JP2002507625A - パピローマウイルス特異的タンパク質を含む配合物、その調製および使用 - Google Patents
パピローマウイルス特異的タンパク質を含む配合物、その調製および使用Info
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、少なくとも一種のパピローマウイルス特異的タンパク質を、濃度約０．３から約４ＭでｐＨ約７．３から約７．４５の塩と共に含む配合物に関する。
Description
【０００１】
この発明は、少なくとも一種のパピローマウイルス特異的タンパク質を、濃度
約０．３から約４ＭでｐＨ約７．３から約７．４５の塩と共に含む配合物に関す
る。
約０．３から約４ＭでｐＨ約７．３から約７．４５の塩と共に含む配合物に関す
る。
【０００２】
いぼウイルスとも呼ばれるパピローマウイルスは、大きさ約８０００塩基対の
ゲノムおよび直径約５５ｎｍの正十二面体様キヤプシッドを有する二本鎖ＤＮＡ
ウイルスである。現在までに１００を超える異なったヒトパピローマウイルス型
が知られており、この中のある種のもの例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、Ｈ
ＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５２または
ＨＰＶ−５８は悪性腫瘍を、および他の例えばＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１または
ＨＰＶ−４２は良性腫瘍を起こし得る。
ゲノムおよび直径約５５ｎｍの正十二面体様キヤプシッドを有する二本鎖ＤＮＡ
ウイルスである。現在までに１００を超える異なったヒトパピローマウイルス型
が知られており、この中のある種のもの例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、Ｈ
ＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５２または
ＨＰＶ−５８は悪性腫瘍を、および他の例えばＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１または
ＨＰＶ−４２は良性腫瘍を起こし得る。
【０００３】 パピローマウイルスのゲノムは、次の３領域に細別できる：第１領域は非コー
ド領域に関し、この領域はウイルスの転写および複製のための調節因子を含む。
所謂Ｅ（early;初期）領域である第２領域は、各種のタンパク質コード部分Ｅ1
からＥ7 を含み、この中で例えばＥ6 およびＥ7 タンパク質は上皮細胞の悪性転
換の原因であり、Ｅ1 タンパク質はＤＮＡコピー数を制御する。Ｅ6 およびＥ7
領域は所謂腫瘍遺伝子であり、これらはまた腫瘍的に変性した細胞中にも現れる
。第３領域はＬ（late; 後期）領域とも呼称し、二つのタンパク質コード部分Ｌ
1 おょびＬ2 を含み、これらの部分はウイルスキヤプシッドの構造的成分をコー
ドする。Ｌ1 タンパク質はウイルスキヤプシッド中に９０％を超えて存在し、Ｌ
1 ：Ｌ2 の比率は一般的に３０：１である。
ド領域に関し、この領域はウイルスの転写および複製のための調節因子を含む。
所謂Ｅ（early;初期）領域である第２領域は、各種のタンパク質コード部分Ｅ1
からＥ7 を含み、この中で例えばＥ6 およびＥ7 タンパク質は上皮細胞の悪性転
換の原因であり、Ｅ1 タンパク質はＤＮＡコピー数を制御する。Ｅ6 およびＥ7
領域は所謂腫瘍遺伝子であり、これらはまた腫瘍的に変性した細胞中にも現れる
。第３領域はＬ（late; 後期）領域とも呼称し、二つのタンパク質コード部分Ｌ
1 おょびＬ2 を含み、これらの部分はウイルスキヤプシッドの構造的成分をコー
ドする。Ｌ1 タンパク質はウイルスキヤプシッド中に９０％を超えて存在し、Ｌ
1 ：Ｌ2 の比率は一般的に３０：１である。
【０００４】 ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１は、特に生殖器いぼの原因としての地位を維持
している；ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ
−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５２およびＨＰＶ−５８等のある種パピローマ
ウイルス型は肛門性器道の悪性腫瘍と関係する。この場合の５０％を超える割合
で、ＨＰＶ−１６は頚部癌（頚部様構造における上皮組織悪性腫瘍）と関係する
。したがって、ＨＰＶ−１６は頚部上皮内癌形成の場合の主たる危険因子である
。加えて、この疾患進行には免疫系が重要な役割を演ずる。このように、細胞免
疫応答、具体的には抗原特異的Ｔリンパ細胞は、防護機構のために重要であると
考えられる。その上、ハイグレードの頚部上皮内癌（CIN II/III）および頚部腫
瘍では、このＥ7 遺伝子は感染上皮の全層中に構造的に現れる。したがってこの
Ｅ7 タンパク質は潜在的腫瘍抗原として、および活性化されたＴ細胞に対する標
的分子であると考えられる。しかしながら、患者においてＥ7 により誘発される
細胞免疫応答は、疾患進行に影響を及ぼすほど充分に強力ではないようである。
この免疫応答は適切なワクチンにより増幅され得る可能性がある。
している；ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ
−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５２およびＨＰＶ−５８等のある種パピローマ
ウイルス型は肛門性器道の悪性腫瘍と関係する。この場合の５０％を超える割合
で、ＨＰＶ−１６は頚部癌（頚部様構造における上皮組織悪性腫瘍）と関係する
。したがって、ＨＰＶ−１６は頚部上皮内癌形成の場合の主たる危険因子である
。加えて、この疾患進行には免疫系が重要な役割を演ずる。このように、細胞免
疫応答、具体的には抗原特異的Ｔリンパ細胞は、防護機構のために重要であると
考えられる。その上、ハイグレードの頚部上皮内癌（CIN II/III）および頚部腫
瘍では、このＥ7 遺伝子は感染上皮の全層中に構造的に現れる。したがってこの
Ｅ7 タンパク質は潜在的腫瘍抗原として、および活性化されたＴ細胞に対する標
的分子であると考えられる。しかしながら、患者においてＥ7 により誘発される
細胞免疫応答は、疾患進行に影響を及ぼすほど充分に強力ではないようである。
この免疫応答は適切なワクチンにより増幅され得る可能性がある。
【０００５】 Ｌ1 遺伝子の発現またはＬ1 およびＬ2 遺伝子の共発現がウイルス様粒子（Ｖ
ＬＰｓ）を形成するということを証明することが可能になった。各種動物系中で
中和用抗体を形成する目的でＶＬＰS を使用することは可能であった。しかしウ
イルス中和用抗体の形成は、ウイルス感染が既に生起しているならば臨床的な重
要性は比較的低く、その理由はウイルス感染細胞の除去に対してはウイルス特異
的細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答が必要であると考えられるからである。したが
ってキメラＬ1 −Ｅ7 タンパク質（Muller, M. らの (1997) Virology, 234, 9
3)から成る所謂キメラパピローマウイルス様粒子（ＣＶＬＰS ）が開発さた：Ｃ
ＶＬＰS を用いたマウスの免疫化によりＥ7 に対する抗体を誘発する実験には失
敗したが（Muller, M. らの (1997), supra) 、ある種のＣＶＬＰS はマウス中
でＥ7 特異的ＣＴＬ応答を誘発する。加えて、患者におけるＨＰＶ関連疾患の中
和用抗体は、投与Ｌ1 タンパク質に対する免疫応答を制約するように考えられる
（Muller, M.らの (1997), supra) 。しかしながら、クラスＩのＭＨＣ分子を介
して提供される腫瘍細胞のＥ7 タンパク質はＣＴＬs の標的分子を表すであろう
から、ワクチン開発の目的ではＣＶＬＰS は依然として興味がある。
ＬＰｓ）を形成するということを証明することが可能になった。各種動物系中で
中和用抗体を形成する目的でＶＬＰS を使用することは可能であった。しかしウ
イルス中和用抗体の形成は、ウイルス感染が既に生起しているならば臨床的な重
要性は比較的低く、その理由はウイルス感染細胞の除去に対してはウイルス特異
的細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答が必要であると考えられるからである。したが
ってキメラＬ1 −Ｅ7 タンパク質（Muller, M. らの (1997) Virology, 234, 9
3)から成る所謂キメラパピローマウイルス様粒子（ＣＶＬＰS ）が開発さた：Ｃ
ＶＬＰS を用いたマウスの免疫化によりＥ7 に対する抗体を誘発する実験には失
敗したが（Muller, M. らの (1997), supra) 、ある種のＣＶＬＰS はマウス中
でＥ7 特異的ＣＴＬ応答を誘発する。加えて、患者におけるＨＰＶ関連疾患の中
和用抗体は、投与Ｌ1 タンパク質に対する免疫応答を制約するように考えられる
（Muller, M.らの (1997), supra) 。しかしながら、クラスＩのＭＨＣ分子を介
して提供される腫瘍細胞のＥ7 タンパク質はＣＴＬs の標的分子を表すであろう
から、ワクチン開発の目的ではＣＶＬＰS は依然として興味がある。
【０００６】 Peng らによる (1998) Virology, 240, 147は、ウシパピローマウイルス（Ｂ
ＰＶ）およびＨＰＶ−１６Ｅ7 49-57 のＣ末端切り取りＬ1 から成るＣＶＬＰS
について記載し、このものはＣ５７Ｂ1 ／6 マウスの接種後にＥ7 特異的細胞毒
性Ｔ細胞を誘発し、Ｅ7 発現性腫瘍の成長から守ることが記載されている。Gree
nstone らの (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1800 は、等身大のＨ
ＰＶ−１６Ｅ7 タンパク質に融合したＨＰＶ−１６Ｌ1 プラスＨＰＶ−１６Ｌ2
から成るＣＶＬＰS を記載し、このものはＣ５７Ｂ1 ／6 マウスの免疫化後に上
皮Ｅ7 発現性腫瘍細胞の成長から守ることが記載されているが、細胞毒性Ｔ細胞
