JP2002512801A - 免疫原性特性および改変された生物学的タンパク質機能を有するポリペプチド - Google Patents
免疫原性特性および改変された生物学的タンパク質機能を有するポリペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、免疫原性特性および改変された生物学的タンパク質機能を有するポリペプチドに関する。上記ポリペプチドは、タンパク質に対して異なる順序で約１０〜４０個のアミノ酸のタンパク質セグメントを有する。本発明はまた、このタイプのポリペプチドをコードするＤＮＡおよびこのタイプのポリペプチドを産生する方法に関し、能動免疫のための上記ＤＮＡおよび上記ポリペプチドの使用に関し、ポリペプチドを標的化する抗体に関する。
Description
【０００１】 本発明は、免疫原性特性および改変された生物学的タンパク質機能を有するポ
リペプチド、かかるポリペプチドをコードするＤＮＡならびにかかるポリペプチ
ドを調製する方法に関する。本発明はまた、能動免疫化のための上記ＤＮＡおよ
び上記ポリペプチドの使用に関し、そして上記ポリペプチドに対する抗体に関す
る。
リペプチド、かかるポリペプチドをコードするＤＮＡならびにかかるポリペプチ
ドを調製する方法に関する。本発明はまた、能動免疫化のための上記ＤＮＡおよ
び上記ポリペプチドの使用に関し、そして上記ポリペプチドに対する抗体に関す
る。
【０００２】 動物およびヒトそれぞれを能動免疫化するために、タンパク質は、抗体および
細胞傷害性Ｔ細胞それぞれに対する免疫原として頻繁に投与され、次いで誘導さ
れる。最近の出願人の実験は、かかるタンパク質が、非常に長い期間動物および
ヒトの身体に滞在し得るという事実に関わる。このことは、タンパク質がそれを
コードする発現プラスミドの形態で投与される場合に特に適用される。従って、
動物およびヒトそれぞれは、上記タンパク質の生物学的機能（例えば、毒性また
はトランスフォーミング性であり得る）に長期間曝される。これは、動物および
ヒトそれぞれに対してかなりのストレスを生じ、結果は全く予見され得ない。
細胞傷害性Ｔ細胞それぞれに対する免疫原として頻繁に投与され、次いで誘導さ
れる。最近の出願人の実験は、かかるタンパク質が、非常に長い期間動物および
ヒトの身体に滞在し得るという事実に関わる。このことは、タンパク質がそれを
コードする発現プラスミドの形態で投与される場合に特に適用される。従って、
動物およびヒトそれぞれは、上記タンパク質の生物学的機能（例えば、毒性また
はトランスフォーミング性であり得る）に長期間曝される。これは、動物および
ヒトそれぞれに対してかなりのストレスを生じ、結果は全く予見され得ない。
【０００３】 それゆえ、本発明の目的は、能動免疫化が、上記欠点を伴うことなく、実行さ
れ得る産物を提供することである。
れ得る産物を提供することである。
【０００４】 本発明に従って、このことは、請求の範囲において規定される主題によって達
成される。
成される。
【０００５】 それゆえ、本発明の主題は、免疫原性特性および改変された生物学的タンパク
質機能を有するポリペプチドならびにかかるポリペプチドをコードするＤＮＡに
関する。これらの産物は、動物およびヒトそれぞれが生物学的タンパク質機能に
少なくともその全体では曝されることなく、能動免疫化を許容する。
質機能を有するポリペプチドならびにかかるポリペプチドをコードするＤＮＡに
関する。これらの産物は、動物およびヒトそれぞれが生物学的タンパク質機能に
少なくともその全体では曝されることなく、能動免疫化を許容する。
【０００６】 本発明は、タンパク質に対して改変された順序で約１０〜４０個のアミノ酸の
タンパク質セグメントを有するポリペプチドが、タンパク質に匹敵し得る免疫原
性を有するが、タンパク質の生物学的機能は、改変され、そして完全に欠失され
得るという出願人の見識に基づく。さらに、出願人は、個々のセグメントの間の
トランジションとしてタンパク質中に存在する約１０〜２０個のアミノ酸の部分
を含ませることが、かかるポリペプチドの免疫原性に好ましいことを見出した。
Ｆｉｇｕｒｅ１は、Ｅ７タンパク質に対して改変された順序でＨＰＶ１６−Ｅ７
タンパク質のセグメントおよび個々のセグメント間でトランジションとしてＥ７
タンパク質中に存在するさらなる部分を含有するポリペプチドを示す。
タンパク質セグメントを有するポリペプチドが、タンパク質に匹敵し得る免疫原
性を有するが、タンパク質の生物学的機能は、改変され、そして完全に欠失され
得るという出願人の見識に基づく。さらに、出願人は、個々のセグメントの間の
トランジションとしてタンパク質中に存在する約１０〜２０個のアミノ酸の部分
を含ませることが、かかるポリペプチドの免疫原性に好ましいことを見出した。
Ｆｉｇｕｒｅ１は、Ｅ７タンパク質に対して改変された順序でＨＰＶ１６−Ｅ７
タンパク質のセグメントおよび個々のセグメント間でトランジションとしてＥ７
タンパク質中に存在するさらなる部分を含有するポリペプチドを示す。
【０００７】 本発明に従って、出願人の見識は、免疫原性特性を有し、かつ改変された生物
学的タンパク質機能を有するポリペプチドを提供するために使用される。上記ポ
リペプチドは、上記タンパク質に対して改変された順序で約１０〜４０個のアミ
ノ酸のタンパク質セグメントを有する。
学的タンパク質機能を有するポリペプチドを提供するために使用される。上記ポ
リペプチドは、上記タンパク質に対して改変された順序で約１０〜４０個のアミ
ノ酸のタンパク質セグメントを有する。
【０００８】 表現「タンパク質」は、免疫原性特性（例えば、そのタンパク質に対する抗体
および細胞傷害性Ｔ細胞それぞれを誘導する能力）および生物学的機能を有する
任意のタンパク質を含む。かかるタンパク質の例は、毒性タンパク質またはトラ
ンスフォーミングタンパク質である。前者は、持続性の感染において発現される
細菌毒素またはウイルスタンパク質であり得る。かかるウイルスタンパク質の例
は、ＨＩＶ−Ｔａｔである。トランスフォーミングタンパク質は、細胞性起源（
例えば、黒色腫特異的抗原（ＭＡＧＥ））であり得る。さらに、それらは、ウイ
ルス（例えば、ＨＰＶ１６または１８のようなヒトに対して病原性であるパピロ
ーマウイルス（ＨＰＶ））に由来し得る。特に、タンパク質Ｅ６およびＥ７は、
かかるウイルスのタンパク質として言及されなければならない。
および細胞傷害性Ｔ細胞それぞれを誘導する能力）および生物学的機能を有する
任意のタンパク質を含む。かかるタンパク質の例は、毒性タンパク質またはトラ
ンスフォーミングタンパク質である。前者は、持続性の感染において発現される
細菌毒素またはウイルスタンパク質であり得る。かかるウイルスタンパク質の例
は、ＨＩＶ−Ｔａｔである。トランスフォーミングタンパク質は、細胞性起源（
例えば、黒色腫特異的抗原（ＭＡＧＥ））であり得る。さらに、それらは、ウイ
ルス（例えば、ＨＰＶ１６または１８のようなヒトに対して病原性であるパピロ
