MXPA00009283A - Fprmulacion con una proteina especifica del virus de papiloma, y la produccion y uso de esta. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a una formulacion que contiene cuando menos una proteina especifica del virus de papiloma con aproximadamente 0.3 a aproximadamente 4 M de una sal con un valor de pH de aproximadamente7.3 a aproximadamente 7.45.

Description

FORMULACIÓN CON UNA PROTEÍNA ESPECÍFICA DEL VIRUS DE PAPILOMA, Y LA PRODUCCIÓN Y USO DE ÉSTA La presente invención se refiere a una formulación que contiene cuando menos uma proteina especifica de papilomavirus, con aproximadamente 0.3 a aproximadamente 4 M de una sal a un pH de aproximadamente 7.3 a aproximadamente 7.45. Los virus de papiloma o papilomavirus, también denominado virus de verrugas, son los virus de DNA í bicatenarios que tienen un tamaño de genoma de aproximadamente 8000 pares de bases y una cápside tipo icosaédrica teniendo un diámetro de aproximadamente 55 nm. A la fecha se conocen más de 100 diferentes tipos de papilomavirus humano de los cuales algunos, por ejemplo, HPV-lß, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 ó HPV-58 pueden causar tumores malignos y otros, por ejemplo, HPV-6, HPV-11 ó HPV-42 pueden causar tumores benignos. El genoma de los papilomavirus puede subdividirse en tres áreas: la primera área se refiere a una región no codificante que contiene elementos de regulación para la transcripción y replicación del virus. La segunda región, la denominada región E (temprana) contiene diferentes secciones codificantes de la proteina E1-E7, de las cuales, por ejemplo, la proteína E6 y la proteina E7 son responsables de la transformación de las células epiteliales y la proteina El controla el número de copias del DNA. La región E6 y la región E7 son denominadas oncógenos, los cuales también se expresan en células degeneradas malignas. La tercera región, también denominada la región L (tardia) , contiene dos secciones que codifican proteina Ll y L2, las cuales codifican para los componentes estructurales de la cápside del virus. La proteína Ll esta presente en más de 90% de la cápside viral, la proporción de Ll:L2 en general siendo 30:1. En HPV-6 y HPV-11 se han tenido como responsables, entre otros, de las verrugas genitales; algunos tipos de papilomavirus como HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 y HPV-58 están asociados con tumores malignos del tracto anogenital. En más de 50% de los casos, el HPV-lß esta relacionado con cáncer cervical (carcinoma del útero) . El HPV-16 por tanto es el factor de riesgo principal para la formación de neoplasias cervicales. Además, el sistema inmune desempeña una función importante en el progreso de la enfermedad. De este modo, se supone que las respuestas inmunes celulares y, en particular, los linfocitos T específicos de antigeno son importantes para el mecanismo de defensa. Además, se ha encontrado que en neoplasias intraepiteliales cervicales de alto grado (CIN/II/III) y tumor cervical, el gen E7 se expresa en forma constitutiva en todas las capas del epitelio infectado. La proteina E7 es, por tanto, considerada como un antigeno potencial de tumor y como una molécula elegida para células T activadas (véase, por ejemplo, WO93/20844) . La respuesta inmune celular inducida por E7 en el paciente, sin embargo, aparentemente no es tan fuerte para influir en el transcurso de la enfermedad. La respuesta inmune posiblemente pueda ser amplificada por vacunas convenientes. Ahora ha sido posible mostrar que la expresión del en Ll o la coexpresión del en Ll y L2 forma partículas tipo virus (VLP) . Fue posible utilizar las VLP para la formación de anticuerpos neutralizantes en diferentes sistemas animales.