は検出されず、したがって免疫応答の誘発には有効性が低いように見える。
ＰＶ）およびＨＰＶ−１６Ｅ7 49-57 のＣ末端切り取りＬ1 から成るＣＶＬＰS
について記載し、このものはＣ５７Ｂ1 ／6 マウスの接種後にＥ7 特異的細胞毒
性Ｔ細胞を誘発し、Ｅ7 発現性腫瘍の成長から守ることが記載されている。Gree
nstone らの (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1800 は、等身大のＨ
ＰＶ−１６Ｅ7 タンパク質に融合したＨＰＶ−１６Ｌ1 プラスＨＰＶ−１６Ｌ2
から成るＣＶＬＰS を記載し、このものはＣ５７Ｂ1 ／6 マウスの免疫化後に上
皮Ｅ7 発現性腫瘍細胞の成長から守ることが記載されているが、細胞毒性Ｔ細胞
は検出されず、したがって免疫応答の誘発には有効性が低いように見える。
【０００７】 一般的にはＶＬＰS およびＣＶＬＰS は、一種または二種以上のＬタンパク質
またはＬおよびＥタンパク質をコードする対応遺伝子の、適切な発現系中での発
現により遺伝子工学的手法で調製される。この対応遺伝子は、例えば Kinbaum,
R.らによる (1994) J. Virol., 67, 6929-6936 に記載があり、またはＥＭＢＬ
データバンクを介して入手可能である。アクセス番号は、例えばＨＰＶ１８の場
合はＰＡＰＨＰＶ１８；ＨＰＶ３１の場合はＰＡＰＰＰＨ３１；ＨＰＶ３３の場
合はＰＡＰＰＰＨ３３またはＨＰＶ−５８の場合はＰＡＰＰＰＨ５８である。
またはＬおよびＥタンパク質をコードする対応遺伝子の、適切な発現系中での発
現により遺伝子工学的手法で調製される。この対応遺伝子は、例えば Kinbaum,
R.らによる (1994) J. Virol., 67, 6929-6936 に記載があり、またはＥＭＢＬ
データバンクを介して入手可能である。アクセス番号は、例えばＨＰＶ１８の場
合はＰＡＰＨＰＶ１８；ＨＰＶ３１の場合はＰＡＰＰＰＨ３１；ＨＰＶ３３の場
合はＰＡＰＰＰＨ３３またはＨＰＶ−５８の場合はＰＡＰＰＰＨ５８である。
【０００８】 適切な発現系は例えば、遺伝子工学的に修飾された酵母例えば Saccharomyces
(cerevisiae) 、Pichia (pastoris) 、Kluyvermyces (lactis) 、Schizosaccha
romyces (pombe) または Hansenula(polymorpha) (Carter. J.J. らによる (19
91), Virology,182, 513) 、例えば Trichoplusia ni High Five 等の昆虫細胞
（例えば Muller らの (1997）参照, supra ）、または原核細胞（例えば WO96/
11272 号公報参照）である。原核細胞中での上記粒子の生産の場合、一般的には
これらを細胞中に析出させて所謂封入体を形成させ、次いでこのものを復元させ
て溶液にする。遺伝子工学的に産生させた粒子またはキヤプシッドまたはそれら
の前駆体を使用する場合は、発現後にさらなる精製工程を必要とする。
(cerevisiae) 、Pichia (pastoris) 、Kluyvermyces (lactis) 、Schizosaccha
romyces (pombe) または Hansenula(polymorpha) (Carter. J.J. らによる (19
91), Virology,182, 513) 、例えば Trichoplusia ni High Five 等の昆虫細胞
（例えば Muller らの (1997）参照, supra ）、または原核細胞（例えば WO96/
11272 号公報参照）である。原核細胞中での上記粒子の生産の場合、一般的には
これらを細胞中に析出させて所謂封入体を形成させ、次いでこのものを復元させ
て溶液にする。遺伝子工学的に産生させた粒子またはキヤプシッドまたはそれら
の前駆体を使用する場合は、発現後にさらなる精製工程を必要とする。
【０００９】 医薬としてのキヤプシッドまたはキヤプソマーの使用におけるさらに重要な問
題点は、それらが溶解性に乏しいことである。したがって例えばＨＰＶ−１６の
キャプシドまたはキヤプソマーは凝集する傾向があり、これにより溶解性が目立
って低下する。ある場合にはキャプシドまたはキヤプソマーの低い溶解性が収率
を低減させるのみではなく、同時に医薬または診断薬としての使用を複雑化させ
る。その上、ときどきＬ1 タンパク質のＣ末端の劣化が観察でき、この結果、医
薬または診断薬としての許認可に不適当な不均一物質に至る。
題点は、それらが溶解性に乏しいことである。したがって例えばＨＰＶ−１６の
キャプシドまたはキヤプソマーは凝集する傾向があり、これにより溶解性が目立
って低下する。ある場合にはキャプシドまたはキヤプソマーの低い溶解性が収率
を低減させるのみではなく、同時に医薬または診断薬としての使用を複雑化させ
る。その上、ときどきＬ1 タンパク質のＣ末端の劣化が観察でき、この結果、医
薬または診断薬としての許認可に不適当な不均一物質に至る。
【００１０】 WO 98/44944 号公報は、ワクチン成分、生理学的に許容し得る濃度までの塩お
よび生理学的に許容し得る濃度までの非イオン洗剤を含むＨＰＶ抗原配合物を記
載する。
よび生理学的に許容し得る濃度までの非イオン洗剤を含むＨＰＶ抗原配合物を記
載する。
【００１１】
したがって、この発明の目的はパピローマウイルス特異的タンパク質が可溶性
で安定な、単純かつ有利な配合物の提供を可能ならしめることにある。
で安定な、単純かつ有利な配合物の提供を可能ならしめることにある。
【００１２】 この度予想外にも、パピローマウイルス特異的タンパク質の溶解性は配合物の
塩濃度および配合物のｐＨに依存性があることが判った。具体的には、ＶＬＰS
またはＣＶＬＰS は宿主細胞の細胞質中で形成されるけれど、賦形剤を添加しな
い組成物は約１００〜１５０ｍＭ塩の等張塩溶液における中性ｐＨでは不安定で
あることは驚きであった。加えて、この発明によればｐＨ約５．５未満でＣＶＬ
ＰS が沈殿し、ｐＨ９．５を超えるとＣＶＬＰS が凝集することが判明した。
塩濃度および配合物のｐＨに依存性があることが判った。具体的には、ＶＬＰS
またはＣＶＬＰS は宿主細胞の細胞質中で形成されるけれど、賦形剤を添加しな
い組成物は約１００〜１５０ｍＭ塩の等張塩溶液における中性ｐＨでは不安定で
あることは驚きであった。加えて、この発明によればｐＨ約５．５未満でＣＶＬ
ＰS が沈殿し、ｐＨ９．５を超えるとＣＶＬＰS が凝集することが判明した。
【００１３】 したがってこの発明の目的は、一種または二種以上のパピローマウイルスの少
なくとも一つの後期タンパク質（Ｌタンパク質）および／または一種または二種
以上のパピローマウイルスの少なくとも一つの初期タンパク質（Ｅタンパク質）
、ならびに濃度約０．３から約４Ｍ、好ましくは約０．４から約２．５〜３Ｍ、
具体的には約０．４〜０．５Ｍから１〜２Ｍ特に約１から２Ｍの塩をｐＨ約７．
３から約７．４５好ましくは約７．４で含み、さらに任意に適切な添加剤および
／または賦形剤を含む配合物にある。
なくとも一つの後期タンパク質（Ｌタンパク質）および／または一種または二種
以上のパピローマウイルスの少なくとも一つの初期タンパク質（Ｅタンパク質）
、ならびに濃度約０．３から約４Ｍ、好ましくは約０．４から約２．５〜３Ｍ、
具体的には約０．４〜０．５Ｍから１〜２Ｍ特に約１から２Ｍの塩をｐＨ約７．
３から約７．４５好ましくは約７．４で含み、さらに任意に適切な添加剤および
／または賦形剤を含む配合物にある。
【００１４】 ”配合物”なる用語は、この発明によれば上記パピローマウイルス特異的タン
パク質の溶液または懸濁物の形態における組成物を意味するものと理解されるべ
きで、この場合のパピローマウイルス特異的タンパク質は一般的にも具体的にも
最大約５０００ｇまでは沈殿物を顕著に生起しない組成物を意味する。
パク質の溶液または懸濁物の形態における組成物を意味するものと理解されるべ
きで、この場合のパピローマウイルス特異的タンパク質は一般的にも具体的にも
最大約５０００ｇまでは沈殿物を顕著に生起しない組成物を意味する。
【００１５】 この塩は一般的にはアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、好ましくはハ
ロゲン化物またはリン酸塩、具体的にはアルカリ金属ハロゲン化物、特にＮａＣ
ｌおよび／またはＫＣｌである。ＮａＣｌの使用は医薬用配合物の調製の場合に
特に好ましい。
ロゲン化物またはリン酸塩、具体的にはアルカリ金属ハロゲン化物、特にＮａＣ
ｌおよび／またはＫＣｌである。ＮａＣｌの使用は医薬用配合物の調製の場合に
特に好ましい。
【００１６】 この組成物のｐＨは、適切な有機または無機緩衝剤を用いて調整するが、例え
ば燐酸塩緩衝剤、トリス緩衝剤［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］、
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］エタンスルホ
ン酸）またはＭＯＰ緩衝剤（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）が好ま
しく使用される。個々の緩衝剤の選択は一般的には所望緩衝剤のモル濃度に依存
する。注射溶液または点滴溶液の場合はリン酸塩緩衝剤が適する。
ば燐酸塩緩衝剤、トリス緩衝剤［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］、
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］エタンスルホ
ン酸）またはＭＯＰ緩衝剤（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）が好ま
しく使用される。個々の緩衝剤の選択は一般的には所望緩衝剤のモル濃度に依存
する。注射溶液または点滴溶液の場合はリン酸塩緩衝剤が適する。
【００１７】 この発明における組成物の医薬または診断約としての使用の場合、パピローマ
ウイルス特異的タンパク質がパピローマウイルス非特異的エピトープを含まない
場合が特に好ましく、これによりパピローマウイルス非特異的免疫応答を低減ま
たは阻止できる。
ウイルス特異的タンパク質がパピローマウイルス非特異的エピトープを含まない