ーマウイルス（ＨＰＶ））に由来し得る。特に、タンパク質Ｅ６およびＥ７は、
かかるウイルスのタンパク質として言及されなければならない。
【０００９】 表現「免疫原性特性および改変された生物学的タンパク質機能を有するポリペ
プチド」は、タンパク質の１つから全ての免疫原性特性ポリペプチドを有し得る
任意のポリペプチドを含み、１つから全ての生物学的タンパク質機能が、改変さ
れ、特に除去され得る。かかるポリペプチドは、約１０〜４０個のアミノ酸、特
に２０〜３０個のアミノ酸のタンパク質セグメントを、タンパク質に対して改変
された順序で含有する。１つまたは数個のアミノ酸が上記タンパク質中の対応す
るセグメントとは異なることが、セグメントにとって有利であり得る。これらは
、例えば、ポリペプチド調製および／またはセグメントの免疫原性に有利である
アミノ酸であり得る。個々のセグメント間のトランジションとしてタンパク質中
に存在する、約１０〜２０個のアミノ酸、特に１８〜２０個のアミノ酸の部分を
さらに含有することもまたポリペプチドにとって好ましい。かかる部分は、ポリ
ペプチドの任意の場所、特にＮ末端および／またはＣ末端に別々にもしくは全体
として存在し得る。
プチド」は、タンパク質の１つから全ての免疫原性特性ポリペプチドを有し得る
任意のポリペプチドを含み、１つから全ての生物学的タンパク質機能が、改変さ
れ、特に除去され得る。かかるポリペプチドは、約１０〜４０個のアミノ酸、特
に２０〜３０個のアミノ酸のタンパク質セグメントを、タンパク質に対して改変
された順序で含有する。１つまたは数個のアミノ酸が上記タンパク質中の対応す
るセグメントとは異なることが、セグメントにとって有利であり得る。これらは
、例えば、ポリペプチド調製および／またはセグメントの免疫原性に有利である
アミノ酸であり得る。個々のセグメント間のトランジションとしてタンパク質中
に存在する、約１０〜２０個のアミノ酸、特に１８〜２０個のアミノ酸の部分を
さらに含有することもまたポリペプチドにとって好ましい。かかる部分は、ポリ
ペプチドの任意の場所、特にＮ末端および／またはＣ末端に別々にもしくは全体
として存在し得る。
【００１０】 本発明の好ましいポリペプチドは、ｆｉｇｕｒｅ１に示されるアミノ酸配列ま
たは１つもしくは数個のアミノ酸がそれとは異なるアミノ酸配列を含む。かかる
ポリペプチドは、タンパク質に対して改変された順序でＨＰＶ１６のＥ７タンパ
ク質のセグメントおよび個々のセグメント間のトランジションとしてそこに存在
するＥ７タンパク質の一部を含む。
たは１つもしくは数個のアミノ酸がそれとは異なるアミノ酸配列を含む。かかる
ポリペプチドは、タンパク質に対して改変された順序でＨＰＶ１６のＥ７タンパ
ク質のセグメントおよび個々のセグメント間のトランジションとしてそこに存在
するＥ７タンパク質の一部を含む。
【００１１】 表現「１つまたは数個のアミノ酸がそれとは異なるアミノ酸配列」とは、この
アミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列が、ｆｉｇｕｒｅ１のＤＮＡとハイブリダ
イズすることをいう。このＤＮＡ配列は、１つまたは数個の塩基対の付加、置換
、欠失および／または逆位により、ｆｉｇｕｒｅ１のＤＮＡとは異なり得る。表
現「ハイブリダイゼーション」は、通常の条件下、特にＤＮＡ配列の融点よりも
２０℃低い温度で起こることをいう。
アミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列が、ｆｉｇｕｒｅ１のＤＮＡとハイブリダ
イズすることをいう。このＤＮＡ配列は、１つまたは数個の塩基対の付加、置換
、欠失および／または逆位により、ｆｉｇｕｒｅ１のＤＮＡとは異なり得る。表
現「ハイブリダイゼーション」は、通常の条件下、特にＤＮＡ配列の融点よりも
２０℃低い温度で起こることをいう。
【００１２】 本発明のさらなる主題は、上記ポリペプチドをコードする核酸に関する。それ
は、ＲＮＡでもよいし、ＤＮＡでもよい。 （ａ）ｆｉｇｕｒｅ１のＤＮＡまたは１つもしくは数個の塩基対がそれとは異な
るＤＮＡ、または （ｂ）縮合コードにより、（ａ）のＤＮＡに関連するＤＮＡ、 を含有してなるＤＮＡが好ましい。
は、ＲＮＡでもよいし、ＤＮＡでもよい。 （ａ）ｆｉｇｕｒｅ１のＤＮＡまたは１つもしくは数個の塩基対がそれとは異な
るＤＮＡ、または （ｂ）縮合コードにより、（ａ）のＤＮＡに関連するＤＮＡ、 を含有してなるＤＮＡが好ましい。
【００１３】 表現「１つまたは数個の塩基対が異なるＤＮＡ」とは、このＤＮＡが、ｆｉｇ
ｕｒｅ１のＤＮＡとハイブリダイズすることをいう。前者のＤＮＡは、１つまた
は数個の塩基対の付加、置換、欠失および／または逆位によりｆｉｇｕｒｅ１の
ＤＮＡとは異なり得る。表現「ハイブリダイゼーション」については、上記説明
を参照されたい。
ｕｒｅ１のＤＮＡとハイブリダイズすることをいう。前者のＤＮＡは、１つまた
は数個の塩基対の付加、置換、欠失および／または逆位によりｆｉｇｕｒｅ１の
ＤＮＡとは異なり得る。表現「ハイブリダイゼーション」については、上記説明
を参照されたい。
【００１４】 本発明によるＤＮＡは、それ自体としてまたはベクター、特に発現ベクター中
に存在し得る。当業者はその例に精通している。大腸菌に関する発現ベクターの
場合には、それらは、例えば、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、
ｐＥＴ３ｂ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびｐＱＥ−８である。酵母における発現
のために、例えば、ｐＹ１００およびＹｃｐａｄ１が言及されなければならず、
一方、例えば、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４は、動物細
胞における発現のために指示されなければならない。バキュロウイルス発現ベク
ターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａは、昆虫細胞における発現に特に適切である。
に存在し得る。当業者はその例に精通している。大腸菌に関する発現ベクターの
場合には、それらは、例えば、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、
ｐＥＴ３ｂ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびｐＱＥ−８である。酵母における発現
のために、例えば、ｐＹ１００およびＹｃｐａｄ１が言及されなければならず、
一方、例えば、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４は、動物細
胞における発現のために指示されなければならない。バキュロウイルス発現ベク
ターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａは、昆虫細胞における発現に特に適切である。
