WO1999055876A2 - Polypeptid mit immunogenen eigenschaften und veränderten biologischen funktionen eines proteins - Google Patents

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WO1999055876A2
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Lutz Gissmann
Ingrid Jochmus
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide which has immunogenic properties and modified biological functions of a protein, a DNA encoding such a polypeptide and a method for producing such a polypeptide.
  • the invention further relates to the use of the DNA and the polypeptide for active immunization and antibodies directed against the polypeptide.
  • a protein When an animal or human is actively immunized, a protein is often administered as an immunogen, against which antibodies or cytotoxic T cells are then induced.
  • the applicant's recent experiments indicate that such a protein can remain in the body of the animal or human being for a very long time. This applies in particular if the protein is administered in the form of an expression plasmid encoding it.
  • the animal or man has long been involved in the biological functions of the protein, which e.g. may be toxic or transforming. This leads to considerable stress on the animal or humans, the consequences of which are not foreseeable at all.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which active immunization can be carried out without the above disadvantages.
  • the present invention thus relates to a polypeptide with immunogenic properties and modified biological functions of a protein and to a DNA coding for such a polypeptide. These agents allow active immunization without the animal or human being at least fully see functions of the protein is exposed.
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant that a polypeptide which has sections of a protein of about 10-40 amino acids in an arrangement which has been changed to the protein has an immunogenicity comparable to that of the protein, but has changes in the biological functions of the protein , which may even be missing entirely.
  • the applicant has further recognized that it is favorable for the immunogenicity of such a polypeptide if it contains parts of about 10-20 amino acids which are present in the protein as transitions between the individual sections.
  • a polypeptide which contains sections of the HPV16-E7 protein in an arrangement changed to the E7 protein and further parts present in the E7 protein as transitions between the individual sections is indicated in FIG. 1.
  • the knowledge of the applicant is used to provide a polypeptide with immunogenic properties and modified biological functions of a protein, the polypeptide having sections of the protein of about 10-40 amino acids in an arrangement that has been changed to the protein.
  • protein includes any protein that has immunogenic properties, e.g. the ability to induce antibodies directed against the protein or cytotoxic T cells, and can have biological functions. Examples of such a protein are toxic or transforming proteins.
  • the former can be bacterial toxins or viral proteins that are expressed in persistent infections.
  • An example of such viral proteins is HIV-Tat.
  • Transforming proteins can be of cellular origin, e.g. a melanoma-specific antigen (MAGE). They can also be infected by viruses, e.g. human pathogenic papilloma viruses (HPV), such as HPV 16 or 18. Proteins of such viruses include in particular the proteins E6 and E7.
  • polypeptide with immunogenic properties and altered biological functions of a protein includes any polypeptide, one or all can have immunogenic properties of a protein, whereby one to all biological functions of the protein can be changed, in particular switched off.
  • a polypeptide has sections of the protein of about 10-40 amino acids, in particular 20-30 amino acids, in an arrangement that has been changed to the protein. It can be advantageous if the sections differ from the corresponding sections in the protein by one or more amino acids. These can be, for example, amino acids which are beneficial for the production of the polypeptide and / or the immunogenicity of the sections.
  • polypeptide also contains parts of about 10-20 amino acids, in particular 18-20 amino acids, which are present in the protein as transitions between the individual sections. Such parts can be present at any point in the polypeptide, in particular at the N- and / or C-terminus, individually or as a whole.
  • a preferred polypeptide of the present invention comprises the amino acid sequence indicated in FIG. 1 or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids.
  • Such a polypeptide comprises sections of the E7 protein from HPV 16 in an arrangement which has been changed to the protein and parts of the E7 protein which are present therein as transitions between the individual sections.
  • an amino acid sequence different from one or more amino acids indicates that the DNA sequence on which this amino acid sequence is based hybridizes with the DNA of FIG. 1.
  • the DNA sequence can differ from the DNA of FIG. 1 by additions, substitutions, deletions and / or inversions of one or more base pairs.
  • hybridization indicates that this takes place under usual conditions, in particular at 20 ° C. below the melting point of the DNA sequence.
