CN104363760B - 用于植物aba反应的合成化合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供激活ABA受体的激动剂化合物，以及包含所述激动剂化合物的农业制剂。所述农业制剂可用于诱导植物营养组织中的ABA反应，降低植物中的非生物胁迫，以及抑制植物种子发芽。所述化合物还可用于在表达内源或异源ABA受体的细胞中诱导ABA反应性基因的表达。

Description

用于植物ABA反应的合成化合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年3月30日提交的美国临时专利申请No.61/618,386的优先权权益，该临时专利申请以引用方式整体并入本文。

关于在联邦政府资助的研究和开发项目中做出的发明的权利的声明

本发明根据美国国家科学基金会授予的第DGE0504249和IOS0820508号资助在政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。

发明背景

脱落酸(ABA)是一种调节与非生物胁迫反应相关的信号转导的植物激素(Cutler等人,2010,Abscisic Acid:Emergence of a Core Signaling Network.Annual Reviewof Plant Biology61:651-679)。已利用ABA信号通路经由多种方法来改善植物胁迫反应和相关的产量性状(Yang等人,2010)。ABA直接施加到植物改善其水分利用效率(Raedmacher等人,1987)；为此，ABA激动剂的发现(Park等人,2009；Melcher等人,2010,Identificationand mechanism of ABA receptor antagonism.Nature Structural&MolecularBiology17(9):1102-1110)已受到越来越多的关注，因为此类分子可有益于提高作物产量(Notman等人,2009)。第一种经鉴定的合成ABA激动剂为称为pyrabactin的萘磺酰胺(Park等人,2009)，其有效激活种子中的ABA信号转导，但是在营养组织中的活性有限，其中发生非生物胁迫耐性的最关键方面。已作为ABA激动剂(参见美国专利公布No.20130045952)和非生物胁迫调节化合物(参见美国专利公布No.20110230350)公开了与pyrabactin高度相似的磺酰胺；并且还已描述了非磺酰胺ABA激动剂(参见美国专利公布No.20130045952和20110271408)。激活ABA通路的补充性方法涉及经由基因方法增强植物对ABA的敏感性。例如，增强植物的ABA敏感性的法尼基转移酶β亚单位基因的条件反义在中度干旱下在油菜和拟南芥中均提高了产量(Wang等人,2005)。因此，操纵ABA信号转导来改善有助于产量的性状现已得到确认。

最近已发现，ABA通过结合到称为PYR/PYL蛋白的受体的可溶性家族而引起其许多细胞反应。PYR/PYL蛋白属于称为START超家族的一大家族的配体结合蛋白(Iyer等人,2001；Ponting等人,1999)。这些蛋白包含由七个反平行β折叠组成的保守三维架构，这些折叠围绕中央α螺旋形成“螺旋夹”基序；这些结构元件一起形成配体结合袋以结合ABA或其它激动剂。

发明概要

本发明提供小分子ABA激动剂，即，激活PYR/PYL蛋白的化合物。在一个方面，本发明提供包含本文所述的ABA激动剂的农业制剂。在一些实施方案中，该农业制剂包含式I的化合物或其盐或异构体：

其中

R¹选自H、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，

R²选自环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，每一个任选地被1-4个R^2a基团取代，

每一个R^2a独立地选自H、卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷基、C_1-6卤代烷氧基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、-OH、C_1-6烷基羟基、-CN、-NO₂、-C(O)R^2b、-C(O)OR^2b、-OC(O)R^2b、-C(O)NR^2bR^2c、-NR^2bC(O)R^2c、-SO₂R^2b、-SO₂OR^2b、-SO₂NR^2bR^2c和-NR^2bSO₂R^2c，

R^2b和R^2c的每一个独立地选自H和C_1-6烷基，

R³、R⁴和R⁵的每一个独立地选自H和C_1-6烷基，

L为选自键和C_1-6亚烷基的连接基，

下标m为0至4的整数，

下标n为0至3的整数。

在一些实施方案中，该农业制剂还包含可用于促进植物生长、减少杂草或减少害虫的农业化学品。在一些实施方案中，该农业制剂还包含杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物激活剂、增效剂、除草剂安全剂、植物生长调节剂、驱虫剂、杀螨剂、灭螺剂或肥料中的至少一种。在一些实施方案中，该农业制剂还包含表面活性剂。在一些实施方案中，该农业制剂还包含载体。

在另一方面，本发明提供增强植物中的非生物胁迫耐性的方法，该方法包括将植物与足量的上述制剂接触的步骤以与不接触所述制剂时植物中的非生物胁迫耐性相比增强植物中的非生物胁迫耐性。在一些实施方案中，该植物为单子叶植物。在一些实施方案中，该植物为双子叶植物。在一些实施方案中，非生物胁迫耐性包括耐旱性。

在另一方面，本发明提供抑制植物中的种子发芽的方法，该方法包括将植物、植物部分或植物种子与足量的上述制剂接触的步骤以抑制发芽。

在另一方面，本发明提供与上述制剂接触的植物或植物部分。在一些实施方案中，该植物为种子。

在另一方面，本发明提供激活PYR/PYL蛋白的方法。在所述方法的一些实施方案中，当PYR/PYL蛋白结合激动剂化合物LC66C6(在本文也称为quinabactin)时，PYR/PYL蛋白结合2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽。在一些实施方案中，该方法包括将PYR/PYL蛋白与本文所述的任何化合物接触的步骤。在一些实施方案中，激活的PYR/PYL蛋白与SEQ ID NO:1-119的任一种基本上相同。在一些实施方案中，PYR/PYL蛋白由细胞表达。在一些实施方案中，PYR/PYL蛋白由植物细胞表达。在一些实施方案中，PYR/PYL蛋白为内源蛋白。在一些实施方案中，PYR/PYL蛋白为异源蛋白。在一些实施方案中，细胞还表达2型蛋白磷酸酶(PP2C)。在一些实施方案中，2型蛋白磷酸酶为HAB1(与ABI1同源)、ABI1(脱落酸不敏感突变体1)或ABI2(脱落酸不敏感突变体2)。

附图简述

图1.新型ABA激动剂结合到多种PYR/PYL。(A)天然存在的(+)-ABA、其(-)类似物和选定的ABA激动剂的化学结构。(B)PYR/PYL受体对5uM供试化学品的敏感性的酵母双杂交激动剂测定。特异性PYR/PYL受体和PP2C HAB1分别作为Gal4BD或AD融合蛋白而表达，如在正文中所述。

图2.新型ABA激动剂通过多种PYR/PYL抑制PPC2活性。(A)天然存在的(+)-ABA和选定的ABA激动剂的化学结构。(B)和(C)在存在或不存在10μM各供试化学品的情况下基于各种受体的ABA激动剂测定的HAB1、ABI1和AB I2PP2C酶活性。

图3.(A)ABA激动剂和类似物对PP2C酶活性的受体介导的剂量依赖性抑制。(B)在基于酶法HAB1PP2C的ABA激动剂测定中观测到的化合物IC₅₀值。

图4.Quinabactin激活多种ABA受体。(A)ABA、pyrabactin和quinabactin的化学结构。(B)ABA受体对HAB1的化学依赖性抑制。IC₅₀值(nM)如方法中所述使用50nM HAB1、50nM和多种浓度的化合物而确定；全剂量反应曲线在图3中提供。(nd)对应于未作为活性蛋白而产生的受体。系统发育树是在MEGA5中使用JTT距离矩阵建立的Neighbor-Joining树(TamuraK等人,(2011)MEGA5:Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using MaximumLikelihood,Evolutionary Distance,and Maximum Parsimony Methods.MolecularBiology and Evolution28(10):2731-2739)。

图5.新型ABA激动剂比pyrabactin更强烈地抑制拟南芥种子的发芽。(A)和(B)ABA激动剂对种子发芽抑制的比较。(C)和(D)ABA和LC66C6(也称为quinabactin)在拟南芥ABA信号转导和生物合成缺陷突变体上对发芽(C)和成苗(D)的影响。将种子播种在含有化学品的1/2X MS琼脂板上，在4℃下储存4天，然后在22±2℃下转移。在连续光照下温育4天后评估了照片(A和C)和发芽(B)或绿色子叶(D)评分。图C显示了对5μM ABA或LC66C6的发芽测定。

图6.LC66C6抑制植物生长。(A)显示了ABA、Pyrabactin和LC66C6对野生型、abi1-1和PYR/PYL四倍突变拟南芥基因型的影响的照片。(B)ABA、LC66C6和pyrabactin对根部生长的抑制和(C)植物生长的抑制。将两天生幼苗转移到含有化学品的1/2X MS板上，在供试化合物上温育5天后对表型评分或拍照。

图7.LC66C6增强干旱胁迫耐性。LC66C6在野生型(A)和aba2突变基因型(B)中抑制了离体叶片的蒸腾失水。(C)LC66C6无法拯救ABA不敏感基因型abi1-1的表型。(D)LC66C6在野生型和aba2但不在abi1-1基因型中诱导了气孔关闭。(E)在大豆中在干旱处理期间化合物对土壤含水量的影响。土壤含水量如实施例中所述而测量。