【００１５】 当業者は、本発明によるＤＮＡ（発現ベクター中に存在する）を発現するのに
適切な細胞に精通している。かかる細胞の例としては、大腸菌株ＨＢ１０１、Ｄ
Ｈ１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１およびＳＧ１３００９が
挙げられ、残りの好ましいものとしては、酵母株サッカロマイセスセレビジア（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および動物細胞Ｌ、３Ｔ
３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａならびに昆虫細胞ｓｆ
９またはＨｉ５である。
適切な細胞に精通している。かかる細胞の例としては、大腸菌株ＨＢ１０１、Ｄ
Ｈ１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１およびＳＧ１３００９が
挙げられ、残りの好ましいものとしては、酵母株サッカロマイセスセレビジア（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および動物細胞Ｌ、３Ｔ
３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａならびに昆虫細胞ｓｆ
９またはＨｉ５である。
【００１６】 当業者は、本発明によるＤＮＡが、発現ベクター中に挿入されなければならな
いことを知っている。当業者はまた、このＤＮＡが、別のポリペプチドをコード
するＤＮＡと組み合わせて挿入され、その結果、本発明によるＤＮＡが、融合ポ
リペプチドの形態で発現され得ることに精通している。
いことを知っている。当業者はまた、このＤＮＡが、別のポリペプチドをコード
するＤＮＡと組み合わせて挿入され、その結果、本発明によるＤＮＡが、融合ポ
リペプチドの形態で発現され得ることに精通している。
【００１７】 さらに、当業者は、形質転換細胞およびトランスフェクト細胞それぞれを培養
する条件を知っている。当業者はまた、本発明によるＤＮＡにより発現されるポ
リペプチドを単離および精製する方法に精通している。
する条件を知っている。当業者はまた、本発明によるＤＮＡにより発現されるポ
リペプチドを単離および精製する方法に精通している。
【００１８】 本発明のさらなる主題は、上記ポリペプチドおよび融合ポリペプチドそれぞれ
に対する抗体に関する。かかる抗体は、一般的な方法によって調製され得る。抗
体は、ポリクローナルおよびモノクローナルそれぞれであり得る。その調製のた
めに、動物−特に、ポリクローナル抗体についてはウサギまたはニワトリを、そ
してモノクローナル抗体についてはマウス−を、上記（融合）タンパク質または
そのフラグメントで免疫化することが有利である。動物のさらなる「追加免疫」
は、同一（融合）タンパク質またはそのフラグメントを用いて達成され得る。次
いで、ポリクローナル抗体は、動物血清および卵黄それぞれから入手され得る。
モノクローナル抗体の調製のために、動物脾臓細胞は、骨髄腫細胞と融合される
。
に対する抗体に関する。かかる抗体は、一般的な方法によって調製され得る。抗
体は、ポリクローナルおよびモノクローナルそれぞれであり得る。その調製のた
めに、動物−特に、ポリクローナル抗体についてはウサギまたはニワトリを、そ
してモノクローナル抗体についてはマウス−を、上記（融合）タンパク質または
そのフラグメントで免疫化することが有利である。動物のさらなる「追加免疫」
は、同一（融合）タンパク質またはそのフラグメントを用いて達成され得る。次
いで、ポリクローナル抗体は、動物血清および卵黄それぞれから入手され得る。
モノクローナル抗体の調製のために、動物脾臓細胞は、骨髄腫細胞と融合される
。
【００１９】 さらに、本発明によるＤＮＡは、動物およびヒトそれぞれに直接的に発現され
得る。この目的のために、本発明によるＤＮＡは、プラスミドおよび／またはウ
イルスベクターに由来する発現ベクター中に存在し得る。ウイルスベクターの例
としては、ＡＡＶ、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスベクターが挙げら
れる。当業者は、本発明によるＤＮＡを動物およびヒトそれぞれに導入し、発現
させる方法を知っている。
得る。この目的のために、本発明によるＤＮＡは、プラスミドおよび／またはウ
イルスベクターに由来する発現ベクター中に存在し得る。ウイルスベクターの例
としては、ＡＡＶ、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスベクターが挙げら
れる。当業者は、本発明によるＤＮＡを動物およびヒトそれぞれに導入し、発現
させる方法を知っている。
【００２０】 本発明のさらなる主題は、 （ａ）本発明によるポリペプチド、および／または （ｂ）本発明によるＤＮＡ、ならびに （ｃ）一般的な補助薬剤、例えば、緩衝液、溶媒、およびキャリア、 を含むワクチン接種薬剤に関する。
【００２１】 かかるワクチン接種薬剤は、例えば、ＨＰＶに対する能動免疫化に適切である
。ワクチン接種薬剤が、（ａ）および／または（ｂ）の代わりに本発明による抗
体（ｃ）を含む場合、ワクチン接種薬剤は、例えば、ＨＰＶに対する受動免疫化
に適切である。
。ワクチン接種薬剤が、（ａ）および／または（ｂ）の代わりに本発明による抗
体（ｃ）を含む場合、ワクチン接種薬剤は、例えば、ＨＰＶに対する受動免疫化
に適切である。
【００２２】 本発明のさらなる主題は、 （ａ）本発明によるポリペプチド、 （ｂ）本発明によるＤＮＡ、および／または （ｃ）本発明による抗体、ならびに （ｄ）一般的な補助薬剤、例えば、緩衝液、溶媒、キャリアおよび対照、 を含有してなるキットに関する。
【００２３】 ワクチン接種薬剤およびキットそれぞれの個々の成分の１つまたはいくつかの
代表は、各々の場合に示され得る。
代表は、各々の場合に示され得る。
【００２４】 本発明は、免疫原性特性および改変された、特に除去された、タンパク質の生
物学的機能を有するポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、かかるポリペ
プチドをコードするＤＮＡを提供する。動物およびヒトそれぞれは、これらの産
物によって能動免疫化され得る。詳細には、上記タンパク質に対する抗体および
上記の全ての細胞傷害性Ｔ細胞の誘導の高い効率は、ＤＮＡによって達成され得
る。上記産物はまた、免疫化された動物およびヒトそれぞれが従来の能動免疫化
の場合に生じるストレスに曝されない点で区別される。本発明による抗体はまた
、能動免疫化およびその課程が観察され得る産物を提供する。同時に、抗体はま
た、受動免疫化のために使用され得る産物を示す。従って、本発明は、疾患の予
防および治療において、新式の方法の開発に大きな貢献を示す。
物学的機能を有するポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、かかるポリペ