La formación de anticuerpos neutralizantes de virus, sin embargo, es de importancia clínica relativamente baja si la infección de virus ya ha tomado lugar, dado que para la eliminación de las células infectadas con virus parece ser necesaria una respuesta de las células T citotóxicas (CTL) especificas del virus. Por tanto, se desarrollaron las denominadas partículas tipo papilomavirus quimérico (CVLP) que consisten en una proteina L1-E7 quimérica (Müller, M. y col., (1997) Virology, 234, 93): algunas CVLP inducen una respuesta CTL específica de E7 en ratones, aunque en los experimentos no se induce anticuerpos por inmunización de ratones con CVLP contra E7 (Müller, M. y col. (1997), supra) . Además, los anticuerpos neutralizantes de los trastornos asociados con HPV en pacientes parecen limitar la respuesta inmune a la proteina Ll administrada (Müller, M. y col. (1997), supra). No obstante, las CVLP son todavía de interés para el desarrollo de una vacuna, en vista de que las proteínas E7 de células de tumor presentadas por las moléculas de MHC de la clase I representarían las moléculas elegidas de las CTL. Peng y col. (1998) Virology, 240, 147 ahora describen las CVLP consistiendo en Ll truncada en el C terminal del papilomavirus de bovino (BPV) y HPV-16E7 g_5 , que inducen células T citotóxicas especificas de E7 después de inoculación de ratones C57B1/6 y protege contra el crecimiento de tumores que expresan E7. Greenstone y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1800 describe las CVLP consistiendo en HPV-16L1 más HPV-16L2 fusionadas para la proteina HPV-16E7 de longitud completa, la cual protege contra el crecimiento de las células de tumor que expresan E7 epitelial después de inmunización de ratones C57B1/6, células T citotóxicas, no obstante, no siendo detectadas y asi parece ser menos eficiente la inducción de la respuesta inmune . Las VLP y CVLP en general están preparadas por medio de manipulación genética mediante la expresión de los genes correspondientes que codifican para una o más de las proteínas L o las proteínas L y E en sistemas de expresión convenientes. Los genes correspondientes están descritos, por ejemplo, en Kirnbaum, R. y col. (1994) J. Virol., 67, 6929-6936 o se puede obtener a través del banco de datos EMBL. Los números de acceso son, por ejemplo, para HPV18: PAPHPV18; para HPV31: PAPPPH31; para HPV33: PAPPPH33Ó para HPV58: PAPPPH58. Los sistemas de expresión convenientes son, por ejemplo, levaduras modificadas por manipulación genética, por ejemplo, Saccharomyces (cerevisiae) , Pichia (pastoris) , Kluyvermyces (lactis) , Schizosaccharomyces (pombe) ó Hansenula (polymorpha) (Cárter, J. J. y col. (1991) , Virology, 182, 513) , células de insecto como puede ser, por ejemplo, Trichoplusia ni High Five (véase, por ejemplo, Müller y col. (1997), supra) o células procarióticas (véase, por ejemplo, 096/11272) . En el caso de la producción de las partículas en células procarióticas, estas están, en general, depositadas en la célula y forman los denominados cuerpos de inclusión, los cuales entonces tienen que ser renaturalizados y llevados a solución. Para uso de las partículas o cápsides producidas por manipulación genética o sus precursores, los denominados capsómeros, son necesarios otros pasos de purificación después de la expresión. Un problema importante en el uso de las cápsides y capsómeros como medicamentos es su mala solubilidad. Asi pues, por ejemplo, las cápsides o capsómeros de HPV-16 tienden a agregarse, con lo cual se reduce significativamente la solubilidad. La baja solubilidad de las cápsides o capsómeros en algunos casos conduce no solo a una pérdida de rendimiento, sino también al uso complicado como medicamento o diagnóstico. Además, algunas veces se puede observar degradación del C terminal de la proteina Ll, lo cual conduce a material no homogéneo que no es conveniente para su aceptación como medicamento o de diagnóstico. WO 98/44944 describe una formulación de antigeno de HPV que consiste en un componente vacuna, una sal en concentraciones fisiológicamente aceptables y un detergente no iónico en concentraciones fisiológicamente aceptables. Por tanto, el objetivo de la presente invención es poner a la disposición una formulación sencilla y ventajosa en la cual las proteínas específicas de papilomavirus son solubles y estables. Ahora, sorprendentemente se ha encontrado que la solubilidad de las proteínas especificas de papilomavirus dependen de la concentración de sal y del pH de la formulación. En particular, fue sorprendente que una composición sin la adición de un excipiente no era estable a pH neutro en una solución salina isotónica de aproximadamente 10-150 mM de la sal, aunque las VLP o CVLP se formaron en el citoplasma de las células hospederas.