  • Another object of the present invention is a nucleic acid coding for a polypeptide above.
  • This can be an RNA or a DNA.
  • a DNA is preferred which comprises the following: (a) The DNA of Fig. 1 or a DNA different therefrom by one or more base pairs, or
  • a DNA different by one or more base pairs indicates that this DNA hybridizes with the DNA of FIG. 1.
  • the former DNA can differ from the DNA of FIG. 1 by additions, substitutions, deletions and / or inversions of one or more base pairs.
  • hybridization reference is made to the above statements.
  • a DNA according to the invention can be present as such or in a vector, in particular an expression vector.
  • an expression vector for E. coli these are e.g. pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b, Biuscript and pQE-8.
  • yeast e.g. to call pY100 and Ycpadl
  • animal cells e.g. pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 must be specified.
  • the baculovirus expression vector pAcSGHisNT-A is particularly suitable for expression in insect cells.
  • suitable cells for expressing a DNA according to the invention which is present in an expression vector.
  • suitable cells include the E. coli strains HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, BL21 and SG 13009, the latter being preferred, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, 3T3, FM3A, CHO, COS , Vero and HeLa and the insect cells sf9 or Hi5.
  • DNA according to the invention has to be inserted into an expression vector. He is also aware that this DNA can be inserted in connection with a DNA coding for another polypeptide, so that the DNA according to the invention can be expressed in the form of a fusion polypeptide. Furthermore, the person skilled in the art knows conditions, transformed or transfected cells. to cultivate. He is also aware of processes for isolating and purifying the polypeptide expressed by the DNA according to the invention.
  • Another object of the present invention is an antibody directed against an above polypeptide or fusion polypeptide.
  • Such an antibody can be produced by conventional methods. It can be polyclonal or monoclonal. For its production, it is favorable to immunize animals, in particular rabbits or chickens for a polyclonal and mice for a monoclonal antibody, with an above (fusion) protein or fragments thereof. Further “boosters" of the animals can be carried out with the same (fusion) protein or fragments thereof. The polyclonal antibody can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals. For the monoclonal antibody, animal spleen cells are fused with myeloma cells.
  • a DNA according to the invention can be expressed directly in animals or humans.
  • the DNA according to the invention can be present in expression vectors which are derived from plasmid and / or virus vectors.
  • virus vectors include AAV, adenovirus and vaccinia virus vectors.
  • the person skilled in the art knows methods of introducing and expressing a DNA according to the invention in animals or humans.
  • Another object of the present invention is a vaccination agent comprising:
  • auxiliaries such as buffers, solvents and carriers.
  • Such a vaccination agent is suitable for active immunization, for example against HPV. If the vaccination agent contains an antibody (c) according to the invention instead of (a) and / or (b), it is suitable for passive immunization, for example against HPV.
  • Another object of the present invention is a kit comprising:
  • auxiliaries such as buffers, solvents, carriers and controls.
  • One or more representatives of the individual components of the vaccination agent or of the kit can be present.
  • the present invention provides polypeptides which have immunogenic properties and modified, in particular deactivated, biological functions of a protein.
  • the present invention further provides DNAs encoding such polypeptides.
  • animals or humans can be actively immunized; in particular, the DNAs can achieve high efficiency in inducing antibodies directed against the protein and, above all, cytotoxic T cells.
  • the agents are characterized in that the immunized animals or humans are not exposed to the stresses that occur with conventional active immunizations.
  • means are provided by the antibodies according to the invention with which the active immunization and its course can be monitored. At the same time, the antibodies are also agents that can be used for passive immunization.
  • the present invention thus makes a major contribution to the development of modern methods in the prophylaxis and therapy of diseases.
  • FIG. 1 shows the base sequence (b) and (c) and the amino acid sequence (a) and (b) derived therefrom of a polypeptide according to the invention which has HPV16-E7 sections. Sections a, b, c and d of the natural HPV16 protein are indicated. The transitions a / b, b / c and c / d are also given. Underlined sequences represent additional amino acids due to the introduced restriction enzyme cleavage sites.
