WO2000073335A1 - Zytotoxische t-zellepitope des papillomavirus l1-proteins und ihre verwendung in diagnostik und therapie - Google Patents

Zytotoxische t-zellepitope des papillomavirus l1-proteins und ihre verwendung in diagnostik und therapie Download PDF

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WO2000073335A1
WO2000073335A1 PCT/EP2000/005006 EP0005006W WO0073335A1 WO 2000073335 A1 WO2000073335 A1 WO 2000073335A1 EP 0005006 W EP0005006 W EP 0005006W WO 0073335 A1 WO0073335 A1 WO 0073335A1
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cells
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cell epitope
complex
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Ingrid Jochmus
John Nieland
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Medigene Aktiengesellschaft
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a papillomavirus T cell epitope with an amino acid sequence ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVPVTYP, YL
  • ICWGNQLFV ICWGNQLFV
  • FYNPDTQRL MHGDTPTLH
  • ETTDLYCY QAEPDRAHYN
  • SMVTSDAQI SMVTSDAQI
  • the papilloma viruses also called wart viruses, are double-stranded DNA viruses with a genome size of about 8000 base pairs and an icosahedral capsid with a diameter of approx. 55 nra.
  • HPV human pathogenic papilloma virus
  • the genome of the papillomaviruses can be divided into three areas:
  • the first area concerns a non-coding region that contains regulatory elements for the transcription and replication of the virus.
  • the second region so-called E (early) region, contains various protein-coding sections E1-E7, of which, for example, the E6 and E7 proteins are responsible for the transformation of epithelial cells and the E1 protein controls the DNA copy number.
  • the E6 and E7 regions are so-called oncogenes that are also malignant degenerate cells are expressed.
  • the third region also called the L (late) region, contains two protein-coding sections L1 and L2 which code for structural components of the virus capsid.
  • L1 protein is understood to mean the main capsid protein of the papillomaviruses (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445).
  • HPV-16 has been linked to cervical cancer (cervical cancer).
  • HPV-16 is the main risk factor for the formation of cervical neoplasia.
  • the immune system plays an important role in the progression of the disease. Cellular immune responses and, in particular, antigen-specific T lymphocytes are probably important for the defense mechanism. It was also found that in highly malignant cervical intra-epithelial neoplasia (CIN II / III) and cervical tumors, the E7 gene is constitutively expressed in all layers of the infected epithelium. Therefore, the E7 protein in particular is regarded as a potential tumor antigen and as a target molecule for activated T cells (see e.g. WO 93/20844). However, the E7-induced cellular immune response in the patient does not appear to be strong enough to influence the course of the disease. The immune response may be boosted by appropriate vaccines.
  • capsomers are understood to be an oligomeric configuration that is made up of five Ll proteins.
  • the capsomer is the basic building block from which viral capsids are built.
  • Stable capsomers are capsomers that are unable to form capsids.
  • Capsids are the shell of the papillomavirus, which is composed, for example, of 72 capsomers (Baker T et al (1991) Biophys J 60, 1445)
  • VLP is a capsid which morphologically and in its antigenicity resembles an intact virus.
  • the VLPs were able to trigger a humoral immune response, which is characterized by the formation of neutralizing antibodies, can be used in various deep systems.
  • the formation of virus-neutralizing antibodies against L1 and / or L2 proteins is of less clinical importance, however, if the virus infection has already occurred, since virus is responsible for the infection -fected cells, not antibodies, but a virus-specific cytotoxic T-cell (CTL) response seems to be necessary.
  • CTL virus-specific cytotoxic T-cell
  • CVLPs for chime ⁇ c virus-like particles
  • CVLPs are therefore of interest both for the development of a vaccine and for the treatment of already existing infections and resulting tumors, since they are presented via class I MHC molecules E7 peptides of tumor cells were the target molecules of cytotoxic T cells
  • a vaccine consisting of CVLPs prevents the pseudoinfection of the
  • CVLPs Underlying cells by the CVLPs This means that the CVLPs enter the cell like viruses, where they are processed into peptides, the peptides are then processed on MHC Class I and II molecules are loaded and ultimately presented with CD8 or CD4 positive T cells.
  • CD8 cells can differentiate into cytotoxic T cells and then cause a cellular immune response
  • CD4 cells develop to T helper cells and stimulate B cells to a humoral or CD8-positive T cells to a cytotoxic immune response and can even induce the lysis of infected cells
  • Small peptides can already bind to MHC class I molecules on the cell surface and then stimulate CDS- or CD4-pos ⁇ t ⁇ ⁇ e cells to a cellular immune response without further processing.
  • a certain peptide can only be bound by certain MHC molecules Polymorphism of the MHC molecules in natural populations can therefore only bind and present a certain peptide by a small part of a population.
  • Presentation in the sense of the present invention means when a peptide or protein fragment binds to an MHC molecule, whereby this binding can take place, for example, in the endoplasmic reticulum, in the extracellular space, the endosomes, proendosomes, lysosomes or protysosomes, and when this MHC-molecule-peptide complex is then bound to the extracellular side of the cell membrane, so that it is bound by immune cells can be specifically recognized
  • CVLPs Since CVLPs trigger both a cellular and humoral immune response and are not MHC-resisting, this technology is generally suitable for the development of vaccines in that the ability to form particles is provided by an Ll component and an additional antigen component in this Ll Share is merged
  • a functional test system that can be used to directly test the immunogenicity of CVLPs.
  • Such a test system should have the property that CVLPs with different antigen contents can be examined with the same test system. Since the cellular immune response is of crucial importance for immunological therapy methods of tumors or viral diseases, the task was to make the cellular immune response caused by CVLPs measurable.
  • T cell epitopes which, in conjunction with MHC molecules, in a special embodiment with HLA A2.01 MHC molecules, trigger a cytotoxic T cell response in vivo and in vitro, for example.
  • These peptides preferably have the sequence ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLWDQDQF, ICDLQDQHQ, YDLWDQDQF.
  • sequences are part of the Ll and E7 peptides of HPV16.
  • Ll 86-94 amino acid ranges Ll 86-94 (5104), Ll 123-131 (5106), Ll 285-293 (5107), Ll 275-283 (5108), Ll 238-246 (5109), Ll 426-434 (5112 ), Ll 28-39 (2016).
  • the names of the respective epitopes are given in brackets.
  • T cells which recognize a peptide do not necessarily also recognize cells which contain whole proteins - containing the corresponding peptide - were loaded.
  • peptides often contain protease interfaces, within which the peptides are cut during the processing of the whole proteins in the cell and thus destroyed and thus can no longer be recognized by T cells. This problem is described, for example, in Feltkamp et al. (1993), Eur. J. Immunol. 23: 2242-2249 confirmed.
  • the present invention therefore relates to a T-cell epitope having an amino acid sequence ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN, SMVTSDAQI, and / or a functionally active variant of it.
  • ILVPKVSGL Under a functionally active variant of ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL,
  • SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN or SMVTSDAQizit see for example a T-System-Ep ) one, on the cytotoxicity of ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN or SMVTSDAQI measured cytotoxicity has the minde- least the sum from the mean of the negative controls and three times Standard deviation corresponds, preferably of at least approximately 30%,
  • a preferred variant is for example a T-cell epitope with a sequence homology to ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN or SMVTSDAQI of minde - at least about 65%, preferably at least about 75% and in particular at least about 85% at the amino acid level.
  • Other preferred variants are also T cell epitopes which have a structural homology to ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL,
  • Such epitopes can be found by counteracting the T cell epitopes ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL,
  • T cell epitopes are understood to mean cytotoxic T cell epitopes.
  • non-cytotoxic T cells are also known which can also recognize MHC I molecules, so that non-cytotoxic T cell epitopes are also included as a variant of the present invention.
  • Another embodiment of the present invention is a T cell epitope that is part of a compound, the compound being not a naturally occurring Ll protein of a papilloma virus and not an exclusively N-terminal or exclusively C-terminal deletion mutant of a naturally occurring Ll protein of a papilloma virus .
  • Such a compound of the invention may have the ability to form CVLPs.
  • the T cell epitope mentioned as part of a compound can be a polypeptide which preferably contains further amino acid sequences, in particular a fusion protein.
  • the compound can be a polypeptide of at least approximately 50 amino acids, preferably of at least approximately 35 amino acids, in particular of at least approximately 20 amino acids, and in a particularly preferred manner of at least approximately 9-12 amino acids in length.
  • the compound In order to detect the compound or to modify its binding activity to T cells, it can contain a chemical, radioactive isotope, non-radioactive isotope, and / or fluorescent label of the T cell epitope and / or of the fusion protein mentioned.
  • chemical substances known to the person skilled in the art which are suitable for a chemical labeling according to the invention are: biotin, FITC (fluorescein isothiocyanate) or streptavidin.
  • a possible embodiment is that a peptide is modified such that it contains at least one lysine.
  • Biotin or FITC fluorescein isothiocyanate
  • a peptide modified in this way is bound to a corresponding MHC molecule or to a cell with corresponding MHC molecules.
  • the peptide can then be detected via labeled avidin or streptavidin or directly via the fluorescence of the FITC.
  • isotopes known to the person skilled in the art which are suitable for radioactive isotope labeling according to the invention are: ⁇ , 1 J, 131 I, 32 P, 33 P or
  • fluorescent substances known to the person skilled in the art which are suitable for a fluorescent label according to the invention are: ⁇ u, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phaldehyde or fluorescamine.
  • Polypeptides according to the invention with an amino acid length of approximately 50 can be produced, for example, by chemical peptide synthesis. Longer polypeptides are preferably genetically engineered.
  • Another object of the present invention is therefore a nucleic acid construct for the expression of said T cell epitope or of the compounds, which contains the following components: (a) at least one regulatory element and (b) at least one nucleic acid which is necessary for an amino acid sequence of encoded connection according to the invention.
  • Said nucleic acid construct is preferably made of DNA or RNA.
  • Suitable regulatory elements allow, for example, the constitutive, regulatable, tissue-specific, cell cycle-specific or metabolically specific expression in eukaryotic cells or the constitutive, metabolically specific or regulatable expression in prokaryotic cells.
  • Regulable elements according to the present invention are promoters, activator sequences, enhancers, silencers, and or repressor sequences.
  • Suitable regulatable elements which enable constitutive expression in eukaryotes are promoters which are recognized by RNA polymerase III or viral promoters such as CMV enhancers, CMV promoters, SV40 promoters and viral promoter and activator sequences derived from, for example, HBV , HCV, HSV, HPV, EBV HTLV or HIV.
  • controllable elements which enable controllable expression in eukaryotes are the tetracycline operator in combination with a corresponding repressor (Gossen M. et al (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
  • regulatable elements which enable tissue-specific expression in eukaryotes are promoters or activator sequences from promoters or enhancers of those genes which code for proteins which are only expressed in certain cell types.
  • controllable elements which enable cell cycle-specific expression in eukaryotes are the promoters of the following genes: cdc25C, cyclin A, cyclin E, cdc2, E2F, B-myb or DHFR (Zwicker J. and Müller R. (1997) Trends Genet 13, 3-6).
  • the nucleic acid can be present as a plasmid, as part of a viral or non-viral vector.
  • Another object of the present invention is therefore a vector, in particular an expression vector, which contains a nucleic acid coding for a polypeptide according to the invention.
  • viral vectors baculoviruses, vaccinia viruses, adenoviruses, adeno-associated viruses and herpes viruses.
  • non-viral vectors virosomes, liposomes, cationic lipids, or poly-lysine-conjugated DNA.
  • Another object of the present invention is a cell that contains at least one T cell epitope, preferably presented.
  • the cell is transfected by one of the vectors mentioned, transformed or infected This cell expresses the polypeptide according to the invention under conditions known to the person skilled in the art which lead to the activation of the regulatable elements used in each case.
  • polypeptide can then be isolated from this cell and, for example, purified using one of the abovementioned labels for genetic engineering production and subsequent purification of the exposed compounds according to the invention are suitable for prokaryotic and eukaryotic cells, in particular bacterial cells such as E co, yeast cells such as S cerevisiae, insect cells such as Spodoptera frugiperda cells (Sf-9) or T ⁇ choplusia ni cells or sucker cells such as for example COS cells or HeLa cells
  • bacterial cells such as E co
  • yeast cells such as S cerevisiae
  • insect cells such as Spodoptera frugiperda cells (Sf-9) or T ⁇ choplusia ni cells
  • sucker cells such as for example COS cells or HeLa cells
  • a preferred embodiment is to use the cell itself which expresses the polypeptide according to the invention, in a particularly preferred embodiment the cell presenting parts of the polypeptide according to the invention via MHC-1 molecules on the cell surface.
  • Antigens are used to produce a cell according to the invention -Presenting cells such as B cells, macrophages, dend ⁇ tica cells, fibroblasts or other HLA A2 01 positive cells, in a preferred embodiment JY-, T2, CaSki cells or EBV-transformed B cells, suitable.
  • the cells according to the invention, the one Presenting polypeptide containing a T cell epitope can be used as target cells for restimulating immune cells, in particular T cells and / or for measuring the activation of T cells.
  • Target cell in the sense of the present invention is to be understood as a cell that presents a T cell epitope via MHC molecules and thus specifically one T cell activation causes, especially a cytotoxic T cell response against the cell
  • the compound containing a T-cell epitope can be part of a complex which is characterized in that the compound is covalent or via hydrophobic interactions, ionic bonding or hydrogen bonding is connected to at least one further species such as peptides, proteins, peptoids, linear or branched oligo- or polysaccharides and nucleic acids.
  • the present invention therefore relates to a complex containing a T cell epitope or a compound and at least one further compound.
  • a preferred embodiment is that the polypeptide is present in connection with MHC class I molecules, preferably as HLA A2.01 tetramer. Human MHC class I molecules are particularly preferred.
  • HLA A2.01 tetramers can be prepared with the corresponding bound peptides, which are able to bind to the T cell receptors of peptide-specific cytotoxic T cells.
