DE19812940A1

DE19812940A1 - Formulierung mit Papillomavirus-spezifischem Protein, seine Herstellung und Verwendung

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Publication number: DE19812940A1
Application number: DE19812940A
Authority: DE
Inventors: Alexander Burger; Josef Gabelsberger
Original assignee: Medigene AG
Current assignee: Medigene AG
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1998-03-24
Publication date: 1999-10-07
Also published as: CA2323526A1; JP2002507625A; WO1999048917A3; AU3598999A; AR014969A1; EP1066321A2; WO1999048917A2; MXPA00009283A

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Formulierung enthaltend mindestens ein Papillomavirus-spezifisches Protein mit ca. 0,3 bis ca. 4 M eines Salzes bei einem pH-Wert von ca. 7,3 bis ca. 7,45.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Formulierung enthaltend mindestens ein Papillomavi rus-spezifisches Protein mit ca. 0,3 bis ca. 4 M eines Salzes bei einem pH-Wert von ca. 7,3 bis ca. 7,45.

Die Papillomaviren, auch Warzenviren genannt, sind doppelsträngige DNA-Viren mit einer Genomgröße von etwa 8000 Basenpaaren und einem Ikosaeder-förmigen Kapsid mit einem Durchmesser von ca. 55 nm. Bis heute sind mehr als 100 verschiedene humane Papillomavirusty pen bekannt, von denen einige, z. B. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 oder HPV-58, bösartige Tumore und andere, z. B. HPV-6, HPV-11 oder HPV-42, gutartige Tumore verursachen können.

Das Genom der Papillomaviren läßt sich in drei Bereiche unterteilen: Der erste Bereich betrifft eine nicht-kodierende Region, die Regulationselemente für die Transkription und Replikation des Virus enthält. Die zweite Region, sogenannte E-(Early)Region enthält verschiedene Prote in-kodierende Abschnitte E1-E7, von denen z. B. das E6- und das E7-Protein für die Transfor mation von Epithelzellen verantwortlich sind und das E1-Protein die DNA-Kopienzahl kon trolliert. Bei der E6- und E7-Region handelt es sich um sogenannte Onkogene, die auch in bösartig entarteten Zellen exprimiert werden. Die dritte Region, auch L-(Late)Region genannt, enthält zwei Protein-kodierende Abschnitte L1 und L2, die für Strukturkomponenten des Virus capsids kodieren. Das L1-Protein ist zu über 90% im viralen Capsid vorhanden, wobei das Verhältnis von L1:L2 im allgemeinen 30 : 1 ist.

HPV-6 und HPV-11 werden u. a. für Genitalwarzen verantwortlich gemacht, einige Papillo mavirustypen wie HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 und HPV-58 sind mit bösartigen Tumoren des anogenitalen Traktes assoziiert. In über 50% der Fälle wird HPV-16 mit dem Gebärmutterhalskrebs (Cervixcarcinom) in Verbindung gebracht. HPV-16 ist der Hauptrisikofaktor für die Ausbildung von cervicalen Neoplasien. Daneben spielt das Immunsystem eine wichtige Rolle beim Fortschritt der Krankheit. So sind vermutlich zelluläre Immunantworten und insbesondere Antigen-spezifische T-Lymphozyten wichtig für den Abwehrmechanismus. Es wurde weiterhin gefunden, daß in hochgradigen cervicalen intra epithelialen Neoplasien (CIN II/III) und cervicalem Tumor das E7-Gen konstitutiv in allen Schichten des infizierten Epithels exprimiert wird. Daher wird das E7-Protein als potentielles Tumorantigen und als Zielmolekül für aktivierte T-Zellen betrachtet. Die E7-induzierte zellulä re Immunantwort im Patienten ist aber anscheinend nicht stark genug, um den Krankheitsver lauf zu beeinflussen. Die Immunantwort kann evtl. durch geeignete Impfstoffe verstärkt wer den.

Es konnte nun gezeigt werden, daß die Expression des L1-Gens bzw. die Coexpression des L1- und L2-Gens Virus-ähnliche Partikel (VLPs) bildet. Die VLPs konnten zur Bildung von neutralisierenden Antikörpern in verschiedenen tierischen Systemen verwendet werden. Die Bildung von virus-neutralisierenden Antikörpern ist jedoch von geringerer klinischer Bedeu tung, wenn die Virusinfektion bereits stattgefunden hat, da für die Eliminierung virus-infizierter Zellen eine virus-spezifische zytotoxische T-Zell(CTL)-Antwort notwendig zu sein scheint. Es wurden daher sogenannte chimäre Papillomavirus-ähnliche Partikel (CVLPs) entwickelt, die aus einem chimären L1-E7-Protein bestehen (Müller, M. et al. (1997) Virology, 234, 93). Ei nige CVLPs induzieren eine E7-spezifische CTL-Antwort in Mäusen, obwohl Experimente fehlschlugen, Antikörper gegen E7 durch Immunisieren von Mäusen mit CVLPs zu induzieren (Müller, M. et al. (1997), supra). Des weiteren scheinen neutralisierende Antikörper von HPV-as soziierten Erkrankungen in Patienten die Immunantowert auf verabreichtes L1-Protein zu limitieren (Müller, M. et al. (1997), supra). CVLPs sind jedoch für die Entwicklung eines Impfstoffes nach wie vor interessant, da die über MHC-Moleküle der Klasse I-präsentierten E7-Proteine von Tumorzellen Zielmoleküle von CTLs darstellen würden.

