ ID NO：14-引物NIM1oop 5＇RI。

SEQ ID NO：15-引物16GSP1。

SEQ ID NO：16-引物16GSP2。

SEQ ID NO：17-引物16GSP3。

SEQ ID NO：18-引物16F。

SEQ ID NO：19-引物16R。

SEQ ID NO：20-引物NI16-DegF。

SEQ ID NO：21-引物NI16-DegR。

SEQ ID NO：22-拟南芥NI19基因的基因组序列。

SEQ ID NO：23-由SEQ ID NO：22编码的NI 19蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24-NI16(962bp)启动子序列。

SEQ ID NO：25-NI16(862bp)启动子序列。

SEQ ID NO：26-NI16(274bp)启动子序列。

SEQ ID NO：27-NI16(544bp)启动子序列。

SEQ ID NO：28-NI16(274bp)启动子序列。

SEQ ID NO：29-编码含内含子序列的GUS报道基因的DNA序列(即

              GIG)。

SEQ ID NO：30-AtPR1启动子。

SEQ ID NO：31-SMAS启动子。

定义

在描述本发明时将使用下列术语，意图将它们定义如下。

相关/可操作连接：指两种DNA序列在物理上或在功能上相关。例如，如果启动子或调控DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列可操作连接，或者这两种序列的位置使得调控DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达，则说它们“相关”。

嵌合基因：这样的重组DNA序列，其中启动子或调控DNA序列与编码mRNA或表达成蛋白质的DNA序列可操作连接或相关，使得调控DNA序列能够调控相关DNA序列的转录或表达。正如在自然界中所发现的，所述嵌合基因的调控DNA序列通常不与所述相关DNA序列可操作连接。

编码序列：转录成RNA诸如mRNA、rRNA、t RNA、s nRNA、有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选的是，RNA继而在生物体中翻译而生成蛋白质。

互补：指包含这样的反向平行核苷酸序列的两种核苷酸序列，即能够在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键的基础上彼此配对。

表达：指植物中内源基因或转基因的转录和/或翻译。例如，在反义构建物的情况中，表达可仅指反义DNA的转录。

表达盒：包含与目的核苷酸序列可操作连接的启动子、能够在适当宿主细胞中指导特定核苷酸序列表达的核酸序列，所述核苷酸序列又与终止信号可操作连接。它通常还包含核苷酸序列正确翻译所必需的序列。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，即其至少一种成分对其至少一种其它成分而言是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但是以可用于异源表达的重组形式获得。然而，表达盒对宿主而言通常是异源的，即表达盒的特定核酸序列不在宿主细胞中天然存在，必须通过转化时间导入宿主细胞或宿主细胞的祖先。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成性启动子或可诱导启动子的控制之下，其中可诱导启动子只在宿主细胞暴露于有些特定外部刺激物时起动转录。在多细胞生物体的情况中，诸如植物，启动子还可以是对特定组织、或其它、或发育阶段特异的。

基因：位于基因组内且除上述编码核酸序列以外包含负责控制编码区段的表达即转录和翻译的其它(主要是调控)核酸序列的限定区域。基因还可包含其它5＇和3＇非翻译序列和终止序列。可存在的其它元件有例如内含子。

异源DNA序列：术语“异源DNA序列”、“外源DNA区段”或“异源核酸”在用于本文时都指源自对特定宿主细胞而言是外来的来源的序列，或者如果来自相同来源，那么由其最初的形式进行了修饰。由此，宿主细胞中的异源基因包括对特定宿主细胞而言是内源的但通过例如使用DNA改组进行了修饰的基因。该术语还包括天然存在DNA序列的非天然存在多拷贝。由此，该术语指对细胞而言是外来的或异源的DNA区段，或者对细胞而言是同源的但位于宿主细胞核酸内通常不会发现该元件的位置。外源DNA区段表达而生成外源多肽。

同源DNA序列：与它所导入的宿主细胞天然相关的DNA序列。

同类编码：当核酸序列编码的多肽与参考核酸序列编码的多肽具有相同的氨基酸序列时，核酸序列与参考核酸序列同类编码。

分离的：在本发明的内容中，分离的核酸分子或分离的酶指经过人工离开其天然环境存在且因此不是天然产物的核酸分子或酶。分离的核酸分子或酶可以纯化形式存在，或者可在非天然环境中存在，诸如例如重组宿主细胞。

最小启动子：在缺乏上游激活时没有活性或启动子活性大大降低的启动子元件，特别是TATA元件。在存在合适转录因子时，最小启动子行使功能而容许转录。

天然的：指存在于未转化细胞的基因组中的基因。

天然存在的：术语“天然存在的”用于描述可在自然界中发现的、与人类人工生成的截然不同的对象。例如，可由自然界中的来源分离的且未经人类在实验室中刻意修饰的生物体(包括病毒)中存在的蛋白质或核苷酸序列就是天然存在的。

NI16：与NIM1蛋白质相互作用的参与SAR信号转导级联反应的基因。

NIM1：Ryals等人，1997中描述的参与SAR信号转导级联反应的基因。

NIM1：由NIM1基因编码的蛋白质。

核酸：术语“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非有明确限制，该术语涵盖含有天然核苷酸的已知同系物的核酸，它们具有与参考核酸相似的结合特性且以与天然存在核苷酸相似的方式进行代谢。除非另有说明，特定核酸序列还隐含其保守修饰变体(如简并密码子替代)和互补序列以及明示的序列。具体而言，简并密码子替代可通过生成这样的序列来实现，即其中一个或多个选定的(或所有)密码子的第三个位置用混和碱基和/或脱氧肌苷残基替代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081，1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260∶2605-2608，1985；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98，1994)。术语“核酸”或“核酸序列”还可与基因、cDNA、和由基因编码的mRNA互换使用。在本发明的内容中，核酸分子优选是DNA区段。核苷酸通过它们的碱基以下列标准缩写表示：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、和鸟嘌呤(G)。

ORF：开放读码框。

植物：任何完整植株。

植物细胞：植物的结构生理学单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离单细胞或培养细胞的形式，或者作为更高组织单位诸如例如植物组织、植物器官、或完整植株的一部分。

植物细胞培养物：植物单位诸如例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和各个发育阶段的胚的培养物。

植物材料：指叶、茎干、根、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物、或植物的任何其它部分或产物。

植物器官：植物的清楚的且明显的有结构且已分化部分，诸如根、茎干、叶、花芽、或胚。

植物组织：组织成结构和功能单位的一群植物细胞。包括植物中或培养中的任何植物组织。该术语包括但不限于完整植株、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何细胞群。该术语联合或缺乏上文所列或此定义以其它方式包含的任何具体植物组织类型的使用并非意图排除任何其它植物组织类型。

启动子：编码区上游的非翻译DNA序列，包含RNA聚合酶II的结合位点并起动DNA的转录。启动子区还可包含担当基因表达调控物的其它元件。

原生质体：没有细胞壁或只有部分细胞壁的分离植物细胞。

纯化的：术语“纯化的”在用于核酸或蛋白质时，指核酸或蛋白质本质上不含在天然状态与其相关的其它细胞成分。优选处于同质状态，尽管它可以是干的或含水的溶液。纯度和同质性通常使用分析化学技术来测定，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层析。作为制品中的主要物质存在的蛋白质是基本上纯化的。术语“纯化的”指核酸或蛋白质在电泳凝胶中本质上产生一条带。一般而言，这意味着核酸或蛋白质是至少约50％纯的，更优选至少约85％纯的，且最优选至少约99％纯的。

重组DNA分子：使用重组DNA技术连接在一起的DNA分子组合。

调控元件：参与控制核苷酸序列表达的序列。调控元件包括与目的核苷酸序列可操作连接的启动子和终止信号。它们还通常包括核苷酸序列正确翻译所必需的序列。

可选择标记基因：其在植物细胞中的表达给予细胞以选择优势的基因。用可选择标记基因转化的细胞所拥有的选择优势可归于它们在存在负选择剂诸如抗生素或除草剂时与未转化细胞的生长相比的生长能力。转化细胞与未转化细胞相比的选择优势还可归于它们利用添加的化合物作为营养物、生长因子、或能源的增强的或全新的能力。选择标记基因还指其在植物细胞中的表达给予细胞以消极和积极两种选择优势的基因或基因组合。

显著提高：酶活性的提高大于测量技术内在误差的极限，优选提高存在抑制物时野生型酶的活性的约2倍或更多，更优选提高约5倍或更多，且最优选提高约10倍或更多。

术语“同一的”或百分比“同一性”在两种或多种核酸或蛋白质序列的语境中指根据使用下列序列比较算法之一的测量或通过目测检查，两种或多种序列或子序列在进行最大对应的比较和比对后相同或指定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同。

基本上同一的：短语“基本上同一的”在两种核酸或蛋白质序列的语境中指根据使用下列序列比较算法之一的测量或通过目测检查，两种或多种序列或子序列在进行最大对应的比较和比对后具有至少60％、优选80％、更优选90-95％、且最优选至少99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。

优选的是，基本同一性存在于长度为至少约50个残基的序列区域上，更优选在至少约100个残基的区域上，且最优选的是序列在至少约150个残基的长度上是基本上同一的。在一个最优选的实施方案中，序列在编码区的整个长度上是基本上同一的。此外，基本上同一的核酸或蛋白质序列基本上执行相同的功能。

对于序列比较，通常以一种序列充当测试序列与其进行比较的参考序列。在使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，根据需要指定子序列坐标，并指定序列比对程序参数。然后序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列对参考序列的百分比序列同一性。

用于比较的序列最佳比对可通过例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2∶482，1981的局部同源性算法)、Needleman和Wunsch，J.Mol.Bio1.48∶443,1970的同源性比对算法、Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988的搜索相似性法、这些算法的计算机化执行程序(威斯康星遗传学软件包WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575ScienceDr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)、或目测检查(一般参阅Ausubel等人，见下文)来进行。

适于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一种实例是BLAST算法，它描述于Altschul等人，J.Mo l.Bio1.215：403-410，1990。用于进行BLAST分析的软件公众可通过国家生物技术信息中心(National  Center for Biotechnology Information，htt p:∥www.ncb i.nlm.nih.gov/)获得。

该算法包括首先通过在检索序列(query sequence)中鉴定长度为W的、在与数据库序列中相同长度的词比对时或是匹配或是满足有些正面估值(positive-valued)阈得分T的短词来鉴定高得分序列对(HSP)。T称为邻词得分阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul等人，1990)。

这些初步邻词采样充当起动搜索的种子以寻找包含它们的更长HSP。然后将词采样沿着每个序列相两个方向延伸，直至累积比对得分增加。对于核苷酸序列，累积得分是使用参数M(一对匹配残基的奖分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算的。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当累积比对得分由其最大实现值下降数量X，因一个或多个负面-得分残基比对的累积而累积得分达到零或以下，或者到达任一序列的末端时，停止每个反向的词延伸。BLAST算法参数W、T、和X决定了算法的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用词长(W)＝11、期望值(E)＝10、截止值＝100、M＝5、N＝-4、和比较两条链作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用词长(W)＝3、期望值(E)＝10、和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参阅Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)。

除了计算百分比序列同一性以外，BLAST算法还进行两种序列之间相似性的统计学分析(参阅如Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787，1993)。由BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小和概率(P(N))，它提供了两种核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指标。例如，如果测试核酸序列与参考核酸序列的比较中的最小和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，且最优选小于约0.001，那么认为测试核酸序列与参考序列相似。