Además, se encontró, de acuerdo con la presente invención, que a un pH menor que aproximadamente 5.5 las CVLP precipitan y a un pH mayor que 9.5 las CVLP se agregan. Por tanto, un objetivo de la presente invención es una formulación que contiene cuando menos una proteina tardia (proteina L) de uno o más papilomavirus y/o cuando menos una proteina temprana (proteina E) de uno o mas papilomavirus y aproximadamente 0.3 a aproximadamente 4 M, de preferencia aproximadamente 0.4 a aproximadamente 2.5-3 M, en particular, aproximadamente 0.4-0.5 a aproximadamente 1-2 M, especialmente aproximadamente 1 a aproximadamente 2M de una sal a pH de aproximadamente 7.3 a aproximadamente 7.45, de preferencia aproximadamente 7.4, y, si es adecuado, los aditivos y/o excipientes convenientes, de preferencia sin aditivos ni excipientes. El término "formulación" se entiende de acuerdo con la presente invención, como una composición en la forma de una solución o suspensión de las proteínas especificas de papilomavirus ya mencionadas, donde las proteínas específicas de papilomavirus inmunorreactivas, en general, y en particular no sedimentan significativamente hasta no más de aproximadamente 500 g. La sal es, en general, una sal de metal alcalino ó de metal alcalinotérreo, de preferencia un haluro o fosfato, en particular un haluro de metal alcalino, especialmente NaCl y/o KCl. El uso de NaCl es particularmente preferido para la producción de una formulación farmacéutica. En general, el pH del medicamento se ajusta utilizando una solución amortiguadora orgánica o inorgánica como puede ser, por ejemplo, de preferencia utilizando una solución amortiguadora de fosfato, un buffer tris (hidroximetil) aminometano) , buffer HEPES (ácido [4- (2-hidroxietil) piperazino] etansulfónico) o buffer MOPS (ácido 3-rmorfolino-l-propansulfónico) . La elección del buffer respectivo en general depende de la molaridad del buffer deseado. El buffer de fosfatos es conveniente, por ejemplo, en soluciones para inyección e infusión. Para el uso de la composición de acuerdo con la invención como medicamento o diagnóstico es particularmente preferible si las proteínas especificas de papilomavirus no contienen epitopes inespecificos de papilomavirus, dado que, por este medio, es posible reducir o prevenir la respuesta inmune inespecifica de papilomavirus [sic] . Los términos proteina L y proteina E se entienden con el significado de la presente invención como proteínas de longitud completa y sus mutantes, por ejemplo, mutantes por deleción. En otra modalidad preferida, la composición de acuerdo con la invención contiene una proteina L delecionada, de preferencia una proteina Ll y/o L2 delecionada. La deleción tiene la ventaja de que las diferentes proteínas, por ejemplo, las secuencias de la proteina E especifica de papilomavirus, pueden ser insertadas en el área delecionada, con lo cual el área de aplicación de la composición de acuerdo con la invención puede ampliarse. Una proteina L teniendo una deleción C terminal y en particular una proteína Ll delecionada en el C terminal es particularmente preferida. La deleción C terminal tiene la ventaja que la eficacia de la formación de las partículas tipo virus puede incrementarse, dado que la señal de ubicación nuclear localizada en el C terminal esta delecionada. La deleción C terminal es, por tanto, preferiblemente hasta de aproximadamente 35 aminoácidos, en particular cerca de 25 hasta cerca de 35 aminoácidos, especialmente cerca de 35 a 34 aminoácidos. Por ejemplo, una deleción C terminal de 32 aminoácidos de largo de la proteina HPV-16L1 y una deleción C terminal de la proteina Ll de BPV-1 (papilomavirus de bovino tipo 1) de aproximadamente 26 aminoácidos de largo es adecuada para permitir incrementar la formación de las partículas tipo virus en cuando menos aproximadamente 10 veces . En otra modalidad preferida, la proteina E también es delecionada, especialmente la proteina E6 y/o E7. Se prefiere particularmente si la parte C terminal de la proteina E esta delecionada, de preferencia la parte C terminal de la proteina E7, en vista de que estas construcciones de preferencia pueden formar capsómeros y/o cápsides en combinación con la proteina L delecionada. Deleciones de hasta aproximadamente 55 aminoácidos son particularmente preferidas, de preferencia cerca de 5 a aproximadamente 55 aminoácidos, en particular cerca de 32 a aproximadamente 43 aminoácidos. Una construcción particularmente preferida es, por ejemplo, E7 teniendo los aminoácidos N terminales 1 a aproximadamente 60, conforme esta construcción contiene un epitope de ratón para la activación de los linfocitos T citotóxicos, el cual esta ubicado en el área de los aminoácidos 49-57. Otra construcción preferida es E7 teniendo los aminoácidos 1 a aproximadamente 55 N terminales, la cual de preferencia forma capsómeros y cápsides en combinación con la proteina L delecionada, en vista de que esta construcción presumiblemente no contiene secuencias especificas de E7 en el área de los aminoácidos 56-70, la cual puede inferir con la formación de las cápsides. Una proteina Ll de HPV-16 delecionada en el C terminal por 32 aminoácidos y que este unida a una proteina E7 de HPV-lß teniendo los aminoácidos 1-55 ó 1-60 es particularmente preferida. Estas construcciones no solo inducen anticuerpos neutralizantes o una respuesta CTL especifica, sino por una parte evita la formación de tumores y por otra parte causa regresión de los tumores ya existentes en experimentos animales. E7, teniendo los aminoácidos 1-60 presenta especialmente una acción profiláctica y terapéutica notable en tumores. Una modalidad particularmente preferida de la presente invención es, por tanto, una proteina de fusión Ll?E7?_x, de preferencia en la forma de una CVLP, en particular de HPV16, x siendo un entero desde 55 hasta e incluyendo 60, y en particular una proteina de fusión Ll?E7?_55 ó Ll?E7?_6o- Para la producción de un medicamento que sea activo para uso profiláctico y terapéutico, se prefiere si la proteina esta unida a la proteina E, por ejemplo en la forma de una proteina de fusión. Además se prefiere si las proteínas especificas de papilomavirus descritas están presentes en la forma de una cápside y/o capsómero, dado que la reacción inmune puede además incrementarse de manera notable por las cápsides y/o capsómeros y en particular por la fracción de _ la proteina L. Las proteínas de fusión preferidas que son convenientes para la formación de la cápside y/o capsómero son, por tanto, por ejemplo proteínas de fusión de Ll y E7 delecionadas, E6 y/o El. Las cápsides dentro del significado de la presente invención son estructuras virales o tipo virus en una forma generalmente icosaédrica, que en general están construidas de 72 capsómeros.

