ES2709025T3 - Compuestos sintéticos para respuestas aba vegetativas - Google Patents

Abstract

Una formulación agrícola, que comprende un compuesto de Fórmula I: **Fórmula** en la que: R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, cada uno opcionalmente sustituido con 1-4 grupos R2a, cada R2a se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H, halógeno, alquilo C1-6, alcoxi C1- 6, haloalquilo C1-6, haloalcoxi C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, -OH, alquilhidroxi C1-6, -CN, -NO2, -C(O)R2b, - C(O)R2b, -OC(O)R2b, -C(O)NR2bR2c, -NR2bC(O)R2c, -SO2R2b, -SO2OR2b, -SO2NR2bR2c, y -NR2bSO2R2c, cada uno de R2b y R2c se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-6, cada uno de R3, R4 y R5 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-6, L es un enlazador seleccionado de entre el grupo que consiste en un enlace y alquileno C1-6, el subíndice m es un número entero de 0 a 4, el subíndice n es un número entero de 0 a 3, o una sal o isómero del mismo; en la que la sulfonamida -N(R5)SO2LR2 está en la posición 6.

Description

DESCRIPCION

Compuestos sinteticos para respuestas aba vegetativas

Antecedentes de la invencion

El acido abscfsico (ABA) es una hormona de planta que regula la transduccion de senales asociada con las respuestas al estres abiotico (Cutler et al., 2010, Abscisic Acid: Emergence of a Core Signaling Network. Annual Review of Plant Biology 61:651-679). La ruta de senalizacion ABA se ha aprovechada para mejorar la respuesta al estres de la planta y los rasgos de rendimiento asociados a traves de numerosos enfoques (Yang et al., 2010, Mol. Plant, vol. 3, n.° 3, pags. 469-490). La aplicacion directa de ABA a las plantas mejora su eficiencia en el uso del agua (Raedmacher et al., 1987, en: Hawkins AF, Stead AD, Pinfield NJ (eds.) Plant growth regulators for agricultural and amenity use. BCPC Monograph 36:53-66.). Por este motivo, el descubrimiento de los agonistas de ABA ha recibido una atencion cada vez mayor, ya que dichas moleculas pueden ser beneficiosas para mejorar el rendimiento de los cultivos (Park et al., 2009, Science, vol. 324, n.° 5930, pags. 1068-1071; Melcher et al., 2010, Identification and mechanism of ABA receptor antagonism. Nature Structural & Molecular Biology 17(9):1102-1110; Notman et al., Royal Society of Chemistry (1 de mayo de 2009) http://www.rsc.org/chemistryworld/News/2009/May/01050901.asp).

El primer agonista sintetico de ABA identificado fue la naftalensulfonamida llamada pirabactina (Park et al., 2009), que activa de manera eficiente la senalizacion de ABA en las semillas, pero tiene una actividad limitada en los tejidos vegetativos, en los que se producen los aspectos mas crfticos de la tolerancia al estres abiotico. Se han divulgado sulfonamidas muy similares a la pirabactina como agonistas de ABA (vease la publiacion de patente de EE.UU. n.° 20130045952) y compuestos moduladores del estres abiotico (vease la publicacion de patente de EE.UU. n.° 20110230350); y tambien se han descrito los agonistas de ABA sin sulfonamida (vease la publicacion de patente de EE.UU n.° 20130045952 y 20110271408).

Un enfoque complementario para activar la ruta ABA implica aumentar la sensibilidad de una planta a ABA a traves de metodos geneticos. Por ejemplo, el antisentido condicional del gen de la subunidad beta de la farnesil transferasa, que aumenta la sensibilidad ABA de una planta, mejora el rendimiento en condiciones de sequfa moderada tanto en la canola como en la Arabidopsis (Wang et al., 2005, The Plant Journal, vol. 43, n.° 3, pags. 413-424). Por lo tanto, la manipulacion de la senalizacion ABA para mejorar los rasgos que contribuyen al rendimiento esta ahora bien establecida.

Recientemente se ha descubierto que el ABA provoca muchas de sus respuestas celulares al unirse a una familia de receptores solubles llamados protefnas PYR/PYL. Las protefnas PYR/PYL pertenecen a una gran familia de protefnas de union a ligandos llamada la superfamilia START (Iyer et al., 2001, Protens: Structure, Function, and Bioinformatcis, vol. 43, n.° 2, pags. 134-144; Ponting et al., 1999, Trends Biochem, vol. 24, n.° 4, pags. 130-132). Estas protefnas contienen una arquitectura tridimensional conservada que consta de siete laminas beta anti-paralelas, que rodean una helice alfa central para formar un motivo de "agarre de helice"; conjuntamente, estos elementos estructurales forman un bolsillo de union a ligando para unir ABA u otros agonistas.

El documento WO 2010/093954 divulga el control de la tolerancia al estres de las plantas, la eficiencia en el uso del agua y la expresion genica usando novedosas protefnas receptoras de ABA y agonistas sinteticos.

El documento WO 2011/139798 divulga receptores PYR/PYL modificados activados por ligandos ortogonales.

Breve sumario de la invencion

La presente invencion proporciona agonistas de ABA de molecula pequena, es decir, compuestos que activan protefnas PYR/PYL. En un aspecto, la presente invencion proporciona formulaciones agrfcolas que comprenden los agonistas de ABA descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la formulacion agrfcola comprende un compuesto de Formula I:

en la que

R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo,

R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, cada uno opcionalmente sustituido con 1-4 grupos R2a,

cada R2a se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H, halogeno, alquilo C1-6, alcoxi C16, haloalquilo Ci-6, haloalcoxi Ci-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, -OH, alquilhidroxi C1-6, -C(O)NR2bR2c, -NR2bC(O)R2c -SO2R2b, -SO2OR2b, -SO2NR2bR2c -CN, -NO2, -C(O)R2b, -C(O)OR2b, -OC(O)R2b, y -NR2bSO2R2c,

cada uno de R2b y R2c se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-6, cada uno de R3, R4 y R5 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-6, L es un enlazador seleccionado de entre el grupo que consiste en un enlace y alquileno C1-6, el subfndice m es un numero entero de 0 a 4, el subfndice n es un numero entero de 0 a 3,

o una sal o isomero del mismo;

en la que la sulfonamida -N(R5)SO2LR2 esta en la posicion 6.

En algunas realizaciones, la formulacion agrfcola comprende ademas una sustancia qufmica agrfcola que es util para promover el crecimiento de las plantas, reducir las malas hierbas o reducir las plagas. En algunas realizaciones, la formulacion agrfcola comprende ademas al menos uno de un fungicida, un herbicida, un plaguicida, un nematicida, un insecticida, un activador de plantas, un sinergista, un protector de herbicidas, un regulador del crecimiento de la planta, un repelente de insectos, un acaricida, un molusquicida o un fertilizante. En algunas realizaciones, la formulacion agrfcola comprende ademas un tensioactivo. En algunas realizaciones, la formulacion agrfcola comprende ademas un portador.

En otro aspecto, la invencion proporciona metodos para aumentar la tolerancia al estres abiotico en una planta, comprendiendo el metodo la etapa de poner en contacto una planta con una cantidad suficiente de las formulaciones anteriores para aumentar la tolerancia al estres abiotico en la planta en comparacion con la tolerancia al estres abiotico en la planta cuando no se pone en contacto con la formulacion. En algunas realizaciones, la planta es una monocotiledonea. En algunas realizaciones, la planta es una dicotiledonea. En algunas realizaciones, la tolerancia al estres abiotico comprende tolerancia a la sequfa.

En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para inhibir la germinacion de semillas en una planta, comprendiendo el metodo la etapa de poner en contacto una planta, una parte de la planta o una semilla de la planta con una cantidad suficiente de las formulaciones anteriores para inhibir la germinacion.

En otro aspecto, la invencion proporciona una planta o una parte de la planta que comprende las formulaciones anteriores. En algunas realizaciones, la planta es una semilla.

En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para activar una protefna PYR/PYL. En algunas realizaciones del metodo, la protefna PYR/PYL se une a un polipeptido de protefna fosfatasa de tipo 2 (PP2C) cuando la protefna PYR/PYL se une al compuesto agonista LC66C6 (tambien denominado en el presente documento quinabactina). En algunas realizaciones, el metodo comprende la etapa de poner en contacto la protefna PYR/PYL con cualquiera de los compuestos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la protefna PYR/PYL que se activa es sustancialmente identica a cualquiera de las SEQ ID NO:1-119. En algunas realizaciones, la protefna PYR/PYL se expresa por una celula. En algunas realizaciones, la protefna PYR/PYL se expresa por una celula de planta. En algunas realizaciones, a protefna PYR/PYL es una protefna endogena. En algunas realizaciones, la protefna PYR/PYL es una protefna heterologa. En algunas realizaciones, la celula expresa ademas una protefna fosfatasa de tipo 2 (PP2C). En algunas realizaciones, la protefna fosfatasa de tipo 2 es HAB1 (homologfa con ABI1), ABI1 (insensible al acido abscfsico 1) o ABI2 (insensible al acido abscfsico 2).

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Los novedosos agonistas de ABA se unen a multiples PYR/PYL. (A) Estructura qufmica de (+)-ABA de origen natural, su (-) analogo y agonistas de ABA seleccionados. (B) Ensayos agonistas de dos hfbridos de levadura de sensibilidad al receptor PYR/PYL a 5 uM de sustancias qufmicas de prueba. Los receptores PYR/PYL especfficos y el PP2C HAB1 se expresan como protefnas de fusion Gal4 BD o AD respectivamente, como se describe en el texto.

Figura 2. Los novedosos agonistas de ABA inhiben la actividad de PPC2 a traves de multiples PYR/PYL.

(A) Estructura qufmica de (+)-ABA de origen natural y agonistas de ABA seleccionados. (B) y (C) Ensayos agonistas de ABA basados en la actividad de las enzimas HAB1, ABI1, y ABI2 PP2C para diversos receptores en presencia o ausencia de 10 pM de cada sustancia qufmica de prueba.

Figura 3. (A) Inhibicion dependiente de la dosis mediada por receptores de la actividad de la enzima PP2C por los agonistas y analogos de ABA. (B) Valores de CI50 de los compuestos observados en ensayos enzimaticos de agonistas de ABA basados en HAB1 PP2C.

Figura 4. La quinabactina activa multiples receptores de ABA. (A) Estructuras qufmicas de ABA, pirabactina y quinabactina. (B) Inhibicion qufmica-dependiente de HAB1 por los receptores de ABA. Los valores de CI50 (nM) se determinaron como se describe en los metodos usando HAB1 50 nM, 50 nM y multiples concentraciones de compuestos; Las curvas de respuesta a la dosis completa se proporcionan como en la Figura 3. (nd) corresponden a receptores que no fueron producidos como protefnas activas. El arbol filogenetico es un arbol Neighbor-Joining que se fabrica usando la matriz de distancia JTT en MEGA5 (Tamura K, et al. (2011) MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28(10):2731-2739).

Figura 5. Los novedosos agonistas de ABA inhiben la germinacion de semillas de Arabidopsis con mas fuerza que la pirabactina. (A) y (B) Comparacion de la inhibicion de la germinacion de semillas por los agonistas de ABA. (C) y (D) los efectos de ABA y LC66C6 (tambien llamada quinabactina) sobre los mutantes deficientes en la senalizacion y biosfntesis de ABA de Arabidopsis en la germinacion (C) y el establecimiento de plantulas (D). Las semillas se sembraron en una placa de agar MS 1/2X que contenfa sustancias qufmicas, y se almacenaron a 4 °C durante 4 dfas, luego se transfirieron a 22 ± 2 °C. Las fotograffas (A y C) y las puntuaciones de germinacion (B) o cotiledones verdes (D) se evaluaron despues de una incubacion de 4 dfas bajo iluminacion continua. El estudio de panel C muestra los ensayos de germinacion en 5 pM de ABA o LC66C6.