两种核酸序列基本上同一的另一种指标是两种分子在严谨条件下彼此发生杂交。短语“特异杂交”指在严谨条件下分子只与复杂混合物(如总细胞DNA或RNA)中存在的特定核苷酸序列发生结合、形成双链(duplexing)、或杂交。“结合”指探针核酸与靶核酸之间的互补杂交，且包括通过降低杂交介质的严谨度可容纳的微小错配，以实现靶核酸序列的期望检测。

“严谨杂交条件”和“严谨杂交清洗条件”在核酸杂交实验诸如Southern和Northern杂交的语境中是随序列而决定的，而且在不同的环境参数下是不同的。较长序列在较高温度发生特异杂交。关于核酸杂交的广泛指导可参阅Tijssen，1993，《Laboratory TechniquesinBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes》，第1部分，第2章，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleicacid probe assays”，Elsevier，New York。一般而言，高严谨杂交和清洗条件选择为比特定序列在限定离子强度和pH的热熔点(Tm)低约5℃。通常，在“严谨条件”下，探针将与其靶子序列发生杂交，但与其它序列不发生杂交。

Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针发生杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。对特定探针选择恰好与Tm相等的严谨条件。具有超过100个互补碱基的互补核酸在滤膜上在Southern或Northern印迹中发生杂交的严谨杂交条件的实例是42℃的含1mg肝素的50％甲酰胺，并将杂交进行过夜。高严谨度清洗条件的实例是用72℃的0.15M NaCl清洗约15分钟。严谨清洗条件的实例是用65℃的0.2x SSC清洗15分钟(关于SSC缓冲液的描述可参阅Sambrook，见下文)。通常，在高严谨度清洗之前进行低严谨度清洗以清除背景探针信号。例如超过100个核苷酸的双链体的中等严谨度清洗的实例是用45℃的1x SSC清洗15分钟。例如超过100个核苷酸的双链体的低严谨度清洗的实例是用40℃的4-6xSSC清洗15分钟。对于较短探针(如约10至50个核苷酸)，严谨条件通常包括盐浓度低于约1.0M Na离子，通常是约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，pH 7.0至8.3，而且温度通常是至少约30℃。严谨条件还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。一般而言，比用无关探针在特定杂交测定法中观察到的信噪比高2倍(或更高)指示特异杂交的检测。如果它们编码的蛋白质是基本上同一的，那么在严谨条件下彼此不发生杂交的核酸仍然是基本上同一的。这发生在例如使用遗传密码容许的最大密码子简并性创建核酸拷贝时。

下面是可用于克隆与本发明的参考核苷酸序列基本上同一的同源核苷酸序列的杂交/清洗条件组的实例：优选的是，参考核苷酸序列与参考核苷酸序列在50℃的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mMEDTA中杂交，并在50℃的2X SSC、0.1％SDS中清洗；更希望在50℃的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中杂交，并在50℃的1X SSC、0.1％SDS中清洗；仍然更希望在50℃的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中杂交，并在50℃的0.5X SSC、0.1％SDS中清洗；优选在50℃的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mMEDTA中杂交，并在50℃的0.1X SSC、0.1％SDS中清洗；更优选在50℃的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中清洗，并在65℃的0.1X SSC、0.1％SDS中清洗。

两种核酸序列或蛋白质基本上同一的另一种指标是由第一种核酸编码的蛋白质与由第二种核酸编码的蛋白质具有免疫学交叉反应性或特异结合。由此，例如在两种蛋白质只因保守替代而不同时，这两种蛋白质通常是基本上同一的。

短语“特异性(或选择性)结合于抗体”或“特异性(或选择性)免疫反应性”在提及蛋白质或肽时，指存在蛋白质和其它生物制品异质群时对存在特定蛋白质具有决定性的结合反应。由此，在指定的免疫测定条件下，指定抗体结合特定蛋白质且不以显著量结合样品中存在的其它蛋白质。在这样的条件下与抗体特异结合可能需要根据其对特定蛋白质的特异性而选择的抗体。例如，可选择针对具有由本发明任何核酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质制备的抗体来获得对该蛋白质而非其它蛋白质除了多态变体具有特异性免疫反应性的抗体。多种免疫测定法形式可用于选择对特定蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法、Western印迹、或免疫组织化学常规用于选择对蛋白质具有特异性免疫反应性的单克隆抗体。关于可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定法形式和条件的描述可参阅Harlow和Lane，1988，《Antibodies，ALaboratory Manual》，ColdSpring Harbor Publications，New York，“Harlow and Lane”。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪音的至少两倍，且更常见的是大于背景的10至100倍。

特定核酸序列的“保守修饰变异”指编码同一的或本质上同一的氨基酸序列的那些核酸序列，或者其中核酸序列不编码本质上同一的氨基酸序列。因为遗传密码的简并性，许许多多功能同一的核酸编码任何特定多肽。例如，密码子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、和AGG都编码氨基酸精氨酸。由此，在由密码子指定为精氨酸的每一个位置，该密码子可改变成所述任何相应密码子而不会改变所编码的蛋白质。这样的核酸变异就是“沉默变异”，它是“保守修饰变异”的一种。本文描述的编码蛋白质的每一种核酸序列也包括任何可能的沉默变异，除非另有注解。技术人员将认识到，核酸中的每一个密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子ATG)都可通过标准技术进行修饰而生成功能同一分子。因此，编码蛋白质的核酸的每一种“沉默变异”隐含在每一种所述序列中。

此外，技术人员将认识到在所编码序列中改变、删除或添加单个氨基酸或较小百分比氨基酸(通常小于5％，更常见的是小于1％)的个别替代、删除或添加是“保守修饰变异”，其中改变导致用化学相似氨基酸替代原有氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守替代表是本领域众所周知的。下面的五组各自含有互为保守替代的氨基酸：脂肪族，甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳香族，苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫，甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性，精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性，天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。还可参阅Creighton，1984，《Proteins》，W.H.Freeman and Company。另外，在所编码序列中改变、删除或添加单个氨基酸或较小百分比氨基酸的个别替代、删除或添加也是“保守修饰变异”。

“子序列”指分别包含更长核酸或氨基酸(如蛋白质)序列的一部分的核酸或氨基酸序列。

在将额外核苷酸(或其它类似分子)掺入核酸时，核酸“得到延长”。最常见的是，这使用聚合物(如DNA聚合物)来进行，如在核酸的3＇末端添加序列的聚合酶。

当来自两种核酸各自的序列在后代核酸中组合时，两种核酸是“重组的”。当两种核酸都是重组的底物时，两种序列是“直接”重组的。当两种序列使用中间物诸如交换寡核苷酸重组时，两种序列是“间接重组的”。对于间接重组，不超过一种序列是重组的实际底物，而在有些情况中，两种序列都不是重组的底物。

两种分子，例如配体和受体，之间的“特异结合亲和力”指一种分子优先结合分子混合物中的另一种分子。

如果结合亲和力为约1×10⁴M^-1至约1×10⁶M^-1或更大，那么可认为分子的结合是特异性的。

转化：用于将异源DNA导入宿主细胞或生物体的过程。

“经转化的”、“转基因的”、和“重组的”指其中导入了异源核酸分子的宿主生物体，诸如细菌或植物。

核酸分子可稳定整合到宿主的基因组中，或者核酸分子也可作为染色体外分子存在。这样的染色体外分子可以自主复制。转化细胞、组织、或植株理解为不仅涵盖转化过程的最终产物，而且包括其转基因后代。“未转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主指不含异源核酸分子的野生型生物体，如细菌或植物。

保藏信息

根据布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏的条款，下列材料已经保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心(Agricultural  Research Service，Patent Culture Collection，NRRL)，1815North University Street，Peoria，Illinois 61604，USA。对获得保藏材料的所有限制将在授予专利权后不可撤回的取消。

克隆编号保藏日期

pRC 25NRRL B-302392000年1月7日

发明详述

在酵母双杂交筛选中使用拟南芥NIM1基因(Ryals等人，1997)作为饵以分离新的NIM1相互作用物NI16和NI19。NI16基因在用水杨酸(SA)和苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)处理以及接种病原体后受到快速诱导。NI16基因还在经过BTH处理的过量表达NIM1的植物中受到诱导。NI16基因序列包含与烟草G8-1基因具有高度同源性的区域，后者在用水杨酸处理后受到快速诱导，且响应很低浓度的水杨酸盐。

使用5＇RACE试剂盒测定了全长拟南芥NI16cDNA，它编码122个氨基酸的蛋白质。另外，由基因组文库克隆得到了拟南芥NI16的基因组拷贝。基因组克隆还包含NI165＇上游启动子区，它在与NI16基因组编码区相邻的区域中包含数个启动子元件。这些启动子元件包括：串联CaMV AS1基序，已知是SA可诱导的(Terzaghi和Cashmore，1995)；串联TCA1基序，另一种常见的SA可诱导基序(Goldsbrough等人，1993)；MYCATR22元件，拟南芥脱水响应基因rd22(ABA诱导)中的MCY(rd22BPI)结合位点；PAL盒，欧芹中苯丙氨酸氨裂合酶家族的三种推定顺式作用元件之一；和HEXAMERAT4元件，拟南芥组蛋白H4启动子的六碱基基序。因为NI16基因在用SAR诱导物SA和BTH处理后受到快速诱导，所以预测NI16启动子可用广泛的已知SAR诱导物来诱导，且因此可用于美国专利号5,614,395关于烟草PR-1a启动子和WO 98/03536关于拟南芥PR-1启动子描述的相同目的。

根据本发明，NI16和NI19基因序列可使用下文实施例中描述的技术来分离，或者通过PCR并使用序列表中列举的NI16序列(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)或NI 19序列(SEQ ID NO：22)作为构建PCR引物的基础。例如，与大致NI16编码序列或其互补序列的最前和最后20-25个连续核苷酸的序列对应的寡核苷酸(如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21)可作为PCR引物用于直接由来自来源植物诸如拟南芥、马铃薯或番茄的cDNA或基因组文库扩增NI16基因序列。由此，序列表中列举的NI16和NI19基因序列以及来自其它植物的同源NI16和NI19基因序列可同样通过PCR由cDNA和基因组文库扩增得到。

NI16基因的转基因表达导致PR-1的组成性表达。因此，NI16基因编码参与SAR基因表达调控的蛋白质。

可使用标准遗传工程技术将本发明的NI16或NI19编码序列插入为植物设计的表达盒以构建依照本发明的嵌合基因。适于在选定的植物宿主中实现期望的表达型式和水平的特异调控序列诸如启动子、信号序列、5＇和3＇非翻译序列、和增强子的选择属于本领域常规技术范围之内。可将由此得到的包含在正确读码框中相连的各种元件的分子插入能够转化到宿主植物细胞中的载体中。

能够在植物细胞中发挥功能的启动子(即能够在植物细胞中驱动相关编码序列诸如编码NI16或NI19蛋白质的序列表达的启动子)的实例包括拟南芥和玉蜀黍遍在蛋白质启动子；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S或35S启动子和CaMV双重启动子；稻肌动蛋白启动子；来自烟草、拟南芥、或玉蜀黍的PR-1启动子；胭脂碱合酶启动子；核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(ssuRUBISCO)启动子，等等。尤其优选拟南芥遍在蛋白质启动子。启动子自身可依照本领域公认的程序进行修饰以操纵启动子强度，从而提高相关编码序列的表达。优选用于本发明的启动子是赋予高水平组成性表达的启动子。

