EP1066321A2 - Formulierung mit papillomavirus-spezifischem protein, seine herstellung und verwendung - Google Patents

Formulierung mit papillomavirus-spezifischem protein, seine herstellung und verwendung

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Publication number
EP1066321A2
EP1066321A2 EP99917850A EP99917850A EP1066321A2 EP 1066321 A2 EP1066321 A2 EP 1066321A2 EP 99917850 A EP99917850 A EP 99917850A EP 99917850 A EP99917850 A EP 99917850A EP 1066321 A2 EP1066321 A2 EP 1066321A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
hpv
formulation according
deleted
approximately
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99917850A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alexander Burger
Josef Gabelsberger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medigene AG
Original Assignee
Medigene AG
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1066321A2 publication Critical patent/EP1066321A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a formulation comprising at least one papillomavirus-specific protein with about 0.3 to about 4 M of a salt at a pH of about 7.3 to about 7.45.
  • the papilloma viruses also called wart viruses, are double-stranded DNA viruses with a genome size of about 8000 base pairs and an icosahedral capsid with a diameter of approx. 55 nm.
  • human papilloma virus some of which, for example, HPV 16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 or HPV-58, malignant tumors and others, e.g. HPV-6, HPV-1 1 or HPV-42, can cause benign tumors
  • the genome of the papillomaviruses can be divided into three areas.
  • the first area concerns a non-coding region that contains regulatory elements for the transcription and replication of the virus.
  • the second region so-called E- (early) region, contains different protein-coding sections E1- E7, of which, for example, the E6 and E7 proteins are responsible for the transformation of epithelial cells and the E1 protein controls the DNA copy number.
  • the E6 and E7 regions are so-called oncogenes, which are also malignant in malignant cells Cells are expressed.
  • the third region also known as the L (late) region, contains two protein-coding sections L1 and L2 which code for structural components of the virus capsid.
  • the Ll protein is present to over 90% in the viral capsid, whereby the Ratio of Ll L2 is generally 30 1
  • HPV-6 and HPV-11 are blamed for genital warts
  • some types of papilloma virus such as HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 and HPV-58 are included malignant tumors of the anogenital tract
  • HPV-16 is associated with cervical cancer in over 50% of cases (Cervical carcinoma)
  • HPV-16 is the main risk factor for the formation of cervical neoplasms.
  • the immune system also plays an important role in the progress of the disease.
  • E7 protein is considered as a potential tumor antigen and as a target molecule for activated T cells.
  • induced cellular immune response in the patient is apparently not strong enough to influence the course of the disease.
  • the immune response may be enhanced by suitable vaccines
  • VLPs virus-like particles
  • the VLPs could be used to generate neutralizing antibodies in various animal systems
  • virus-neutralizing antibodies are of less clinical importance if the virus infection has already taken place, since a virus-specific cytotoxic T-cell (CTL) response seems to be necessary for the inhibition of virus-infected cells.
  • CTL cytotoxic T-cell
  • CVLPs Papillomavirus-like particles
  • Some CVLPs induce an E7-specific CTL response in mice, although experiments failed To induce antibodies against E7 by immunizing mice with CVLPs (Muller, M et al (1997), supra).
  • neutralizing antibodies from HPV-associated To limit the immune diseases in patients to the administered L1 protein (Muller, M et al (1997), supra) CVLPs are, however, still interesting for the development of a vaccine, since the E7 presented via class I MHC molecules -Proteins from tumor cells were target molecules from CTLs
  • VLPs or CVLPs are generally produced genetically by expression of the corresponding genes coding for one or more L proteins or L and E proteins in suitable expression systems.
  • the corresponding genes are described, for example, by Kirnbauer, R et al (1994) J Virol 67 , 6929-6936 or obtainable from the EMBL database.
  • the access numbers are, for example, for HPV18 PAPHPV18, for HPV31 PAPPPH31, for HPV33 PAPPPH33 or for HPV58 PAPPPH58.
  • Suitable expression systems are, for example, genetically modified yeasts, for example Saccharomyces (cerevisiaiae), P (pastoris), Kluyvermyces (lactis), Schizosaccharomyces (pombe) or Hansenula (polymorpha) (Carter, JJ et al (1991), Virology, 182, 513), insect cells, such as, for example, Trichoplusia ni High Five (see, for example, Muller, M et al (1997), supra) or prokaryotic cells (see, for example, WO 96/1 1272).
  • yeasts for example Saccharomyces (cerevisiaiae), P (pastoris), Kluyvermyces (lactis), Schizosaccharomyces (pombe) or Hansenula (polymorpha)
  • insect cells such as, for example, Trichoplusia ni High Five (see, for example, Muller, M et al (1997), supra) or prokary
  • inclusion bodies inclusion bodies
  • capsomers further purification steps are necessary after expression
  • capsids and capsomers A major problem with the use of capsids and capsomers as medicaments is their poor solubility.
  • capsids or capsomers of HPV-16 tend to aggregate, as a result of which the solubility is substantially reduced.
  • the partly low solubility of the capsids or capsomers not only leads to a loss of yield, but also to difficult use as a drug or diagnostic.
  • a degradation of the C-terminus of the Ll protein can sometimes be observed, which leads to inhomogeneous leads material that is not suitable for approval as a drug or diagnostic
  • WO 98/44944 describes an HPV antigen formulation containing a vaccine component, a salt at physiologically acceptable concentrations and a non-ionic detergent at physiologically acceptable concentrations
  • the present invention therefore relates to a formulation comprising at least one late protein (L protein) of one or more papillomaviruses and / or at least one early protein (E protein) of one or more papillomaviruses and about 0.3 to about 4 M , preferably about 0.4 to about 2.5-3 M, in particular about 0.4-0.5 to about 1-2 M, especially about 1 to about 2 M of a salt at a pH of about 7, 3 to about 7.45, preferably about 7.4, and, if appropriate, suitable additives and / or auxiliaries, preferably without any additives and / or auxiliaries
  • the term “formulation” is understood to mean a composition in the form of a solution or a suspension of the papillomavirus-specific proteins mentioned, with immunoreactive papilla do not sediment mavirus-specific proteins in general and in particular up to a maximum of about 5000 g
  • the salt is generally an alkali or alkaline earth metal salt, preferably a halide or phosphate, in particular an alkali halide, especially NaCl and / or KC1.
  • a halide or phosphate in particular an alkali halide, especially NaCl and / or KC1.
  • the use of NaCl is particularly preferred for the preparation of a pharmaceutical formulation
  • the pH of the composition is generally adjusted with a suitable organic or inorganic buffer, such as preferably with a phosphate buffer, Tris buffer (Tris (hydroxymethyl) aminomethane), HEPES buffer ([4- (2 -Hydroxyethyl) -piperazino] -ethanesulfonic acid) or MOPS buffer (3-morpholino-l-propanesulfonic acid).
  • a suitable organic or inorganic buffer such as preferably with a phosphate buffer, Tris buffer (Tris (hydroxymethyl) aminomethane), HEPES buffer ([4- (2 -Hydroxyethyl) -piperazino] -ethanesulfonic acid) or MOPS buffer (3-morpholino-l-propanesulfonic acid).
  • a suitable organic or inorganic buffer such as preferably with a phosphate buffer, Tris buffer (Tris (hydroxymethyl) aminomethane), HEPES buffer ([4- (2 -Hyd
  • composition according to the invention as a medicament or diagnostic agent, it is particularly preferred if the papillomavirus-specific proteins do not contain papillomavirus-unspecific epitopes, since this can reduce or prevent a papillomavirus-unspecific immune response
  • L-protein and E-protein mean both the Vol GmbH proteins and their mutants, such as, for example, deletion mutants
  • the composition according to the invention contains a deleted L protein, preferably a deleted L1 and / or L2 protein.
  • the deletion has the advantage that other proteins, for example PapiUomavirus-specific E protein sequences, can be inserted into the deleted area , whereby the field of application of the composition according to the invention can be expanded.