場合が特に好ましく、これによりパピローマウイルス非特異的免疫応答を低減ま
たは阻止できる。
【００１８】 Ｌタンパク質およびＥタンパク質なる用語は、この発明の趣旨以内では、例え
ば欠失突然変異体等の等身大タンパク質およびそれらの突然変異体を意味するも
のと理解される。
ば欠失突然変異体等の等身大タンパク質およびそれらの突然変異体を意味するも
のと理解される。
【００１９】 さらなる好ましい実施態様では、この発明における組成物は欠失Ｌタンパク質
好ましくは欠失Ｌ1 および／または欠失Ｌ2 タンパク質を含む。この欠失は、異
種タンパク質例えばパピローマウイルス特異的Ｅタンパク質配列を欠失領域中へ
挿入し得る利点があり、これにより本発明における組成の応用領域が拡大する。
Ｃ末端欠失を有するＬタンパク質、具体的にはＣ末端欠失Ｌ1 タンパク質は殊の
外好ましい。Ｃ末端欠失は、Ｃ末端に位置する核位置信号が欠失するので、ウイ
ルス様粒子形成効率を増強できる利点がある。したがってこのＣ末端欠失は、好
ましくは約３５アミノ酸まで、具体的には約２５から約３５アミノ酸、特に約３
２から３４アミノ酸である。例えば３２アミノ酸長のＨＰＶ−１６Ｌ1 のＣ末端
欠失および約２６アミノ酸長のＢＰＶ−１Ｌ1 タンパク質（ウシパピローマウイ
ルス１型）のＣ末端欠失は、ウイルス様粒子形成を少なくとも約１０倍まで増強
し得るので適切である。
好ましくは欠失Ｌ1 および／または欠失Ｌ2 タンパク質を含む。この欠失は、異
種タンパク質例えばパピローマウイルス特異的Ｅタンパク質配列を欠失領域中へ
挿入し得る利点があり、これにより本発明における組成の応用領域が拡大する。
Ｃ末端欠失を有するＬタンパク質、具体的にはＣ末端欠失Ｌ1 タンパク質は殊の
外好ましい。Ｃ末端欠失は、Ｃ末端に位置する核位置信号が欠失するので、ウイ
ルス様粒子形成効率を増強できる利点がある。したがってこのＣ末端欠失は、好
ましくは約３５アミノ酸まで、具体的には約２５から約３５アミノ酸、特に約３
２から３４アミノ酸である。例えば３２アミノ酸長のＨＰＶ−１６Ｌ1 のＣ末端
欠失および約２６アミノ酸長のＢＰＶ−１Ｌ1 タンパク質（ウシパピローマウイ
ルス１型）のＣ末端欠失は、ウイルス様粒子形成を少なくとも約１０倍まで増強
し得るので適切である。
【００２０】 さらなる好ましい実施態様では、上記Ｅタンパク質特にＥ6 および／またはＥ
7 タンパク質も欠失される。Ｅ7 タンパク質のＣ末端部分好ましくはＥ7 タンパ
ク質のＣ末端部分が欠失される場合が特に好ましく、この場合、これらの構築体
は欠失Ｌタンパク質との組み合わせでキャプソマーおよび／またはキヤプシッド
を形成する。５５アミノ酸までの欠失が特に好ましく、好ましくは約５から約５
５アミノ酸、具体的には約３２から約４３アミノ酸の欠失が好ましい。
7 タンパク質も欠失される。Ｅ7 タンパク質のＣ末端部分好ましくはＥ7 タンパ
ク質のＣ末端部分が欠失される場合が特に好ましく、この場合、これらの構築体
は欠失Ｌタンパク質との組み合わせでキャプソマーおよび／またはキヤプシッド
を形成する。５５アミノ酸までの欠失が特に好ましく、好ましくは約５から約５
５アミノ酸、具体的には約３２から約４３アミノ酸の欠失が好ましい。
【００２１】 特に好ましい構築体は例えばＮ末端アミノ酸１から約６０を有するＥ7 であり
、この構築体は、アミノ酸４９から５７の領域に位置する細胞毒性Ｔリンパ細胞
の活性化のためのマウスエピトープを含有するからである。他の好ましい構築体
はＮ末端アミノ酸１から約５５を有するＥ7 であり、この構築体はキヤプシッド
形成を損ない得るＥ7 特異的配列をアミノ酸５６〜７０領域中に含まないので、
欠失Ｌタンパク質との組み合わせでキヤプソマーおよびキヤプシッドを好ましく
形成する。３２アミノ酸によりＣ末端で欠失されたＨＰＶ−１６のＬ1 タンパク
質および、これがアミノ酸１−５５または１−６０を有するＨＰＶ−１６のＥ7
タンパク質と結合したものは特に好ましい。これらの構築体は中和性抗体または
特異的ＣＴＬ応答を誘発するのみでなく、一方では腫瘍形成を阻止し、他方では
既存の腫瘍の進行を動物実験では退化させる。特にアミノ酸１〜６０を有するＥ
7 は、腫瘍中で顕著な予防的および治療的作用を特に発揮する。したがって、こ
の発明における特に好ましい実施態様はＬ1 ΔＥ7 1-X 融合タンパク質好ましく
はＣＶＬＰs 形態における具体的にはＨＰＶ１６の形態における融合タンパク質
であり（ｘは６０を包含する、５５から６０までの整数）、特にＬ1 ΔＥ7 1-55 またはＬ1 ΔＥ7 1-60融合タンパク質である。
、この構築体は、アミノ酸４９から５７の領域に位置する細胞毒性Ｔリンパ細胞
の活性化のためのマウスエピトープを含有するからである。他の好ましい構築体
はＮ末端アミノ酸１から約５５を有するＥ7 であり、この構築体はキヤプシッド
形成を損ない得るＥ7 特異的配列をアミノ酸５６〜７０領域中に含まないので、
欠失Ｌタンパク質との組み合わせでキヤプソマーおよびキヤプシッドを好ましく
形成する。３２アミノ酸によりＣ末端で欠失されたＨＰＶ−１６のＬ1 タンパク
質および、これがアミノ酸１−５５または１−６０を有するＨＰＶ−１６のＥ7
タンパク質と結合したものは特に好ましい。これらの構築体は中和性抗体または
特異的ＣＴＬ応答を誘発するのみでなく、一方では腫瘍形成を阻止し、他方では
既存の腫瘍の進行を動物実験では退化させる。特にアミノ酸１〜６０を有するＥ
7 は、腫瘍中で顕著な予防的および治療的作用を特に発揮する。したがって、こ
の発明における特に好ましい実施態様はＬ1 ΔＥ7 1-X 融合タンパク質好ましく
はＣＶＬＰs 形態における具体的にはＨＰＶ１６の形態における融合タンパク質
であり（ｘは６０を包含する、５５から６０までの整数）、特にＬ1 ΔＥ7 1-55 またはＬ1 ΔＥ7 1-60融合タンパク質である。
【００２２】 予防用および治療用の両方で活性な医薬の生産の場合は、タンパク質が融合タ
ンパク質の形態でＥタンパク質に結合している場合が好ましい。その上、所望パ
ピローマウイルス特異的タンパク質がキヤプシッドおよび／またはキヤプソマー
の形態で存在するのが好ましく、その理由はこのキヤプシッドおよび／またはキ
ヤプソマーにより、具体的にはＬタンパク質のフラクションにより免疫反応が追
加的に顕著に増強されるからでる。したがってキヤプシッドおよび／またはキヤ
プソマー形成に適する好ましい融合タンパク質は、例えば欠失Ｌ1 およびＥ7 、
Ｅ6 および／またはＥ1 からの融合タンパク質である。
ンパク質の形態でＥタンパク質に結合している場合が好ましい。その上、所望パ
ピローマウイルス特異的タンパク質がキヤプシッドおよび／またはキヤプソマー
の形態で存在するのが好ましく、その理由はこのキヤプシッドおよび／またはキ
ヤプソマーにより、具体的にはＬタンパク質のフラクションにより免疫反応が追
加的に顕著に増強されるからでる。したがってキヤプシッドおよび／またはキヤ
プソマー形成に適する好ましい融合タンパク質は、例えば欠失Ｌ1 およびＥ7 、
Ｅ6 および／またはＥ1 からの融合タンパク質である。
【００２３】 この発明の趣旨以内でのキヤプシッドは、一般的には７２キヤプソマーから構
築される一般的正二十面体様形態のウイルスまたはウイルス様構造体である。
築される一般的正二十面体様形態のウイルスまたはウイルス様構造体である。
【００２４】 この発明の趣旨以内でのキヤプソマーは、少なくとも一種のパピローマウイル
ス構造タンパク質、好ましくはＬ1 またはＬ1 の欠失体を含む集合タンパク質で
ある。この発明における５種の融合タンパク質は、集合してキヤプソマーを与え
、このものは今度はキヤプシッドを与えるために集合し得る。
ス構造タンパク質、好ましくはＬ1 またはＬ1 の欠失体を含む集合タンパク質で
ある。この発明における５種の融合タンパク質は、集合してキヤプソマーを与え
、このものは今度はキヤプシッドを与えるために集合し得る。
【００２５】 ヒト用医薬または診断薬の生産の場合は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
、好ましくはＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ
−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−
５２およびＨＰＶ−５８、具体的にはＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３
１および／またはＨＰＶ−４５のタンパク質またはペプチドが上記構築体に適し
ている。特に組み合わせワクチン生産の場合には、各種ＨＰＶ型からのタンパク
質またはペプチドを組み合わせるのが有利であり、例えば頚部様構造における悪
性腫瘍の場合にはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８またはＨＰＶ−１８、ＨＰＶ
−３１、ＨＰＶ−４５およびＨＰＶ−４５の組み合わせ、または例えばコンジロ
ームの場合にはＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１の組み合わせが有利である。
、好ましくはＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ
−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−
５２およびＨＰＶ−５８、具体的にはＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３
１および／またはＨＰＶ−４５のタンパク質またはペプチドが上記構築体に適し
ている。特に組み合わせワクチン生産の場合には、各種ＨＰＶ型からのタンパク
質またはペプチドを組み合わせるのが有利であり、例えば頚部様構造における悪
性腫瘍の場合にはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８またはＨＰＶ−１８、ＨＰＶ
−３１、ＨＰＶ−４５およびＨＰＶ−４５の組み合わせ、または例えばコンジロ
ームの場合にはＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１の組み合わせが有利である。