可将信号或转运肽与NI16编码序列在本发明的嵌合DNA构建物中融合以指导所表达蛋白质转运至期望的作用部位。信号肽的实例包括与植物发病机理相关蛋白质如PR-1、PR-2、等等天然相连的信号肽。参阅如Payne等人，1988。转运肽的实例包括叶绿体转运肽，诸如VonHeijne等人，1991、Mazur等人，1987、和Vorst等人，1988中描述的转运肽；以及线粒体转运肽，诸如Boutry等人，1987中描述的转运肽。还包括导致所编码蛋白质定位于各种细胞区室诸如液泡的序列。参阅例如Neuhaus等人，1991和Chrispeels，1991。

本发明的嵌合DNA构建物可包含多个拷贝的启动子或多个拷贝的本发明NI16或NI19编码序列。另外，构建物包含标记物的编码序列和其它肽的标记物，诸如信号或转运肽，每一个都与DNA分子中的其它功能元件位于正确的读码框中。这些构建物的制备属于本领域普通技术水平之内。

有用的标记物包括提供除草剂、抗生素或药物抗性的肽，诸如例如对原卟啉原氧化酶抑制物、潮霉素、卡那霉素、G418、艮他霉素、林肯霉素、氨甲喋呤、草甘膦、膦丝菌素、等等的抗性。这些标记物可用于由未转化细胞选择经本发明嵌合DNA构建物转化的细胞。其它有用的标记物有可通过可视反应例如显色反应容易检测的肽酶，例如萤光素酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、或β-半乳糖苷酶。

可通过许多本领域公认的方法将为植物表达设计的嵌合基因诸如本文设计的嵌合基因导入植物细胞。本领域技术人员将领会，方法的选择可能取决于转化所靶向的植物(即单子叶植物或双子叶植物)和/或细胞器(即核、叶绿体、线粒体)的类型。适于转化植物细胞的方法包括显微注射(Crossway等人，1986)、电穿孔(Riggs等人，1986)、农杆菌介导的转化(Hinchee等人，1988；Ishida等人，1996)、直接基因转移(Paszkowski等人，1984；Hayashimoto等人，1990)、和使用可由Agracetus公司(Madison，Wisconsin)和Dupont公司(Wilmington，Delaware)购买的装置进行的弹果微粒加速(参阅例如美国专利号4,945,050；和McCabe等人，1988)。还可参阅Weisinger等人，1988；Sanford等人，1987(洋葱)；Christou等人，1988(大豆)；McCabe等人，1988(大豆)；Datta等人，1990(稻)；Klein等人，1988(玉蜀黍)；Klein等人，1988(玉蜀黍)；Klein等人，1988(玉蜀黍)；Fromm等人，1990；和Gordon-Kamm等人，1990(玉蜀黍)；Svab等人，1990(烟草叶绿体)；Gordon-Kamm等人，1993(玉蜀黍)；Shimamoto等人，1989(稻)；Christou等人，1991(稻)；Datta等人，1990(稻)；欧洲专利申请EP 0 332581(鸭茅和其它早熟禾亚科)；Vasil等人，1993(小麦)；Weeks等人，1993(小麦)；Wan等人，1994(大麦)；Jahne等人，1994(大麦)；Umbeck等人，1987(棉)；Casas等人，1993(高粱)；Somers等人，1992(燕麦)；Torbert等人，1995(燕麦)；Weeks等人，1993(小麦)；WO 94/13822(小麦)；和Nehra等人，1994(小麦)。用于通过微弹轰击将重组DNA分子导入玉蜀黍的特别优选的一组实施方案可参阅Koziel等人，1993；Hill等人，1995；和Koziel等人，1996。另一个优选的实施方案是EP 0292435中公开的用于玉蜀黍的原生质体转化法。

一旦将包含NI16或NI19编码序列的嵌合基因转化到特定植物物种中，可使用传统育种技术使它在该物种中繁殖或移动到相同物种的其它品种中，特别包括商业品种。本发明优选的植物包括裸子植物、单子叶植物、和双子叶植物，尤其是农业上重要的农作物植物，诸如稻、小麦、大麦、黑麦、油菜、玉米、马铃薯、胡萝卜、甘薯、甜菜、蚕豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、辣椒、芹菜、西葫芦、南瓜、夏南瓜、黄瓜、苹果、梨、榅桲、甜瓜、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱、和甘蔗。上文描述的改造到转基因种子和植物中的遗传特性通过有性繁殖传代，且由此可在后代植株中得到维持和繁殖。

实施例

通过下面的详细流程、制备、和实施例更为详细的例示了本发明。实施例仅仅用于例示目的，而非解释为限制本发明的范围。本文所使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，且描述于Sambrook等人，1989；T.J.Silhavy、M.L.Berman、和L.W.Enquist，1984；及Aus ube l，F.M.等人，1987。

I.NIM1相互作用物的分离

实施例1：NIM1双杂交筛选

在酵母双杂交筛选中使用拟南芥NIM1基因(Rya l s等人，1997)作为饵。所用筛选系统是基于最初由Fields和Song(1989)开发且稍后由Gyuris等人(1993)修改的LexA版本双杂交筛选系统。使用PCR产物(引物NIM5＇RI和NIM3＇SalI，见下文表1)将全长NIM1基因序列克隆到饵质粒pEG202(Gyuris等人，1993)中，作为与LexA DNA结合结构域的融合物。使用编码NIM1蛋白质(Ryals等人，1997)前450个氨基酸的核苷酸序列及引物NIM5＇RI和NIMt runcNCOI3＇构建另一种饵(NIM450)。使用引物NIM1oop5＇RI和NIM3＇SalI克隆只含有编码NIM1蛋白质(Ryals等人，1997)氨基酸366-594的NIM1基因C端部分的第三种饵。将这些饵转化到包含与Leu2基因融合的低灵敏度LexA操纵基因的酵母菌株EGY188中，并进行适当测试以确定NIM1融合蛋白是否内在激活酵母报道基因的表达。使用来自经丁香假单胞菌感染的拟南芥叶片的RNA在质粒pJG4-5中构建酵母表达文库(来自Jeff Dang l，UNC-Chapel Hill)。该文库编码所表达拟南芥基因与B42转录激活结构域的融合蛋白。将文库连同上述三种NIM1饵之一和含有与LacZ融合的2个LexA操纵基因作为第二报道基因的质粒一起进行转化。在筛选用每种饵分析了大约10⁶个转化子，通过标准流程分离激活Leu2和LacZ两种报道基因的个别克隆并测序。最频繁分离得到的克隆(NI16)用NIM366-594饵找到了25次，用全长饵找到了12次。NI16克隆不与NIM450饵发生相互作用。

使用购自BRL Life Technologie s的5＇RACE试剂盒测定了全长NI16cDNA。将cDNA引物16GSP1用于cDNA合成。然后，在TdT装尾反应后，将引物16GSP 2连同制造商提供的删节锚引物用于通过PCR扩增cDNA产物。将第三种引物16GSP 3连同GSP2引物用作PCR对照。扩增得到cDNA片段，克隆到pCR2.1载体(Clonetech)中，并测序。

全长拟南芥NI16 cDNA序列显示为SEQ ID NO：1，而所编码的122个氨基酸的蛋白质序列显示为SEQ ID NO：2。NI 16基因序列包含与烟草G8-1基因具有高度同源性的区域，后者在用水杨酸处理后受到快速诱导，且响应很低浓度的水杨酸盐(Horvath等人，1996)。

实施例2：NI16mRNA的诱导

1.水杨酸和BTH诱导NI16 mRNA

由喷洒水、5mM水杨酸钠溶液(SA)、或300μm苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)溶液的4周龄Wassilewskija(WS-0)植株制备RNA。Wa rd等人(1991)和Lawton等人(1996)已经证明SA和BTH都在拟南芥中激活SAR且诱导发病机理相关(PR)基因表达。如Ausubel等人(1987)先前所述进行RNA提取和RNA印迹杂交。NI16RNA在SA或BTH诱导15分钟内诱导5-10倍，并在SA处理2小时内达到峰值大约50倍诱导，且用BTH处理达到25倍诱导。转录物在SA处理后可长达24小时而在BTH处理后至少48小时保持高度诱导。

2.NI16mRNA应答病原体感染而被诱导而在NahG或nim1-4植株中不被诱导

如Lawton等人(1995)先前所述，用含有avrRPM1基因的无毒病原体丁香假单胞菌番茄致病变种(P.s.t.)感染WS-0植株。将四周龄植株的三片叶子在一半中脉上接种缓冲液或P.s.t.，并在0、2、4、6、12、24、48、和72小时时收集局部和系统组织。NI16在局部组织中在4小时内被诱导，而在系统组织中在6小时内诱导5倍，并在感染后至多达72小时保持诱导。在一个分开的实验的，将WS-0、nim1-4、和NahG植株接种相同的P.s.t.隔离群，并在48小时后收集系统组织。尽管用化学诱导物2，6-二氯异烟酸进行了处理，根据其应答化学诱导和病原体处理的PR-1积累及其对病原体易感性的测量，nim1-4植株其应答病原体的能力受损(Ryals等人，1997)。NahG植株表达细菌水杨酸羟化酶(nahG)基因，且不能积累水杨酸(Gaffney等人，1993和Delaney等人，1994)。在野生型WS-0植株中，NI16在P.s.t.接种后被诱导大约4倍，但在NahG植株中不诱导且在nim1-4植株中只有轻微诱导。在另一个实验中，nim1-4植株在BTH处理后被2和24小时不能积累NI16转录物。由这些实验结果可以得出结论，水杨酸和功能性NIM1蛋白质是应答病原体诱导NI16所必需的。

实施例3：NI16和相关启动子序列的基因组克隆

依照制造商的方案将NI16的基因组拷贝由入ZapII文库(Stratagene)克隆到载体pBluescript中。由文库得到两个分开的克隆。克隆4-1包含3.1kb的NI16上游序列和NI16编码区，直至内部EcoRI位点(见SEQ ID NO：1)。第二个克隆5-1包含theEcoRI位点的3＇序列和3.1kb的NI16下游序列。通过首先由克隆4-1删除1.87kbBg1II/BamHI片段，然后将来自克隆5-1的350bp的EcoRI/EcoRV片段连接到克隆4-1剩余的EcoRI和EcoRV位点中，得到了完整的基因组克隆。将基因组克隆测序，得到NI16基因组序列，显示为SEQ ID NO：3。启动子元件位于与NI16基因组编码区相邻的5＇上游区域(见SEQ ID NO：3)。含有质粒pRC25(在pBluescript中包含大约1.9kb Bg1II/EcoRV基因组NI16片段)的大肠杆菌菌株DH5α已经于2000年1月7日保藏于NRRL，并指派编号NRRL B-30239。

实施例4：NI16的转基因表达导致组成性PR-1表达

在二元载体pBAR 35S(来自Jeff Dang1，UNC-Cha pel Hill)中制备NI16构建物。首先，通过将NI16的5＇序列(通过5＇RACE获得并克隆到AT载体pCR2.1中)作为EcoRI片段克隆到最初pJG4-5克隆的EcoRI位点中，得到了全长克隆。然后，用引物16F和16R(表1)将NI16的整个编码区PCR克隆回pCR2.1中。用XbaI和SacI切割由此得到的质粒，用于克隆到pBAR35S中。将克隆转化到农杆菌菌株GV3101(Koncz和Schell，1986)中。使用标准流程转化WS-0和nim1-4植株，并通过发芽后隔天喷洒60μg/ml BASTA溶液达6天来选择由此得到的T1种子。4周后对BASTA抗性植株分析N116和PR-1RNA水平。