  • the C-terminal deletion has the advantage that the efficiency of the The formation of virus-like particles can be increased since the nuclear localization signal located at the C-terminus is deleted.
  • the C-terminal deletion is therefore preferably up to approx. 35 amino acids, in particular approx. 25 to approx.
  • a 32 amino acid C-terminal deletion of the HPV-16 L1 protein and an approximately 26 amino acid long C-terminal deletion of the BPV-1 Ll protein are sufficient to form virus-like particles to be able to increase this at least about ten times
  • the E protein is also deleted, in particular the E6 and / or E7 protein.
  • the C-terminal part of the E protein is deleted, preferably the C-terminal part of the E7 Proteins, since these constructs can preferably form capsomers and / or capsids in conjunction with deleted L-protein.
  • a particularly preferred construct is, for example, E7 with the N-terminal amino acids 1 to about 60, since this construct contains a mouse epitope for the activation of cytotoxic T lymphocytes, which is located in the region of amino acids 49-57.
  • Another preferred construct is E7 with the N-terminal amino acids 1 to about 55, which forms capsomers and capsids in conjunction with deleted L-protein, since this construct presumably does not contain E7-specific sequences in the region of amino acids 56-70, which form the formation of capsids
  • a Ll protein of HPV-16 deleted by 32 amino acids C-terminal, which is linked to an E7 protein of HPV-16 with amino acids 1-55 or 1-60 is particularly preferred.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention is therefore a Ll ⁇ E7 ⁇ -x fusion protein, preferably in the form of a CVLP, in particular of HPV16, where x is an integer from 55 up to and including 60, and in particular an L1 ⁇ CE7] .55 or Ll ⁇ CE7 ⁇ .6o fusion protein
  • the L protein to the E protein, for example in the form of a fusion protein.
  • the described papillomavirus-specific proteins are in the form of a capsid and / or Capsomers are present, since the immune response can be significantly increased by the capsids and / or capsomers and in particular by the proportion of L protein.
  • Fusion proteins which are suitable for capsid and / or capsomer formation are therefore, for example, fusion proteins from deleted L1 and E7, E6 and / or El preferred
  • capsids are viral or virus-like structures in a generally icosahedral form, which are generally composed of approximately 72 capsomers
  • capsomers are assembled proteins containing at least one papillomavirus structural protein, preferably L1 or deletions of L1.
  • L1 or deletions of L1 preferably L1 or deletions of L1.
  • 5 fusion proteins can assemble to form a capsomer, which in turn can assemble to form a capsid
  • Proteins or peptides of human papillomavirus (HPV) and preferably of HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV are for the described constructs for the production of a human medicament or diagnostic agent -35, HPV-39, HPV-45, HPV-52 and / or HPV-58, in particular HPV-16, HPV-18, HPV-31 and / or HPV-45 suitable.
  • the expression vectors can be, for example, prokaryotic or eukaryotic expression vectors.
  • prokaryotic expression vectors for expression in E. coli for example, the vectors pGEM or pUC-Derviate (see, for example, WO96 / 11272).
  • Examples of eukaryotic expression vectors for expression in Saccharomyces cerevisiae for example, the vectors p426Met25 or p426GALl (Mumberg et al (1994) Nucl Acids Res, 22, 5767-5768, Carter, JJ et al (1991) supra) and for expression in insect cells, for example baculovirus vectors, in particular the Autographa Californica virus, as in EP-B1-0 127 839 or EP- B1-0 549 721 (see, for example, also WO94 / 20137), and for expression in sucker cells, for example the vectors Rc / CMV and Rc / RSV or SV40 vectors, all of which are generally available.
  • Baculovirus expression systems such as the Baculo Gold TM Transfection Kit from Pharmingen or the Bac-to-Bac TM Baculovirus Expression Systems from Gibco BRL.
  • Other suitable expression systems are recombinant vaccinia viruses (see, for example, WO 93/02184)
  • the expression vectors also contain promoters suitable for the respective host cell, such as, for example, the trp promoter for expression in E. coli (see, for example, EP -B 1-0 154 133), the ADH2 promoter for expression in yeasts ( Rüssel et al (1983), J Biol Chem 258, 2674-2682), the baculovirus polyhedrin promoter for expression in insect cells (see, for example, EP-B1-0 127 839 or US 5,004,687) or the early SV40 promoter or LTR - Promoters e.g. from MMTV (mouse mammary tumor virus, Lee et al (1981) Nature 214, 228-232)
  • promoters suitable for the respective host cell such as, for example, the trp promoter for expression in E. coli (see, for example, EP -B 1-0 154 133), the ADH2 promoter for expression in yeasts ( Rüssel et al (1983), J Biol Chem 258, 2674-
  • Suitable host cells are, for example, the E coli strains DH5, HB101 or BL21, the yeast strains Saccharomyces cerevisia, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces or Hansenula (Carter, JJ et al (1991), Virology, 182, 513), the insect cell line Lepidopteran, e.g. from Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou or Galleria Mellonela or the animal cells COS, C127, Vero, 293 and HeLa, all of which are generally available (see e.g. WO94 / 00152)
  • the coding nucleic acids for the individual papillomavirus-specific proteins can, for example, be isolated and cloned from a gene bank via PCR (“polymerase chain reaction”) amplification.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the genome of BPV-1 is under the GenBank Accession No X02346 or HPV-16 generally available under GenBank Accession No K02718.
  • Amino acid long HPV 16 E7 protein is described, for example, by Seedorf et al.
  • Virology 145, 181-185.
  • Another method of obtaining the desired nucleic acids is to isolate the papillomavirus-specific genes directly from warts or tumors by means of PCR. Suitable primers for the E6 and E7 genes HPV-16 and HPV-18 are disclosed, for example, in WO93 / 21958. Further references for the desired nucleic acids are, for example, Kirnbauer, R et al (1994), supra and the clones mentioned above in the EMBL database
  • the expression vector is constructed in such a way that the expressed fusion protein is not extended by any further amino acids caused by the vector. This is achieved, for example, by generating unwanted nucleotides by mutagenesis in a PCR reaction using suitable primer oligonucleotides code for additional amino acids, are removed (Ho et a (1989) Gene, 77, 51-59). In this way, a fusion protein is obtained which is free of additional amino acids and thus free of any additional foreign epitopes which can cause immunological side reactions
  • Suitable additives and / or auxiliaries which serve, for example, to further stabilize the papillomavirus-specific protein in the composition according to the invention, are, for example, detergents, such as, for example, Triton-X-100 or sodium deoxycholate, but also polyols, such as, for example, polyethylene glycol or Glycerin, sugar, such as B sucrose or glucose, zwitterionic compounds, such as. B amino acids such as glycine or in particular taurine or betaine and / or protein, such as bovine or human serum albumin. Detergents, polyols and / or zwitterionic compounds are preferred
  • protease inhibitors such as aprotinin, ⁇ -aminocaproic acid or pepstatin A
  • Another object of the present invention is a process for the preparation of the formulation according to the invention, the PapiUomavirus-specific protein described above, for example in solution containing about 0.3 to about 4 M, preferably about 0.4 to about 2.5 to 3 M, in particular approx. 0.4 - 0.5 to approx. 1 - 2 M, especially approx. 1 to approx. 2 M of a salt with a corresponding pH value of approx. 7.3 to approx. 7.45, preferably approx. 7.4 as well as suitable ones
  • Additives and auxiliary substances are introduced and / or dialyzed against the composition described.
  • the formulation can preferably be stored in a stable manner at about 4 ° C. or above all at about -80 ° C. over a longer period, for example 1-2 months or longer
  • the formulation according to the invention is suitable as a medicament or diagnostic agent.
  • the present invention therefore also relates to the use of the formulation according to the invention as a medicament or diagnostic agent.
  • the formulation according to the invention is preferably adjusted to a concentration of approximately 0.45 M.