Los capsómeros dentro del significado de la presente invención son proteínas ensambladas que consisten en cuando menos una proteina estructural de papilomavirus, de preferencia Ll o deleciones de Ll. Por ejemplo, cinco proteínas de fusión pueden ser ensambladas para obtener un capsómero que a su vez puede ser ensamblado para obtener una cápside. Para la producción de un medicamento para humanos o de diagnóstico, las proteínas o péptidos de papilomavirus humano (HPV) y, de preferencia de HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-52 y/o HPV-58, en particular HPV-16, HPV-18, HPV-31 y/o HPV-45 son convenientes para las construcciones descritas. Especialmente para la producción de una vacuna en combinación, es ventajoso combinar proteínas o péptidos de diferentes tipos de HPV, por ejemplo, una combinación de HPV-16 y HPV-18 ó HPV-18, HPV-31, HPV-45 y HPV-58 en el caso de, por ejemplo, carcinoma de cervix o HPV-6y HPV-11 en el caso de, por ejemplo, condilomas. Los vectores de expresión pueden ser, por ejemplo, vectores de expresión procarióticos o eucarióticos. Los ejemplos de los vectores de expresión procarióticos son, para expresión en E. coli, por ejemplo, los vectores pGEM o derivados de pUC (véase, por ejemplo, WO 96/11272) .Los ejemplos de vectores de expresión eucarióticos son, para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo, los vectores p426Met25 ó p426GALl (Mumberg y col. (1994) Nucí. Acids. Res., 22, 5767-5768, Cárter, J. J. y col. (1991) supra) y, para la expresión en células de insecto, por ejemplo vectores baculovirus, en particular de Autographa Californica virus, como esta descrito en EP-B1-0 127 839 ó EP-B1-0 549 721 (véase, por ejemplo, también W094/20137), y, para expresión en células de mamífero, por ejemplo, los vectores Rc/CMV y Rc/RSV o vectores de SV40 que son todos en general obtenibles. No obstante, el sistema de expresión baculovirus disponible en el comercio también son convenientes -como pueden ser, por ejemplo, el kit de transfección Báculo Gold™ de Pharmingen o el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac™ de Gibco BRL. Otros sistemas de expresión convenientes son los virus de vacuna recombinantes (véase, por ejemplo WO 93/02184) . En general, los vectores de expresión también contienen promotores convenientes para la célula hospedera respectiva, como puede ser, por ejemplo, el promotor trp para la expresión en E. coli (véase, por ejemplo, EP-B1-0 154 133), el promotor ADH2 para la expresión en levaduras (Russel y col. (1983), J. Biol. Chem. 258. 2374-2682), el promotor de polihedrina de baculovirus para la expresión en células de insecto (véase, por ejemplo EP-B1-0 127 839 ó U. S. 5,004,687) o el promotor de SV40 temprano o los promotores LTR, por ejemplo MMTV (virus de tumor mamario de ratón; Lee y col. (1981) Nature 214, 228-232) . Las células hospederas convenientes son, por ejemplo, cepas de E. coli DH5, HB101 ó BL21, las cepas de levadura Saccharomyces, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces o Hansenula (Cárter, J. J. y col. (1991), Virology, 182, 513), la linea de células de insecto lepidóptero, por ejemplo de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou ó Galleria Mellonela o las células de animal COS, C127, Vero, 293 y HeLa, que en general todas pueden ser obtenidas (véase, por ejemplo, WO 94/00152) . Los ácidos nucleicos codificantes para las proteínas especificas de papilomavirus individuales pueden ser aislados y clonados, por ejemplo, a partir de un banco génico por medio de una amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) . Por ejemplo, el genoma de BPV-1 generalmente se obtiene con el número de acceso GenBank No. X02346 ó HPV-16 bajo el número de acceso de GenBank No. K02718. También se describe una secuencia de HPV-16 Ll, por ejemplo en WO 94/08792. La secuencia de 98 aminoácidos de largo de la proteina E7 de HPV16 esta descrita, por ejemplo, en Seedorf y col. (1985) Virology, 145, 181-185. Otro método de obtención de los ácidos nucleicos deseados es aislar los genes específicos de papilomavirus directamente de las verrugas o tumores por medio de PCR. Los iniciadores convenientes para los genes de E6 y E7 de HPV-16 y HPV-18 están descritos, por ejemplo, en WO 93/21958. Otras referencias para los ácidos nucleicos deseados son, por ejemplo, Kirnbaum, R. y col. (1994), supra por los clones depositados en el banco de datos EMBL ya mencionado. En otra modalidad preferida, el vector de expresión se construye de modo que la proteina de fusión expresada se extienda por no más aminoácidos causada por el vector [sic] . Esto se logra, por ejemplo, eliminando los nucleótidos no deseados que codifican para los aminoácidos no adicionales por mutagénesis en una reacción PCR por medio de oligonucleótidos iniciadores convenientes (Ho y col. (1989) Gene, 11 , 51-59) . De este modo, se obtiene una proteina de fusión libre de aminoácidos adicionales y asimismo libre de posibles epitopes extraños adicionales que pueden causar reacciones inmunológicas adversas. Después de la expresión de la proteina de fusión descrita, es preferible purificarla más o renaturalizarla. Los ejemplos de procesos de purificación cromatográfica se encuentran en Hjorht, R. & Moreno-Lopez, L. (1982) J. Virol.