Peng et al. (1998) Virology, 240, 147 beschreiben nun CVLPs bestehend aus C-terminalverkürztem L1 des Rinderpapillomavirus (BPV) und HPV-16E7_49-57, welche nach Impfung von C57B1/6-Mäusen E7-spezifische zytotoxische T-Zellen induzieren und vor dem Auswachsen E7-exprimierender Tumore schützen. Greenstone et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1800 beschreiben CVLPs bestehend aus HPV-16L1 plus HPV-16L2 fusioniert mit dem Vollängen HPV-16E7-Protein, welche nach Immunisierung von C57B1/6-Mäusen vor dem Auswachsen epithelialer E7-exprimierender Tumorzellen schützen, wobei jedoch zyto toxische T-Zellen nicht nachgewiesen wurden und somit die Induktion der Immunantwort we niger effizient erscheint.

Die Herstellung von VLPs bzw. CVLPs erfolgt im allgemeinen gentechnisch durch Expression der entsprechenden Gene kodierend für ein oder mehrere L-Proteine bzw. L- und E-Proteine in geeigneten Expressionssystemen. Die entsprechenden Gene sind beispielsweise bei Kirnbauer, R. et al. (1994) J. Virol. 67, 6929-6936 beschrieben bzw. über die EMBL-Datenbank erhält lich. Die Zugangsnummern lauten z. B. für HPV18: PAPHPV18; für HPV31: PAPPPH31; für HPV33: PAPPPH33 oder für HPV58: PAPPPH58. Geeignete Expressionssysteme sind bei spielsweise gentechnisch veränderte Hefen, z. B. Saccharomyces (cerevisiae), Pichia (pastoris), Kluyvermyces (lactis), Schizosaccharomyces (pombe) oder Hansenula (polymorpha) (Carter, J. J. et al. (1991), Virology, 182, 513), Insektenzellen, wie z. B. Trichoplusia ni High Five (siehe z. B. Müller, M. et al. (1997), supra) oder prokaryotische Zellen (siehe z. B. WO 96/11272). Bei der Herstellung der Partikel in prokaryotischen Zellen fallen diese im allgemeinen in der Zelle aus und bilden sogenannte Einschlußkörperchen (Inclusion Bodies), die anschließend renaturiert und in Lösung gebracht werden müssen. Für die Verwendung der gentechnisch hergestellten Partikel bzw. Capside oder deren Vorstufen, den sogenannten Capsomeren, sind nach der Expression weitere Reinigungsschritte notwendig.

Ein wesentliches Problem bei der Verwendung von Capsiden und Capsomeren als Arzneimittel ist deren schlechte Löslichkeit. So neigen beispielsweise Capside oder Capsomere von HPV-16 zur Aggregation, wodurch die Löslichkeit wesentlich verringert wird. Die zum Teil geringe Löslichkeit der Capside bzw. Capsomere führt nicht nur zu einem Verlust an Ausbeute, son dern auch zu einer erschwerten Anwendung als Arzneimittel oder Diagnostikum.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine Formulierung bereitzustellen, in der Papillomavirus-spezifische Proteine löslich sind.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die Löslichkeit von Papillomavirus-spe zifischen Proteinen sowohl von der Salzkonzentration wie auch vom pH-Wert der Formu lierung abhängig ist.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Formulierung enthaltend mindestens ein spätes Protein (L-Protein) eines oder mehrerer Papillomaviren und/oder mindestens ein frühes Protein (E-Protein) eines oder mehrerer Papillomaviren und ca. 0,3 bis ca. 4 M, vor zugsweise ca. 0,4 bis ca. 3 M, insbesondere ca. 0,5 bis ca. 2 M, vor allem ca. 1 bis ca. 2 M eines Salzes bei einem pH-Wert von ca. 7,3 bis ca. 7,45, vorzugsweise ca. 7,4, sowie gegebe nenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

Unter dem Begriff "Formulierung" versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung sowohl eine erfindungsgemäße Lösung als auch eine erfindungsgemäße Suspension der genannten Papillomavirus-spezifischen Proteine, wobei immunreaktive Papillomavirus-spezifische Protei ne im allgemeinen und insbesondere bei bis zu maximal ca. 5000 g nicht wesentlich sedimentie ren.

Das Salz ist im allgemeinen ein Alkali- oder Erdalkalisalz, vorzugsweise ein Halogenid oder Phosphat, insbesondere ein Alkalihalogenid, vor allem NaCl und/oder KCl. Die Verwendung von NaCl ist insbesondere für die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung bevorzugt.