Figura 6. LC66C6 inhibe el crecim iento de las plantas. (A) Fotograffas que muestran el efecto de ABA, pirabactina y LC66C6 en los genotipos de Arabidopsis de tipo silvestre, abi1-1 y cuadruples mutantes de PYR/PYL. (B) Inhibicion del crecimiento de la rafz y (C) Inhibicion del crecimiento de la planta por A^{b a} , LC66C6 y pirabactina. Las plantulas de dos dfas se transfirieron a una placa 1/2X MS que contenfa sustancias qufmicas y los fenotipos se puntuaron o fotografiaron despues de una incubacion de 5 dfas en los compuestos de prueba.

Figura 7. LC66C6 mejora la tolerancia al estres por sequfa. LC66C6 reprime la perdida de agua por transpiracion de las hojas desprendidas en el tipo silvestre (A) y los genotipos mutantes aba2 (B). (C) LC66C6 no puede rescatar los fenotipos del genotipo insensible a ABA abi1-1. (D) LC66C6 induce el cierre del estoma en los genotipos de tipo silvestre y aba2, pero no abi1-1. (E) Efectos de los compuestos en el contenido de agua del suelo durante los tratamientos de sequfa en la soja. El contenido de agua del suelo se midio como se describe en los ejemplos.

Figura 8. La quinabactina confiere tolerancia al estres por sequfa en plantas de tipo silvestre. (A) Efecto de la quinabactina sobre la tolerancia a la sequfa de Arabidopsis. Las plantas de dos semanas de edad se sometieron a estres por sequfa mediante la retencion de agua y se fotografiaron despues de 12 dfas. Durante el perfodo de sequfa, las plantas se trataron cada 3 dfas con un compuesto de 25 pM. Las plantas se rehidrataron despues de un tratamiento de sequfa de 2 semanas; el numero de plantas supervivientes (del numero total probado) para cada tratamiento se muestra al lado de cada imagen. (B) Efectos de la quinabactina sobre la soja. Las plantas de dos semanas de edad se sometieron a estres por sequfa mediante la retencion de agua y se fotografiaron despues de un tratamiento de sequfa de 8 dfas. Para todos los tratamientos de estres por sequfa, los compuestos (probados a 25 pM para Arabidopsis y 50 pM para soja) se aplicaron en soluciones que contenfan Tween-20 al 0,05 % y se aplicaron como aerosoles cada 3 dfas durante el regimen de sequfa. Los valores para todos los experimentos son medias ± ETM (n = 6, 3 plantas usadas por experimento).

Figura 9. LC66C6 induce numerosos genes sensibles a ABA. (A) Muestra los niveles de expresion de ARNm inducidos por sustancias qufmicas de los genes indicadores sensibles a ABA RD29B y MAPKKK18 en el tipo silvestre, abi1-1, y los genotipos cuadruples mutantes de los receptores pyr1/pyl1/pyl2/pyl4 de plantulas de Arabidopsis tratadas con vehfculo (DMSO), pirabactina, LC66C6 o (+)-ABA. (B) ^lC66C6 induce de manera eficiente genes sensibles a ABA en plantulas de Arabidopsis, mientras que la pirabactina no lo hace. Las plantulas de diez dfas se trataron con un disolvente portador (DMSO) o con ABA 25 pM, pirabactina o LC66C6 durante 8 horas. A continuacion se preparo el ARN total marcado e hibridado con micromatrices ATH1. Los datos representados son valores de expresion media transformados por log2 para sondas ~13K que fueron detectables en todos los experimentos. Los datos mostrados son promedios determinados a partir de replicas biologicas por triplicado. (C) y (D) muestran la expresion de un gen indicador en diferentes tejidos de plantas despues del tratamiento con vehfculo (DMSO), pirabactina, LC66C6 o (+)- ABA.

Figura 10. Expresion de los genes sensibles a ABA en mutantes individuales de PYR/PYL. La respuesta de los ARNm de MAPKKK18, RD29A y RD29B sensibles a ABA a LC66C6, ABA y pirabactina se caracterizo en los ecotipos Col y Ler y los genotipos mutantes individuales pyr1, pyl1, ply2, pyl3 y pyl4.

Figura 11. LC66C6 induce la expresion de los genes sensibles a ABA en plantas de tipo silvestre, abi1-1 y los cuadruples mutantes de PYR/PYL. LC66C6 y (+)- ABA indujeron la expresion de ABF3, GBF3, NCED3, y RD29A en una manera dependiente de la dosis en las plantas de tipo silvestre Col, mientras que la pirabactina no lo hace.

Figura 12. La sensibilidad de LC66C6 no se ve influenciada por la CYP707A ABA: hidroxilacion de enzimas. (A) muestra las fotograffas y (B) muestra la cuantificacion de la longitud de la rafz primaria en plantas de tipo silvestre, plantas que sobreexpresan CYP707A (CYP707AOX) y plantas que son doble mutantes para cyp707a tratada con DMSO, (+)-ABA 40 pM y LC66C640 pM. (C) muestra peso fresco y (D) muestra el porcentaje de plantas con cotiledones verdes en las plantas tratadas como en (A).

Figura 13. LC66C6 modula las respuestas de ABA en diversas especies. Inhibicion de la germinacion (A) y perdida de agua por transpiracion en hojas desprendidas 2 horas despues del desprendimiento (B) en respuesta a los compuestos mostrados. La expresion de genes marcadores sensibles a ABA en soja (C), cebada (D) y mafz (E) despues de la aplicacion de sustancias qufmicas. D, P, L y A indican DMSO, pirabactina, LC66C6 y (+)-ABA, respectivamente.

Figura 14. Estructura qufmica de ABA y agonistas.

Figura 15. El efecto de ABA y agonistas en los ensayos de levadura y germinacion de semillas. (A) muestra los resultados de los ensayos de dos hfbridos de levadura usando los receptores PYR/PYL PYR1, PYL1, PYL2, PYL3 y PYL4 para probar la respuesta a cada uno de los agonistas que se muestran en la Figura 14. (B) muestra los resultados de las pruebas de los agonistas en la Figura 14 sobre la germinacion de semillas de tipo silvestre. (C) muestra los efectos de los compuestos en una lfnea indicadora de ABA segun se mide usando ensayos de glucuronidasa en una lfnea transgenica que expresa glucuronidasa bajo el control del gen de Arabidopsis inducible por ABA MAPKKK18.

Figura 16. La aplicacion de LC66C6 puede rescatar los defectos de crecimiento observados en el mutante aba2 deficiente en ABA. La solucion qufmica (25 pM) se pulverizo en plantas de 14 dfas dos veces al dfa durante 2 semanas. La imagen (A) y el peso fresco (B) se obtuvieron de plantas de 4 semanas.

Figura 17. El efecto de ABA y sus agonistas en Physcomitrella patens y Chlamydomonas. Imagenes de crecimiento del protonema (A) y analisis cuantitativo (B) de los efectos de ABA y agonistas en Phsycomitrella patens. Los protonemas se cultivaron en 200 pM de sustancia qufmica de prueba especffica durante 10 dfas. Los efectos de LC66C6 fueron debiles, pero inhibieron significativamente el crecimiento del protonema. La pirabactina blanqueo el protonema. (C) La expresion de genes sensibles a ABA de Physcomitrella patens. Los protonemas se trataron con soluciones qufmicas 200 pM durante 3 h. (D) Crecimiento de colonias de Chlamydomonas en la sustancia qufmica con estres por salinidad y estres osmotico. No hubo efecto de ABA y LC66C6 en el crecimiento de Chlamydomonas con y sin estres. La pirabactina blanqueo Physcomitrella patens y Chlamydomonas, lo que sugiere que este compuesto puede tener toxicidad en estas especies no relacionadas con su actividad agonista ABA.

La Figura 18 muestra un resumen de los compuestos agonistas probados por su efecto sobre la inhibicion de la germinacion y pMAPKK18: expresion del indicador Gus. +++++ indica una actividad fuerte, mientras que un solo indica una actividad debil, un guion (-) indica que no hay actividad, y nd indica que no esta determinado.

Definiciones

Los "agonistas" son agentes que, por ejemplo, inducen o activan la expresion de una protefna diana descrita o se unen, estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, aumentan la activacion, sensibilizan o regulan positivamente la actividad de una o mas protefnas PYR/PYL de plantas (o polinucleotido codificante). Los agonistas pueden incluir moleculas de origen natural y sinteticas. En algunas realizaciones, los agonistas se combinan con agroqufmicos para producir y formulacion agrfcola. Ejemplos de agroqufmicos adecuados incluyen fungicidas, herbicidas, plaguicidas, fertilizantes y/o tensioactivos. Los ensayos para determinar si un agonista "agoniza" o "no agoniza" una protefna PYR/PYL incluyen, por ejemplo, poner en contacto los agonistas supuestos con la(s) protefna(s) PYR/PYL purificada(s) y luego determinar los efectos funcionales sobre la actividad de la protefna PYR/PYL, como se describe en el presente documento, o poner en contacto los agonistas supuestos con celulas que expresan la(s) protefna(s) PYR/PYL y luego determinar los efectos funcionales sobre la actividad de la protefna diana descrita, como se describe en el presente documento. Un experto en la tecnica sera capaz de determinar si un ensayo es adecuado para determinar si un agonista agoniza o no agoniza una protefna PYR/PYL. Las muestras o ensayos que comprenden protefnas PYR/PYL que se tratan con un agonista supuesto se comparan con las muestras de control sin el agonista para examinar el alcance del efecto. A las muestras de control (no tratadas con agonistas) se les asigna un valor de actividad relativa del 100 %. El agonismo de la protefna PYR/PYL se alcanza cuando el valor de la actividad en relacion con el control es del 110 %, opcionalmente 150 %, opcionalmente 200, 300 %, 400 %, 500 %, o 1000-3000 % o mas alto.

La expresion "polipeptido del receptor PYR/PYL" se refiere a una protefna caracterizada en parte por la presencia de uno o mas o todos de un dominio de policetido ciclasa 2 (PF10604), un dominio de policetido ciclasa 1 (PF03364) y un dominio de Bet VI (PF03364), que en forma de tipo silvestre media el acido abscfsico (ABA) y la senalizacion analogica de ABA. Una amplia diversidad de secuencias polipeptfdicas del receptor PYR/PYL son conocidas en la tecnica. En algunas realizaciones, un polipeptido del receptor PYR/PYL comprende un polipeptido que es sustancialmente identico a uno cualquiera de las SEQ ID NO:1-119. Vease, por ejemplo, la solicitud PCT publicada del documento WO 2011/139798.

La expresion "ensayo de actividad" se refiere a cualquier ensayo que mida o detecte la actividad de un polipeptido del receptor PYR/PYL. Un ensayo ejemplar para medir la actividad del receptor PYR/PYL es un ensayo de dos hfbridos de levadura que detecta la union de un polipeptido PYR/PYL a un polipeptido de la protefna fosfatasa de tipo 2 (PP2C), tal como se describe en los Ejemplos.

Se dice que dos secuencias de acido nucleico o polipeptidos son "identicas" si la secuencia de nucleotidos o restos de aminoacidos, respectivamente, en las dos secuencias es la misma cuando se alinea para la maxima correspondencia como se describe a continuacion. Los terminos "identico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o mas secuencias de acidos nucleicos o polipeptidos, se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especffico de restos de aminoacidos o nucleotidos que son iguales, cuando se compara y alinea para la correspondencia maxima en una ventana de comparacion, segun lo medido usando uno de los siguientes algoritmos de comparacion de secuencias o mediante alineacion manual e inspeccion visual. Cuando se usa un porcentaje de identidad de secuencia en referencia a protefnas o peptidos, se reconoce que las posiciones de restos que no son identicas a menudo difieren por sustituciones de aminoacidos conservativas, en las que se sustituyen restos de aminoacidos por otros restos de aminoacidos con propiedades qufmicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molecula. Cuando las secuencias difieren en las sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitucion. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Tfpicamente esto implica puntuar una sustitucion conservativa como una falta de coincidencia parcial mas que completa, aumentando, por tanto, el porcentaje de identidad de secuencia. Por lo tanto, por ejemplo, cuando a un aminoacido identico se le asigna una puntuacion de 1 y a una sustitucion no conservativa se le asigna una puntuacion de cero, se asigna una puntuacion entre cero y 1 a la sustitucion conservativa. La puntuacion de las sustituciones conservativas se calcula de acuerdo con, por ejemplo, el algoritmo de Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17 (1988) por ejemplo, como se implemento en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, EE.UU.).

