WO1998005790A1 - Vektor zur aktivierung des immunsystems gegen mit papillomviren bzw. sequenzen davon assoziierten zellen - Google Patents

Vektor zur aktivierung des immunsystems gegen mit papillomviren bzw. sequenzen davon assoziierten zellen Download PDF

Info

Publication number
WO1998005790A1
WO1998005790A1 PCT/DE1997/001629 DE9701629W WO9805790A1 WO 1998005790 A1 WO1998005790 A1 WO 1998005790A1 DE 9701629 W DE9701629 W DE 9701629W WO 9805790 A1 WO9805790 A1 WO 9805790A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vector
cells
poly
peptide
orf
Prior art date
Application number
PCT/DE1997/001629
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen KLEINSCHMIDT
Ingrid Jochmus
Lutz Gissmann
Martin Müller
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
Priority to EP97935500A priority Critical patent/EP0917586A1/de
Publication of WO1998005790A1 publication Critical patent/WO1998005790A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a vector which is suitable for activating the immune system against cells associated with papilloma viruses or sequences thereof, a vaccination agent containing such a vector and the use of both.
  • HPVs Human papilloma viruses
  • benign e.g. Warts
  • malignancies e.g. B. Carcinomas of the skin and uterus, epithelial neoplasms.
  • HPVs are also being considered for the development of malignant tumors of the respiratory tract.
  • HPVs are also considered to be at least jointly responsible for the development of squamous carcinomas of the lungs.
  • Papilloma viruses have an icosahedral capsid without a shell, in which a circular, double-stranded DNA molecule of approximately 7900 bp is present.
  • the capsid comprises a major capsid protein (L1) and a minor capsid protein (L2).
  • L1 open reading frame
  • L2-ORF open reading frame
  • L1 or L1 and L2 lead to the formation of virus-like particles (VLPs) in vitro.
  • VLPs virus-like particles
  • E6 and E7 are encoded by E6-ORF or E7-ORF.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which the immune system can be activated to recognize and switch off cells, in particular tumor cells, which are associated with papilloma viruses or sequences thereof. According to the invention, this is achieved by the subject matter in the claims.
  • the present invention thus relates to a vector with a nucleic acid coding for a fusion polypeptide, the fusion polypeptide comprising a structural papillomavirus (poly) peptide and a non-transforming (poly) peptide encoded by an early papillomavirus gene.
  • vector includes any vector that is suitable for gene transfer, i.e. the introduction of nucleic acids into cells.
  • the vector can be used in the
  • the vector can be a plasmid or a virus vector.
  • a virus vector examples include retroviral, adenovirus, vaccinia virus or adeno-associated virus (AAV) vectors, the latter being preferred.
  • An AAV vector can be in wild-type or modified form. It can also only include those sequences, such as ITR sequences, that are necessary for its transduction capability. However, it can also be favorable if it additionally comprises sequences such as rep sequences which enable it to be integrated into chromosome 19.
  • a virus vector can be present as a virus particle or in the form of its nucleic acid. It is preferred if the virus vector is replication-defective.
  • papilloma virus encompasses any papilloma virus or sequences thereof which can be associated with cells, in particular tumor cells.
  • it can be HPVs and very particularly "high risk” HPVs, such as HPV16, 1 8, 33, 35 and 45.
  • nucleic acid encompasses any nucleic acid, such as DNA and / or RNA, that encodes a fusion polypeptide that includes a papillomavirus (poly) structural peptide and a non-transforming (poly) early papillomavirus gene-encoded peptide. It is favorable if the nucleic acid can be expressed. It is particularly favorable if they are under the control of a constitutive or inducible promoter, such as a tissue or tumor-specific one Promoter stands.
  • a constitutive or inducible promoter such as a tissue or tumor-specific one Promoter stands.
  • structural papillomavirus (poly) peptide encompasses any peptide or polypeptide of a papillomavirus which is at least partly responsible for the structure of the papillomavirus.
  • a (poly) peptide is encoded by L1-ORF or L2-ORF of a papilloma virus or by a part thereof.
  • a (poly) peptide which can be present as a VLP is particularly preferred.
  • a non-transforming (poly) peptide encoded by an early papillomavirus gene encompasses any peptide or polypeptide which is encoded by an early papillomviurs gene, in particular E1, E2, E4, E5, E6 or E7-ORF or by a part of it is coded and non-transforming.
  • non-transforming indicates that the (poly) peptide has no transformability by nature or by intervention.
  • a preferred (poly) peptide is by E6 or E7 ORF of a papilloma virus or by
  • fusion polypeptide indicates that the papillomvirs (poly) structural peptide and the non-transforming (early) papillomavirus gene encoded (poly) peptide may be present in any combination in the fusion polypeptide.
  • the individual (poly) peptides can also come from different papilloma viruses.