  • 2 shows the base sequence (b) and the amino acid sequence derived therefrom, (a) of the natural HPV16-E7 protein. Sections a, b, c and d are given. These are separated from each other by arrows pointing downwards. The transitions a / b, b / c and c / d are also given. These are shown by arrows pointing upwards.
  • a DNA coding for the E7 protein (98 amino acids) of HPV 16 comprises the 297 base pairs indicated in FIG. 2 plus the stop codon TAA. This DNA was broken down into four parts (a-d): 1-30 (a), 31-120 (b), 121-210 (c) and 211-294 (d; without stop codon). In addition, the transitions a / b (10-60), b / c (100-144) and c / d (190-231; plus stop codon) were synthesized.
  • Fragments a and d were assembled by PCR; A HindIII cleavage site was inserted 5 'to a and an EcoRI cleavage site was inserted 3' to d (each with 6 bp spacer for better cleavage). In detail we proceeded as follows:
  • This fragment was isolated after gel electrophoresis and using the primer
  • Fragments c and b were assembled by PCR; An EcoRI cleavage site was used 5 'to c and a BamHI cleavage site (each with 6 bp spacer) was used 3' to b. In detail we proceeded as follows:
  • VII 5 '- (AGC AGT) Spacer (GGA TCC) BamHI A 120 CC ATC TAT TTC ATC CTC CTC CTC T 96 -3'
  • transitions a / b, b / c and c / d were assembled by PCR, 5 'of a / b using a BamHI cleavage site and 3' of c / d an Xbal cleavage site.
  • the procedure was as follows:
  • the fragments (VIII / IX) and X / Xl were linked using primers VIII and XI, so that the sequence 5'-spacer - BamHI - 7 -> 54/97 -> 144/187 -> 198-3 '( 117 bp) was created.
  • This fragment was linked together with the fragment (Xll / Xlll) using primers VIII and XIII, so that the sequence 5'-spacer - BamHI - 7 -> 54/97 -> 144/187 234 -> - Stop - Xbal - Spacer-3 '(171 bp) was created.
  • This sequence was cloned in the vector Bluescript after cleavage with BamHI and Xbal.
  • Example 2 Production and purification of a protein according to the invention
  • Example 1 The DNA obtained under 5 of Example 1 was inserted into the expression vector pQE-8 (Qiagen), which had been cleaved with HindIII and Xbal.
  • the expression plasmid pQE-8 / E7 was obtained.
  • pQE-8 / E7 was used to transform E.coli SG 13009 (see Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273).
  • the bacteria were cultivated in an LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin and 25 ⁇ g / ml kanamycin and induced for 4 h with 60 ⁇ M isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the bacteria were lysed by adding 6 M guanidine hydrochloride, and then chromatography (Ni-NTA resin) was carried out with the lysate in the presence of 8 M urea in accordance with the manufacturer's (Diagen) instructions for the chromatography material.
  • the bound fusion protein was eluted in a pH 3.5 buffer.
  • the fusion protein was subjected to an 18% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie blue (cf. Thomas, JO and Kornberg, RD, J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733) ). It was found that a (fusion) protein according to the invention can be produced in a highly pure form.
  • Example 3 Production and detection of an antibody according to the invention
  • a fusion protein according to the invention from Example 2 was subjected to 18% SDS polyacrylamide gel electrophoresis. After staining the gel with 4 M sodium acetate, an approximately 15 kD band was cut out of the gel and incubated in phosphate-buffered saline. Pieces of gel were sedimented before the protein concentration of the supernatant was determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, which was followed by a Coomassie blue staining. Animals were immunized with the gel-purified fusion protein as follows:
  • the rabbit's serum was tested in the immunoblot.
  • a fusion protein according to the invention from Example 1 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Bioche. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209).
  • Western blot analysis was performed as in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229.
  • the nitrocellulose filter was incubated for one hour at 37 ° C. with a first antibody. This antibody was rabbit serum (1: 10,000 in PBS). After several washes with PBS, the nitrocellulose filter was incubated with a second antibody.
  • This antibody was an alkaline phosphorus phatase coupled goat monoclonal anti-rabbit IgG antibody (Dianova) (1: 5000) in PBS. After 30 minutes incubation at 37 ° C, several washing steps with PBS followed and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ) at room temperature until bands were visible.
