DE69629556T2

DE69629556T2 - Synthetisches, hpv6/11 hybrides l1 dns, das für menschliches papillomavirus typ 11 l1-protein kodiert

Info

Publication number: DE69629556T2
Application number: DE69629556T
Authority: DE
Inventors: Kathryn J. Hofmann; Kathrin U. Jansen; Michael P. Neeper; Joseph G. Joyce; Hugh A. George; E.Dale Lehman
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1995-03-30
Filing date: 1996-03-26
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2016-03-27
Also published as: PL183299B1; KR19980703391A; NO974514L; KR100441477B1; AU5527796A; EP0817852A2; IL117591A0; SK129397A3; ZA962526B; NZ306663A; CN1154732C; US6159729A; WO1996030520A3; PT817852E; NO974514D0; EA199700281A1; AU708111B2; ATE247712T1; JP3918877B2; JPH11503313A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein synthetisches DNA-Molekül, das für gereinigtes Human-Papillomavirus Typ 11-L1-Protein und Derivate davon kodiert.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des HPV6/11-Hybrid-L1-Gens unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide.
2 zeigt die Nukleotidsequenz des HPV6/11-Hybrids, veröffentlichter HPV6a- und veröffentlichter HPV11-L1-Gene.
3 zeigt den bidirektionalen Hefe-Expressionsvektor pGAL1-10, der zur Expression von Papillomavirus-L1-Kapsidproteinen verwendet wurde.
4 ist eine Northern-Analyse von HPV11-L1-mRNA aus Hefe.
5 zeigt die Expression von HPV11-L1-Protein in Hefe durch Western-Analyse (Immunoblot).
6 zeigt ELISA-Reaktivitäten von HPV11-L1-VLPs, exprimiert von Wildtyp (Wt)-HPV11, im Vergleich zu HPV6/11-Hybrid-DNA.
7 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von HPV11-L1-VLPs, exprimiert in Hefe.
8 zeigt die Nukleotidsequenz des HPV6/11-Hybridgens.
Hintergrund der Erfindung
Papillomavirus (PV)-Infektionen treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore an der Infektionsstelle induzieren. Papillomaviren sind spezies-spezifische infektiöse Agenzien; ein Human-Papillomavirus kann kein nicht-menschliches Lebewesen infizieren.
Papillomaviren können auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf der Grundlage von DNA-Sequenzhomologie in mehr als 70 Typen eingeteilt. PV-Typen scheinen insofern typspezifische Immunogene darzustellen als eine neutralisierende Immunität gegen Infektion durch einen Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen einen anderen Typ von Papillomavirus verleiht.
Bei Menschen verursachen verschiedene HPV-Typen unterschiedliche Erkrankungen. Die HPV-Typen 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 26–29 verursachen gutartige Warzen bei sowohl normalen als auch immungeschwächten Personen. Die HPV-Typen 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19–25, 36 und 46–50 verursachen flache Läsionen bei immungeschwächten Personen. Die HPV-Typen 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55 verursachen nicht-maligne Condylome der Schleimhäute der Genitalien oder Atemwege. Die HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 45 und 58 verursachen eine Epithel-Dysplasie der Genitalschleimhaut und sind mit der Mehrheit von in situ- und invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses, der Vagina, Vulva und des Analkanals assoziiert.
Papillomaviren sind kleine (50–60 nm), nicht von einer Hülle umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche für bis zu acht frühe und zwei späte Gene kodieren. Die offenen Leserahmen (ORF) der Virusgenome werden als E1 bis E8 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet und "L" spät bedeutet. L1 und L2 kodieren für Virus-Kapsidproteine. Die frühen (E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation, transkriptionaler Regulation und zellulärer Transformation assoziiert.
Das L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht von 55– 60 kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 55–60 kD und ein scheinbares Molekulargewicht von 75–100 kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist. Immunologische Daten legen nahe, daß sich der größte Teil des L2-Proteins innerhalb des L1-Proteins in dem viralen Kapsomer befindet. Der L1-ORF ist bei verschiedenen Papillomaviren hochkonserviert. Die L2-Proteine sind bei verschiedenen Papillomaviren weniger konserviert.
Die L1- und L2-Gene wurden als gute Ziele für die Immunprophylaxe identifiziert. Von einigen der frühen Gene wurde auch gezeigt, daß sie potentielle Ziele für die Vakzin-Entwicklung sind. Studien in den Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus (CRPV)- und Rinder-Papillomavirus (BPV)-Systemen haben gezeigt, daß Immunisierungen mit rekombinanten L1- und/oder L2-Poteinen (produziert in Bakterien oder unter Verwendung von Vaccinia-Vektoren) Tiere vor einer Virusinfektion schützten. Die Expression von Papillomavirus-L1-Genen in Baculovirus-Expressionssystemen oder unter Verwendung von Vaccinia-Vektoren führte zum Zusammenbau von virusähnlichen Partikeln (VLP), welche zur Induktion von virus-neutralisierenden Antikörperreaktionen mit hohem Titer, die mit dem Schutz vor einer viralen Herausforderung korrelieren, eingesetzt wurden. Ferner wurden die L1- und L2-Gene zur Erzeugung von Vakzinen für die Verhütung und Behandlung von Papillomavirus-Infektionen in Lebewesen eingesetzt.