图8.Quinabactin为野生型植物赋予干旱胁迫耐性。(A)quinabactin对拟南芥耐旱性的影响。使两周生植物通过断水而经受干旱胁迫并在12天后拍照。在干旱期中，每3天用25μM化合物对植物进行处理。在2周干旱处理后再度为植物给水；针对每种处理的存活植物的数量(与所测试的总数)紧挨着每一个图像示出。(B)quinabactin对大豆的影响。使两周生植物通过断水而经受干旱胁迫，并在8天干旱处理后拍照。对于所有干旱胁迫处理，化合物(对于拟南芥以25μM进行测试，对于大豆以50μM进行测试)均以含有0.05％的吐温-20的溶液进行施用，并在旱情期间每3天作为喷雾而施用。所有实验的值均为平均值±SEM(n＝6，每一个实验使用3株植物)。

图9.LC66C6诱导了多种ABA反应性基因。(A)显示了在用媒介物(DMSO)、pyrabactin、LC66C6或(+)-ABA处理的野生型、abi1-1、pyr1/pyl1/pyl2/pyl4四倍受体突变基因型的拟南芥幼苗中ABA反应报告基因RD29B和MAPKKK18的化学诱导mRNA表达水平。(B)LC66C6有效诱导了拟南芥幼苗中的ABA反应性基因，而pyrabactin则不。将十天生幼苗用载体溶剂(DMSO)或25μM ABA、pyrabactin或LC66C6处理8小时。然后制备了总RNA，标记并杂交到ATH1微阵列。制图数据为在所有实验中可检测的约13K个探针的log2变换平均表达值。所示数据为由一式三份生物学重复样确定的平均值。(C)和(D)显示了在用媒介物(DMSO)、pyrabactin、LC66C6或(+)-ABA处理后在不同植物组织中报告基因的表达。

图10.PYR/PYL单突变体中的ABA反应性基因表达。ABA反应性MAPKKK18、RD29A和RD29B mRNA对LC66C6、ABA和pyrabactin的反应在Col和Ler生态型和pyr1、pyl1、ply2、pyl3和pyl4单突变基因型中进行了表征。

图11.LC66C6在野生型植物、abi1-1和PYR/PYL四倍突变体中诱导了ABA反应性基因表达。LC66C6和(+)-ABA在Col野生型植物中以剂量依赖性方式诱导了ABF3、GBF3、NCED3和RD29A的表达，而pyrabactin则不。

图12.LC66C6敏感性不受CYP707A ABA羟基化酶的影响。(A)显示了照片，而(B)显示了在用DMSO、40μM(+)-ABA和40μMLC66C6处理的野生型植物、过表达CYP707A(CYP707AOX)的植物以及为cyp707a双突变体的植物中对主根长的定量。(C)显示了鲜重，而(D)显示了在如(A)中所处理的植物中具有绿色子叶的植物的百分比。

图13.LC66C6在不同的物种中调节ABA反应。响应于所示化合物的发芽抑制(A)和离体后2小时离体叶片中的蒸腾失水(B)。在施加化学品后ABA反应性标记基因在大豆(C)、大麦(D)和玉蜀黍(E)中的表达。D、P、L和A分别指示DMSO、pyrabactin、LC66C6和(+)-ABA。

图14.ABA和激动剂的化学结构。

图15.ABA和激动剂在酵母测定和种子发芽中的影响。(A)显示了使用PYR/PYL受体PYR1、PYL1、PYL2、PYL3和PYL4的酵母双杂交测定以测试图14中所示的各种激动剂的反应的结果。(B)显示了测试图14中的激动剂对野生型种子的发芽的影响的结果。(C)显示了在ABA诱导型拟南芥基因MAPKKK18控制下表达葡糖醛酸酶的转基因株系中使用葡糖醛酸酶测定法测得的化合物对ABA报告基因株系的影响。

图16.施加LC66C6可拯救在ABA缺陷突变aba2中观察到的生长缺陷。将化学品溶液(25μM)每天两次喷洒在14天生植物上，持续2周。从4周生植物获得了图像(A)和鲜重(B)。

图17.ABA及其激动剂在小立碗藓(Physcomitrella patens)和衣藻属(Chlamydomonas)中的作用。原丝体生长图像(A)和ABA及激动剂对小立碗藓的影响的定量分析(B)。原丝体在200μM特定供试化学品上生长10天。LC66C6的影响较弱，但明显抑制了原丝体生长。Pyrabactin使原丝体白化。(C)小立碗藓的ABA反应性基因的表达。将原丝体用200μM化学品溶液处理了3h。(D)在盐分胁迫和渗透胁迫下衣藻属在化学品上的群体生长。在具有和不具有胁迫的情况下，ABA和LC66C6对衣藻属无影响。Pryabactin白化小立碗藓和衣藻属，表明了该化合物在这些物种中可能具有与其ABA激动剂活性无关的毒性。

图18显示了测试激动剂化合物对发芽和pMAPKK18:Gus报告基因表达的抑制的影响的激动剂化合物的汇总。++++++表示强活性，而单个+表示弱活性，破折号(-)表示无活性，而n.d.表示未确定。

定义

“激动剂”是例如诱导或激活所述靶蛋白的表达，或结合、刺激、增强、开放、激活、促进、增强活化、致敏或上调一种或多种植物PYR/PYL蛋白(或编码多核苷酸)活性的试剂。激动剂可包括天然存在的分子和合成分子。在一些实施方案中，将激动剂与农化品结合以产生农业制剂。合适的农化品的实例包括杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、肥料和/或表面活性剂。用于确定激动剂是“激动”还是“不激动”PYR/PYL蛋白的测定法包括例如如本文所述将推定的激动剂与纯化的PYR/PYL蛋白接触然后确定对PYR/PYL蛋白活性的功能影响，或如本文所述将推定的激动剂与表达PYR/PYL蛋白的细胞接触然后确定对所述靶蛋白活性的功能影响。本领域的技术人员将能够确定一种测定法是否适于确定激动剂是激动还是不激动PYR/PYL蛋白。将包含用推定的激动剂处理的PYR/PYL蛋白的样品或测定与不含激动剂的对照样品进行比较以检验影响程度。为对照样品(未用激动剂处理)赋予100％的相对活性值。PYR/PYL蛋白的激动在相对于对照的活性值为110％、任选150％、任选200、300％、400％、500％或1000-3000％或更高时实现。

术语“PYR/PYL受体多肽”是指部分特征在于存在聚酮环化酶结构域2(PF10604)、聚酮环化酶结构域1(PF03364)和Bet V I结构域(PF03364)(在野生型中介导脱落酸(ABA)和ABA类似物信号转导)中的一者或多者或全部的蛋白。多种多样的PYR/PYL受体多肽序列在本领域中是已知的。在一些实施方案中，PYR/PYL受体多肽包括与SEQ ID NO:1-119中的任一者基本上相同的多肽。参见例如已公布的PCT申请WO 2011/139798。

术语“活性测定”是指测量或检测PYR/PYL受体多肽的活性的任何测定。测量PYR/PYL受体活性的示例性测定为检测PYR/PYL多肽与2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽的结合的酵母双杂交测定，如实施例中所述。

在以下情况中将两个核酸序列或多肽称为“相同的”：两个序列中的核苷酸或氨基酸残基的序列分别在如下文所述进行最大对应性比对时相同。在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下的术语“相同”或百分比“同一性”是指当在比较窗口中进行比较和最大对应性比对时，相同的或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列，如使用以下序列比较算法之一或通过人工比对和视觉观察测量。当序列同一性的百分比关于蛋白或肽使用时，已经认识到，不相同的残基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被取代为具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基并因此不改变分子的功能特性。当序列在保守取代中不同时，可以向上调整百分比序列同一性以校正取代的保守性。用于进行该调整的手段是本领域技术人员熟知的。通常，这涉及将保守取代作为部分而非完全错配来评分，由此增加百分比序列同一性。因此，例如，当将相同的氨基酸给分为1且非保守取代给分为0时，保守取代给分在0和1之间。保守取代的评分根据例如Meyers&Miller,Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17(1988)的算法而计算，例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California,USA)中实施。

在两个核酸或多肽的背景下使用的短语“基本上相同”是指与参比序列具有至少60％序列同一性的序列。或者，百分比同一性可以为60％至100％的任何整数。一些实施方案包括使用本文所述的程序(优选地如下所述采用标准参数的BLAST)与参比序列相比至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。本发明的实施方案提供与SEQ ID NO:1-119中的任一者基本上相同的多肽和编码多肽的核酸。

对于序列比较，通常而言，一个序列充当参比序列，而将测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参比序列输入计算机，如果需要则指定子序列坐标系，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以制定替代参数。序列比较算法然后依据程序参数计算出测试序列相对于参比序列的百分比序列同一性。

如本文所用的“比较窗口”包括指代具有任一邻接位置数的片段，所述邻接位置数选自：20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150，其中将序列和邻接位置数相同的参比序列进行最佳比对后，可以比较所述两个序列。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可例如通过以下方法进行用于比较的序列最佳比对：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实施方式(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)或人工比对和视觉观察。

适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法为BLAST和BLAST2.0算法，其分别在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1977)NucleicAcids Res.25:3389-3402中进行了描述。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中鉴定长度为W的短字串来鉴定高评分序列对(HSP)，当其与数据库序列中相同长度的字串比对时，匹配或满足某一正值阈值评分Τ。T被称为相邻字串评分阈值(Altschul等人，上文)。这些初始相邻字串命中结果(word hit)作为开始检索的种子，以找到含有它们的更长的HSP。字串命中结果然后沿每一序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积的比对评分。对于核苷酸序列，用参数M(一对匹配残基的奖分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积的评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积的评分。当累积的比对评分从其最大获得值减少量X时；当由于一个或多个负评分残基比对的累积使累积的评分为0或以下时；或当达到任一序列的终点时，停止字串命中结果在每一方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下默认值：字长(W)28，期望值(E)10，M＝1，N＝-2，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下默认值：字长(W)3，期望值(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))。