Meth. 5, 151; Nakai, Y. y col. (1987) J. Gen. Virol., 68, 1891; Hofmann, K. J. y col. (1995) Virology, 209, 506; Rose, R. C. y col. (1993) J. Virol., 67, 1936, Sasagawa, T. y col. (1995), Virology, 206, 126 ó WO 95/31532. Los aditivos y/o excipientes convenientes que sirven, por ejemplo, para la mayor estabilización de la proteína especifica de papilomavirus en la composición de acuerdo con la invención son, por ejemplo, detergentes como Tritón X-100, o deoxicolato de sodio, pero también polioles como polietilen glicol o glicerol, azúcares como sacarosa o glucosa, compuestos anfotéricos como aminoácidos, por ejemplo glicina o en particular taurina o betaina y/o proteina, por ejemplo, albúmina de suero de bovino o humano. Se prefiere detergentes, polioles y/o compuestos anfotéricos. Otros aditivos y/o excipientes adecuados son los inhibidores de la proteasa como pueden ser, por ejemplo, aprotinina, ácido e-aminocapróico o pepstatina A. Otro objetivo de la presente invención es un proceso para la producción de la formulación de acuerdo con la invención, en el cual se introduce la proteina especifica de papilomavirus. antes descrita, por ejemplo, en solución conteniendo aproximadamente 0.3 a aproximadamente 4 M, de preferencia aproximadamente 0.4 a aproximadamente 2.5-3 M, en particular, aproximadamente 0.4-0.5 a aproximadamente 1-2 M, especialmente aproximadamente 1 a aproximadamente 2 M de una sal a pH de aproximadamente 7.3 a aproximadamente 7.45, de preferencia aproximadamente 7.4 y, si es adecuado, los aditivos y excipientes convenientes y/o se dializa contra la composición descrita. De preferencia, la formulación puede ser almacenada de manera estable a aproximadamente 4°C o en especial aproximadamente -80°C [sic] durante un tiempo relativamente prolongado, por ejemplo 1-2 meses o más. La formulación de acuerdo con la invención es conveniente como medicamento o diagnóstico. Por tanto, la presente invención también se refiere al uso de la formulación de acuerdo con la invención como medicamento o diagnóstico. Para el uso inmediato como medicamento o diagnóstico, la formulación de acuerdo con la invención de preferencia se ajusta a una concentración de aproximadamente 0.45 M. En particular, se prefiere si el medicamento no contiene coadyuvantes, es decir, ninguna sustancia que amplifique la inmunogenicidad de la proteina especifica de papilomavirus, dado que la inmunogenicidad ya esta adecuadamente amplificada, en particular en presencia de una proteina L, en especial de Ll. Esta propiedad es muy ventajosa en la autorización como medicamento o diagnóstico, en vista de que los únicos materiales inmunoestimulantes en la actualidad autorizados por las autoridades regulatorias son las sales de aluminio. El medicamento es particularmente conveniente para la prevención y/o tratamiento de tumor benigno o maligno especifico de papilomavirus, en particular del tumor maligno, como puede ser, carcinoma de la laringe, cervix, pene, vulva o ano, y para el diagnóstico de una o más infecciones de papilomavirus. Un ejemplo de un diagnóstico es el inmunodiagnóstico conocido por los expertos, por ejemplo un ELISA para la medición de los anticuerpos específicos de papilomavirus (véase, por ejemplo, Voller A. y col. (1976) Bull. World Health Organ., 53, 55-63) o una prueba de piel de acuerdo con, por ejemplo Hopfl y col. (1991) Lancet. 1, 373-374). En general, el medicamento puede administrarse por via oral, parenteral, por ejemplo, por via subcutánea, intramuscular o a través de la membrana mucosa, en forma liquida o suspensión, en forma de un elixir o como cápsulas, de preferencia como una solución para inyección o infusión. En el caso de las formulaciones de acuerdo con la invención es posible omitir un coadyuvante, lo cual es particularmente ventajoso. Otro objetivo de la presente invención, por tanto, se refiere al uso de la formulación de acuerdo con la invención para uso como una solución para inyección o infusión. En general, solo se utilizan soluciones para inyección si se va a administrar al cuerpo solo cantidades relativamente pequeñas de una solución o suspensión, por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 20 ml. En general, se utilizan soluciones para inyección si se va a administrar una cantidad mayor de una solución o suspensión, por ejemplo uno o más litros. Ya que, contrario a la solución para infusión, solo se administra algunos mililitros en el caso de soluciones para inyección, pequeñas diferencias del pH y de la presión osmótica de la sangre o del fluido tisular en la inyección no las hace perceptibles o solo las hace perceptibles en un grado insignificante con respecto a la sensación del dolor. La dilución de la formulación de acuerdo con la invención antes de su uso es, por tanto, en general no necesaria, no obstante, en el caso de la administración de cantidades relativamente grandes, la formulación de acuerdo con la invención debe ser diluida muy poco antes de la administración a tal grado que se pueda obtener una solución isotónica. Un ejemplo de una solución isotónica es una solución de cloruro de sodio al 0.9%. En el caso de infusión, la dilución se puede realizar, por ejemplo utilizando agua estéril mientras se lleva a cabo la administración, por ejemplo a través de una denominada derivación. La ventaja importante de la presente invención es que la formulación de acuerdo con la invención prácticamente no da origen a precipitación de la proteina especifica de papilomavirus inmunorreactiva. En particular, más que aproximadamente 90%, en especial más que aproximadamente 95% de la proteina permanece en solución y no precipita durante un tiempo de cuando menos cerca de 12 horas. La proteina especifica de papilomavirus inmunorreactiva, tampoco sedimenta substancialmente por centrifugación a un máximo de 5000 g. Además, la formulación sigue siendo homogénea y estable durante un tiempo relativamente prolongado de aproximadamente 1-2 meses y más. La figura y los siguientes ejemplos se proponen para ilustrar la invención con mayor detalle sin limitarla. La Figura 1 muestra gráficamente la dependencia de la solubilidad de las partículas tipo virus sobre la concentración salina.