  • the C-terminus of the structural (poly) peptide is connected to the N-terminus of the non-transforming (poly) peptide. It may also be advantageous if the non-transforming (poly) peptide is located within the structural (poly) peptide.
  • a preferred fusion polypeptide comprises a (poly) peptide encoded by HPV 16 L1 -ORF and a (poly) peptide encoded by HPV1 6 E6 or E7-ORF. Furthermore, a fusion polypeptide is preferred which comprises a (poly) peptide encoded by HPV 18 L1 ORF and a (poly) peptide encoded by HPV 18 E6 or E7 ORF.
  • an AAV vector can be produced as a virus particle as follows: The 5 'end of the HPV 16 E6 ORF is ligated to the 3' end of the HPV 16 L1 ORF. Previously, part of the E6 ORF was deleted, which destroyed the transforming properties of E6. The DNA fragment L1 -ORF-E6-ORF is inserted into an AAV vector which contains the 5'- and 3'-ITR-
  • AAV vector Contains sequences of AAV, but not the sequences coding for the AAV rep and cap proteins. The insertion takes place between the two ITR sequences.
  • the DNA fragment L1 -ORF-E6-ORF is under the control of a promoter which is heterologous with respect to AAV.
  • the resulting AAV vector is transfected into cells that express the AAV Rep and Cap proteins.
  • the cells are further infected with a helper virus, e.g. Adenovirus, whereby the AAV vector is obtained as a virus particle.
  • helper virus e.g. Adenovirus
  • the immune system can be activated to recognize and switch off cells, in particular tumor cells, which are associated with papilloma viruses or sequences thereof. This can be achieved prophylactically and in therapy.
  • cells of the organism in question such as antigen-presenting cells, for example dendritic cells, B cells, macrophages and / or tumor cells or pre-tumor cells associated with papilloma viruses or sequences thereof, are transduced with the vector.
  • the transduction can be carried out by conventional methods. If the vector is in the form of a virus particle, it is favorable to infect the cells with it. On the other hand, if it is present as nucleic acid, such as DNA, it is advisable to transfect the cells with it.
  • Electroporation, lipofection and particle cannon are examples of transfection techniques.
  • the cells can be present in the organism.
  • the cells to be transduced can also be isolated from the organism, transduced outside the organism and then returned to the organism. Such cells are called autologous cells.
  • allogeneic cells can also be used for transduction with regard to the organism. It is advantageous if these cells belong to an HLA type corresponding to the organism. Those skilled in the art are familiar with methods of imparting a certain HLA type to cells. It is also beneficial if in one of the above methods, the tumor cells or pre-tumor cells are inactivated before they are returned to the organism. Conventional methods such as radiation can be carried out for this.
  • Another object of the present invention is a vaccination agent which comprises a vector above and conventional auxiliary substances such as buffers, diluents, carriers, etc. It may be beneficial if the vaccination agent contains other substances that affect the immune system, e.g. against tumor cells. Such substances can in particular be MHC-1 molecules, costimulatory molecules, e.g. B7, and secretory immunostimulators, e.g. Cytokines such as IL-2, IL-1 2, interferon and GM-CSF.
  • the substances can e.g. in the form of peptides, in particular synthetic peptides.
  • the substances can also be in the form of expression plasmids encoding them, which can also encode HLA molecules. It is particularly favorable if the vaccination agent also by the
  • the present invention it is possible to activate the immune system against cells which are associated with papilloma viruses or sequences thereof. These cells can be tumor cells or pre-tumor cells.
  • the immune system can be activated prophylactically and in therapy.
  • the present invention represents a new step in treating the most serious diseases using in vivo or ex vivo gene therapy.
  • the invention is illustrated by the following example.
  • L1 ORF From a genomic HPV1 6 clone (see Kirnbauer et al, (1 993), 6929-6936) the L1 ORF was amplified by a PCR reaction. For this purpose, L1-specific primers were used which have an additional Bgl II restriction site at the 5 'end. The amplified DNA fragment was digested with Bgl II and inserted into the BamHI restriction site of the usual vector pUC 19. An EcoRV- was identified at position 7051 of L1 -ORF by specific mutagenesis
  • Vector pVL1 392 inserted. From this, the L1-E7 fusion gene was cut out by NotI / Smal and inserted into the NotI restriction site of the AAV vector pUF2 (cf. Zolotukhin et al., J. Virol. 70, (1 996), 4646-4654). A vector was obtained which codes for an HPV16 L1 -E7 fusion polypeptide. Viral particles of the vector were obtained in accordance with customary methods (cf.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor mit einer für ein Fusionspolypeptid kodierenden Nukleinsäure, wobei das Fusionspolypeptid ein strukturelles Papillomvirus-(Poly)peptid und ein nicht-transformierendes, durch ein frühes Papillomvirus-Gen kodiertes (Poly)peptid umfaßt. Ferner betrifft die Erfindung ein einen solchen Vektor enthaltendes Vakzinierungs-Mittel und die Verwendung beider.