回收得到4株高于野生型水平表达NI16的WS-0植株。根据Nor thern印迹的检测，它们都具有升高的PR-1RNA水平。将所有4株植株都培育至T3代。对两株T3系进行定量Northern，一个具有相对较低水平的NI16RNA(1-1B)，一个具有高水平的NI16RNA(2-1B)。将Northern印迹与NI16和PR-1探针进行杂交。测量是使用Molecular Dynamics感光成像仪进行的，它直接测量每个单位面积的计数。PR-1RNA的数量与NI16RNA的数量直接相关，即NI16的最高表达具有最高水平的PR-1(表2)。以低于通常用于提供针对寄生霜霉的保护的比率施用BTH在转基因系中没有显著提高NI16 RNA的数量。PR-1水平在相同比率在两个NI16系中像WS-0对照一样受到诱导，然而，稳定状态PR-1水平更高，尤其在0和10μM BTH。因此，NI16可能是SAR应答所必需的，且NI16的过量表达可能激活应答子集。PR-1在过量表达NI16的nahG、nim1-1和nim1-4植株中也升高。在34株含有35S-NI16构建物的nim1-1T1植株中，22株具有升高的PR-1水平。类似的，18/26株nim1-4和20/27株nahG原始转化株具有升高的PR-1水平。在每种情况中，高NI16表达与高PR-1水平相关。这是重要的，因为nim1和nahG植株其应答病原体而诱导PR1的能力通常是缺陷的。此外，这为NI16的过量表达可至少部分补偿植物中SA和功能性NIM蛋白质的缺乏提供了证据。

实施例5：通过PCR由马铃薯和番茄克隆的NI16同系物

使用Marathon cDNA扩增试剂盒由马铃薯和番茄克隆NI16的同系物。依照制造商的说明书，由马铃薯和番茄polyA RNA制备cDNA，并在两个末端连接接头。通过比较拟南芥NI16序列与烟草G8-1序列(Horvath等人，1998)来设计简并引物。然后使用引物NI16de gR1(SEQ ID NO：20)和NI16 degF1(SEQ ID NO：21)连同Clonetech提供的接头引物来扩增cDNA的5＇和3＇末端。然后使用购自Invitrogen的TOPO-TA克隆试剂盒克隆PCR产物并测序。回收得到完整的马铃薯cDNA(SEQ ID NO：4)和番茄cDNA的3＇端(SEQ ID NO：6)。下文表3显示了拟南芥、马铃薯、和番茄克隆以及由烟草G8-1基因和通过BLAST同源性鉴定的两种大豆EST(AI 495102和A I 461039)编码的多肽序列的序列比对。所有cDNA都编码小蛋白质(<122个氨基酸)，它们具有在6种序列间45％同一且82％相似的22个氨基酸的核心基序(粗体)。

表1：N IM1和N I 16克隆中所使用的引物

*n＝a、c、t、或g；y＝c或t；r＝a或g。

表2：野生型拟南芥和过量表达NI16的两种株系中用0、10或100μm BTH诱导后24小时的NI16和PR-1相对水平

基因型  BTH浓度(μM)  NI16水平  PR-1水平WS      0             1         110             \10      30100           90        90I-1B    0             760       3.510            1400      30100           1480      1202-1B    0             11000     5010            14000     70100           12000     140

表3：NI 16同源序列的比对

实施例6：NIM1相互作用物NI19的分离

除了NI16 cDNA克隆，还可在实施例1描述的双杂交筛选中分离NI19克隆。在用NI19 cDNA克隆对基因库数据库进行blast搜索后找到了全长克隆。基因库(#F14J9)中的细菌人工染色体(BAC)与碱基19726-19439的序列匹配。使用GCG seqweb翻译额外的侧翼序列(碱基19726-20000)。在碱基19897-19513之间找到了开放读码框，给出112个氨基酸的预测蛋白质。全长拟南芥NI19基因组序列显示为SEQID NO：22，而所编码的112个氨基酸的蛋白质序列显示为SEQ ID NO：23。SEQ ID NO：22的核苷酸127-413代表了在NIM1双杂交筛选中分离得到了最初cDNA克隆。

II.本发明的基因序列在植物中的表达

可使用常规重组DNA技术将本发明的NIM1相互作用物NI16掺入植物细胞。一般而言，这包括使用本领域知道的标准克隆程序将本发明的编码序列插入对其而言该编码序列是异源的(即通常不存在的)表达系统。该载体含有所插入蛋白质编码序列的转录和翻译所必需的元件。可使用本领域知道的多种载体系统，诸如质粒、噬菌体病毒和其它改良病毒。合适的载体包括但不限于病毒载体，诸如λ载体系统λgt11、λgt10和Charon 4；质粒载体，诸如pBI121、pBR322、pACYC177、pACYC 184、pAR系列、pKK 223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNAII；和其它类型系统。表达系统的成分还可进行修饰以提高表达。例如，可采用截短的序列、核苷酸替代或其它修饰。本文所述表达系统实际上可用于在合适条件下转化任何农作物植物细胞。可使转化细胞再生成完整植株，使得NIM1相互作用物在转基因植株中提高SAR基因(如PR-1)表达。

实施例7：植物表达盒的构建

首先在表达盒中在可在植物中表达的合适启动子后装配意图在转基因植物中表达的编码序列。表达盒还可包含转基因表达所需要的或选择的任何其它序列。这些序列包括但不限于转录终止子、增强表达的外来序列诸如内含子、要害序列(vitals equence)、和意图将基因产物靶向特定细胞器和细胞区室的序列。然后可将这些表达盒容易的转移到下文描述的植物转化载体中。下文是典型表达盒的各种成分的描述。

1.启动子

表达盒中所使用的启动子的选择将决定转基因在转基因植物中的空间和时间表达型式。所选择的启动子将在特定细胞类型(诸如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮层细胞)中或在特定组织或器官(例如根、叶或花)中表达转基因，而且选择将反映期望基因产物积累的部位。或者，所选择的启动子可在多种诱导条件下驱动基因表达。启动子的强度即启动转录的能力有所不同。根据所采用的宿主细胞系统，可使用多种合适的启动子，包括基因的天然启动子。下面是可用于表达盒的启动子的非限制性实例。

a.组成性表达，遍在蛋白质启动子

遍在蛋白质是已知在许多细胞类型中积累的基因产物，而且已经由数个物种克隆了它的启动子以用于转基因植物(如向日葵-Binet等人，Plant Science 79∶87-94，1991；玉蜀黍-Christensen等人，Plant Molec.Biol.12∶619-632，1989；和拟南芥-Calli s等人，J.Biol.Chem.265∶12486-12493，1990和Norris等人，Plant Mol.Bio1.21∶895-906，1993)。已经在转基因单子叶植物系统中开发了玉蜀黍遍在蛋白质启动子，而且专利出版物EP 0 342926(Lubrizol)公开了它的序列和为单子叶植物转化而构建的载体，将其引入本文作为参考。Taylor等人(Plant CellRep.12∶491-495，1993)描述了包含玉蜀黍遍在蛋白质启动子和第一个内含子的载体(pAHC25)，以及它通过微弹轰击诱导后在许多单子叶植物的细胞悬浮液中的高活性。拟南芥遍在蛋白质启动子对于与本发明的核苷酸序列一起使用是理想的。清蛋白启动子适于转基因植物中的基因表达，包括单子叶植物和双子叶植物二者。合适的载体是通过引入适当遍在蛋白质启动子和/或内含子序列而修饰的pAHC25衍生物或本申请中描述的任何转化载体。

b.组成性表达，CaMV 35S启动子

已出版的专利申请EP 0 392225(实施例23)描述了质粒pCGN1761的构建，将其引入本文作为参考。pCGN1761含有“双重”CaMV 35S启动子和tml转录终止子，在启动子和终止子之间具有唯一的EcoRI位点，且具有pUC型主链。构建了这样一种pCGN1761衍生物，它具有除现有EcoRI位点以外包含NotI和XhoI位点的经修饰多接头。将该衍生物命名为pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用于在其多接头中克隆cDNA序列或编码序列(包括微生物ORF序列))，以用于在转基因植物中在35S启动子的控制下表达它们的目的。可经由启动子5＇端的HindIII、SphI、SalI和XbaI位点及终止子3＇端的XbaI、BamHI和BglI位点切下这种构建物的整个35S启动子-编码序列-tml终止子盒以转移到转化载体中，诸如下文所描述的。此外，可通过HindIII、SphI、SalI、XbaI或PstI的5＇切割及任何多接头限制性位点(EcoRI、NotI或XhoI)的3＇切割切下双重35S启动子片段以用另一种启动子替换。如果需要，通过引入可增强翻译的序列，可在克隆位点附近进行修饰。这在需要过量表达时特别有用。例如，可通过如美国专利号5,639,949的实施例37所述优化翻译起始位点来修饰pCGN1761ENX，将其引入本文作为参考。

c.组成性表达，肌动蛋白启动子

已知数种同种型(isoform)肌动蛋白在大多数细胞类型中表达，因此肌动蛋白启动子是组成性启动子的优良选择。具体而言，已经克隆并鉴定了来自稻ActI基因的启动子(McE1roy等人，Plant Cell2：163-171,1990)。发现启动子的1.3kb片段含有在稻原生质体中进行表达所必需的所有调控元件。此外，已经构建了基于ActI启动子的许多表达载体，专门用于单子叶植物(McElroy等人，Mol.Gen.Gene t.231∶150-160，1991)。它们引入了ActI-内含子1、AdhI 5＇侧翼序列和Adh I-内含子1(来自玉蜀黍乙醇脱氢酶基因)、和来自CaMV 35S启动子的序列。显示最高表达的载体是35S与ActI内含子或者ActI5＇侧翼序列与ActI内含子的融合物。(GUS表达基因的)起始ATG附近序列的优化也增强表达。McElroy等人(Mol.Gen.Gene t.231∶150-160，1991)描述的启动子表达盒可容易的为基因表达进行修饰，而且特别适合用于单子叶植物宿主。例如，由McElroy的构建物切下含启动子片段，并用于替换pCGN1761ENX中的双重35S启动子，然后可用于插入特定基因序列。然后可将由此构建的融合基因转移到适当的转化载体中。在一份分开的报告中，还发现稻ActI启动子及其第一个内含子在培养的大麦细胞中指导高表达(Chibbar等人，Plant CellRep.12：506-509，1993)。

d.可诱导表达，PR-1启动子

pCGN1761ENX中的双重35S启动子可用将导致合适高表达水平的任何其它启动子选择替换。例如，可用美国专利号5,614,395中描述的一种化学可调控启动子诸如烟草PR-1a启动子替换双重35S启动子。或者，可使用Lebel等人，Plant J.16∶223-233，1998中描述的拟南芥PR-1启动子。优选使用限制酶由其来源切下选择的启动子，或者可使用携带适当末端限制性位点的引物通过PCR扩增。如果采取PCR扩增，那么应当在将扩增的启动子克隆到靶载体中后对启动子重新测序以检查扩增错误。由质粒pCIB1004切下化学/病原体可调控的烟草PR-l a启动子(用于构建，参阅EP 0332104的实施例21，将其引入本文作为参考)，并转移到质粒pCGN1761ENX(Ukne s等人，Plant Cell4∶645-656，1992)中。用NcoI切割pCIB1004，并通过T4DNA聚合酶处理将由此产生的线性化片段的3＇凸出补平。然后用HindIII切割该片段，将由此得到的含PR-la启动子片段凝胶纯化，并克隆到切除了双重35S启动子的pCGN1761ENX中。这是这样进行的，用XhoI切割并用T4聚合酶补平，随后用HindIII切割并分离含载体终止子的较大片段，向其中克隆pCIB1004启动子片段。这生成了具有PR-la启动子和tm1终止子的pCGN1761ENX衍生物，具有唯一EcoRI和NotI位点的多接头介于二者之间。可将选择的编码序列插入该载体，随后可将融合产物(即启动子-基因-终止子)转移到任何选定转化载体中，包括下文所描述的。可采用多种化学调节物来诱导选定编码序列在依照本发明转化的植物中的表达，包括美国专利号5,523,311和5,614,395中公开的苯并噻二唑、异烟酸、和水杨酸化合物。