  • a further embodiment is the immobilization of the compound according to the invention or of the complex mentioned on support materials.
  • Suitable carrier materials are, for example, ceramic, metal, in particular noble metal, glasses, plastics, crystalline materials or thin layers of the carrier, in particular the materials mentioned, or (bio) molecular filaments such as cellulose or framework proteins.
  • a component of the complex can additionally contain a protein tag.
  • Protein tags according to the invention allow, for example, high affinity absorption to a matrix, stringent washing with suitable buffers without eluting the complex to any appreciable extent, and subsequent targeted elution of the absorbed complex.
  • Examples of protein tags known to the person skilled in the art are a (HIS) 6 tag, a Myc tag, a FLAG tag, a hemaglutenin tag, glutathione transferase (GST) tag, intein with an affinity chitin binding Tag or maltose binding protein (MBP) Tag
  • the protein tags according to the invention can be N-, C-terminal, and / or internal
  • Another object of the present invention is a method for in vitro detection of the activation of T cells by at least one compound containing a T cell epitope.
  • Such a method preferably consists of three steps a) In a first step, cells with at least of a compound containing a T-cell epitope stimulated
  • This compound can contain at least one compound according to the invention containing a T-cell epitope, at least one complex according to the invention containing a T-cell epitope, at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one VLP,
  • immune cells are stimulated by incubation with CVLPs.
  • Immune cells stimulated in this way are, for example, after a Vaccination or in a tumor patient nten obtained from the blood, from tumors or from lymph nodes, and / or cultured b)
  • T cells The activation of T cells is determined in a third step.
  • Methods suitable for this include, for example, the detection of the production or secretion of cytokines by the T cells, the expression of sion of surface molecules on T cells, the lysis of target cells or the proliferation of cells. Suitable methods for this are, for example, a cytokine assay (Chapter 6.2 to 6.24 in Current Protocols in Immunology (1999), edited by Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM and Strober W., John Wiley & Sons), ELISPOT
  • immune cells such as cytotoxic T-cells, T-helper cells, B-
  • Cells, NK cells and other cells can be distinguished.
  • the use of compounds, complexes and / or cells according to the invention which contain markings according to the invention allows the detection of T cells which recognize the T cell epitope by detecting the binding of labeled compounds, complexes and or cells the T-
  • the binding of MHC-polypeptide complexes according to the invention to the surface of the T cells is detected.
  • This can be carried out in such a way that the MHC complexes themselves are labeled, for example fluorescence-labeled, or that in a further step an MHC-specific, labeled, for example fluorescence-labeled antibody is used in order to in turn detect the MHC complexes.
  • the fluorescence labeling of the T cells can then be measured and evaluated, for example, in a ' Fluorescens Activated Cell Sorter ' (FACS).
  • FACS Fluorescens Activated Cell Sorter '
  • the present invention also relates to a method which contains an additional step a ') which is introduced after step a).
  • the isolated or cultured cells are loaded with at least one target cell with a compound according to the invention containing a T cell epitope, at least one complex according to the invention containing a T cell epitope, at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one VLP, at least one CVLP and or at least one virus, with at least one complex according to the invention containing a T cell epitope, and / or at least one target cell, the one
  • T cell epitope presented co-cultivated for at least about 8 weeks, in particular for at least about 1 week, before step b) follows.
  • Another object of the present invention is a method for producing a target cell presenting a T cell epitope. It is possible to do this Load target cell with combinations of different T cell epitopes.
  • the target cell is incubated with at least one compound containing a T cell epitope and / or at least one complex containing a T cell epitope.
  • the target cell is incubated in growth medium which contains polypeptides according to the invention or with MHC class I complexes with bound polypeptides according to the invention.
  • the MHC class I complexes can be present, for example, as HLA A2.01 tetramers. A tetramer usually binds four peptides.
  • the target cell is transfected, transformed and / or infected with a nucleic acid and or a vector.
  • the target cell is infected with a vaccinia virus vector.
  • the method according to the invention is carried out with antigen-presenting cells, for example with B cells, macrophages, dendritic cells, embryonic cells or fibroblasts or other HLA A2.01 positive cells, in a preferred embodiment with JY, T2, CaSki cells or EBV cells. transformed B cell lines performed.
  • the CVLPs used contain a Papillomavirus L1 protein or variants thereof, in particular HPV16 L1 protein and, but not necessarily, a protein heterologous to L1 or variants thereof.
  • the two proteins can be bound directly or indirectly.
  • directly bound means that there is a covalent bond between the two proteins, for example a peptide bond or a disulfide bond.
  • Bound indirectly means that the proteins are bound via non-covalent bonds, for example hydrophobic interactions, ionic bonds or hydrogen bonds.
  • the CVLPs contain a papilloma virus L2 protein in addition to Ll protein or variants thereof.
  • a preferred embodiment of the L1 protein of the present invention are, for example, L1 proteins with one or more deletions, in particular a C-terminal deletion.
  • a C-terminal deletion has the advantage that the efficiency of the formation of virus-like particles can be increased since the nuclear location signal located at the C-terminus is deleted.
  • the C-terminal deletion is therefore preferably up to approximately 35 amino acids, in particular approximately 25 to approximately 35 amino acids, especially approximately 32 to approximately 34 amino acids.
  • a 32-amino acid long C-terminal Deletion of the HPY16 Ll protein sufficient to be able to increase the formation of virus-like particles by at least about ten-fold.
  • the Ll protein can carry one or more mutations or the Ll portion can be composed of Ll proteins from various papillomaviruses his common characteristic of the L1 proteins according to the invention is that they prevent the formation of VLPs or w Allow CVLPs and that they contain at least one T cell epitope according to the invention
  • the L1 protein or variants thereof and the protein heterologous to L1 is a fusion protein.
  • heterologous proteins which are composed of several different proteins or parts thereof.
  • epitopes in particular cytotoxic T- Cell epitopes of proteins being epitopes in the sense of the invention can also be part of a synthetic polypeptide with a length of approx. 50 amino acids, preferably of at least approx. 35 amino acids, in particular of at least approx. 20 amino acids and in a particularly preferred manner of at least approx. 9 amino acids
  • proteins which are heterologous to L1 and which are derived from a viral protein for example derived from HIV, HBV or HCV, preferably from papillomaviruses, in particular from human papillomaviruses
  • this is an E protein of a papilloma virus, preferably an E6 and / or E7 protein.
  • the E protein is a deleted E protein, preferably a C-terminally deleted, in particular a C-terminally deleted E7 protein, since these constructs in connection with deleted L1 protein preferably virus-like particles can train.
  • Deletions of up to 55 amino acids are particularly preferred, preferably approximately 5 to approximately 55 amino acids, in particular approximately 38 to approximately 55 amino acids.
  • the protein heterologous to L1 can be derived from antigens that are not viral pathogens. They can also be derived from autoimmune antigens such as thyroglobulin, myelin basic protein or zona pellucida glycoprotein 3 (ZP 3 ), which are associated with certain autoimmune diseases such as thyroiditis, multiple sclerosis, oophoritis or rheumatoid arthritis.
  • autoimmune antigens such as thyroglobulin, myelin basic protein or zona pellucida glycoprotein 3 (ZP 3 ), which are associated with certain autoimmune diseases such as thyroiditis, multiple sclerosis, oophoritis or rheumatoid arthritis.
  • the protein heterologous to L1 is derived from tumor antigens, preferably melanoma antigens such as MART, ovarian carcinoma antigens such as Her2 new (c-erbB2), BCRA-1 or CA125, colon carcinoma antigens such as CA125 or breast carcinoma antigens such as Her2 new (c- erbB2), BCRA-1, BCRA-2.
  • tumor antigens preferably melanoma antigens such as MART, ovarian carcinoma antigens such as Her2 new (c-erbB2), BCRA-1 or CA125, colon carcinoma antigens such as CA125 or breast carcinoma antigens such as Her2 new (c- erbB2), BCRA-1, BCRA-2.
  • Another object of this invention is a method for the in vitro detection of the activation of T cells, which are obtained by preparation from samples.
  • This method makes it possible to determine whether papillomavirus L1 protein-specific cytotoxic T cells are present in a sample, for example a blood sample from a patient or in tumors or lymph nodes of a tumor patient.
  • a detection method contains the following steps: a ") In a first step, cells are obtained, for example by drawing blood from a patient or by preparing, for example from tumors or lymph nodes. The cells are then taken up in growth medium and cultured. b) In a second step, cells are incubated with at least one target cell which presents a T cell epitope or with at least one complex which comprises as a component a compound containing a T cell epitope.
  • a third step the activation of T cells is determined.
  • Suitable methods for this are, for example, the detection of the production or secretion of cytokines by the T cells, the expression of surface molecules on T cells. the lysis of target cells or the proliferation of cells. Methods suitable for this are, for example, a cytokine assay (Chapter 6.2 to 6.24 in Current Protocols in Immunology (1999), edited by Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM and Strober W., John Wiley & Sons), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), a 3 i Cr release test
  • the present invention also relates to a method which contains an additional step a '), which is introduced after step a ").
  • additional step a ' following step a"), the isolated or cultured cells are included at least one target cell loaded with a compound according to the invention containing a T cell epitope, at least one complex according to the invention containing a T cell
  • Cell epitope at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one VLP, at least one CVLP and / or at least one virus, with at least one complex according to the invention containing a T cell epitope, and / or at least one target cell which contains a T Cell epitope presented, co-cultivated for at least about 8 weeks, in particular for at least about 1 week, before step b) follows.
  • Epitope at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one VLP, at least one CVLP, and / or at least one virus, (n) in the presence of at least one complex according to the invention containing a T cell epitope,
  • Another object of the invention is a test system (kit) for the in vitro detection of the activation of T cells containing a) at least one T cell epitope according to the invention, at least one compound according to the invention, at least one vector according to the invention, at least one cell according to the invention, and / or at least one complex according to the invention, and b) effector cells of the immune system, preferably T cells, in particular cytotoxic T cells or T helper cells
  • the test system is used in a special embodiment for determining the L-protein-specific cytotoxic T cells present, for example in a patient's blood sample or in tumors or lymph nodes of a tumor patient.
  • the cells described in b) are contained in the test system Control cells, the activation of which by the first kit component, the substances mentioned under a), serves as standard. The activation observed in this reaction is compared with the T-cell activation of cells isolated from patients by the kit component a)
  • the test system is used, for example, to determine the L1 protein-specific antigenicity of a compound containing a T cell epitope, a complex containing a T cell epitope Capsomers, a stable capsomer, a VLP, a CVLP, and / or a virus.
  • the substances described in a) are control substances whose activating effect on the second kit component, the cells mentioned under b), serves as the standard.
  • the activation observed in this reaction is associated with the activating effect of a compound containing a T cell epitope, a complex containing a T cell epitope, a capsomer, a stable capsomer, a VLP, a CVLP, and / or a virus the kit component b) compared.
  • Another object of the invention is the use of at least one T cell epitope, at least one compound according to the invention containing a T cell epitope, at least one vector according to the invention containing a nucleic acid coding for a compound containing a T cell epitope, at least one cell according to the invention containing a T cell epitope for, and / or at least one complex according to the invention containing a T cell epitope for triggering or for detecting an immune response.
  • Cells which present at least one of the molecules according to the invention via their MHC class I molecules are particularly suitable for stimulating immune cells in vitro and in vivo.
  • Suitable cells for antigen presentation are e.g. B. B cells, dendritic cells, macrophages, fibroblasts or other HLA A2.01 positive cells, which can stimulate specific T cells by joint cultivation with immune cells.
  • a compound according to the invention for example an HPV18 L1E7 fusion protein, which additionally contains a T cell epitope according to the invention, can be used to detect an immune response.
  • a compound of the invention may have the ability to form CVLPs.
  • Another object of the invention is a medicament or diagnostic agent containing at least one compound according to the invention containing a T cell epitope, at least one vector containing a nucleic acid coding for a compound containing a T cell epitope, at least one cell according to the invention containing a T cell Epitope, and / or at least one complex according to the invention containing a T cell epitope and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
  • supports known to those skilled in the art are glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, amylase, natural or modified cellulose, polyacrylamides, agarose, aluminum hydroxide or magnitide.
  • a medicament or diagnostic agent according to the invention can be present in solution, bound to a solid matrix, and / or an adjuvant can be added.
  • the drug or diagnostic agent can be administered in various ways. Examples of administration forms known to the person skilled in the art are parenteral, local and / or systemic administration by, for example.
  • the preferred form of application is influenced, for example, by the natural route of infection of the respective papillomavirus infection.
  • the amount administered depends on the age, weight, general health of the patient and the type of papillomavirus infection.
  • the medicament or diagnostic agent can be administered in the form of capsules, solution, suspension, elixir (for oral administration) or sterile solutions or suspensions (for parenteral or intranasal administration).
  • saline or phosphate-buffered saline can be used as the inert and immunologically acceptable carrier.
  • the drug is administered in therapeutically effective amounts. This means amounts sufficient to elicit a protective immunological response.
  • a compound according to the invention for example an HPV18 L1E7 fusion protein, which additionally contains a T cell epitope according to the invention, can be used as a medicament or diagnostic agent.
  • a compound of the invention may have the ability to form CVLPs.
  • FIG. 1 shows the graphical evaluation of the MTT staining of WEHI cell lysates, measured as absorption at 595 nm, which had been incubated with supernatants from T cells, which in turn were stimulated by different antigen-presenting peripheral blood lymphocytes (PBL) were.
  • T cells stimulated by specific antigen-presenting PBL secrete TNF. This induces apoptosis in WEHI cells, so that these cells can no longer process MTT into a brownish dye.
  • Low absorption means low dye production and thus many apoptotic cells, which were thus exposed to a lot of TNF ⁇ , so that the associated T cells had been stimulated.
  • the lower the absorption for a particular antigen at 595 nm the better the stimulation of the T cells.
  • FIG. 2 shows the graphical evaluation of the fluorescence of T2 cells - measured in a FACS analysis - whose MHC-1 molecules on the cell surface had been labeled by a FITC-labeled antibody.