BLAST算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993))。BLAST算法所提供的一种相似性度量为最小总和概率(P(N))，该概率提供两个核苷酸或氨基酸序列之间随机发生匹配的概率的指示。例如，如果供试核酸与参比核酸比较中的最小总和概率小于约0.01、更优选小于约10^-5并且最优选小于约10^-20，则将核酸视为与参比序列相似。

“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定的核酸序列，保守修饰变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量在功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由某个密码子指定的每一个位置，该密码子都可被改变成所述的任何相应密码子，而不会改变编码的多肽。此类核酸变异为“沉默变异”，它们是一种保守修饰的变异。本文中编码多肽的每一个核酸序列还描述该核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每一个密码子(AUG除外，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子)均可被修饰以得到功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一种沉默变异均隐含在每一个所描述的序列中。

至于氨基酸序列，技术人员将认识到，核酸、肽、多肽或蛋白序列中改变所编码序列中的单一氨基酸或低百分比氨基酸的各个取代为“保守修饰变体”，其中这种变化导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代。提供在功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域中熟知的。

以下六组的每一组都含有作为彼此的保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

(参见例如Creighton,Proteins(1984))。

术语“植物”包括整个植株、枝条的营养器官和/或结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药)、胚珠(包括卵细胞和中央细胞)、种子(包括受精卵、胚胎、胚乳和种皮)、果实(例如成熟的子房)、幼苗、植物组织(例如维管组织、基本组织等)、细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)及其子代。可用于本发明方法的植物种类包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、苔藓植物以及多细胞和单细胞藻类植物。它包括多种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。

如本文所用，术语“转基因”描述非天然存在的含有人工修饰的基因组的植物，其中植物在其基因组中包含可来自相同或不同植物物种的外源核酸分子。所述外源核酸分子可以是基因调控元件，诸如启动子、增强子或其它调控元件，或可含有可与异源基因调控元件连接的编码序列。通过有性杂交或自交产生的转基因植物为这种植物的后代并且也被称为“转基因的”。

如本文所用，术语“抗旱性”或“耐旱性”(包括其任何变型形式)是指植物从干旱胁迫期(即，很少水或没有水的天数)恢复的能力。通常，干旱胁迫将为至少5天，也可以长达例如18或20天或更长(例如，至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天)，具体取决于例如植物物种。

如本文所用，术语“非生物胁迫”、“胁迫”或“胁迫条件”是指将植物、植物细胞等暴露于非生命的(“非生物的”)物理或化学试剂，所述试剂对植物的代谢、生长、发育、繁殖或存活(统称为“生长”)具有不利影响。胁迫可因例如以下方面而施加于植物：环境因素，诸如水(例如水涝、干旱或脱水)、缺氧条件(例如低水平的氧或高水平的CO₂)、异常渗透条件、盐分或温度(例如热/高温、冷、冻害或霜)，营养缺乏或暴露于污染，或通过激素、第二信使或其它分子。无氧胁迫例如由于足以产生胁迫反应的氧气水平降低(低氧或缺氧)所致。水涝胁迫可因诸如雨季、湿季、突发水涝或过度灌溉植物等期间发生的将植物、植物部分、组织或分离的细胞长期或暂时地浸没于液体介质中而导致。冷胁迫或热胁迫可由于对特定植物物种的最适宜生长温度范围的温度分别降低或升高所致。该最适宜生长温度范围易于由本领域技术人员确定或为他们所熟知。脱水胁迫可由于细胞、组织、器官或整个植株失水、膨压降低或含水量降低而引起。干旱胁迫可由于细胞、组织、器官或生物体损失水分或供水减少而诱导或与其有关。盐分诱导的胁迫(盐胁迫)可与细胞的细胞内或细胞外环境的渗透势混乱有关或由其引起。如本文所用，术语“非生物胁迫耐性”或“胁迫耐性”是指相比正常条件下的植物而言植物对非生物胁迫具有增加的抗性或耐性，并在非生物胁迫条件下能有相对出众的表现。

如果多肽序列源于外来物种或者来源于相同物种但从其原始形式发生了改变，则该多肽序列与生物体或第二多肽序列“异源”。

具体实施方式

I.简介

本发明部分地基于选择性脱落酸(ABA)激动剂的发现。不同于之前的ABA激动剂，本文所述的激动剂强效激活植物营养组织中的ABA通路并诱导非生物胁迫耐性。这些新的激动剂可用于诱导植物的作物物种中的胁迫耐性。所述激动剂可用于诱导单子叶和双子叶植物物种中的胁迫耐性，这些物种包括但不限于西兰花、萝卜、苜蓿、大豆、大麦和玉米(玉蜀黍)。

脱落酸为参与多种植物保护功能的多功能的植物激素，所述植物保护功能包括芽休眠、种子休眠和/或成熟、叶片和果实的脱落以及对各种各样的生物胁迫(例如冷、热、盐和干旱)的反应。ABA还通过独立于CO₂浓度的机制负责调节气孔的关闭。ABA受体蛋白的PYR/PYL家族介导ABA信号转导。至今检验的植物表达不止一种PYR/PYL受体蛋白家族成员，其至少有点冗余活性。PYR/PYL受体蛋白在例如种子发芽、发芽后生长、气孔运动和植物胁迫(包括但不限于干旱)耐性中作为正调节物介导ABA信号转导。

多种多样的野生型(天然存在的)PYR/PYL多肽序列在本领域中是已知的。虽然PYR1最初在拟南芥中被鉴定为脱落酸(ABA)受体，但事实上，PYR1为也介导ABA信号转导的拟南芥中同一蛋白家族中至少14种蛋白(PYR/PYL蛋白)群组的成员。该蛋白家族也存在于其它植物中(参见例如序列表)并且特征部分在于存在聚酮环化酶结构域2(PF10604)、聚酮环化酶结构域1(PF03364)和Bet V I结构域(PF03364)中的一者或多者或全部。START/Betv1超家族结构域在例如Radauer,BMC Evol.Biol.8:286(2008)中有所描述。在一些实施方案中，野生型PYR/PYL受体多肽包括SEQ ID NO:1-119中的任一者。在一些实施方案中，野生型PYR/PYL受体多肽与SEQ ID NO:1-119中的任一者基本上相同(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％或99％相同)。在一些实施方案中，PYR/PYL受体多肽与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118或119中的任一者基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)。

II.ABA激动剂

本发明提供小分子ABA激动剂，即，激活PYR/PYL蛋白的化合物。示例性ABA激动剂包括例如选自以下的化合物或其盐或异构体：

式I的化合物：

其中

R¹选自H、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，

R²选自环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，每一个任选地被1-4个R^2a基团取代，

每一个R^2a独立地选自H、卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷基、C_1-6卤代烷氧基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、-OH、C_1-6烷基羟基、-CN、-NO₂、-C(O)R^2b、-C(O)OR^2b、-OC(O)R^2b、-C(O)NR^2bR^2c、-NR^2bC(O)R^2c、-SO₂R^2b、-SO₂OR^2b、-SO₂NR^2bR^2c和-NR^2bSO₂R^2c，

R^2b和R^2c的每一个独立地选自H和C_1-6烷基，

R³、R⁴和R⁵的每一个独立地选自H和C_1-6烷基，

L为选自键和C_1-6亚烷基的连接基，

下标m为0至4的整数，

下标n为0至3的整数。

在一些实施方案中，该化合物具有式(II)：

在一些实施方案中，该化合物具有式(III)：

在一些实施方案中，R¹为C_1-6烷基，并且R²选自芳基和杂芳基，每一个任选地被1-4个R^2a基团取代。

在一些实施方案中，每一个R^2a独立地选自H、卤素和C_1-6烷基。

在一些实施方案中，R²选自苯基、萘基、噻吩、呋喃、吡咯和吡啶基。

在一些实施方案中，R¹选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基和己基；R²选自苯基和噻吩，每一个任选地被1个R^2a基团取代；每一个R^2a独立地选自H、F、Cl、甲基和乙基；并且L选自键和亚甲基。

在一些实施方案中，该化合物具有式(IV)：

在一些实施方案中，该化合物具有式(V)：

在一些实施方案中，该化合物为图8所示的化合物之一。

在一些实施方案中，该化合物具有式(VI)：

具有式(VI)的化合物也称为LC66C6或quinabactin(1-(4-甲基苯基)-N-(2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)甲烷磺酰胺)。上述化合物通过筛选购自Life Chemicals(Orange,CT)的结构不同的化合物的文库而鉴定。

在一些实施方案中，该化合物具有式(VII)：

上述化合物可使用本领域熟知的方法合成。例如，基于相同化学骨架的化合物如美国专利No.5,498,755和美国专利No.6,127,382中所述而合成，这些专利的内容以引用方式整体并入本文。

III.ABA激动剂制剂

本发明提供被配制成接触植物的农业化学制剂，其中该制剂包含本发明的ABA激动剂。在一些实施方案中，与激动剂接触的植物包含或表达内源PYR/PYL多肽。在一些实施方案中，与激动剂接触的植物不包含或表达异源PYR/PYL多肽(例如，植物不是转基因的，或者是转基因的但表达异源PYR/PYL蛋白之外的异源蛋白)。在一些实施方案中，与激动剂接触的植物不包含或表达如本文所述的异源PYR/PYL多肽。

