DE4447664C2 - Fusionsproteine, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Anwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft rekombinant hergestellte Fusionsproteine sowie Verfahren zur Bildung dieser Fusionsproteine und deren Anwendung.

Infektionen mit bestimmten ("high-risk") Typen von genitalen Papillomaviren des Menschen (HPV), z. B. HPV 16, 18 oder 45, gelten als hauptsächlicher Risikofaktor für die Entstehung von bösartigen Tumoren des Anogenitaltrakts, von denen Gebärmutterhalskrebs (Cervixcarcinom) mit Abstand am häufigsten ist. Nach einer Schätzung der WHO treten jährlich weltweit etwa eine halbe Million neuer Fälle dieser Erkrankung auf. Aufgrund dieser Häufung ist der Zusammenhang zwischen HPV-Infektion und Cervixcarcinom am besten untersucht:

• a) Vorläuferläsionen vom Cervixcarcinom (cervikale intraepitheliale Neoplasie: CIN) werden durch Papillomavirus-Infektion verursacht.
• b) Die Genome bestimmter HPV-Typen (z. B. 16, 18, 33, 35, 45) werden in mehr als 95% der Tumorbiopsien sowie in davon abgeleiteten Zellinien nachgewiesen. Abhängig vom geographischen Ursprung der Tumore enthalten 50 bis 70% davon HPV 16.
• c) In allen daraufhin untersuchten Fällen werden die offenen Leseraster E6 und E7 transkribiert (Wettstein et al., in Pfister H. (ed): Papillomaviruses and human cancer, S. 155 bis 179, Boca Raton, 1990).
• d) Die Proteine E6 und E7 sind in allen Cervixcarcinom- Zellinien sowie in in vitro transformierten menschlichen Keratinozyten nachweisbar und die Mehrzahl der Cervixcarcinom-Patientinnen haben E6- bzw. E7-spezifische Antikörper.
• e) Die konstitutive Expression der E6/E7-Proteine ist notwendig zur Aufrechterhaltung des transformierten Zustandes HPV-positiver Tumore.
• f) Die E6- und E7-Gene von HPV 16 und HPV 18 sind biologisch in folgenden experimentellen Systemen aktiv:
  • 1. Induktion von zellulärer DNA Synthese in menschlichen Zellen;
  • 2. Transformation von menschlichen Keratinozyten und anderen Zellen in Kultur;
  • 3. Tumorbildung in transgenen Mäusen.

Andere HPV-Typen (in erster Linie HPV 6 und 11) verursachen gutartige Genitalwarzen (condylomata acuminata) und sind nur extrem selten mit bösartigen Tumoren assoziiert ("low-risk" Typen).

Genitale Papillomaviren des Menschen werden in der Regel durch Geschlechtsverkehr übertragen und führen in den meisten Fällen zu einer persistierenden Infektion in der Anogenital- Schleimhaut. Daraus wurde geschlossen, daß Primärinfektionen nur eine ungenügende Immunantwort induzieren oder daß das Virus Möglichkeiten entwickelt hat, in den infizierten Zellen der Immunüberwachung zu entkommen. Auf der anderen Seite gibt es gute Hinweise darauf, daß das Immunsystem bei der Primärmanifestation bzw. bei der malignen Progression von Papillomavirus-Infektionen beteiligt ist (zur Übersicht siehe Altmann et al. (1994) in Minson A., Neil J., McCrae M. (eds): Viruses and Cancer, Cambridge University Press, S. 71 bis 80).

• a) Bei animalen Papillomaviren (Kaninchen-Papillomavirus und Rinder-Papillomavirus) läßt sich die klinische Manifestation von Primärinfektionen durch Vakzinierung mit Virus-Strukturproteinen oder mit Warzenextrakten ("autologe Vakzine") verhindern.
• b) Nager werden durch Impfung mit HPV 16 E6- oder E7- positiven Vaccinia-Rekombinanten bzw. durch synthetische Peptide vor der Tumorbildung nach Inokulation HPV 16 transformierter autologer Zellen geschützt.
• c) Regression von Warzen ist oftmals systemisch und läßt sich bei animalen Papillomaviren durch Transfer von Lymphozyten von "Regressor"-Tieren induzieren.
• d) Die Häufigkeit von Genitalwarzen, CIN und Anogenitalkrebs ist bei immunsupprimierten Patienten (z. B. Nierentransplantierten oder HIV-Infizierten) erhöht.

Daraus wurde geschlossen, daß Papillomavirus-spezifische Impfungen mit dem Ziel der Verhinderung der Primärinfektion und der Entstehung von Genitalkrebs möglich sein sollten.