  • the medicament does not contain an adjuvant, ie no substance which enhances the immunogenicity of the papillomavirus-specific protein, since in particular in the presence of an L protein, especially of Ll, the immunogenicity is already sufficiently enhanced. This property is particularly important in the approval as a drug or diagnostic, because the only immunostimulating materials approved by the regulatory authorities are currently aluminum salts
  • the medicinal product is particularly suitable for avoiding and / or treating papillomavirus-specific benign or malignant tumors, in particular malignant tumors such as, for example, laryngeal, cervical, penile, vulvar or anal carcinoma, and the diagnostic agent for diagnosing one or several pairs pillomavirus infection (s)
  • a diagnostic agent is immunodiagnostics known to the person skilled in the art, for example an ELISA for measuring papillomavirus-specific antibodies (see, for example, Voller, A et al (1976) Bull World Health Organ, 53, 55-63) or a skin test according to e.g. Hopfl et al (1991) Lancet 1, 373-374)
  • the medicament can be administered orally, parenterally, for example subcutaneously, intramuscularly or via the mucous membrane, in liquid or suspended form, in the form of an elixir or as capsules, preferably as an injection or infusion solution an adjuvant can be dispensed with, which is particularly advantageous
  • Another object of the present invention therefore relates to the use of the formulation according to the invention as an injection or infusion solution
  • Injection solutions are generally used when only relatively small amounts of a solution or suspension, for example about 1 to about 20 ml, are to be supplied to the organism.
  • Infusion solutions are generally used when a larger amount of a solution or suspension, for example a or several liters, should be administered Since, in contrast to the infusion solution, only a few milliliters are administered with injection solutions, slight deviations from the pH value and from the osmotic pressure of the blood or the tissue fluid during the injection do not, or only insignificantly with regard to the Sensation of pain noticeable. Dilution of the formulation according to the invention before use is therefore generally not necessary.
  • the formulation according to the invention should be diluted shortly before application so that an isotonic solution can be obtained
  • the ionic solution is a 0.9% sodium chloride solution.
  • the dilution can be done, for example, with sterile water during the application, for example via a so-called bypass
  • the main advantage of the present invention is that the formulation according to the invention essentially does not lead to the precipitation of immunoreactive papillomavirus-specific protein. In particular, more than about 90%, especially more than about 95% of the protein remain in solution and do not fall for one Period of at least approx. 12 hours from.
  • the immunoreactive PapiUomavirus-specific protein cannot be sedimented significantly by centrifugation at a maximum of 5000 g.
  • the formulation remains homogeneous and stable over a longer period of approx. 1-2 months and longer
  • HPV 16L1 ⁇ C * E7 1-55 was prepared according to Muller, M et al (1997), supra.
  • the HPV-16L1 open reading frame (ORF) was derived from the plasmid HPV-16-114 / k-Ll / L2-pSynxtVr ( Kirnbauer, R et al (1994) J Virol 67, 6929) with the restriction endonuclease BglII and cloned into the vector pUC19 (New England Biolabs) in the BamHI site.
  • Two primers were constructed for the production of HPV-16L1 ⁇ C. 16L1 ORF are complementary.
  • the first primer has the sequence AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC and the second primer AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG
  • Both primers code 5 'an EcoRV restriction enzyme interface.
  • the EcoRV site is followed by a TAA translation stop codon in order to delete the last 34 amino acids of the HPV16L1 ORF.
  • the PCR reaction was carried out to remove the entire L1 ORF and the whole Vector to amplify.
  • the linear product was digested with EcoRV, circularized with T4 DNA ligase and E coli DH5 ⁇ cells transformed. The clones were analyzed for the presence of an EcoRV site.
  • the resulting construct pUCHPV16Ll ⁇ C was used to isolate the ORF of HPV16E7 1-50 in to clone the EcoRV site
  • Primers with a 5 PrimcoRV restriction enzyme interface were used to clone the fragment.
  • the following primer pair was used: AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC and
  • the PCR products were cleaved with EcoRV and inserted into the EcoRV site of the modified Ll gene
  • Spodoptera frugiperda (Sf9) cells were grown as monolayers or in suspension culture in TNM-FH insect medium (Sigma, Deisenhofen) with 10% fetal calf serum and 2 mM glutamine.
  • Recombinant baculoviruses HPV16L1 ⁇ CE7 1-55 were obtained by cotransfection of 10 ⁇ g and the recombinant 2 ⁇ g of linearized Baculo-Gold DNA (Pharmingen, San Diego, CA) transfected in Sf9 cells.
  • Recombinant viruses were purified according to the manufacturer's instructions.
  • 10 6 Sf9 cells were mixed with recombinant baculovirus and a moi (“multiplicity of infection ”) from 5 to 10 infected.
  • Trichoplusia ni (TN) high five cells were grown at 27 ° C. to a density of 1-1.5 ⁇ 10 6 cells per ml in Ex-Cell 405 serum-free medium (JRH, Biosciences, Lennexa, KS)
  • JRH, Biosciences, Lennexa, KS serum-free medium
  • a 400 ml culture was harvested and infected with recombinant baculoviruses for one hour with periodic inversions with a moi of 2 to 5.
  • Up to 240 ml of medium were added and the cells grew for 3 to 4 days.
  • the cells were then pelleted and in 10 ml extraction buffer resuspended (25 mM Tris / HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA) and sonicated for 45 seconds at 60 watts. After centrifugation at 10,000 rpm in the Sorvall SS34 rotor, the pellet was placed in the 6 ml extraction buffer dissolved, sonicated at 60 watts for 30 seconds and centrifuged again.
  • 10 ml extraction buffer resuspended 25 mM Tris / HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA
  • the supernatants were combined and applied to a two-stage gradient composed of 40% (w / v) sucrose and 57.5% (w / v) CsCl after centrifugation in a SW-28 rotor at 27,000 rpm for two For one hour, the interphase and the CsCl layer were collected, adjusted to a CsCl density of 1.38 g / ml and centrifuged at 45,000 rpm for 16 hours.
  • the gradients were fractionated and each fraction was subjected to Western blot with anti-HPVl ⁇ LlmAb Camvirl (Pharmingen, San Diego, CA)
  • the reactive fractions were pooled and ultrafiltered with Centricon 30 microconcentrator (Amicon Corp Beverly, MA) against Hepes buffer (1mM Hepes, 149mM NaCl, 0.5mM KCl, pH 7.2) dialyzed and the presence of CVLPs confirmed by means of transmission electron microscopy.
  • the concentration of LlE7 protein was approximately determined in an SDS gel which was stained with Coomassie blue by comparison with BSA standards
  • a fraction containing virus-like particles isolated from high five cells by sucrose cushion and casium chloride equilibrium ultracentrifuge was used as a sample.
  • the total protein concentration was 0.29 mg / ml and the CVLP concentration was 0.17 mg / ml

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Formulierung enthaltend mindestens ein Papillomavirus-spezifisches Protein mit ca. 0,3 bis ca. 4 M eines Salzes bei einem pH-Wert von ca. 7,3 bis ca. 7,45.

Description

Formulierung mit Papillomavirus-spezifϊschem Protein, seine Herstellung und Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Formulierung enthaltend mindestens ein Papillomavirus-spezifisches Protein mit ca 0,3 bis ca 4 M eines Salzes bei einem pH-Wert von ca 7,3 bis ca 7,45.