Ejemplos 1. Preparación de genes quiméricos que codifican para proteínas de fusión HPV16L1E7 HPV16Ll?C*E71-55 fue preparado de acuerdo con Müller, M. y col. (1997), supra. El marco de lectura abierto (ORF) HPV-16L1 fue escindido del plásmido HPV-16-114/k-Ll/L2-pSynxtVI~ (Kirnbauer, R. y col. (1994) J. Viro!. 67, 6929) utilizando la endonucleasa de restricción Bglll y clonado en el sitio BamHl en el vector pUC19 (New England Biolabs) . Para la preparación de HPV-16L1?C, se construyeron dos iniciadores que son complementarios a HPV-16L1 ORF. El primer iniciador tiene la secuencia: AAAGATATCTTGTATAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC y un segundo iniciador AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG.

Ambos iniciadores codifican un sitio de disociación 5' de la enzima de restricción EcoRV. En los iniciadores que se encuentran corriente abajo, un codón antisentido de la traducción TAA sigue el sitio EcoRV para delecionar los últimos 34 aminoácidos de la HPV16L1 ORF. La reacción PCR se realizó para amplificar todo el Ll ORF y todo el vector. El producto lineal fue disociado con EcoRV y ciclado con T4 DNA ligasa y las células DH5 de E. coli fueron transformadas. Los clones fueron analizados para la presencia de un sitio EcoRV. La construcción pUCHPVldll?C obtenida fue utilizada para clonar el ORF de HPV16E7 1-50 en el sitio EcoRV. Para la clonación del fragmento se utilizaron los iniciadores que tenían un sitio de disociación de la enzima de restricción 5' EcoRV. Se utilizó el siguiente par de iniciadores : AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC y TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTCTCC . Los productos de la PCR fueron disociados con EcoRV e insertados en el sitio EcoRV del gen Ll modificado. Para la eliminación de los sitios EcoRV, se realizaron dos reacciones de la PCR para amplificar dos fragmentos traslapantes del clon pUC-HPV16Ll?CE7 1-50. Los fragmentos de DNA resultantes traslapados en la posición del limite L1/E7 (PCR del cuarto iniciador, Ho, S. N. y col. (1989) Gene 77, 51). No obstante los iniciadores no contenían los dos sitios de disociación con el desdoblamiento de la enzima de restricción EcoRV. Se preparó el fragmento 1 utilizando los iniciadores Pl y P2 y el fragmento 2 utilizando los iniciadores P3 y P4. Pl: GTTATGACATACATACATTCTATG (Ll) P2: CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC (E7) P3: CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC (E7) P4: CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG (E7) Una décima parte de los productos purificados fue mezclada y utilizada como una matriz en la reacción de la PCR con los iniciadores Pl y P4 exclusivamente. El producto resultante fue disociado utilizado- EcoNI (Ll) y Hindi (corriente abajo del codón antisentido en el iniciador P4) y utilizado para reemplazar un fragmento EcoNI/Hindi del HPV16L1 ORF clonado. El clon resultante, por tanto, difiere del clon HPV16L1?CE7 1-50 por la pérdida de los dos sitios internos de disociación de la enzima de restricción EcoRV y los correspondientes aminoácidos Asp e lie no HPV entre el ORF Ll y E7 y corriente debajo de E7. El primer sitio EcoRV fue reemplazado por los aminoácidos de Ll originales en esta posición (AlaGly) . El segundo sitio EcoRV fue reemplazado por uña señal de interrupción de la traducción. Este clon HPV16L1?C*E7 1-52) además contiene los primeros 52 aminoácidos de HPV16E7. El clon HPV16L1?C*E7 1-52 fue utilizado para la preparación de los clones HPV16L1.C*E7 1-55, con la ayuda del iniciador Pl en combinación con P5. P5: CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG (E7 1-55) En todos los casos, se utilizaron EcoNI y Hindi para reemplazar los fragmentos correspondientes. Los clones fueron analizados por secuenciación del DNA. 2. Preparación de baculovirus recombinantes Se utilizaron células de Spodoptera frugiperda (Sf9) como una monocapa o en cultivo en suspensión en medio TNF-FH de insecto (Sigma, Deisenhofen) con 10% de suero bovino fetal y glutamina 2mM. Los baculovirus recombinantes HPV16L1.CE7 1-55 fueron transfectados por cotransfección de 10 .g de los plásmidos recombinantes y 2 .g del Baculo-Gold DNA (Pharmingen, San Diego, CA) linearizado en células Sf9. los virus recombinantes fueron purificados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para hacer la prueba de la expresión, 106 células SF9 fueron infectadas con baculovirus recombinante una m. o. i. (multiplicidad de infección) de 5 a 10. Después de la incubación, el medio fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM Kcl .sic, 8.1 mM Na2P04, 1.5 mM KH2P04, pH 7.2). Las células fueron entonces Usadas en buffer de muestra SDS y probadas por cromatografia en gel SDS y ensayo de inmunoabsorción. 3. Purificación de partículas tipo virus Para la preparación de las CVLP, se cultivaron células Trichoplusia ni (TN) High Five a 27 °C hasta una densidad de 1-1.5 x 10 células por ml en medio sin suero Ex-Cell 405 (JRH, Biosciences, Lennexa, KS) . 