根据本发明，所述制剂可适于例如在载体中处理植物或植物繁殖材料，诸如种子。合适的添加剂包括缓冲剂、润湿剂、包衣剂、多糖和研磨剂。示例性载体包括水、水溶液、浆液、固体和干燥粉末(例如泥炭、小麦、糠、蛭石、粘土、消毒土壤、碳酸钙的多种形式、白云石、各种等级的石膏、皂土和其它粘土矿物、磷酸岩和其它磷化合物、二氧化钛、腐殖质、滑石、海藻酸盐和活性碳。本领域技术人员已知的任何在农业上合适的载体都是可接受的，并且都预期在本发明中使用)。任选地，该制剂还可以包含表面活性剂、除草剂、杀真菌剂、杀虫剂或肥料中的至少一种。

在一些实施方案中，该农业化学制剂包含表面活性剂、除草剂、杀虫剂(诸如但不限于杀真菌剂、杀菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂和杀线虫剂)、植物激活剂、增效剂、除草剂安全剂、植物生长调节剂、驱虫剂或肥料中的至少一种。

在一些实施方案中，该农业化学制剂包含有效量的一种或多种选自以下的除草剂：百草枯(592)、甲基磺草酮(500)、磺草酮(710)、异噁草酮(159)、四唑酰草胺(340)、苯噻草胺(491)、噁嗪草酮(583)、茚草酮(450)、草甘膦(407)、苄草丹(656)、草达灭(542)、醚苯磺隆(773)、氯吡嘧磺隆(414)和丙草胺(632)。上述除草活性成分例如在"The PesticideManual",编辑C.D.S.Tomlin,第12版,British Crop Protection Council,2000中以括号内所添加的条目号进行了描述；例如，甲基磺草酮(500)在其中以条目号500进行了描述。上述化合物例如在US7,338,920中进行了描述，其以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，该农业化学制剂包含有效量的一种或多种选自以下的杀真菌剂：环苯吡菌胺、咯菌腈、吡噻菌胺、丙硫菌唑、粉唑醇、恶醚唑、嘧菌酯、克菌丹、环唑醇、嘧菌环胺、啶酰菌胺、烯唑醇、氟环唑、氟嘧菌酯、肟菌酯、甲霜灵、高效甲霜灵(精甲霜灵)、氟喹唑、氯苯嘧啶醇、氟苯嘧啶醇、啶斑肟、唑菌胺酯、噻菌灵、戊唑醇、三唑醇、苯霜灵、精苯霜灵、苯菌灵、多菌灵、萎锈灵、氟酰胺、麦穗宁(fuberizadole)、克热净、腈菌唑、氟醚唑、抑霉唑、叶菌唑、双苯三唑醇、霜脲氰、种菌唑、异菌脲、咪鲜安、戊菌隆、霜霉威、硅噻菌胺、二硫四甲秋兰姆、唑菌嗪、灭菌唑、甲苯氟磺胺和锰化合物(诸如代森锰锌、代森锰)。在一些实施方案中，该农业化学制剂包含有效量的一种或多种选自以下的杀昆虫剂、杀螨剂和/或杀线虫剂：噻虫嗪、吡虫啉、可尼丁、三氟氯氰菊酯、七氟菊酯、高效氟氯氰菊酯、扑灭司林、阿巴美丁、氟虫腈和多杀菌素。具有通用名的每一种上述杀虫剂的详细信息(例如结构、化学名、商品名等)可见于e-Pesticide Manual,版本3.1,第13版,编辑CDC Tomlin,British CropProtection Council,2004-05。上述化合物例如在US8,124,565中进行了描述，其以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，该农业化学制剂包含有效量的选自以下的一种或多种杀真菌剂：嘧菌环胺((4-环丙基-6-甲基-嘧啶-2-基)-苯胺)(208)、多果定(289)、百菌清(142)、灭菌丹(400)、丙硫菌唑(685)、啶酰菌胺(88)、丙氧喹啉(682)、二噻农(279)、氟啶胺(363)、种菌唑(468)和苯菌酮。上述化合物的一些例如在"The Pesticide Manual"[The PesticideManual--A World Compendium；第13版；编辑:C.D.S.Tomlin；The British CropProtection Council,2003]中以括号内添加的条目号进行了描述。上述化合物例如在以引用方式整体并入本文的US8,349,345中进行了描述。

在一些实施方案中，该农业化学制剂包含有效量的一种或多种选自以下的杀真菌剂：咯菌腈、甲霜灵和甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂，或其混合物。在一些实施方案中，甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为嘧菌酯、啶氧菌酯、克收欣或三氟敏(trifloxystorbin)。在一些实施方案中，该农业化学制剂包含有效量的一种或多种选自以下的杀昆虫剂：苯基吡唑和新烟碱。在一些实施方案中，苯基吡唑为氟虫腈，而新烟碱选自噻虫嗪、吡虫啉、噻虫啉、可尼丁、烯啶虫胺和啶虫脒。上述化合物例如在US7,071,188中进行了描述，其以引用方式整体并入本文的。在一些实施方案中，该农业化学制剂包含有效量的一种或多种生物杀虫剂，包括但不限于巴斯德氏芽菌属(Pasteuria spp.)、拟青霉属(Paeciliomyces)、厚垣普奇尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)、漆斑菌(Myrothecium)代谢物、Muscodor挥发物、万寿菊属(Tagetes spp.)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，包括坚强芽孢杆菌CNCM I-1582。

IV.施加到植物

ABA激动剂制剂和组合物可使用多种已知的方法施加到植物，例如通过在繁殖材料上喷洒、气雾化、滴下、倾倒、灌溉、撒下或分散组合物，或在植物上刷涂或倾倒或以其它方式接触组合物，或就种子而言，通过涂布、包封、喷洒、浸渍、将种子浸入液体组合物或以其它方式处理种子。在替代方式中，为了在种植前直接处理植物或种子，也可以将本发明的制剂引入将要在其中种植种子的土壤或其它介质。例如，可通过喷洒、分散、倾倒、灌溉或以其它方式处理土壤而将制剂引入土壤。在一些实施方案中，载体也用于该实施方案。载体可以是固体或液体，正如上面提到的。在一些实施方案中，将泥炭悬浮在水中作为ABA激动剂的载体，并将该混合物喷洒进土壤或种植介质和/或在种植种子时喷洒在种子上。

可用本文所述的ABA激动剂处理的植物类型包括单子叶植物物种和双子叶植物物种，包括谷物，诸如大麦、黑麦、高粱、小黑麦(tritcale)、燕麦、稻、小麦、大豆和玉米；甜菜(例如糖用甜菜和饲用甜菜)；葫芦科植物，包括黄瓜、甜瓜、美国甜瓜、南瓜和西瓜；甘蓝类作物(cale crop)，包括椰菜、卷心菜、西兰花、白菜和其它多叶绿色植物；其它蔬菜，包括番茄、辣椒、莴苣、菜豆、豌豆、洋葱、大蒜和花生；油料作物，包括芸苔、花生、向日葵、油菜和大豆；茄科植物，包括烟草；块茎和块根作物，包括马铃薯、薯蓣、萝卜、甜菜、胡萝卜和白薯；果实，包括草莓；纤维作物，包括棉花和大麻；其它植物，包括咖啡、花坛植物、多年生植物、木本观赏植物、草皮和切花，包括康乃馨和玫瑰；甘蔗；用集装箱装的木本作物；常绿树，包括冷杉和松树；落叶树，包括枫树和橡树；以及水果和坚果果树，包括樱桃、苹果、梨、杏、桃、胡桃和柑橘。

应当理解，本文所述的ABA激动剂模拟ABA对细胞的功能。因此，预计的是，通过将细胞与ABA接触而触发的一种或多种细胞反应也将通过使细胞与本文所述的ABA激动剂接触而触发。本文所述的ABA激动剂模拟ABA的功能并在有用的制剂中提供。

在一些实施方案中，施加本文所述的ABA激动剂增强植物的非生物胁迫抗性。

在一些实施方案中，向种子施加本文所述的ABA激动剂抑制种子发芽。

本发明还提供与本文所述的ABA制剂接触的植物。与ABA制剂接触的植物可包括植物部分和/或种子。

V.筛选新的ABA激动剂和拮抗剂

本发明的实施方案还提供筛选推定的化学激动剂以确定当将该推定的激动剂与PYR/PYL受体多肽接触时该推定的激动剂是否激动PYR/PYL受体多肽的方法。如本文所用，如果某一试剂的存在导致受体活性的激活或上调，例如，增强PYR/PYL受体的下游信号转导，则该试剂“激动”PYR/PYL受体蛋白。对于本发明，如果某一试剂以不大于200μM的浓度存在，将该试剂与PYR/PYL受体接触导致PYR/PYL受体活性的激活或上调，则该试剂激动PYR/PYL受体。如果当某一试剂以不大于200μM的浓度存在时该试剂不诱导PYR/PYL受体蛋白活性的激活或上调，则该试剂不明显激动PYR/PYL受体。如本文所用，“激活作用”需要最低的活性阈值被所述试剂诱导。确定是否满足该最小活性阈值可例如通过以下方式实现：通过使用酶法磷酸酶测定法，该测定法设定必须诱导的酶活性水平的最小值；或通过在比色检测试剂存在下(例如磷酸对硝基苯酯)使用酶法磷酸酶测定法，其中如果观察到颜色变化则满足最小活性阈值。