Die Papillomaviren, auch Warzenviren genannt, sind doppelstrangige DNA- Viren mit einer Genomgroße von etwa 8000 Basenpaaren und einem Ikosaeder- formigen Kapsid mit einem Durchmesser von ca 55 nm Bis heute sind mehr als 100 verschiedene humane Papillomavirustypen bekannt, von denen einige, z.B HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 oder HPV-58, bösartige Tumore und andere, z.B. HPV-6, HPV-1 1 oder HPV-42, gutartige Tu- more verursachen können
Das Genom der Papillomaviren läßt sich in drei Bereiche unterteilen' Der erste Bereich betrifft eine nicht-kodierende Region, die Regulationselemente für die Transkription und Replikation des Virus enthalt Die zweite Region, sogenannte E-(Early)Region enthalt verschiedene Protein-kodierende Abschnitte E1-E7, von denen z.B das E6- und das E7-Protein für die Transformation von Epithelzellen verantwortlich sind und das El -Protein die DNA-Kopienzahl kontrolliert Bei der E6- und E7-Region handelt es sich um sogenannte Onkogene, die auch in bösartig entarteten Zellen exprimiert werden Die dritte Region, auch L-(Late)Region genannt, enthalt zwei Protein-kodierende Abschnitte Ll und L2, die für Strukturkomponenten des Viruscapsids kodieren Das Ll -Protein ist zu über 90% im vi- ralen Capsid vorhanden, wobei das Verhältnis von Ll L2 im allgemeinen 30 1 ist
HPV-6 und HPV-11 werden u.a. für Genitalwarzen verantwortlich gemacht, einige Papillomavirustypen wie HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV- 45, HPV-52 und HPV-58 sind mit bösartigen Tumoren des anogenitalen Traktes assoziiert In über 50% der Fälle wird HPV-16 mit dem Gebarmutterhalskrebs (Cervixcarcinom) in Verbindung gebracht HPV-16 ist der Hauptrisikofaktor für die Ausbildung von cervicalen Neoplasien Daneben spielt das Immunsystem eine wichtige Rolle beim Fortschritt der Krankheit So sind vermutlich zellulare Immunantworten und insbesondere Antigen-spezifische T-Lymphozyten wichtig für den Abwehrmechanismus Es wurde weiterhin gefunden, daß in hochgradigen cervicalen intraepithelialen Neoplasien (CI II/III) und cervicalem Tumor das E7- Gen konstitutiv in allen Schichten des infizierten Epithels exprimiert wird Daher wird das E7-Protein als potentielles Tumorantigen und als Zielmolekul für aktivierte T-Zellen betrachtet Die E7-induzierte zellulare Immunantwort im Patienten ist aber anscheinend nicht stark genug, um den Krankheitsverlauf zu beeinflussen Die Immunantwort kann evtl durch geeignete Impfstoffe verstärkt werden
Es konnte nun gezeigt werden, daß die Expression des Ll-Gens bzw die Coex- pression des Ll- und L2-Gens Virus-ahnliche Partikel (VLPs) bildet Die VLPs konnten zur Bildung von neutralisierenden Antikörpern in verschiedenen tierischen Systemen verwendet werden Die Bildung von virus-neutralisierenden Antikörpern ist jedoch von geringerer klinischer Bedeutung, wenn die Virusinfektion bereits stattgefunden hat, da für die Ehminierung virus-infizierter Zellen eine vi- rus-spezifische zytotoxische T-Zell(CTL)-Antwort notwendig zu sein scheint Es wurden daher sogenannte chimare Papillomavirus-ahnliche Partikel (CVLPs) entwickelt, die aus einem chimaren Ll-E7-Protein bestehen (Muller, M et al (1997) Virology, 234, 93) Einige CVLPs induzieren eine E7-spezifische CTL- Antwort in Mausen, obwohl Experimente fehlschlugen, Antikörper gegen E7 durch Immunisieren von Mausen mit CVLPs zu induzieren (Muller, M et al (1997), supra) Des weiteren scheinen neutralisierende Antikörper von HPV- assoziierten Erkrankungen in Patienten die Immunantowert auf verabreichtes Ll- Protein zu limitieren (Muller, M et al (1997), supra) CVLPs sind jedoch für die Entwicklung eines Impfstoffes nach wie vor interessant, da die über MHC- Molekule der Klasse I-prasentierten E7-Proteine von Tumorzellen Zielmolekule von CTLs darstellen wurden
Peng et al (1998) Virology, 240, 147 beschreiben nun CVLPs bestehend aus C- terminalverkurztem Ll des Rinderpapillomavirus (BPV) und HPV-16E749-57, welche nach Impfung von C57Bl/6-Mausen E7-spezifische zytotoxische T-Zellen induzieren und vor dem Auswachsen E7-exprimierender Tumore schützen Greenstone et al (1998) Proc Natl Acad Sei USA, 95, 1800 beschreiben CVLPs bestehend aus HPV-16L1 plus HPV-16L2 fusioniert mit dem Vollangen HPV-16E7-Protein, welche nach Immunisierung von C57Bl/6-Mausen vor dem Auswachsen epithelialer E7-exprimierender Tumorzellen schützen, wobei jedoch zytotoxische T-Zellen nicht nachgewiesen wurden und somit die Induktion der Immunantwort weniger effizient erscheint
Die Herstellung von VLPs bzw CVLPs erfolgt im allgemeinen gentechnisch durch Expression der entsprechenden Gene kodierend für ein oder mehrere L- Proteine bzw L- und E-Proteine in geeigneten Expressionssystemen Die entsprechenden Gene sind beispielsweise bei Kirnbauer, R et al (1994) J Virol 67, 6929-6936 beschrieben bzw über die EMBL-Datenbank erhaltlich Die Zugangsnummern lauten z B für HPV18 PAPHPV18, für HPV31 PAPPPH31, für HPV33 PAPPPH33 oder für HPV58 PAPPPH58 Geeignete Expressionssysteme sind beispielsweise gentechnisch veränderte Hefen, z B Saccharomyces (cerevi- siae), Pichia (pastoris), Kluyvermyces (lactis), Schizosaccharomyces (pombe) oder Hansenula (polymorpha) (Carter, J J et al (1991), Virology, 182, 513), Insektenzellen, wie z B Trichoplusia ni High Five (siehe z B Muller, M et al (1997), supra) oder prokaryotische Zellen (siehe z B WO 96/1 1272) Bei der Her- Stellung der Partikel in prokaryotischen Zellen fallen diese im allgemeinen in der Zelle aus und bilden sogenannte Einschlußkorperchen (Inclusion Bodies), die anschließend renaturiert und in Losung gebracht werden müssen Für die Verwendung der gentechnisch hergestellten Partikel bzw Capside oder deren Vorstufen, den sogenannten Capsomeren, sind nach der Expression weitere Reinigungs- schritte notwendig
Ein wesentliches Problem bei der Verwendung von Capsiden und Capsomeren als Arzneimittel ist deren schlechte Loslichkeit So neigen beispielsweise Capside oder Capsomere von HPV-16 zur Aggregation, wodurch die Loslichkeit wesent- lieh verringert wird Die zum Teil geringe Loslichkeit der Capside bzw Capsomere führt nicht nur zu einem Verlust an Ausbeute, sondern auch zu einer erschwerten Anwendung als Arzneimittel oder Diagnostikum. Zudem kann bisweilen eine Degradation des C-Terminus des Ll -Proteins beobachtet werden, was zu inhomo- genem Material fuhrt, das für die Zulassung als Arzneimittel oder Diagnostikum nicht geeignet ist
WO 98/44944 beschreibt eine HPV Antigenformulierung enthaltend eine Vacci- nekomponente, ein Salz zu physiologisch annehmbaren Konzentrationen und ein nicht-ionisches Detergenz zu physiologisch annehmbaren Konzentrationen
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine einfache und vorteilhafte Formulierung bereitzustellen, in der Papillomavirus-spezifische Proteine loslich und stabil sind
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die Loslichkeit von Papilloma- virus-spezifischen Proteinen sowohl von der Salzkonzentration wie auch vom pH- Wert der Formulierung abhangig ist Insbesondere war überraschend, daß bei neutralem pH in einer isotonischen Salzlosung von ca 100-150 mM Salz eine Zusammensetzung ohne Zusatz eines Hilfsstoffes nicht stabil ist, obwohl VLPs bzw CVLPs im Zytoplasma der Wirtszellen gebildet werden Desweiteren wurde gemäß der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß bei einem pH-Wert von kleiner als ca 5,5 die CVLPs ausfallen und bei einem pH-Wert von großer als 9,5 die CVLPs aggregieren