Description

Vektor zur Aktivierung des Immunsystems gegen mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziierten Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor, der sich zur Aktivierung des Immunsystems gegen mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziierten Zellen eignet, ein einen solchen Vektor enthaltendes Vakzinierungs-Mittel und die Verwendung beider.
Papillomviren infizieren das Epithelgewebe von Mensch und Tier. Human-Papil- lomviren (HPVs) finden sich in benignen, z.B. Warzen, Kondylome im Genitalbereich, und malignen, z. B. Karzinome der Haut und der Gebärmutter, epithelialen Neoplasmen. Auch werden HPVs für die Entwicklung maligner Tumoren des Respirationstrakts in Betracht gezogen. Ferner werden HPVs für die Entwicklung squamöser Karzinome der Lunge als zumindest mitverantwortlich angesehen.
Papillomviren weisen ein ikosaedrisches Capsid ohne Hülle auf, in dem ein zirkuläres, doppelsträngiges DNA-Molekül von etwa 7900 bp vorliegt. Das Capsid umfaßt ein Hauptcapsid-Protein (L1 ) und ein Nebencapsid-Protein (L2).
Ersteres wird durch den offenen Leserahmen L1 (L1 -ORF) und letzteres durch L2-ORF kodiert. L1 oder L1 und L2 führen in vitro zur Ausbildung von Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs). Die Transformationsfähigkeit von Papillomviren wird den Proteinen E6 und E7 zugeschrieben. Diese werden durch E6-ORF bzw. E7-ORF kodiert.
Viele Versuche wurden unternommen, das Immunsystem gegenüber Zellen zu stimulieren, die mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziiert sind. Bisher haben diese Versuche jedoch keine zufriedenstellenden Ergebnisse gebracht.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem das Immunsystem aktiviert werden kann, Zellen, insbesondere Tumorzellen, zu erkennen und auszuschalten, die mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziiert sind. Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Vektor mit einer für ein Fusionspolypeptid kodierenden Nukleinsaure, wobei das Fusionspolypeptid ein strukturelles Papillomvirus-(Poly)peptid und ein nicht-transformierendes, durch ein frühes Papillomvirus-Gen kodiertes (Poly)peptid umfaßt.
Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jeglichen Vektor, der sich für einen Gentransfer, d.h. das Einführen von Nukleinsäuren in Zellen, eignet. Der Vektor kann in den
Zellen episomal verbleiben oder in das Genom integriert werden. Ferner kann der Vektor ein Plasmid- oder ein Virus- Vektor sein. Beispiele eines Virus-Vektors sind retrovirale, Adenovirus-, Vacciniavirus- oder Adeno-assoziierte Virus (AAV)- Vektoren, wobei letztere bevorzugt sind. Ein AAV-Vektor kann in Wildtyp- oder veränderter Form vorliegen. Auch kann er nur solche Sequenzen, wie ITR-Se- quenzen, umfassen, die für seine Transduktionsfähigkeit notwendig sind. Günstig kann es aber auch sein, wenn er zusätzlich solche Sequenzen, wie rep- Sequenzen, umfaßt, die ihm die Integration in das Chromosom 19 ermöglichen. Ein Virus- Vektor kann als Virus-Partikel oder in Form seiner Nukleinsaure vor- liegen. Bevorzugt ist es, wenn der Virus-Vektor replikationsdefekt ist.
Der Ausdruck "Papillomvirus" umfaßt jegliche Papillomviren oder Sequenzen davon, die mit Zellen, insbesondere Tumorzellen assoziiert sein können. Insbesondere können es HPVs und ganz besonders "high risk" HPVs, wie HPV16, 1 8, 33, 35 und 45, sein.
Der Ausdruck "Nukleinsaure" umfaßt jegliche Nukleinsaure, wie DNA und/oder RNA, die für ein Fusionspolypeptid kodiert, das ein strukturelles Papillomvirus- (Poly)peptid und ein nicht-transformierendes, durch ein frühes Papillomvirus-Gen kodiertes (Poly)peptid umfaßt. Günstig ist es, wenn die Nukleinsaure exprimier- bar ist. Besonders günstig ist es, wenn sie unter der Kontrolle eines konstituti- ven oder induzierbaren Promotors, wie eines Gewebe- oder Tumor-spezifischen Promotors steht.