本发明还提供通过筛选分子诱导PYR/PYL-PP2C结合的能力(就激动剂而言)或破坏ABA和其它激动剂以促进PYR/PYL-PP2C结合的能力(就拮抗剂而言)而筛选ABA激动剂和拮抗剂的方法。可以使用多种不同的筛选方案来鉴定激动或拮抗PYR/PYL多肽的试剂。

筛选可使用分离的、纯化的或部分纯化的试剂进行。在一些实施方案中，可以使用纯化的或部分纯化的PYR/PYL多肽。

或者，可以使用基于细胞的筛选方法。例如，可以使用天然表达PYR/PYL多肽或重组表达PYR/PYL多肽的细胞。在一些实施方案中，所用的细胞为植物细胞、动物细胞、细菌细胞、真菌细胞(包括但不限于酵母细胞)、昆虫细胞或哺乳动物细胞。一般而言，该筛选方法涉及筛选多种试剂，以通过例如结合到PYR/PYL多肽、或激活PYR/PYL多肽或增加PYR/PYL多肽或编码PYR/PYL多肽的转录物的表达而鉴定调节PYR/PYL多肽活性的试剂。

1.PYR/PYL多肽结合测定法

任选地，初步筛选可通过筛选能够结合到PYR/PRL多肽的试剂而进行，因为如此鉴定的所述试剂中的至少一些可能为PYR/PYL多肽调节剂。

结合测定可涉及将PYR/PYL多肽与一种或多种供试试剂接触并允许蛋白和供试试剂接触足够的时间以形成结合复合物。所形成的任何结合复合物可使用多种既定的分析技术中的任一种进行检测。蛋白结合测定法包括但不限于测量非变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的共沉淀或共迁移以及Western印迹上的共沉淀的方法(参见例如Bennet,J.P.和Yamamura,H.I.(1985)“Neurotransmitter,Hormone or Drug Receptor BindingMethods,”Neurotransmitter Receptor Binding(Yamamura,H.I.等人编辑)，第61-89页)。其它结合测定法涉及使用质谱法或NMR技术来鉴定结合到PYR/PYL多肽的分子或标记底物(例如标记的ABA)的位移。用于此类测定法的PYR/PYL多肽蛋白可天然表达、克隆或合成。

2.活性

PYR/PYL多肽激动剂可通过筛选激活或增加PYR/PYL多肽的活性的试剂而加以鉴定。拮抗剂可通过降低活性而鉴定。

一种活性测定法涉及测试候选激动剂是否能以激动剂特异性方式诱导PYR/PYL蛋白结合到2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽。哺乳动物或酵母双杂交方法(参见例如Bartel,P.L.等人,Methods Enzymol,254:241(1995))可用于鉴定在细胞中一起表达时相互作用或结合的多肽或其它分子。在一些实施方案中，在PYR/PYL多肽与2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽(例如ABI1或2或其直系同源物，例如，来自PP2C的A组亚家族)之间的双杂交测定法中鉴定激动PYR/PYL多肽的试剂，其中ABA激动剂被鉴定为激活PYR/PYL多肽和PP2C多肽或使得它们能够结合的试剂。因此，两种多肽在存在所述试剂的情况下结合，但不存在所述试剂时不结合。在一些实施方案中，如果酵母细胞在酵母双杂交测定法中变蓝，则将化合物或试剂鉴定为PYR/PYL蛋白的激动剂。

PYR1和PYR/PYL蛋白的生物化学功能一般是抑制PP2C活性。这可以在活细胞中用酵母双杂交或其它基于细胞的方法加以测量。其还可以在体外用酶法磷酸酶测定法在存在比色检测试剂(例如磷酸对硝基苯酯)的情况下加以测量。上文使用的基于酵母的测定法提供配体结合的间接指示。为了解决这一潜在局限，可以使用体外竞争测定法或使用其它生物体的基于细胞的测定法，作为用于鉴定弱结合目标化合物的替代方法。

3.表达测定法

还提供了增加PYR/PYL多肽表达的化合物的筛选法。筛选方法通常涉及进行基于细胞的或基于植物的测定，其中将供试化合物与一种或多种表达PYR/PYL多肽的细胞接触，然后检测PYR/PYL表达(转录物或翻译产物)的增加。可用天然表达PYR/PYL的细胞，或在经重组改变以表达PYR/PYL的细胞中，或在经重组改变以在PYR/PYL启动子控制下表达报告基因的细胞中进行测定。

可以进行各种控制以确保观测到的活性是真实可靠的，包括通过不含报告构建体的细胞进行平行反应，或不使具有报告构建体的细胞与供试化合物接触。

4.验证

可对通过任何前述筛选方法最初鉴定的试剂进行进一步测试以验证试剂的表观活性和/或确定试剂的其它生物作用。在一些情况下，测试所鉴定的试剂实现植物胁迫(例如耐旱性)、种子发芽或受ABA影响的另一表型的能力。多种此类测定法和表型在本领域中是已知的并可根据本发明的方法使用。

5.固相和可溶性高通量测定法

在本发明的高通量测定法中，可能的是在一天中筛选多达数千种不同的调节剂或配体。具体而言，微量滴定板的每一个孔可用于进行针对选定的潜在调节剂的独立测定，或者，如果要观察浓度或温育时间效应，则每5-10个孔可测试一种调节剂。因此，单个标准的微量滴定板可测定约100(例如96)种调节剂。如果使用1536孔板，则单个板可容易地测定约100至约1500种不同的化合物。可能的是，每天测定数个不同的板；使用本发明的集成系统可能检测筛选多达约6,000-20,000种或更多种不同的化合物。此外，可以使用试剂操纵的微流体方法。

所关注的分子(例如PYR/PYL或表达PYR/PYL多肽的细胞)可经由共价或非共价键合直接或间接结合到固态组分。

本发明提供用于以高通量方式鉴定可调节PYR/PYL的表达或活性的化合物的体外测定法。

非生物胁迫抗性可根据多种熟知技术中的任一种进行测定。例如，对于耐旱性，可使植物在其中向植物提供比最适宜情况低的水分的条件下生长。耐旱性可通过多种标准量度中的任一种加以测定，这些量度包括膨压、生长、产量等。

VI.增强植物中的非生物胁迫耐性的方法

本发明还提供增强植物中的非生物胁迫耐性的方法。因此，在一些实施方案中，将植物与足量的本文所述的ABA激动剂或ABA激动剂制剂接触以增强植物中的非生物胁迫耐性。施加到植物的ABA激动剂制剂的量可足以与不使植物与ABA激动剂制剂接触时相比增强非生物胁迫耐性。可使用本文所述的任何方法将植物与ABA制剂接触。非生物胁迫耐性的增强可改善在对植物生长或存活造成不利影响的非生物胁迫条件下的植物生长和/或存活。非生物胁迫包括本文所述的物理条件或化学条件。

VII.抑制植物中的种子发芽的方法

本发明还提供抑制种子发芽的方法。因此，在一些实施方案中，将植物、植物部分或种子与足以抑制种子发芽的量的ABA激动剂制剂接触。可使用本文所述的任何方法将种子与ABA制剂接触。在一些实施方案中，将种子与ABA激动剂制剂直接接触。在一些实施方案中，在种植或播种种子之前或之后，将地面或土壤与ABA激动剂制剂接触。在一些实施方案中，将植物与足够的ABA激动剂制剂接触以抑制随后从植物发育而来的种子发芽。

VIII.激活PYR/PYL受体多肽的方法

本发明还提供激活PYR/PYL受体多肽的方法。在一些实施方案中，将PYR/PYL多肽与上述化合物接触，而激活的PYR/PYL多肽结合到PP2C多肽。在一些实施方案中，PYR/PYL多肽能够被激动剂化合物LC66C6激活。在一些实施方案中，激活的PYR/PYL蛋白与SEQ ID NO:1-119的任一种基本上相同。来自各种植物的ABA受体的序列的实例在美国专利公布2011/0271408中有所提供，所述专利公布以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，该方法在无细胞的体外测定法中激活PYR/PYL受体。在一些实施方案中，该方法激活在细胞中表达的PYR/PYL受体。在一些实施方案中，该细胞还表达PP2C多肽。在一些实施方案中，该细胞为植物细胞。在一些实施方案中，该细胞为动物或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞表达内源PYR/PYL蛋白。在一些实施方案中，该细胞经工程改造以表达异源PYR/PYL多肽。在一些实施方案中，该细胞表达异源PP2C多肽。在一些实施方案中，该细胞表达选自HAB1(与ABI1同源)、ABI1或ABI2的PP2C多肽。

在一些实施方案中，激活的PYR/PYL多肽诱导异源基因的表达。在一些实施方案中，异源基因为ABA反应性基因。在一些实施方案中，诱导的基因表达在表达内源PYR/PYL多肽的细胞中发生。在一些实施方案中，诱导的基因表达在表达异源PYR/PYL多肽的细胞中发生。