La expresion "sustancialmente identico", usada en el contexto de dos acidos nucleicos o polipeptidos, se refiere a una secuencia que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con una secuencia de referencia. Como alternativa, el porcentaje de identidad puede ser cualquier numero entero de 60 % a 100 %. Algunas realizaciones incluyen al menos: 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %, en comparacion con una secuencia de referencia que usa los programas descritos en el presente documento; preferentemente BLAST usando parametros convencionales, como se describe a continuacion. Las realizaciones de la presente invencion proporcionan polipeptidos y acidos nucleicos que codifican polipeptidos, que son sustancialmente identicos a cualquiera de las SEQ ID NO:1-119.

Para la comparacion de secuencias, tfpicamente una secuencia actua como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parametros del programa del algoritmo de secuencias. Se pueden usar los parametros predeterminados del programa, o se pueden designar parametros alternativos. El algoritmo de comparacion de secuencia calcula luego el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba en relacion con la secuencia de referencia, basandose en los parametros del programa.

Una "ventana de comparacion", como se usa en el presente documento, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera del numero de posiciones contiguas seleccionadas de entre el grupo que consiste en de 20 a 600, por lo general, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, mas generalmente, de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas una vez alineadas las dos secuencias de manera optima. Los metodos de alineacion de secuencias para la comparacion son bien conocidos en la tecnica. La alineacion optima de secuencias para la comparacion puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologfa local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homologfa de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.

48:443 (1970), mediante el metodo de busqueda por similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante la alineacion manual y visual.

Los algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, respectivamente. El software para realizar los analisis de BLAST esta disponible publicamente a traves del sitio web del National Center for Biotechnology Information (NCBI). El algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuacion (HSP) mediante la identificacion de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen alguna puntuacion umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se conoce como el umbral de puntuacion de palabras adyacentes (Altschul et al, supra). Estos aciertos de palabra adyacente iniciales actuan como semillas para iniciar busquedas para encontrar HSP mas largos que los contengan. Los aciertos de palabra entonces se prolongan en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia todo el tiempo que pueda aumentarse la puntuacion de alineacion acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para las secuencias de nucleotidos, los parametros M (puntuacion de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuacion de penalizacion para restos no coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoacidos, se usa una matriz de puntuacion para calcular la puntuacion acumulativa. La prolongacion de los aciertos de palabra en cada direccion se detiene cuando: la puntuacion de alineacion acumulativa queda fuera por una cantidad X de su valor maximo alcanzado; la puntuacion acumulativa llega a cero o por debajo, debido a la acumulacion de una o mas alineaciones de restos de puntuacion negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parametros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineacion. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) usa por defecto un tamano de palabra (W) de 28, una expectativa (E) de 10, M=1, N = -2 y una comparacion de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP usa por defecto un tamano de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:10915 (1989)).

El algoritmo BLAST tambien realiza un analisis estadfstico de la similitud entre dos secuencias (vease, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma mas pequena (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad por la que sucederfa una coincidencia entre dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos por casualidad. Por ejemplo, un acido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma mas pequena en una comparacion del acido nucleico de prueba con el acido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,01, mas preferentemente inferior a aproximadamente 10-5, y lo mas preferentemente inferior a aproximadamente 10-20.

"Variantes modificadas de manera conservativa" se aplica tanto a secuencias de aminoacidos como de acido nucleico. Con respecto a secuencias de acidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de manera conservativa se refieren a aquellos acidos nucleicos que codifican secuencias de aminoacidos identicas o esencialmente identicas, o cuando el acido nucleico no codifica una secuencia de aminoacidos, a secuencias esencialmente identicas. Debido a la degeneracion del codigo genetico, un gran numero de acidos nucleicos funcionalmente identicos codifican cualquier protefna dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos ellos, el aminoacido alanina. Por lo tanto, en cada posicion en la que una alanina se especifica mediante un codon, el codon se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipeptido codificado. Dichas variaciones de acido nucleico se denominan "variaciones silenciosas", que son un especie de variaciones modificadas de manera conservativa. Cada secuencia de acido nucleico del presente documento que codifica un polipeptido tambien describe todas y cada una de las posibles variaciones silenciosas del acido nucleico. Un experto reconocera que cada codon en un acido nucleico (excepto AUG, que habitualmente es el unico codon para la metionina) puede modificarse para producir una molecula funcionalmente identica. En consecuencia, cada una de las variaciones silenciosas de un acido nucleico que codifica un polipeptido esta implfcita en cada secuencia descrita.

En cuanto a las secuencias de aminoacidos, un experto reconocera que las sustituciones individuales, en una secuencia de acido nucleico, peptido, polipeptido o protefna que altera un solo aminoacido o un pequeno porcentaje de aminoacidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de manera conservativa "en la que la alteracion da como resultado la sustitucion de un aminoacido con un aminoacido qufmicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoacidos funcionalmente similares son bien conocidas en la tecnica.

Cada uno de los seis grupos siguientes contienen aminoacidos que son sustituciones conservativas entre si:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2 ) Acido aspartico (D), Acido glutamico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

(vease, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

El termino "planta" incluye plantas enteras, organos y/o estructuras vegetativas de vastagos (por ejemplo, hojas, tallos y tuberculos), rafces, flores y organos florales (por ejemplo, bracteas, sepalos, petalos, estambres, carpelos, anteras), ovulos (incluidos los huevos y las celulas centrales), semillas (incluidos el cigoto, el embrion, el endospermo y la cubierta de semillas), frutos (por ejemplo, el ovario maduro), plantulas, tejidos de plantas (por ejemplo, tejido vascular, tejido del suelo y similares), celulas (por ejemplo, celulas protectoras, celulas huevo, tricomas y similares), y la progenie de los mismos. La clase de plantas que se pueden usar en los metodos de la invencion incluye angiospermas (plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas), gimnospermas, helechos, briofitos y algas multicelulares y unicelulares. Incluye plantas de una diversidad de niveles de ploidfa, que incluyen aneuploides, poliploides, diploides, haploides y hemicigotos.

Como se usa en el presente documento, el termino "transgenico" describe una planta de origen no natural que contiene un genoma modificado por el hombre, en el que la planta incluye en su genoma una molecula de acido nucleico exogena, que puede obtenerse de la misma o de una especie de planta diferente. La molecula de acido nucleico exogena puede ser un elemento regulador del gen tal como un promotor, potenciador u otro elemento regulador, o puede contener una secuencia de codificacion, que puede estar unida a un elemento regulador del gen heterologo. Las plantas transgenicas que surgen del cruce sexual o por autofecundacion son descendientes de dicha planta y tambien se consideran "transgenicas".

Como se usa en el presente documento, la expresion "resistencia a la sequfa" o "tolerancia a la sequfa", incluidas cualquiera de sus variaciones, se refiere a la capacidad de una planta para recuperarse de perfodos de estres por sequfa (es decir, poca o ninguna agua durante un perfodo de dias). Tfpicamente, el estres por sequfa sera de al menos 5 dfas y puede ser tan largo como, por ejemplo, de 18 a 20 dfas o mas (por ejemplo, al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 dfas), dependiendo de, por ejemplo, la especie de planta.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "estres abiotico", "estres", o "condicion de estres" se refieren a la exposicion de una planta, celula de planta o similar, a un agente ffsico o qufmico no vivo ("abiotico") que tiene un efecto adverso sobre el metabolismo, el crecimiento, el desarrollo, la propagacion o la supervivencia de la planta (colectivamente, "crecimiento"). Un estres puede ser impuesto en una planta debido, por ejemplo, a un factor ambiental, tal como agua (por ejemplo, inundacion, sequfa, o deshidratacion), condiciones anaerobicas (por ejemplo, un menor nivel de oxfgeno o un alto nivel de CO2), condiciones osmoticas anormales, salinidad o temperatura (por ejemplo, calor/calefaccion, frfo, congelacion o escarcha), una deficiencia de nutrientes o exposicion a contaminantes, o por una hormona, un segundo mensajero u otra molecula. El estres anaerobico, por ejemplo, se debe a una reduccion en los niveles de oxfgeno (hipoxia o anoxia) suficiente para producir una respuesta al estres. Un estres por inundacion puede deberse a la inmersion prolongada o transitoria de una planta, parte de la planta, tejido o celula aislada en un medio lfquido, como se produce durante el monzon, la estacion humeda, la inundacion repentina o el riego excesivo de plantas, o similares. Un estres por frfo o por calor puede producirse debido a una disminucion o aumento, respectivamente, en la temperatura del intervalo optimo de temperaturas de crecimiento para una especie de planta en particular. Dichos intervalos optimos de temperatura de crecimiento son facilmente determinados o conocidos por los expertos en la tecnica. El estres por deshidratacion puede ser inducido por la perdida de agua, la reduccion de la turgencia o la reduccion del contenido de agua de una celula, tejido, organo o planta entera. El estres por sequfa puede ser inducido o estar asociado con la privacion de agua o la reduccion del suministro de agua a una celula, tejido, organo, u organismo. El estres inducido por la salinidad (estres salino) puede estar asociado o ser inducido por una perturbacion en el potencial osmotico del entorno intracelular o extracelular de una celula. Como se usa en el presente documento, la expresion "tolerancia al estres abiotico" o "tolerancia al estres" se refiere al aumento de la resistencia o tolerancia al estres abiotico de una planta en comparacion con las plantas en condiciones normales y la capacidad de desempenarse de manera relativamente superior cuando se encuentran en condiciones de estres abiotico.

Una secuencia de polipeptidos es "heterologa" a un organismo o una segunda secuencia de polipeptidos si se origina en una especie extrana o, si es de la misma especie, se modifica de su forma original.

Descripcion detallada de la invencion

I. Introduccion

La presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de agonistas selectivos del acido abscfsico (ABA). A diferencia de los agonistas de ABA anteriores, los agonistas descritos en el presente documento activan de manera potente la ruta de ABA en tejidos vegetales de plantas e inducen tolerancia al estres abiotico. Los nuevos agonistas se pueden usar para inducir tolerancia al estres en especies de cultivos de plantas. Los agonistas se pueden usar para inducir tolerancia al estres en especies de plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas, que incluyen, pero sin limitacion, brocoli, rabano, alfalfa, soja, cebada y mafz (mafz).

El acido abscfsico es una fitohormona multifuncional de una diversidad de funciones fito-protectoras que incluyen la latencia del brote, la latencia y/o la maduracion de las semillas, la abscision de hojas y frutos, y la respuesta a una amplia diversidad de estres biologicos (por ejemplo, frfo, calor, salinidad y sequfa). ABA tambien es responsable de regular el cierre del estoma mediante un mecanismo independiente de la concentracion de CO2. La familia PYR/PYL de protefnas receptoras de ABA median la senalizacion de ABA. Las plantas examinadas hasta la fecha expresan mas de un miembro de la familia de protefnas del receptor PYR/PYL, que tienen al menos algo de actividad redundante. Las protefnas del receptor PYR/PYL median en la senalizacion a Ba como un regulador positivo en, por ejemplo, la germinacion de semillas, el crecimiento posterior a la germinacion, el movimiento del estoma y la tolerancia de la planta al estres, incluyendo, pero sin limitacion, la sequfa.