Der Ausdruck "strukturelles Papillomvirus-{Poly)peptid" umfaßt jegliches Peptid bzw. Polypeptid eines Papillomvirus, das für die Struktur des Papillomvirus zumindest mitverantwortlich ist. Insbesondere wird ein solches (Poly)Peptid durch L1 -ORF oder L2-ORF eines Papillomvirus bzw. durch einen Teil dieser kodiert. Besonders bevorzugt ist ein (Poly)peptid, das als VLP vorliegen kann.
Der Ausdruck "ein nicht-transformierendes, durch ein frühes Papillomvirus-Gen kodiertes (Poly)peptid" umfaßt jegliches Peptid bzw. Polypeptid, das durch ein frühes Papillomviurs-Gen, insbesondere E1 -, E2-, E4-, E5-, E6 oder E7-ORF bzw. durch einen Teil dieses kodiert und nicht-transformierend ist. Der Ausdruck "nicht-transformierend" weist darauf hin, daß das (Poly)peptid von Natur aus oder durch ein Eingreifen keine Transformationsfähigkeit besitzt. Ein bevorzugtes (Poly)peptid wird durch E6- oder E7-ORF eines Papillomvirus bzw. durch einen
Teil dieses kodiert.
Der Ausdruck "Fusionspolypeptid" weist darauf hin, daß das strukturelle Papil- lomvirs-(Poly)peptid und das nicht-transformierende, durch ein frühes Papillom- virus-Gen kodierte (Poly)peptid in jeglicher Kombination in dem Fusionspolypeptid vorliegen können. Auch können die einzelnen (Poly)peptide von verschiedenen Papillomviren stammen. Vorzugsweise ist der C-Terminus des strukturellen (Poly)peptids mit dem N-Terminus des nicht-transformierenden (Poly)peptids verbunden. Ferner kann es von Vorteil sein, wenn das nicht-transformierende (Poly)peptid innerhalb des strukturellen (Poly)peptids lokalisiert ist. Ein bevorzugtes Fusionspolypeptid umfaßt ein durch HPV 16 L1 -ORF kodiertes (Poly)pep- tid und ein durch HPV1 6 E6- bzw. E7-ORF kodiertes (Poly)peptid. Ferner wird ein Fusionspolypeptid bevorzugt, das ein durch HPV 1 8 L1 -ORF kodiertes (Poly)ρeptid und ein durch HPV 18 E6- bzw. E7-ORF kodiertes (Poly)Peptid umfaßt.
Zur Herstellung eines vorstehenden Vektors können übliche Verfahren durch- geführt werden. Beispielsweise kann ein AAV-Vektor als Virus-Partikel wie folgt hergestellt werden: An das 3'-Ende des HPV 16 L1 -ORF wird das 5'-Ende des HPV 1 6 E6-ORF ligiert. Zuvor wurde ein Teil des E6-ORF deletiert, wodurch die transformierenden Eigenschaften von E6 zerstört wurden. Das DNA-Fragment L1 -ORF-E6-ORF wird in einen AAV-Vektor inseriert, der die 5'- und 3'-ITR-
Sequenzen von AAV, nicht aber die für die AAV-Rep und -Cap-Proteine kodierenden Sequenzen enthält. Die Insertion erfolgt zwischen den beiden ITR-Se- quenzen. Das DNA-Fragment L1 -ORF-E6-ORF steht unter der Kontrolle eines bezüglich AAV heterologen Promotors. Der erhaltene AAV-Vektor wird in Zellen transfiziert, welche die AAV-Rep und -Cap-Proteine exprimieren. Ferner werden die Zellen mit einem Helfer-Virus, z.B. Adenovirus, infiziert, wodurch der AAV- Vektor als Virus-Partikel erhalten wird.
Mit einem vorstehenden Vektor kann das Immunsystem aktiviert werden, Zellen, insbesondere Tumorzellen, zu erkennen und auszuschalten, die mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziiert sind. Dies kann prophylaktisch und in einer Therapie erreicht werden. Hierzu werden Zellen des betreffenden Organismus, wie Antigen-präsentierende Zellen, z.B. dendritische Zellen, B-Zellen, Makropha- gen und/oder mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziierte Tumorzellen bzw. Prä-Tumorzellen mit dem Vektor transduziert. Die Transduktion kann durch übliche Verfahren erfolgen. Liegt der Vektor als Virus-Partikel vor, ist es günstig, die Zellen mit diesen zu infizieren. Liegt er andererseits als Nukleinsaure, z.B. DNA, vor, ist es angeraten, die Zellen mit dieser zu transfizieren. Als Trans- fektionstechniken sind z.B. Elektroporation, Lipofektion und Partikel-Kanone zu nennen. Die Zellen können in dem Organismus vorliegen. Andererseits können die zu transduzierenden Zellen auch aus dem Organismus isoliert, außerhalb