Der pH-Wert der Zusammensetzung wird im allgemeinen mit einem geeigneten organischen oder anorganischen Puffer eingestellt, wie z. B. vorzugsweise mit einem Phosphat-Puffer, Tris-Puffer (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), HEPES-Puffer ([4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethan sulfonsäure) oder MOPS-Puffer (3-Morpholino-1-propansulfonsäure). Die Auswahl des jeweiligen Puffers richtet sich im allgemeinen nach der gewünschten Puffermolarität. Phosphat- Puffer ist beispielsweise für Injektions- und Infusionslösungen geeignet.

Für die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung als Arzneimittel oder Dia gnostikum ist es besonders bevorzugt, wenn die Papillomavirus-spezifischen Proteine keine Papillomavirus-unspezifischen Epitope enthalten, da hierdurch eine Papillomavirus-un spezifische Immunantwort verringert bzw. verhindert werden kann.

Unter den Begriffen L-Protein und E-Protein versteht man im Sinne der vorliegenden Erfin dung sowohl die Vollängen-Proteine wie auch deren Mutanten, wie z. B. Deletionsmutanten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Zusammenset zung ein deletiertes L-Protein, vorzugsweise ein deletiertes L1- und/oder L2-Protein. Die De letion hat den Vorteil, daß in den deletierten Bereich andere Proteine, beispielsweise Papillo mavirus-spezifische E-Proteinsequenzen eingefügt werden können, wodurch sich der Anwen dungsbereich der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erweitern läßt. Insbesondere bevor zugt ist ein L-Protein mit einer C-terminalen Deletion und insbesondere ein C-terminal deletier tes L1-Protein. Die C-terminale Deletion hat den Vorteil, daß die Effizienz der Bildung virus ähnlicher Partikel gesteigert werden kann, da das am C-Terminus lokalisierte nukleäre Lokali sationssignal deletiert ist. Die C-terminale Deletion beträgt daher vorzugsweise bis zu ca. 35 Aminosäuren, insbesondere ca. 25 bis ca. 35 Aminosäuren, vor allem ca. 32 bis ca. 34 Ami nosäuren. Beispielsweise ist eine 32 Aminosäuren lange C-terminale Deletion des HPV-16 L1-Proteins und eine ca. 26 Aminosäuren lange C-terminale Deletion des BPV-1 L1-Proteins (Bovines Papillomavirus Typ 1) ausreichend, um die Bildung von virusähnlichen Partikeln um das mindestens ca. zehnfache steigern zu können.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist auch das E-Protein deletiert, vor allem das E6- und/oder E7-Protein. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn der C-terminale Teil des E- Proteins deletiert ist, vorzugsweise der C-terminale Teil des E7-Proteins, da diese Konstrukte in Verbindung mit deletiertem L-Protein bevorzugt Capsomere und/oder Capside ausbilden können. Insbesondere bevorzugt sind Deletionen bis zu ca. 55 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 55 Aminosäuren, insbesondere ca. 38 bis ca. 43 Aminosäuren.

Ein besonders bevorzugtes Konstrukt ist beispielsweise E7 mit den N-terminalen Aminosäuren 1 bis ca. 60, da dieses Konstrukt ein Maus-Epitop zur Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten enthält, welches im Bereich der Aminosäuren 49-57 lokalisiert ist. Ein anderes bevorzugtes Konstrukt ist E7 mit den N-terminalen Aminosäuren 1 bis ca. 55, welches in Ver bindung mit deletiertem L-Protein Capsomere und Capside bevorzugt bildet, da dieses Kon strukt E7-spezifische Sequenzen im Bereich der Aminosäuren 56-70 vermutlich nicht enthält, welche die Bildung von Capsiden stören können. Besonders bevorzugt ist ein um 32 Ami nosäuren C-terminal deletiertes L1-Protein von HPV-16, welches mit einem E7-Protein von HPV-16 mit den Aminosäuren 1-55 oder 1-60 verbunden ist. Diese Konstrukte induzieren nicht nur neutralisierende Antikörper oder eine spezifische CTL-Antwort, sondern verhindern einerseits die Bildung von Tumoren und verursachen andererseits einen Rückgang von bereits bestehenden Tumoren im Tierexperiment. Vor allem E7 mit den Aminosäuren 1-60 zeigt eine deutliche prophylaktische wie auch therapeutische Wirkung bei Tumoren. Eine besonders be vorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist daher ein L1ΔE7_1-x-Fusionsprotein, vorzugsweise in Form eines CVLPs, insbesondere von HPV16, wobei x eine ganze Zahl von 55 bis einschließlich 60 bedeutet, und insbesondere ein L1ΔCE7_1-55- oder L1ΔCE7_1-60-Fusionsprotein.