【００２６】 この発現ベクターは例えば原核または真核発現ベクターであってよい。原核発
現ベクターの例は、Ｅ．coli における発現の場合、例えばベクターｐＧＥＭま
たはｐＵＣ誘導体である（例えば、WO 96/11272 号公報参照）。真核発現ベクタ
ーの例は、Saccharomyces cerevisiae における発現の場合、例えばベクターｐ
４２６Ｍｅｔ２５またはｐ４２６ＧＡＬ1 であり（Mumberg らによる (1994) Nu
cl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J.J. らによる (1991) supra ）、ま
た昆虫細胞における発現の場合、例えば Baculovirus ベクター具体的には EP-
B1-0127839号または EP-B1-0549721号公報開示のような Autographa Californic
a ウイルスであり（例えば WO 94/20137号公報参照）、また哺乳類細胞における
発現の場合、例えばベクターＲｃ／ＣＭＶおよびＲｃ／ＲＳＶまたはＳＶ４０ベ
クターであり、これらはすべて一般的に取得可能である。しかしながら、Pharmi
ngen社製「Baculo Gold TM」トランスフエクション用具または Gibco BRL社製
「Bac-to-Bac TM 」Baculovirus 発現系等の、商業的に入手可能な Baculovirus
発現系もまた適当である。さらに適当な発現系は、組み換えワクシニア症ウイ
ルス（例えば、WO 93/02184 号公報参照）である。
現ベクターの例は、Ｅ．coli における発現の場合、例えばベクターｐＧＥＭま
たはｐＵＣ誘導体である（例えば、WO 96/11272 号公報参照）。真核発現ベクタ
ーの例は、Saccharomyces cerevisiae における発現の場合、例えばベクターｐ
４２６Ｍｅｔ２５またはｐ４２６ＧＡＬ1 であり（Mumberg らによる (1994) Nu
cl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J.J. らによる (1991) supra ）、ま
た昆虫細胞における発現の場合、例えば Baculovirus ベクター具体的には EP-
B1-0127839号または EP-B1-0549721号公報開示のような Autographa Californic
a ウイルスであり（例えば WO 94/20137号公報参照）、また哺乳類細胞における
発現の場合、例えばベクターＲｃ／ＣＭＶおよびＲｃ／ＲＳＶまたはＳＶ４０ベ
クターであり、これらはすべて一般的に取得可能である。しかしながら、Pharmi
ngen社製「Baculo Gold TM」トランスフエクション用具または Gibco BRL社製
「Bac-to-Bac TM 」Baculovirus 発現系等の、商業的に入手可能な Baculovirus
発現系もまた適当である。さらに適当な発現系は、組み換えワクシニア症ウイ
ルス（例えば、WO 93/02184 号公報参照）である。
【００２７】 一般的に、これらの発現ベクターは、Ｅ. coliにおける発現のためのｔｒｐプ
ロモーター（例えば、EP-B1-0154133 号公報参照）、酵母における発現のための
ＡＤＨ２プロモーター［Russel らによる (1983), J. Biol.Chem. 258, 2674-2
682)］、昆虫細胞における発現のための Baculovirus 多面体プロモーター（例
えば、 EP-B1-0127839号または U.S. 5,004,687 号公報参照）または例えばＭＭ
ＴＶ［mouse mammary tumour uirus (マウス哺乳類腫瘍ウイルス）：Lee らによ
る (1981) Nature 214, 228-232 ］の初期ＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプ
ロモーター等の、個々の宿主細胞に適するプロモーターもまた含む。
ロモーター（例えば、EP-B1-0154133 号公報参照）、酵母における発現のための
ＡＤＨ２プロモーター［Russel らによる (1983), J. Biol.Chem. 258, 2674-2
682)］、昆虫細胞における発現のための Baculovirus 多面体プロモーター（例
えば、 EP-B1-0127839号または U.S. 5,004,687 号公報参照）または例えばＭＭ
ＴＶ［mouse mammary tumour uirus (マウス哺乳類腫瘍ウイルス）：Lee らによ
る (1981) Nature 214, 228-232 ］の初期ＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプ
ロモーター等の、個々の宿主細胞に適するプロモーターもまた含む。
【００２８】 適当な宿主細胞の例は、Ｅ. coli 株ＤＨ５、ＨＢ１０１またはＢＬ2 １、酵
母株 Saccharomyces cerevisia、Pichia、Kluyvermyces、Schizosaccharomyces
または Hansenula(Carter, J.J. らによる (1991), Virology, 182, 513 ）、 例えば Spodoptera frugiperda、Trichoplusia ni 、Rachiplusia ou または G
alleria Mellonela からの昆虫細胞系 Lepidopteran 、または動物細胞ＣＯＳ、
Ｃ１２７、Ｖｅｒｏ、２９３およびＨｅｌａであり、これらは一般的に得られる
（例えば、WO 94/00152 号公報参照）。
母株 Saccharomyces cerevisia、Pichia、Kluyvermyces、Schizosaccharomyces
または Hansenula(Carter, J.J. らによる (1991), Virology, 182, 513 ）、 例えば Spodoptera frugiperda、Trichoplusia ni 、Rachiplusia ou または G
alleria Mellonela からの昆虫細胞系 Lepidopteran 、または動物細胞ＣＯＳ、
Ｃ１２７、Ｖｅｒｏ、２９３およびＨｅｌａであり、これらは一般的に得られる
（例えば、WO 94/00152 号公報参照）。
【００２９】 個々のパピローマウイルス特異的タンパク質に対するコード核酸は単離でき、
かつ、例えばＰＣＲ（polymerase chain reaction) 増幅手法により遺伝子バン
クからクローン化できる。例えば、ＢＰＶ−１のゲノムは GenBankアクセス番号
Ｘ 02346の下に、またはＨＰＶ−１６は GenBank アクセス番号Ｋ 02718の下に
一般的に得られる。例えばWO 94/05792 号公報には、ＨＰＶ−１６Ｌ1 配列も開
示されている。９８アミノ酸長のＨＰＶ−１６Ｅ7 タンパク質の配列は、例えば
Seedorf らによる (1985) Virology, 145, 181-185 中に記載がある。所望す
る核酸を取得する他の方法は、ＰＣＲ手法によりパピローマウイルス特異的遺伝
子をいぼまたは腫瘍から直接単離することにある。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−
１８からのＥ6 およびＥ7 遺伝子に対する好適なプライマーは、例えば WO 93/2
1958 号公報中に開示がある。所望核酸に対するさらなる引例は、例えば Kirnb
auer, R.らによる (1994), supraであり、または上記ＥＭＢＬデータバンクに寄
託したクローン類である。
かつ、例えばＰＣＲ（polymerase chain reaction) 増幅手法により遺伝子バン
クからクローン化できる。例えば、ＢＰＶ−１のゲノムは GenBankアクセス番号
Ｘ 02346の下に、またはＨＰＶ−１６は GenBank アクセス番号Ｋ 02718の下に
一般的に得られる。例えばWO 94/05792 号公報には、ＨＰＶ−１６Ｌ1 配列も開
示されている。９８アミノ酸長のＨＰＶ−１６Ｅ7 タンパク質の配列は、例えば
Seedorf らによる (1985) Virology, 145, 181-185 中に記載がある。所望す
る核酸を取得する他の方法は、ＰＣＲ手法によりパピローマウイルス特異的遺伝
子をいぼまたは腫瘍から直接単離することにある。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−
１８からのＥ6 およびＥ7 遺伝子に対する好適なプライマーは、例えば WO 93/2
1958 号公報中に開示がある。所望核酸に対するさらなる引例は、例えば Kirnb
auer, R.らによる (1994), supraであり、または上記ＥＭＢＬデータバンクに寄
託したクローン類である。
【００３０】 さらなる好ましい実施態様では、ベクターによりもたらされるさらなるアミノ
酸によって発現融合タンパク質が延長されない態様で発現ベクターが構築される
。このことは、例えば適切なプライマーオリゴヌクレオチド手法（Ho らによる
(1989) Gene, 77, 51-59) により、ＰＣＲ反応における突然変異誘発により追
加的アミノ酸をコードする望ましからぬヌクレオチドの除去により遂行される。
このようにして追加的アミノ酸を含まず、したがって免疫学的副反応の原因であ
る追加的外来エピトープの可能性が無い融合タンパク質が得られる。
酸によって発現融合タンパク質が延長されない態様で発現ベクターが構築される
。このことは、例えば適切なプライマーオリゴヌクレオチド手法（Ho らによる
(1989) Gene, 77, 51-59) により、ＰＣＲ反応における突然変異誘発により追
加的アミノ酸をコードする望ましからぬヌクレオチドの除去により遂行される。
このようにして追加的アミノ酸を含まず、したがって免疫学的副反応の原因であ
る追加的外来エピトープの可能性が無い融合タンパク質が得られる。
【００３１】 上記融合タンパク質の発現後、これをさらに精製または復元するのが好ましい
。クロマログラフイーによる精製方法の例は、Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L.