  • developer solution 36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2
  • Antibodies were extracted from egg yolk and tested in a Western blot. Polyclonal antibodies according to the invention have been detected.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid mit immunogenen und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins, wobei das Polypeptid Abschnitte des Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren in einer zum Protein veränderten Anordnung aufweist. Ferner betrifft die Erfindung eine ein solches Polypeptid kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Polypeptids. Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Polypeptids zur aktiven Immunisierung sowie gegen das Polypeptid gerichtete Antikörper.

Description

Polypeptid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, das immunogene Eigenschaften und veränderte biologische Funktionen eines Proteins aufweist, eine ein solches Polypeptid kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Polypeptids. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Polypeptids zur aktiven Immunisierung sowie gegen das Polypeptid gerichtete Antikörper.
Bei aktiver Immunisierung eines Tieres bzw. Menschen wird vielfach ein Protein als Immunogen verabreicht, gegen das dann Antikörper bzw. zytotoxische T-Zellen induziert werden. Jüngste Versuche des Anmelders weisen darauf hin, daß ein solches Protein sehr lange im Körper des Tieres bzw. Menschen verweilen kann. Dies gilt insbesondere, wenn das Protein in Form eines es kodierenden Expressions- plasmids verabreicht wird. Somit ist das Tier bzw. der Mensch lange den biologischen Funktionen des Proteins, die z.B. toxisch oder transformierend sein können, ausgesetzt. Dies führt zu erheblichen Belastungen des Tieres bzw. Menschen, deren Folgen überhaupt nicht absehbar sind.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem eine aktive Immunisierung ohne die vorstehenden Nachteile durchgeführt werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit ein Polypeptid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins und eine für ein solches Polypeptid kodierende DNA. Diese Mittel erlauben eine aktive Immunisierung, ohne daß das Tier bzw. der Mensch zumindest in vollem Umfang den biologi- sehen Funktionen des Proteins ausgesetzt ist.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß ein Polypeptid, das Abschnitte eines Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren in einer zum Protein veränderten Anordnung aufweist, zwar eine mit dem Protein vergleichbare Immunogenität besitzt, jedoch Veränderungen in den biologischen Funktionen des Proteins aufweist, wobei diese sogar gänzlich fehlen können. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß es für die Immunogenität eines solchen Polypeptids günstig ist, wenn es Teile von etwa 10-20 Aminosäuren enthält, die im Protein als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen. Ein Polypeptid, das Abschnitte des HPV16-E7 Proteins in einer zum E7-Protein veränderten Anordnung und weitere im E7-Protein als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegende Teile enthält, ist in Fig. 1 angegeben.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein Polypeptid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins bereitzustellen, wobei das Polypeptid Abschnitte des Proteins von etwa 10- 40 Aminosäuren in einer zum Protein veränderten Anordnung aufweist.
Der Ausdruck "Protein" umfaßt jegliches Protein, das immunogene Eigenschaften, z.B. die Fähigkeit zur Induktion von gegen das Protein gerichteten Antikörpern bzw. zytotoxischen T-Zellen, und biologische Funktionen aufweisen kann. Beispiele eines solchen Proteins sind toxische oder transformierende Proteine. Erstere können bakterielle Toxine oder virale Proteine sein, die bei persistierenden Infektionen exprimiert werden. Ein Beispiel solcher viraler Proteine ist HIV-Tat. Transformierende Proteine können zellulären Ursprungs sein, z.B. ein Melanom-spezifisches Antigen (MAGE). Ferner können sie von Viren, z.B. humanpathogenen Papillom-Viren (HPV), wie HPV 16 oder 18, stammen. Als Proteine solcher Viren sind insbesondere die Proteine E6 und E7 zu nennen.