des Organismus transduziert und dann wieder in den Organismus zurückgeführt werden. Solche Zellen werden als autologe Zellen bezeichnet. Des weiteren können hinsichtlich des Organismus auch allogene Zellen zur Transduktion verwendet werden. Hierbei ist es günstig, wenn diese Zellen einem dem Organismus entsprechenden HLA-Typ angehören. Der Fachmann kennt Verfahren, Zellen einen bestimmten HLA-Typ zu verleihen. Weiterhin ist es günstig, wenn bei einem vorstehenden Verfahren die Tumorzellen oder Prä-Tumorzellen vor ihrer Rückführung in den Organismus inaktiviert werden. Hierfür können übliche Verfahren, wie Bestrahlung, durchgeführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vakzinierungs-Mittel, das einen vorstehenden Vektor und übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Verdünnungsmittel, Trägermittel, etc. umfaßt. Günstig kann es sein, wenn das Vakzinierungs-Mittel weitere Substanzen enthält, die das Immunsystem, z.B. gegen Tumorzellen, aktivieren können. Solche Substanzen können insbesondere MHC- 1 -Moleküle, kostimulatorische Moleküle, z.B. B7, und sekretorische Immunsti- mulatoren, z.B. Zytokine, wie IL-2, IL-1 2, Interferon und GM-CSF, sein. Die Substanzen können z.B. in Form von Peptiden, insbesondere synthetischen Pepti- den, vorliegen. Auch können die Substanzen in Form von sie kodierenden Expressionsplasmiden vorliegen, die ferner für HLA-Moleküle kodieren können. Besonders günstig ist es, wenn das Vakzinierungs-Mittel auch die durch den
Vektor transduzierten Zellen enthält. Für die Zellen gelten vorstehende Ausführungen. Handelt es sich um Tumor- oder Prä-Tumorzellen, ist es günstig, wenn die Zellen inaktiviert sind.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, das Immunsystem gegen Zellen zu aktivieren, die mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziiert sind. Diese Zellen können Tumorzellen bzw. Prä-Tumorzellen sein. Die Aktivierung des Immunsystems kann prophylaktisch und in der Therapie erfolgen. Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Schritt dar, über eine in vivo bzw. ex vivo Gentherapie schwerste Erkrankungen zu therapieren.
Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert.
Beispiel: Herstellung eines Vektors, der für ein HPV16 L1-E7 Fusionspoly- peptid kodiert
Von einem genomischen HPV1 6 Klon (vgl. Kirnbauer et al, ( 1 993), 6929-6936) wurde der L1 -ORF durch eine PCR-Reaktion amplifiziert. Hierzu wurden L1 - spezifische Primer verwendet, die am 5'-Ende eine zusätzliche Bgl Il-Restriktions- stelle aufweisen. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit Bgl II gespalten und in die BamHI-Restriktionsstelle des üblichen Vektors pUC 1 9 inseriert. Durch spezifische Mutagenese wurde an der Position 7051 des L1 -ORF eine EcoRV-
Restriktionsstelle, gefolgt von einem Translationsstopcodon (TAA) eingeführt. Damit wurde erreicht, daß der L1 -ORF für ein L1 kodierte, dem die letzten 34 Aminosäuren fehlten.
In einer weiteren PCR-Reaktion wurde jener Teil des E7-ORF von HPV1 6 amplifiziert, der für die ersten 50 Aminosäuren von E7 kodiert. Die verwendeten Primer enthielten an ihrem 5'-Ende eine EcoRV-Restriktionsstelle. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde in die EcoRV-Restriktionsstelle vorstehenden pUC1 9 Vektors inseriert, der für das verkürzte L1 kodiert. Somit wurde ein L1 -E7 Fusionsgen erhalten. Dieses wurde über Xbal/Smal in den üblichen Baculovirus-
Vektor pVL1 392 inseriert. Von diesem wurde das L1 -E7 Fusionsgen durch Notl/Smal herausgeschnitten und in die Notl-Restriktionsstelle des AAV-Vektors pUF2 (vgl. Zolotukhin et al., J. Virol. 70, ( 1 996), 4646-4654) inseriert. Es wurde ein Vektor erhalten, der für ein HPV16 L1 -E7 Fusionspolypeptid kodiert. Virale Partikel des Vektors wurden gemäß üblicher Verfahren erhalten (vgl.
Rolling and Samulski, Molecular Biotechnology 3, ( 1 995), 9-1 5).