(1982) J. Virol. Meth. 5, 151; Nakai, Y. らによる (1987) J. Gen. Virol.
, 68, 1891; Hofmann, K. J. らによる (1995) Virology, 209, 506; Rose, R.
C. らによる (1993) J. Virol., 67, 1936; Sasagawa, T. らによる (1995) Vi
rology, 206, 126 または WO 95/31532 号公報中に見られる。
。クロマログラフイーによる精製方法の例は、Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L.
(1982) J. Virol. Meth. 5, 151; Nakai, Y. らによる (1987) J. Gen. Virol.
, 68, 1891; Hofmann, K. J. らによる (1995) Virology, 209, 506; Rose, R.
C. らによる (1993) J. Virol., 67, 1936; Sasagawa, T. らによる (1995) Vi
rology, 206, 126 または WO 95/31532 号公報中に見られる。
【００３２】 この発明における組成物中のパピローマウイルス特異的タンパク質のさらなる
安定性に役立つ好適な添加剤および／または賦形剤の例は、例えば「Triton X-1
00」またはコール酸ナトリウム等の洗剤であるが、例えばポリエチレングリコー
ルまたはグリセロール等のポリオール、例えばスクロースまたはグルコース等の
糖類、例えばグリシンまたは具体的にはタウリンまたはベタイン等のアミノ酸の
ような双性イオン化合物、および／または例えばウシまたはヒト血清アルブミン
等のタンパク質も挙げられる。洗剤、ポリオールおよび／または双性イオン化合
物が好ましい。他の添加剤および／または賦形剤は、例えばアプロチニン、ε−
アミノカプロン酸またはペプスタチンＡ等のプロテアーゼ阻害剤である。
安定性に役立つ好適な添加剤および／または賦形剤の例は、例えば「Triton X-1
00」またはコール酸ナトリウム等の洗剤であるが、例えばポリエチレングリコー
ルまたはグリセロール等のポリオール、例えばスクロースまたはグルコース等の
糖類、例えばグリシンまたは具体的にはタウリンまたはベタイン等のアミノ酸の
ような双性イオン化合物、および／または例えばウシまたはヒト血清アルブミン
等のタンパク質も挙げられる。洗剤、ポリオールおよび／または双性イオン化合
物が好ましい。他の添加剤および／または賦形剤は、例えばアプロチニン、ε−
アミノカプロン酸またはペプスタチンＡ等のプロテアーゼ阻害剤である。
【００３３】 この発明における他の目的は、この発明における調合物の生産方法であり、こ
の場合、上記パピローマウイルス特異的タンパク質を、例えば濃度約０．３から
約４Ｍ、好ましくは約０．４から約２．５〜３Ｍ、具体的には約０．４〜０．５
Ｍから１〜２Ｍ特に約１から２Ｍの塩をｐＨ約７．３から約７．４５好ましくは
約７．４で含み、さらに任意に適切な添加剤および／または賦形剤を含む溶液中
に導入し、および／または上記溶液に対して透析する。この配合物は、比較的長
期間例えば１〜２ケ月またはこれを超す期間に亙って約４℃または約−８０℃で
安定して貯蔵できるので好ましい。
の場合、上記パピローマウイルス特異的タンパク質を、例えば濃度約０．３から
約４Ｍ、好ましくは約０．４から約２．５〜３Ｍ、具体的には約０．４〜０．５
Ｍから１〜２Ｍ特に約１から２Ｍの塩をｐＨ約７．３から約７．４５好ましくは
約７．４で含み、さらに任意に適切な添加剤および／または賦形剤を含む溶液中
に導入し、および／または上記溶液に対して透析する。この配合物は、比較的長
期間例えば１〜２ケ月またはこれを超す期間に亙って約４℃または約−８０℃で
安定して貯蔵できるので好ましい。
【００３４】 この発明における配合物は医薬または診断薬として適する。したがってこの発
明は、本発明の配合物を医薬または診断薬として使用することにも関する。医薬
または診断薬として直ちに使用する場合、この発明における配合物を濃度約０．
４５Ｍに調整するのが好ましい。具体的には、この医薬がアジュバントを含まず
、すなわちパピローマウイルス特異的タンパク質の抗原性を増幅する物質を含ま
ないことが好ましく、その理由は、抗原性は具体的にはＬタンパク質特にＬ1 の
存在により既に適切に増幅されているからである。許認可当局により現在認可さ
れている唯一の免疫刺激材料はアルミニウム塩であるから、上記性質は医薬また
は診断薬としての許認可に際して特に有利である。
明は、本発明の配合物を医薬または診断薬として使用することにも関する。医薬
または診断薬として直ちに使用する場合、この発明における配合物を濃度約０．
４５Ｍに調整するのが好ましい。具体的には、この医薬がアジュバントを含まず
、すなわちパピローマウイルス特異的タンパク質の抗原性を増幅する物質を含ま
ないことが好ましく、その理由は、抗原性は具体的にはＬタンパク質特にＬ1 の
存在により既に適切に増幅されているからである。許認可当局により現在認可さ
れている唯一の免疫刺激材料はアルミニウム塩であるから、上記性質は医薬また
は診断薬としての許認可に際して特に有利である。
【００３５】 この医薬は、パピローマウイルス特異的な良性または悪性腫瘍、具体的には喉
頭、頚部、陰茎、外陰または肛門の頚部上皮内癌等の悪性腫瘍の回避または治療
に、ならびに一種または二種以上のパピローマウイルス感染の診断用診断薬に特
に適する。診断薬の一例は、例えばパピローマウイルス特異的抗体の測定用（例
えば、Voller, A.らによる (1976) Bull. World Health Organ., 533, 55-63
参照）または例えば Hopflらによる (1991) Lancet. 1, 375-374) による皮膚試
験のためのＥＬＩＳＡであり、当業者には既知の免疫診断薬である。
頭、頚部、陰茎、外陰または肛門の頚部上皮内癌等の悪性腫瘍の回避または治療
に、ならびに一種または二種以上のパピローマウイルス感染の診断用診断薬に特
に適する。診断薬の一例は、例えばパピローマウイルス特異的抗体の測定用（例
えば、Voller, A.らによる (1976) Bull. World Health Organ., 533, 55-63
参照）または例えば Hopflらによる (1991) Lancet. 1, 375-374) による皮膚試
験のためのＥＬＩＳＡであり、当業者には既知の免疫診断薬である。
【００３６】 一般的にこの医薬は、例えば皮下、筋肉内または粘膜経由等の経口的、非経口
的に、液状または懸濁状、エリキシル形状またはカプセル形状で、好ましくは注
射溶液または点滴溶液として投与できる。この発明における調合物の場合には、
特に有利なアジュバントを一緒に分散できる。
的に、液状または懸濁状、エリキシル形状またはカプセル形状で、好ましくは注
射溶液または点滴溶液として投与できる。この発明における調合物の場合には、
特に有利なアジュバントを一緒に分散できる。
【００３７】 したがってこの発明のさらなる目的は、注射溶液または点滴溶液としての、こ
の発明における調合物の使用に関する。
の発明における調合物の使用に関する。
【００３８】 注射溶液は、例えば約１から約２０ｍｌの比較的小量の溶液または懸濁物を身
体に投与する際に一般的には使用される。点滴溶液は、例えば１リットリまたは
それを超す量の大量の溶液または懸濁物を投与する場合に一般的には使用する。
点滴溶液とは対照的に注射溶液の場合には僅か数ミリリットルが投与されるので
、注射における血液または組織流体のｐＨおよび浸透圧からの微妙な差異は、痛
みに関してはそれ自体が感知できないか、または微々たる程度でのみ感知し得る
程度である。したがって、この発明における配合物の使用前希釈は、一般的には
必要がない。しかし、比較的大量投与の場合には、この発明における配合物は、
少なくとも等浸透圧溶液が得られるような態様で投与直前に希釈すべきである。
等浸透圧溶液の例は０．９％強度塩化ナトリウム溶液である。点滴の場合は、例
えば滅菌水を用いて希釈を行うことができ、一方、投与は例えば所謂バイパスを
介して実施できる。
体に投与する際に一般的には使用される。点滴溶液は、例えば１リットリまたは
それを超す量の大量の溶液または懸濁物を投与する場合に一般的には使用する。
点滴溶液とは対照的に注射溶液の場合には僅か数ミリリットルが投与されるので
、注射における血液または組織流体のｐＨおよび浸透圧からの微妙な差異は、痛
みに関してはそれ自体が感知できないか、または微々たる程度でのみ感知し得る
程度である。したがって、この発明における配合物の使用前希釈は、一般的には
必要がない。しかし、比較的大量投与の場合には、この発明における配合物は、
少なくとも等浸透圧溶液が得られるような態様で投与直前に希釈すべきである。
等浸透圧溶液の例は０．９％強度塩化ナトリウム溶液である。点滴の場合は、例
えば滅菌水を用いて希釈を行うことができ、一方、投与は例えば所謂バイパスを
介して実施できる。
【００３９】 この発明における重要な利点は、この発明における配合物が免疫反応性パピロ
ーマウイルス特異的タンパク質の沈殿を本質的に起こさないことである。具体的
にはタンパク質の約９０％を超す量、特に約９５％を超す量が溶液中に残留し、
かつ同時に、少なくとも約１２時間は析出しないことである。この免疫反応性パ
ピローマウイルス特異的タンパク質は、最大５０００ｇの遠心分離によってさえ
も顕著に析出され得ない。加えて、この配合物は約１〜２カ月およびそれを超す