e.可诱导表达，乙醇可诱导启动子

某些醇或酮诸如乙醇可诱导的启动子也可用于赋予本发明的编码序列以可诱导表达。这样的启动子有例如来自构巢曲霉(Aspergillusnidulan2s)的alcA基因启动子(Caddick等人，Nat.Biotechno1.16：177-180，1998)。在构巢曲霉中，alcA基因编码醇脱氢酶I，它的表达在存在化学诱导物时受到AlcR转录因子的调控。为了本发明的目的，用本发明的编码序列替换包含与最小35S启动子融合的alcA基因启动子序列的质粒palcA:CAT中的CAT编码序列(Caddick等人，Nat.Biotechnol.16∶177-180，1998)以形成在alcA基因启动子的控制之下具有编码序列的表达盒。这是使用本领域众所周知的方法进行的。

f.可诱导表达，糖皮质激素可诱导启动子

还设想了使用基于类固醇激素的系统诱导本发明核酸序列的表达。例如，采用糖皮质激素介导的诱导系统(Aoyama和Chua，The PlantJourna l11：605-612，1997)，并通过施用糖皮质激素诱导基因表达，例如合成的糖皮质激素，优选地塞米松，优选0.1mM-1mM的浓度范围，更优选10mM-100mM。为了本发明的目的，用本发明的核酸序列替换萤光素酶基因序列以形成在与35S最小启动子融合的六个拷贝的GAL4上游激活序列的控制之下具有本发明核酸序列的表达盒。这是使用本领域众所周知的方法进行的。反式作用因子包括与疱疹病毒蛋白质VP16的反式激活结构域(Triezenber g等人，Genes Devel.2∶718-729，1988)融合的GAL4DNA结合结构域(Keegan等人，Science 231：699-704，1986)，前者又与大鼠糖皮质激素受体的激素结合结构域(Picard等人，Cell54：1073-1080，1988)融合。融合蛋白的表达受到本领域知道的或本文描述的适于在植物中表达的任何启动子的控制。该表达盒还包含在含有与6xGAL4/最小启动子融合的本发明核酸序列之植物中。由此获得了融合蛋白的组织或器官特异性，导致杀虫毒素的可诱导组织或器官特异性。

g.根部特异表达

基因表达的另一种型式是根部表达。合适的根启动子是Framond(FEBS，290：103-106，1991)还有美国专利号5,466,785中描述的玉蜀黍金属硫蛋白样(MTL)基因的启动子，引入本文作为参考。将此“MTL”启动子转移到合适的载体中，诸如pCGN1761ENX，用于插入选择的基因并随后将整个启动子-基因-终止子盒转移到目的转化载体中。

h.创伤可诱导启动子

创伤可诱导启动子可能也适于基因表达。已经描述了许多这样的启动子(如Xu等人，Plant Molec.Biol.22∶573-588，1993；Logemann等人，Plant Cell 1：151-158，1989；Rohrmeier和Lehle，Plant Molec.Bio1.22∶783-792，1993；Firek等人，Plant Molec.Biol.22∶129-142，1993；Warner等人，Plant J.3：191-201，1993)，而且都适用于本发明。Logemann等人描述了双子叶马铃薯wunI基因的5＇上游序列。Xu等人证明了来自双子叶马铃薯的创伤可诱导启动子(pin2)在单子叶稻中有活性。另外，Rohrmeier和Lehle描述了玉蜀黍WipIcDNA的克隆，它是创伤诱导的且可使用标准技术用于分离相关启动子。类似的，Firek等人和Warner等人描述了了来自单子叶植物芦笋(Aspa ragus officinalis)的创伤诱导基因，它在局部创伤处和病原体侵入部位表达。使用本领域众所周知的克隆技术，可将这些启动子转移到合适载体中，与本发明相关基因融合，并用于在植物受伤部位表达这些基因。

i.髓优先表达

专利申请WO 93/07278描述了优先在髓细胞中表达的玉蜀黍trpA基因的分离，将其引入本文作为参考。呈现了由转录起点延伸至-1726bp的基因序列和启动子。使用标准分子生物学技术，可将此启动子或其部分转移到诸如pCGN1761等载体中，其中它可替换35S启动子并用于以髓优先方式驱动外来基因的表达。事实上，可将含有髓优先启动子或其部分的片段转移到任何载体中，并为了在转基因植物中的效用进行修饰。

j.叶特异表达

Hudspeth和Grula(Plant Molec.Biol.12∶579-589，1989)已经描述了编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉蜀黍基因。使用标准分子生物学技术，可将该基因的启动子用于在转基因植物中以叶特异方式驱动任何基因的表达。

k.花粉特异表达

WO 93/07278描述了在花粉细胞中表达的玉蜀黍钙依赖性蛋白质激酶(CDPK)基因的分离。基因序列和启动子由转录起点延伸至1400bp。使用标准分子生物学技术，可将该启动子或其部分转移到诸如pCGN1761等载体中，其中它可替换35S启动子并用于以花粉特异方式驱动本发明核酸序列的表达。

2.转录终止子

可获得多种转录终止子用于表达盒。它们负责在转基因和正确的mRNA聚腺苷酸化后终止转录。适当的转录终止子是已知在植物中发挥功能的终止子，包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶植物和双子叶植物二者。另外，可使用基因的天然转录终止子。

3.用于增强或调控表达的序列

已经发现许多序列增强来自转录单位内的基因表达，而且这些序列可联合本发明的基因使用以提高它们在转基因植物中的表达。

已经证明许多内含子序列增强表达，特别是在单子叶植物的细胞中。例如，已经证明玉蜀黍AdhI基因的内含子在导入玉蜀黍细胞后显著增强其相关启动子下的野生型基因的表达。发现内含子1特别有效，它在与氯霉素乙酰基转移酶基因的融合构建物中增强表达(Callis等人，Genes Develop.1：1183-1200，1987)。在相同的实验系统中，来自玉蜀黍bronze1基因的内含子在增强表达中具有相似的效果。已经将内含子序列常规引入植物转化载体，通常在非翻译前导内。

还知道衍生自病毒的许多非翻译前导序列增强表达，而且它们在双子叶植物的细胞中特别有效。具体而言，已经证明来自烟草花叶病毒(TMV，“W序列”)、玉蜀黍褪绿斑驳病毒(MCMV)、和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列有效增强表达(如Gallie等人，Nuc1.Acids Res.15∶8693-8711，1987；Skuzeski等人，Plant Molec.Biol.15∶65-79，1990)。本领域已知的其它前导序列包括但不限于：小RNA病毒前导，例如EMCV前导(脑心肌炎5＇非编码区)(Elroy-Stein，0.、Fuerst，T.R.、和Moss，B.，PNAS USA 86∶6126-6130，1989)；马铃薯Y病毒组前导，例如TEV前导(烟草蚀刻病毒)(Allison等人，1986)；MDMV前导(玉蜀黍矮缩花叶病毒)(Virology，154∶9-20)；人，免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导(Macejak，D.G.和Sarnow，P.，Nature 353：90-94，1991)；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导(Jobling，S.A.和Gehrke，L.，Nature 325∶622-625，1987)；烟草花叶病毒前导(TMV)(Gallie，D.R.等人，《MolecularBiology of RNA》，p 237-256，1989)；和玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导(MCMV)(Lommel，S.A.等人，Virology 81：382-385，1991)。还可参阅Della-Cioppa等人，Plant Physiology 84∶965-968，1987。

除了将一种或多种上述元件引入本发明靶表达盒的5＇调控区以外，还可引入靶表达盒特有的其它元件。这些元件包括但不限于最小启动子。最小启动子意指在没有上游激活的条件下没有或几乎没有活性的基础启动子。在不存在反式激活蛋白时或者在缺乏增强子或应答元件结合位点时，这样的启动子在植物中具有低背景活性。对于植物中的靶基因特别有用的一种最小启动子是由玉蜀黍的bronze1基因获得的Bz1最小启动子。Bz1核心启动子是由“myc”突变型Bz1-萤光素酶构建物pBzlLucR98通过位于-53至-58的NheI位点处的切割得到的(Roth等人，Plant Cell 3：317，1991)。衍生的Bz 1核心启动子片段由此由-53延伸至+227，并在5＇非翻译区中包含Bz1内含子-1。对本发明同样有用的还有通过使用合成TATA元件构建的最小启动子。TATA元件容许RNA聚合物因子识别启动子并在缺乏激活的条件下赋予基础水平的基因表达(通常参阅Mukumoto，Plant Mol.Bio1.23∶995-1003，1993；Green，Trends  Biochem.Sci .25∶59-63，2000)。

4.基因产物在细胞内的靶向

已知植物中存在基因产物的多种靶向机制，而且已经较为详细的鉴定了控制这些机制发挥功能的序列。例如，将基因产物靶向叶绿体受到在多种蛋白质的氨基末端发现的信号序列的控制，这些蛋白质在输入叶绿体的过程中遭到切割而生成成熟蛋白质(如Comai等人，J.Biol.Chem.263∶15104-15109，1988)。可将这些信号序列与异源基因产物融合以实现将异源产物输入叶绿体(van den Broeck等人，Nature 313∶358-363，1985)。可由编码RUBISCO蛋白质、CAB蛋白质、EPSP合酶、GS2蛋白质及已知定位于叶绿体的许多其它蛋白质的cDNA的5＇端分离编码适当信号序列的DNA。还可参阅美国专利号5,639,949的实施例37中题为“Expression With ChloroplastTargeting”的部分。

其它基因产物可定位于其它细胞器，诸如线粒体和过氧化物酶头(如Unger等人，Plant Mol ec.Biol.13∶411-418，1989)。也可操作编码这些产物的cDNA以实现将异源基因产物靶向这些细胞器。这种序列的实例有核编码的ATP酶和特异天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工型。Rogers等人(Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 82∶6512-6516，1985)已经描述了靶向细胞蛋白质体。

另外，已经鉴定了引起基因产物靶向其它细胞区室的序列。氨基末端序列负责靶向ER、质外体、和糊粉细胞的胞外分泌(Koehler和Ho，Plant Cell2：769-783,1990)。另外，氨基末端序列连同羧基末端序列负责基因产物靶向液泡(Shinshi等人，Plant Molec.Biol.14∶357-368,1990)。