Claims

Patentansprüche
1 . Vektor mit einer für ein Fusionspolypeptid kodierenden Nukleinsaure, wobei das Fusionspolypeptid ein strukturelles Papillomvirus-(Poly)peptid und ein nicht-transformierendes, durch ein frühes Papillomvirus-Gen kodiertes (Poly)peptid umfaßt.
2. Vektor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Papillomvirus ein HPV ist.
3. Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das HPV ausge- wählt ist aus HPV 1 6, 1 8, 33, 35 und 45.
4. Vektor nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Virus- oder ein Plasmid-Vektor ist.
5. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Virus-Vektor ein AAV-, retroviraler, Adenovirus- oder Vacciniavirus-Vektor ist.
6. Vektor nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsaure unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors steht.
7. Vektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein Gewebe- oder Tumor-spezifischer Promotor ist.
8. Vektor nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß das strukturelle Papillomvirus-(Poly)peptid durch L1 -ORF bzw. durch einen Teil davon kodiert ist.
9. Vektor nach einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-transformierende, durch ein frühes Papillomvirus-Gen kodierte (Poly)peptid durch E6-ORF oder E7-ORF bzw. durch einen Teil dieser kodiert ist.
10. Vakzinierungs-Mittel, enthaltend den Vektor nach einem der Ansprüche
1 - 9 und übliche Hilfsstoffe.
1 1 . Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß weitere das Immunsystem aktivierende Substanzen vorliegen.
1 2. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 1 0 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor in Zellen vorliegt.
13. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 1 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziierte Tumorzellen und/oder Prä-Tumorzellen sind.
14. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 1 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen und die Prä-Tumorzellen inaktiviert sind.
15. Verwendung des Vektors nach einem der Ansprüche 1 - 9 und des Vakzi- nierungsmittels nach einem der Ansprüche 10 - 14 zur Aktivierung des Immunsystems gegen mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziierten Zellen.
PCT/DE1997/001629 1996-08-02 1997-07-30 Vektor zur aktivierung des immunsystems gegen mit papillomviren bzw. sequenzen davon assoziierten zellen WO1998005790A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97935500A EP0917586A1 (de) 1996-08-02 1997-07-30 Vektor zur aktivierung des immunsystems gegen mit papillomviren bzw. sequenzen davon assoziierten zellen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19631357.0 1996-08-02
DE1996131357 DE19631357A1 (de) 1996-08-02 1996-08-02 Vektor zur Aktivierung des Immunsystems gegen mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziierten Zellen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998005790A1 true WO1998005790A1 (de) 1998-02-12

Family

ID=7801681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE1997/001629 WO1998005790A1 (de) 1996-08-02 1997-07-30 Vektor zur aktivierung des immunsystems gegen mit papillomviren bzw. sequenzen davon assoziierten zellen

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP0917586A1 (de)