プチドをコードするＤＮＡを提供する。動物およびヒトそれぞれは、これらの産
物によって能動免疫化され得る。詳細には、上記タンパク質に対する抗体および
上記の全ての細胞傷害性Ｔ細胞の誘導の高い効率は、ＤＮＡによって達成され得
る。上記産物はまた、免疫化された動物およびヒトそれぞれが従来の能動免疫化
の場合に生じるストレスに曝されない点で区別される。本発明による抗体はまた
、能動免疫化およびその課程が観察され得る産物を提供する。同時に、抗体はま
た、受動免疫化のために使用され得る産物を示す。従って、本発明は、疾患の予
防および治療において、新式の方法の開発に大きな貢献を示す。
【００２５】 本発明は、下記の実施例によって例示される。
【００２６】 実施例１：本発明によるＤＮＡの調製 ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質（９８アミノ酸）をコードするＤＮＡは、ｆｉｇ
ｕｒｅ２に示される２９７塩基対＋停止コドンＴＡＡを含む。このＤＮＡを、４
つの部分（ａ−ｄ）：１〜３０（ａ）、３１〜１２０（ｂ）、１２１〜２１０（
ｃ）および２１１〜２９４（ｄ；停止コドンなし）に分けた。さらに、トランジ
ションａ／ｂ（１０〜６０）、ｂ／ｃ（１００〜１４４）およびｃ／ｄ（１９０
〜２３１；＋停止コドン）を合成した。
ｕｒｅ２に示される２９７塩基対＋停止コドンＴＡＡを含む。このＤＮＡを、４
つの部分（ａ−ｄ）：１〜３０（ａ）、３１〜１２０（ｂ）、１２１〜２１０（
ｃ）および２１１〜２９４（ｄ；停止コドンなし）に分けた。さらに、トランジ
ションａ／ｂ（１０〜６０）、ｂ／ｃ（１００〜１４４）およびｃ／ｄ（１９０
〜２３１；＋停止コドン）を合成した。
【００２７】 １．フラグメントａおよびｄを、ＰＣＲによって連結した；ａの５’にＨｉｎ
ｄＩＩＩ切断部位を挿入し、ｄの３’にＥｃｏＲＩ切断部位を導入した（より良
好な切断能力のために各々６ｂｐのスペーサーとともに）。詳細には、以下の工
程を行った：
ｄＩＩＩ切断部位を挿入し、ｄの３’にＥｃｏＲＩ切断部位を導入した（より良
好な切断能力のために各々６ｂｐのスペーサーとともに）。詳細には、以下の工
程を行った：
【００２８】 以下の配列を、プライマーＩＩおよびＩＩＩによりｆｉｇｕｒｅ２のＤＮＡか
ら作成した： （ＩＩ／ＩＩＩ）：５’〜２１−＞３０／２１１−＞２９４／ＥｃｏＲＩ−スペ
ーサー−３’（１０６ｂｐ）。 このフラグメントを、ゲル電気泳動の後に単離し、プライマーＩおよびＩＩＩに
よって伸長し、その結果、配列（Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ） ５’−スペーサー−ＨｉｎｄＩＩＩ／１−＞３０／２１１−＞２９４／ＥｃｏＲ
Ｉ−スペーサー−３’（１３８ｂｐ）を得た。
ら作成した： （ＩＩ／ＩＩＩ）：５’〜２１−＞３０／２１１−＞２９４／ＥｃｏＲＩ−スペ
ーサー−３’（１０６ｂｐ）。 このフラグメントを、ゲル電気泳動の後に単離し、プライマーＩおよびＩＩＩに
よって伸長し、その結果、配列（Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ） ５’−スペーサー−ＨｉｎｄＩＩＩ／１−＞３０／２１１−＞２９４／ＥｃｏＲ
Ｉ−スペーサー−３’（１３８ｂｐ）を得た。
【００２９】 プライマー：
【００３０】
【表１】
【００３１】 ２．フラグメントｃおよびｂをＰＣＲにより連結した；ｃの５’にＥｃｏＲＩ
切断部位を挿入し、ｂの３’にＢａｍＨＩ切断部位（各々６ｂｐスペーサーとと
もに）を導入した。詳細には、以下の工程を行った：
切断部位を挿入し、ｂの３’にＢａｍＨＩ切断部位（各々６ｂｐスペーサーとと
もに）を導入した。詳細には、以下の工程を行った：
【００３２】 以下の配列を、プライマーペアＩＶ−ＶおよびＶＩ−ＶＩＩＩによってｆｉｇ
ｕｒｅ２のＤＮＡから調製した： （ＩＶ／Ｖ）：５’−スペーサー−ＥｃｏＲＩ／１２１−＞２１０／３１−＞４
０−３’（１１２ｂｐ） （ＶＩ／ＶＩＩ）：５’−２０１−＞２１０／３１−＞１２０−ＢａｍＨＩ−ス
ペーサー−３’（１１２ｂｐ）。
ｕｒｅ２のＤＮＡから調製した： （ＩＶ／Ｖ）：５’−スペーサー−ＥｃｏＲＩ／１２１−＞２１０／３１−＞４
０−３’（１１２ｂｐ） （ＶＩ／ＶＩＩ）：５’−２０１−＞２１０／３１−＞１２０−ＢａｍＨＩ−ス
ペーサー−３’（１１２ｂｐ）。
【００３３】 これらのフラグメントを、ゲル電気泳動の後に単離し、プライマーＩＶおよび
ＶＩＩによって伸長させ、その結果、配列（ＩＶ／Ｖ／ＶＩ／ＶＩＩ） ５’−スペーサー−ＥｃｏＲＩ／１２１−＞２１０／３１−＞１２０−ＢａｍＨ
Ｉ−スペーサー−３’（２０４ｂｐ）を得た。
ＶＩＩによって伸長させ、その結果、配列（ＩＶ／Ｖ／ＶＩ／ＶＩＩ） ５’−スペーサー−ＥｃｏＲＩ／１２１−＞２１０／３１−＞１２０−ＢａｍＨ
Ｉ−スペーサー−３’（２０４ｂｐ）を得た。
【００３４】 プライマー：
【００３５】
【表２】
【００３６】 ３．フラグメントａｄおよびｃｂを、ＥｃｏＲＩにより切断し、連結した。詳
細には以下の工程を行った：
細には以下の工程を行った：
【００３７】 項目２．および３．で入手した配列（Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ）および（ＩＶ／Ｖ／
ＶＩ／ＶＩＩ）を、ゲル電気泳動によって単離し、ＥｃｏＲＩを用いて切断し、
連結した。結果として、配列 ５’−スペーサー−ＨｉｎｄＩＩＩ／１−＞３０／２１１−＞２９４／ＥｃｏＲ
Ｉ／１２１−＞２１０／３１−＞１２０−ＢａｍＨＩ−スペーサー−３’（３１
８ｂｐ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて切断した後のベクターＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローン化した。
ＶＩ／ＶＩＩ）を、ゲル電気泳動によって単離し、ＥｃｏＲＩを用いて切断し、
連結した。結果として、配列 ５’−スペーサー−ＨｉｎｄＩＩＩ／１−＞３０／２１１−＞２９４／ＥｃｏＲ
Ｉ／１２１−＞２１０／３１−＞１２０−ＢａｍＨＩ−スペーサー−３’（３１
８ｂｐ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて切断した後のベクターＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローン化した。
【００３８】 ４．トランジションａ／ｂ、ｂ／ｃおよびｃ／ｄを、ＰＣＲによって連結し、
ａ／ｂの５’にＢａｍＨＩ切断部位を導入し、ｃ／ｄの３’にＸｂａＩ切断部位
を挿入した。詳細には、以下の工程を行った：
ａ／ｂの５’にＢａｍＨＩ切断部位を導入し、ｃ／ｄの３’にＸｂａＩ切断部位
を挿入した。詳細には、以下の工程を行った：
【００３９】 以下の配列を、プライマーペアＶＩＩＩ−ＩＸ、Ｘ−ＸＩおよびＸＩＩ−ＸＩ