通过将上文描述的靶向序列与目的转基因序列融合，有可能将转基因产物引导至任何细胞器或细胞区室。例如，对于靶向叶绿体，将来自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合酶、或GS 2基因的叶绿体信号序列以相同读码框融合于转基因的氨基末端ATG。所选择的信号序列应当包含已知的切割位点，而且所构建的融合物应当考虑到切割所必需的切割位点后的任何氨基酸。在有些情况中，这种需要可通过在切割位点与转基因ATG之间添加少数氨基酸来满足，或者替换转基因序列内的有些氨基酸。可对为输入叶绿体而构建的融合物测试叶绿体摄取的效力，即使用Bartlett等人，在Edelmann等人编的《Methods in ChloroplastMolecular Biology》一书中，Elsevier，pp 1081-1091，1982和Wasmann等人，Mo1.Gen.Gene t.205∶446-453，1986描述的技术，体外翻译体外转录的构建物，随后进行体外叶绿体摄取。这些构建技术是本领域众所周知的，而且平等适用于线粒体和过氧化物酶体。

上述细胞靶向机制不仅可联合它们的相关启动子使用，而且可联合异源启动子以实现在与衍生靶向信号的启动子具有不同表达型式的启动子的转录调控下特异细胞靶向目标。

实施例8∶植物转化载体的构建

植物转化领域的普通技术人员知道可获得用于植物转化的许多转化载体，而且本发明相关的基因可联合任何这些载体使用。载体的选择将取决于偏爱的转化技术和转化的靶物种。对于某些靶物种，可能优选不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化中常规使用的选择标记包括nptII基因，它赋予针对卡那霉素和相关抗生素的抗性(Messing和Vierra，Gene 19：259-268，1982；Bevan等人，Nature 304∶184-187，1983)；bar基因，它赋予针对除草剂膦丝菌素的抗性(White等人，Nuc1.Acids Res.18∶1062，1990；Spence r等人，Theor.Appl.Gene t.79∶625-631,1990)；hph基因，它赋予针对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger和Diggelmann，Mo1.Cell Biol.4∶2929-2931)；和dhfr基因，它赋予针对甲氨喋呤的抗性(Bourouis等人，EMBO J.2(7)∶1099-1104，1983)；EPSPS基因，它赋予针对草甘膦的抗性(美国专利号4,940,935和5,188,642)；和甘露糖-6-磷酸异构酶基因，它提供代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)。

1.适用于农杆菌转化的载体

可获得许多载体用于使用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的转化。它们通常携带至少一个T-DNA边界序列，且包括诸如pBIN19等载体(Bevan，Nuc1.Acids Res.，1984)。下文描述了适用于农杆菌转化的两种典型载体的构建。

a.pCIB200和pCIB2001：

二元载体pCIB200和pCIB2001用于构建与农杆菌一起使用的重组载体，且以如下方式构建。用NarI消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，J.Bacteriol.164∶446-455，1985)得到pTJS75kan，容许切除四环素抗性基因，随后插入来自pUC4k的携带NPTII(Messing和Vierra，Gene 19∶259-268，1982；Bevan等人，Nature 304∶184-187，1983；McBride等人，Plant Molecular Biology 14∶266-276,1990)的AccI片段。将XhoI接头与含有T-DNA左界和右界、植物可选择nos/nptII嵌合基因、和pUC多接头的PCIB7的EcoRV片段连接(Rothstein等人，Gene 53∶153-161，1987)，并将XhoI消化片段克隆到经SalI消化的pTJS75kan中，产生pCIB200(还可参阅EP 0332104，实施例19)。pCIB200包含下列唯一多接头限制性位点：EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、和SalI。pCIB2001是pCIB200的衍生物，通过在多接头中插入额外限制性位点而产生。pCIB2001多接头中的唯一限制性位点有：EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BelI、AvrII、ApaI、HpaI、和StuI。除了包含这些唯一限制性位点以外，pCIB2001还具有植物和细菌卡那霉素选择标记、用于农杆菌介导的转化的T-DNA左界和右界、用于在大肠杆菌和其它宿主之间动员的RK2衍生trfA功能、及同样来自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接头适于克隆包含其自身调控信号的植物表达盒。

b.pCIB10及其潮霉素选择衍生物：

二元载体pCIB10包含编码用于在植物中进行选择的卡那霉素抗性的基因及T-DNA右界和左界序列，并掺入了来自宿主范围广的质粒pRK252的序列，容许它在大肠杆菌和农杆菌二者中复制。Rothstein等人(Gene 53∶153-161，1987)描述了它的构建。构建了pCIB10的各种衍生物，其中掺入了Gritz等人(Gene 25∶179-188，1983)描述的潮霉素B磷酸转移酶基因。这些衍生物使得能够只对潮霉素(pCIB743)或者对潮霉素及卡那霉素(pCIB715、pCIB717)选择转基因植物细胞。

2.适于非农杆菌转化的载体

不使用根癌农杆菌的转化规避了对所选择转化载体中T-DNA序列的需要，因此除了诸如上文描述的包含T-DNA序列的载体以外还可采用缺乏这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括经由微粒轰击、原生质体摄取(如PEG和电穿孔)、和显微注射的转化。载体的选择很大程度上取决于偏爱的转化物种的选择。下文描述了适用于非农杆菌转化的典型载体的构建。

a.pCIB3064：

pCIB3064是适于直接基因转移技术连同除草剂basta(或膦丝菌素)选择的pUC衍生载体。质粒pCIB246在与大肠杆菌GUS基因和CaMV35S转录终止子的可操作融合物中包含CaMV 35S启动子，而且描述于PCT出版的申请WO 93/07278。这种载体的35S启动子在起始位点5＇含有两个ATG序列。使用标准PCR技术以这样一种方式突变这些位点以消除ATG并生成限制性位点SspI和PvuII。新的限制性位点距离唯一的SalI位点96和37bp，距离实际的起始位点101和42bp。将由此得到的pCIB246衍生物命名为pCIB 3025。然后由pCIB3025通过SalI和SacI消化切除GUS基因，将末端补平，并重新连接而生成质粒pCIB 3060。质粒pJIT82来自John Innes Centre，Norwich，切下包含来自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的bar基因的400bp SmaI片段，并插入pCIB3060的HpaI位点(Thompson等人，EMBO J 6：2519-2523，1987)。这生成了pCIB3064，它包含CaMV 35S启动子和终止子控制下的用于除草剂选择的bar基因、用于氨苄青霉素抗性的基因(用于大肠杆菌中的选择)、及具有唯一位点SphI、PstI、HindIII和BamHI的多接头。此载体适于克隆包含其自身调控信号的植物表达盒。

b.pSOG19和pSOG 35：

pSOG35是利用赋予甲氨喋呤抗性的大肠杆菌基因二氢叶酸还原酶(DFR)作为选择标记的转化载体。使用PCR扩增35S启动子(-800bp)、来自玉蜀黍Adh1基因的内含子6(-550bp)、和来自pSOG10的18bp GUS非翻译前导序列。还通过PCR扩增编码大肠杆菌二氢叶酸还原酶II型基因的250bp片段，并将这两个PCR片段与来自pB1221(Clontech)的SacI-PstI片段装配到一起，pB1221包含pUC19载体主链和胭脂碱合酶终止子。这些片段的装配生成pSOG19，它包含与内含子6序列、GUS前导、DHFR基因和胭脂碱合酶终止子融合的35S启动子。用来自玉蜀黍褪绿斑驳病毒(MCMV)的前导序列替换pSOG19中的GUS前导，生成载体pSOG35。pSOG19和pSOG35携带氨苄青霉素抗性的pUC基因，且具有HindIII、SphI、PstI和EcoRI位点可用于克隆外来物质。

3.适于叶绿体转化的载体

为了在植物质体中表达本发明的核苷酸序列，采用质体转化载体pPH143(WO 97/32011，实施例36)。将核苷酸序列插入pPH143，由此替换PROTOX编码序列。然后将该载体用于质体转化和壮观霉素抗性转化子选择。或者，将核苷酸序列插入pPH143，使其替换aadH基因。在这种情况中，对转化子选择对PROTOX抑制物的抗性。

实施例9：转化

一旦将本发明的核酸序列克隆到表达系统中，将它转化到植物细胞中。可以多种本领域认可的方法将本发明的接受者和靶表达盒导入植物细胞。用于再生植株的方法也是本领域众所周知的。例如，Ti质粒载体已经用于外来DNA投递，以及直接DNA摄取、脂质体、电穿孔、显微注射、和微弹。另外，来自农杆菌属的细菌可用于转化转化植物细胞。下文描述了用于转化双子叶植物和单子叶植物的代表性技术，以及代表性的质体转化技术。

1．双子叶植物的转化

用于双子叶植物的转化技术是本领域众所周知的，包括基于农杆菌的技术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌技术包括由原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。这可以通过PCG或电穿孔介导的摄取、微粒轰击介导的投递、或纤维注射来实现。这些技术的实例描述于Paszkowski等人，EMBO J3：2717-2722，1984；Potrykus等人，Mo1.Gen.Genet.199：169-177，1985；Reich等人，Biotechnology 4：1001-1004，1986；和Klein等人，Nature 327：70-73，1987。在每种情况中，使用本领域知道的标准技术将转化细胞再生成完整植株。

农杆菌介导的转化是转化双子叶植物的优选技术，因为它的转化效率高且可广泛用于许多不同物种。农杆菌转化通常包括将携带目的外来DNA的二元载体(如pCIB200或pCIB2001)转移到适当农杆菌菌株中，它可能依赖宿主农杆菌菌株或是在共驻留Ti质粒上或是在染色体上携带的vir基因的补足作用(如用于pCIB200和pCIB2001的菌株CIB542)(Uknes等人，Plant Cell 5：159-169，1993)。将重组二元载体转移到农杆菌中是通过使用携带重组二元载体的大肠杆菌、携带诸如pRK2013等质粒且能够动员重组二元载体到靶农杆菌菌株中的辅助大肠杆菌菌株的三亲株交配程序实现的。或者，可通过DNA转化将重组二元载体转移到农杆菌中(

和Willmitzer，Nucl．AcidsRes.16：9877，1988)。

通过重组农杆菌对靶植物物种的转化通常包括农杆菌与来自植物的外植体的共培养，且遵照本领域众所周知的方案。在含有二元质粒T-DNA边界之间存在的抗生素或除草剂抗性标记的选择性培养基上使转化组织再生。

用基因转化植物细胞的另一种方法包括驱使惰性或生物学活性微粒进入植物组织和细胞。该技术公开于美国专利号4,945,050、5,036,006、和5,100,792，都授予Sanford等人。一般而言，该程序包括在有效穿透细胞外表面并使之掺入其内部的条件下驱使惰性或生物学活性微粒进入细胞。在采用惰性微粒时，可通过用包含期望基因的载体包被微粒而将载体导入细胞。或者，可用载体包围靶细胞，使得载体经由微粒运送进入细胞。也可驱使生物学活性微粒(如干酵母细胞、干细菌、或噬菌体，都包含试图导入的DNA)进入植物细胞和组织。

2.单子叶植物的转化

大多数单子叶植物物种的转化现在也已经成为常规。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术将基因直接转移到原生质体中，以及通过微粒轰击进入愈伤组织。转化可使用单一DNA种类或多种DNA种类(即共转化)来进行，这两种技术都适用于本发明。共转化可具有下列优点：避免完全的载体构建和生成具有目的基因与选择标记的非连锁基因座的转基因植物；能够在后代中清除选择标记，如果需要的。然而，使用共转化的缺点是分开的DNA种类整合到基因组中的频率低于100％(Schocher等人，Biotechnology 4∶1093-1096，1986)。