Zur Herstellung eines sowohl prophylaktisch wie auch therapeutisch wirksamen Arzneimittels ist es bevorzugt, das L-Protein an das E-Protein beispielsweise in Form eines Fusionsproteins zu binden. Des weiteren ist es bevorzugt, wenn die beschriebenen Papillomavirus-spezifischen Proteine in Form eines Capsids und/oder Capsomers vorliegen, da durch die Capside und/oder Capsomere und insbesondere durch den Anteil von L-Protein die Immunreaktion noch deutlich gesteigert werden kann. Als Fusionsproteine, die zur Capsid- und/oder Capsomerbildung ge eignet sind, sind daher beispielsweise Fusionsproteine aus deletiertem L1 und E7, E6 und/oder E1 bevorzugt.

Capside sind im Sinne der vorliegenden Erfindung virale oder virus-ähnliche Strukturen in ei ner im allgemeinen ikosaedrischen Form, die im allgemeinen aus ca. 72 Capsomeren aufgebaut sind.

Capsomere sind im Sinne der vorliegenden Erfindung assemblierte Proteine enthaltend minde stens ein Papillomavirus-Strukturprotein, vorzugsweise L1 oder Deletionen von L1. Beispiels weise können 5 Fusionsproteine zu einem Capsomer assemblieren, die wiederum zu einem Capsid assemblieren können.

Für die Herstellung eines humanen Arzneimittels bzw. Diagnostikums sind für die beschriebe nen Konstrukte Proteine bzw. Peptide des humanen Papillomavirus (HPV) und vorzugsweise von HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-52 und/oder HPV-58, insbesondere HPV-16, HPV-18, HPV-31 und/oder HPV-45 ge eignet. Vor allem für die Herstellung einer Kombinationsvaccine ist es vorteilhaft, Proteine bzw. Peptide aus verschiedenen HPV-Typen zu kombinieren, beispielsweise eine Kombination von HPV-16 und HPV-18 bzw. HPV-18, HPV-31, HPV-45 und HPV-58 im Falle von z. B. Cervixcarcinom oder HPV-6 und HPV-11 im Fall von z. B. Condylomen.

Die Expressionsvektoren können beispielsweise prokaryotische oder eukaryotische Expressi onsvektoren sein. Beispiele für prokarvotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z. B. die Vektoren pGEM oder pUC-Deiviate (siehe z. B. WO 96/11272). Beispiele für eukaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J. J. et al. (1991) supra) und für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus-Vektoren, insbesondere das Autographa Californica-Virus, wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart (siehe z. B. auch WO 94/20137), und für die Expression in Säugerzellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind. Es eignen sich jedoch auch kommerziell erhältliche Baculovirus Ex pressionssysteme wie z. B. der Baculo Gold™ Transfection Kit von Pharmingen oder das Bac-to-Bac™ Baculovirus Expressionsystems von Gibco BRL. Weitere geeignete Expressi onssysteme sind rekombinante Vaccinia-Viren (siehe z. B. WO 93/02184).

Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirtszelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z. B. EP-B1-0 154 133), den ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen (siehe z. B. EP-B1-0 127 839 oder U.S. 5,004,687) oder den frühen SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232).

Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DHS, HB101 oder BL21, die Hefestämme Saccharomyces cerevisia, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces oder Han senula (Carter, J. J. et al. (1991), Virology, 182, 513), die Insektenzellinie Lepidopteran, z. B. von Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou oder Galleria Mellonela oder die tierischen Zellen COS, C127, Vero, 293 und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind (siehe z. B. WO 94/00152).

Die kodierenden Nukleinsäuren für die einzelnen Papillomavirus-spezifischen Proteine können beispielsweise über eine PCR("polymerase chain reaction")-Amplifizierung aus einer Genbank isoliert und kloniert werden. Beispielsweise ist das Genom von BPV-1 unter der GenBank Ac cession No. X02346 oder HPV-16 unter der GenBank Accession No. K02718 allgemein er hältlich. Eine HPV-16 L1-Sequenz ist beispielsweise auch in WO 94/05792 offenbart. Die Se quenz des 98 Aminosäure-langen HPV16 E7-Proteins ist beispielsweise bei Seedorf et al. (1985) Virology, 145, 181-185 beschrieben. Eine andere Methode, die gewünschten Nuklein säuren zu erhalten, ist, die Papillomavirus-spezifischen Gene direkt aus Warzen oder Tumore mittels PCR zu isolieren. Geeignete Primer für die E6- und E7-Gene aus HPV-16 und HPV-18 sind z. B. in WO 93/21958 offenbart. Weitere Literaturstellen für die gewünschten Nukleinsäu ren sind beispielsweise Kirnbauer, R. et al. (1994), supra bzw. die oben bereits erwähnten in der EMBL-Datenbank hinterlegten Klone.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Expressionsvektor so konstruiert, daß das exprimierte Fusionsprotein um keine weiteren, durch den Vektor verursachte Aminosäuren verlängert ist. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, daß durch Mutagenese in einer PCR-Re aktion mittels geeigneter Primer-Oligonucleotide unerwünschte Nucleotide, die für zusätzli che Aminosäuren kodieren, entfernt werden (Ho et a. (1989) Gene, 77, 51-59). Auf diese Wei se erhält man ein Fusionsprotein, welches frei von zusätzlichen Aminosäuren und somit frei von möglicherweise zusätzlichen Fremdepitopen ist, die immunologische Nebenreaktionen bewirken können.