400 ml de cultivo fueron cosechados e infectados con una m. o. i. de 2 a 5 con baculovirus recombinantes durante una_ hora con inversiones periódicas. Hasta 240 ml del medio fueron adicionados y las células fueron crecidas durante 3 a 4 dias. Entonces las células fueron empacadas y resuspendidas en 10 ml de buffer para extracción (Tris/HCl 25 mM, pH 7.5; NaCl 500 mM, EDTA 1 mM) y sonificadas durante 45 segundos a 60 vatios. Después de la centrifugación a 10,000 rpm en un rotor Sorvall SS34, el paquete fue disuelto en 6 ml de buffer para extracción, sonificado durante 30 segundos a 60 vatios y nuevamente centrifugado. Los sobrenadantes fueron combinados y aplicados a un gradiente de dos etapas de sacarosa al 40% (p/v) y CsCl al 57.5% (p/v). Después de centrifugación en un rotor SW-28 a 27,000 rpm durante dos horas, la interfase y la capa de CsCl fueron recolectadas, ajustadas a una densidad en CsCl de 1.38 g/ml y centrifugadas a 45,000 rpm durante 16 horas. Los gradientes fueron fraccionados y cada fracción fue probada por Western blot utilizando anti-HPVlßLlmAb Camvirl (Pharmingen, San Diego, CA) . Las fracciones reactivas fueron combinadas y dializadas por medio de una ultracentrifugación utilizando un microconcentrador Centricon 30 (Amicon Corp. Beverly, MA) contra buffer Hepes (1 mM Hepes, 149 mM NaCl, 0.5 mM KCl, pH 7.2) y fue confirmada la presencia de las CVLP por medio de microscopía electrónica de transmisión. La concentración de la proteína L1E7 fue determinada aproximadamente en un gel SDS que fue teñido con azul de Coomassie mediante la comparación con los estándares de BSA. 4. Experimentos de microdiálisis La muestra utilizada fue una fracción que contenia partículas tipo virus que hablan sido aisladas de células High Five por centrifugación con cojin [sic] de sacarosa y equilibrio con cloruro de cesio. La concentración total de la proteina fue 0.29 mg/ml y la concentración de la CVLP 0.17 mg/ml. 40 ml de la solución correspondiente fueron introducidos en un recipiente de plástico de 50 ml con un cierre de rosca. Sobre esta solución se colocó cuidadosamente un filtro para diálisis teniendo un diámetro de poro de 0.25 µ, el cual flota sobre el liquido durante la realización de la diálisis. 30 µl de la solución de CVLP pura fueron pipeteados sobre este filtro y el recipiente fue sellado. Se dejó el recipiente en reposo a 4-6°C durante cuando menos 12 horas para que la solución de la gota se intercambiara por la solución de diálisis (Tris/HCl 50 mM, pH 7.5, con concentración creciente de NaCl) . La gota fue retirada utilizando una pipeta de pistón e igualada con 30 µl de la solución del depósito. Después de centrifugación a 10,000 g (10 min, 4°C) , el sobrenadante fue investigado en el ensayo ELISA (Kemeny, D. M. (1994) ELISA indirecto a partir de: ELISA, uso para el ensayo inmunoa sorbente de enzimas ligadas en el laboratorio biológico/médico, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, p. 111, prueba 6.2) utilizando anticuerpo monoclonal especifico de conformación contra HPV16L1 y en un ensayo de proteínas. Se determinó la concentración de las proteínas utilizando un ensayo con ácido bicinconinico (Smith, P. K. y col. (1985) Anal. Biochem. 150, 70-85) contra albúmina de suero bovino como estándar. El resultado se muestra en la Figura 1.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> MediGene Aktiengesellschaft <120> FORMULACIÓN CON UNA PROTEÍNA ESPECÍFICA DEL VIRUS DE PAPILOMA, Y LA PRODUCCIÓN Y USO DE ÉSTA <150> 198 12 940.8 <151> 1998-03-24 <160> 9 <170> FastSEQ para Windows versión 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador de la PCR oligonucleótido que introduce un sitio de restricción <400> 1 aaagatatct tgtagtaaaa atttgcgtcc taaaggaaac 40 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador de la PCR oligonucleótido que introduce un sitio de restricción <T400> 2 aaagatatct aatctacctc tacaactgct aaacgcaaaa aacg 44 <210> 3 <211> 35 <212> 'DNA <213> secuencia artificial <220> <2"23> iniciador de la PCR oligonucleótido que introduce un sitio de restricción <400> 3 aaaagatatc atgcatggag atacacctac attgc 35 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador de la PCR oligonucleótido que introduce un sitio de restricción <400> 4 ttttgatatc ggctctgtcc ggttctgctt gtcc 34 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador oligonucléotido para "PCR de cuatro iniciadores" <400> 5 gttatgacat acatacattc tatg 24 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador oligonucléotido para "PCR de cuatro iniciadores" <400> 6 ccatgcattc ctgcttgtag taaaaatttg cgtcc 35 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador oligonucléotido para "PCR de cuatro iniciadores" 400> 7 ctacaagcag gaatgcatgg agatacacc 29 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador oligonucléotido para "PCR de cuatro iniciadores" <400> 8 catctgaagc ttagtaatgg gctctgtccg gttctg 36 210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador de la PCR oligonucleótido que introduce tres codones adicionales para una extensión C terminal de la proteina de fusión codificada <400> 9 catctgaagc ttatcaatat tgtaatgggc tctgtccg 38

Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación que contiene cuando menos una proteina tardia (proteina L) de uno o más papilomavirus y/o cuando menos una proteina temprana (proteina E) de uno o más papilomavirus y 0.3 a 4 M de una sal a pH 7.3 a 7.45, la estabilización de la proteina tomando lugar prácticamente por la concentración de la sal y el pH.

2. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, se caracteriza porque la concentración de la sal es 0.4 a 3 M a pH de 7.3 a 7.45.

3. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, se caracteriza porque la concentración de la sal es 0.5 a 2 M a pH de 7.3 a 7.45. 4. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1 a 3, se caracteriza porque la concentración de la sal es 1 a 2 M a pH de 7.

4.

5. La formulación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, se caracteriza porque la sal es una sal de metal alcalino o de metal alcalinotérreo.

6. La formulación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, se caracteriza porque el pH se ajusta utilizando una solución amortiguadora.

7. La formulación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, se caracteriza porque la proteina o proteínas mencionadas no contienen epítopes inespecificos de papilomavirus .

8. La formulación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, se caracteriza porque la proteina L es una proteina L delecionada.

9. La formulación de acuerdo con la reivindicación 8, se caracteriza porque la proteina L es una proteina L delecionada en el C terminal.

10. La formulación de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, se caracteriza porque hasta 35 aminoácidos están delecionados de la proteina L.

11. La formulación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-10, se caracteriza porque la proteina E es una proteina E delecionada.

12. La formulación de acuerdo con la reivindicación 11, se caracteriza porque la proteina E delecionada es una proteina E delecionada en el C terminal.

13. La formulación de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, se caracteriza porque hasta 55 aminoácidos están delecionados.

14. La formulación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-13, se caracteriza porque la proteina L esta unida a la proteina E.

15. La formulación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-14, se caracteriza porque la proteina mencionada esta presente en la forma de una cápside y/o capsómero.

16. La formulación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-15, se caracteriza porque el papilomavirus es un papilomavirus humano (HPV) .

17. La formulación de acuerdo con la reivindicación 16, se caracteriza porque el HPV se selecciona de HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-42, HPV-45, HPV-52 y/o HPV-58.

18. La formulación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-17 se caracteriza porque la formulación tiene aditivos y/o excipientes que no contribuyen significativamente a la estabilización de la proteina.

19. La formulación de acuerdo con la reivindicación 18, se caracteriza porque los aditivos y/o excipientes son uno o mas detergentes, polioles y/o compuestos anfotéricos.

20. Un proceso para la producción de una formulación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-19, se caracteriza porque la proteina mencionada se incorpora en y/o dializa contra una solución que consiste en una sal de 0.3 a 4 M a un pH de 7.3 a 7.45.

21. El proceso de acuerdo con la reivindicación 20, se caracteriza porque la proteina mencionada se incorpora en y/o se dializa contra una solución que consiste en una sal 0 . 4 a 3 M a un pH de 7 . 3 a 7 . 45 .

22. El proceso de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, se caracteriza porque la proteina mencionada se incorpora en y/o se dializa contra una solución que consiste en una sal 0.5 a 2 M a un pH de 7.3 a 7.45.

23. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 20 a 22, se caracteriza porque la proteina mencionada se incorpora en y/o se dializa contra una solución que consiste en una sal 1 a 2 M a un pH de 7.4.

24. El uso de una formulación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-18 como medicamento o diagnóstico.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, _ caracterizado porque la formulación no contiene coadyuvante.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25, se caracteriza porque el medicamento sirve para la prevención o tratamiento de tumor especifico de papilomavirus.

27. El uso de acuerdo con la reivindicación 26, se caracteriza porque el tumor es un carcinoma de laringe, cervix, pene, vulva o ano.

28. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 24-27, se caracteriza porque la formulación mencionada se utiliza como una solución para inyección o infusión.

29. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, se caracteriza porque el diagnóstico sirve para diagnosticar una o más infecciones de papilomavirus.