  • Cell len whose MHC-1 molecules can specifically bind the peptides plotted on the X axis, have increased MHC-1 molecules, since the specific binding stabilizes the MHC complexes so that they can accumulate on the cell surface.
  • FIG. 3 shows the evaluation of three FACScan experiments after restimulation of CVLP-specific human T cells with peripheral blood mononuclear cells (PBMC), which present different antigens.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 4 shows the evaluation of FACScan experiments after restimulation of specific human T cells from an HLA AI positive donor with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which present different antigens.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the name of the respective peptide with which the PBMC was loaded is plotted from left to right. "None” stands for PBMC, which were only incubated with buffer.
  • the proportion of CD8-positive T cells which were classified as reactive on the basis of interferon ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • FIG. 5 shows the evaluation of FACScan experiments after restimulation of specific human T cells from a non-HLA-typed donor with peripheral blood mononuclear cells (PBMC), which present different antigens.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the name of the respective peptide with which the PBMC was loaded is plotted from left to right. "None” stands for PBMC, which were only incubated with buffer.
  • the proportion of CD4-positive T cells which were classified as reactive on the basis of interferon ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • FIG. 6 shows the evaluation of FACScan experiments after restimulation of specific human T cells from an HLA AI positive donor with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which present different antigens.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 7 shows the evaluation of FACScan experiments after restimulation of specific human T cells from an HLA A24 positive donor with peripheral blood mononuclear cells (BLCL), which present different antigens.
  • BLCL peripheral blood mononuclear cells
  • the ratio of the effector cells used to the target cells used is plotted on the X axis, and the% of the specifically lysed target cells, determined by the release of 51 Cr from the target cells, is plotted on the Y axis.
  • The% values were calculated using the formula given in Example 7. Examples
  • T2 cells which can be obtained under the ATCC number: CRL-1992, have a defect in the antigen processing-associated transport which leads to
  • MHC-1 molecules Prevents the loading of MHC-1 molecules in the endoplasmic reticulum.
  • the unloaded MHC-1 molecules still present on the cell surface can be loaded, for example, by incubating the cells in peptide-containing media, so that these cells are very well suited for the presentation of an antigen.
  • PMBC peripheral blood mononuclear cells, the isolation of which is described, for example, in Rudolf MP. et al. (1999), Biol. Chem. 380, 335-40.
  • BLCL means a B cell line transformed with the help of the Epstein-Barr virus (obtained from Dr. Andreas Kaufmann, Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany).
  • BB7.2 means an ⁇ -HLA A2.01-specific monoclonal mouse antibody (ATCC HB-82).
  • ⁇ -hum CD28 means a monoclonal mouse antibody which is directed against the extracellular part of human CD28.
  • ⁇ -hum CD3 / PE means a monoclonal mouse antibody that is directed against the extracellular part of human CD3 ( ⁇ ) and contains the fluorescent marker phycoerithrin (Medac, Hamburg, Germany).
  • ⁇ -hum CD4 / Cychrome means a monoclonal mouse antibody which is directed against the extracellular part of human CD4 and which contains the fluorescence marker cychrome (DAKO; Glostrup, Denmark).
  • ⁇ -hum interferon ⁇ / FITC means a monoclonal antibody which is directed against human interferon ⁇ and contains the fluorescent marker FITC (Medac, Hamburg, Germany).
  • ⁇ -hum CD8 / PE means a monoclonal mouse antibody which is directed against the extracellular part of human CD8 and contains the fluorescence marker phycoerithrin (Pharmingen, Heidelberg, Germany).
  • InfluenzaMP means amino acids 58-66 GILGFVFTL of the influenza matrix protein (see Dunbar P.R. et al. (1998) Curr. Biol. 26, 413-6).
  • HPV16E7 peptide means amino acids 11-20 YMLDLQPETT of the human papillomavirus E7 protein.
  • MTT solution in PBS means 2.5 mg / ml of 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide in PBS (Sigma, Deisenhofen, Germany).
  • PBS means “phosphate buffered saline” and consists of 16.6 mM Na 2 HPO 8.4 mM NaH 2 PO 4 , 150 mM NaCl pH 7.4. • Cells were each in 37 ° C. and 5% CO 2 in RPMI -Medium (Gibco BRL, Eggenstein; Germany) cultivated with 10% fetal calf serum, kanamycin and ampicillin.
  • Human T cells (4 ⁇ l0 5 ) from an HLA A2.01 positive donor were cured for 8 weeks with HPV 16 Ll ⁇ C * E7 ⁇ _ 5 5 CVLPs at 37 ° C with weekly addition of 1 ⁇ g / ml CVLPs, 10 irradiated peripheral blood mononuclear cells ( PMBC) and 10 IU / ml IL-2 stimulated and harvested.
  • PMBC peripheral blood mononuclear cells
  • Fig. 1 shows the different antigens plotted against the measured absorption at 595 nm.
  • Low absorption means low dye production and thus many apoptotic cells, which were thus exposed to a lot of TNF ⁇ , so that the associated T cells had been stimulated.
  • the lower the absorption at 595 nm the better the stimulation of the T cells.
  • the peptides 5104, 5106, 5107, 5108, 5109 and 51 12 were able to stimulate CVLP-specific T cells.
  • T2 cells 2.5 ⁇ 10 6 T2 cells from an HLA A2.01 positive donor were carried out overnight in medium containing 2% human serum in the presence of 0, 10 or 100 ⁇ g / ml 5105, 5106, 5107, 5109 , 5112, 5113, InfluenzaMP, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021, 2022, 2023, 2024, 2025 peptide incubated at 37 ° C.
  • suitable peptides can bind to the unphysiologically empty MHC-1 molecules and thus stabilize them, whereas MHC-1 molecules without suitable peptides are absorbed back into the cell relatively quickly.
  • specifically binding peptides increase the number of MHC-1 molecules on the cell surface.
  • the cells were harvested, washed with PBS containing 0.5% bovine serum albumin (BSA) and the MHC-1 molecules demonstrated. This is done by incubating for 30 min on ice with the BB7.2 antibody, washing and staining with an ⁇ -mouse FITC antibody for a further 30 min on ice. The cells were washed again, measured in a FACScan calibur and analyzed with Cellquest software.
  • BSA bovine serum albumin
  • T2 cells after incubation with the Ll peptides 5106, 5107, 5109, 51 12, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020 and 2022 show, as after incubation with the known influenza peptide MP, significantly more MHC molecules on the Cell surface, which indicates a binding of the corresponding peptides to the MHC molecules.
  • Human T cells (4 ⁇ l0 5 ) from an HLA A2.01 positive donor were irradiated for 8 weeks with HPV16 L1 ⁇ C * E7 I -55 CVLPS at 37 ° C with weekly addition of 1 ⁇ g ml CVLPs and 10 5 antigen-presenting cells (irradiated PMBC) stimulated and harvested. The cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C.
  • FIG. 3 shows that the CVLP-incubated PBMC, like the PBMC incubated with the L1 peptide 2022, caused restimulation of CVLP-stimulated T cells, but not the PBMC incubated with the control peptide.
  • Human T cells (4x10 " ⁇ ) of an HLA AI positive donor were for 5 weeks with HPV 16L 1 ⁇ C * E7 I _ 55 CVLPs at 37 ° C with weekly addition of 1 ⁇ g / ml CVLPs and 10 5 antigen-presenting cells ( irradiated PMBC) and the cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with 10 ⁇ g / ml of the peptides indicated on the X axis of FIG. 4 in the presence of 10 IU / ml IL2 as a negative control served only cells incubated with buffer.
  • FIG. 4 shows that the PBMC incubated with peptides 43, 47 and 48 caused restimulation of CVLP-stimulated T cells, but not the PBMC incubated with the native peptides.
  • Peptide 43 contains the 9mer peptide of the sequence MHGDTPTLH
  • the two overlapping peptides 47 and 48 contain the lOmer peptide of the sequence QAEPDRAHYN, which were described as HLA AI-binding peptides in KITA et al (supra), but for which no functional detection has yet been carried out
  • Human T cells (4x10) from a non-HLA-typed donor were stimulated for 6 weeks with HPV16Llj, c * E7 ⁇ 5i CVLPs at 37 ° C with weekly addition of 1 ⁇ g / ml CVLPs and 10 antigen-presenting cells (irradiated PMBC) and harvested Then the cells were restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with 10 ⁇ g / ml of the peptides indicated on the X-axis of FIG. 5 in the presence of 10 IU / ml IL2. Only cells incubated with buffer served as a negative control
  • FIG. 5 shows that the PBMC incubated with peptides 27 and 28 caused restimulation of CVLP-stimulated T cells, but not the PBMC incubated with the other peptides.
  • the two overlapping peptides 27 and 28 contain the peptide of the sequence SMVTSDAQI, so that the peptide actually recognized must essentially comprise this sequence.
  • Human T cells (4x10) from an HLA AI positive donor were irradiated for 6 weeks with HPV16L1 ⁇ C * E7 I _ 55 CVLPs at 37 ° C with weekly addition of 1 ⁇ g / ml CVLPs and 10 5 antigen-presenting cells (irradiated PMBC) stimulated and harvested.
  • the 20mer peptides 1 to 51 were according to the matrix
  • the T cells of an HLA AI positive donor were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with the peptide pools in the presence of 10 IU / ml IL2.
  • the amounts of the peptide pools used were such that 1 ⁇ g / ml was added for each individual peptide. Only cells incubated with buffer served as a negative control.
  • FIG. 6 shows that the PBMC incubated with the peptide pools E and 6 brought about a restimulation of CVLP-stimulated T cells, but not the PBMC incubated with the other peptide pools.
  • the peptide pools E and 6 together contain the peptide 45, which is therefore likely to be responsible for the restimulation of the CVLP-stimulated T cells.
  • the peptide 45 in turn contains the peptide ETTDLYCY, which KITA et al. (supra) has described as a HLA AI binding peptide, but for which no functional detection has yet been possible.
  • the T cells of an HLA A24 positive donor with the peptide pools were restimulated and analyzed as above.
  • FIG. 7 shows that the PBMC incubated with the peptide pools A and 2 brought about a restimulation of CVLP-stimulated T cells, but not the PBMC incubated with the other peptide pools.
  • the peptide pools A and 2 together contain the peptide 9, which is therefore likely to be responsible for the restimulation of the CVLP-stimulated T cells.
  • the Parker et al. results in a potential peptide for HLA A24 with the sequence FYNPDTQRL, which is therefore likely to be responsible for the activity of peptide 9.
  • Target cells which were incubated in medium were used for the spontaneous lysis, target cells which were incubated with 0.5% Triton were used for the maximum lysis.
  • FIG. 8 shows that the BLCL cells loaded with peptide 9 could be effectively lysed by the T cells, but the non-loaded BLCL cells could not.
  • Peptide 9 is thus an HLA A24 restricted cytotoxic T cell epitope.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Papillomavirus T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN, SMVTSDAQI, und/oder eine funktionell aktive Variante davon, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie.

Description

Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus Ll-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Papillomavirus T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL,
ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN, SMVTSDAQI, und/oder eine funktioneil aktive Variante davon, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie.
Die Papillomviren, auch Warzenviren genannt, sind doppelsträngige DNA-Viren mit einer Genomgröße von etwa 8000 Basenpaaren und einem Ikosaeder- förmigen Kapsid mit einem Durchmesser von ca. 55 nra. Bis heute sind mehr als 100 verschiedene humanpathogene Papillomavirustypen (HPV) bekannt, von denen einige, z.B. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 oder HPV-58, bösartige Tumore und andere, z.B. HPV-6, HPV-1 1 oder HPV-42 gutartige Tumore verursachen können.
Das Genom der Papillomaviren läßt sich in drei Bereiche unterteilen: Der erste Bereich betrifft eine nicht-kodierende Region, die Regulationselemente für die Transkription und Replikation des Virus enthält. Die zweite Region, sogenannte E-(Early)Region enthält verschiedene Protein-kodierende Abschnitte E1-E7, von denen z.B. das E6- und das E7-Protein für die Transformation von Epithelzellen verantwortlich sind und das El -Protein die DNA-Kopienzahl kontrolliert. Bei der E6- und E7-Region handelt es sich um sogenannte Onkogene, die auch in bösartig entarteten Zellen exprimiert werden. Die dritte Region, auch L-(Late)Region genannt, enthält zwei Protein-kodierende Abschnitte Ll und L2, die für Strukturkomponenten des Viruskapsids kodieren. Das Ll -Protein ist zu über 90% im vi- ralen Kapsid vorhanden, wobei das Verhältnis von L1 :L2 im allgemeinen 30: 1 ist. Unter dem Begriff Ll -Protein versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung das Hauptkapsid Protein der Papillomaviren (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445).
In über 50% der Fälle wird HPV-16 mit Gebärmutterhalskrebs (Cervixcarcinom) in Verbindung gebracht. HPV-16 ist der Hauptrisikofaktor für die Ausbildung von cervicalen Neoplasien. Das Immunsystem spielt eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Krankheit. So sind vermutlich zelluläre Immunantworten und insbesondere Antigen-spezifische T-Lymphozyten wichtig für den Abwehrmechanismus. Es wurde weiterhin gefunden, daß in hochgradig malignen cervicalen intra- epithelialen Neoplasien (CIN II/III) und cervicalen Tumoren das E7-Gen konsti- tutiv in allen Schichten des infizierten Epithels exprimiert wird. Daher wird vor allem das E7-Protein als potentielles Tumorantigen und als Zielmolekül für aktivierte T-Zellen betrachtet (siehe z.B. WO 93/20844). Die E7-induzierte zelluläre Immunantwort im Patienten ist aber anscheinend nicht stark genug, um den Krankheitsverlauf zu beeinflussen. Die Immunantwort kann eventuell durch geeignete Impfstoffe verstärkt werden.