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Formulierung enthaltend mindestens ein spates Protein (L-Protein) eines oder mehrerer Papillomaviren und/oder mindestens ein frühes Protein (E-Protein) eines oder mehrerer Papillo- maviren und ca 0,3 bis ca 4 M, vorzugsweise ca 0,4 bis ca 2,5-3 M, insbesondere ca 0,4-0,5 bis ca 1-2 M, vor allem ca 1 bis ca 2 M eines Salzes bei einem pH- Wert von ca 7,3 bis ca 7,45, vorzugsweise ca 7,4, sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, vorzugsweise ohne jeden Zusatz- und/oder Hilfsstoff
Unter dem Begriff „Formulierung" versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung in Form einer Losung oder einer Suspension der genannten Papillomavirus-spezifischen Proteine, wobei immunreaktive Papillo- mavirus-spezifische Proteine im allgemeinen und insbesondere bei bis zu maximal ca 5000 g nicht wesentlich sedimentieren
Das Salz ist im allgemeinen ein Alkali- oder Erdalkalisalz, vorzugsweise ein Ha- logenid oder Phosphat, insbesondere ein Alkalihalogenid, vor allem NaCl und/oder KC1 Die Verwendung von NaCl ist insbesondere für die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung bevorzugt
Der pH-Wert der Zusammensetzung wird im allgemeinen mit einem geeigneten organischen oder anorganischen Puffer eingestellt, wie z B vorzugsweise mit einem Phosphat-Puffer, Tris-Puf er (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), HEPES-Puffer ([4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethansulfonsaure) oder MOPS- Puffer (3-Morpholino-l-propansulfonsaure) Die Auswahl des jeweiligen Puffers richtet sich im allgemeinen nach der gewünschten Puffermolaritat Phosphat- Puffer ist beispielsweise für Injektions- und Infüsionslosungen geeignet
Für die Verwendung der erfindungsgemaßen Zusammensetzung als Arzneimittel oder Diagnostikum ist es besonders bevorzugt, wenn die Papillomavirus- spezifischen Proteine keine Papillomavirus-unspezifischen Epitope enthalten, da hierdurch eine Papillomavirus-unspezifische Immunantwort verringert bzw verhindert werden kann
Unter den Begriffen L-Protein und E-Protein versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl die Vollangen-Proteine wie auch deren Mutanten, wie z B Deletionsmutanten
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalt die erfindungsgemaße Zusammensetzung ein deletiertes L-Protein, vorzugsweise ein deletiertes Ll- und/oder L2 -Protein Die Deletion hat den Vorteil, daß in den deletierten Bereich andere Proteine, beispielsweise PapiUomavirus-spezifische E-Proteinsequenzen eingefügt werden können, wodurch sich der Anwendungsbereich der erfindungsgemaßen Zusammensetzung erweitern läßt Insbesondere bevorzugt ist ein L- Protein mit einer C-terminalen Deletion und insbesondere ein C-terminal deletiertes Ll -Protein Die C-terminale Deletion hat den Vorteil, daß die Effizienz der Bildung virus-ahnlicher Partikel gesteigert werden kann, da das am C-Terminus lokalisierte nukleare Lokalisationssignal deletiert ist Die C-terminale Deletion betragt daher vorzugsweise bis zu ca 35 Aminosäuren, insbesondere ca 25 bis ca 35 Aminosäuren, vor allem ca 32 bis ca 34 Aminosäuren Beispielsweise ist eine 32 Aminosäuren lange C-terminale Deletion des HPV-16 Ll -Proteins und eine ca 26 Aminosäuren lange C-terminale Deletion des BPV-1 Ll -Proteins (Bo- vines Papillomavirus Typ 1) ausreichend, um die Bildung von virusahnlichen Partikeln um das mindestens ca zehnfache steigern zu können
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist auch das E-Protein deletiert, vor allem das E6- und/oder E7-Protein Insbesondere ist es bevorzugt, wenn der C-terminale Teil des E-Proteins deletiert ist, vorzugsweise der C-terminale Teil des E7-Proteins, da diese Konstrukte in Verbindung mit deletiertem L-Protein bevorzugt Capsomere und/oder Capside ausbilden können Insbesondere bevor- zugt sind Deletionen bis zu ca 55 Aminosäuren, vorzugsweise ca 5 bis ca 55 Aminosäuren, insbesondere ca 38 bis ca 43 Aminosäuren
Ein besonders bevorzugtes Konstrukt ist beispielsweise E7 mit den N-terminalen Aminosäuren 1 bis ca 60, da dieses Konstrukt ein Maus-Epitop zur Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten enthalt, welches im Bereich der Aminosäuren 49-57 lokalisiert ist Ein anderes bevorzugtes Konstrukt ist E7 mit den N- terminalen Aminosäuren 1 bis ca 55, welches in Verbindung mit deletiertem L- Protein Capsomere und Capside bevorzugt bildet, da dieses Konstrukt E7- spezifische Sequenzen im Bereich der Aminosäuren 56-70 vermutlich nicht ent- halt, welche die Bildung von Capsiden stören können Besonders bevorzugt ist ein um 32 Aminosäuren C-terminal deletiertes Ll -Protein von HPV-16, welches mit einem E7-Protein von HPV-16 mit den Aminosäuren 1-55 oder 1-60 verbunden ist Diese Konstrukte induzieren nicht nur neutralisierende Antikörper oder eine spezifische CTL-Antwort, sondern verhindern einerseits die Bildung von Tumo- ren und verursachen andererseits einen Ruckgang von bereits bestehenden Tumoren im Tierexperiment Vor allem E7 mit den Aminosäuren 1-60 zeigt eine deutliche prophylaktische wie auch therapeutische Wirkung bei Tumoren Eine besonders bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung ist daher ein LlΔE7ι-x-Fusionsprotein, vorzugsweise in Form eines CVLPs, insbesondere von HPV16, wobei x eine ganze Zahl von 55 bis einschließlich 60 bedeutet, und insbesondere ein L1ΔCE7].55- oder LlΔCE7ι.6o-Fusionsprotein
Zur Herstellung eines sowohl prophylaktisch wie auch therapeutisch wirksamen Arzneimittels ist es bevorzugt, das L-Protein an das E-Protein beispielsweise in Form eines Fusionsproteins zu binden Des weiteren ist es bevorzugt, wenn die beschriebenen Papillomavirus-spezifischen Proteine in Form eines Capsids und/oder Capsomers vorliegen, da durch die Capside und/oder Capsomere und insbesondere durch den Anteil von L-Protein die Immunreaktion noch deutlich gesteigert werden kann Als Fusionsproteine, die zur Capsid- und/oder Capsomer- bildung geeignet sind, sind daher beispielsweise Fusionsproteine aus deletiertem Ll und E7, E6 und/oder El bevorzugt
Capside sind im Sinne der vorliegenden Erfindung virale oder virus-ahnliche Strukturen in einer im allgemeinen ikosaedrischen Form, die im allgemeinen aus ca 72 Capsomeren aufgebaut sind
Capsomere sind im Sinne der vorliegenden Erfindung assemblierte Proteine enthaltend mindestens ein Papillomavirus-Strukturprotein, vorzugsweise Ll oder Deletionen von Ll Beispielsweise können 5 Fusionsproteine zu einem Capsomer assemblieren, die wiederum zu einem Capsid assemblieren können
Für die Herstellung eines humanen Arzneimittels bzw Diagnostikums sind für die beschriebenen Konstrukte Proteine bzw Peptide des humanen Papillomavirus (HPV) und vorzugsweise von HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-52 und/oder HPV-58, insbesondere HPV- 16, HPV- 18, HPV-31 und/oder HPV-45 geeignet Vor allem für die Herstellung einer Kombinationsvaccine ist es vorteilhaft, Proteine bzw Peptide aus verschiedenen HPV-Typen zu kombinieren, beispielsweise eine Kombination von HPV- 16 und HPV- 18 bzw HPV- 18, HPV-31, HPV-45 und HPV-58 im Falle von z B Cervixcarcinom oder HPV-6 und HPV-11 im Fall von z B Condylomen