DE (1) DE19631357A1 (de)
WO (1) WO1998005790A1 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999055876A2 (de) * 1998-04-30 1999-11-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Polypeptid mit immunogenen eigenschaften und veränderten biologischen funktionen eines proteins
WO2000073335A1 (de) * 1999-06-01 2000-12-07 Medigene Aktiengesellschaft Zytotoxische t-zellepitope des papillomavirus l1-proteins und ihre verwendung in diagnostik und therapie
US6911207B1 (en) 1999-06-01 2005-06-28 Medigene Aktiengesellschaft Cytotoxic T-cell epitopes of the papillomavirus L1-protein and use thereof in diagnostics and therapy

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992016636A1 (en) * 1991-03-14 1992-10-01 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Recombinant virus vectors encoding human papillomavirus proteins
WO1994021808A1 (de) * 1993-03-19 1994-09-29 Boehringer Ingelheim International Gmbh Verfahren zur herstellung von krebsvakzinen
WO1996000583A1 (en) * 1994-06-30 1996-01-11 Merck & Co., Inc. Polynucleotide vaccine for papillomavirus
WO1996011272A2 (de) * 1994-10-07 1996-04-18 Medigene Gesellschaft Für Molekularbiologische Diagnostik, Theraphie Und Technologie Mbh Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4435907C2 (de) * 1994-10-07 1997-07-24 Lutz Prof Dr Gissmann Papillomavirusähnliche Partikel und deren Anwendung
AU4727296A (en) * 1995-02-24 1996-09-11 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992016636A1 (en) * 1991-03-14 1992-10-01 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Recombinant virus vectors encoding human papillomavirus proteins
WO1994021808A1 (de) * 1993-03-19 1994-09-29 Boehringer Ingelheim International Gmbh Verfahren zur herstellung von krebsvakzinen
WO1996000583A1 (en) * 1994-06-30 1996-01-11 Merck & Co., Inc. Polynucleotide vaccine for papillomavirus
WO1996011272A2 (de) * 1994-10-07 1996-04-18 Medigene Gesellschaft Für Molekularbiologische Diagnostik, Theraphie Und Technologie Mbh Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZOLOTUKHIN S. ET AL.: "A 'humanized' green fluorescent protein cDNA adapted for high level expression in mammalian cells.", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 70, no. 7, July 1996 (1996-07-01), pages 4646 - 4654, XP002047302 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999055876A2 (de) * 1998-04-30 1999-11-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Polypeptid mit immunogenen eigenschaften und veränderten biologischen funktionen eines proteins
WO1999055876A3 (de) * 1998-04-30 2000-03-23 Deutsches Krebsforsch Polypeptid mit immunogenen eigenschaften und veränderten biologischen funktionen eines proteins
WO2000073335A1 (de) * 1999-06-01 2000-12-07 Medigene Aktiengesellschaft Zytotoxische t-zellepitope des papillomavirus l1-proteins und ihre verwendung in diagnostik und therapie
US6838084B1 (en) 1999-06-01 2005-01-04 Medigene Aktiengesellschaft Cytotoxic T-cell epitopes of the papilloma virus l1-protein and use thereof in diagnosis and therapy
US6911207B1 (en) 1999-06-01 2005-06-28 Medigene Aktiengesellschaft Cytotoxic T-cell epitopes of the papillomavirus L1-protein and use thereof in diagnostics and therapy