Es konnte gezeigt werden, daß die Expression des Ll-Gens bzw. die Coexpressi- on des Ll - und L2-Gens zur Bildung von Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden oder Virus-ähnliche Partikel (VLPs für virus-like particle) führen kann (siehe z.B. WO 93/02184, WO 94/20137 oder WO 94/05792). Unter Capsomeren versteht man eine oligomere Konfiguration, die aus fünf Ll -Proteinen aufgebaut ist. Das Capsomer ist der Grundbaustein, aus denen virale Capside aufgebaut sind. Unter stabilen Capsomeren versteht man Capsomere, die nicht dazu in der Lage sind sich zu Capsiden zusammenzusetzen. Unter Capsiden versteht man die Hülle des Papillomavirus, die beispielsweise aus 72 Capsomeren zusammengesetzt ist (Baker T et al (1991) Biophys J 60, 1445) Unter VLP versteht man ein Capsid, das morphologisch und in seiner Antigenitat einem intakten Virus gleicht Die VLPs konnten zur Auslosung einer humoralen Immunantwort, die durch Bildung \on neutralisierenden Antikörpern charakterisiert ist, in verschiedenen tieπschen Systemen verwendet werden Die Bildung von virus-neutrahsierenden Antikörpern gegen Ll - und oder L2-Proteιn ist jedoch von geπngerer klinischer Bedeutung, wenn die Virusinfektion bereits stattgefunden hat, da für die Ehminierung virus-mfizierter Zellen keine Antikörper, sondern eine virus-spezifische zytotoxi- sehe T-Zell-(CTL)-Antwort notwendig zu sein scheint Und obwohl VLPs in der Lage sind eine zytotoxische T-Zell-Antwort auszulosen, scheint eine ausschließlich gegen die Kapsidproteine L l und/oder L2 geπchtete Immunantwort nicht zur Bekämpfung eines durch Papillomaviren bedingten Tumors geeignet
Es wurden daher sogenannte chimare Papillomavirus-ahnliche Partikel (CVLPs für chimeπc virus-like particle) entwickelt, die aus einem Fusionsprotein des Kapsidproteins Ll und des potentiellen Tumorantigen E7 bestehen (WO 96/1 1272 und Muller, M et al (1997) Virology, 234, 93) Die CVLPs losten nur im geringen Maße eine gegen das E7-Proteιn geπchtete humorale Immunantwort aus (Muller, M et al (1997), supra) Einige der getesteten CVLPs induzieren jedoch tatsächlich die erwünschte E7-spezιfιsche zytotoxische T-Zellantwort in Mausen (siehe auch Peng S et al (1998) Virology 240,147-57) CVLPs sind deshalb sowohl für die Entwicklung eines Impfstoffes als auch für die Behandlung bereits bestehender Infektionen und daraus resultierender Tumore interessant, da die über MHC-Molekule der Klasse I-prasentierten E7-Peptιde von Tumorzellen Zielmo- lekule von zytotoxischen T-Zellen darstellen wurden
Einem Impfstoff bestehend aus CVLPs egt das Pπnzip der Pseudoinfektion der
Zellen durch die CVLPs zugrunde Dies bedeutet, daß die CVLPs wie Viren in die Zelle gelangen, dort zu Peptiden prozessiert werden, die Peptide dann auf MHC- Klasse I und II-Molekule geladen werden und letztend ch CD8- bzw CD4- positiven T-Zellen präsentiert werden CD8-Zellen können als Folge dieser Stimulation zu zytotoxischen T-Zellen differenzieren und dann eine zellulare Immunantwort bewirken, CD4-Zellen hingegen entw ickeln sich zu T-Helferzellen und stimulieren B-Zellen zu einer humoralen oder CD8-posιtιve T-Zellen zu einer zytotoxischen Immunantwort und können selbst die Lyse von infizierten Zellen induzieren
Kleine Peptide können bereits auf der Zelloberflache an MHC-Klasse I-Molekule binden und dann ohne weitere Prozessierung CDS- oder CD4-posιtι\ e Zellen zu einer zellularen Immunantwort stimulieren Ein bestimmtes Peptid kann jedoch nur durch bestimmte MHC-Molekule gebunden werden Durch den großen Poly- morphismus der MHC-Molekule in naturlichen Populationen kann deshalb ein bestimmtes Peptid lediglich durch einen kleinen Teil einer Population gebunden und präsentiert w erden Unter Präsentation im Sinne der vorliegenden Erfindung wird verstanden, wenn ein Peptid oder Proteinfragment an ein MHC-Molekul bindet, wobei diese Bindung beispielsweise im endoplasmatischen Retikulum, im extrazellularen Raum, den Endosomen, Proendosomen, Lysosomen oder Protyso- somen, stattfinden kann, und wenn dann dieser MHC-Molekul-Peptid-Komplex auf der extrazellularen Seite der Zellmembran gebunden ist, so daß er durch Immunzellen spezifisch erkannt werden kann
Da CVLPs sowohl eine zellulare als auch humorale Immunantwort auslosen und nicht MHC-restπngiert sind, eignet sich diese Technologie generell zur Entwick- lung von Impfstoffen, indem die Fähigkeit zur Partikelbildung durch einen Ll- Anteil zur Verfügung gestellt wird und ein zusatzlicher Antigenanteil an diesen Ll -Anteil fusioniert wird Bei der Entwicklung derartiger CVLPs ist es unbedingt notwendig, ein fünktio- nelles Testsystem zur Verfügung zu haben, mit dem man direkt die Immunogeni- tät von CVLPs untersuchen kann. Ein derartiges Testsystem sollte die Eigenschaft besitzen, daß CVLPs mit unterschiedlichen Antigenanteilen mit demselben Test- System untersucht werden können. Da für immunologische Therapieverfahren von Tumoren oder Viruserkrankungen die zelluläre Immunantwort von entscheidender Bedeutung ist, stellte sich die Aufgabe, die durch CVLPs hervorgerufene zelluläre Immunantwort meßbar zu machen.
Die Lösung dieser Aufgabe gelang durch die Identifikation von T-Zell-Epitopen, die in Verbindung mit MHC-Molekülen, in einer besonderen Ausfuhrungsform mit HLA A2.01 MHC-Molekülen in vivo und in vitro beispielsweise eine zytotoxische T-Zellantwort auslösen. Diese Peptide haben vorzugsweise die Sequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN, SMVTSDAQI. Diese Sequenzen sind Bestandteil des Ll- und des E7-Peptid des HPV16. Sie umfassen die Aminosäurebereiche Ll 86-94 (5104), Ll 123-131 (5106), Ll 285-293 (5107), Ll 275-283 (5108), Ll 238-246 (5109), Ll 426-434 (5112), Ll 28-39 (2016). Ll 31 1-320 (2017), Ll 408-417 (2018), Ll 38-47 (2019), Ll 396-404 (2020), Ll 349-357 (2022), Ll 298-306 (27/28), Ll 90-98 (9), E7 1-9 (43), E7 18-25 (45) und E7 44-53 (47/48). Die Namen der jeweiligen Epitope ist in Klammern angegeben.
Die E7-Peptide 43, 45 und 47/48 wurden als potentielle Epitope bereits in Käst et al, (1994) Journal of Immunology 152, 3904-3912 publiziert. Allerdings wird in dieser Publikation lediglich gezeigt, daß diese Peptide an HLA AI Moleküle binden können, jedoch nicht, daß tatsächlich ein zytotoxische T-Zellantwort ausgelöst werden kann. Des weiteren sind keine Daten aufgeführt, die dokumentieren, daß die Peptide als Bestandteil eines Proteins durch T-Zellen erkannt werden. Es wurde nämlich vielfach gezeigt, daß Peptide, die per se an HLA-Moleküle binden, nicht notwendigerweise auch durch T-Zellen erkannt werden. Des weiteren ist bekannt, daß T-Zellen, die zwar ein Peptid erkennen, meßbar dadurch daß sie sich durch das Peptid zu einer T-Zellantwort induzieren lassen, nicht notwendigerwei- se auch Zellen erkennen, die mit ganzen Proteinen - enthaltend das entsprechende Peptid - beladen wurden. Dies ist dadurch zu erklären, daß oft Peptide Protease- schnittstellen enthalten, innerhalb derer die Peptide während der Prozessierung der ganzen Proteine in der Zelle geschnitten und somit zerstört werden und somit nicht mehr durch T-Zellen erkannt werden können. Diese Problematik wird bei- spielsweise in Feltkamp et al. (1993), Eur. J. Immunol. 23: 2242-2249 bestätigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN, SMVTSDAQI, und/oder eine funktionell aktive Variante davon.
Unter einer funktionell aktiven Vaπante von ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL,
SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI versteht man ein T-Zell-Epitop, das in einem T-Zell-Zytotoxizitäts-Testsystem (siehe beispielsweise Beispiele 2-5 der vorliegenden Erfindung) eine, an der Zytotoxizität von ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI gemessene Zytotoxizität besitzt, die minde- stens der Summe aus dem Mittelwert der Negativkontrollen und der dreifachen Standardabweichung entspricht, vorzugsweise von mindestens ca. 30%, insbesondere mindestens ca. 50% und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca. 80%.
Eine bevorzugte Variante ist beispielsweise ein T-Zell-Epitop mit einer Sequenzhomologie zu ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI von minde- stens ca. 65%, vorzugsweise mindestens ca. 75% und insbesondere mindestens ca. 85% auf Aminosäureebene. Andere bevorzugte Varianten sind auch T-Zell- Epitope, die eine strukturelle Homologie zu ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL,
SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI haben. Solche Epitope können aufgefunden werden, indem man gegen die T-Zell-Epitope ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL,
SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI spezifische T-Zellen generiert (DeBruijn M.L. et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21, 2963-70; und DeBruijn M.L. (1992) Eur. J. Immunol. 22, 3013-20) und beispielsweise synthetisch hergestellte Peptide nach Wahl auf Erkennung durch die peptidspezi fischen T-Zellen getestet werden (siehe Beispiele). Insbesondere werden unter T-Zellepitopen zytotoxische T-Zellepitope verstanden. Es sind jedoch auch nicht zytotoxische T-Zellen bekannt, die ebenfalls MHC I-Moleküle erkennen können, so daß auch nicht-zytotoxische T- Zellepitope als Variante von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind. Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein T-Zell-Epitop, das Teil einer Verbindung ist, wobei die Verbindung kein natürlich vorkommendes Ll Protein eines Papillomavirus und keine ausschließlich N-terminale oder ausschließlich C-terminale Deletionsmutante eines natürlich vorkommenden Ll Proteins eines Papillomavirus ist.
In einer besonderen Ausführungsform kann ein T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV. und/oder eine funktionell aktive Variante in einem Ll -Protein eines anderen Papillomavirus oder in einem chimären Ll -Protein, beispielsweise einem HPV18L1E7- Fusionsprotein, enthalten sein. Eine solche erfindungsgemäße Verbindung kann die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen.
Vorzugsweise kann das genannte T-Zell-Epitop als Teil einer Verbindung ein Polypeptid, das in bevorzugter Weise weitere Aminosäuresequenzen enthält, insbesondere ein Fusionsprotein sein. Insbesondere kann die Verbindung ein Polypeptid von mindestens ca. 50 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens ca. 35 Aminosäuren, insbesondere von mindestens ca. 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca. 9-12 Aminosäuren Länge sein.
Um die Verbindung zu detektieren oder in ihrer Aktivität der Bindung an T-Zellen zu modifizieren, kann sie eine chemische, radioaktive Isotopen-, nicht radioaktive Isotopen-, und/oder Fluoreszensmarkierung des T-Zell-Epitops und/oder des genannten Fusionsproteins enthalten. Beispiele von dem Fachmann bekannten chemischen Substanzen, die sich für eine erfindungsgemäße chemische Markierung eignen, sind: Biotin, FITC (Fluorescei- nisothiocyanat) oder Streptavidin.
Eine mögliche Ausführungsform ist, daß ein Peptid derart modifiziert wird, daß es mindestens ein Lysin enthält. An dieses Lysin wird in der dem Fachmann bekannter Weise Biotin oder FITC (Fluoresceinisothiocyanat) gekoppelt. Ein derartig modifiziertes Peptid wird an ein entsprechendes MHC-Molekül oder an eine Zelle mit entsprechenden MHC-Molekülen gebunden. Daraufhin kann das Peptid über markiertes Avidin oder Streptavidin bzw. direkt über die Fluoreszenz des FITC nachgewiesen werden.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen, die sich für eine erfindungsgemäße radioaktive Isotopenmarkierung eignen, sind: Η, 1 J, 131I, 32P, 33P oder
1 C.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen, die sich für eine erfindungs-
7 1 ". gemäße nicht radioaktive Isotopenmarkierung eignen, sind: "H oder C.
Beispiele von dem Fachmann bekannten fluoreszierenden Substanzen, die sich für eine erfindungsgemäße Fluoreszensmarkierung eignen, sind: Εu, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o- Phtaldehyd oder Fluorescamin.
Dem Fachmann sind weitere hier nicht aufgeführte Markierung bekannt, die auch im Sinne dieser Erfindung zur Markierung eingesetzt werden können. Beispiele von dem Fachmann bekannten erfindungsgemäßen chemischen Modifikationen sind die Übertragung von Acetyl-, Phosphat-, und/oder Monosacharid- gruppen
Erfindungsgemäße Polypeptide mit einer Aminosäurelänge von ca. 50 können beispielsweise durch eine chemische Peptidsynthese hergestellt werden. Längere Polypetide werden vorzugsweise gentechnisch erzeugt. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Nukleinsäurekonstrukt zur Expression des genannten T-Zell-Epitops oder der Verbindungen, das folgende Komponenten enthält: (a) mindestens ein regulatorisches Element und (b) mindestens eine Nu- kleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Verbindung kodiert. Das genannte Nukleinsäurekonstrukt ist vorzugsweise aus DNA oder RNA. Geeignete regulatorische Elemente erlauben beispielsweise die konstitutive, regulierbare, gewebsspezifische, zellzyklusspezifische oder metabolischspezifi- sehe Expression in eukaryotischen Zellen oder die konstitutive, metabolischspezi- fische oder regulierbare Expression in prokaryotischen Zellen. Regulierbare Elemente gemäß der vorliegenden Erfindung sind Promotoren, Aktivatorsequenzen, Enhancer, Silencer, und oder Repressorsequenzen.