Die Expressionsvektoren können beispielsweise prokaryotische oder eukaryoti- sche Expressionsvektoren sein Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E coli z B die Vektoren pGEM oder pUC-Derviate (siehe z B WO96/11272) Beispiele für eukaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z B die Vektoren p426Met25 oder p426GALl (Mumberg et al (1994) Nucl Acids Res , 22, 5767-5768, Carter, J J et al (1991) supra) und für die Expression in Insektenzellen z B Baculovirus- Vektoren, insbesondere das Autographa Californica- Virus, wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart (siehe z B auch WO94/20137), und für die Expression in Saugerzellen z B die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle allgemein erhaltlich sind Es eignen sich jedoch auch kommerziell erhaltliche Baculovirus Expressionssysteme wie z B der Baculo Gold ™ Transfection Kit von Pharmingen oder das Bac-to-Bac™ Baculovirus Expressionsystems von Gibco BRL Weitere geeignete Expressionssysteme sind rekombinante Vaccinia- Viren (siehe z B WO 93/02184)
Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirtszelle geeignete Promotoren, wie z B den trp-Promotor für die Expression in E coli (siehe z B EP -B 1-0 154 133), den ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Rüssel et al (1983), J Biol Chem 258, 2674-2682), den Baculovirus- Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen (siehe z B EP-B1-0 127 839 oder U S 5,004,687) oder den frühen SV40 Promotor oder LTR- Promotoren z B von MMTV (mouse mammary tumour virus, Lee et al (1981) Nature 214, 228-232)
Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E coli Stamme DH5, HB101 oder BL21, die Hefestamme Saccharomyces cerevisia, Pichia, Kluyvermyces, Schizo- saccharomyces oder Hansenula (Carter, J J et al (1991), Virology, 182, 513), die Insektenzellinie Lepidopteran, z B von Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou oder Galleria Mellonela oder die tierischen Zellen COS, C127, Vero, 293 und HeLa, die alle allgemein erhaltlich sind (siehe z B WO94/00152)
Die kodierenden Nukleinsäuren für die einzelnen Papillomavirus-spezifischen Proteine können beispielsweise über eine PCR(„polymerase chain reaction")- Amplifizierung aus einer Genbank isoliert und kloniert werden Beispielsweise ist das Genom von BPV-1 unter der GenBank Accession No X02346 oder HPV- 16 unter der GenBank Accession No K02718 allgemein erhältlich. Eine HPV- 16 Ll-
Sequenz ist beispielsweise auch in WO94/05792 offenbart. Die Sequenz des 98
Aminosaure-langen HPV 16 E7-Proteins ist beispielsweise bei Seedorf et al
(1985) Virology, 145, 181-185 beschrieben Eine andere Methode, die ge- wünschten Nukleinsäuren zu erhalten, ist, die Papillomavirus-spezifischen Gene direkt aus Warzen oder Tumore mittels PCR zu isolieren Geeignete Primer für die E6- und E7-Gene aus HPV- 16 und HPV- 18 sind z B in WO93/21958 offenbart Weitere Literaturstellen für die gewünschten Nukleinsäuren sind beispielsweise Kirnbauer, R et al (1994), supra bzw die oben bereits erwähnten in der EMBL-Datenbank hinterlegten Klone
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ist der Expressionsvektor so konstruiert, daß das exprimierte Fusionsprotein um keine weiteren, durch den Vektor verursachte Aminosäuren verlängert ist Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, daß durch Mutagenese in einer PCR-Reaktion mittels geeigneter Primer- Oligonucleotide unerw nschte Nucleotide, die für zusätzliche Aminosäuren kodieren, entfernt werden (Ho et a (1989) Gene, 77, 51-59) Auf diese Weise erhalt man ein Fusionsprotein, welches frei von zusatzlichen Aminosäuren und somit frei von möglicherweise zusatzlichen Fremdepitopen ist, die immunologische Nebenreaktionen bewirken können
Nach der Expression des beschriebenen Fusionsproteins ist es bevorzugt, dieses weiter zu reinigen bzw zu renaturieren Beispiele von chromatographischen Reinigungsverfahren finden sich Hjorth, R & Moreno-Lopez, L (1982) J Virol Meth , 5, 151, Nakai, Y et al. (1987) J Gen Virol , 68, 1891, Hofmann, K J et al (1995) Virology, 209, 506, Rose, R C et al (1993) J Virol , 67, 1936, Sasa- gawa, T et al (1995) Virology, 206, 126 oder WO 95/31532
Als Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, die beispielsweise zur weiteren Stabilisierung des Papillomavirus-spezifischen Proteins in der erfindungsgemäßen Zusammen- Setzung dienen, eignen sich beispielsweise Detergentien, wie z.B Triton-X-100 oder Natriumdesoxycholat, aber auch Polyole, wie z B Polyethylenglykol oder Glycerin, Zucker, wie z. B Saccharose oder Glukose, zwitterionische Verbindungen, wie z. B Aminosäuren wie Glycin oder insbesondere Taurin oder Betain und/oder Protein, wie z B bovines oder humanes Serumalbumin Bevorzugt sind Detergentien, Polyole und/oder zwitterionische Verbindungen
Andere geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe sind Proteaseinhibitoren, wie z B Aprotinin, ε-Aminocapronsaure oder Pepstatin A
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemaßen Formulierung, wobei das oben beschriebene PapiUomavirus-spezifische Protein beispielsweise in Losung enthaltend ca 0,3 bis ca 4 M, vorzugsweise ca 0,4 bis ca 2,5 - 3 M, insbesondere ca 0,4 - 0,5 bis ca 1 - 2 M, vor allem ca 1 bis ca 2 M eines Salzes bei entsprechendem pH-Wert von ca 7,3 bis ca 7,45, vorzugsweise ca 7,4 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und Hilfsstoffe, eingebracht und/oder gegen die beschriebene Zusammensetzung dialysiert wird Die Formulierung kann vorzugsweise bei ca 4° C oder vor allem bei ca -80° C über einen längeren Zeitraum, beispielsweise 1-2 Monate oder langer, stabil gelagert werden
Die erfindungsgemaße Formulierung eignet sich als Arzneimittel oder Diagnostikum Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung der erfindungsgemaßen Formulierung als Arzneimittel oder Diagnostikum Für die unmittelbare Anwendung als Arzneimittel oder Diagnostikum wird vorzugsweise die erfindungsgemaße Formulierung auf eine Konzentration von ca 0,45 M eingestellt Insbesondere ist es bevorzugt, wenn das Arzneimittel kein Adjuvans enthalt, d h keine Substanz, die die Immunogenitat des Papillomavirus-spezifischen Proteins verstärkt, da insbesondere in Anwesenheit eines L-Proteins vor allem von Ll die Immunogenitat bereits ausreichend verstärkt ist Diese Eigenschaft ist insbesondere bei der Zulassung als Arzneimittel oder Diagnostikum von Vorteil, da die einzigen von den Zulassungsbehorden zugelassenen immunstimulierenden Materialien zur Zeit Aluminiumsalze sind
Das Arzneimittel eignet sich insbesondere zur Vermeidung und/oder Behandlung von Papillomavirus-spezifischem gutartigem oder bösartigem Tumor, insbesondere von bösartigem Tumor, wie z B Larynx-, Cervix-, Penis-, Vulva- oder Analcarcinom, und das Diagnostikum zur Diagnose von einer oder mehreren Pa- pillomavirus-Infektion(en) Beispiel eines Diagnostikums ist die dem Fachmann bekannte Immunodiagnostik, beispielsweise ein ELISA zur Messung von Papillomavirus-spezifischen Antikörpern (siehe z B Voller, A et al (1976) Bull World Health Organ , 53, 55-63) oder ein Hauttest gemäß z B Hopfl et al (1991) Lancet 1, 373-374)