专利申请EP 0292435、EP 0 392225、和WO 93/07278描述了用于由玉蜀黍的精华自交系制备愈伤组织和原生质体、使用PEG或电穿孔转化原生质体、及由经转化原生质体再生玉蜀黍植株的技术。Gordon-Kamm等人(Plant Cell2：603-618，1990)和Fromm等人(Biotechnology 8：833-839，1990)发表了使用微粒轰击转化A188衍生玉蜀黍系的技术。此外，WO 93/07278和Koziel等人(Biotechnology 11：194-200，1993)描述了通过微粒轰击转化玉蜀黍的精华自交系的技术。该技术利用由授粉后14-15天的玉蜀黍穗切下的长度为1.5-2.5mm的未成熟玉蜀黍胚及用于轰击的PDS-1000HeBiolistics装置。

稻的转化也可通过利用原生质体或微粒轰击的直接基因转移技术来进行。已经描述了日本产植物型和印度产植物型的原生质体介导的转化(Zhang等人，Plant CellRep.7∶379-384，1988；Shimamoto等人，Nature 338：274-277，1989；Datta等人，Biotechnology 8：736-740，1990)。这两种类型都可常规使用微粒轰击来转化(Christou等人，Biotechno1ogy 9：957-962，1991)。此外，WO 93/21335描述了通过电穿孔转化稻的技术。

专利申请EP 0 332 581描述了用于生成、转化、和再生早熟禾亚科原生质体的技术。这些技术容许转化鸭茅属和小麦。此外，Vasil等人(Biotechnology 10：667-674，1992)，使用微粒轰击into C型长期可再生愈伤组织的细胞，还有Vasil等人(Biotechnology 11：1553-1558，1993)和weeks等人(Plant Physiol.102：1077-1084，1993)，使用未成熟胚和未成熟胚衍生愈伤组织的微粒轰击，描述了小麦转化。然而，用于小麦转化的优选技术牵涉通过未成熟胚的微粒轰击来转化小麦，且在基因投递前包括高蔗糖或高麦芽糖步骤。在轰击前，将任何数目的胚(长度为0.75-1mm)置于含3％蔗糖(Murashiga和Skoog，Physiologia Plantarum 15：473-497，1962)和3mg/L 2，4-D的MS培养基上以诱导体细胞胚，这容许在黑暗中进行。在选择进行轰击的那天，由诱导培养基中取出胚，并置于渗透剂(即以期望浓度添加蔗糖或麦芽糖的诱导培养基，通常15％)上。容许胚质壁分离2-3小时，然后轰击。通常每个靶盘二十个胚，尽管这并不重要。使用标准程序将携带基因的适当质粒(诸如pCIB3064或pSG35)沉淀到微米尺度的金微粒上。用DuPont Biolistics

helium装置射击每盘胚，使用爆压约1000psi和标准80网筛。轰击后，将胚置回黑暗中，恢复约24小时(仍然在渗透剂上)。24小时后，由渗透剂中取出胚，并置回诱导培养基上，它们在此在再生前逗留约一个月。约一个月后，将具有发育中胚胎发生愈伤组织的胚外植体转移至还含有适当选择剂(在pCIB3064的情况中是10mg/L basta，而在pSOG35的情况中是2mg/L甲氨喋呤)的再生培养基(Ms+1mg/L NAA、5mg/L GA)。约一个月后，将发育的转移至含有半强度MS、2％蔗糖、和相同浓度选择剂的更大无菌容器，称为“GA7s”。

使用农杆菌转化单子叶植物也已有描述。参阅WO 94/00977和美国专利号5,591,616，将二者都引入本文作为参考。

3.质体的转化

使珊西烟草(Nicotiana tabacum c.v.‘Xanthi nc’)的种子在T琼脂培养基上发芽，每板七粒，成1＂环形排列，并本质上如Svab，Z.和Maliga，P.，PNAS 90：913-917，1993所述在播种后12-14天用以来自质粒pPH143和pPH145的DNA包被的1μm钨微粒(M10，Biorad，Hercules，CA)进行轰击)。将轰击后的幼苗在T培养基上培育两天，然后切下叶并在明亮光照(350-500μmo l光子/m²/s)下以离轴侧向上置于含500μg/ml(二)盐酸壮观霉素(Sigma，St.Louis，MO)的RMOP培养基(Svab，Z.、Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.，PNAS 87∶8526-8530，1990)平板上。将轰击后三至八周在变白叶片下面出现的抗性枝条(shoot)亚克隆到相同选择性培养基上，使其形成愈伤组织，并分离和亚克隆次生(secondary)枝条(shoot)。通过Southern印迹(Sambrook等人，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1989)的标准技术评估独立亚克隆中转化质体基因组拷贝(同质性)的完全隔离。在1％Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上分离经BamH I/EcoR I消化的总细胞DNA(Mettler，I.J.，Plant Mol.Biol.Reporter 5：346-349，1987)，转移到尼龙膜(Amersham)上，并用与来自pC8的含有部分rps7/12质体靶向序列的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段对应的32P标记的随机引发DNA序列进行探查。使同质枝条(shoo t)在含壮观霉素的MS/IBA培养基(McBride，K.E.等人，PNAS 91：7301-7305，1994)上无菌生根并转移至温室。

III.育种和种子生产

实施例10：育种

通过用本发明的核酸序列进行转化获得的植物可以是极其多种植物物种，包括单子叶植物和双子叶植物；然而，本发明方法中所使用的植物优选选自上文列举的农业上重要的靶农作物表。通过育种可将本发明的基因连同对产量和质量重要的其它特征的表达引入植物品系。育种的方法和技术是本领域知道的。参阅例如Welsh，J.R.，《Fundamentals of Plant Genetics and Breeding》，John Wiley&Sons，NY，1981；《Crop Breeding》，Wood，D.R.编，American Societyof Agronomy，Madison，Wisconsin，1983；Mayo，0.，《The Theoryof Plant Breeding》，第二版，Clarendon Press，0xford，1987；Singh，D.P.，《Breeding for Resistance to Diseases and InsectPests》，Springer-Verlag，NY，1986；及Wricke和Weber，《Quantitative Genetics and Sele tion Plant Breeding》，Walterde Gruyter and Co.，Berlin，1986。

如上所述改造到转基因种子和植物中的遗传特性通过有性繁殖或营养生长而传代，且由此可在后代植株中得到维持和繁殖。一般而言，所述维持和繁殖利用已知的为了适应特定目的而开发的农业方法，诸如耕作、播种或收获。也可采用诸如水培或温室技术等专业方法。因为生长中的农作物易受由昆虫或感染引起的攻击和损伤以及杂草植物的竞争，所以采取措施来控制杂草、植物疾病、昆虫、线虫、和不利于提高产量的其它条件。它们包括机械措施，诸如耕耘土壤或清除杂草和受感染植株，以及使用农用化学品，诸如除草剂、杀真菌剂、杀配子剂、杀线虫剂、生长调节剂、成熟剂和杀昆虫剂。

依照本发明的转基因植物和种子的有利遗传特性的使用还可在植物育种中进行，它致力于开发具有改良特性的植物，诸如害虫、除草剂、或压力耐受力、提高的营养价值、提高的产量、或使得存放或脱粒引起的损失降低的改进的结构。各种育种步骤的特征是详细说明的人为干预，诸如选择进行杂交的株系、指导亲本株系的授粉、或选择适当的后代植株。根据期望的特性，采取不同的育种措施。相关技术是本领域众所周知的，包括但不限于杂交、近交、回交育种、多系育种、品种混和、种间杂交、非整倍体技术等。杂交技术还包括通过机械、化学、或生化手段的植物绝育以生成雄性或雌性不育植物。雄性不育植物与不同株系的花粉的杂交授粉确保了雄性不育而非雌性不育植物的基因组将统一获得两种亲本株系的特性。由此，依照本发明的转基因种子和植物可用于改良植物系的育种，例如提高常规方法诸如除草剂或杀虫剂处理的效力或者由于它们的改良遗传特性容许免除所述方法。或者，可获得具有改良压力耐受力的新农作物，它们由于优化的遗传“装备”而生成质量比不能耐受可比不利发育条件的产物更好的收获产物。

实施例11：种子生产

在种子生产中，种子的发芽质量和一致性是关键的产品特征。因为难以保证农作物不合其它农作物和杂草种子，为了控制种子传播的疾病，和为了生产具有优良发芽的种子，富有培育、调理和销售纯种子经验的种子生产者已经开发了相当广泛且详细说明的种子生产实践。由此，农民购买经过鉴定达到特定质量标准的种子，代替使用由他自己的农作物收获的种子，这是常见的实践。通常用含有除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、或其混合物的保护剂涂层处理用作种子的繁殖材料。通常使用的保护剂涂层含有诸如克菌丹、萎锈灵、色拉磨

、methalaxy1和匹雷米甲

等化合物。如果需要，可将这些化合物与配制领域通常采用的其它载体、表面活性剂、或促进施用的佐剂配制在一起，以提供针对由细菌、真菌、或动物害虫引起的损害的保护。可通过用液体制剂浸泡繁殖材料或者通过用湿的或干的联合制剂进行包被来施用保护剂涂层。其它施用方法也是可能的，诸如定向芽或果实的处理。

IV．疾病抗性评估

疾病抗性评估是通过本领域知道的方法进行的。参阅uknes等人，1993；

等人，1996；Alexander等人，1993。例如，下文描述了几种代表性的疾病抗性测定法。

实施例12：寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)(黑梗病)抗性

测定法

针对寄生疫霉，引起黑梗病的生物体，的抗性的测定法是如Alexander等人(1993)所述在培育的六周龄植物上进行的。给植物洒水，使其排水通畅，然后通过向土壤中施用10ml孢子囊悬浮液(300个孢子囊/ml)进行接种。将接种后的植物置于温室中，维持在日间温度23-25℃和夜间温度20-22℃。用于测定法的枯萎指数如下：0＝没有症状；1＝没有症状；1＝有些枯萎迹象，且紧涨度降低；2＝清楚的枯萎症状，但没有腐烂或发育迟缓；3＝清楚的枯萎症状且发育迟缓，但没有明显的茎干腐烂；4＝严重枯萎，且显著的茎干腐烂和对根系的有些损伤；5＝同4，但植物接近或已经死亡，且根系严重减少。所有测定都是对以随机设计排列的植物盲目评分的。

实施例13：丁香假单胞菌抗性测定法

将丁香假单胞菌烟草致病变种菌株#551注射到七株6-7周龄植物的两片较低叶子中，浓度为每毫升H₂O含10⁶或3x10⁶。每个时间点对六株个别植物进行评估。将受到烟草假单胞菌感染的植物依照5点疾病严重性等级进行定级，5＝100％死亡组织，0＝没有症状。对每天的评估进行T检验(LSD)，并在平均疾病定级值后显示分组。在该评估日后面为相同字母的值在统计学上没有显著差异。

实施例14：烟草尾孢(Cercosporanicotiana e)抗性测定法

将烟草尾孢(ATCC#18366)的孢子悬浮液(每毫升100，000-150，000个孢子)以逼进径流喷洒到叶片表面。将植物在100％湿度维持五天。然后每天对植物喷以水雾5-10次。每个时间点对六株个别植物进行评估。将烟草尾孢在显示疾病症状的％叶片面积的基础上进行定级。对每天的评估进行T检验(LSD)，并在平均疾病定级值后显示分组。在该评估日后面为相同字母的值在统计学上没有显著差异。