Nach der Expression des beschriebenen Fusionsproteins ist es bevorzugt, dieses weiter zu rei nigen bzw. zu renaturieren. Beispiele von chromatographischen Reinigungsverfahren finden sich Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L. (1982) J. Virol. Meth., 5, 151; Nakai, Y. et al. (1987) J. Gen. Virol., 68, 1891; Hofmann, K. J. et al. (1995) Virology, 209, 506; Rose, R. C. et al. (1993) J. Virol., 67, 1936, Sasagawa, T. et al. (1995) Virology, 206, 126 oder WO 95/31532.

Als Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, die beispielsweise zur weiteren Stabilisierung des Papilloma virus-spezifischen Proteins in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung dienen, eignen sich beispielsweise Detergentien, wie z. B. Triton-X-100 oder Natriumdesoxycholat, aber auch Po lyole, wie z. B. Polyethylenglykol oder Glycerin, Zucker, wie z. B. Saccharose oder Glukose, zwitterionische Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren wie Glycin oder insbesondere Taurin oder Betain und/oder Protein, wie z. B. bovines oder humanes Serumalbumin. Bevorzugt sind Detergentien, Polyole und/oder zwitterionische Verbindungen.

Andere Zusatz- und/oder Hilfsstoffe sind Proteaseinhibitoren, wie z. B. Aprotinin, ε-Aminocapronsäure oder Pepstatin A.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der er findungsgemäßen Formulierung, wobei das oben beschriebene Papillomavirus-spezifische Pro tein beispielsweise in Lösung enthaltend ca. 0,3 bis ca. 4 M, vorzugsweise ca. 0,4 bis ca. 3 M, insbesondere ca. 0,5 bis ca. 2 M, vor allem ca. 1 bis ca. 2 M eines Salzes bei entsprechendem pH-Wert von ca. 7,3 bis ca. 7,45, vorzugsweise ca. 7,4 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und Hilfsstoffe, eingebracht und/oder gegen die beschriebene Zusammensetzung dialysiert wird.

Die erfindungsgemäße Formulierung eignet sich als Arzneimittel oder Diagnostikum. Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung der erfindungsgemäßen For mulierung als Arzneimittel oder Diagnostikum. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn das Arz neimittel kein Adjuvans enthält, d. h. keine Substanz, die die Immunogenität des Papillomavi rus-spezifischen Proteins verstärkt, da insbesondere in Anwesenheit eines L-Proteins vor allem von L1 die Immunogenität bereits ausreichend verstärkt ist. Diese Eigenschaft ist insbesondere bei der Zulassung als Arzneimittel oder Diagnostikum von Vorteil, da die einzigen von den Zulassungsbehörden zugelassenen immunstimulierenden Materialien zur Zeit Aluminiumsalze sind.

Das Arzneimittel eignet sich insbesondere zur Vermeidung und/oder Behandlung von Papillo mavirus-spezifischem gutartigem oder bösartigem Tumor, insbesondere von bösartigem Tu mor, wie z. B. Larynx-, Cervix-, Penis-, Vulva- oder Analcarcinom, und das Diagnostikum zur Diagnose von einer oder mehreren Papillomavirus-Infektion(en). Beispiel eines Diagnostikums ist die dem Fachmann bekannte Immunodiagnostik, beispielsweise ein ELISA zur Messung von Papillomavirus-spezifischen Antikörpern (siehe z. B. Voller, A. et al. (1976) Bull. World Health Organ., 53, 55-63) oder ein Hauttest gemäß z. B. Höpfl et al. (1991) Lancet. 1, 373-374).

Im allgemeinen kann das Arzneimittel oral, parenteral, wie z. B. subcutan, intramuskulär oder über die Schleimhaut, in flüssiger oder suspendierter Form, in Form eines Elixiers oder als Kapseln verabreicht werden, vorzugsweise als Injektions- oder Infusionslösung. Bei den erfin dungsgemäßen Formulierungen kann auf ein Adjuvans verzichtet werden, was besonders vor teilhaft ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Formulierung als Injektions- oder Infusionslösung.