Beispiele für geeignete regulierbare Elemente, die konstitutive Expression in Eu- karyoten ermöglichen sind Promotoren die von der RNA Polymerase III erkannt werden oder virale Promotoren, wie CMV-Enhancer, CMV-Promotor, SV40 Promotor und virale Promotor-und Aktivatorsequenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV HTLV oder HIV.
Beispiele für regulierbare Elemente, die regulierbare Expression in Eukaryoten ermöglichen sind der Tetrazyklinoperator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor (Gossen M. et al (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20). Beispiele für regulierbare Elemente, die gewebsspezi fische Expression in Euka- ryoten ermöglichen sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in bestimmten Zelltypen exprimiert werden.
Beispiele für regulierbare Elemente, die zellzyklusspezifische Expression in Euka- ryoten ermöglichen sind die Promotoren der folgenden Gene: cdc25C, Cyclin A, Cyclin E, cdc2, E2F, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6).
Beispiele für regulierbare Elemente, die metabolisch spezifische Expression in Eukaryoten ermöglichen sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glucose- mangel, durch Phosphatkonzentration oder durch Hitzeschock reguliert werden.
Um die Einführung der genannten Nukleinsäure und damit die Expression des Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nukleinsäure als Plasmid, als Teil eines viralen, oder nicht viralen Vektors vorliegen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Vektor, insbesondere ein Expressions- vektor, der eine Nukleinsäure codierend für ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Baculoviren, Vakzi- niaviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Virosomen, Liposomen, kationische Li- pide, oder Poly-Lysin konjugierte DNA.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mindestens ein T-Zell-Epitop enthält, vorzugsweise präsentiert. In einer besonderen Ausfuhrungsform wird die Zelle durch einen der genannten Vektoren transfiziert, transformiert oder infiziert Diese Zelle exprimiert unter dem Fachmann bekannten Bedingungen, die zur Aktivierung der jeweils verwendeten regulierbaren Elemente fuhren, das erfindungsgemaße Polypeptid Das Polypeptid kann dann aus dieser Zelle isoliert und z B unter Verwendung einer der oben genannten Markie- rungen aufgereinigt werden Zur gentechnischen Herstellung und anschließenden Aufreinigung der expπmierten, erfindungsgemaßen Verbindungen eignen sich prokaryotische und eukaryotische Zellen, insbesondere Bakteπenzellen wie beispielsweise E co , Hefezellen wie beispielsweise S cerevisiae, Insekten Zellen wie beispielsweise Spodoptera frugiperda Zellen (Sf-9) oder Tπchoplusia ni Zel- len oder Saugerzellen wie beispielsweise COS-Zellen oder HeLa-Zellen
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform ist es, die Zelle, die das erfindungsgemaße Polypeptide exprimiert, selbst zu verwenden, wobei in einer besonders bevorzugten Aus führungs form die Zelle Teile das erfindungsgemaßen Polypeptids über MHC-1 Moleküle auf der Zelloberflache präsentiert Für die Herstellung einer erfindungsgemaßen Zelle sind Antigen-prasentierende Zellen wie beispielsweise B-Zellen, Makrophagen, dendπtische Zellen, Fibroblasten oder anderen HLA A2 01 positive Zellen, in einer bevorzugten Ausfuhrungsform JY-, T2, CaSki- Zellen oder EBV-transformierte B-Zelhnien, geeignet Die erfindungsgemaßen Zellen, die ein Polypeptid enthaltend ein T-Zell-Epitop, präsentieren, können als Zielzellen zur Restimulation von Immunzellen, insbesondere T-Zellen und/oder zur Messung der Aktivierung von T-Zellen eingesetzt werden Unter Zielzelle im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle zu verstehen, die über MHC- Molekule ein T-Zell-Epitope präsentiert und damit spezifisch eine T-Zell- Aktivierung hervorruft, insbesondere eine zytotoxische T-Zell-Reaktion gegen die Zelle
Ferner kann die ein T-Zell-Epitop enthaltene Verbindung, Teil eines Komplexes sein, der dadurch charakterisiert ist, daß die Verbindung kovalent oder über hy- drophobe Wechselwirkungen, Ionenbindung oder Wasserstoffbruckenbindungen mit mindestens einer weiteren Spezies wie Peptide, Proteine, Peptoide, lineare oder verzweigte Oligo- oder Polysacharide und Nukleinsäuren verbunden ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Komplex enthaltend ein T- Zell-Epitop oder eine Verbindung und mindestens eine weitere Verbindung. Eine bevorzugte Ausführungsform ist, daß das Polypeptid in Verbindung mit MHC Klasse I-Molekülen, vorzugsweise als HLA A2.01 Tetramer vorliegt. Besonders bevorzugt sind humane MHC-Klasse I Moleküle. Durch die Technik von Altman J.D. et al. (1996, Science 274, 94-6) lassen sich beispielsweise HLA A2.01- Tetramere mit den entsprechenden gebundenen Peptiden herstellen, die in der Lage sind, an die T-Zellrezeptoren von peptidspezifischen zytotoxischen T-Zellen zu binden.
Eine weitere Ausführungsform ist die Immobilisierung der erfindungsgemäßen Verbindung oder des genannten Komplexes an Trägermaterialien. Als Trägermaterialien eignen sich beispielsweise Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Gläser, Kunststoffe, kristalline Materialien bzw. dünne Schichten des Trägers, insbesondere der genannten Materialien, oder (bio)molekulare Filamente wie Cellulose oder Gerüstproteine.
Zur Aufreinigung des erfindungsgemäßen Komplexes kann eine Komponente des Komplexes zusätzlich noch ein Protein-Tag enthalten. Erfindungsgemäße Protein- Tags erlauben beispielsweise die hochaffine Absorption an eine Matrix, stringen- tes Waschen mit geeigneten Puffern ohne den Komplex im nennenswerten Maße zu eluieren und anschließende gezielte Elution des absorbierten Komplexes. Beispiele von dem Fachmann bekannten Protein-Tags, sind ein (HIS)6-Tag, ein Myc- Tag, ein FLAG-Tag, ein Hämaglutenin-Tag, Glutathion-Transferase (GST)-Tag, Intein mit einem Affinitäts- Chitin-binding Tag oder Maltose binding protein (MBP)-Tag Die erfindungsgemaßen Protein-Tags können sich N-, C-terminal, und/oder intern befinden
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum in v itro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen durch mindestens eine Verbindung, enthaltend ein T-Zell-Epitop Ein derartiges Verfahren besteht vorzugsweise aus drei Schritten a) In einem ersten Schπtt werden Zellen mit mindestens einer Verbindungen enthaltend ein T-Zell-Epitop stimuliert Diese Verbindung kann mindestens eine erfindungsgemaße Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einen erfindungsgemaßen Komplex enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein VLP, mindestens ein CVLP, und oder mindestens ein Virus bedeuten In einer bevorzugten Ausfuhrungsform w erden Immunzellen durch die Inkubation mit CVLPs stimuliert Diese Stimulation kann beispielsweise in Form einer Impfung erfolgen, oder durch Inkubation von Immunzellen mit CVLPs in vitro Derartig stimulierte Immunzellen w erden beispielsweise nach einer Impfung oder bei einem Tumorpatienten aus dem Blut, aus Tumoren oder aus Lymphknoten gewonnen, und/oder erden kultiviert b) In einem zweiten Schπtt werden Zellen mit mindestens einem erfindungsgemaßen T-Zell-Epitop, mindestens einer erfindungsgemaßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell- Epitop präsentiert und/oder mit mindestens einem erfindungsgemaßen
Komplex inkubiert c) In einem dπtten Schπtt erfolgt die Bestimmung der Aktivierung von T- Zellen Hierfür geeignete Verfahren sind beispielsweise der Nachweis der Produktion oder Sekretion von Cytokinen durch die T-Zellen, der Expres- sion von Oberflächenmolekülen auf T-Zellen, der Lyse von Zielzellen oder der Proliferation von Zellen. Hierfür geeignete Methoden sind beispielsweise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Current Protocols in Im- munology (1999), edited by Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies D.H., Shevach E.M. and Strober W., John Wiley & Sons), ELISPOT
(Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein 51Cr- Freisetzungstest (Chapter 3.1 1 in Current Protocols in Immunology, supra) oder der Nachweis der Proliferation (Chapter 3.12 in Cuπent Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Methode kann dabei auch zwi- sehen den Immunzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen, B-
Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden. Die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen, Komplexen, und/oder Zellen, die erfindungsgemäße Markierungen enthalten, erlaubt die Detek- tion von T-Zellen, die das T-Zell-Epitop erkennen über den Nachweis der Bindung markierter Verbindungen, Komplexe, und oder Zellen an die T-
Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindung erfindungsgemäßer MHC-Polypeptid-Komplexe an die Oberfläche der T- Zellen nachgewiesen. Dies kann derart durchgeführt werden, daß die MHC-Komplexe selbst markiert, beispielsweise fluoreszenzmarkiert sind, oder daß man in einem weiteren Schritt einen MHC-spezifischen, markierten, beispielsweise fluoreszenzmarkierten Antikörper verwendet, um wiederum die MHC-Komplexe nachzuweisen. Die Fluoreszenzmarkierung der T-Zellen läßt sich dann beispielsweise in einem 'Fluorescens Activated Cell Sorter' (FACS) messen und auswerten. Eine andere Möglichkeit zum Nachweis der Bindung von den Komplexen an die T-Zellen ist erneut die
Messung der Aktivierung von T-Zellen (Cytokinassay, Elispot, 51Cr- Freisetzungstest, Proliferation, siehe oben). Allerdings benötigt man hierfür die gleichzeitige Stimulation von Korezeptoren (z. B. CD28), beispielsweise durch Korezeptor-spezifische Antikörper (Anti-CD28) und/oder andere unspezifische Aktivatoren (IL-2). Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren, das einen zusätzlichen Schritt a') enthält, der nach Schritt a) eingeführt wird. a') In diesem zusätzlichen dem Schritt a) nachfolgenden Schritt a') werden die isolierten oder kultivierten Zellen mit mindestens einer Zielzelle beladen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP und oder mindestens einem Virus, mit mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, und/oder mindestens einer Zielzelle, die ein
T-Zell-Epitop präsentiert, für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere für mindestens ca. 1 Woche cokultiviert, bevor sich Schritt b) anschließt.
Unter Cokultivierung ist das Wachstum der Zellen:
(i) in Gegenwart von mindestens einer Zielzelle beladen mit einer er- findungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP, und/oder mindestens einem Virus, (ii) in Gegenwart mindestens eines erfindungsgemäßen Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop,
(iii) in Gegenwart mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert, im selben Wachstumsmedium und selben Gewebekulturbehälter zu verste- hen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer T-Zell-Epitop präsentierenden Zielzelle. Hierbei ist es möglich, die Zielzelle mit Kombinationen von unterschiedlichen T-Zell-Epitopen zu beladen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle mit mindestens einer Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop und/oder mindestens einem Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop inkubiert. In einer besonders bevorzugten Ausfüh- rungsform wird die Zielzelle in Wachstumsmedium, das erfindungsgemäße Polypeptide enthält, oder mit MHC Klasse I-Komplexen mit gebundenen erfindungsgemäßen Polypeptiden inkubiert. Die MHC Klasse I-Komplexe können beispielsweise als HLA A2.01 -Tetramere vorliegen. Ein Tetramer bindet dabei in der Regel vier Peptide. Diese können sowohl identisch sein oder aber unterschiedliche Spezies von Peptiden repräsentieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle mit einer Nukleinsäure und oder einem Vektor transfiziert, transformiert und/oder infiziert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle mit einem Vakziniavirusvektor infiziert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Antigen-präsentierenden Zellen beispielsweise mit B-Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen, embryonalen Zellen oder Fibroblasten oder anderen HLA A2.01 positiven Zellen, in einer bevorzugten Ausführungsform mit JY-, T2-, CaSki- Zellen oder EBV-transformierten B-Zellinien durchgeführt.