Una amplia diversidad de secuencias de polipeptidos PYR/PYL de tipo silvestre (de origen natural) son conocidas en la tecnica. Aunque PYR1 se identifico originalmente como un receptor del acido abscfsico (ABA) en Arabidopsis, de hecho PYR1 es un miembro de un grupo de al menos 14 protefnas (protefnas PYR/PYL) en la misma familia de protefnas en Arabidopsis que tambien median la senalizacion de ABA. Esta familia de protefnas tambien esta presente en otras plantas (vease, por ejemplo, la LISTA DE SECUENCIAS) y se caracteriza en parte por la presencia de uno o mas o todos de un dominio de policetido ciclasa 2 (PF10604), un dominio de policetido ciclasa 1 (PF03364), y un dominio de Bet VI (PF03364). El dominio de la superfamilia START/Bet v 1 se describe, por ejemplo, en Radauer, BMC Evol. Biol. 8:286 (2008). En algunas realizaciones, un polipeptido del receptor PYR/PYL de tipo silvestre comprende cualquiera de las SEQ ID NO:1-119. En algunas realizaciones, un polipeptido del receptor PYR/PYL de tipo silvestre es sustancialmente identico a (por ejemplo, al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identico a) cualquiera de las SEQ ID NO:1-119. En algunas realizaciones, un polipeptido del receptor PYR/PYL es sustancialmente identico a (por ejemplo, al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identicos a) cualquiera de la SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,

40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,

102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 o 119.

II. Agonistas de ABA

La presente invencion proporciona agonistas de ABA de molecula pequena, es decir, compuestos que activan protefnas PYR/PYL. Los agonistas de ABA ejemplares incluyen, por ejemplo, un compuesto seleccionado de entre los siguientes:

Un compuesto de Formula I:

en la que

R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo,

R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, cada uno opcionalmente sustituido con 1-4 grupos R2a,

cada R2a se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H, halogeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, haloalquilo C1-6, haloalcoxi C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, -OH, alquilhidroxi C1-6, -CN, -NO2, -C(O)OR2b, -OC(O)R2b, -C(O)NR2bR2c, -NR2bC(O)R2c, -SO2R215, -SO2OR213, -SO2NR2bR2c, y -NR2bSO2R2c,

cada uno de R2b y R2c se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-6,

cada uno de R3, R4 y R5 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-6,

L es un enlazador seleccionado de entre el grupo que consiste en un enlace y alquileno C1-6, el subfndice m es un numero entero de 0 a 4, el subfndice n es un numero entero de 0 a 3,

o una sal o isomero del mismo;

en la que la sulfonamida -N(R5)SO2LR2 esta en la posicion 6.

Los compuestos que tienen la Formula (II) se divulgan en el presente documento:

En algunas realizaciones, el compuesto tiene la formula (III):

En algunas realizaciones, R1 es alquilo C1-6 y R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en arilo y heteroarilo, cada uno opcionalmente sustituido con 1-4 grupos R2a.

En algunas realizaciones, cada R2a se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H, halogeno y alquilo C1-6.

En algunas realizaciones, R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en fenilo, naftilo, tiofeno, furano, pirrolo y piridilo.

En algunas realizaciones, R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, ferc-butilo, pentilo, isopentilo, neo-pentilo y hexilo; R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en fenilo y tiofeno, cada uno opcionalmente sustituido con 1 grupo R2a; cada R2a se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H, F, Cl, metilo y etilo; y L se selecciona de entre el grupo que consiste en un enlace y metileno.

En algunas realizaciones, el compuesto tiene la formula (IV):

En algunas realizaciones, el compuesto tiene la formula (V):

En algunas realizaciones, el compuesto es uno de los compuestos que se muestran en la Figura 8.

En algunas realizaciones, el compuesto tiene la formula (VI):

El compuesto que tiene la formula (VI) tambien se denomina LC66C6 o quinabactina (1-(4-metilfenil)-N-(2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)metanosulfonamida). Los compuestos descritos anteriormente se identificaron seleccionando una biblioteca de compuestos estructuralmente diversos adquiridos en Life Chemicals (Orange, CT).

En algunas realizaciones, el compuesto tiene la formula (VII):

Los compuestos descritos anteriormente se pueden sintetizar usando metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los compuestos basados en el mismo armazon qufmico se sintetizaron como se describe en la patente de EE.UU. n.° 5.498.755 y la patente de EE.UU. n.° 6.127.382.

III. Formulaciones agonistas de ABA

La presente invencion proporciona formulaciones qufmicas agrfcolas formuladas para ponerse en contacto con plantas, en las que la formulacion comprende un agonista de ABA de la presente invencion. En algunas realizaciones, las plantas que se ponen en contacto con los agonistas comprenden o expresan un polipeptido PYR/PYL endogeno. En algunas realizaciones, las plantas que se ponen en contacto con los agonistas no comprenden ni expresan un polipeptido PYR/PYL heterologo (por ejemplo, las plantas no son transgenicas o son transgenicas pero expresan protefnas heterologas distintas de las protefnas PYR/PYL heterologas). En algunas realizaciones, las plantas que se ponen en contacto con los agonistas si comprenden o expresan un polipeptido PYR/PYL heterologo como se describe en el presente documento.

Las formulaciones pueden ser adecuadas para tratar plantas o material de propagacion de plantas, tales como semillas, de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo, en un portador. Los aditivos adecuados incluyen agentes tamponantes, agentes humectantes, agentes de recubrimiento, polisacaridos y agentes abrasivos. Los portadores ejemplares incluyen agua, soluciones acuosas, suspensiones, solidos y polvos secos (por ejemplo, turba, trigo, salvado, vermiculita, arcilla, tierra pasteurizada, muchas formas de carbonato de calcio, dolomita, diversos grados de yeso, bentonita y otros minerales de arcilla, roca fosforica y otros compuestos de fosforo, dioxido de titanio, humus, talco, alginato y carbon activado. Cualquier portador adecuado desde el punto de vista agrfcola conocido por un experto en la tecnica serfa aceptable y se contempla para su uso en la presente invencion. Opcionalmente, las formulaciones tambien pueden incluir al menos un tensioactivo, herbicida, fungicida, plaguicida o fertilizante.

En algunas realizaciones, la formulacion qufmica agrfcola comprende al menos uno de un tensioactivo, un herbicida, un plaguicida, tal como, pero sin limitacion, un fungicida, un bactericida, un insecticida, un acaricida y un nematicida, un activador de plantas, un sinergista, un protector de herbicidas, un regulador del crecimiento de la planta, un repelente de insectos o un fertilizante.

En algunas realizaciones, la formulacion qufmica agrfcola comprende una cantidad efectiva de uno o mas herbicidas seleccionados de entre el grupo que consiste en: paraquat (592), mesotriona (500), sulcotriona (710), clomazona (159), fentrazamida (340), mefenacet (491), oxaziclomefona (583), indanofan (450), glifosato (407), prosulfocarb (656), molinato (542), triasulfuron (773), halosulfuron-metil (414) y pretilaclor (632). Los principios activos herbicidas anteriores se describen, por ejemplo, en " The Pesticide Manual", Editor CDS Tomlin, 12a edicion, British Crop Protection Council, 2000, con los numeros de entrada anadidos entre parentesis; por ejemplo, la mesotriona (500) se describe en el mismo con el numero de entrada 500. Los compuestos anteriores se describen, por ejemplo, en el documento US 7.338.920.

En algunas realizaciones, la formulacion qufmica agrfcola comprende una cantidad efectiva de uno o mas fungicidas seleccionados de entre el grupo que consiste en: sedaxano, fludioxonilo, pentiopirad, protioconazol, flutriafol, difenoconazol, azoxistrobina, captano, ciproconazol, ciprodinilo, boscalid, diniconazol, epoxiconazol, fluoxastrobina, trifloxistrobina, metalaxilo, metalaxil-M (mefenoxam), fluquinconazol, fenarimol, nuarimol, pirifenox, piraclostrobina, tiabendazol, tebuconazol, triadimenol, benalaxilo, benalaxil-M, benomilo, carbendazima, carboxina, flutolanilo, fuberizadol, guazatina, miclobutanilo, tetraconazol, imazalilo, metconazol, bitertanol, cimoxanilo, ipconazol, iprodiona, procloraz, pencicuron, propamocarb, siltiofam, tiram, triazoxido, triticonazol, tolilfluanida, y un compuesto de manganeso (tal como mancozeb, maneb). En algunas realizaciones, la formulacion qufmica agrfcola comprende una cantidad efectiva de uno o mas de un insecticida, un acaricida y/o nematicida seleccionado de entre el grupo que consiste en: tiametoxam, imidacloprid, clotianidina, lambda-cihalotrina, teflutrina, beta-ciflutrina, permetrina, abamectina, fipronil y spinosad. Los detalles (por ejemplo, estructura, nombre qufmico, nombres comerciales, etc.) de cada uno de los plaguicidas anteriores con un nombre comun se pueden encontrar en e-Pesticide Manual, version 3.1, 13a edicion, ed. CDC Tomlin, British Crop Protection Council, 2004-05. Los compuestos anteriores se describen, por ejemplo, en el documento US 8.124.565.

En algunas realizaciones, la formulacion qufmica agrfcola comprende una cantidad efectiva de uno o mas fungicidas seleccionados de entre el grupo que consiste en: Ciprodinil((4-ciclopropil-6-metil-pirimidin-2-il)-fenilamina) (208), Dodina (289); Clorotalonil (142); Folpet (400); Protioconazol (685); Boscalid (88); Proquinazid (682); Ditianon (279); Fluazinam (363); Ipconazol (468); y Metrafenona. Algunos de los compuestos anteriores se describen, por ejemplo, en "The Pesticide Manual" The Pesticide Manual" [The Pesticide Manual--A World Compendium; decimotercera edicion; editor: CDS Tomlin; The British Crop Protection Council, 2003], con los numeros de entrada anadidos entre parentesis. Los compuestos anteriores se describen, por ejemplo, en el documento US 8.349.345.

En algunas realizaciones, la formulacion qufmica agrfcola comprende una cantidad efectiva de uno o mas fungicidas seleccionados de entre el grupo que consiste en: fludioxonilo, metalaxilo y un fungicida de estrobilurina, o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, el fungicida de estrobilurina es azoxistrobina, picoxistrobina, kresoxim-metilo o trifloxistrobina. En algunas realizaciones, la formulacion qufmica agrfcola comprende una cantidad efectiva de uno o mas de un insecticida seleccionado de entre un fenilpirazol y un neonicotinoide. En algunas realizaciones, el fenilpirazol es fipronil y el neonicotinoide se selecciona de entre tiametoxam, imidacloprid, tiacloprid, clotianidina, nitenpiram y acetamiprid. Los compuestos anteriores se describen, por ejemplo, en el documento US 7.071.188. En algunas realizaciones, la formulacion qufmica agrfcola comprende una cantidad efectiva de uno o mas plaguicidas biologicos, incluyendo, pero sin limitacion, Pasteuria spp., Paeciliomyces, Pochonia chlamydosporia, metabolitos de Myrothecium, compuestos volatiles de Muscodor, Tagetes spp., bacillus firmus, incluida bacillus firmus CNCM 1-1582.

IV. Aplicacion a las plantas

Las formulaciones y composiciones agonistas de ABA se pueden aplicar a las plantas usando una diversidad de metodos conocidos, por ejemplo, pulverizando, atomizando, recubriendo por inmersion, vertiendo, irrigando, espolvoreando o esparciendo las composiciones sobre el material de propagacion, o cepillando o vertiendo o poniendo en contacto de otro modo las composiciones sobre la planta o, en el caso de las semillas, recubriendo, encapsulando, pulverizando, recubriendo por inmersion, sumergiendo la semilla en una composicion lfquida, o tratando de otro modo la semilla. En una alternativa al tratamiento directo de una planta o semilla antes de plantar, las formulaciones de la invencion tambien pueden introducirse en el suelo u otro medio en el que se va a plantar la semilla. Por ejemplo, las formulaciones pueden introducirse en el suelo rociando, dispersando, vertiendo, irrigando o tratando de otro modo el suelo. En algunas realizaciones, tambien se usa un portador en esta realizacion. El portador puede ser solido o lfquido, como se ha indicado anteriormente. En algunas realizaciones, la turba se suspende en agua como un portador del agonista de ABA, y esta mezcla se pulveriza en el suelo o el medio de plantacion y/o sobre la semilla que esta plantada.