Der Ausdruck "Polypeptid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins" umfaßt jegliches Polypeptid, das eine bis alle immunogenen Eigenschaften eines Proteins aufweisen kann, wobei eine bis alle biologischen Funktionen des Proteins verändert, insbesondere ausgeschaltet, sein können. Ein solches Polypeptid weist Abschnitte des Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren, insbesondere 20-30 Aminosäuren, in einer zum Protein veränderten Anordnung auf. Günstig kann es sein, wenn sich die Abschnitte von den entsprechenden Abschnitten im Protein durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheiden. Dies können z.B. Aminosäuren sein, die für die Herstellung des Polypeptids und/oder die Immunogenität der Abschnitte förderlich sind. Ferner kann es günstig sein, wenn das Polypeptid auch Teile von etwa 10-20 Aminosäuren, insbesondere 18-20 Aminosäuren, enthält, die im Protein als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen. Solche Teile können an beliebiger Stelle des Polypeptids, insbesondere am N- und/oder C-Terminus, einzeln oder in einer Gesamtheit vorliegen.
Ein bevorzugtes Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfaßt die in Fig. 1 angegebene Aminosäuresequenz oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz. Ein solches Polypeptid umfaßt Abschnitte des E7-Proteins von HPV 16 in einer zum Protein veränderten Anordnung und Teile des E7-Proteins, die in diesem als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen.
Der Ausdruck "eine durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz" weist darauf hin, daß die dieser Aminosäuresequenz zugrundeliegende DNA-Sequenz mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 1 durch Additionen, Substitutionen, Deletionen und/oder Inversionen von einem oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist darauf hin, daß diese unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20 °C unter dem Schmelzpunkt der DNA-Sequenz erfolgt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine für ein vorstehendes Polypeptid kodierende Nukleinsäure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt: (a) Die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, oder
(b) eine über den degenerierten Code mit der DNA von (a) verwandte DNA.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA" weist darauf hin, daß diese DNA mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert. Erstere DNA kann sich von der DNA von Fig. 1 durch Additionen, Substitutionen, Deletionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybridisierung" wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen.
Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in einem Vektor, insbesondere einem Expressionsvektor, vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b, Biuscript und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z.B. pY100 und Ycpadl zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101 , DH1 , x1776, JM101 , JM 109, BL21 und SG 13009, wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9 oder Hi5.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Polypeptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusionspolypeptids ex- primiert werden kann. Ferner kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen. zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße DNA exprimierte Polypeptid zu isolieren und zu reinigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Polypeptid bzw. Fusionspolypeptid gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklo- nal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions) protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions) protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Des weiteren kann eine erfindungsgemäße DNA direkt in Tieren bzw. dem Menschen exprimiert werden. Die erfindungsgemäße DNA kann hierzu in Expressionsvektoren vorliegen, die von Plasmid- und/oder Virusvektoren abgeleitet sind. Beispiele von Virusvektoren umfassen AAV-, Adenovirus und Vacciniavirus-Vektoren. Der Fachmann kennt Verfahren, eine erfindungsgemäße DNA in Tiere bzw. den Menschen einzuführen und zu exprimieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vakzinierungsmittel, umfassend:
(a) Ein erfindungsgemäßes Polypeptid, und/oder
(b) eine erfindungsgemäße DNA, sowie
(c) übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Lösungsmittel und Träger.
Ein solches Vakzinierungsmittel eignet sich zur aktiven Immunisierung, z.B. gegen HPV. Enthält das Vakzinierungsmittel anstelle von (a) und/oder (b) einen erfindungsgemäßen Antikörper (c), so eignet es sich zur passiven Immunisierung, z.B. gegen HPV. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, umfassend:
(a) Ein erfindungsgemäßes Polypeptid,
(b) eine erfindungsgemäße DNA und/oder
(c) einen erfindungsgemäßen Antikörper, sowie
(d) übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Lösungsmittel, Träger und Kontrollen.
Von den einzelnen Komponenten des Vakzinierungsmittels bzw. des Kits können jeweils ein oder mehrere Vertreter vorliegen.