Also Published As

Publication number Publication date
EP0917586A1 (de) 1999-05-26
DE19631357A1 (de) 1998-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69835294T2 (de) Methode zur in vitro auseinander- und wiederzusammensetzung von papillomavirus virusähnlichen teilchen (vlps)
Zhou et al. Expression of vaccinia recombinant HPV 16 L1 and L2 ORF proteins in epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like particles
DE60117550T2 (de) Doppelsträngige parvovirus-vektoren
EP0809700B1 (de) Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung
DE69831741T2 (de) Modifizierte adenovirale fiber und sie enthaltende adenoviren
DE69826661T2 (de) Antitumorale zusammenstellung von immunogene polypetiden mit veränderter zellokalisierung
DE19608753C1 (de) Transduktionssystem und seine Verwendung
DE69531387T2 (de) Von Adenovirus abgeleitete rekombinante Vektoren, für Gentherapie
Sandalon et al. Self-assembly and protein–protein interactions between the SV40 capsid proteins produced in insect cells
DE69634300T2 (de) Gentherapie mit hilfe von schaf-adenoviralen vektoren
DE10066104A1 (de) Wirtszellen zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung
JP2023134441A (ja) 標的蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組み換え微生物に由来する細胞外小嚢及びその用途
EP3875588A1 (de) Gentherapievektor zur behandlung der retinitis-pigmentosa-krankheit
DE69933875T2 (de) Protein-verabreichungssystem, das dem menschlichen papillomavirus ähnliche partikel benützt.
DE102008010954A1 (de) DNA-Vakzine zur Therapie und Prophylaxe von Gebärmutterhalskrebs und seinen prämalignen Vorstufen
WO1998005790A1 (de) Vektor zur aktivierung des immunsystems gegen mit papillomviren bzw. sequenzen davon assoziierten zellen
EP1270586A2 (de) Zusammensetzung zum zellspezifischen Transfer von Wirkstoffen
DE4435907C2 (de) Papillomavirusähnliche Partikel und deren Anwendung
DE10059631A1 (de) T-Zellepitope des Papillomavirus L1-und E7-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
DE10055545A1 (de) Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen
EP0354440A1 (de) Humaner Papillomvirus Typ 57, seine DNA und die davon kodierten Proteine
DE19644500C2 (de) AAV-DNA mit Helfervirus-Sequenzen
KR100497289B1 (ko) 바이러스 유사 입자 내부에 외래 유전자를 함유하는유전자 수송체
DE19526752C2 (de) Hocheffiziente Bildung von Papillomavirusähnlichen Partikeln
WO2000065075A1 (de) Verwendung von coxsackieviren zur verbesserung der transfektion von zellen

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1997935500

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09230929

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1997935500

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 1998507479

Format of ref document f/p: F

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1997935500

Country of ref document: EP