Los tipos de plantas que pueden tratarse con los agonistas de ABA descritos en el presente documento incluyen especies de plantas tanto monocotiledoneas como dicotiledoneas, que incluyen cereales tales como cebada, centeno, sorgo, triticale, avena, arroz, trigo, soja y mafz; remolachas (por ejemplo, remolacha azucarera y remolacha forrajera); cucurbitaceas que incluyen pepino, melon, almizcleno, melon, calabaza y sandfa; los cultivos de kale, incluyendo el brocoli, el repollo, la coliflor, el bok choi y otras verduras de hoja verde, otras verduras incluyendo el tomate, el pimiento, la lechuga, las judfas, los guisantes, la cebolla, el ajo y el cacahuete; cultivos oleaginosos incluidos canola, cacahuete, girasol, colza y soja; plantas solanaceas incluyendo tabaco; cultivos de tuberculos y rafces incluyendo patata, name, rabano, remolacha, zanahorias y batatas; frutas incluyendo la fresa; cultivos de fibra incluyendo algodon y canamo; otras plantas incluyendo cafe, plantas para transplante, plantas perennes, plantas ornamentales lenosas, cesped y flores cortadas, incluyendo claveles y rosas; cana de azucar; cultivos de arboles en contenedores; arboles de hoja perenne incluyendo el abeto y el pino; arboles de hoja caduca incluyendo el arce y el roble; y arboles frutales y de frutos secos que incluyen cereza, manzana, pera, almendras, melocoton, nuez y cftricos.

Se entendera que los agonistas de ABA descritos en el presente documento imitan la funcion de ABA en las celulas. Por lo tanto, se espera que una o mas respuestas celulares desencadenadas al poner en contacto la celula con ABA tambien se activaran al poner en contacto la celula con los agonistas de ABA descritos en el presente documento. Los agonistas de ABA descritos en el presente documento imitan la funcion de ABA y se proporcionan en una formulacion util.

En algunas realizaciones, la aplicacion de los agonistas de ABA descritos en el presente documento aumenta la resistencia al estres abiotico de una planta.

En algunas realizaciones, la aplicacion de los agonistas de ABA descritos en el presente documento a semillas inhibe la germinacion de las semillas.

La presente invencion tambien proporciona plantas en contacto con las formulaciones de ABA descritas en el presente documento. La planta en contacto con la formulacion ABA puede incluir una parte de la planta y/o una semilla.

V. Deteccion de nuevos agonistas y antagonistas de ABA

En el presente documento se divulgan metodos de deteccion de agonistas qufmicos supuestos para determinar si el agonista supuesto agoniza un polipeptido del receptor PYR/PYL, cuando el agonista supuesto se pone en contacto con el polipeptido del receptor PYR/PYL. Como se usa en el presente documento, un agente "agoniza" una protefna del receptor PYR/PYL si la presencia del agente da como resultado la activacion o la regulacion positiva de la actividad del receptor, por ejemplo, para aumentar la senalizacion corriente abajo del receptor PYR/PYL. Para la presente divulgacion, un agente agoniza un receptor PYR/PYL si, cuando el agente esta presente a una concentracion no mayor que 200 pM, el contacto del agente con el receptor PYR/PYL da como resultado la activacion o la regulacion positiva de la actividad del receptor PYR/PYL. Si un agente no induce la activacion o la regulacion positiva de la actividad de una protefna del receptor PYR/PYL cuando el agente esta presente en una concentracion no mayor que 200 pM, entonces el agente no agoniza significativamente el receptor PYR/PYL. Como se usa en el presente documento, la "activacion" requiere que el agente induzca un umbral mfnimo de actividad. Se puede lograr determinar si se ha alcanzado este umbral mfnimo de actividad, por ejemplo, mediante el uso de un ensayo de fosfatasa enzimatica que establece un valor mfnimo para el nivel de actividad enzimatica que debe inducirse, o mediante el uso de un ensayo de fosfatasa enzimatica en presencia de un reactivo de deteccion colorimetrico (por ejemplo, para-nitrofenilfosfato) en el que se ha alcanzado el umbral mfnimo de actividad si se observa un cambio de color.

En el presente documento tambien se divulgan metodos de deteccion de agonistas y antagonistas de ABA mediante la deteccion de la capacidad de una molecula para inducir la union de PYR/PYL-PP2C en el caso de agonistas, o para interrumpir la capacidad de ABA y otros agonistas para promover la union de PYR/PYL-PP2C en el caso de los antagonistas. Se pueden utilizar varios protocolos de deteccion diferentes para identificar agentes que agonizan o antagonizan un polipeptido PYR/PYL.

La deteccion puede realizarse usando reactivos aislados, purificados o parcialmente purificados. En algunas realizaciones, se puede usar polipeptido PYR/PYL purificado o parcialmente purificado.

Como alternativa, pueden usarse metodos de deteccion basados en celulas. Por ejemplo, se pueden usar celulas que expresan naturalmente un polipeptido PYR/PYL o que expresan de manera recombinante un polipeptido PYR/pYl . En algunas realizaciones, las celulas usadas son celulas de plantas, celulas animales, celulas bacterianas, celulas fungicas, que incluyen pero sin limitacion celulas de levadura, celulas de insecto o celulas de mamfferos. En terminos generales, los metodos de deteccion implican detectar una pluralidad de agentes para identificar un agente que modula la actividad de un polipeptido PYR/PYL, por ejemplo, uniendose a un polipeptido PYR/PYL, o activando un polipeptido PYR/PYL o aumentando la expresion de un polipeptido PYR/PYL, o un transcrito que codifica un polipeptido PYR/PYL.

1. Ensayos de union a polipeptidos PYR/PYL

Opcionalmente, se pueden realizar examenes preliminares mediante la deteccion de agentes capaces de unirse a un polipeptido PYR/PRL, ya que al menos algunos de los agentes asf identificados son probablemente moduladores del polipeptido PYR/PYL.

Los ensayos de union pueden implicar poner en contacto un polipeptido PYR/PYL con uno o mas agentes de prueba y dejar suficiente tiempo para que la protefna y los agentes de prueba formen un complejo de union. Cualquier complejo de union formado se puede detectar usando cualquiera de una serie de tecnicas analfticas establecidas. Los ensayos de union a protefnas incluyen, pero sin limitacion, metodos que miden la precipitacion conjunta o la migracion conjunta en geles de SDS-poliacrilamida no desnaturalizantes y la migracion conjunta en transferencias Western (vease, por ejemplo, Bennet, JP y Yamamura, HI (1985) "Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods," in Neurotransmitter Receptor Binding (Yamamura, HI, et al., eds.), pags. 61-89). Otros ensayos de union involucran el uso de tecnicas de espectrometrfa de masas o RMN para identificar moleculas unidas al polipeptido PYR/PYL o desplazamiento de sustratos marcados (por ejemplo, a Ba marcado). La protefna polipeptfdica PYR/PYL utilizada en dichos ensayos puede expresarse, clonarse o sintetizarse de forma natural.

2. Actividad

Los agonistas del polipeptido PYR/PYL pueden identificarse mediante la deteccion de agentes que activan o aumentan la actividad de un polipeptido PYR/PYL. Los antagonistas pueden identificarse reduciendo la actividad.

Un ensayo de actividad implica probar si un agonista candidato puede inducir la union de una protefna PYR/PYL a un polipeptido de protefna fosfatasa de tipo 2 (PP2C) en una forma especffica de agonista. Enfoques de dos hfbridos de mamfferos o levaduras (vease, por ejemplo, Bartel, PL et al. Methods Enzymol, 254:241 (1995)) puede usarse para identificar polipeptidos u otras moleculas que interactuan o se unen cuando se expresan juntos en una celula. En algunas realizaciones, los agentes que agonizan un polipeptido PYR/PYL se identifican en un ensayo de dos hfbridos entre un polipeptido PYR/PYL y un polipeptido de protefna fosfatasa de tipo 2 (PP2C) (por ejemplo, ABI1 o 2 o sus ortologos, por ejemplo, de la subfamilia del grupo A de PP2Cs), en el que un agonista de ABA se identifica como un agente que activa o permite la union del polipeptido PYR/PYL y el polipeptido PP2C. Por lo tanto, los dos polipeptidos se unen en presencia, pero no en ausencia del agente. En algunas realizaciones, un compuesto o agente qufmico se identifica como un agonista de una protefna PYR/PYL si la celula de levadura se vuelve azul en el ensayo de dos hfbridos de levadura.

La funcion bioqufmica de las protefnas PYR1 y PYR/PYL en general, es inhibir la actividad PP2C. Esto se puede medir en celulas vivas usando los metodos de dos hfbridos de levadura u otros basados en celulas. Tambien se puede medir in vitro usando ensayos de fosfatasa enzimatica en presencia de un reactivo de deteccion colorimetrico (por ejemplo, para-nitrofenilfosfato). El ensayo basado en levadura usado anteriormente proporciona un indicador indirecto de la union del ligando. Para abordar esta posible limitacion, se pueden usar ensayos de competicion in vitro, o ensayos basados en celulas que usan otros organismos, como enfoques alternativos para identificar compuestos diana de union debil.

3. Ensayos de expresion

La deteccion de un compuesto que aumenta la expresion de un polipeptido PYR/PYL tambien se divulga en el presente documento. Los metodos de deteccion generalmente implican la realizacion de ensayos basados en celulas o basados en plantas en los cuales los compuestos de prueba se ponen en contacto con una o mas celulas que expresan el polipeptido PYR/PYL, y luego detectan un aumento en la expresion de PYR/PYL (ya sea un transcrito o un producto de traduccion). Los ensayos pueden realizarse con celulas que expresan de forma natural PYR/PYL o en celulas alteradas de forma recombinante para expresar PYR/PYL, o en celulas alteradas de forma recombinante para expresar un gen indicador bajo el control del promotor PYR/PYL.

Se pueden realizar diversos controles para asegurar que la actividad observada sea autentica, incluyendo la ejecucion de reacciones paralelas con celulas que carecen de la construccion indicadora o al no contactar una celula que alberga la construccion indicadora con el compuesto de prueba.

4. Validacion

Los agentes que se identifican inicialmente por cualquiera de los metodos de deteccion anteriores se pueden probar adicionalmente para validar la actividad aparente y/o determinar otros efectos biologicos del agente. En algunos casos, el agente identificado se prueba para determinar la capacidad de afectar el estres de la planta (por ejemplo, la tolerancia a la sequfa), la germinacion de las semillas u otro fenotipo afectado por ABA. Una serie de dichos ensayos y fenotipos son conocidos en la tecnica y pueden emplearse de acuerdo con los metodos divulgados en el presente documento.

5. Ensayos en fase solida y alto rendimiento soluble

En los ensayos de alto rendimiento de la divulgacion, es posible detectar hasta varios miles de moduladores o ligandos diferentes en un solo dfa. En particular, cada pocillo de una placa de microtitulacion se puede usar para ejecutar un ensayo separado contra un modulador potencial seleccionado o, si se observan efectos de concentracion o tiempo de incubacion, cada 5-10 pocillos puede probar un solo modulador. Por lo tanto, una unica placa de microtitulacion convencional puede determinar aproximadamente 100 (por ejemplo, 96) moduladores. Si se usan placas de 1536 pocillos, entonces una sola placa puede determinar facilmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 1500 compuestos diferentes. Es posible determinar varias placas diferentes por dfa; son posibles examenes de analisis de hasta aproximadamente 6.000-20.000 o mas compuestos diferentes usando los sistemas integrados divulgados en el presente documento. Ademas, se pueden usar enfoques microflufdicos para la manipulacion de reactivos.