Die verwendeten CVLPs enthalten ein Papillomavirus Ll -Protein oder Varianten davon, insbesondere HPV16 Ll-Protein und, jedoch nicht notwendigerweise, ein zu Ll heterologes Protein oder Varianten davon. Die zwei Proteine können direkt oder indirekt gebunden vorliegen. Direkt gebunden meint im Sinne der Erfindung, daß eine kovalente Bindung zwischen den beiden Proteinen vorliegt, beispielsweise eine Peptidbindung oder eine Disulfidbindung. Indirekt gebunden bedeutet, daß die Proteine über nicht-kovalente Bindungen gebunden sind, beispielsweise hydrophobe Wechselwirkungen, Ionenbindungen oder Wasserstoffbrücken. In einer weiteren Ausfuhrungs form enthalten die CVLPs zusätzlich zu Ll-Protein oder Varianten davon ein Papillomavirus L2-Protein. Eine bevorzugte Ausführung des Ll -Proteins der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise Ll -Proteine mit einer oder mehreren Deletionen, insbesondere einer C-terminalen Deletion Eine C-terminale Deletion hat den Vorteil, daß die Effizienz der Bildung virus-ahnlicher Partikel gesteigert werden kann, da das am C-Terminus lokalisierte nukleare Loka sationssignal deletiert wird Die C- terminale Deletion betragt daher vorzugsweise bis zu ca 35 Aminosäuren, insbesondere ca 25 bis ca 35 Aminosäuren, vor allem ca 32 bis ca 34 Aminosäuren Beispielsweise ist eine 32 Aminosäuren lange C-terminale Deletion des HPY16 Ll -Proteins ausreichend, um die Bildung von virus-ahnlichen Partikeln um das mindestens ca zehnfache steigern zu können Des w eiteren kann das Ll -Protein eine oder mehrere Mutationen tragen oder der Ll -Anteil aus Ll -Proteinen ' erschiedener Papillomaviren zusammengesetzt sein Gemeinsames Kennzeichen der erfindungsgemaßen Ll -Proteine ist, daß sie die Bildung von VLPs bzw CVLPs zulassen und daß sie mindestens ein erfindungsgemaßes T-Zell-Epitop enthalten
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist das Ll -Protein oder Vaπanten davon und das zu Ll heterologe Protein ein Fusionsprotein Beinhaltet sind auch he- terologe Proteine, die aus mehreren verschiedenen Proteinen oder Teilen da\ on zusammengesetzt sind Dies können beispielsweise auch Epitope, insbesondere zytotoxische T-Zellepitope von Proteinen sein Epitope im Sinne der Erfindung können dabei auch Teil eines synthetischen Polypeptids mit einer Lange von ca 50 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens ca 35 Aminosäuren, insbesondere von mindestens ca 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca 9 Aminosäuren sein
Bevorzugt sind zu Ll heterologe Proteine, die von einem viralen Protein abgeleitet sind, beispielsweise abgeleitet von HIV, HBV oder HCV, vorzugsweise von Papillomaviren, insbesondere von humanen Papillomaviren In einer bevorzugten Ausführungsform ist dies ein E-Protein eines Papillomavirus, vorzugsweise ein E6- und/oder E7-Protein. Insbesondere ist bevorzugt, wenn das E-Protein ein deletiertes E-Protein ist, vorzugsweise ein C-terminal deletier- tes, insbesondere ein C-terminal deletiertes E7-Protein, da diese Konstrukte in Verbindung mit deletiertem Ll-Protein bevorzugt virus-ähnliche Partikel ausbilden können. Insbesondere bevorzugt sind Deletionen bis zu 55 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 55 Aminosäuren, insbesondere ca. 38 bis ca. 55 Aminosäuren.
In einer weiteren Ausführung kann das zu Ll heterologe Protein von Antigenen nicht viraler Erreger abstammen. Ebenso können sie von Autoimmunantigenen wie z.B. Thyroglobulin, Myelin basic protein oder Zona Pellucida Glycoprotein 3 (ZP3), die mit bestimmten Autoimmunkrankheiten wie z.B. Thyroiditis, Multiple Sklerose, Oophoritis oder rheumatoider Arthritis assoziiert sind, abgeleitet sein. In einer bevorzugten Ausführung stammt das zu Ll heterologe Protein von Tumorantigenen ab, vorzugsweise Melanomaantigenen wie MART, Ovarialcarcino- mantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-1 oder CA125, Coloncarcino- mantigenen wie CA125 oder Mammacarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-l , BCRA-2.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen, die durch Präparation aus Proben gewonnen werden. Dieses Verfahren erlaubt es zu bestimmen, ob in einer Probe, beispielsweise einer Blutprobe eines Patienten oder in Tumoren oder Lymphknoten eines Tumorpatienten, Papillomavirus Ll -Protein-spezifische zytotoxische T-Zellen vorhanden sind. Ein derartiges Nachweisverfahren enthält die folgenden Schritte: a") In einem ersten Schritt werden Zellen gewonnen, beispielsweise durch Blutabnahme von einem Patienten oder durch die Präparation zum Beispiel von Tumoren oder Lymphknoten. Anschließend werden die Zellen in Wachstumsmedium aufgenommen und kultiviert. b) In einem zweiten Schritt werden Zellen mit mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert oder mit mindestens einem Komplex, der als eine Komponente eine Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitope umfaßt, inkubiert.
c) In einem dritten Schritt erfolgt die Bestimmung der Aktivierung von T- Zellen. Hierfür geeignete Verfahren sind beispielsweise der Nachweis der Produktion oder Sekretion von Cytokinen durch die T-Zellen, der Expressi- on von Oberflächenmolekülen auf T-Zellen. der Lyse von Zielzellen oder der Proliferation von Zellen. Hierfür geeignete Methoden sind beispielsweise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Current Protocols in Immunology ( 1999), edited by Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies D.H., Shevach E.M. and Strober W., John Wiley & Sons), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein 3 iCr-Freisetzungstest
(Chapter 3.1 1 in Current Protocols in Immunology, supra) oder der Nachweis der Proliferation (Chapter 3.12 in Cuπent Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Methode kann dabei auch zwischen den Immunzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen, B-Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden. Die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen, Komplexen, und/oder Zellen die erfindungsgemäße Markierungen enthalten erlaubt die Detektion von T-Zellen, die das T-Zell-Epitop erkennen über den Nachweis der Bindung markierter Verbindungen, Komplexe, und oder Zellen an die T-Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindung erfindungsgemäßer MHC-Polypeptid-
Komplexe an die Oberfläche der T-Zellen nachgewiesen. Dies kann derart durchgeführt werden, daß die MHC-Komplexe selbst markiert, beispielsweise fluoreszenzmarkiert sind, oder daß man in einem weiteren Schritt einen MHC-spezifischen, markierten, beispielsweise fluoreszenzmarkierten Antikörper verwendet, um wiederum die MHC-Komplexe nachzuweisen. Die Fluoreszenzmarkierung der T-Zellen läßt sich dann beispielsweise in einem 'Fluorescens Activated Cell Sorter' (FACS) messen und auswerten. Eine andere Möglichkeit zum Nachweis der Bindung von den Komplexen an die T-Zellen ist erneut die Messung der Aktivierung von T-Zellen (Cyto- kinassay, Elispot, 51Cr-Freisetzungstest, Proliferation, siehe oben). Allerdings benötigt man hierfür die gleichzeitige Stimulation von Korezeptoren (z. B. CD28), beispielsweise durch Korezeptor-spezifische Antikörper (An- ti-CD28) und/oder andere unspezifische Aktivatoren (IL-2).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren, das einen zusätzlichen Schritt a') enthält, der nach Schritt a") eingeführt wird. a') In diesem zusätzlichen dem Schritt a") nachfolgenden Schritt a')werden die isolierten oder kultivierten Zellen mit mindestens einer Zielzelle beladen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-
Zell-Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP und/oder mindestens einem Virus, mit mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, und/oder mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert, für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere für mindestens ca. 1 Woche cokultiviert, bevor sich Schritt b) anschließt.
Unter Cokultivierung ist das Wachstum der Zellen:
(i) in Gegenwart von mindestens einer Zielzelle beladen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, min- destens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-
Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP, und/oder mindestens einem Virus, (n) in Gegenwart mindestens eines erfindungsgemaßen Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop,
(in) in Gegenwart mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert, im selben Wachstumsmedium und selben Gewebekulturbehalter zu verstehen
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testsystem (Kit) zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen enthaltend a) mindestens ein erfindungsgemaßes T -Zell-Epitop, mindestens eine erfindungsgemaße Verbindung, mindestens einen erfindungsgemaßen Vektor, mindestens eine erfindungsgemaße Zelle, und/oder mindestens einen erfindungsgemaßen Komplex, und b) Effektorzellen des Immunsystems, vorzugsweise T-Zellen, insbesondere zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen
Das Testsystem ird in einer besonderen Ausführungsform zur Bestimmung der, beispielsweise in einer Blutprobe eines Patienten oder in Tumoren oder Lymphknoten eines Tumorpatienten vorhandenen Ll -Protein-spezifischen zyto- toxischen T-Zellen verwendet In diesem Fall sind die in b) beschπebenen Zellen im Testsystem enthaltene Kontrollzellen, deren Aktivierung durch die erste Kitkomponente, die unter a) genannten Substanzen, als Standard dient Die in dieser Reaktion beobachteten Aktivierung wird mit die T-Zell-Aktivierung von aus Patienten isolierten Zellen durch die Kitkomponente a) verglichen
In einer weiteren besonderen Ausfuhrungs form wird das Testsystem beispielsweise zur Bestimmung der Ll -Protein-spezifischen Antigenitat einer Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, eines Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop, eines Capsomers, eines stabilen Capsomers, eines VLPs, eines CVLPs, und/oder eines Virus verwendet. In diesem Fall sind die in a) beschriebenen Substanzen Kontrollsubstanzen deren aktivierende Wirkung auf die zweite Kitkomponente, die unter b) genannten Zellen, als Standard dient. Die in dieser Reaktion beobachteten Aktivierung wird mit der aktivierenden Wirkung einer Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, einem Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, einem Capsomer, einem stabilen Capsomer, einem VLP, ein CVLP, und/oder einem Virus auf die Kitkomponente b) verglichen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von mindestens einem T-Zell-Epitop, mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T- Zell-Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für eine ein T-Zell-Epitop enthaltende Verbindung, mindestens einer erfindungsgemäßen Zelle enthaltend ein T-Zell-Epitop zur, und/oder mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop zur Auslösung oder zum Nachweis einer Immunantwort.
Zur Stimulation von Immunzellen in vitro wie in vivo eignen sich insbesondere Zellen, die mindestens eines der erfindungsgemäßen Moleküle über ihre MHC- Klasse I-Moleküle präsentieren. Zur Antigen-Präsentation geeignete Zellen sind z. B. B-Zellen, dendritische Zellen, Macrophagen, Fibroblasten oder andere HLA A2.01 positive Zellen, die durch eine gemeinsame Kultivierung mit Immunzellen eine Stimulation von spezifischen T-Zellen eπeichen können.
In einer besonderen Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Verbindung beispielsweise ein HPV18 LlE7-Fusionsprotein, das zusätzlich ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop enthält, zur Detektion einer Immunantwort eingesetzt werden. Eine solche erfindungsgemäße Verbindung kann die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel oder Diagnostikum enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens einen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für eine ein T-Zell-Epitop enthaltende Verbindung, mindestens eine erfindungsgemäße Zelle enthaltend ein T-Zell-Epitop, und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop und gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Trägern sind Glas, Polystyren, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylase, natürliche oder modifizierte Zellulose, Polyacrylamide, Agarose, Aluminiumhydroxid oder Magnitid.
Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel oder Diagnostikum kann in Lösung vorlie- gen, an eine feste Matrix gebunden sein, und/oder mit einem Adjuvans versetzt sein.
Das Arzneimittel oder Diagnostikum kann auf verschiedene Weisen verabreicht werden. Beispiele von dem Fachmann bekannten Verabreichungsformen sind pa- renterale, lokale und/oder systemische Applikation durch z. B. orale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, und/oder topische Applikation. Die bevorzugte Applikationsform wird beispielsweise durch den natürlichen Infektionsweg der jeweiligen Papillomavirusinfektion beeinflußt. Die verabreichte Menge richtet sich nach Alter, Gewicht, allgemeinem Gesundheitszustand des Patienten und dem Typ der Papillomavirusinfektion. Das Arzneimittel oder Diagnostikum kann in Form von Kapseln, Lösung, Suspension, Elixier (für orale Applikation) oder sterile Lösungen bzw. Suspensionen (für parenterale oder intranasale Applikation) verabreicht werden. Als inerter und immunologisch akzeptabler Träger kann beispielsweise Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung verwendet werden. Das Arzneimittel wird in therapeutisch effektiven Mengen verabreicht. Das bedeutet Mengen, die ausreichend sind, um eine schützende immunologische Antwort hervorzurufen.
In einer besonderen Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Verbindung beispielsweise ein HPV18 LlE7-Fusionsprotein, das zusätzlich ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop enthält, als Arzneimittel oder Diagnostikum eingesetzt werden. Eine solche erfindungsgemäße Verbindung kann die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen.
Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Fig. 1 zeigt die graphische Auswertung der MTT-Färbung von WEHI-Zellysaten, gemessen als Absorption bei 595 nm, die mit Überständen von T-Zellen inkubiert worden waren, die wiederum durch unterschiedliche Antigen-präsentierende peri- phere Blutlymphozyten (PBL) stimuliert worden waren. Durch spezifische Antigen-präsentierende PBL stimulierte T-Zellen sekretieren TNF . Dieses induziert bei WEHI-Zellen Apoptose, so daß diese Zellen MTT nicht mehr zu einem bräunlichen Farbstoff prozessieren können. Niedrige Absorption bedeutet geringe Farbstoffproduktion und somit viele apoptotische Zellen, die somit viel TNFα ausgesetzt waren, so daß die zugehörigen T-Zellen stimuliert worden waren. Somit ist die Stimulation der T-Zellen umso besser, je niedriger die Absorption für ein bestimmtes Antigen bei 595 nm ist.
Fig. 2 zeigt die graphische Auswertung der Fluoreszenz von T2-Zellen - gemessen in einer FACS-Analyse - , deren auf der Zelloberfläche befindliche MHC-1 Moleküle durch einen FITC-markierten Antikörper markiert worden waren. Zel- len, deren MHC-1 Moleküle spezifisch die auf der X-Achse aufgetragenen Peptide binden können, haben vermehrt MHC-1 Moleküle, da die spezifische Bindung die MHC-Komplexe stabilisiert, so daß sie sich auf der Zelloberfläche anreichern können.
Fig. 3 zeigt die Auswertung von drei FACScan-Experimenten nach Restimulation CVLP-spezifischer humaner T-Zellen mit peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMC), die unterschiedliche Antigene präsentieren. Von links nach rechts ist jeweils der Gehalt an CD3 aufgetragen, das für T-Zellen spezifisch ist, und von unten nach oben der Gehalt an humanem Interferon γ, das für aktivierte Zellen spezifisch ist.