实施例15：寄生霜霉抗性测定法

针对寄生霜霉的抗性的测定法是如Uknes等人(1993)所述在植物上进行的。通过喷洒分生孢子悬浮液(每毫升约5×10⁴个孢子)给植物接种相容寄生霜霉的隔离群。将接种后的植物在14小时白天/10小时夜晚循环的栽培室中在潮湿条件下于17℃培育。在接种后3-14天、优选7-12天对植物检查分生孢子的存在。另外，由每种处理随机选择几株植物，并用乳酚-锥虫蓝染色(Keogh等人，1980)以进行显微镜检查。

实施例16：二元启动子∷报道基因质粒的构建

构建了用于拟南芥转化的二元启动子∷报道基因质粒(pNOV2374)。使用GATEWAY^TM技术依照制造商的方案如操作说明书(LifeTechnologies，Rockviile，MD)中所述通过重组将调控/启动子序列与GUS报道基因(Jefferson等人，EMBO J6：3901-3907，1987)融合。然后通过电穿孔将构建物转化到根癌农杆菌菌株中。

pNOV2374是具有VS1复制起点、主链中一个拷贝的农杆菌VirG基因、及T-DNA左界和右界序列之间的Basta抗性选择标记盒的二元载体。Basta

选择标记盒包含与编码Basta

抗性的基因(即“BAR”基因，膦丝菌素乙酰基转移酶)(white等人，Nucl.Acids Res.18：1062，1990)和35S终止子可操作连接的根癌农杆菌冠瘿碱(manopine)合酶启动子(AtMas)(Barker等人，Plant Mo1.Bio1.2：335-350，1983)。AtMas启动子、BAR编码序列、和35S终止子分别位于pNOV2374的第4211至4679位、第4680至5228位、和第5263至5488位核苷酸。该载体包含GATEWAY^TM重组成分，它们是通过使用GATEWAY^TM载体变换系统(LifeTechnologies，Rockville，MD)连接含attR位点、ccdB、和氯霉素抗性标记的平端盒而导入二元载体主链的。GATEWAY^TM盒位于pNOV2374的第126和1818位核苷酸之间。通过LR重组反应插入启动子盒，由此消除pNOV2374第126和1818位核苷酸之间的DNA序列并用侧翼为att序列的目的启动子替换。重组导致启动子序列与含内含子的GuS报道基因(GIG)融合。GIG基因(SEQ ID NO：29)在GUS第385至576位核苷酸含有来自马铃薯(Solanum tuberosum)的ST-LS1内含子(来自Stanton Gelvin博士，Purdue University，并描述于Narasimhulu等人，Plant Cell 8：873-886，1996)。选择标记和启动子-报道基因盒在二元载体中的取向如下：

右界--NI16启动子片段(即SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27、或SEQ ID NO：28)+GIG基因(SEQ ID NO：29)+nos--AtMas+BAR+35S终止子左界

为了比较启动子活性，用与GIG基因(SEQ ID NO：29)和nos启动子可操作连接的已知拟南芥PR1(SEQ ID NO：30)和SMAS(SEQ ID NO：31)启动子(分别参阅Plant J.16(2)：223-233，1998和Plant Mol.Biol.20(2)：219-233，1992)制备了其它构建物。选择标记和启动子-报道基因盒在这些二元载体构建物中的取向如下：

右界   AtPR1启动子(SEQ ID NO：30)+GIG基因(SEQ ID NO：29)+nos--AtMas+BAR+35S终止子左界

右界    SMAS启动子(SEQ ID NO：31)+GIG基因(SEQ ID NO：29)+nos--AtMas+BAR+35S终止子左界

实施例17：拟南芥转化

1.植物的准备和种植

将拟南芥种子以每个4″罐9粒种子密度播种到弄湿的Fafard发芽混合物上，置于浅盘中，盖上塑料罩以保持湿气，然后移到生长室中。发芽后，摘下罩子，并使植物在短日照(8小时光照)条件下生长3-5周以促经营养生长和具有许多花的大型植株的生成。通过提供2-3周的长日照(16小时光照)条件来诱导开花，此时植物已可进行农杆菌中的浸泡接种以生成转基因植物。

2.农杆菌转化、培养物生长、和为植物渗透做准备

通过电穿孔将二元启动子∷报道基因质粒导入农杆菌。二元质粒赋予细菌以壮观霉素抗性，容许含有质粒的细胞通过在LB+壮观霉素(50mg/L)的平板上的菌落生长得到选择。通过来自细菌的质粒DNA的序列分析验证存在正确的启动子∷GUS质粒。

在植物转化前两天，将5ml LB+壮观霉素(50mg/L)培养基接种含有二元启动子∷GUS质粒的农杆菌菌株，并于30℃温育约2 4小时。然后将每份5ml培养物转移至500ml LB+壮观霉素(50mg/L)，并于30℃温育约24小时。将每份500ml培养物转移到离心瓶中，并在Sorvall离心机中以5000rpm离心10分钟。取出上清液并保留沉淀的农杆菌细胞。将农杆菌细胞重悬于500ml修改后渗透培养基(IM+MOD：50g/L蔗糖、10mM MgCl、1OμM苄氨基嘌呤)，其中已经添加了50μl Silwet L-77(Dupont)。

3.通过浸泡渗透进行的植物转化

将重悬细胞倒入1升三角倒嘴烧杯中。在植物倒插入培养基后，确认所有的花序都覆盖了细菌。将烧杯轻轻摇动30秒，保持所有的花序组织都被淹没。在浸泡接种农杆菌后将植物送回生长室。可在5天后进行第二次浸泡以提高转化频率。转化后约4至6周收获种子。

4.转基因拟南芥的选择

将来自经转化拟南芥植株的种子播种到浅盆中弄湿的Fafard发芽混合物上，盖上罩子以保持湿气，然后置于生长室中。发芽后，给幼苗喷洒除草剂BASTA。由于二元启动子∷GUS质粒中存在BAR基因，所以转基因植物具有BASTA

抗性。

实施例18：启动子活性诱导测定法

1.用水杨酸处理

给三至四周龄植物喷洒溶于H₂O的5mM水杨酸(SA)。如细雾般对叶片施加处理。在施加SA前(T₀)和施加后各个时间间隔收集叶片组织用于β-葡糖醛酸糖苷酶(GuS)荧光测定法。

2.通过缓冲液注射或病原体接种处理

给三至四周龄植物的叶子注射10mM MgCl₂(缓冲液)或接种病原体含avrRPMI无毒基因的丁香假单胞菌斑生致病变种，它在拟南芥的Ws栽培变种中引起超敏应答(HR)。用缓冲液或病原体处理后立即收集叶片组织(T₀)，并在注射后的各个时间间隔收集叶片组织。通过β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)荧光评估启动子活性。

实施例19：报道基因测定法

使用β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的组织化学和荧光测定法定性和定量评估启动子活性。

1.组织化学β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)测定法

为了定性评估启动子活性，将各种拟南芥组织和器官用于GUS组织化学测定法。将完整器官或组织碎片浸入GUS染色液。GUS染色液含有1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸(X-Gluc，Duchefa，溶于DMSO的20mM储液)、100mM磷酸钠缓冲液pH 7.0、10mM EDTA pH8.0、和0.1％Triton X100。将组织样品于37℃温育1-16小时。如果需要，可通过几次70％乙醇清洗除去叶绿素，使样品清晰。染色后，在可见光显微镜下观察组织以评估显示GUS表达型式的蓝色染色。

2.β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)荧光测定法

为了在诱导处理后或者在各种拟南芥组织和器官中定量分析启动子活性，通过荧光测定法测量GUS表达。收集组织样品并在冰冷的GUS提取缓冲液(50mM Na₂HPO₄ pH7.0、5mM DTT、1mM Na₂EDTA、0.1％TritonX100、0.1％十二烷基肌氨酸钠)中研磨。将磨碎的样品在微量离心机中于4℃以10,000离心15分钟。离心后，取出上清液用于GUS测定和蛋白质浓度测定。

为了测量GUS活性，在预热至37℃的GUS测定缓冲液(50mM Na₂HPO₄pH7.0、5mM DTT、1mM Na₂EDTA、0.1％Tr it on X100、0.1％十二烷基肌氨酸钠、1mM 4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖醛酸二水合物(MUG))中测定植物提取物。温育反应液，在30分钟里以10分钟为间隔取出100μ1小样，并通过将100μ1小样加到装有900μ12％Na₂CO₃的管中终止反应。然后在Tecan分光荧光计上对终止的反应液于365nm激发和455发射波长读数。蛋白质浓度是使用BCA测定法依照制造商的方案测定的。GUS活性表述为pmol MU/mg蛋白质/min。

表4：水杨酸(SA)处理后NI16启动子片段活性的比较

通过施用SA诱导

表5：病原体处理后NI16962bp启动子片段的活性通过缓冲液或病原体接种诱导

本说明书中所引用的所有出版物、公开的专利文件、和专利申请书表明了本发明所属领域的技术水平。将本文所引用的所有出版物、公开的专利文件、和专利申请书引入本文作为参考，其程度就像明确且个别指出将每一篇个别出版物、公开的专利文件、或专利申请书引入本文作为参考一样。

上文参照各种实施方案和实施例描述了本发明。所有具体的实施方案、实施例、或者具体实施方案或实施例的要素都不应解释为任何或所有权利要求的至关重要的、必需的、或本质的要素或特色。在用于本文时，术语“包含”、“包括”、“含有”及其任何变体意图覆盖不排他的内容，使得包含、包括、或含有某种要素或要素列表的所述过程、方法、方法限定的产品、或组合物不仅包括那些要素，而且可包括没有明确列出的或并非所述过程、方法、方法限定的产品、或组合物内在的其它要素。另外，本文所描述的所有要素都不是实践本发明所必需的，除非明确描述为“本质的”或“至关重要的”。

应答领会，可以对公开的实施方案进行各种修改和替代，而不会背离下文权利要求所列举的本发明范围。说明书，包括附图和实施例，应视作例示方式，而非限制性的，而且所有修改和替代意图包括在本发明的范围之内。因此，本发明的范围应当由所附权利要求及其法定等价物来决定，而非上文给出的实施例。例如，在任何方法或过程权利要求中所引用的步骤可以任何可行顺序执行，而不限于任何权利要求中所提出的顺序。

参考文献

本文所引用的参考文献表明了本领域的当前状况。将下列每一篇引入本公开书作为参考。

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Claims (13)

1.由启动子组成的分离的核酸分子，其中该启动子由SEQ ID NO：26组成。

2.包含与目的编码序列可操作连接的权利要求1的分离的核酸分子的嵌合基因。

3.包含权利要求2的嵌合基因的重组载体。

4.包含权利要求2的嵌合基因的转基因宿主细胞。

5.权利要求4的转基因宿主细胞，其中该宿主细胞是植物细胞。

6.由启动子组成的分离的核酸分子，其中该启动子由SEQ IDNO：24或其片段组成，所述SEQ I D NO：24的片段由SEQ I D NO：25、SEQID NO：26和SEQ ID NO：27之一组成。

7.权利要求6的分离的核酸分子，其中所述启动子可由系统获得性抗性诱导化学品或病原体诱导。

8.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述系统获得性抗性诱导化学品是水杨酸或苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯。

9.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述病原体是丁香假单胞菌。

10.包含与目的编码序列可操作连接的权利要求6的分离的核酸分子的嵌合基因。

11.包含权利要求10的嵌合基因的重组载体。

12.包含权利要求10的嵌合基因的转基因宿主细胞。

13.权利要求12的转基因宿主细胞，其中该宿主细胞是植物细胞。