La molecula de interes (por ejemplo, PYR/PYL o una celula que expresa un polipeptido PYR/PYL) puede unirse al componente del estado solido, directa o indirectamente, a traves del enlace covalente o no covalente.

En el presente documento se divulgan ensayos in vitro para identificar, en un formato de alto rendimiento, compuestos que pueden modular la expresion o actividad de PYR/PYL.

La resistencia al estres abiotico puede determinarse de acuerdo con cualquiera de una serie de tecnicas bien conocidas. Por ejemplo, para la tolerancia a la sequfa, las plantas se pueden cultivar en condiciones en las que se proporciona menos agua que la optima a la planta. La resistencia a la sequfa se puede determinar mediante una serie de medidas convencionales que incluyen la presion de turgor, el crecimiento, el rendimiento y similares.

VI. Metodos de aumento de la tolerancia al estres abiotico en plantas

La presente invencion tambien proporciona metodos para aumentar la tolerancia al estres abiotico en una planta. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una planta se pone en contacto con un agonista de ABA descrito en el presente documento, o una formulacion de agonista de ABA, en una cantidad suficiente para aumentar la tolerancia al estres abiotico en la planta. La cantidad de la formulacion del agonista de ABA aplicada a la planta puede ser suficiente para aumentar la tolerancia al estres abiotico en comparacion con no poner en contacto la planta con la formulacion del agonista de ABA. La planta puede ponerse en contacto con la formulacion ABA usando cualquiera de los metodos descritos en el presente documento. El aumento en la tolerancia al estres abiotico puede mejorar el crecimiento y/o la supervivencia de las plantas en condiciones de estres abiotico que afectan negativamente el crecimiento o la supervivencia de la planta. El estres abiotico incluye las condiciones ffsicas o qufmicas descritas en el presente documento.

VII. Metodos de inhibicion de la germinacion de semillas en una planta

La presente invencion tambien proporciona metodos para inhibir la germinacion de semillas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una planta, una parte de la planta o una semilla se ponen en contacto con una formulacion de agonista de ABA en una cantidad suficiente para inhibir la germinacion de la semilla. La semilla puede ponerse en contacto con la formulacion de ABA usando cualquiera de los metodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la semilla se pone en contacto directamente con la formulacion del agonista de ABA. En algunas realizaciones, el suelo o el terreno se ponen en contacto con la formulacion del agonista de ABA antes o despues de plantar o sembrar las semillas. En algunas realizaciones, una planta se pone en contacto con suficiente formulacion del agonista de ABA para inhibir la germinacion de semillas que luego se desarrollan a partir de la planta.

VIII. Metodos de activacion de polipeptidos del receptor PYR/PYL

La presente invencion tambien proporciona metodos para activar un polipeptido del receptor PYR/PYL. En algunas realizaciones, un polipeptido PYR/PYL se pone en contacto con un compuesto descrito anteriormente, y el polipeptido PYR/PYL activado se une a un polipeptido PP2C. En algunas realizaciones, el polipeptido PYR/PYL es capaz de ser activado por el compuesto agonista LC66C6. En algunas realizaciones, la protefna PYR/PYL que se activa es sustancialmente identica a cualquiera de las SEQ ID NO:1-119. Ejemplos de secuencias de receptores de ABA de diversas plantas se proporcionan en la publicacion de patente de EE.UU. 2011/0271408.

En algunas realizaciones, el metodo activa un receptor PYR/PYL en un ensayo in vitro sin celulas. En algunas realizaciones, el metodo activa un receptor PYR/PYL expresado en una celula. En algunas realizaciones, la celula tambien expresa un polipeptido PP2C. En algunas realizaciones, la celula es una celula de planta. En algunas realizaciones, la celula es una celula animal o de mamffero. En algunas realizaciones, la celula expresa una protefna PYR/PYL endogena. En algunas realizaciones, la celula esta disenada por ingenierfa para expresar un polipeptido PYR/PYL heterologo. En algunas realizaciones, la celula expresa un polipeptido p P2C heterologo. En algunas realizaciones, la celula expresa un polipeptido PP2C seleccionado de entre HAB1 (homologfa con ABI1), ABI1 o ABI2.

En algunas realizaciones, el polipeptido PYR/PYL activado induce la expresion de genes heterologos. En algunas realizaciones, los genes heterologos son genes sensibles a ABA. En algunas realizaciones, la expresion genica inducida se produce en celulas que expresan un polipeptido PYR/PYL endogeno. En algunas realizaciones, la expresion genica inducida se produce en celulas que expresan un polipeptido PYR/PYL heterologo.

Ejemplos

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra que los novedosos agonistas de ABA descritos en el presente documento se unen y activan multiples receptores PYR/PYL.

Metodos

Deteccion qufmica

Un sistema de dos hfbridos de levadura descrito anteriormente se uso en detectores de alto rendimiento (HTS) para identificar agonistas de ABA (vease, Peterson FC, et al. (2010) Structural basis for selective activation of ABA receptors. Nature Structural Biology y Molecular Biology 17 (9): 1109-1111). En este sistema, la interaccion receptor-PP2C promovida por agonistas impulsa la expresion de un gen indicador URA3 o HIS3 y rescata la auxotrofia de uracilo o histidina de cepas parentales (Peterson FC, et al. (2010); Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, & Boeke JD (1996) Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Actas de la National Academy of Sciences de los Estados Unidos de America 93(19):10315-10320). Se realizaron HTS usando 5 cepas indicadoras diferentes que expresan fusiones de dominio de union (BD) a PYR1, PYL1, PYL2, PYL3 o PYL4; estos fueron expresados conjuntamente con fusiones de dominio de activacion (AD) a HAB1 (pACT-HAB1); las construcciones usadas se han descrito anteriormente (Park et al. 2009). Los investigadores usan estas cepas en dos detectores separados. En la primera deteccion se determinaron ~65.000 compuestos obtenidos en Chembridge (San Diego, EE. UU.) para determinar la actividad agonista usando un ensayo de halo, esencialmente como lo describe Gassner NC, et al. (2007) (acelerando el descubrimiento de moleculas pequenas biologicamente activas usando un ensayo de halo de levadura de alto rendimiento. Journal of Natural Products 70 (3):383-390). En este metodo, las cepas de levadura se embeben en agar selectivo y los compuestos se transfieren mediante clavijas de soluciones madre de DMSO 10 mM a placas de ensayo; los aciertos son evidentes por el aumento de la densidad celular en la vecindad de los compuestos activos. Los experimentos que usaron el ensayo de halo usaron la cepa de levadura PJ69-4A y los medios suplementados con 3-aminotriazol 10 mM para mejorar las selecciones. Los detectores de halo se configuraron usando un Biomek FX equipado con una microplaca hotel automatizada (Thermo Cytomat) y una herramienta de 384 clavijas (V & P Scientific), que se uso para detectar compuestos en las placas de ensayo. Antes de cada transferencia qufmica, las clavijas se lavaron en una mezcla 1:1 de DMSO/agua seguido de un lavado con etanol al 95 %. Despues de la transferencia qufmica, las placas se incubaron a 28 °C y los agonistas candidatos se evidenciaron mediante inspeccion manual.

Aunque el metodo de deteccion de halo es poderoso desde la perspectiva del rendimiento, los investigadores posteriormente emplearon un metodo de deteccion mas convencional para una segunda deteccion de una biblioteca de 12.000 miembros obtenida en Life Chemicals (Ucrania). Este cambio fue motivado por el deseo de controlar mejor la concentracion del ensayo. En la segunda deteccion de los investigadores, las construcciones indicadoras se expresaron en la cepa de levadura MAV99, que permite selecciones basadas en uracilo a traves de un transgen URA3 impulsado por el promotor GAL1 (Peterson Fc , et al. (2010)). Los compuestos de la deteccion se anadieron a medios de uracilo' selectivo sembrados con cepas indicadoras en formato de placa de 96 pocillos a una concentracion final de 25 pM; el crecimiento de levadura se inspecciono manualmente despues de ~3 dfas. Los compuestos se transfirieron a los pocillos de deteccion de soluciones madre de 2,5 mM usando un manipulador de lfquidos Biomek FX.

Como tercer enfoque de deteccion, la biblioteca de Life Chemicals tambien se examino en busca de inhibidores de la germinacion de Arabidopsis en medio de agar solidificado que contiene 0,5 X sales de MS, sacarosa al 0,5 % y compuesto de prueba 25 pM. Los aciertos del ensayo de germinacion se probaron posteriormente en ensayos de dos hfbridos de levadura. Los compuestos encontrados se reabastecieron de sus proveedores originales y se usaron en detectors secundarios y la caracterizacion de compuestos. La quinabactina y sus analogos se adquirieron en Life Chemicals.

Ensayo de actividad PP2C

Las protemas HAB1 y PYL se expresaron y se purificaron como se describio anteriormente (Park SY, et al. (2009) Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science 324 (5930): 1068-1071), con modificaciones menores. Para obtener las protemas de fusion GST-HAB1, -ABI1 y -ABI2, el ADNc de HAB1 se clono en pGex-2T mientras que los ADNc de ABI1 y ABI2 se clonaron en el vector pGex-4T-1. La expresion se realizo en celulas huesped BL21 [DE3] pLysS. Las celulas transformadas se cultivaron previamente durante una noche, se transfirieron a medio LB y se cultivaron a 30 °C para cultivar A600 de ~0,5. El cultivo se enfrio luego en hielo y se anadio MnCl2 a 4 mM e IPTG a 0,3 mM. Despues de 16 h de incubacion a 15 °C, las celulas se recolectaron y las protemas recombinantes se purificaron en agarosa glutation como se describio anteriormente (Park SY et al. (2009). Para obtener las protemas de fusion del receptor 6XHis-PYL, los ADNc del receptor para los 13 receptores ABA se clonaron en el vector pET28 y se expresaron y purificaron como se describio anteriormente (Mosquna A, et al. (2011) Potent and selective activation of abscisic acid receptors in vivo by mutational stabilization of their agonist-bound conformation. PNAS 108 (51):20838-20843); esto produjo protema soluble y funcional (evaluada usando ensayos de inhibicion de PP2C mediados por receptor) para todos los receptores excepto PYL7, PYL11 y PYL12. Por lo tanto, estos tres receptores se expresaron alternativamente como protemas de fusion de union a maltosa (MBP) usando el vector pMAL-c; la expresion de estas construcciones se llevo a cabo en la cepa huesped BL21 [DE3] pLysS con las mismas condiciones de induccion usadas para GST-HAB1. Las protemas de fusion MBP-PYL recombinantes se purificaron a partir de lisado por ultrasonidos y aclarado con resina de amilosa (New England Biolab, Inc.) usando las instrucciones de purificacion del fabricante. Este esfuerzo produjo una protema de fusion MBP-PYL11 activa, pero fracaso para PYL7 y PYL12.

Los ensayos de actividad de PP2C usando receptores recombinantes y PP2Cs se llevaron a cabo de la siguiente manera: Las protemas purificadas se incubaron previamente en tampon de ensayo de 80 pl que contema MnCl210 mM, 3 pg de albumina de suero bovino y 2-mercaptoetanol al 0,1 % con ABA o agonista de a Ba durante 30 minutos a 22 °C. Las reacciones se iniciaron anadiendo 20 pl de una solucion de reaccion que contema Tris-OAc 156 mM, pH 7,9, KOAc 330 mM y fosfato de 4-metilumbeliferilo 5 mM, despues de lo cual se recogieron las mediciones de fluorescencia de inmediato usando un filtro de excitacion de 355 nm y un filtro de emision de 460 nm en un lector de placa Wallac. Las reacciones conteman PP2C 50 nM y protemas PYR/PYL 100 nM, respectivamente.