• 1. Geeignet ist die Verhinderung von HPV-Infektionen durch Impfung mit den Papillomavirus-Strukturproteinen L1 und L2 (prophylaktische Impfung).
  Da sich Papillomaviren nicht in Zellkultur oder anderen experimentellen Systemen zu ausreichenden Titern vermehren lassen, können die viralen Proteine nur mit Hilfe rekombinanter Vektoren hergestellt werden. Kürzlich wurden virusähnliche Partikel (VLP), die nach Expression der viralen Strukturproteine L1 und L2 (bzw. L1 allein) in rekombinanten Vakzinia oder Baculovirus entstehen, beschrieben. Die Reinigung der VLP's ist sehr einfach mittels Zentrifugation in CsCl- oder Sucrosegradienten durchführbar.
  Die WO 93/02184 beschreibt eine Methode, die "Papilloma virus like particles" (VLP's, Papillomavirusähnliche Partikel) zur Verfügung stellt, die für diagnostische Verwendungen oder als Vaccine gegen durch den Papillomavirus verursachte Infektionen genutzt werden.
  Die WO 94/00152 beschreibt ein rekombinant produziertes L1-Haupt-Capsid-Protein, welches die konformational neutralisierenden Epitope auf humanen und tierischen Papilloma-Virionen nachahmt (mimics). Diese rekombinanten Proteine sind als Vaccine, die gegen Papillomavirus- Infektionen schützen, einsetzbar.
• 2. Behandlung von Cervixcarcinomen oder Vorläuferläsionen durch Immuntherapie mit Hilfe von frühen Papillomavirus- Proteinen (in erster Linie E6 bzw. E7), die in den persistent infizierten Zellen exprimiert werden (therapeutische Impfung).
  Es wird angenommen, daß durch diese Impfung zytotoxische T-Zellen gegen persistent infizierte Genitalläsionen aktiviert werden. Zielpopulation sind Patienten mit HPV- assoziierten prämalignen oder malignen Genitalläsionen.

Frühe HPV-Proteine werden durch Expression in E. coli oder eukaryontischen Vektoren (z. B. Baculovirus oder Hefe) hergestellt. Die Reinigung wird jedoch durch die geringe Löslichkeit erschwert und bedarf in der Regel einer Kombination von Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltration und Affinitätssäulen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Fusionsproteine zur Verfügung zu stellen, die sich als prophylaktischer und therapeutischer Impfstoff eignen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Proteine. Ebenso soll eine einfache Reinigung der erhaltenen rekombinanten Proteine ermöglicht sein.

Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe gemäß den im unabhängigen Anspruch 1 angegebenen Fusionsproteinen, dem im Anspruch 6 angegebenen Verfahren und der Anwendung nach Anspruch 9. Weitere bevorzugte Ausgestaltungen, Aspekte und Details der Erfindung sind in den abhängigen Patentansprüchen und den bevorzugten Ausführungsformen dargelegt.

Es werden VLP's hergestellt, die aus Fusionsproteinen von späten und frühen HPV-Proteinen (oder Fragmenten davon) ("HVLP") bestehen und für prophylaktische bzw. therapeutische Impfung einsetzbar sind. Ein solcher Impfstoff besitzt gegenüber konventionellen Präparaten die im folgenden beschriebenen Vorteile:

• a) Im Falle von prophylaktischer Impfung verhindern HVLP's durch Induktion L1/L2-spezifischer Antikörper nicht nur den Eintritt des Virus in die Zelle, sondern eliminieren bereits infizierte Zellen (durch Induktion von zytotoxischen T-Zellen), falls schon früher eine Infektion stattgefunden hat oder die humorale Immunantwort nicht ausreichend war.
• b) Im Falle von therapeutischer Impfung eliminieren HVLP's persistent infizierte Zellen (z. B. bei Patienten mit CIN oder Cervixcarcinom) und verhindern vor allem bei Patientinnen mit CIN-Läsionen eine Reinfektion.
• c) Die Reinigung der HVLP's ist ähnlich einfach wie die der VLP's ohne frühe HPV-Proteine.

VLP's des Bovinen Papillomavirus (BPV) Typ 1 und der humanen Papillomaviren 11 und 16 können nach Expression von L1 plus L2 bzw. von L1 allein in Vaccinia oder Baculovirus hergestellt werden. Experimente zeigen, daß Teile des L1- Proteins deletiert werden können (Aminosäuresequenz 311-351, 331-371, 391-431 von BPV 1; 306-315 von HPV 16), ohne daß die Fähigkeit zur Bildung von VLP's verlorengeht. Solche Bereiche existieren in den L1-Proteinen aller Papillomaviren, so daß der deletierte Bereich von L1 durch andere Proteine (von Papillomaviren oder von anderem Ursprung) ersetzt werden kann und daß so virusähnliche Hybridpartikel hergestellt werden können. In gleicher Weise werden auch Teile des Papillomavirus-Proteins L2 deletiert und durch andere (frühe HPV oder sonstige) Proteine ersetzt, daß also HVLP's auch aus dem vollständigen L1-Protein plus einem L2-Fusionsprotein gebildet werden können.