Im allgemeinen kann das Arzneimittel oral, parenteral, wie z B subcutan, intramuskulär oder über die Schleimhaut, in flussiger oder suspendierter Form, in Form eines Elixiers oder als Kapseln verabreicht werden, vorzugsweise als Injek- tions- oder Infusionslosung Bei den erfindungsgemaßen Formulierungen kann auf ein Adjuvans verzichtet werden, was besonders vorteilhaft ist
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auf die Verwendung der erfindungsgemaßen Formulierung als Injektions- oder Infusi- onslosung
Injektionslosungen werden im allgemeinen dann verwendet, wenn nur relativ geringe Mengen einer Losung bzw Suspension, beispielsweise ca 1 bis ca 20 ml, dem Organismus zugeführt werden soll Infusionslosungen werden im allgemei- nen dann verwendet, wenn eine größere Menge einer Losung oder Suspension, beispielsweise ein oder mehrere Liter, appliziert werden sollen Da im Gegensatz zur Infüsionslosung bei Injektionslosungen nur wenige Milliliter verabreicht werden, machen sich geringe Abweichungen vom pH-Wert und vom osmotischen Druck des Blutes bzw der Gewebsflussigkeit bei der Injektion nicht oder nur un- wesentlich im Hinblick auf die Schmerzempfindung bemerkbar Eine Verdünnung der erfindungsgemaßen Formulierung vor der Anwendung ist daher im allgemeinen nicht erforderlich Bei der Applikation größerer Mengen sollte hingegen kurz vor der Applikation die erfindungsgemaße Formulierung so weit verdünnt werden, daß eine isotonische Losung erhalten werden kann Ein Beispiel einer isoto- nischen Losung ist eine 0,9%-ige Natriumchloridlosung Bei der Infusion kann die Verdünnung beispielsweise mit sterilem Wasser wahrend der Applikation z B über einen sog Bypaß erfolgen Der wesentliche Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die erfindungsgemaße Formulierung im wesentlichen nicht zu einem Ausfallen von immunreaktiven Papillomavirus-spezifischem Protein führt Insbesondere bleiben mehr als ca 90%, vor allem mehr als ca 95% des Proteins in Losung und fallen auch nicht für einen Zeitraum von mindestens ca 12 Stunden aus Auch ist das immunoreaktive PapiUomavirus-spezifische Protein durch Zentrifligation bei maximal 5000 g nicht wesentlich sedimentierbar Zudem bleibt die Formulierung über einen längeren Zeitraum von ca 1 -2 Monaten und langer homogen und stabil
Die Figur und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung naher erläutern, ohne sie zu beschranken
Fig 1 zeigt graphisch die Abhängigkeit der Loslichkeit Virus-ahnlicher Partikel von der Salzkonzentration
Beispiele
1 Herstellung von chimaren Genen kodierend für HPV16LlE7-Fusionsproteine
Die Herstellung von HPV 16L1ΔC* E7 1-55 erfolgte nach Muller, M et al (1997), supra Hierbei wurde der HPV-16L1 offene Leserahmen (ORF) aus dem Plasmid HPV-16-114/k-Ll/L2-pSynxtVr (Kirnbauer, R et al (1994) J Virol 67, 6929) mit der Restriktionsendonuklease Bglll ausgeschnitten und in den Vektor pUC19 (New England Biolabs) in die BamHI-Stelle kloniert Zur Herstellung von HPV-16L1ΔC wurden zwei Primer konstruiert, die zu HPV- 16L1 ORF komplementär sind Der erste Primer hat die Sequenz AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC und der zweite Primer AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG
Beide Primer kodieren 5' eine EcoRV Restriktionsenzymschnittstelle In den stromabwartsliegenden Primern folgt auf die EcoRV Stelle ein TAA Translations- stopkodon, um die letzten 34 Aminosäuren des HPV16L1 ORF zu deletieren Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, um den gesamten Ll ORF und den gesamten Vektor zu amplifizieren Das lineare Produkt wurde mit EcoRV gespalten, mit T4 DNA-Ligase zirkularisiert und E coli DH5α-Zellen transformiert Die Klone wurden auf die Anwesenheit einer EcoRV Stelle analysiert Das erhaltene Konstrukt pUCHPV16LlΔC wurde benutzt, um den ORF von HPV16E7 1-50 in die EcoRV Stelle zu klonieren
Zur Klonierung des Fragmentes wurden Primer mit einer 5ΕcoRV Restriktionsenzymschnittstelle verwendet Es wurde folgendes Primerpaar verwendet AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC und
TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC
Die PCR Produkte wurden mit EcoRV gespalten und in die EcoRV Stelle des modifizierten Ll-Gens lnsertiert
Zur E minierung der EcoRV Stellen wurden zwei PCR-Reaktionen durchgeführt, um zwei überlappende Fragmente des Klons pUC-HPV16LlΔCE7 1-50 zu amplifizieren Die resultierenden DNA-Fragmente überlappten an der Position der L1/E7 Grenze („Four Primer PCR", Ho, S N et al (1989) Gene 77, 51) Jedoch enthielten die Primer nicht die zwei EcoRV Restriktionsenzymschnittstellen Fragment 1 wurde mit den Pπmern Pl und P2 und Fragment 2 mit den Primern P3 und P4 hergestellt
P 1 GTTATGAC ATAC ATAC ATTCTATG (L 1 ) P2 CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC (E7) P3 CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC (E7) P4 CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG (El)
Ein Zehntel der gereinigten Produkte wurde gemischt und als Matrize in der PCR- Reaktion mit ausschließlich den Primern Pl und P4 benutzt Das resultierende Produkt wurde mit EcoNI (Ll) und Hindlll (stromabwärts vom Stopkodon auf den Primer P4) gespalten und benutzt, um ein EcoNI Hindlll Fragment des klo- nierten HPV16L1 ORF zu ersetzen Der resultierende Klon unterscheidet sich daher vom Klon HPV16L1ΔCE7 1-50 durch den Verlust der zwei internen EcoRV Restriktionsenzymschnittstellen und der korrespondierenden nicht-HPV Aminosäuren Asp und He zwischen dem Ll ORF und E7 und stromabwärts von E7 Die erste EcoRV Stelle wurde durch die ursprunglichen Ll Aminosäuren an dieser Position ersetzt (AlaGly) Die zweite EcoRV Stelle wurde durch ein Translationsstopsignal ersetzt Zusatzlich enthalt dieser Klon (HPV16L1ΔC*E7 1- 52) die ersten 52 Aminosäuren von HPV16E7 Klon HPV16L1ΔC*E7 1-52 wurde zur Herstellung des Klons HPV16L1ΔC*E7 1-55 mit Hilfe des Primers Pl in Kombination mit P5 verwendet
P5 CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG (E7 1-55)
In allen Fallen wurden EcoNI und Hindlll benutzt, um die korrespondierenden Fragmente zu ersetzen Die Klone wurden durch DNA-Sequenzierung analysiert
2 Herstellung von rekombinanten Baculoviren
Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen wurden als Monolayer oder in Suspensionskultur in TNM-FH Insektenmedium (Sigma, Deisenhofen) mit 10% fötalem Kal- berserum und 2 mM Glutamin herangezogen Rekombinante Baculoviren HPV16L1ΔCE7 1-55 wurden durch Cotransfektion von 10 μg der rekombinanten Plasmide und 2 μg von linearisiertem Baculo-Gold DNA (Pharmingen, San Diego, CA) in Sf9 Zellen transfiziert Rekombinante Viren wurden gemäß der Angaben des Herstellers gereinigt Um die Expression zu testen, wurden 106 Sf9 Zellen mit rekombinantem Baculovirus und einer m o i („multiplicity of infection") von 5 bis 10 infiziert Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen mit PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 8,1 mM Na2PO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,2) gewaschen Die Zellen wurden dann in SDS-Probenpuffer lysiert und durch SDS-Gelchromatographie und Immunoblotassay getestet