La Figura 1A muestra un grupo representativo de agonistas de ABA. Como se muestra en la Figura 1B, los multiples receptores de PYR/PYL son activados por varios agonistas, incluyendo LC66C6, en un ensayo de dos hfbridos de levadura. Este ensayo informa sobre la interaccion ffsica promovida por agonistas de las protemas PYR/PYL y las protemas PP2C del clado A cuando un receptor espedfico y PP2C se fusionan con la activacion de GAL4 y los dominios de union al ADN respectivamente, como se describio anteriormente (Park et al. 2009). Estos ensayos basados en la levadura indican que LC66C6 es un agonista de multiples receptores PYR/PYL, a diferencia del agonista descrito anteriormente, la pirabactina, que tiene una selectividad del receptor mucho mayor que ABA o el nuevo agonista LC66C6. Como se ha descrito anteriormente, la union de un receptor a un clado A PP2C promovido por los agonistas inhibe la actividad fosfatasa de PP2C. En la Arabidopsis, hay 14 receptores PYR/PYL, 13 de los cuales pueden mediar respuestas ABA en un sistema de ensayo basado en protoplastos (Fujii et al. 2009). Para examinar mas de cerca la selectividad de LC66C6, los investigadores intentaron expresar y purificar las protemas 6X-His-PYR/PYL recombinantes para los 14 miembros y recuperaron los receptores sensibles a ABA para todos los receptores excepto PYL7, 12 y 13, que no pudieron producirse en formas activas por razones tecnicas. Este estudio de panel de receptores recombinantes permite un retrato casi completo de una actividad agonista de ABA en miembros de la familia de receptores PYR/PYL de Arabidopsis. Como se muestra en la Figura 2, la actividad de la enzima PPC2 de HBA1, ABI1 y ABI2 se inhibe en> 90 % por ABA 10 pM en presencia de todos los receptores de ABA probados (Figura 2B). En respuesta a LC66C6 (quinabactina), se observo> 70 % de inhibicion de PP2C de HBA1, ABI1 y ABI2 con los receptores PYR1, PYL1, PYL2, PYL3 y PYL5.

Para caracterizar mejor la actividad de la quinabactina y definir su selectividad del receptor, se realizaron ensayos de inhibicion de PP2C mediados por receptor usando 10 receptores recombinantes en combinacion con los PP2Cs HAB1, ABI1 o ABI2. Estos experimentos mostraron que la quinabactina activa PYR1, PYL1-3 y PYL5 con valores CI50 submicromolares y muestra una actividad sustancialmente mayor en los sitios de receptor dimerico (Figuras 2, 3 y 4). Los resultados tambien muestran que la quinabactina es un agonista de PYR1 o PYL1 mas fuerte que ABA (Figuras 2 y 3). Ademas, la inhibicion maxima de PP2C observada por la quinabactina fue mayor que la observada con la pirabactina con todos los receptores probados. Aunque la pirabactina puede activar PYL5 con una CI50 de 0,90 pM, se satura a ~ 40 % de inhibicion de p P2C, lo que sugiere que es un agonista de PYL5 incompleto/parcial. Por lo tanto, este ejemplo demuestra la identificacion de un nuevo agonista de sulfonamida con una actividad mas amplia del espectro del receptor y una mayor bioactividad en relacion con la pirabactina.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra que los novedosos agonistas de ABA inhiben la germinacion y el crecimiento de las plantas.

Analisis de la inhibicion de la germinacion y el crecimiento del hipocotilo de Arabidopsis

Para el analisis de inhibicion de la germinacion y el crecimiento del hipocotilo de Arabidopsis, las semillas que habfan madurado despues de aproximadamente 4 semanas se esterilizaron en la superficie con una solucion que contenfa NaClO al 5 % y Tween-20 al 0,05 % durante 10 minutos, y se enjuagaron con agua cuatro veces. Las semillas esterilizadas se suspendieron con agar al 0,1 % y se sembraron en medio de agar solidificado al 0,8 % que contenfa 1/2 sales de Murashige y Skoog (MS) (Sigma-Aldrich) en presencia de sustancias qufmicas y se almacenaron a 4 °C durante 4 dfas, luego se transfirieron a 22 °C bajo la oscuridad o luz. La germinacion se determino despues de una incubacion de 4 dfas, mientras que el crecimiento del hipocotilo se fotografio despues de una incubacion de 6 dfas.

Materiales de plantas

Se usaron las siguientes cepas de alelos/mutantes: aba2-1 (Leon-Kloosterziel KM, et al. (1996) Isolation and characterization of abscisic acid-deficient Arabidopsis mutants at two new loci. Plant J 10 (4):655-661), abi1-1 (Umezawa T, et al. (2009) ype 2C protein phosphatases directly regulate abscisic acid-activated protein kinases in Arabidopsis. Actas de la National Academy of Sciences de los Estados Unidos de America 106(41): 17588-17593), abi3-9, abi4-11 (Nambara E, et al. (2002) A screen for genes that function in abscisic acid signaling in Arabidopsis thaliana. Genetics 161 (3):1247-1255 ), y los cuadruples pry1pyl1pyl2ply4 (Park SY, et al. (2009) Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science 324 (5930): 1068-1071); Todas estas cepas estan en el fondo de Columbia. La tincion de los cuadruples mutantes pry1pyl1pyl2ply4 usada se retrocruzo a Columbia tres veces. Las semillas de cebada y soja se adquirieron en Living Whole Foods, Inc., mientras que las semillas de mafz se obtuvieron en W. Atlee Burpee & Co. Los metodos de detalle usados para los experimentos fisiologicos que usan estos materiales se proporcionan como informacion de ayuda.

Para explorar las consecuencias fisiologicas de las propiedades agonistas unicas de LC66C, los investigadores caracterizaron sus efectos sobre las semillas de Arabidopsis, las plantulas y las plantas adultas. Como se muestra en la Figura 5, los agonistas de ABA descritos en el presente documento inhiben fuertemente la germinacion de las semillas en Arabidopsis. Las Figuras 5A y 5B muestran que varios agonistas, incluyendo LC66C6, inhiben la germinacion de las semillas de una manera dependiente de la dosis. En particular, LC66C6 fue casi tan eficaz, en una base por mol, para inhibir la germinacion como (+)-ABA, y fue mas eficaz que los otros agonistas probados.

Las Figuras 5C y 5D muestran el efecto de los agonistas (+)-ABA y LC66C6 en la inhibicion de la germinacion de semillas de diversos mutantes insensibles a ABA. Como se muestra en la Figura 5C, a una concentracion de 5 pM, LC66C6 mostro un patron similar de inhibicion de la germinacion como (+)-ABA hizo para todos los mutantes probados excepto para el cuadruple mutante de PYR/PYL (pyrl1 pyl1/pyl2/pyl4) y un solo mutante pyr1. Combinado con los datos de CI50 presentados anteriormente en la Figura 4, estos datos geneticos sugieren que la actividad inhibitoria de la germinacion de LC66C6 se explica en gran medida por su capacidad para agonizar PYR1, PYL1 y PYL2. La capacidad de ABA para inhibir la germinacion en el cuadruple mutante probablemente se explica por su actividad agonista en otros receptores. Los datos geneticos de los investigadores son coherentes con la hipotesis de que PYR1 juega un papel importante pero redundante en la germinacion de semillas en respuesta a ABA, ya que el mutante pyr1 germina en presencia de LC66C6 o pirabactina 5 pM (Park et al. 2009).

Como se muestra en la Figura 6, LC66C6 tambien inhibe el crecimiento de las plantas despues de la germinacion. Las Figuras 6A y 6B muestran que LC66C6 inhibe el alargamiento de la rafz en el tipo silvestre, abi1 y el cuadruple mutante, y es comparable o ligeramente mas eficaz que el (+)-ABA en sus efectos inhibidores en todas las concentraciones probadas. Ademas, la Figura 6C demuestra que LC66C6 inhibe el crecimiento de plantas tanto de tipo silvestre como mutantes de una manera dependiente de la concentracion. La inhibicion del crecimiento de las plantas por LC66C6 es significativamente mayor que la inhibicion por la pirabactina, y comparable a la de (+)-ABA.

Este ejemplo demuestra que LC66C6 es un potente inhibidor de la germinacion de semillas y el crecimiento de planta de tipo silvestre y mutantes insensibles a ABA.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra que el agonista LC66C6 induce la tolerancia al estres por sequfa.

Ensayos fisiologicos

Los ensayos fisiologicos se realizaron en plantas de Arabidopsis cultivadas a 22 ± 2 °C y humedad relativa (HR) 45 ± 10 % en un ciclo de luz/oscuridad de 16/8 h. Para los analisis de perdida de agua por transpiracion en Arabidopsis, las plantas se trataron previamente con pulverizacion en aerosol de una solucion de 4 ml que contenfa un compuesto 25 pM y Tween-20 al 0,05 %. Se pulverizaron 12 plantas de 4 semanas de edad por compuesto o control analizado. Despues del tratamiento previo con compuestos durante una noche, las porciones aereas se desprendieron de las rafces y su peso fresco se midio a intervalos de 20 minutos durante un perfodo de tiempo de 2 horas. Para medir la apertura del estoma, las plantas se trataron previamente con compuestos como se describio anteriormente, se cubrieron con tapas plasticas para mantener una HR alta y despues del tratamiento previo durante una noche se obtuvieron impresiones epidermicas de las hojas usando el metodo Suzuki de microimpresion universal (SUMP) mediante la solucion de impresion SUMP con placas SUMP B (Laboratorio SUMP). Las impresiones de las hojas se analizaron mediante microscopfa optica y las aberturas del estoma se determinaron a partir de los anchos de los poros usando el software ImageJ 1.43v (National Institutes of Health, EE. UU.). Para los ensayos de estres por sequfa de Arabidopsis, se aplicaron aproximadamente 1,5 ml de una solucion qufmica de 25 pM mediante aerosol a las plantas a intervalos diarios durante un perfodo de 3 dfas. Las plantas se cultivaron en recipientes cuadrados de 6 X 6 X 5 cm que contenfan 100 g de suelo por recipiente. Los ensayos de estres por sequfa de soja se realizaron en plantas cultivadas a 25 ± 2 °C, 65 ± 10 % de HR en ciclos de luz/oscuridad de 16/8 h. Se pulverizaron aproximadamente 20 ml de una solucion qufmica 50 pM que contenfa Tween-20 al 0,05 % por recipiente (3 plantas por recipiente) cuatro veces cada 3 dfas. Los recipientes usados tenfan un tamano de 250 ml y contenfan 200 g de suelo por recipiente. Los recipientes se cubrieron en Parafilm para que la perdida de agua medida estuviera mediada por transpiracion. El % de contenido de agua del suelo se determino midiendo el peso del recipiente y se calculo eliminando el peso de suelo seco del peso total.

Analisis de perdidas de agua en soja, cebada y mafz.

Para los analisis de perdida de agua usando soja, cebada y mafz, se pulverizo una solucion qufmica 100 pM que contenfa Tween-20 al 0,05 % sobre las partes aereas de las plantas. Las plantas de soja, cebada y mafz usadas tenfan aproximadamente 4, 2 y 2 semanas de edad respectivamente. Los compuestos se aplicaron 16 horas antes de que se realizaran los ensayos de perdida de agua. Para medir la perdida de agua se desprendieron vastagos completos y se controlo su peso fresco.

La Figura 7 muestra el efecto de LC66C6 en diversos parametros en relacion con el estres por sequfa. Como se muestra en las figuras 7A y 7B, LC66C6 redujo la cantidad de perdida de agua por transpiracion en hojas desprendidas de plantas de tipo silvestre y mutante aba2 (mutante deficiente en ABA 2). Sin embargo, como se muestra en la Figura 7C, LC66C6 no redujo la perdida de agua por transpiracion en las hojas desprendidas del mutante abi1-1. La Figura 7D muestra que LC66C6 induce el cierre del estoma en el tipo silvestre y el mutante aba2, pero no en el mutante abil-1. La Figura 7E muestra los efectos de los compuestos agonistas en el contenido de agua del suelo durante el tratamiento de sequfa de las plantas de soja.