比較的長期に亙って均一かつ安定に残存する。 図面および次の実施例は、発明をさらに詳細に説明する目的のものであり、
範囲の制限を意図するものではない。
ーマウイルス特異的タンパク質の沈殿を本質的に起こさないことである。具体的
にはタンパク質の約９０％を超す量、特に約９５％を超す量が溶液中に残留し、
かつ同時に、少なくとも約１２時間は析出しないことである。この免疫反応性パ
ピローマウイルス特異的タンパク質は、最大５０００ｇの遠心分離によってさえ
も顕著に析出され得ない。加えて、この配合物は約１〜２カ月およびそれを超す
比較的長期に亙って均一かつ安定に残存する。 図面および次の実施例は、発明をさらに詳細に説明する目的のものであり、
範囲の制限を意図するものではない。
【００４０】 図１は、塩濃度に対するウイルス様粒子の溶解性の依存度を示すグラフである
。
。
【００４１】
【実施例】１．ＨＰＶ１６Ｌ1 Ｅ7 融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子の調製 ＨＰＶ−１６Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-55を Muller らの (1997) supra に準拠して調
製した。 ＨＰＶ−１６Ｌ1 オープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）を制限エンドヌク
レアーゼＢｇ1 ＩＩを用いてプラスミドＨＰＶ−１６−114/k −Ｌ1 ／Ｌ2 -pＳ
ｙｎｘｔＶＴ- （Kirnbauser, R. らによる（1994）J. Virol. 67, 6929）から
切除し、ベクターｐＵＣ19（New England Biolabs) 中でＢａｍＨＩサイト中に
クローン化した。
製した。 ＨＰＶ−１６Ｌ1 オープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）を制限エンドヌク
レアーゼＢｇ1 ＩＩを用いてプラスミドＨＰＶ−１６−114/k −Ｌ1 ／Ｌ2 -pＳ
ｙｎｘｔＶＴ- （Kirnbauser, R. らによる（1994）J. Virol. 67, 6929）から
切除し、ベクターｐＵＣ19（New England Biolabs) 中でＢａｍＨＩサイト中に
クローン化した。
【００４２】 ＨＰＶ−１６Ｌ1 ΔＣ調製のために、ＨＰＶ−１６Ｌ1 ＯＲＦに相補の二つの
プライマーを構築した。最初のプライマーは次の配列： AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC を有し、第２プライマーは次の配列： AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG を有した。
プライマーを構築した。最初のプライマーは次の配列： AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC を有し、第２プライマーは次の配列： AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG を有した。
【００４３】 両方のプライマーはＥcoＲＶ制限酵素切断サイト５’をコードする。下流に位
置するプライマーでは、ＨＰＶ１６Ｌ1 ＯＲＦの最後の３４アミノ酸を欠失する
目的でＴＡＡ翻訳停止コドンがＥcoＲＶに続く。全Ｌ1 ＯＲＦおよび全ベクター
を増幅する目的でＰＣＲ反応を実施した。この直鎖生成物をＥcoＲＶで切断し、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼで環化し、Ｅ. coli ＤＨ5 α細胞をトランスフオームさせ
た。ＥcoＲＶサイトの存在に関して、このクローンを分析した。得られたｐＵＣ
ＨＰＶ１６Ｌ1 ΔＣ構築体を、ＨＰＶ16Ｅ7 1-50のＯＲＦのＥcoＲＶサイトへの
クローン化の目的で用いた。
置するプライマーでは、ＨＰＶ１６Ｌ1 ＯＲＦの最後の３４アミノ酸を欠失する
目的でＴＡＡ翻訳停止コドンがＥcoＲＶに続く。全Ｌ1 ＯＲＦおよび全ベクター
を増幅する目的でＰＣＲ反応を実施した。この直鎖生成物をＥcoＲＶで切断し、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼで環化し、Ｅ. coli ＤＨ5 α細胞をトランスフオームさせ
た。ＥcoＲＶサイトの存在に関して、このクローンを分析した。得られたｐＵＣ
ＨＰＶ１６Ｌ1 ΔＣ構築体を、ＨＰＶ16Ｅ7 1-50のＯＲＦのＥcoＲＶサイトへの
クローン化の目的で用いた。
【００４４】 このフラグメントのクローン化のために、５’ＥcoＲＶ制限酵素切断サイトを
有するプライマーを使用した。次のプライマー対を用いた： AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC および TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC このＰＣＲ生成物をＥcoＲＶを用いて切断し、修飾Ｌ1 遺伝子のＥcoＲＶサイ
トへ挿入した。
有するプライマーを使用した。次のプライマー対を用いた： AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC および TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC このＰＣＲ生成物をＥcoＲＶを用いて切断し、修飾Ｌ1 遺伝子のＥcoＲＶサイ
トへ挿入した。
【００４５】 ＥcoＲＶサイトの除去にために、クローンｐＵＣ−ＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣＥ7 1-50 の二つの重複フラグメントを増幅する目的で二つのＰＣＲ反応を実施した。生成
ＤＮＡフラグメントはＬ1 ／Ｅ7 境界の位置で重複した（四つのプライマーＰＣ
Ｒ、Ho, S.N. らの (1989） Gene 77, 51）。しかし、これらのプライマーは二
つのＥcoＲＶ制限酵素切断サイトを含まなかった。フラグメント１はプライマー
Ｐ１およびＰ２を用いて調製し、フラグメント２はプライマーＰ３およびＰ４を
用いて調製した。 Ｐ１：GTTATGACATACATACATTCTATG(Ｌ1 ） Ｐ２：CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC（Ｅ7 ） Ｐ３：CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC（Ｅ7 ） Ｐ４：CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG（Ｅ7 ）
ＤＮＡフラグメントはＬ1 ／Ｅ7 境界の位置で重複した（四つのプライマーＰＣ
Ｒ、Ho, S.N. らの (1989） Gene 77, 51）。しかし、これらのプライマーは二
つのＥcoＲＶ制限酵素切断サイトを含まなかった。フラグメント１はプライマー
Ｐ１およびＰ２を用いて調製し、フラグメント２はプライマーＰ３およびＰ４を
用いて調製した。 Ｐ１：GTTATGACATACATACATTCTATG(Ｌ1 ） Ｐ２：CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC（Ｅ7 ） Ｐ３：CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC（Ｅ7 ） Ｐ４：CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG（Ｅ7 ）
【００４６】 精製生成物の１／１０を混合し、プライマーＰ1 およびＰ4 のみを用いたＰＣ
Ｒ反応のマトリックスとして用いた。ＥcoＮＩ（Ｌ1 ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（
プライマーＰ4 上の停止コドンの下流）を用いて生成物を切断し、クローン化Ｈ
ＰＶ16Ｌ1 ＯＲＦのＥcoＮＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを置換基する目的で
これを使用した。したがって、生成したクローンは、二つの内部ＥcoＲＶ制限酵
素切断サイトの消失、ならびにＬ1 ＯＲＦおよびＥ7 間の対応非ＨＰＶアミノ酸
ＡｓｐとＩｌｅおよびＥ7 の下流の消失によりクローンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣＥ7 1- 50 とは異なっている。最初のＥcoＲＶサイトは、この位置（AlaGly）で本来のＬ
1 アミノ酸で置換した。第２のＥｃｏＲＶサイトは翻訳停止信号により置換した
。このクローン（ＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-52）はＨＰＶ16Ｅ7 の最初の５２ア
ミノ酸を追加的に含んでなる。クローンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-52は、Ｐ5 と
の組み合わせにおけるプライマーＰ1 の手助けでクローンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ
7 1-55の調製用に使用した。 Ｐ５：CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG(Ｅ71-55） 全ての場合、対応フラグメントを置換する目的でＥcoＮＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉを使用した。このクローンはＤＮＡ配列決定により解析した。