Injektionslösungen werden im allgemeinen dann verwendet, wenn nur relativ geringe Mengen einer Lösung bzw. Suspension, beispielsweise ca. 1 bis ca. 20 ml, dem Organismus zugeführt werden soll. Infusionslösungen werden im allgemeinen dann verwendet, wenn eine größere Menge einer Lösung oder Suspension, beispielsweise ein oder mehrere Liter, appliziert werden sollen. Da im Gegensatz zur Infusionslösung bei Injektionslösungen nur wenige Milliliter ver abreicht werden, machen sich geringe Abweichungen vom pH-Wert und vom osmotischen Druck des Blutes bzw. der Gewebsflüssigkeit bei der Injektion nicht oder nur unwesentlich im Hinblick auf die Schmerzempfindung bemerkbar. Eine Verdünnung der erfindungsgemäßen Formulierung vor der Anwendung ist daher im allgemeinen nicht erforderlich. Bei der Applika tion größerer Mengen sollte hingegen kurz vor der Applikation die erfindungsgemäße Formu lierung so weit verdünnt werden, daß eine isotonische Lösung erhalten werden kann. Ein Bei spiel einer isotonischen Lösung ist eine 0,9%-ige Natriumchloridlösung. Bei der Infusion kann die Verdünnung beispielsweise mit sterilem Wasser während der Applikation z. B. über einen sog. Bypaß erfolgen.

Der wesentliche Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die erfindungsgemäße Zusammen setzung im wesentlichen nicht zu einem Ausfallen von immunreaktiven Papillomavirus-spe zifischem Protein führt. Insbesondere bleiben mehr als ca. 90%, vor allem mehr als ca. 95% des Proteins in Lösung und fallen auch nicht für einen Zeitraum von mindestens ca. 12 Stun den aus. Auch ist das immunoreaktive Papillomavirus-spezifische Protein durch Zentrifugation bei maximal 5000 g nicht wesentlich sedimentierbar.

Die Figur und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu be schränken.

Fig. 1 zeigt graphisch die Abhängigkeit der Löslichkeit Virus-ähnlicher Partikel von der Salz konzentration.

Beispiele 1. Herstellung von chimären Genen kodierend für HPV16L1E7-Fusionsproteine

Die Herstellung von HPV 16L1ΔC.E7 1-55 erfolgte nach Müller, M. et al. (1997), supra. Hierbei wurde der HPV-16L1 offene Leserahmen (ORF) aus dem Plasmid HPV-16-114/k-L1/L2-pSynxtVI⁻ (Kirnbauer, R. et al. (1994) J. Virol. 67, 6929) mit der Restriktionsendonu klease BglII ausgeschnitten und in den Vektor pUC19 (New England Biolabs) in die BamHI-Stelle kloniert.

Zur Herstellung von HPV-16L1ΔC wurden zwei Primer konstruiert, die zu HPV-16L1 ORF komplementär sind. Der erste Primer hat die Sequenz

AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC

und der zweite Primer

AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG.

Beide Primer kodieren 5' eine EcoRV Restriktionsenzymschnittstelle. In den stromabwärtslie genden Primern folgt auf die EcoRV Stelle ein TAA Translationsstopkodon, um die letzten 34 Aminosäuren des HPV16L1 ORF zu deletieren. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, um den gesamten L1 ORF und den gesamten Vektor zu amplifizieren. Das lineare Produkt wurde mit EcoRV gespalten, mit T4 DNA-Ligase zirkularisiert und E. coli DH5α-Zellen transfor miert. Die Klone wurden auf die Anwesenheit einer EcoRV Stelle analysiert. Das erhaltene Konstrukt pUCHPV16L1ΔC wurde benutzt, um den ORF von HPV16E7 1-50 in die EcoRV Stelle zu klonieren.

Zur Klonierung des Fragmentes wurden Primer mit einer 5'EcoRV Restriktionsenzymschnitt stelle verwendet. Es wurde folgendes Primerpaar verwendet:

AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC
und
TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC.

Die PCR Produkte wurden mit EcoRV gespalten und in die EcoRV Stelle des modifizierten L1-Gens insertiert.

Zur Eliminierung der EcoRV Stellen wurden zwei PCR-Reaktionen durchgeführt, um zwei überlappende Fragmente des Klons pUC-HPV16L1ΔCE7 1-50 zu amplifizieren. Die resultie renden DNA-Fragmente überlappten an der Position der L1/E7 Grenze ("Four Primer PCR", Ho, S. N. et al (1989) Gene 77, 51). Jedoch enthielten die Primer nicht die zwei EcoRV Re striktionsenzymschnittstellen. Fragment 1 wurde mit den Primern P1 und P2 und Fragment 2 mit den Primern P3 und P4 hergestellt.

P1: GTTATGACATACATACATTCTATG (L1)
P2: CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC (E7)
P3: CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC (E7)
P4: CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG (E7).

Ein Zehntel der gereinigten Produkte wurde gemischt und als Matrize in der PCR-Reaktion mit ausschließlich den Primern P1 und P4 benutzt. Das resultierende Produkt wurde mit EcoNI (L1) und HindIII (stromabwärts vom Stopkodon auf den Primer P4) gespalten und benutzt, um ein EcoNI/HindIII Fragment des klonierten HPV16L1 ORF zu ersetzen. Der resultierende Klon unterscheidet sich daher vom Klon HPV16L1ΔCE7 1-50 durch den Verlust der zwei internen EcoRV Restriktionsenzymschnittstellen und der korrespondierenden nicht-HPV Ami nosäuren Asp und Ile zwischen dem L1 ORF und E7 und stromabwärts von E7. Die erste EcoRV Stelle wurde durch die ursprünglichen L1 Aminosäuren an dieser Position ersetzt (AlaGly). Die zweite EcoRV Stelle wurde durch ein Translationsstopsignal ersetzt. Zusätzlich enthält dieser Klon (HPV16L1ΔC.E7 1-52) die ersten 52 Aminosäuren von HPV16E7. Klon HPV16L1ΔC.E7 1-52 wurde zur Herstellung des Klons HPV16L1ΔC.E7 1-55 mit Hilfe des Primers P1 in Kombination mit PS verwendet.