实施例

实施例1

该实施例证实了本文所述的新型ABA激动剂结合到多种PYR/PYL受体并激活所述受体。

方法

化学筛选

将先前所述的酵母双杂交系统用于高通量筛选(HTS)以鉴定ABA激动剂(参见Peterson FC,等人(2010)Structural basis for selective activation of ABAreceptors.Nature Structural&Molecular Biology17(9):1109-1111)。在该系统中，促进受体-PP2C相互作用的激动剂驱动URA3或HIS3报告基因的表达，并拯救亲本品系的尿嘧啶或组氨酸营养缺陷体(Peterson FC等人(2010)；Vidal M,Brachmann RK,Fattaey A,Harlow E,&Boeke JD(1996)Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detectdissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America93(19):10315-10320)。使用5种不同的表达与PYR1、PYL1、PYL2、PYL3或PYL4的结合域(BD)融合体的报告品系进行HTS；这些融合体与HAB1的激活域(AD)融合体(pACT-HAB1)共表达；所用的构建体已在先前进行了描述(Park等人2009)。我们将这些品系用于两个单独的筛选。在第一个筛选中，基本上如Gassner NC等人(2007)(Accelerating the discovery of biologicallyactive small molecules using a high-throughput yeast halo assay.Journal ofNatural Products70(3):383-390)所述，使用卤素测定法测定了得自Chembridge(SanDiego,USA)的约65,000种化合物的激动剂活性。在该方法中，将酵母菌株嵌入选择性琼脂中，将化合物从10mM DMSO储备液针转移(pin transferred)到测定板上；在活性化合物附近细胞密度增加表明匹配(hit)。使用卤素测定法的实验利用酵母菌株PJ69-4A和补充了10mM3-氨基三唑以改善选择的培养基。使用配备自动化微孔板存储器(Thermo Cytomat)和384针工具(V&P Scientific)的Biomek FX建立卤素筛选，所述384针工具用于在测定板上进行化合物点样。在每次化学转移前，将针在1:1的DMSO/水混合物中洗涤，然后用95％乙醇洗涤。在化学转移后，将板在28℃下温育，人工观察候选激动剂。

虽然卤素筛选方法从通量的角度来看是有力的，但是我们随后采用了更常规的筛选方法对得自Life Chemicals(Ukraine)的12,000个成员的文库进行了第二次筛选。这一变化的动机是希望更好地控制测定浓度。在我们的第二次筛选中，将报告构建体在酵母菌株MAV99中表达，这使得能够经由GAL1启动子驱动的URA3转基因实现基于尿嘧啶的选择(Peterson FC等人(2010))。将筛选化合物以25M的最终浓度加到96孔板中接种了报告菌株的选择性尿嘧啶阴性培养基中；在大约3天后人工观察酵母生长。将化合物使用Biomek FX液体处理器从2.5mM储备液转移到筛选孔中。

作为第三种筛选方法，还在含有0.5X MS盐、0.5％蔗糖和25μM供试化合物的固化琼脂培养基中对Life Chemicals文库的拟南芥发芽抑制剂进行了筛选。将得自发芽测定的匹配随后在酵母双杂交测定中进行了测试。将匹配化合物从其原供应商补足，并用于二次筛选和化合物表征。Quinabactin及其类似物购自Life Chemicals。

PP2C活性测定法

如先前所述稍加修改，表达并纯化了HAB1和PYL蛋白(Park SY等人(2009)Abscisic Acid Inhibits Type2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family ofSTART Proteins.Science324(5930):1068-1071)。为了获得GST-HAB1、-ABI1和-AB I2融合蛋白，将HAB1cDNA克隆进pGex-2T，而将ABI1和ABI2cDNA克隆进载体pGex-4T-1。在BL21[DE3]pLysS宿主细胞中进行表达。将转化的细胞预培养过夜，转移到LB培养基，并在30℃下培养以培养到A₆₀₀为约0.5。然后将培养物在冰上冷却，将MnCl₂添加到4mM并将IPTG添加到0.3mM。在15℃下温育16小时后，收获细胞，并如先前所述在谷胱甘肽琼脂糖上纯化重组蛋白(Park SY等人(2009))。为了获得6XHis-PYL受体融合蛋白，如先前所述将所有13种ABA受体的受体cDNA克隆进载体pET28并表达和纯化(Mosquna A等人(2011)Potent andselective activation of abscisic acid receptors in vivo by mutationalstabilization of their agonist-bound conformation.PNAS108(51):20838-20843)；这得到了除PYL7、PYL11和PYL12以外的所有受体的可溶性且功能性蛋白(使用受体介导的PP2C抑制测定法评估)。因此，使用载体pMAL-c将这三种受体可选地表达为麦芽糖结合(MBP)融合蛋白；通过用于GST-HAB1的相同诱导条件，在BL21[DE3]pLysS宿主菌中进行了这些构建体的表达。使用直链淀粉树脂(New England Biolab,Inc.)根据制造商的纯化说明从超声处理并澄清的裂解液中纯化了重组体MBP-PYL融合蛋白。这一努力得到了活性的MBP-PYL11融合蛋白，但PYL7和PYL12则不然。

如下进行了使用重组受体和PP2C的PP2C活性测定：在22℃下，将纯化的蛋白在含有10mM MnCl₂、3μg牛血清白蛋白和0.1％2-巯基乙醇的80μl测定缓冲液中用ABA或ABA激动剂预温育30分钟。通过添加20μL含有156mM Tris-OAc(pH7.9)、330mM KOAc和5mM4-甲基伞形酮磷酸酯的反应溶液而启动反应，之后，立即使用激发滤光片355nm和发射滤光片460nm在Wallac酶标仪上采集荧光测量值。反应物分别包含50nM PP2C和100nM PYR/PYL蛋白。

图1A显示了ABA激动剂的代表性群组。如图1B所示，多种PYR/PYL受体在酵母双杂交测定中被多种激动剂(包括LC66C6)激活。这一测定法报告了当特异性受体和PP2C分别融合到GAL4激活和DNA结合结构域时激动剂促进的PYR/PYL蛋白与进化枝A PP2C蛋白的物理相互作用，如先前所述(Park等人2009)。这些基于酵母的测定法表明LC66C6为多种PYR/PYL受体的激动剂，它不同于先前所述的激动剂pyrabactin，后者具有比ABA或新型激动剂LC66C6高得多的受体选择性。如先前所述，激动剂促进的受体与进化枝APP2C的结合抑制PP2C的磷酸酶活性。在拟南芥中，存在14种PYR/PYL受体，其中13种可在基于原生质体的测定系统中介导ABA反应(Fujii等人2009)。为了更密切地检验LC66C6的选择性，我们尝试了表达并纯化所有14个成员的重组6X-His-PYR/PYL蛋白并回收了除PYL7、12和13(其出于技术原因无法以活性形式产生)之外的所有受体的ABA反应性受体。该组重组受体使得能够几乎完全地描绘ABA激动剂对拟南芥PYR/PYL受体家族成员的活性。如图2所示，HBA1、ABI1和ABI2的PPC2酶活性通过10μM ABA在存在所有所测试的ABA受体的情况下抑制了>90％(图2B)。响应于LC66C6(Quinabactin)，对于受体PYR1、PYL1、PYL2、PYL3和PYL5，观察到了HBA1、ABI1和ABI2的>70％的PP2C抑制。

为了进一步表征quinabactin的活性并限定其受体选择性，使用10个重组受体连同PP2C HAB1、ABI1或ABI2进行了受体介导的PP2C抑制测定。这些实验表明了quinabactin以亚微摩尔IC₅₀值激活PYR1、PYL1-3和PYL5并显示出在二聚受体位点明显更高的活性(图2、3和4)。结果还表明quinabactin是比ABA更强的PYR1或PYL1激动剂(图2和3)。此外，对于所测试的所有受体，通过quinabactin观察到的最大PP2C抑制高于通过pyrabactin所观察到的抑制。虽然pyrabactin可以0.90μM的IC50激活PYL5，但是其以约40％的PP2C抑制达到饱和，从而表明其为不完全/部分PYL5激动剂。因此，该实施例阐述了对具有更宽的受体谱活性并相对于pyrabactin而言生物活性增强的新型磺酰胺激动剂的鉴定。

实施例2

该实施例证实了新型ABA激动剂抑制发芽和植物生长。

拟南芥发芽和下胚轴生长抑制分析

对于拟南芥发芽和下胚轴生长抑制分析，将成熟约4周后的种子用含有5％NaClO和0.05％吐温-20的溶液进行10分钟的表面消毒，然后用水漂洗四次。将消毒后的种子用0.1％琼脂悬浮，然后在存在化学品的情况下播种在含有1/2Murashige and Skoog(MS)盐(Sigma-Aldrich)的0.8％固化琼脂培养基中，在4℃下储存4天，然后在22℃下于黑暗或光照下转移。发芽在温育4天后进行确定，而下胚轴生长在温育6天后进行拍照。

植物材料

使用了以下等位基因/突变品系：aba2-1(Leon-Kloosterziel KM等人(1996)Isolation and characterization of abscisic acid-deficient Arabidopsis mutantsat two new loci.Plant J10(4):655-661)、abi1-1(Umezawa T等人(2009)Type2Cprotein phosphatases directly regulate abscisic acid-activated proteinkinases in Arabidopsis.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America106(41):17588-17593)、abi3-9、abi4-11(Nambara E等人(2002)A screen for genes that function in abscisic acid signaling inArabidopsis thaliana.Genetics161(3):1247-1255)和pry1pyl1pyl2ply4四倍体(ParkSY等人(2009)Abscisic Acid Inhibits Type2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins.Science324(5930):1068-1071)；所有这些品系均在Columbia背景下。所用的pry1pyl1pyl2ply4四倍体突变品系回交到Columbia三次。大麦和大豆种子购自Living Whole Foods,Inc.，而玉蜀黍种子得自W.Atlee Burpee&Co.。用于采用这些材料的生理实验的详细方法作为支持信息而提供。