Ｒ反応のマトリックスとして用いた。ＥcoＮＩ（Ｌ1 ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（
プライマーＰ4 上の停止コドンの下流）を用いて生成物を切断し、クローン化Ｈ
ＰＶ16Ｌ1 ＯＲＦのＥcoＮＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを置換基する目的で
これを使用した。したがって、生成したクローンは、二つの内部ＥcoＲＶ制限酵
素切断サイトの消失、ならびにＬ1 ＯＲＦおよびＥ7 間の対応非ＨＰＶアミノ酸
ＡｓｐとＩｌｅおよびＥ7 の下流の消失によりクローンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣＥ7 1- 50 とは異なっている。最初のＥcoＲＶサイトは、この位置（AlaGly）で本来のＬ
1 アミノ酸で置換した。第２のＥｃｏＲＶサイトは翻訳停止信号により置換した
。このクローン（ＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-52）はＨＰＶ16Ｅ7 の最初の５２ア
ミノ酸を追加的に含んでなる。クローンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ7 1-52は、Ｐ5 と
の組み合わせにおけるプライマーＰ1 の手助けでクローンＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣ* Ｅ
7 1-55の調製用に使用した。 Ｐ５：CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG(Ｅ71-55） 全ての場合、対応フラグメントを置換する目的でＥcoＮＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉを使用した。このクローンはＤＮＡ配列決定により解析した。
【００４７】２．組み換え Baculovirus の調製 Spodoptera frugiperda (Sf9）を、単層として、または１０％胎児子牛血清お
よび２ｍＭグルタミンを用いたＴＮＭ−ＦＨ昆虫媒体（Sigma, Deisenhofen）の
懸濁培地で使用した。組み換え baculovirus ＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣＥ7 1-X を、１
０μｇの組み換えプラスミドおよび２μｇの直鎖化 Baculo-Gold ＤＮＡ（Phar
mingen, San Diego, CA)のコントラフエクションによりSf9 細胞中にトランスフ
エクトさせた。組み換えウイルスはメーカー指示に従って精製した。発現試験の
目的で、１０6Sf9 細胞を組み換え Baculovirus および５から１０のｍ．ｏ．
ｉ．（multiplicity of infection ；感染多重度）で感染させた。保温後、培地
を除き、ＰＢＳ（140mM NaCl、 2.7mM KCl、 8.1mM Na2PO4 、1.5mM KH2PO4、pH
7.2）で洗浄した。次いで細胞をＳＤＳ試料緩衝剤中に溶菌し、ＳＤＳゲルクロ
マトグラフイーおよび免疫アッセイにより試験した。
よび２ｍＭグルタミンを用いたＴＮＭ−ＦＨ昆虫媒体（Sigma, Deisenhofen）の
懸濁培地で使用した。組み換え baculovirus ＨＰＶ16Ｌ1 ΔＣＥ7 1-X を、１
０μｇの組み換えプラスミドおよび２μｇの直鎖化 Baculo-Gold ＤＮＡ（Phar
mingen, San Diego, CA)のコントラフエクションによりSf9 細胞中にトランスフ
エクトさせた。組み換えウイルスはメーカー指示に従って精製した。発現試験の
目的で、１０6Sf9 細胞を組み換え Baculovirus および５から１０のｍ．ｏ．
ｉ．（multiplicity of infection ；感染多重度）で感染させた。保温後、培地
を除き、ＰＢＳ（140mM NaCl、 2.7mM KCl、 8.1mM Na2PO4 、1.5mM KH2PO4、pH
7.2）で洗浄した。次いで細胞をＳＤＳ試料緩衝剤中に溶菌し、ＳＤＳゲルクロ
マトグラフイーおよび免疫アッセイにより試験した。
【００４８】３．ウイルス様粒子の精製 ＣＶＬＰS 調製のために、Trichoplusia ni (TN) High Five 細胞を Ex-Cell
405 無血清培地(JRH, Biosciences, Lennexa, KS) 中でｍｌ当たりの密度１〜
１．５×１０6 細胞／ｍｌまで２７℃で培養した。４００ｍｌ培地を収穫し、周
期的反転下に１時間、組み換え baculovirus を用いてm.o.i.２から５で感染さ
せた。培地２４０ｍｌまでを添加し、３〜４日間細胞を培養した。次いで細胞を
ペレット化し、抽出緩衝液（25mM Tris/HCl, pH 7.5; 500mM NaCl, 1mM EDTA ）
１０ｍｌ中に再懸濁し、６０ワットで４５秒間超音波処理した。Sorvall SS34
ローターを用いた 10,000 rpm での遠心分離後、ペレットを６ｍｌの抽出緩衝液
中に溶解し，６０ワットで３０秒間超音波処理し、再度遠心分離した。上澄み液
を併合し、４０％ (w/V) スクロースおよび５７．５％（W/V) ＣｓＣｌの２段
勾配に処した。27,000 rpmのＳＷ−２８ローター中での遠心分離後、中間層およ
びＣｓＣｌ層を採取し、ＣｓＣｌ密度１．３８ｇ／ｍｌに調整し、45,000 rpmで
１６時間遠心分離した。この勾配体を分画し、各フラクションをアンチＨＰＶ16
Ｌ1 ｍＡｂ Camvirl (Pharmingen, San Diego, CA)によるウエスタンブロットに
より試験した。反応性フラクションを併合し、Centricon 30 ミクロ濃縮器（Am
icon Corp. Beverly, MA）を使用する限界濾過手段により Hepes 緩衝液（1mM
Hepes 、 149mM NaCl 、 0.5mM KCl、 pH 7.2 ）に対して透析し、透過電子顕微
鏡手法によりＣＶＬＰs の存在を確認した。Ｌ1 Ｅ7 タンパク質の濃度は、クー
マシーブルーで汚染したＳＤＳゲル中で標準ＢＳＡと比較することにより、ざっ
と決定した。
405 無血清培地(JRH, Biosciences, Lennexa, KS) 中でｍｌ当たりの密度１〜
１．５×１０6 細胞／ｍｌまで２７℃で培養した。４００ｍｌ培地を収穫し、周
期的反転下に１時間、組み換え baculovirus を用いてm.o.i.２から５で感染さ
せた。培地２４０ｍｌまでを添加し、３〜４日間細胞を培養した。次いで細胞を
ペレット化し、抽出緩衝液（25mM Tris/HCl, pH 7.5; 500mM NaCl, 1mM EDTA ）
１０ｍｌ中に再懸濁し、６０ワットで４５秒間超音波処理した。Sorvall SS34
ローターを用いた 10,000 rpm での遠心分離後、ペレットを６ｍｌの抽出緩衝液
中に溶解し，６０ワットで３０秒間超音波処理し、再度遠心分離した。上澄み液
を併合し、４０％ (w/V) スクロースおよび５７．５％（W/V) ＣｓＣｌの２段
勾配に処した。27,000 rpmのＳＷ−２８ローター中での遠心分離後、中間層およ
びＣｓＣｌ層を採取し、ＣｓＣｌ密度１．３８ｇ／ｍｌに調整し、45,000 rpmで
１６時間遠心分離した。この勾配体を分画し、各フラクションをアンチＨＰＶ16
Ｌ1 ｍＡｂ Camvirl (Pharmingen, San Diego, CA)によるウエスタンブロットに
より試験した。反応性フラクションを併合し、Centricon 30 ミクロ濃縮器（Am
icon Corp. Beverly, MA）を使用する限界濾過手段により Hepes 緩衝液（1mM
Hepes 、 149mM NaCl 、 0.5mM KCl、 pH 7.2 ）に対して透析し、透過電子顕微
鏡手法によりＣＶＬＰs の存在を確認した。Ｌ1 Ｅ7 タンパク質の濃度は、クー
マシーブルーで汚染したＳＤＳゲル中で標準ＢＳＡと比較することにより、ざっ
と決定した。
【００４９】４．マイクロ透析実験 使用試料は、スクロースクッションおよび塩化セシウム平衡超遠心分離により
Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞から単離されたウイルス様粒子を含むフラクションであ
った。全タンパク質濃度は０．２９ｍｇ／ｍｌおよびＣＶＬＰ濃度は０．１７ｍ
ｇ／ｍｌであった。
Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞から単離されたウイルス様粒子を含むフラクションであ
った。全タンパク質濃度は０．２９ｍｇ／ｍｌおよびＣＶＬＰ濃度は０．１７ｍ
ｇ／ｍｌであった。
【００５０】 相当する溶液４０ｍｌをスクリュー型ふたを有する５０ｍｌプラスチック容器
中に導入した。ポア直径０．０２５μｍの透析濾紙をこの溶液上に注意深く配設
したが、この濾紙は透析実施期間中に液面上に浮かんだ。純ＣＶＬＰ溶液３０μ
ｌをこの濾紙上にピペットで置き、容器を密封した。液滴溶液が透析溶液（増強
ＮａＣｌ濃度を用いた、５０ｍＭ tris/ ＨＣｌ）と交換されるように、少なく
とも１２時間、容器を４〜６℃で放置した。ピストンピペットを用いてこの液滴
を取り除き、３０μｌの貯蔵溶液と平衡化させた。１０，０００ｇ（１０分、４
℃）での遠心分離後の上澄み液を、ＨＰＶ16Ｌ1 に対する高次構造特異的モノク
ロナール抗体を用い、かつ、タンパク質検定においてＥＬＩＳＡ［Kemeny, D.M.