Fig. 4 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen eines HLA AI positiven Spenders mit peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMC), die unterschiedliche Antigene präsentieren. Von links nach rechts ist der Name des jeweiligen Peptids aufgetragen, mit denen die PBMC beladen wurden. „None" steht für PBMC, die lediglich mit Puffer inkubiert wurden. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von Interferon γ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 5 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen eines nicht-HLA-typisierten Spenders mit peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMC), die unterschiedliche Antigene präsentieren. Von links nach rechts ist der Name des jeweiligen Peptids aufgetragen, mit denen die PBMC beladen wurden. „None" steht für PBMC, die lediglich mit Puffer inkubiert wurden. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von Interferon γ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden. Fig. 6 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen eines HLA AI positiven Spenders mit peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMC), die unterschiedliche Antigene präsentieren. Von links nach rechts ist der Name des jeweiligen Peptidpools aufgetragen, mit denen die PBMC beladen wurden. „None" steht für PBMC, die lediglich mit Puffer inkubiert wurden. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von Interferon γ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 7 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen eines HLA A24 positiven Spenders mit peripheren Blutmononukleären Zellen (BLCL), die unterschiedliche Antigene präsentieren. Von links nach rechts ist der Name des jeweiligen Peptidpools aufgetragen, mit denen die BLCL beladen wurden. „None" steht für BLCL, die lediglich mit Puffer inkubiert wurden. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von Interferon γ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 8 zeigt die Auswertung eines 51Cr-Freisetzungsexperiments nach Beladung von BLCL-Zellen eines HLA A24 positiven Spenders (=Zielzellen) mit dem Peptid 9. Die Zielzellen wurden durch mit den Peptiden 1-43 stimulierte T-Zellen (=Effektorzellen) lysiert. Auf der X-Achse ist das Verhältnis der eingesetzten Effektorzellen zu den eingesetzten Zielzellen aufgetragen, auf der Y-Achse die % der spezifisch lysierten Zielzellen, bestimmt durch die Freisetzung von 51Cr aus den Zielzellen. Die %-Werte wurden nach der in Beispiel 7 angegebenen Formel berechnet. Beispiele
1. Beschreibung der Ausgangsmaterialien
• Die Herstellung von HPV16 L1ΛC*E7I -55 CVLPs erfolgte gemäß der deutschen Patentanmeldung DE 198 12 941, siehe auch Müller M. et al. (1997) Virology
234, 93-1 1 1.
• Die Herstellung von Ll VLP's erfolgte gemäß Müller M. et al. (1997) Virology 234, 93-11 1.
• T2 Zellen, die unter der ATCC Nummer: CRL-1992 zu beziehen sind, weisen einen Defekt im Antigenprozessierungs-assoziierten Transport auf, der zur
Unterbindung der Beladung von MHC-1 Molekülen im endoplasmatischen Retikulum führt. Die dennoch auf der Zelloberfläche vorhandenen unbelade- nen MHC-1 Moleküle können beispielsweise durch Inkubation der Zellen in Peptid-haltigen Medien beladen werden, so daß sich diese Zellen sehr gut zur Präsentation eines Antigens eignen.
• WEHI Zellen sind unter der ATCC Nummer CRL-2148 zu beziehen.
• PMBC bedeutet periphere Blutmononukleäre Zellen, deren Isolierung wird beispielsweise in Rudolf MP. et al. (1999), Biol. Chem. 380, 335-40 beschrieben. • BLCL bedeutet eine mit Hilfe des Epstein-Barr-Virus transformierte B-Zelline (erhalten von Dr. Andreas Kaufmann, Friedrich-Schiller-University, Jena, Deutschland).
• BB7.2 bedeute ein α-HLA A2.01-spezifischer monoklonaler Maus Antikörper (ATCC HB-82). • α-hum CD28 bedeutet ein monoklonaler Maus-Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD28 gerichtet ist. • α-hum CD3/PE bedeutet ein monoklonaler Maus Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD3 (ε) gerichtet ist und den Fluoreszens- marker Phycoerithrin enthält (Medac, Hamburg, Deutschland).
• α-hum CD4/Cychrome bedeutet ein monoklonaler Maus-Antikörper, der ge- gen den extrazellulären Teil von humanen CD4 gerichtet ist und den Fluores- zensmarker Cychrome enthält (DAKO; Glostrup, Dänemark).
• α-hum Interferon γ/FITC bedeutet einen monoklonaler Ratten-Antikörper, der gegen humanes Interferon γ gerichtet ist und den Fluoreszensmarker FITC enthält (Medac, Hamburg, Deutschland). • α-hum CD8/PE bedeutet einen monoklonalen Maus-Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD8 gerichtet ist und den Fluores- zenzmarker Phycoerithrin enthält (Pharmingen, Heidelberg, Deutschland).
• InfluenzaMP bedeutet Aminosäuren 58-66 GILGFVFTL des Influenza Matrix Protein (siehe Dunbar P.R. et al. (1998) Curr. Biol. 26, 413-6). • HPV16E7-Peptid bedeutet Aminosäuren 11-20 YMLDLQPETT des humanen Papillomavirus E7-Proteins.
• Anhand des Algorithmus für potentielle HLA A2.01-bindende Peptide (Parker, KC et al. (1994) J. Immunol. 152: 163), durchgeführt in dem Peptid- Prediction Program von Parker unter http://www-bimas.dcrt.nih.gov/molbio/- hla bind index.html wurden die folgenden Peptide als Kandidaten für HPV16
Ll identifiziert und synthetisch hergestellt. Die angegebenen Aminosäurepositionen des jeweiligen Peptids sind relativ zum Met (+1) der unter Genbank Zugangsnummer k02718 hinterlegten Sequenz für Ll angegeben (siehe nachfolgende Tabelle 1). Tabelle 1 : Potentielle HLA A2.01-bindende Peptide von HPN16 Ll
Peptid ame Sequenz rel. Ll -Position
5104 ILVPKVSGL (86-94)
5105 SMDYKQTQL (174-182)
5106 RLVWACVGV (123-131)
5107 HLFNRAGTV (285-293)
5108 YLRREQMFV (275-283)
5109 TLQANKSEV (238-246)
51 12 ILEDWNFGL (426-434)
5113 TLEDTYRFV (441-449)
2016 SLWLPSEATVYL (28-39)
2017 NLASSNYFPT (31 1-320)
2018 TLTADVMTYI (408-417)
2019 YLPPVPVSKV (38-47)
2020 YDLQFIFQL (396-404)
2021 FQLCKITLT (402-410)
2022 ICWGNQLFV (349-357)
2023 KVVSTDEYV (46-54)
2024 QLFVTVVDT (354-362)
2025 GLQYRVFRI (93-101)
• Des weiteren wurden um jeweils 9 Aminosäuren überlappende 20mer-Peptide synthetisiert, welche die Sequenz des Ll und des E7 Proteins von HPV16 um- fassen. Die Peptide wurden von 1 bis 52 durchnumeriert. Ihr Name und ihre Sequenz sind in der folgenden Tabelle zuammengefaßt, in der "restr." restringiert bedeutet,
Tabelle 2: Synthetische überlappende 20mer Peptide von HPN16 Ll und E7
Peptid Sequenz relative Epitop-
Name Position Information Ll-Peptide
1 MSL LPSEATVY PPVPVSK (1-20)
2 YLPPVPVSKWSTDEYVART (12-31)
3 STDEYVARTNIYYHAGTSRL (23-42)
4 YYHAGTSRLLAVGHPYFPIK (34-53)
5 VGHPYFPIKKPNNNKILVPK (45-64)
6 NN KILVPKVSGLQYRVFRI (56-75)
7 GLQYRVFRIHLPDPNKFGFP (67-86)
8 PDPNKFGFPDTSFYNPDTQR (78-97)
9 SFYNPDTQRLVWACVGVEVG (89-108) zvtotox. Epitop, HLA A24 restr.
10 WACVGVEVGRGQPLGVGISG (100-119)
11 QPLGVGISGHPLLNKLDDTE (111-130)
12 LLNKLDDTENASAYAANAGV (122-141)
13 SAYAANAGVDNRECISMDYK (133-152)
14 RECISMDYKQTQLCLIGCKP (144-163)
15 Q CLIGCKPPIGEH GKGSP (155-174)
16 GEH GKGSPCTNVAVNPGDC (166-185)
17 NVAVNPGDCPPLELINTVIQ (177-196)
18 LELINTVIQDGDMVDTGFGA (188-207)
19 DMNDTGFGA DFTTLQANKS (199-218)
20 FTTLQANKSEVPLDICTSIC (210-229)
21 PLDICTSICKYPDYIKMNSE (221-240)
22 PDYIKMVSEPYGDSLFFYLR (232-251) 23 GDSLFFYLRREQMFVRHLFN (243-262) 24 QMFVRHLFNRAGAVGENVPD (254-273) 25 GAVGENVPDDLYIKGSGSTA (265-284) 26 YIKGSGSTANLASSNYFPTP (276-295) 27 ASSNYFPTPSGSMVTSDAQI (287-306) T-Helfer Epitop 28 S VTSDAQIFNKPYWLQRAQ (298-317) T-Helfer Epitop 29 KPYWLQRAQGHNNGIC GNQ (309-328) 30 NNGICWGNQLFVTWDTTRS (320-339) 31 VTWDTTRSTNMSLCAAIST (331-350) 32 MSLCAAISTSETTYKNTNFK (342-361) 33 TTYKNTNFKEYLRHGEEYDL (353-372) 34 LRHGEEYDLQFIFQLCKITL (364-383) 35 IFQLCKITLTADVMTYIHSM (375-394) 36 DVMTYIHSMNSTILEDWNFG (386-405) 37 TILEDWNFGLQPPPGGTLED (397-416) 38 PPPGGTLEDTYRFVTSQAIA (408-427) 39 RFVTSQAIACQKHTPPAPKE (419-438) 40 KHTPPAPKEDPLKKYTFWEV (430-449) 41 LKKYTFWEVNLKEKFSADLD (441-460) 42 KEKFSADLDQFPLGRKFLLQ (452-471 ) 43 PLGRKFLLQAGMHGDTPTLH (463-482) zytotox. Epitop HLA AI restr.
E7-Peptide
44 MHGDTPTLHEYMLDLQPETT (1-20)
45 MLDLQPETTDLYCYEQL DS (12-31) zytotox. Epitop HLA AI restr.
46 YCYEQLNDSSEEEDEIDGPA (23-42) 47 EEDEIDGPAGQAEPDRAHYN (34-53) zytotox. Epitop HLA AI restr.
48 AEPDRAHYNIVTFCCKCDST (45-64) zytotox. Epitop HLA AI restr.
49 TFCCKCDSTLRLCVQSTHVD (56-75) 50 LCVQSTHVDIRTLEDLLMGT (67-86) 51 TLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (78-97) Influenza Kontrollpeptid
52 KEYLRHGEEGILGFVFTLCK
• Golgi Plug ist durch Pharmingen (Hamburg, Deutschland) erhältlich.
• Monensin ist durch Sigma (Deisenhofen, Deutschland) erhältlich. • IL-2 wurde von Becton Dickinson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
• MTT-Lösung in PBS bedeutet 2,5 mg/ml 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazoliumbromid in PBS (Sigma, Deisenhofen, Deutschland).
• PBS bedeutet „phosphate buffered saline" und besteht aus 16,6 mM Na2HPO 8,4 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl pH 7,4. • Zellen wurden jeweils bei 37°C und 5% CO2 in RPMI-Medium (Gibco BRL, Eggenstein; Deutschland) mit 10% fötalem Kälberserum, Kanamycin und Ampicillin kultiviert.
• Luma-Platten und der Canberra-Packerd B-Plate Counter wurden von Canber- ra-Packerd, Dreieich, Deutschland bezogen. • FACScan calibur bedeutet 'fluorescens activated cell sorter' die Apparatur wurde von Becton Dickenson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
• Cellquest Software wurde von Becton Dickinson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
2. Peptid-spezifische TNFα-Sekretion durch CVLP-stimulierte T-Zellen
a) Herstellung CVLP-spezifischer T-Zellen
Humane T-Zellen (4χ l05) eines HLA A2.01 positiven Spenders wurden für 8 Wochen mit HPV 16 LlΛC*E7ι_55 CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml CVLPs, 10 bestrahlten periphere Blutmononukleäre Zellen (PMBC) und 10 IU/ml IL-2 stimuliert und geerntet.
b) Stimulation mit Antigenen Die Zellen wurden über Nacht in 100 μl Medium bei 37°C mit unterschiedlichen Antigenen (PMBC + E7-Peptid; PMBC + HPV16 LlΔC*E7ι.55 (CVLP); PMBC + 5104, 5105, 5106, 5107, 5108, 5109, 51 12, 5113 je 10 μg/ml) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL-2 stimuliert. Während dieser Zeit produzieren stimulierte Zellen TNFα.
c) TNFα-Nachweis
Am nächsten Tag wurden 50 μl Überstand entnommen, eingefroren, wieder aufgetaut (um evtl. mitgenommene Zellen abzutöten) und zu 50 μl einer Zellsuspension gegeben, die 0,9x 106 WEHI-Zellen, 2 μg/ml Actinomycin D und 400 mM LiCl enthielt. Die Zellen wurden für 24 h bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit leitet TNFα (sofern im Überstand enthalten) Apoptose der WEHI-Zellen ein. Durch Zugabe von 50 μl einer 2,5 mg/ml MTT-Lösung in PBS wurden innerhalb von 3 Stunden nicht apoptotische Zellen braun angefärbt, apoptotische Zellen hingegen blieben gelb. Sämtli- ehe Zellen wurden durch Zugabe von 100 μl Lysis-Puffer (34% N,N dime- thylformamide, 20% sodium dodecyl sulfate) und eine Inkubation für mindestens 6 Stunden bei 37° lysiert, so daß die Farbstoffe freigesetzt wurden. Abschließend wurde die Absorption der Lösung bei 595 nm gemessen. Fig. 1 zeigt die unterschiedlichen Antigene aufgetragen gegen die gemessene Absorption bei 595 nm. Niedrige Absorption bedeutet geringe Farbstoffproduktion und somit viele apoptotische Zellen, die somit viel TNFα ausgesetzt waren, so daß die zugehörigen T-Zellen stimuliert worden waren. Somit war die Stimulation der T-Zellen umso besser, je niedriger die Absoφtion bei 595 nm ist.
Ergebnis: Die Peptide 5104, 5106, 5107, 5108, 5109 und 51 12 waren in der Lage, CVLP-spezifische T-Zellen zu stimulieren.