为了探索LC66C独特的激动剂特性的生理学后果，我们表征了其对拟南芥种子、幼苗和成株的影响。如图5所示，本文所述的ABA激动剂强烈抑制了拟南芥中的种子发芽。图5A和5B显示了多种激动剂(包括LC66C6)以剂量依赖性方式抑制种子发芽。具体地讲，LC66C6在每摩尔的基础上在抑制发芽方面几乎与(+)-ABA一样有效，并且比所测试的其它激动剂更有效。

图5C和5D显示了激动剂(+)-ABA和LC66C6对抑制得自各种ABA不敏感突变体的种子发芽的影响。如图5C所示，在5μM的浓度下，对于除了PYR/PYL四倍突变体(pyr1/pyl1/pyl2/pyl4)和pyr1单突变体以外的所有测试的突变体，LC66C6显示出与(+)-ABA相似的发芽抑制模式。与在上面的图4中所展示的IC₅₀数据相结合，该遗传数据表明LC66C6的发芽抑制活性的主要原因是其激动PYR1、PYL1和PYL2的能力。ABA在四倍突变体中抑制发芽的能力可能是因为其对其它受体的激动剂活性。我们的遗传数据与以下假设一致：PYR1响应于ABA在种子发芽中发挥着重要但冗余的作用，因为pyr1突变体在存在5μM LC66C6或pyrabactin的情况下发芽(Park等人2009)。

如图6所示，LC66C6还抑制了发芽后的植物生长。图6A和6B显示了LC66C6抑制了野生型、abi1和四倍突变体中的根伸长，并且在所测试的所有浓度下在其抑制作用方面与(+)-ABA相当或稍微更有效。另外，图6C证实了LC66C6以浓度依赖性方式抑制了野生型和突变植物两者的生长。LC66C6对植物生长的抑制明显高于pyrabactin产生的抑制，并与(+)-ABA相当。

该实施例证实了LC66C6为野生型和ABA不敏感突变植物的种子发芽和生长的强效抑制剂。

实施例3

该实施例证实了激动剂LC66C6诱导干旱胁迫耐性。

生理测定

对在22±2℃和45±10％的相对湿度(RH)下于16/8h光照/黑暗循环中生长的拟南芥植物进行了生理测定。对于拟南芥中的蒸腾失水分析，将植物通过含有25μM化合物和0.05％吐温-20的4ml溶液的气溶胶喷雾进行预处理。将12株4周生植物用所分析的每种化合物或对照进行喷洒。在用化合物过夜预处理后，将地上部分与根部分离，并在2小时的时间段中以20min为间隔测量其鲜重。为了测量气孔开度，将植物用如上所述的化合物预处理，盖上塑料盖以维持高RH，在过夜预处理后，使用铃木通用微印刷(Suzuki’s UniversalMicro-Printing,SUMP)方法用SUMP压印溶液与SUMP B板(SUMP Laboratory)得到了叶表皮压痕。通过光学显微镜分析叶片压痕，并使用ImageJ1.43v软件(National Institutes ofHealth,USA)由孔宽度确定了气孔开度。对于拟南芥干旱胁迫测定，在3天中，每天一次将约1.5ml25μM的化学溶液通过气溶胶施用给植物。使植物在每盆含有100g土壤的方形6×6×5cm盆中生长。对在25±2℃、65±10％的RH下于16/8h光照/黑暗循环中生长的植物进行了大豆干旱胁迫测定。每盆(每盆3株植物)喷洒约20ml50μM的含0.05％吐温-20的化学溶液，每3天四次。所用的盆的大小为250ml，每盆含有200g土壤。将盆盖上石蜡膜，使得测得的失水为介导的蒸腾失水。土壤水含量％通过测量盆重而确定，并通过从总重中减去干燥土壤重量而计算。

大豆、大麦和玉蜀黍中的失水分析。

对于使用大豆、大麦和玉蜀黍的失水分析，将100μM的含0.05％吐温-20的化学溶液喷洒在植物的地上部分。所用的大豆、大麦和玉蜀黍分别为约4、2和2周生。在进行失水测定前16小时施加化合物。为了测量失水，将整个根部分离，并监测其鲜重。

图7显示了LC66C6对与干旱胁迫相关的各种参数的作用。如图7A和7B所示，LC66C6减少了得自野生型和aba2(ABA缺陷突变体2)突变植物的分离叶片中的蒸腾失水量。然而，如图7C所示，LC66C6未减少得自abi1-1突变体的分离叶片中的蒸腾失水。图7D显示了LC66C6诱导了野生型和aba2突变体但不包括abi1-1突变体中的气孔关闭。图7E显示了在大豆植物的干旱处理期间激动剂化合物对土壤水含量的影响。

图8A显示了用quinabactin处理植物赋予了拟南芥植物与用(+)-ABA处理所赋予的相似的干旱胁迫耐性。在该实施例中，使两周生植物通过断水而经受干旱胁迫，并在12天后拍照。在2周干旱处理后再度为植物给水。所测试的植物的总数对应的存活植物的数量紧邻照片示出。图8B显示了用quinabactin处理大豆植物赋予了与用(+)-ABA处理所赋予的相似的干旱胁迫耐性。在该实施例中，使两周生植物通过断水而经受干旱胁迫，并在8天干旱处理后拍照。对于所有干旱胁迫处理，化合物(对于拟南芥以25μM进行测试，对于大豆以50μM进行测试)均以含有0.05％吐温-20的溶液进行施用，并在旱情期间每3天作为喷雾而施用。所有实验的值均为平均值±SEM(n＝6，每一个实验使用3株植物)。

该实施例显示了LC66C6在野生型和aba2突变拟南芥植物中以及在野生型大豆植物中诱导了与(+)-ABA所赋予的相似的干旱胁迫耐性。

实施例4

该实施例证实了LC66C6以与(+)-ABA所诱导的相似方式诱导了ABA反应性基因。

微阵列分析

使用RNAeasy植物小量提取试剂盒(Qiagen,USA)根据制造商的说明分离了总RNA。由Riverside的IIGB Core Instrumentation Facility of University of California使用Affymetrix方案进行了cDNA合成、标记以及与拟南芥ATH1芯片(Affymetrix,USA)的杂交。对于DMSO对照、ABA、pyrabactin和quinabactin处理，进行生物学三平行样杂交；将化合物以25μM的最终浓度施加，在暴露于化合物或对照6小时后，从冷冻组织制备了RNA。计算了探针组的表达信号，并通过MAS5统计算法(Affymetrix,USA)归一化。针对在所有实验中存在的信号进行了阵列数据的实验过滤。将每种化学处理中的平均转录物水平与对照实验中的那些水平进行了比较，并用于计算倍数变化值。将Log₂变换倍数变化值用于计算实验条件之间的皮尔逊相关系数(Person Correlation Coefficient)。

定量RT-PCR分析

使用植物RNA纯化试剂(Invitrogen,USA)根据制造商的说明分离了总RNA。使用QantiTec逆转录试剂盒(Qiagen,USA)由1μg总RNA合成了cDNA。通过iQ5实时PCR检测系统(Bio-Rad,Hercules,CA)进行了使用SYBR Green/Fluorescein qPCR主混合物(Fermentas)的实时PCR。使用相对标准曲线方法确定了目标mRNA的相对量，并通过内控mRNA的相对量归一化。进行了生物学三平行实验。用于这些实验的引物序列在表1中示出。

表1.用于定量RT-PCR的引物组

ABA反应性报告基因测定

现有的ABA反应性启动子-GUS融合体以我们的经验不是理想的，原因是高背景水平或响应于ABA相对低的诱导水平。MAPKKK18是具有低背景水平的高ABA诱导型基因(Matsui A等人,Plant Cell Physiol49(8):1135-1149(2008))；MAPKKK18还强烈地受到干旱和盐胁迫的诱导。因此，我们表征了激动剂对MAPKKK18启动子::GUS报告转基因植物的影响。在具有以下组成的反应缓冲液中进行了GUS染色：50mM磷酸钠缓冲液pH7.0、0.05％吐温-20、2.5mM亚铁氰化钾、2.5mM铁氰化钾、1mM X-gluc。将反应缓冲液真空渗透进供试样品持续10分钟，共两次，然后在37℃下孵育5h。通过将样品用70％的乙醇洗涤而终止反应，叶绿素色素通过在65℃下温育而白化。

图9显示了响应于pyrabactin、LC66C6和(+)-ABA而诱导的基因表达变化。如图9A所示，LC66C6在野生型植物中以剂量依赖性方式诱导了RD29B和MAPKKK18mRNA的表达，而那些诱导水平在abi1-1和PYR/PYL四倍突变体植物中均受损。通过LC66C6对基因表达的诱导与通过(+)-ABA观察到的相似。与(+)-ABA和LC66C6形成对比，pyrabactin未在野生型植物中诱导基因表达，但是当将更高的浓度用于处理时其在幼苗中确实诱导了适度的ABA相关的基因表达(Park等人,2009)。

图9B显示了ABA和LC66C或pyrabactin与对照处理相比对野生型幼苗的影响的全基因组比较，如通过标记的RNA与ATH1微阵列的杂交所测量。如图9B所示，LC66C6在微阵列实验中诱导了与ABA所诱导的那些相似的一组基因。相比之下，pyrabactin未诱导与ABA相似的表达模式。

图9C和9D显示了LC66C6在与(+)-ABA相同的组织中诱导了报告基因的表达。报告基因的表达在叶片和根部的保卫细胞和维管组织中以及在吸胀种子的胚根尖端中观察到。