Fusionsproteine bestehend aus deletiertem L1- oder L2-Protein von verschiedenen HPV-Typen (in erster Linie HPV 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45) und den entsprechenden frühen Proteinen E1, E2, E4, E5, E6, E7 (oder Teilen davon) werden durch Expression in Vaccinia-Rekombinanten hergestellt, die in sehr kurzer Zeit konstruiert werden können. Die Bildung von VLP's, bestehend entweder aus einem L1-Fusionsprotein oder aus einem vollständigen L1-Protein plus einem L2-Fusionsprotein, wird durch Elektronenmikroskopie überprüft und das Vorhandensein des frühen HPV-Proteins durch Western Blot Analyse mit Hilfe spezifischer Antiseren getestet. Für die Produktion von HPLV's im großen Maßstab wird die Expression der Proteine in viralen oder eukaryotischen Systemen, bevorzugt in Baculovirus oder in Hefe, durchgeführt.

Entsprechende Experimente zur Herstellung von Fusionsproteinen können mit Proteinen anderen Ursprungs durchgeführt werden.

Rekombinant hergestellte, virusähnliche Partikel (virus like particles, VLP's) können nach Expression der viralen Strukturproteine L1 und/oder L2 entstehen, wobei Abschnitte des L1- und/oder L2-Proteins deletiert sind, ohne daß die Fähigkeit zur Bildung von VLP's verlorengeht.

Gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem deletierten Bereich im L1-Protein des Bovinen Papillomavirus Typ 1 bevorzugt um die Aminosäuresequenzen 311-351, 331-371, 391-431. Bei L1-Proteinen des humanen Papillomavirus 16 handelt es sich vorteilhafterweise um die Aminosäuresequenz 306-315.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird der deletierte Bereich von L1- und/oder L2-Proteinen durch andere Proteine oder Proteinfragmente ersetzt, wobei Fusionsproteine erhalten werden. Der Anteil an L1- bzw. L2- Protein beträgt vorteilhafterweise ca. 50 bis 99%, bevorzugt ca. 60 bis 90%, besonders bevorzugt ca. 80%.

Gemäß der vorliegenden Erfindung sollen jedoch, wenn auch im weiteren nicht explizit erwähnt, auch mehr als ein Bereich des L1- und/oder L2-Proteins deletiert und bevorzugt durch andere Proteine oder Proteinfragmente ersetzt werden.

Besonders bevorzugt wird der deletierte Bereich im L1- oder L2-Protein durch andere Proteine von Papillomaviren und/oder Proteine anderen Ursprungs ersetzt, wodurch virusähnliche Hybridpartikel (HVLP's) herstellbar sind.

Es hat sich als besonders vorteilhaft gemäß der vorliegenden Erfindung erwiesen, daß die Bildung der VLP's aus einem L1- Fusionsprotein oder gemäß einer weiteren Ausführungsform aus einem vollständigen L1-Protein und einem L2-Fusionsprotein erfolgt.

Die Fusionsproteine, insbesondere zur Bildung von virusähnlichen Hybridpartikeln bestehen gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise aus einem deletierten L1- und/oder L2-Protein von verschiedenen HPV-Typen (human papilloma virus), besonders bevorzugt HPV 6, 11, 16, 18, 33, 35 und 45, und anderen Proteinen oder Proteinfragmenten. Bevorzugt handelt es sich bei diesen anderen Proteinen oder Proteinfragmenten um entsprechende frühe Proteine oder Fragmente davon, wie z. B. die frühen Proteine E1, E2, E4, E5, E6 und/oder E7.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Expression der Fusionsproteine und Proteine in viralen oder eukaryotischen Vektoren, ganz besonders bevorzugt in Baculoviren oder in Hefen, durchgeführt.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Fusionsproteine durch Expression in Vaccinia-Rekombinanten hergestellt.

Die Anwendung der Fusionsproteine oder der virusähnlichen Hybridpartikel zur Herstellung eines prophylaktischen und therapeutischen Impfstoffs erfolgt gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt nach Zugabe weiterer Komponenten.

Claims (10)

1. Fusionsproteine, dadurch gekennzeichnet, daß die Fusionsproteine deletierte L1- und/oder L2-Proteine von verschiedenen HPV-Typen und andere Proteine oder Fragmente davon enthalten.

2. Fusionsproteine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Bildung von papillomavirusähnlichen Hybridpartikeln eingesetzt werden.

3. Fusionsproteine nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die anderen Proteine oder Fragmente frühe Proteine oder Fragmente sind.

4. Fusionsproteine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die frühen Proteine E1, E2, E4, E5, E6, E7 oder um Fragmente davon handelt.

5. Fusionsprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um deletierte L1- und/oder L2-Proteine von verschiedenen HPV-Typen, insbesondere HPV 6, 11, 16, 18, 33, 35 und 45, handelt.

6. Verfahren zur Expression der Fusionsproteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression der Proteine und Fusionsproteine in viralen oder in eukaryotischen Vektoren durchgeführt wird.

7. Verfahren zur Expression der Fusionsproteine nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Fusionsproteine durch Expression in Vaccinia- Rekombinanten hergestellt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression der Proteine und Fusionsproteine in Baculoviren oder in Hefen durchgeführt wird.

9. Anwendung der Fusionsproteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines prophylaktischen und therapeutischen Impfstoffs.

10. Anwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß weitere Komponenten zugegeben werden.