La Figura 8A muestra que el tratamiento de plantas con quinabactina confiere tolerancia al estres por sequfa en plantas de Arabidopsis similar a la conferida por el tratamiento con (+)-ABA. En este ejemplo, las plantas de dos semanas de edad se sometieron a estres por sequfa mediante la retencion de agua y se fotografiaron despues de 12 dfas. Las plantas se rehidrataron despues de 2 semanas de tratamiento de sequfa. El numero de plantas supervivientes por numero total de plantas probadas se muestra adyacente a las fotograffas. La Figura 8B muestra que el tratamiento de las plantas de soja con quinabactina confiere una tolerancia al estres por sequfa similar a la conferida por el tratamiento con (+)-ABA. En este ejemplo, las plantas de dos semanas de edad se sometieron a estres por sequfa mediante la retencion de agua y se fotografiaron despues de 8 dfas de tratamiento de sequfa. Para todos los tratamientos de estres por sequfa, los compuestos (probados a 25 pM para Arabidopsis y 50 pM para soja) se aplicaron en soluciones que contenfan Tween-20 al 0,05 % y se aplicaron como aerosoles cada 3 dfas durante el regimen de sequfa. Los valores para todos los experimentos son medias ± ETM (n = 6, 3 plantas usadas por experimento).

Este ejemplo muestra que LC66C6 induce tolerancia al estres por sequfa en plantas de Arabidopsis de tipo silvestre y mutantes aba2 y en plantas de soja de tipo silvestre similares a las conferidas por (+)-ABA.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra que el LC66C6 induce genes sensibles a ABA de una manera similar a los inducidos por (+)-ABA.

Analisis de micromatrices

El ARN total se aislo usando el mini kit RNAeasy Plant (Qiagen, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La smtesis de ADNc, el etiquetado y la hibridacion con los chips ATH1 de Arabidopsis (Affymetrix, EE. UU.) se realizaron en la instalacion de instrumentacion principal IIGB de la universidad de California en Riverside usando los protocolos de Affymetrix. Las muestras de triplicado biologico se hibridaron para los controles de DMSO, ABA, pirabactina y tratamientos de quinabactina; el compuesto se aplico a una concentracion final de 25 pM y el ARN se preparo a partir de tejido congelado despues de 6 horas de exposicion a los compuestos o controles. Las senales de expresion para los conjuntos de sondas se calcularon y normalizaron mediante el algoritmo estadfstico MAS5 (Affymetrix, EE. UU.). El filtrado experimental de los datos de la matriz se realizo para detectar la presencia de senales en todos los experimentos. Los niveles medios de transcritos en cada tratamiento qmmico se compararon con los de los experimentos de control y se usaron para calcular los valores de cambio. Se usaron valores de cambio transformados por Log2 para calcular los coeficientes de correlacion de Pearson entre las condiciones experimentales.

Analisis cuantitativo de TR-RCP

El ARN total se aislo usando reactivo de purificacion de ARN de planta (Invitrogen, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizo a partir de 1 pg de ARN total usando el kit de transcripcion inversa QantiTec (Qiagen, EE. UU.). La RCP en tiempo real con Maxima® SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (Fermentas) se realizo con el sistema de deteccion de RCP en tiempo real iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA). Las cantidades relativas de ARNm diana se determinaron usando el metodo de curva convencional relativa y se normalizaron mediante la cantidad relativa de ARNm de control interno. Se realizaron experimentos por triplicado biologicos. Las secuencias de cebadores usadas en estos experimentos se muestran en la Tabla 1.

Ensayos del gen indicador sensible a ABA

En la experiencia de los investigadores, las fusiones promotoras-GUS sensibles a ABA existentes no son ideales debido a los altos niveles de fondo o los niveles de induccion relativamente bajos en respuesta a ABA. MAPKKK18 as a highly-ABA inducible gene with low background levels (Matsui A, et al., Plant Cell Physiol 49 (8):1135-1149 (2008)); MAPKKK18 tambien esta fuertemente inducido por la sequfa y el estres salino. Por lo tanto, los investigadores caracterizaron los efectos de los agonistas en el promotor MAPKKK18::indicador GUS de plantas transgenicas. La tincion con GUS se realizo en un tampon de reaccion de la siguiente composicion: tampon de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, Tween-20 al 0,05 %, ferrocianuro de potasio 2,5 mM, ferricianuro de potasio 2,5 mM, X-gluc 1 mM. El tampon de reaccion se infiltro al vacfo en muestras de prueba durante 10 minutos dos veces y luego se incubo a 37 °C durante 5 horas. La reaccion se detuvo lavando las muestras con etanol al 70 % y los pigmentos de clorofila se blanquearon mediante incubacion a 65 °C.

La Figura 9 muestra los cambios en la expresion genica inducidos en respuesta a la pirabactina, LC66C6 y (+)-ABA. Como se muestra en la figura 9A, LC66C6 indujo la expresion de ARNm RD29B y MAPKKK18 de una manera dependiente de la dosis en plantas de tipo silvestre, mientras que los niveles de induccion disminuyeron tanto en ab il-1 como en las plantas cuadruples mutantes de PYR/PYL. La induccion de la expresion genica por LC66C6 es similar a la observada con (+)-ABA. A diferencia de (+)-ABA y LC66C6, la pirabactina no indujo la expresion genica en plantas de tipo silvestre, aunque si induce una expresion modesta relacionada con ABA en las semillas cuando se utilizan concentraciones mas altas en el tratamiento (Park et al., 2009).

La Figura 9B muestra la comparacion en todo el genoma de los efectos de ABA y LC66C o pirabactina, en comparacion con los tratamientos de control, en las plantulas de tipo silvestre, medidas por hibridacion de los ARN marcados con micromatrices ATH1. Como se muestra en la Figura 9b, LC66C6 induce un conjunto similar de genes a los inducidos por ABA en un experimento de micromatrices. Por el contrario, la pirabactina no indujo un patron de expresion similar al de ABA.

La Figuras 9C y 9D muestran que LC66C6 induce la expresion de genes indicadores en los mismos tejidos que (+)-ABA. La expresion de los genes indicadores se observo en las celulas protectoras y en los tejidos vasculares de las hojas y las rafces, y en las puntas de las radfculas de las semillas embebidas.

La Figura 10 muestra la expresion del gen sensible a ABA en mutantes individuales de PYR/PYL. Como se muestra en la Figura 10, los ARNm de MAPKKK18, RD29A y RD29B sensibles a ABA fueron inducidos por LC66C6 y (+)-ABA en los ecotipos de Col y Ler y los genotipos mutantes individuales pyrl, pyll, ply2, pyl3 y pyl4. Por el contrario, la pirabactina no indujo significativamente la expresion de ninguno de los genes determinados en ninguno de los mutantes individuales o ecotipos de tipo silvestre.

La Figura 11 muestra la expresion del gen sensible a ABA en plantas de tipo silvestre, abi1-1 y cuadruples mutantes de PYR/PYL. Como se muestra en la Figura 11, tanto LC66C6 como (+)-a Ba indujeron la expresion de ABF3, GBF3, NCED3, y RD29A en una manera dependiente de la dosis en las plantas de tipo silvestre Col, mientras que los niveles de induccion disminuyeron tanto en

abi1-1 como en las plantas cuadruples mutantes de PYR/PYL. De acuerdo con los resultados anteriores, la pirabactina no indujo la expresion significativa de ningun gen analizado en las plantas de tipo silvestre.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra que las enzimas clave para el catabolismo ABA no afectan las respuestas inducidas por LC66C6.

Como se muestra en la Figura 12, la inhibicion del crecimiento y la germinacion de las plantas por ABA se mejora en las plantas que son doble mutante para cyp707a, una enzima clave para el catabolismo de a Ba , pero se reduce en las plantas que sobreexpresan CYP707A (CYP707AOX; vease las Figuras 12A-D). Por el contrario, los efectos sobre el crecimiento y la germinacion de las plantas por LC66C6 no son significativamente diferentes en plantas que son doble mutante para cyp707a, plantas de tipo silvestre o en plantas que sobreexpresan CYP707AOX (vease las Figuras 12A-D).

Este ejemplo muestra que las enzimas involucradas en la descomposicion de ABA no influyen en los fenotipos regulados por LC66C6.

Ejemplo 6

Este ejemplo muestra que el LC66C6 es bioactivo en diversas especies de plantas, incluyendo monocotiledoneas y dicotiledoneas.

La Figura 13A muestra que LC66C6 inhibe la germinacion de brocoli, rabano, alfalfa, soja, cebada, trigo, sorgo y semillas de mafz. El nivel de inhibicion de la germinacion por LC66C6 es mayor que la pirabactina. Como se muestra

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una formulacion agrfcola, que comprende un compuesto de Formula I:

en la que:

R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo,

R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, cada uno opcionalmente sustituido con 1-4 grupos R2a,

cada R2a se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H, halogeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, haloalquilo C1-6, haloalcoxi C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, -OH, alquilhidroxi C1-6, -CN, -NO2, -C(O)R2b, -C(O)R2b, -OC(O)R2b, -C(O)NR2bR2c, -NR2bC(O)R2c, -SO2R2b, -SO2OR2b, -SO2NR2bR2c, y -NR2bSO2R2c, cada uno de R2b y R2c se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-6, cada uno de R3, R4 y R5 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-6, L es un enlazador seleccionado de entre el grupo que consiste en un enlace y alquileno C1-6,

el subfndice m es un numero entero de 0 a 4,

el subfndice n es un numero entero de 0 a 3,

o una sal o isomero del mismo;

en la que la sulfonamida -N(R5)SO2LR2 esta en la posicion 6.

2. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que el compuesto tiene la formula:

3. La formulación de la reivindicación 2, en la que:

R1 es alquilo C1-6 y

R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en arilo y heteroarilo, cada uno opcionalmente sustituido con 1-4 grupos R2a.

4. La formulacion de la reivindicacion 3, en la que:

(i) cada R2a se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H, halogeno y alquilo C1-6; o (ii) R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en fenilo, naftilo, tiofeno, furano, pirrolo y piridilo.

5. La formulacion de la reivindicacion 3, en la que:

R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, neo-pentilo y hexilo;

R2 se selecciona de entre el grupo que consiste en fenilo y tiofeno, cada uno opcionalmente sustituido con 1 grupo R2a; cada R2a se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en H, F, Cl, metilo y etilo; y L se selecciona de entre el grupo que consiste en un enlace y metileno.

6. La formulacion de la reivindicacion 5, en la que el compuesto tiene la formula:

7. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que el compuesto es uno de los compuestos que se muestran a continuacion:

8. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que el compuesto es

9. La formulacion de la reivindicacion 1, que comprende ademas:

(i) al menos uno de un fungicida, un herbicida, un plaguicida, un nematicida, un insecticida, un activador de plantas, un sinergista, un protector de herbicidas, un regulador del crecimiento de la planta, un repelente de insectos, un acaricida, un molusquicida o un fertilizante;

(ii) un tensioactivo; o

(iii) un portador.

10. Un metodo de aumento de la tolerancia al estres abiotico en una planta, comprendiendo el metodo poner en contacto una planta con una cantidad suficiente de la formulacion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para aumentar la tolerancia al estres abiotico en la planta en comparacion con no poner en contacto la planta con la formulacion.

11. Un metodo de inhibicion de la germinacion de semillas en una planta, comprendiendo el metodo poner en contacto una semilla con una cantidad suficiente de la formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para inhibir la germinacion.

12. Una planta que comprende la formulacion como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Una semilla que comprende la formulacion como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

14. Un metodo de activacion de una protefna PYR/PYL, comprendiendo el metodo poner en contacto la protefna PYR/PYL con el compuesto divulgado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.