P5: CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG (E7 1-55).

In allen Fällen wurden EcoNI und HindIII benutzt, um die korrespondierenden Fragmente zu ersetzen. Die Klone wurden durch DNA-Sequenzierung analysiert.

2. Herstellung von rekombinanten Baculoviren

Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen wurden als Monolayer oder in Suspensionskultur in TNM-FH Insektenmedium (Sigma, Deisenhofen) mit 10% fötalem Kälberserum und 2 mM Glutamin herangezogen. Rekombinante Baculoviren HPV16L1ΔCE7 1-55 wurden durch Cotransfektion von 10 µg der rekombinanten Plasmide und 2 µg von linearisiertem Baculo-Gold DNA (Pharmingen, San Diego, CA) in Sf9 Zellen transfiziert. Rekombinante Viren wurden gemäß der Angaben des Herstellers gereinigt. Um die Expression zu testen, wurden 106 Sf9 Zellen mit rekombinantem Baculovirus und einer m.o.i. ("multiplicity of infection") von 5 bis 10 infiziert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen mit PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂PO₄, 1,5 mM KH₂PO₄, pH 7,2) gewaschen. Die Zellen wurden dann in SDS-Probenpuffer lysiert und durch SDS-Gelchromatographie und Immunoblotassay getestet.

3. Reinigung von virusähnlichen Partikeln

Für die Herstellung von CVLPs wurden Trichoplusia ni (TN) High Five-Zellen bei 27°C bis zu einer Dichte von 1-1,5×10⁶ Zellen pro ml in Ex-Cell 405 serumfreiem Medium gezüchtet (JRH, Biosciences, Lennexa, KS). Eine 400 ml Kultur wurde geerntet und mit einer m.o.i. von 2 bis 5 mit rekombinanten Baculoviren für eine Stunde mit periodischen Inversionen infiziert. Es wurden bis zu 240 ml Medium hinzugegeben und die Zellen wuchsen 3 bis 4 Tage lang. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und in 10 ml Extraktionspuffer resuspendiert (25 mM Tris/HCl, pH 7,5; 500 mM NaCl, 1 mM EDTA) und für 45 Sekunden bei 60 Watt be schallt. Nach der Zentrifugation bei 10 000 rpm im Sorvall SS34 Rotor wurde das Pellet im 6 ml Extraktionspuffer gelöst, für 30 Sekunden bei 60 Watt beschallt und erneut zentrifugiert. Die Überstände wurden kombiniert und auf einen Zweistufengradienten aus 40% (w/v) Sac charose und 57,5% (w/v) CsCl aufgebracht. Nach der Zentrifugation in einem SW-28 Rotor bei 27 000 rpm für zwei Stunden wurden die Interphase und die CsCl-Schicht gesammelt, auf eine CsCl-Dichte von 1,38 g/ml justiert und bei 45 000 rpm für 16 Stunden zentrifugiert. Die Gradienten wurden fraktioniert und jede Fraktion wurde durch Western Blot mit Anti- HPV16L1mAb Camvir1 (Pharmingen, San Diego, CA) getestet. Die reaktiven Fraktionen wurden vereinigt und über eine Ultrafiltration mit Centricon 30 Mikrokonzentrator (Amicon Corp. Beverly, MA) gegen Hepes-Puffer (1 mM Hepes, 149 mM NaCl, 0,5 mM KCl, pH 7,2) dialysiert und die Anwesenheit von CVLPs mittels Transmissionselektronenmikroskopie bestä tigt. Die Konzentration von L1E7-Protein wurde in einem SDS-Gel, welches mit Coomassie blue angefärbt wurde, durch Vergleich mit BSA-Standards ungefähr bestimmt.

4. Mikrodialyseexperimente

Als Probe wurde eine Fraktion mit Virus-ähnlichen Partikeln verwendet, die aus High Five- Zellen durch Saccharosekissen- und Cäsiumchlorid-Gleichgewicht-Ultrazentrifugation isoliert worden waren.