Die vorliegende Erfindung stellt Polypeptide bereit, die immunogene Eigenschaften und veränderte, insbesondere ausgeschaltete, biologische Funktionen eines Proteins aufweisen. Ferner stellt die vorliegende Erfindung DNAs bereit, die für solche Polypeptide kodieren. Mit diesen Mitteln können Tiere bzw. der Mensch aktiv immunisiert werden, insbesondere kann durch die DNAs eine hohe Effizienz bei der Induktion von gegen das Protein gerichteten Antikörpern und vor allem von zytotoxischen T- Zellen erreicht werden. Ferner zeichnen sich die Mittel dadurch aus, daß die immunisierten Tiere bzw. der Mensch nicht den Belastungen ausgesetzt sind, die bei herkömmlichen aktiven Immunisierungen auftreten. Des weiteren werden durch die erfindungsgemäßen Antikörper Mittel bereitgestellt, mit denen die aktive Immunisierung und deren Verlauf überwacht werden können. Gleichzeitig stellen die Antikörper auch Mittel dar, die für eine passive Immunisierung eingesetzt werden können. Somit stellt die vorliegende Erfindung einen großen Beitrag für die Entwicklung moderner Verfahren in der Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen dar.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
Fig. 1 zeigt die Basensequenz (b) und (c) und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (a) und (b) eines erfindungsgemäßen, HPV16-E7 Abschnitte aufweisenden Polypeptids. Die Abschnitte a, b, c und d des natürlichen HPV16-Proteins sind angegeben. Ebenso sind die Übergänge a/b, b/c und c/d angegeben. Unterstrichene Sequenzen stellen zusätzliche Aminosäuren aufgrund der eingeführten Spaltstellen für Restriktionsenzyme dar. Fig. 2 zeigt die Basensequenz (b) und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz, (a) des natürlichen HPV16-E7 Proteins. Die Abschnitte a, b, c und d sind angegeben. Diese werden durch abwärts gerichtete Pfeile voneinander getrennt. Ebenso sind die Übergänge a/b, b/c und c/d angegeben. Diese werden durch aufwärts gerichtete Pfeile verdeutlicht.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 : Herstellung einer erfindungsgemäßen DNA
Eine für das E7-Protein (98 Aminosäuren) von HPV 16 kodierende DNA umfaßt die in Fig. 2 angegebenen 297 Basenpaare plus Stopcodon TAA. Diese DNA wurde in vier Teile (a-d) zerlegt: 1-30 (a), 31-120 (b), 121-210 (c) und 211-294 (d; ohne Stopco- don). Zusätzlich wurden die Übergänge a/b (10-60), b/c (100-144) und c/d (190-231 ; plus Stopcodon) synthetisiert.
1. Die Fragmente a und d wurden durch PCR zusammengesetzt; 5' zu a wurde eine Hindill Spaltstelle und 3' von d eine EcoRI Spaltstelle (jeweils mit 6 bp Spacer zur besseren Spaltbarkeit) eingesetzt. Im einzelnen wurde wir folgt vorgegangen:
Aus der DNA von Fig. 2 wurde durch die Primer II und III folgende Sequenz hergestellt: (ll/lll): 5'-21 -> 30/211 -> 294/EcoRI - Spacer-3' (106 bp)
Dieses Fragment wurde nach Gelektrophorese isoliert und mit Hilfe der Primer
I und III verlängert, so daß die Sequenz (l/ll/lll)
5'-Spacer - Hindlll/1 -> 30/211 -> 294/EcoRI - Spacer-3' (138 bp) erhalten wurde.
Primer:
(I) 5'(AGC AGT)spaoer(AAG CTT)HmmA,JG CAT GGA GAT ACA CCT ACA TTG CAT GAA30A2ιιGC ACA CAC G2353'
(II) 5'-A21TT GCA TGA A30A2nG CAC ACA CGT AGA CAT TCG TAC TT235-3'
(III) 5'-(AGC AGηspaoer(GAA TTC)EooRlT294GG TTT CTG AGA ACA GAT GGG
G273-3'
2. Die Fragmente c und b wurden durch PCR zusammengesetzt; 5' zu c wurde eine EcoRI Spaltstelle und 3' zu b wurde eine BamHI Spaltstelle (jeweils mit 6 bp Spacer) eingesetzt. In einzelnen wurde wir folgt vorgegangen:
Aus der DNA von Fig. 2 wurden durch die Primerpaare IV-V und Vl-Vll folgende Sequenzen hergestellt: (IV/V): 5'-Spacer - EcoRI/121 ->210/31 -> 40-3' (112 bp) (Vl/Vll): 5'-201 ->210/31 -> 120 - BamHI - Spacer-3' (112 bp)
Diese Fragmente wurden nach Gelektrophorese isoliert und mit Hilfe der
Primer IV und VII verlängert, so daß die Sequenz (IV/V/VI/VII)
5'-Spacer - EcoRI/121 -> 210/31 -> 120 - BamHI - Spacer-3' (204 bp) erhalten wurde.