3. Bindung von Peptiden an T2 -Zellen
a) Beladung der T2-Zellen 2,5x 106 T2-Zellen eines HLA A2.01 positiven Spenders wurden in Medium enthaltend 2% humanes Serum über Nacht in Anwesenheit von 0, 10 oder 100 μg/ml 5105, 5106, 5107, 5109, 5112, 5113, InfluenzaMP, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021, 2022, 2023, 2024, 2025 Peptid bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit können passende Peptide an die unphysiolo- gisch leeren MHC-1 Moleküle binden und diese somit stabilisieren, wohingegen MHC-1 Moleküle ohne passende Peptide relativ schnell wieder in die Zelle aufgenommen werden. Somit erhöhen spezifisch bindende Peptide die Anzahl der MHC-1 Moleküle auf der Zelloberfläche.
b) Nachweis der Peptidbindung an MHC- 1 Komplexe der T2-Zellen
Am nächsten Morgen wurden die Zellen geerntet, mit PBS enthaltend 0,5% bovines Serumalbumin (BSA) gewaschen und die MHC-1 Moleküle nachgewiesen. Dies erfolgt durch die Inkubation für 30 min auf Eis mit dem Antiköφer BB7.2, Waschen und Färbung mit einem α-Maus FITC- Antiköφer für weitere 30 min auf Eis. Die Zellen wurden erneut gewaschen, in einem FACScan calibur gemessen und mit Cellquest Software analysiert.
Fig. 2 zeigt die verschiedenen Peptide aufgetragen gegen die gemessene Fluoreszenz.
Ergebnis: T2-Zellen nach Inkubation mit den Ll -Peptiden 5106, 5107, 5109, 51 12, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020 und 2022 zeigen wie nach Inkubation mit dem bekannten Influenza-Peptid MP deutlich mehr MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche, was auf eine Bindung der entsprechenden Peptide an die MHC- Moleküle hindeutet.
Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Humane T-Zellen (4χl05) eines HLA A2.01 positiven Spenders wurden für 8 Wochen mit HPV16 L1ΛC*E7I -55 CVLPS bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg ml CVLPs sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 10 μg/ml verschiedener Antigene in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 und 0,5 μg/ml α-human CD28 restimuliert: a) über Nacht mit CVLP-inkubierten PBMC b) über Nacht mit Ll 2022-Peptid inkubierten PBMC c) über Nacht mit Ll 2025-Peptid (Kontroll-Peptid) inkubierten
PBMC
Nach einer Stunde wurde 1 μl Golgi Plug zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-hum CD3/PE, mit α-hum CD4/Cychrome und mit α-hum Interferon γ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 3 zeigt, daß die CVLP-inkubierten PBMC wie auch die mit dem Ll -Peptid 2022-inkubierten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T- Zellen bewirkten, nicht aber die mit dem Kontroll-Peptid inkubierten PBMC.
5. Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Humane T-Zellen (4x10"^) eines HLA AI positiven Spenders wurden für 5 Wochen mit HPV 16L 1ΛC*E7I_55 CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml CVLPs sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 10 μg/ml der auf der X-Achse von Fig. 4 angegebenen Peptide in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin (300 μM) zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-hum CD8/PE, mit α-hum CD4/Cychrome und mit α- hum Interferon γ/FITC gefärbt Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert
Ergebnis Fig 4 zeigt, daß die mit den Peptiden 43, 47 und 48-ιnkubιerten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit den ubπgen Peptiden inkubierten PBMC Das Peptid 43 enthalt das 9mer-Peptιd der Sequenz MHGDTPTLH, die beiden überlappenden Peptide 47 und 48 enthalten das lOmer-Peptid der Sequenz QAEPDRAHYN, die jeweils in Käst et al (su- pra) als HLA AI bindende Peptide beschπeben wurden, für die jedoch noch kein funktioneller Nachweis geführt werden konnte
6 Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Humane T-Zellen (4x10 ) eines nicht-HLA-typisierten Spenders wurden für 6 Wochen mit HPV16Llj,c*E7ι 5i CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml CVLPs sowie 10 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 10 μg/ml der auf der X-Achse von Fig 5 angegebenen Peptide in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin (300 μM) zugegeben Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-hum CD8/PE, mit α-hum CD4/Cychrome und mit α- hum Interferon γ/FITC gefärbt Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 5 zeigt, daß die mit den Peptiden 27 und 28-inkubierten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit den übrigen Peptiden inkubierten PBMC. Die beiden überlappenden Peptide 27 und 28 enthalten das Peptid der Sequenz SMVTSDAQI, so daß das tatsächlich erkannte Peptid im wesentlichen diese Sequenz umfassen muß.
Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Humane T-Zellen (4x10 ) eines HLA AI -positiven Spenders wurden für 6 Wo- chen mit HPV16L1ΛC*E7I _55 CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml CVLPs sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet.
Die 20mer-Peptide 1 bis 51 wurden gemäß der Matrix
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
in Peptidpools A bis H bzw. 1 bis 7 zusammengefaßt.
Anschließend wurden die T-Zellen eines HLA AI positiven Spenders in 100 μl Medium bei 37°C mit den Peptidpools in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Dabei wurden derartige Mengen der Peptidpools eingesetzt, daß für jedes einzelne Peptid 1 μg/ml zugegeben wurde. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Golgi Plug zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-hum CD8/PE, mit α-hum CD4/Cychrome und mit α-hum Interferon γ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 6 zeigt, daß die mit den Peptidpools E und 6 inkubierten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit den übrigen Peptidpools inkubierten PBMC. Die Peptidpools E und 6 enthalten gemeinsam das Peptid 45, das somit aller Voraussicht nach für die Restimulation der CVLP-stimulierte T-Zellen verantwortlich ist. Das Peptid 45 enthält wiederum das Peptid ETTDLYCY, das Käst et al. (supra) als HLA AI bindendes Peptid beschrieben hat, für das jedoch noch kein funktioneller Nachweis geführt werden konnte. Des weiteren wurden die T-Zellen eines HLA A24 positiven Spenders mit den Peptidpools wie oben restimuliert und analysiert.
Ergebnis: Fig. 7 zeigt, daß die mit den Peptidpools A und 2 inkubierten PBMC eine Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit den übrigen Peptidpools inkubierten PBMC. Die Peptidpools A und 2 enthalten gemeinsam das Peptid 9, das somit aller Voraussicht nach für die Restimulation der CVLP-stimulierte T-Zellen verantw örtlich ist. Die Voraussage nach Parker et al. (supra) ergibt ein potentielles Peptid für HLA A24 mit der Sequenz FYNPDTQRL, das somit voraussichtlich für die Aktivität des Peptids 9 verantwortlich ist.
8. Lvse von mit Peptid 9 belandenen BLCL-Zellen
BLCL-Zellen eines HLA A24-positiven Spenders wurden mit 5 lCr für eine Stunde bei 37°C inkubiert, dreimal mit Medium gewaschen und in 2 Aliquots aufgeteilt. Zum einen Aliquot der Zellen wurden 10 μg/ml von Peptid 9 gegeben, das ande- re Aliquot diente als Negativkontrolle in Abwesenheit eines Peptids. Anschließend wurden jeweils 2000 der Zellen (=Zielzellen) zu ansteigenden Mengen von T-Zellen (=Effektorzellen) in einem Gesamtvolumen von 150 μl gegeben. Die T- Zellen waren zuvor über 5 Wochen mit einem Gemisch aus 43 Peptiden (Peptide 1-43, je 1 μg/ml) stimuliert worden. Parallel wurden Ansätze für spontane und maximale Lyse der Zellen angesetzt. Für die spontane Lyse dienten Zielzellen, die in Medium inkubiert wurden, für die maximale Lyse dienten Zielzellen, die mit 0,5%) Triton inkubiert wurden. Die Ansätze wurden für 5 h bei 37°C inkubiert. 50 μl Überstand der Ansätze wurden auf Luma-Platten gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Am nächsten morgen wurde die Menge an radioaktivem 51Cr mit Hilfe eines Canbeπa-Packerd B-Plate Counter bestimmt (Counts) und in Relation zu den maximal lysierten Zellen des Triton- Ansatzes gesetzt. Dabei wurden die % spezifische Lyse nach der Formel: x = 100 • (counts - spontan counts) / (maximal counts - spontan counts) bestimmt.
Fig. 8 zeigt, daß die mit dem Peptid 9 beladenen BLCL-Zellen effektiv durch die T-Zellen lysiert werden konnten, die nicht beladenen BLCL-Zellen hingegen nicht. Das Peptid 9 ist somit ein HLA A24 restringiertes zytotoxische T- Zellepitop.

Claims

Patentansprüche
1. T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz ILVPKVSGL,
RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV, FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN, SMVTSDAQI, und/oder eine funktionell aktive Variante davon.
2. T-Zell-Epitop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte
Variante eine Sequenzhomologie zu ILVPKVSGL, RLVWACVGV, HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI von mindestens ca.
65%, vorzugsweise mindestens ca. 75% und insbesondere mindestens ca. 85% auf Aminosäureebene besitzt.
3. T-Zell-Epitop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Variante eine strukturelle Homologie zu ILVPKVSGL, RLVWACVGV,
HLFNRAGTV, YLRREQMFV, TLQANKSEV, ILEDWNFGL, SLWLPSEATVYL, NLASSNYFPT, TLTADVMTYI, YLPPVPVSKV, YDLQFIFQL, ICWGNQLFV FYNPDTQRL, MHGDTPTLH, ETTDLYCY, QAEPDRAHYN oder SMVTSDAQI hat.
T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das T-Zell-Epitop ein zytotoxisches T-Zell-Epitop ist.
5. Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1 bis
4, wobei die Verbindung kein natürlich vorkommendes Ll Protein eines
Papillomavirus und keine ausschließlich N-terminale oder ausschließlich
C-terminale Deletionsmutante eines natürlich vorkommenden Ll Proteins eines Papillomavirus ist.
Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ein Polypeptid, insbesondere ein Fusionsprotein ist.
7. Verbindung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die
Verbindung ein Polypeptid von mindestens ca. 50 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens ca. 35 Aminosäuren, insbesondere von mindestens ca. 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca. 9-13 Aminosäuren Länge ist.
8. Verbindung nach einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung eine chemische, radioaktive, nicht radioaktive Isotopen und/oder Fluoreszenzmarkierung des T-Zell-Epitops und/oder des genannten Fusionsproteins, und oder eine chemische Modifikation des T- Zell-Epitops und/oder Fusionsproteins enthält.
9. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein T-Zell-Epitop oder eine Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche
5-8 kodiert.
10. Vektor, insbesondere ein Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 enthält.
1 1. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 5-8 enthält, vorzugsweise präsentiert.
12. Zelle nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 und/oder einem Vektor gemäß Anspruch 10 transfiziert, transformiert, und/oder infiziert ist.
13. Zelle nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit min- destens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 und/oder mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 5-8, inkubiert wurde.
14. Zelle nach Anspruch 1 1 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine B-Zelle, ein Makrophage, eine dendritische Zelle, ein Fibroblast, insbesondere eine JY-, T2-, CaSki-Zelle oder EBV-transformierte Zelle ist.
15. Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1 -4 oder eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 und mindestens ei- ne weitere Verbindung.
16. Komplex nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex mindestens ein MHC-Klasse I-Molekül, vorzugsweise als HLA A2.01 Te- tramer enthält.
17. Komplex nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte MHC-Klasse I Molekül ein humanes MHC-Klasse I Molekül, insbesondere ein HLA A2.01 Molekül ist.
18. Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen durch mindestens eine Verbindung, enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1 -4, das folgende Schritte enthält: a) Stimulation von Zellen mit mindestens einer genannten Verbindung; b) Zugabe von mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1 -4 präsentiert oder eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 15-17, und c) Bestimmung der Aktivierung von T-Zellen.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Schritt a) folgenden zusätzlichen Schritt a') enthält:
a') Cokultivierung der Zellen für mindestens ca. 1 Woche, insbesondere mindestens ca. 8 Wochen mit:
(i) mindestens einer Zielzelle beladen mit einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens einem Komplex gemäß ei- nem der Ansprüche 15-17, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP, und oder mindestens einem Virus,
(ii) mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17,
(iii) und/oder mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4 präsentiert, bevor sich Schritt b) anschließt.
20. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach einem der Ansprüche 1 1 , 13, 14, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzelle mit mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 und/oder mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 enthaltend ein T- Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 5-8, inkubiert wird.
21. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach einem der Ansprüche 1 1 , 12, 14, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzellen mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 und/oder einem Vektor gemäß Anspruch 10 transfiziert, transformiert und/oder infiziert wird.
22. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzelle eine B-Zelle, ein Makrophage, eine dendritische Zelle, ein Fibroblast, insbesondere eine JY-, T2-, CaSki- Zelle oder EBV-transformierte Zelle ist.
23. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von Schritt a) folgender Schritt a") durchgeführt wird: a") Gewinnung und Präparation von Proben enthaltend T-Zellen und an- schließende Kultivierung.
24. Testsystem zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen enthaltend: a) mindestens ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4, mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 10, mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 1-14, und/oder mindestens einen Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17, und b) Effektorzellen des Immunsystems, vorzugsweise T-Zellen, insbesondere zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen.
25. Verwendung mindestes eines T-Zell-Epitops gemäß einem der Ansprüche 1-4, mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens eines Vektors gemäß Anspruch 10, mindestens einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 1-14, und/oder mindestens eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 15-17 zur Auslösung oder zum Nachweis einer Immunantwort.
26. Arzneimittel oder Diagnostikum enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 10, mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 1-14, und/oder mindestens einen Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
27. Arzneimittel oder Diagnostikum nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens ein Vektor gemäß Anspruch 10, mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 1-14, und/oder mindestens ein Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 in Lösung vorliegt, an eine feste Matrix gebunden ist, und/oder mit einem Adjuvans versetzt ist.
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