In einem 50 ml Plastikgefäß mit Schraubverschluß wurden 40 ml der entsprechenden Lösung vorgelegt. Auf diese Lösung wurde vorsichtig ein Dialysefilter mit einem Porendurchmesser von 0,025 µm gelegt, der auf der Flüssigkeit während der Durchführung der Dialyse schwimmt. Auf diesen Filter wurden 30 µl der reinen CVLP-Lösung pipettiert und das Gefäß verschlossen. Mindestens 12 Stunden wurde das Gefäß bei 4-6°C stehen gelassen, so daß die Lösung des Tropfen gegen die Dialyselösung (50 mM Tris/HCl, pH 7,5 mit steigender NaCl- Konzentration) ausgetauscht wurde. Der Tropfen wurde mit der Kolbenhubpipette entnommen und es wurde mit 30 µl Reservoirlösung ausgeglichen. Nach Zentrifugation bei 10 000 g (10 min, 4°C) wurde der Überstand im ELISA (Kemeny, D. M. (1994) Indirekter ELISA aus: ELISA, Anwendung des Enzyme Linked Immunosorbent Assay im biologisch/medizinischen Labor, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, S. 111, Test 6.2) mit einem konformationsspezifi schen monoklonalen Antikörper gegen HPV16L1 und in einem Proteinassay untersucht. Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mit einem Bicinchonsäureassay (Smith, P. K. et al. (1985) Anal. Biochem., 150, 76-85) gegen Rinderserumalbumin als Standard. Das Ergebnis ist in Fig. 1 dargestellt.

Claims

1. Formulierung enthaltend mindestens ein spätes Protein (L-Protein) eines oder mehrerer Papillomaviren und/oder mindestens ein frühes Protein (E-Protein) eines oder mehrerer Papillomaviren und ca. 0,3 bis ca. 4 M, vorzugsweise ca. 0,4 bis ca. 3 M, insbesondere ca. 0,5 bis ca. 2 M, vor allem ca. 1 bis ca. 2 M eines Salzes bei einem pH-Wert von ca. 7,3 bis ca. 7,45, vorzugsweise von ca. 7,4, sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

2. Formulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz ein Alkali- oder Erdalkalisalz ist, vorzugsweise ein Halogenid oder Phosphat, insbesondere ein Alkalihalogenid, vor allem NaCl und/oder KCl.

3. Formulierung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert mit einem Puffer eingestellt wird, vorzugsweise mit einem Phosphat-Puffer, Tris-Puffer, HEPES-Puffer oder MOPS-Puffer.

4. Formulierung nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die genannten Proteine keine Papillomavirus-unspezifischen Epitope enthält.

5. Formulierung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das L-Protein ein deletiertes L-Protein ist, vorzugsweise ein dele tiertes L1- und/oder L2-Protein.

6. Formulierung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das L-Protein ein C-terminal deletiertes L-Protein ist, insbesondere ein C-terminal deletiertes L1-Protein.

7. Formulierung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu ca. 35 Aminosäuren vom L-Protein deletiert sind, vorzugsweise ca. 25 bis ca. 35, insbesondere ca. 32 bis ca. 34 Aminosäuren.

8. Formulierung nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß das E-Protein ein deletiertes E-Protein ist, vor allem ein deletiertes E6- und/oder E7-Protein.

9. Formulierung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das dele tierte E-Protein ein C-terminal deletiertes E-Protein ist, vorzugsweise ein C-terminal deletiertes E7-Protein.

10. Formulierung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu ca. 55 Aminosäuren deletiert sind, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 55 Aminosäuren, insbesondere ca. 38 bis ca. 43 Aminosäuren.

11. Formulierung nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß das L-Protein an das E-Protein gebunden, vorzugsweise fusioniert, ist.

12. Formulierung nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein in Form eines Capsids und/oder Capsomers vorliegt.

13. Formulierung nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß das Papillomavirus ein humanes Papillomavirus (HPV) ist.

14. Formulierung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das HPV ausgewählt ist aus HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-42, HPV 45, HPV-52 und/oder HPV-58.

15. Formulierung nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatz- und/oder Hilfsstoffe ein oder mehrere Detergentien, Polyole und/oder zwitterionische Verbindungen sind.

16. Verfahren zur Herstellung einer Formulierung nach einem der Ansprü che 1-15, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein in eine Lösung enthaltend ca. 0,3 bis ca. 4 M, vorzugsweise ca. 0,4 bis ca. 3 M, insbesondere ca. 0,5 bis ca. 2 M, vor allem ca. 1 bis ca. 2 M eines Salzes bei einem pH-Wert von ca. 7,3 bis ca. 7,45, vorzugsweise von ca. 7,4, eingebracht und/oder dagegen dialysiert wird.

17. Verwendung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 1-15 als Arzneimittel oder Diagnostikum.

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die For mulierung kein Adjuvans enthält.

19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel der Vermeidung oder Behandlung von Papillomaviren-spe zifischem Tumor dient.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Tumor ein Larynx-, Cervix-, Penis-, Vulva- oder Analcarcinom ist.

21. Verwendung nach einem der Ansprüche 17-20, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Formulierung als Injektions- oder Infusionslösung verwendet wird.

22. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Dia gnostikum zur Diagnose von einer oder mehrerer Papillomavirus-Infek tion(en) dient.