ＩＩによりｆｉｇｕｒｅ２のＤＮＡから作成した： （ＸＩＩＩ／ＩＸ）：５’−スペーサー−ＢａｍＨＩ−７−＞５４／９７−＞１
０５−３’（６９ｂｐ） （Ｘ／ＸＩ）：５’−４６−＞５４／９７−＞１４４／１８７−＞１９８−３’
（６９ｂｐ） （ＸＩＩ／ＸＩＩＩ）：５’−１３６−＞１４４／１８７−＞２３４−停止−Ｘ
ｂａＩ−スペーサー−３’（６９ｂｐ）
ＩＩによりｆｉｇｕｒｅ２のＤＮＡから作成した： （ＸＩＩＩ／ＩＸ）：５’−スペーサー−ＢａｍＨＩ−７−＞５４／９７−＞１
０５−３’（６９ｂｐ） （Ｘ／ＸＩ）：５’−４６−＞５４／９７−＞１４４／１８７−＞１９８−３’
（６９ｂｐ） （ＸＩＩ／ＸＩＩＩ）：５’−１３６−＞１４４／１８７−＞２３４−停止−Ｘ
ｂａＩ−スペーサー−３’（６９ｂｐ）
【００４０】 対応するフラグメントをゲル電気泳動後に単離した。
【００４１】 フラグメント（ＶＩＩＩ／ＩＸ）および（Ｘ／ＸＩ）を、プライマーＶＩＩＩ
およびＸＩによって連結し、その結果、配列５’−スペーサー−ＢａｍＨＩ−７
−＞５４／９７−＞１４４／１８７−＞１９８−３’（１１７ｂｐ）を得た。こ
のフラグメントを、プライマーＶＩＩＩおよびＸＩＩＩによってフラグメント（
ＸＩＩ／ＸＩＩＩ）と連結し、その結果、配列５’−スペーサー−ＢａｍＨＩ−
７−＞５４／９７−＞１４４／１８７ ２３４−＞−停止−ＸｂａＩ−スペーサ
ー−３’（１７１ｂｐ）を得た。 この配列を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによって切断した後にＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔベクター中にクローン化した。
およびＸＩによって連結し、その結果、配列５’−スペーサー−ＢａｍＨＩ−７
−＞５４／９７−＞１４４／１８７−＞１９８−３’（１１７ｂｐ）を得た。こ
のフラグメントを、プライマーＶＩＩＩおよびＸＩＩＩによってフラグメント（
ＸＩＩ／ＸＩＩＩ）と連結し、その結果、配列５’−スペーサー−ＢａｍＨＩ−
７−＞５４／９７−＞１４４／１８７ ２３４−＞−停止−ＸｂａＩ−スペーサ
ー−３’（１７１ｂｐ）を得た。 この配列を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによって切断した後にＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔベクター中にクローン化した。
【００４２】 プライマー：
【００４３】
【表３】
【００４４】 ５．フラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ａ−ｄ−ＥｃｏＲＩ−ｃ−ｂ−ＢａｍＨＩ
およびＢａｍＨＩ−ａ／ｂ−ｂ／ｃ−ｃ／ｄ−ＸｂａＩを、ＢａｍＨＩにより切
断し、ライゲーションによって連結した。詳細には、以下の工程を行った：
およびＢａｍＨＩ−ａ／ｂ−ｂ／ｃ−ｃ／ｄ−ＸｂａＩを、ＢａｍＨＩにより切
断し、ライゲーションによって連結した。詳細には、以下の工程を行った：
【００４５】 項目３および４に記載される配列を、ＢａｍＨＩにより切断し、連結し、その
結果以下の配列を得た： ５’−スペーサー−ＨｉｎｄＩＩＩ／１−＞３０／２１１−＞２９４／ＥｃｏＲ
Ｉ／１２１−＞２１０／３１−＞１２０−ＢａｍＨＩ−７−＞５４／９７−＞１
４４／１８７−＞２３４−停止−ＸｂａＩ−スペーサー−３’（４７７ｂｐ）（
ｆｉｇｕｒｅ１を参照のこと）
結果以下の配列を得た： ５’−スペーサー−ＨｉｎｄＩＩＩ／１−＞３０／２１１−＞２９４／ＥｃｏＲ
Ｉ／１２１−＞２１０／３１−＞１２０−ＢａｍＨＩ−７−＞５４／９７−＞１
４４／１８７−＞２３４−停止−ＸｂａＩ−スペーサー−３’（４７７ｂｐ）（
ｆｉｇｕｒｅ１を参照のこと）
【００４６】 この配列を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩによって切断し、Ｂｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔベクター中にクローン化した。
ｉｐｔベクター中にクローン化した。
【００４７】 実施例２：本発明によるタンパク質の調製および精製 実施例１の項目５において得られるＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ
によって切断される発現ベクターｐＱＥ−８（Ｑｉａｇｅｎ社）中に挿入した。
発現プラスミドｐＱＥ−８／Ｅ７を得た。かかるプラスミドは、６ヒスチジン残
基（Ｎ末端パートナー）および本発明によるｆｉｇ．１の（タンパク質）（Ｃ末
端パートナー）に由来する融合タンパク質をコードする。ｐＱＥ−８／Ｅ７を、
大腸菌ＳＧ１３００９を形質転換するために使用した（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ
．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８，（１９８１），２６５〜２７３を参照
のこと）。上記細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカ
ナマイシンを有するＬＢブロスにおいて培養し、６０μＭイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。上記細菌の溶解を、
６Ｍ塩酸グアニジンの添加によって達成した。その後、クロマトグラフィー（Ｎ
ｉ−ＮＴＡ樹脂）を、クロマトグラフィー材料の製造業者（Ｄｉａｇｅｎ社）か
らの指示に従って、８Ｍ尿素の存在下で溶解物とともに実行した。結合した融合
タンパク質を、３．５のｐＨを有する緩衝液中で溶出した。その中和後、融合タ
ンパク質を、１８％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に曝し、クーマシ
ーブルーで染色した（Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｏ．およびＫｏｒｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄ
．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４９（１９７５），７０９〜７３３を参照のこと
）。
によって切断される発現ベクターｐＱＥ−８（Ｑｉａｇｅｎ社）中に挿入した。
発現プラスミドｐＱＥ−８／Ｅ７を得た。かかるプラスミドは、６ヒスチジン残
基（Ｎ末端パートナー）および本発明によるｆｉｇ．１の（タンパク質）（Ｃ末
端パートナー）に由来する融合タンパク質をコードする。ｐＱＥ−８／Ｅ７を、
大腸菌ＳＧ１３００９を形質転換するために使用した（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ
．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８，（１９８１），２６５〜２７３を参照
のこと）。上記細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカ
ナマイシンを有するＬＢブロスにおいて培養し、６０μＭイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。上記細菌の溶解を、
６Ｍ塩酸グアニジンの添加によって達成した。その後、クロマトグラフィー（Ｎ
ｉ−ＮＴＡ樹脂）を、クロマトグラフィー材料の製造業者（Ｄｉａｇｅｎ社）か
らの指示に従って、８Ｍ尿素の存在下で溶解物とともに実行した。結合した融合
タンパク質を、３．５のｐＨを有する緩衝液中で溶出した。その中和後、融合タ
ンパク質を、１８％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に曝し、クーマシ
ーブルーで染色した（Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｏ．およびＫｏｒｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄ
．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４９（１９７５），７０９〜７３３を参照のこと
）。
【００４８】 これにより、本発明による（融合）タンパク質は、高度に純粋な形態で調製さ
れ得ることを示した。
れ得ることを示した。
【００４９】 実施例３：本発明による抗体の精製および検出 本発明による実施例２の融合タンパク質を、１８％のＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に曝した。ゲルを４Ｍ酢酸ナトリウムで染色した後、約１５ｋＤ
バンドを、ゲルから切り出し、リン酸緩衝化された一般的な塩溶液中でインキュ
ベートした。ゲルの断片を沈殿させた後、上清のタンパク質濃度を、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって測定し、続いてクーマシーブルー染色を行
った。動物を、ゲル精製した融合タンパク質で以下のように免疫化した：
ドゲル電気泳動に曝した。ゲルを４Ｍ酢酸ナトリウムで染色した後、約１５ｋＤ
バンドを、ゲルから切り出し、リン酸緩衝化された一般的な塩溶液中でインキュ
ベートした。ゲルの断片を沈殿させた後、上清のタンパク質濃度を、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって測定し、続いてクーマシーブルー染色を行
った。動物を、ゲル精製した融合タンパク質で以下のように免疫化した：
【００５０】 ウサギにおけるポリクローナル抗体に対する免疫化プロトコル ０．７ｍｌのＰＢＳ中の３５μｇのゲル精製した融合タンパク質、ならびに０
．７ｍｌの完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントそ
れぞれを免疫化ごとに使用した： ０日目：１回目の免疫化（完全フロイントアジュバント） １４日目：２回目の免疫化（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ） ２８日目：３回目の免疫化（ｉｃＦＡ） ５６日目：４回目の免疫化（ｉｃＦＡ） ８０日目：放血させ屠殺。
．７ｍｌの完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントそ
れぞれを免疫化ごとに使用した： ０日目：１回目の免疫化（完全フロイントアジュバント） １４日目：２回目の免疫化（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ） ２８日目：３回目の免疫化（ｉｃＦＡ） ５６日目：４回目の免疫化（ｉｃＦＡ） ８０日目：放血させ屠殺。
【００５１】 ウサギ血清を、イムノブロットにおいて試験した。この目的のために、本発明
による実施例１の融合タンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
曝し、そしてニトロセルロースフィルターに移した（Ｋｈｙｓｅ−Ａｎｄｅｒｓ
ｅｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．１０（１９８４）
，２０３〜２０９）。ウエスタンブロット分析を、Ｂｏｃｋ，Ｃ．−Ｔ．ら、Ｖ
ｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ８，（１９９４），２１５〜２２９に記載されるように
行った。この目的のために、ニトロセルロースフィルターを、一次抗体とともに
３７℃で１時間インキュベートした。この抗体はウサギ血清であった（ＰＢＳ中
に１：１００００）。ＰＢＳを使用する数回の洗浄工程の後に、ニトロセルロー
スフィルターを、二次抗体とともにインキュベートした。この抗体は、アルカリ
ホスファターゼを結合させたモノクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｄｉａｎ
ｏｖａ社）であった ＰＢＳ中に（１：５０００）。３７℃で３０分間のインキ
ュベーションの後に、ＰＢＳを用いて数回の洗浄工程およびそれに続いて現像液
（３６μＭの５’−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ、４０
０μＭのニトロブルーテトラゾリウム、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９
．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 ）を用いて室温でバンドが見
えるようになるまでアルカリホスファターゼ検出反応を行った。
による実施例１の融合タンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
曝し、そしてニトロセルロースフィルターに移した（Ｋｈｙｓｅ−Ａｎｄｅｒｓ
ｅｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．１０（１９８４）
，２０３〜２０９）。ウエスタンブロット分析を、Ｂｏｃｋ，Ｃ．−Ｔ．ら、Ｖ
ｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ８，（１９９４），２１５〜２２９に記載されるように
行った。この目的のために、ニトロセルロースフィルターを、一次抗体とともに
３７℃で１時間インキュベートした。この抗体はウサギ血清であった（ＰＢＳ中
に１：１００００）。ＰＢＳを使用する数回の洗浄工程の後に、ニトロセルロー
スフィルターを、二次抗体とともにインキュベートした。この抗体は、アルカリ
ホスファターゼを結合させたモノクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｄｉａｎ
ｏｖａ社）であった ＰＢＳ中に（１：５０００）。３７℃で３０分間のインキ
ュベーションの後に、ＰＢＳを用いて数回の洗浄工程およびそれに続いて現像液
（３６μＭの５’−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ、４０
０μＭのニトロブルーテトラゾリウム、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９
．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 ）を用いて室温でバンドが見
えるようになるまでアルカリホスファターゼ検出反応を行った。
【００５２】 これにより、本発明によるポリクローナル抗体が調製され得ることを示した。
【００５３】 ニワトリにおけるポリクローナル抗体に関する免疫化プロトコル ０．８ｍｌのＰＢＳ中の４０μｇのゲル精製した融合タンパク質ならびに０．
８ｍｌの完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントそれ
ぞれを免疫化ごとに使用した。
８ｍｌの完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントそれ
ぞれを免疫化ごとに使用した。
【００５４】 ０日目：１回目の免疫化（完全フロイントアジュバント） ２８日目：２回目の免疫化（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ） ５０日目：３回目の免疫化（ｉｃＦＡ）。
【００５５】 抗体を卵黄から抽出し、ウエスタンブロットにおいて試験した。本発明による
抗体を検出した。
抗体を検出した。
【００５６】 マウスにおけるモノクローナル抗体に関する免疫化プロトコル ０．２５ｍｌのＰＢＳ中の１２μｇのゲル精製した融合タンパク質、ならびに
０．２５ｍｌの完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバン
トそれぞれを免疫化ごとに使用した。融合タンパク質を、４回目の免疫化におい
て０．５ｍｌ（アジュバントなし）に溶解させた。
０．２５ｍｌの完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバン
トそれぞれを免疫化ごとに使用した。融合タンパク質を、４回目の免疫化におい
て０．５ｍｌ（アジュバントなし）に溶解させた。
【００５７】 ０日目：１回目の免疫化（完全フロイントアジュバント） ２８日目：２回目の免疫化（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ） ５６日目：３回目の免疫化（ｉｃＦＡ） ８４日目：４回目の免疫化（ＰＢＳ） ８７日目：融合。
【００５８】 ハイブリドーマの上清を、ウエスタンブロットにおいて試験した。本発明によ
るモノクローナル抗体を検出した。
るモノクローナル抗体を検出した。
【図１】 Ｆｉｇｕｒｅ１は、ＨＰＶ１６−Ｅ７セグメントを含む本発明によるポリペプ
チドの塩基配列（ｂ）および（ｃ）ならびにそれに由来するアミノ酸配列（ａ）
および（ｂ）を示す。天然のＨＰＶ１６タンパク質のセグメントａ、ｂ、ｃおよ
びｄが示される。トランジションａ／ｂ、ｂ／ｃおよびｃ／ｄもまた示される。
下線を付した配列は、制限酵素用の導入された切断部位を考慮したさらなるアミ
ノ酸を表す。
チドの塩基配列（ｂ）および（ｃ）ならびにそれに由来するアミノ酸配列（ａ）
および（ｂ）を示す。天然のＨＰＶ１６タンパク質のセグメントａ、ｂ、ｃおよ
びｄが示される。トランジションａ／ｂ、ｂ／ｃおよびｃ／ｄもまた示される。
下線を付した配列は、制限酵素用の導入された切断部位を考慮したさらなるアミ
ノ酸を表す。
【図２】 Ｆｉｇｕｒｅ２は、天然のＨＰＶ−１６−Ｅ７タンパク質の塩基配列（ｂ）お
よびそれ に由来するアミノ酸配列（ａ）を示す。セグメントａ、ｂ、ｃおよびｄが示され
る。それらは、下方の矢印によって互いに分離される。トランジションａ／ｂ、
ｂ／ｃおよびｃ／ｄもまた示される。それらは、上方の矢印によって説明される
。
よびそれ に由来するアミノ酸配列（ａ）を示す。セグメントａ、ｂ、ｃおよびｄが示され
る。それらは、下方の矢印によって互いに分離される。トランジションａ／ｂ、
ｂ／ｃおよびｃ／ｄもまた示される。それらは、上方の矢印によって説明される
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヨヒムス，イングリット ドイツ連邦共和国 ヴィースロッホ デー −69168 ツェーリンガーシュトラーセ １ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 BA41 CA01 CA07 EA04 GA11 HA15 4B064 AG27 AG30 AG32 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA95Y AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 AA07 AA13 BA01 BA02 BA08 BA18 BA19 BA20 BA23 CA01 CA04 CA53 CA56 ZB092 4H045 AA10 AA11 BA10 BA15 BA16 BA17 BA18 BA19 BA40 CA01 DA76 DA83 DA86 EA22 FA74
Claims (18)
- 【請求項１】 タンパク質に対して改変された順序で約１０〜４０個のアミ
ノ酸のタンパク質セグメントを含有してなる、免疫原性および改変された生物学
的タンパク質機能を有してなるポリペプチド。 - 【請求項２】 生物学的機能が除去されているものである、請求項１記載の
ポリペプチド。 - 【請求項３】 タンパク質が毒性またはトランスフォーミングタンパク質で
ある、請求項１または２記載のポリペプチド。 - 【請求項４】 トランスフォーミングタンパク質が、ＨＰＶ、特にＨＰＶ１
６またはＨＰＶ１８に由来するものである、請求項３記載のポリペプチド。 - 【請求項５】 タンパク質がＥ６またはＥ７タンパク質である、請求項４記
載のポリペプチド。 - 【請求項６】 セグメントが２０〜３０個のアミノ酸を含有してなる、請求
項１〜５いずれか１つに記載のポリペプチド。 - 【請求項７】 セグメントが、タンパク質中の対応するセグメントと１つま
たは数個のアミノ酸が異なるものである、請求項１〜６いずれか１つに記載のポ
リペプチド。 - 【請求項８】 ポリペプチドが、個々のセグメント間のトランジションとし
てタンパク質中に存在する約１０〜２０個のアミノ酸の部分をさらに含有してな
る、請求項１〜７いずれか１つに記載のポリペプチド。 - 【請求項９】 部分が１８〜２０個のアミノ酸を含有してなる、請求項８記