Primer:
(IV): 5'-(AGC AGT)Spacer (GAA TTC)EcoRI C121CA GCT GGA CAA GCA GAA
CCG GAC A145-3' (V): 5'-C40TA ACA TAT
Figure imgf000010_0001
GTA CGC ACA ACC GAA GCG TAG AG18β-3' (VI) : 5'-G201TG CGT ACA A210T31 A TAT GTT AGA TTT GCA ACC AGA GA55-3'
(VII): 5'-(AGC AGT)Spacer(GGA TCC)BamHIA120CC ATC TAT TTC ATC CTC CTC CTC T96-3'
3. Die Fragmente ad und cb wurden mit EcoRI gespalten und durch Ligation zusammengesetzt. Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen:
Die unter 2. und 3. erhaltenen Sequenzen (l/ll/lll) und (IV/V/VI/VII) wurden durch Geleelektrophorese isoliert, durch EcoRI gespalten und ligiert. Dadurch wurde die Sequenz
5'-Spacer-Hindlll/1 -> 30/211 ->294/EcoRI/121 -> 210/31 ->120 - BamHI- Spacer-3' (318 bp) erhalten, die nach Spaltung mit Hindill und BamHI in dem Vektor Bluescript kloniert wurde.
Die Übergänge a/b, b/c und c/d wurden durch PCR zusammengesetzt, wobei 5' von a/b eine BamHI Spaltstelle und 3' von c/d eine Xbal Spaltstelle eingesetzt wurden. Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen:
Aus der DNA von Fig. 2 wurden durch die Primerpaare VIII-IX, X-Xl und Xll-Xlll folgende Sequenzen hergestellt:
(VIII/IX): 5'-Spacer-BamHI - 7 -> 54/97 -> 105 - 3' (69 bp)
(XXI): 5'- 46 -> 54/97 -> 144/187 -> 198-3' (69 bp) (Xll/Xlll): 5' -136 -> 144/187 -> 234 - Stop - Xbal - Spacer-3' (69 bp)
Die entsprechenden Fragmente wurden nach Gelektrophorese isoliert.
Die Fragmente (VIII/IX) und X/Xl wurden mit Hilfe der Primer VIII und XI verbunden, so daß die Sequenz 5'-Spacer - BamHI - 7 -> 54/97 -> 144/187 -> 198-3' (117 bp) entstand. Dieses Fragment wurde zusammen mit dem Fragment (Xll/Xlll) mit Hilfe der Primer VIII und XIII verbunden, so daß die Sequenz 5'-Spacer - BamHI - 7 -> 54/97 -> 144/187 234 -> - Stop - Xbal - Spacer-3' (171 bp) entstand. Diese Sequenz wurde nach Spaltung mit BamHI und Xbal in dem Vektor Bluescript kloniert.
Primer:
(VIII): 5'-(AGC AGT)Spacer(GGA TCC)Bam HIG7 GA GAT ACA CCT ACA21-3' (IX) : 5'-C105TC CTC CTC97C54TC TGG TTG CAA ATC40-3' (X): 5'-C4eAA CCA GAG54G97AG GAG GAG GAT GAA1ι 3'
(XI): 5'-A195AG CGT AGA187G144TC CGG TTC TGC TTG TCC127-3' (XII): 5'-G136AA CCG GAC144TCT187ACG CTT CGG TG201201-3' (XIII): 5'-(AGC AGT)Spacer(TCT AGA)Xbal(TTA)stopAGT234ACG AAT GTC TAC220-3'
5. Die Fragmente Hindill - a - d - EcoRI - c - b - BamHI und BamHI - a/b - b/c - c/d - Xbal wurden mit BamHI gespalten und durch Ligation zusammengesetzt.
Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen:
Die in 3. und 4. beschriebenen Sequenzen wurden mit BamHI gespalten und ligiert, so daß folgende Sequenz erhalten wurde: 5'-Spacer-Hindlll/1 ->30/211 ->294/EcoRI/121 -> 210/31 ->120 - BamHI - 7
->54/97 ->144/187 ->234 - Stop - Xbal - Spacer-3' (477 bp) (vgl. Fig. 1). Diese Sequenz wurde mit Hindlll und Xbal gespalten und in dem Vektor Bluescript kloniert.
Beispiel 2: Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen Proteins
Die unter 5. von Beispiel 1 erhaltende DNA wurde in den mit Hindlll und Xbal gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wurde das Expres- sionsplasmid pQE-8/E7 erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen (Protein) von Fig. 1 (C-Terminuspartner). pQE-8/E7 wurde zur Transformation von E.coli SG 13009(vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien wurden in einem LB-Medium mit 100μg/ml Ampicillin und 25μg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60μM Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wurde eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wurde mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wurde in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wurde das Fusions- protein einer 18 % SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coo- massie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J.Mol.Biol. 149 (1975), 709-733). Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions) protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.
Beispiel 3: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 2 wurde einer 18 % SDS-Poly- acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natrium- acetat wurde eine ca. 15 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke wurden sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektropho- rese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgte, bestimmt wurde. Mit dem Gel-ge- reinigten Fusionsprotein wurden Tiere wie folgt immunisiert:
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung wurden 35μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt. Tag O: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 28 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80 Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfin- dungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelek- trophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Ander- sen, J., J. Bioche . Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens (1 :10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phos- phatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-lgG-Antikörper (Dianova) (1 :5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400μM Nitroblau- tetrazolium, 100mM Tris-HCI, pH 9.5, 100 mM NaCI, 5 mM MgCI2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.
Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung wurden 40μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O. 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus
Pro Immunisierung wurden 12μg Gel-gereinigtes Fusioπsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag O. 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 56 3. Immunisierung (icFA) Tag 84 4. Immunisierung (PBS) Tag 87 Fusion
Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.

Claims

Patentansprüche
1. Polypeptid mit immunogenen und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins, wobei das Polypeptid Abschnitte des Proteins von etwa 10-40 Aminosäuren in einer zum Protein veränderten Anordnung aufweist.
2. Polypeptid nach Anspruch 1 , wobei die biologischen Funktionen ausgeschaltet sind.
3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein ein toxisches oder transformierendes Protein ist.
4. Polypeptid nach Anspruch 3, wobei das transformierende Protein von HPV, insbesondere HPV 16 oder HPV 18 stammt.
5. Polypeptid nach Anspruch 4, wobei das Protein ein E6- oder E7-Protein ist.
6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 -5, wobei die Abschnitte 20-30 Amino- säuren umfassen.
7. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-6, wobei sich die Abschnitte von den entsprechenden Abschnitten im Protein durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheiden.
8. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-7, wobei das Polypeptid auch Teile von etwa 10-20 Aminosäuren enthält, die im Protein als Übergänge zwischen den einzelnen Abschnitten vorliegen.
9. Polypeptid nach Anspruch 8, wobei die Teile 18-20 Aminosäuren umfassen.
10. Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Teile am N- und/oder C-Termi- nus des Polypeptids einzeln oder in einer Gesamtheit vorliegen.
11. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-10, wobei das Polypeptid die in Fig. 1 angegebene Aminosäuresequenz oder eine hiervon durch eine oder mehre- re Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequernz umfaßt.
12. DNA, kodierend für das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-10.
13. DNA nach Anspruch 11 , wobei die DNA umfaßt: (a) Die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, oder (b) eine über den degenerierten Code mit der DNA von (a) verwandte DNA.
14. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 12 oder 13.
15. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 14.
16. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-11 , umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 15 unter ge- eigneten Bedingungen.
17. Antikörper, gerichtet gegen das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-11.
18. Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-11 oder der DNA nach Anspruch 12 oder 13 zur aktiven Immunisierung.
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