3 Reinigung von virusahnlichen Partikeln Für die Herstellung von CVLPs wurden Trichoplusia ni (TN) High Five-Zellen bei 27°C bis zu einer Dichte von 1-1,5 x 106 Zellen pro ml in Ex-Cell 405 serumfreiem Medium gezüchtet (JRH, Biosciences, Lennexa, KS) Eine 400 ml Kultur wurde geerntet und mit einer m.o.i von 2 bis 5 mit rekombinanten Baculoviren für eine Stunde mit periodischen Inversionen infiziert Es wurden bis zu 240 ml Medium hinzugegeben und die Zellen wuchsen 3 bis 4 Tage lang Anschließend wurden die Zellen pelletiert und in 10 ml Extraktionspuffer resuspendiert (25 mM Tris/HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA) und für 45 Sekunden bei 60 Watt beschallt Nach der Zentrifugation bei 10 000 rpm im Sorvall SS34 Rotor wurde das Pellet im 6 ml Extraktionspuffer gelost, für 30 Sekunden bei 60 Watt beschallt und erneut zentrifugiert Die Überstände wurden kombiniert und auf einen Zweistufengradienten aus 40% (w/v) Saccharose und 57,5% (w/v) CsCl aufgebracht Nach der Zentrifugation in einem SW-28 Rotor bei 27 000 rpm für zwei Stunden wurden die Interphase und die CsCl-Schicht gesammelt, auf eine CsCl-Dichte von 1,38 g/ml justiert und bei 45 000 rpm für 16 Stunden zentrifugiert Die Gradienten wurden fraktioniert und jede Fraktion wurde durch Western Blot mit Anti- HPVlόLlmAb Camvirl (Pharmingen, San Diego, CA) getestet Die reaktiven Fraktionen wurden vereinigt und über eine Ultrafiltration mit Centricon 30 Mi- krokonzentrator (Amicon Corp Beverly, MA) gegen Hepes-Puffer (1 mM Hepes, 149 mM NaCl, 0,5 mM KCl, pH 7,2) dialysiert und die Anwesenheit von CVLPs mittels Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt Die Konzentration von LlE7-Protein wurde in einem SDS-Gel, welches mit Coomassie blue angefärbt wurde, durch Vergleich mit BSA-Standards ungefähr bestimmt
4 Mikrodialyseexperimente
Als Probe wurde eine Fraktion mit Virus-ahnlichen Partikeln verwendet, die aus High Five-Zellen durch Saccharosekissen- und Casiumchlorid-Gleichgewicht- Ultrazentrifügation isoliert worden waren Die Gesamtproteinkonzentration betrug 0,29 mg/ml und die CVLP- Konzentration 0,17 mg/ml
In einem 50 ml Plastikgefaß mit Schraubverschluß wurden 40 ml der entsprechenden Losung vorgelegt Auf diese Losung wurde vorsichtig ein Dialysefilter mit einem Porendurchmesser von 0,025 μm gelegt, der auf der Flüssigkeit wahrend der Durchführung der Dialyse schwimmt Auf diesen Filter wurden 30 μl der reinen CVLP -Losung pipettiert und das Gefäß verschlossen Mindestens 12 Stunden wurde das Gefäß bei 4-6°C stehen gelassen, so daß die Losung des Trop- fen gegen die Dialyselosung (50 mM Tris/HCl, pH 7,5 mit steigender NaCl- Konzentration) ausgetauscht wurde Der Tropfen wurde mit der Kolbenhubpipette entnommen und es wurde mit 30 μl Reservoirlosung ausgeglichen Nach Zentrifugation bei 10 000 g (10 min, 4°C) wurde der Überstand im ELISA (Kemeny, D M (1994) Indirekter ELISA aus ELISA, Anwendung des Enzyme Linked Immu- nosorbent Assay im biologisch/medizinischen Labor, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, S 111, Test 6 2) mit einem konformationsspezifischen monoklonalen Antikörper gegen HPV16L1 und in einem Proteinassay untersucht Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mit einem Bicinchonsaureassay (Smith, P K et al (1985) Anal Biochem , 150, 76-85) gegen Rinderserumalbumin als Stan- dard Das Ergebnis ist in Fig 1 dargestellt

Claims

Patentansprüche
Formulierung enthaltend mindestens ein spates Protein (L-Protein) eines oder mehrerer Papillomaviren und/oder mindestens ein frühes Protein (E-Protein) eines oder mehrerer Papillomaviren und ca 0,3 bis ca 4 M, vorzugsweise ca 0,4 bis ca 2,5-3 M, insbesondere ca 0,4-0,5 bis ca 1-2 M, vor allem ca 1 bis ca 2 M eines Salzes bei einem pH- Wert von ca 7,3 bis ca 7,45, vorzugsweise von ca 7,4, sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe
Formulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz ein Alkali- oder Erdalkalisalz ist, vorzugsweise ein Halogenid oder Phosphat, insbesondere ein Alkalihalogenid, vor allem NaCl und/oder KCl
Formulierung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH- Wert mit einem Puffer eingestellt wird, vorzugsweise mit einem Phosphat- Puffer, Tris-Puffer, HEPES-Puffer oder MOPS-Puffer
Formulierung nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die genannten Proteine keine Papillomavirus-unspezifischen Epitope ent- halt
Formulierung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das L-Protein ein deletiertes L-Protein ist, vorzugsweise ein deletiertes Ll- und/oder L2-Protein
Formulierung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das L-Protein ein C-terminal deletiertes L-Protein ist, insbesondere ein C-terminal deletiertes Ll- Protein
Formulierung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu ca 35 Aminosäuren vom L-Protein deletiert sind, vorzugsweise ca 25 bis ca 35, insbesondere ca 32 bis ca 34 Aminosäuren Formulierung nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß das E-Protein ein deletiertes E-Protein ist, vor allem ein deletiertes E6- und/oder E7-Protein
Formulierung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das deletierte E- Protein ein C-terminal deletiertes E-Protein ist, vorzugsweise ein C-terminal deletiertes E7-Protein
Formulierung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu ca 55 Aminosäuren deletiert sind, vorzugsweise ca 5 bis ca 55 Aminosäuren, insbesondere ca 38 bis ca 43 Aminosäuren
Formulierung nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß das L-Protein an das E-Protein gebunden, vorzugsweise fusioniert, ist
Formulierung nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein in Form eines Capsids und/oder Capsomers vorliegt
Formulierung nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß das Papillomavirus ein humanes Papillomavirus (HPV) ist
Formulierung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das HPV ausgewählt ist aus HPV-6, HPV-1 1, HPV- 16, HPV-18, HPV-3 1, HPV-33, HPV- 35, HPV-39, HPV-42, HPV 45, HPV-52 und oder HPV-58
Formulierung nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatz- und/oder Hilfsstoffe ein oder mehrere Detergentien, Polyole und/oder zwitterionische Verbindungen sind
Verfahren zur Herstellung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein in eine Losung enthaltend ca 0,3 bis ca 4 M, vorzugsweise ca 0,4 bis ca 2,5-3 M, insbesondere ca 0,4- 0,5 bis ca 1-2 M, vor allem ca 1 bis ca 2 M eines Salzes bei einem pH- Wert von ca 7,3 bis ca 7,45, vorzugsweise von ca 7,4, eingebracht und/oder dagegen dialysiert wird
Verwendung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 1-15 als Arznei- mittel oder Diagnostikum
Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Formulierung kein Adjuvans enthalt
Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel der Vermeidung oder Behandlung von Papillomaviren-spezifischem Tumor dient
Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Tumor ein Larynx-, Cervix-, Penis-, Vulva- oder Analcarcinom ist
Verwendung nach einem der Ansprüche 17-20, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Formulierung als Injektions- oder Infusionslosung verwendet wird
Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Diagnostikum zur Diagnose von einer oder mehrerer Papillomavιrus-Infektion(en) dient
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