图10显示了在PYR/PYL单突变体中的ABA反应性基因表达。如图10所示，ABA反应性MAPKKK18、RD29A和RD29B mRNA在Col和Ler生态型以及pyr1、pyl1、ply2、pyl3和pyl4单突变体基因型中受LC66C6和(+)-ABA的诱导。相比之下，pyrabactin未在任何单突变体或野生型生态型中明显诱导任何基因的表达。

图11显示了在野生型植物、abi1-1和PYR/PYL四倍突变体中的ABA反应性基因表达。如图11所示，LC66C6和(+)-ABA均在Col野生型植物中以剂量依赖性方式诱导了ABF3、GBF3、NCED3和RD29A的表达，而在abi1-1和PYR/PYL四倍突变体植物中诱导水平受损。与上述结果一致，pyrabactin未诱导在野生型植物中所分析的任何基因的明显表达。

实施例5

该实施例证实了ABA分解代谢的关键酶不影响LC66C6所诱导的反应。

如图12所示，ABA对植物生长和发芽的抑制在针对cyp707a(ABA分解代谢的一种关键酶)双倍突变体的植物中得以增强，但在过表达CYP707A(CYP707AOX，参见图12A-D)的植物中降低。相比之下，LC66C6对植物生长和发芽的影响在针对cyp707a野生型植物的双倍突变体的植物中以及在过表达CYP707AOX(参见图12A-D)的植物中无明显不同。

该实施例显示了在ABA分解中所涉及的酶不影响LC66C6所调控的表型。

实施例6

该实施例显示了LC66C6对不同的植物物种(包括单子叶植物和双子叶植物)具有生物活性。

图13A显示了LC66C6抑制西兰花、萝卜、苜蓿、大豆、大麦、小麦、高粱和玉蜀黍种子的发芽。LC66C6的发芽抑制水平高于pyrabactin。如图13B所示，LC66C6在上述物种的离体叶片中在2小时的时间内减少了蒸腾失水。另外，LC66C6强烈诱导了大豆中ABA反应性基因GmNAC4和GmbZIP1的表达(图13C)，温和诱导了大麦中ABA反应性基因HVA1和HvDRF1的表达(图13D)，并且弱诱导了玉蜀黍中ABA反应性基因ZmRab17和ZmLEA的表达(图13E)。

该实施例证实了LC66C6在一组不同的农业重要物种中抑制了发芽并减少蒸腾失水，从而表明LC66C6可用于在多种物种中减轻干旱胁迫。

实施例7

该实施例显示了ABA和本文所述的激动剂的化学结构，以及激动剂的体外或体内作用。

图14和18显示了ABA和所测试的激动剂的化学结构。图15A显示了使用PYR/PYL受体PYR1、PYL1、PYL2、PYL3和PYL4的酵母双杂交测定以测试图14中所示的每一种激动剂的反应的结果。图15B显示了测试图14中的激动剂对野生型种子的发芽的影响的结果，并证实了LC66C6在抑制野生型种子发芽方面是继(+)- ABA之后最有效的激动剂之一。图15C显示了在ABA诱导型拟南芥基因MAPKKK18控制下表达葡糖醛酸酶的转基因株系中使用葡糖醛酸酶测定法测得的化合物对ABA报告基因株系的影响。

该实施例证实了LC66C6为在体外和体内测试的最有效的激动剂之一。

实施例8

该实施例显示了LC66C6可增加ABA缺陷型突变植物的大小。

在该实施例中，向14天生野生型和aba2突变植物喷洒含有25μM激动剂的溶液，每天两次，持续两周。从4周生植物获得图像和鲜重。如图16所示，向aba2突变植物施加LC66C6与仅用载体DMSO处理的对照植物相比明显增加了突变植物的大小。

该实施例证实了LC66C6可以与(+)-ABA相似的方式补充在aba2突变中所观察到的生长表型。

实施例9

该实施例显示了LC66C6可弱抑制苔藓中的原丝体生长，但对单细胞绿藻衣藻属的生长无影响。

如图17A和17B所示，LC66C6对苔藓小立碗藓原丝体的生长显示出弱的但明显的抑制。pyrabactin使原丝体白化，从而表明其可能对该物种具有毒性。

图17C显示了LC66C6可诱导苔藓中ABA反应性基因的表达。然而，这些诱导水平弱于ABA的诱导水平。

如图17D所示，在具有和不具有盐和渗透胁迫的情况下，(+)-ABA和LC66C6均对衣藻属的生长无影响。同样，pyrabactin使衣藻属白化，从而表明其也对该物种也具有毒性。

该实施例显示了LC66C6可在苔藓小立碗藓中弱抑制原丝体生长并且弱诱导ABA反应性基因表达，但不影响单细胞藻类衣藻属的生长。

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于示例性目的，并且本领域的技术人员将想到对其各种修改或更改，而这些修改或更改将落在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。本文列出的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请均为了所有目的以引用方式整体并入本文。

Claims (38)

1.一种农业制剂，包含式I-A的化合物或其盐：

其中

R¹为C_1-6烷基，

R²选自苯基和噻吩，每一个任选地被1-4个R^2a基团取代，

每一个R^2a独立地选自卤素和C_1-6烷基，

L为选自键和C_1-6亚烷基的连接基。

2.根据权利要求1所述的制剂，其中R²选自苯基和噻吩，每一个任选地被1个R^2a基团取代。

3.根据权利要求2所述的制剂，其中

R¹选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基和己基；

每一个R^2a独立地选自氟、氯、甲基和乙基；并且

L选自键和亚甲基。

4.根据权利要求3所述的制剂，其中所述化合物具有下式：

5.根据权利要求3所述的制剂，其中所述化合物具有下式：

6.农业制剂，其包含选自以下的化合物：

7.根据权利要求1所述的制剂，其中所述化合物为

8.根据权利要求1所述的制剂，还包含杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、植物激活剂、增效剂、除草剂安全剂、植物生长调节剂、驱虫剂、灭螺剂或肥料中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的制剂，其中所述杀虫剂为杀线虫剂、杀昆虫剂或杀螨剂。

10.根据权利要求1所述的制剂，还包含表面活性剂。

11.根据权利要求1所述的制剂，还包含载体。

12.一种增强植物中的耐旱性的方法，所述方法包括将植物与足量的根据权利要求1至11任一项所述的制剂接触，以与不使所述植物与所述制剂接触相比增强所述植物中的耐旱性。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述植物为双子叶植物。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述接触步骤包括将所述制剂通过飞机或灌溉递送给所述植物。

16.一种抑制植物中的种子发芽的方法，所述方法包括将种子与足量的根据权利要求1至11任一项所述的制剂接触以抑制发芽。

17.一种产生经处理的植物的方法，其包括将植物与权利要求1至11任一项所述的制剂接触。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述植物为种子。

19.一种激活PYR/PYL蛋白的方法，所述方法包括将所述PYR/PYL蛋白与权利要求1至11任一项所述的农业制剂接触。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述PYR/PYL蛋白由细胞表达。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞为植物细胞。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述PYR/PYL蛋白为内源蛋白。

23.根据权利要求20所述的方法，其中所述PYR/PYL蛋白为异源蛋白。

24.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞还表达2型蛋白磷酸酶(PP2C)。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述2型蛋白磷酸酶为HAB1(与ABI1同源)、ABI1(脱落酸不敏感突变体1)或ABI2(脱落酸不敏感突变体2)。

26.用农业制剂处理植物的方法，其包括用所述农业制剂与植物接触；

其中所述农业制剂包含式I-A的化合物或其盐：

其中

R¹为C_1-6烷基；

R²选自苯基和噻吩，每一个任选地被1-4个R^2a基团取代，

每一个R^2a独立地选自卤素和C_1-6烷基，

L为选自键和C_1-6亚烷基的连接基。

27.根据权利要求26所述的方法，其中R²选自苯基和噻吩，每一个任选地被1个R^2a基团取代。

28.根据权利要求27所述的方法，其中

R¹选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基和己基；

每一个R^2a独立地选自氟、氯、甲基和乙基；并且

L选自键和亚甲基。

29.根据权利要求26所述的方法，其中所述农业制剂还包含杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、植物激活剂、增效剂、除草剂安全剂、植物生长调节剂、驱虫剂、灭螺剂或肥料中的至少一种。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述杀虫剂为杀线虫剂、杀昆虫剂或杀螨剂。

31.根据权利要求26所述的方法，其中所述农业制剂还包含表面活性剂。

32.根据权利要求26所述的方法，其中所述农业制剂还包含载体。

33.一种农业制剂，其包含式I-A的化合物或其盐以及载体：

其中

R¹为C_1-6烷基；

R²选自苯基和噻吩，每一个任选地被1-4个R^2a基团取代，

每一个R^2a独立地选自卤素和C_1-6烷基，

L为选自键和C_1-6亚烷基的连接基。

34.根据权利要求33所述的制剂，其中R²选自苯基和噻吩，每一个任选地被1个R^2a基团取代。

35.根据权利要求34所述的制剂，其中

R¹选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基和己基；

每一个R^2a独立地选自氟、氯、甲基和乙基；并且

L选自键和亚甲基。

36.根据权利要求33所述的制剂，还包含杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、植物激活剂、增效剂、除草剂安全剂、植物生长调节剂、驱虫剂、灭螺剂或肥料中的至少一种。

37.根据权利要求36所述的制剂，其中所述杀虫剂为杀线虫剂、杀昆虫剂或杀螨剂。

38.根据权利要求33所述的制剂，还包含表面活性剂。