載のポリペプチド。 - 【請求項１０】 部分がポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に別々
にまたは全体として存在する、請求項８または９記載のポリペプチド。 - 【請求項１１】 ポリペプチドが、ｆｉｇ．１に示されるアミノ酸配列また
は１つもしくは数個のアミノ酸がそれとは異なるアミノ酸配列を含有してなる、
請求項１〜１０いずれか１つに記載のポリペプチド。 - 【請求項１２】 請求項１〜１０いずれか１つに記載のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ。 - 【請求項１３】 （ａ）ｆｉｇ．１のＤＮＡまたは１つもしくは数個の塩基
対がそれとは異なるＤＮＡ、または （ｂ）縮重コードにより（ａ）のＤＮＡに関連するＤＮＡ、 を含有してなる、請求項１１記載のＤＮＡ。 - 【請求項１４】 請求項１２または１３記載のＤＮＡを含有してなる、発現
プラスミド。 - 【請求項１５】 請求項１４記載の発現プラスミドを含んでなる、形質転換
体。 - 【請求項１６】 請求項１５記載の形質転換体を適切な条件下で培養する工
程を含む、請求項１〜１１いずれか１つに記載のポリペプチドの調製方法。 - 【請求項１７】 請求項１〜１１いずれか１つに記載のポリペプチドに対す
る抗体。 - 【請求項１８】 能動免疫化のための、請求項１〜１１いずれか１つに記載
のポリペプチドあるいは請求項１２または１３記載のＤＮＡの使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19819476A DE19819476C1 (de) | 1998-04-30 | 1998-04-30 | Polypeptid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins |
| DE19819476.5 | 1998-04-30 | ||
| PCT/DE1999/001331 WO1999055876A2 (de) | 1998-04-30 | 1999-04-30 | Polypeptid mit immunogenen eigenschaften und veränderten biologischen funktionen eines proteins |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002512801A true JP2002512801A (ja) | 2002-05-08 |
Family
ID=7866375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000546020A Pending JP2002512801A (ja) | 1998-04-30 | 1999-04-30 | 免疫原性特性および改変された生物学的タンパク質機能を有するポリペプチド |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1073751A2 (ja) |
| JP (1) | JP2002512801A (ja) |
| AU (1) | AU4895499A (ja) |
| DE (1) | DE19819476C1 (ja) |
| WO (1) | WO1999055876A2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE60126737T2 (de) * | 2001-03-23 | 2007-11-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Modifizierte HPV E6- und E7-Gene und -Proteine als Impfstoff |
| GB0120938D0 (en) * | 2001-08-29 | 2001-10-17 | Norchip As | Detection of human papillomavirus E7 mRNA |
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| DE3907721A1 (de) * | 1989-03-10 | 1990-09-20 | Behringwerke Ag | Immunogene regionen auf dem e7-protein des humanen papillomvierus typ 16 |
| WO1992010513A1 (en) * | 1990-12-12 | 1992-06-25 | The University Of Queensland | Subunit papillomavirus vaccine and peptides for use therein |
| GB9105383D0 (en) * | 1991-03-14 | 1991-05-01 | Immunology Ltd | An immunotherapeutic for cervical cancer |
| GB9207701D0 (en) * | 1992-04-08 | 1992-05-27 | Cancer Res Campaign Tech | Papillomavirus e7 protein |
| AUPN015794A0 (en) * | 1994-12-20 | 1995-01-19 | Csl Limited | Variants of human papilloma virus antigens |
| DE19631357A1 (de) * | 1996-08-02 | 1998-02-05 | Deutsches Krebsforsch | Vektor zur Aktivierung des Immunsystems gegen mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziierten Zellen |
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- 1998-04-30 DE DE19819476A patent/DE19819476C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-04-30 WO PCT/DE1999/001331 patent/WO1999055876A2/de not_active Application Discontinuation
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- 1999-04-30 AU AU48954/99A patent/AU4895499A/en not_active Abandoned
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