(1994) 次のＥＬＩＳＡからの間接ＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡ、biological/medic
al laboratory, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 111頁，Test 6.2 にお
ける酵素結合免疫吸着検定の使用］中で研究した。このタンパク質濃度を、標準
としてのウシ血清アルブンミンに対するバイシンコニン酸検定（Smith, P.K. ら
による (1985) Anal. Biochem., 150, 76-85）を用いて決定した。結果を図１に
示す。
中に導入した。ポア直径０．０２５μｍの透析濾紙をこの溶液上に注意深く配設
したが、この濾紙は透析実施期間中に液面上に浮かんだ。純ＣＶＬＰ溶液３０μ
ｌをこの濾紙上にピペットで置き、容器を密封した。液滴溶液が透析溶液（増強
ＮａＣｌ濃度を用いた、５０ｍＭ tris/ ＨＣｌ）と交換されるように、少なく
とも１２時間、容器を４〜６℃で放置した。ピストンピペットを用いてこの液滴
を取り除き、３０μｌの貯蔵溶液と平衡化させた。１０，０００ｇ（１０分、４
℃）での遠心分離後の上澄み液を、ＨＰＶ16Ｌ1 に対する高次構造特異的モノク
ロナール抗体を用い、かつ、タンパク質検定においてＥＬＩＳＡ［Kemeny, D.M.
(1994) 次のＥＬＩＳＡからの間接ＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡ、biological/medic
al laboratory, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 111頁，Test 6.2 にお
ける酵素結合免疫吸着検定の使用］中で研究した。このタンパク質濃度を、標準
としてのウシ血清アルブンミンに対するバイシンコニン酸検定（Smith, P.K. ら
による (1985) Anal. Biochem., 150, 76-85）を用いて決定した。結果を図１に
示す。
【００５１】
【配列表】
【図１】 塩濃度に対するウイルス様粒子の溶解性の依存度を示すグラフである。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年５月３日（２０００．５．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA32 CA07 DA02 EA02 GA11 4C085 AA03 BA76 BB11 CC21 GG02 GG04 GG05 4H045 AA11 AA30 CA01 DA86 EA28 FA72 FA73 FA74
Claims (22)
- 【請求項１】 一種または二種以上のパピローマウイルスの少なくとも一つの後期タンパク質
（Ｌタンパク質）および／または一種または二種以上のパピローマウイルスの少
なくとも一つの初期タンパク質（Ｅタンパク質）、ならびに濃度約０．３から約
４Ｍ、好ましくは約０．４から約２．５〜３Ｍ、具体的には約０．４〜０．５Ｍ
から１〜２Ｍ特に約１から２Ｍの塩を、ｐＨ約７．３から約７．４５好ましくは
約７．４で含み、さらに任意に適切な添加剤および／または賦形剤を含む配合物
。 - 【請求項２】 塩が、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、好ましくはハロゲン化物ま
たはリン酸塩、具体的にはアルカリ金属ハロゲン化物特にＮａＣｌまたはＫＣｌ
であることを特徴とする、請求項１記載の配合物。 - 【請求項３】 ｐＨを、緩衝剤好ましくはリン酸塩緩衝剤、トリス緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤
またはＭＯＰＳ緩衝剤を用いて調整することを特徴とする、請求項１または２記
載の配合物。 - 【請求項４】 上記タンパク質またはタンパク質類が、パピローマウイルス非特異的エピトー
プを含まないことを特徴とする、請求項１から３のいずか１項記載の配合物。 - 【請求項５】 Ｌタンパク質が、欠失Ｌタンパク質好ましくは欠失Ｌ1 および／またはＬ2 タ
ンパク質であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項記載の配合物
。 - 【請求項６】 Ｌタンパク質が、Ｃ末端欠失Ｌタンパク質具体的にはＣ末端欠失Ｌ1 タンパク
質であることを特徴とする、請求項５記載の配合物。 - 【請求項７】 約３５アミノ酸まで、好ましくは約２５から約３５アミノ酸、具体的には約３
２から約３４アミノ酸がＬタンパク質から欠失されることを特徴とする、請求項
５または６記載の配合物。 - 【請求項８】 Ｅタンパク質が、欠失Ｅタンパク質特に欠失Ｅ6 および／または欠失Ｅ7 タン
パク質であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項記載の配合物。 - 【請求項９】 欠失Ｅタンパク質がＣ末端欠失Ｅタンパク質好ましくはＣ末端欠失Ｅ7 タンパ
ク質であることを特徴とする、請求項８記載の配合物。 - 【請求項１０】 約５５アミノ酸まで、好ましくは約５から約５５アミノ酸、具体的には約３８
から約４３アミノ酸が欠失されてなることを特徴とする、請求項８または９記載
の配合物。 - 【請求項１１】 Ｌタンパク質がＥタンパク質に結合、好ましくはＥタンパク質に融合してなる
、請求項１から１０のいずれか１項記載の配合物。 - 【請求項１２】 上記タンパク質がキヤプシッドおよび／またはキヤプソマーの形態で存在する
ことを特徴とする、請求項１から１１のいずれか１項記載の配合物。 - 【請求項１３】 パピローマウイルスがヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）であることを特徴と
する、請求項１から１２のいずれか１項記載の配合物。 - 【請求項１４】 ＨＰＶが、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ
−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−
４５、ＨＰＶ−５２および／またはＨＰＶ−５８から選択されることを特徴とす
る、請求項１３記載の配合物。 - 【請求項１５】 添加剤および／または賦形剤が一種または二種以上の洗剤、ポリオールおよび
／または双性イオン化合物であることを特徴とする、請求項１から１４のいずれ
か１項記載の配合物。 - 【請求項１６】 上記タンパク質を、濃度約０．３から約４Ｍ、好ましくは約０．４から約２．
５〜３Ｍ、具体的には約０．４〜０．５Ｍから約１〜２Ｍ特に約１から約２Ｍの
塩をｐＨ約７．３から約７．４５好ましくは約７．４で含む溶液中に均一混合お
よび／または上記溶液に対して透析することを特徴とする、請求項１から１５の
いずれか１項記載の配合物。 - 【請求項１７】 医薬または診断約としての、請求項１から１５のいずれか１項記載の配合物の
使用。 - 【請求項１８】 配合物がアジュバントを含有しないとを特徴とする、請求項１７記載の使用。
- 【請求項１９】 この医薬が、パピローマウイルス特異的腫瘍の回避用または治療用として役立
つことを特徴とする、請求項１７または１８記載の使用。 - 【請求項２０】 腫瘍が、喉頭、頚部、陰茎、外陰または肛門における上皮組織悪性腫瘍である
ことを特徴とする、請求項１９記載の使用。 - 【請求項２１】 上記配合物を、注射溶液または点滴溶液としてとして使用することを特徴とす
る、請求項１７から２０のいずれか１項記載の使用。 - 【請求項２２】 診断薬が、一種または二種以上のパピローマウイルス感染の診断用に役立つこ
とを特徴とする、請求項１７記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19812940A DE19812940A1 (de) | 1998-03-24 | 1998-03-24 | Formulierung mit Papillomavirus-spezifischem Protein, seine Herstellung und Verwendung |
| DE19812940.8 | 1998-03-24 | ||
| PCT/EP1999/001999 WO1999048917A2 (de) | 1998-03-24 | 1999-03-24 | Formulierung mit papillomavirus-spezifischem protein, seine herstellung und verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002507625A true JP2002507625A (ja) | 2002-03-12 |
Family
ID=7862147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000537899A Pending JP2002507625A (ja) | 1998-03-24 | 1999-03-24 | パピローマウイルス特異的タンパク質を含む配合物、その調製および使用 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1066321A2 (ja) |
| JP (1) | JP2002507625A (ja) |
| AR (1) | AR014969A1 (ja) |
| AU (1) | AU3598999A (ja) |
| CA (1) | CA2323526A1 (ja) |
| DE (1) | DE19812940A1 (ja) |
| MX (1) | MXPA00009283A (ja) |
| WO (1) | WO1999048917A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008516616A (ja) * | 2004-10-22 | 2008-05-22 | オンコリティクス バイオテック， インコーポレイティッド | 改良されたウイルス精製法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2519043T3 (es) | 2000-12-08 | 2014-11-06 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Péptidos largos de 22-45 residuos de aminoácidos que inducen y/o mejoran las respuestas inmunológicas específicas para antígenos |
| EP1355925A2 (en) * | 2000-12-08 | 2003-10-29 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Long peptides of 22-45 amino acid residues that induce and/or enhance antigen specific immune responses |
| EP1213299A1 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-12 | Leids Universitair Medisch Centrum | Immunogenic epitopes of human papilloma virus and uses thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3915794A (en) * | 1973-02-09 | 1975-10-28 | Rit Rech Ind Therapeut | Stabilizing compositions for cell-free viruses and cell-free virus preparations containing them |
| SE9001705D0 (sv) * | 1990-05-11 | 1990-05-11 | Medscand Ab | Saett foer diagnostik av virusbaerande tumoerer genom immunoassay |
| US6066324A (en) * | 1994-10-07 | 2000-05-23 | Loyola University Of Chicago | Carboxyl terminal of papilloma virus L1 region is not required for formation of virus-like particles |
| DE4435907C2 (de) * | 1994-10-07 | 1997-07-24 | Lutz Prof Dr Gissmann | Papillomavirusähnliche Partikel und deren Anwendung |
-
1998
- 1998-03-24 DE DE19812940A patent/DE19812940A1/de not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-03-24 WO PCT/EP1999/001999 patent/WO1999048917A2/de not_active Application Discontinuation
- 1999-03-24 CA CA002323526A patent/CA2323526A1/en not_active Abandoned
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