Die Entwicklung und kommerzielle Verwendung prophylaktischer und therapeutischer Vakzine für eine PV-Infektion und -Erkrankung, welche L1-Protein, L1- + L2-Proteine oder modifizierte L1- oder L1- + L2-Proteine enthalten, wurde durch den Mangel an großen Mengen von gereinigtem Virus und gereinigtem Protein behindert. Nachdem PV nicht ohne weiteres in vitro kultiviert wird, ist es schwierig, die erforderlichen Mengen an L1- und L2-Protein durch in vitro-Vermehrung von PV herzustellen. Die resultierenden Versorgungsprobleme machen die Charakterisierung von PV und PV-Proteinen schwierig. Dementsprechend wäre es von Nutzen, eine unschwer erneuerbare Quelle von rohen PV-Proteinen, insbesondere PV-L1- und -L2-Proteinen oder modifizierten L1- und L2-Proteinen, zu entwickeln. Es wäre auch von Nutzen, Verfahren zur Reinigung großer Mengen der rohen Papillomavirus-Proteine auf Niveaus einer für immunologische Studien und Vakzin-Entwicklung geeigneten Reinheit zu entwickeln. Es wäre auch von Nutzen, große Mengen an Papillomavirus-Proteinen mit den immunitätsverleihenden Eigenschaften der nativen Proteine, wie z. B. der Konformation des nativen Proteins, herzustellen. Darüber hinaus wäre es von Nutzen, Verfahren zur Analyse der PV-Proteine und Verfahren zur Bestimmung der relativen Reinheit der Proteine sowie von Zusammensetzungen, welche die Proteine enthalten, zu entwickeln. Solche hochgereinigten Proteine wären auch von Nutzen bei der Herstellung einer Vielfalt von Reagenzien, die sich für das Studium der PV-Infektion eignen; solche Reagenzien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und analytische Standards.
HPV6 und 11 sind die Ursachen für ~90% der gutartigen Genitalwarzen und sind nur selten mit malignen Tumoren assoziiert (Gissmann et al., 1983, PNAS 80, 560–563). HPV6a wird als häufigster HPV6-Subtyp in Condyloma accuminata angesehen (Brown, D. B., et al., J. Clin. Microbiol. 31: 1667–1673). Arztbesuche wegen Genitalwarzen (Condyloma acuminatum oder planum) nahmen in den letzten Jahren zu. Es wird geschätzt, daß ~10% der allgemeinen Bevölkerung (Alter 15–49) HPV-Infektionen des Genitaltrakts aufweisen (Koutsky et al., 1988, Epidemiol. Rev. 10, 122–163). Während die Mehrheit der Condylome mit HPV6 assoziiert ist, ist im Falle von laryngealer Papillomatose HPV11 der dominierende Typ. Die HPV11-Replikation in den Epithelzellen des Atemtrakts stimuliert die Proliferation dieser Zellen, welche zu isolierten Läsionen von geringerer klinischer Relevanz oder zu multiplen, sich ausbreitenden Läsionen und Wiederauftreten der Krankheit führen kann. Wiederkehrende respiratorische Papillomatose, eine Erkrankung, welche häufiger die jugendliche Population betrifft, kann eine lebensbedrohende Erkrankung sein, indem sie Blockaden des Atemtrakts verursacht. Kürzlich wurde ein Tiermodell entwickelt, welches die Replikation von infektiösem HPV11 erlaubt (Kreider et al., 1985, Nature 317, 639–640; Kreider et al., 1987, J. Virol. 61, 590–593). Das Modell ermöglichte die Identifizierung von neutralisierenden Konformationsepitopen auf nativen Virionen und baculovirus-exprimierten VLPs unter Verwendung monoklonaler Antikörper (Christensen et al., 1990, J. Virol. 64, 5678–5681; Christensen und Kreider, 1991, Virus Res. 21, 169–179; Christensen und Kreider, 1993, Virus Res. 28, 195–202; Christensen et al., 1994, 75, 2271–2276).
Virusähnliche Partikel, die HPV11-L1-Protein enthalten, wurden sowohl in Insekten als auch in Säugerzellsystemen exprimiert. Die Expression von VLPs in Hefezellen bietet die Vorteile, kosteneffektiv zu sein und leicht an die Züchtung in großem Maßstab in Fermentern adaptiert zu werden. Jedoch wird das HPV11-L1-Protein in Hefezellen in niedrigen Niveaus exprimiert. Es wurde festgestellt, daß dies ein Ergebnis der Verkürzung der HPV11-L1-mRNA ist. Im Gegensatz dazu wird das HPV6-L1-Gen als Vollängen-mRNA transkribiert und in hohen Niveaus exprimiert. Durch Modifizierung der HPV6-L1-DNA, um für das HPV11-L1-Protein zu kodieren, ist es möglich, die Transkription von Vollängen-mRNA zu erleichtern, was zu erhöhter HPV11-L1-Protein-Expression führt. Die vorliegende Erfindung stellt eine HPV6/11-Hybrid-L1-Gensequenz bereit sowie ein Verfahren zur Konstruktion des HPV6/11-Hybrid-L1-Gens unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide. Das Hybridgen wurde unter Verwendung der HPV6a-L1-Sequenz konstruiert (Hofmann, K. J., et al., 1995, Virology, für die Veröffentlichung angenommen), enthält jedoch die minimale Anzahl an Basenaustauschen, welche erforderlich ist, um das HPV11-L1-Protein zu kodieren. Im Gegensatz zu dem Wildtyp-HPV11-L1-Gen enthält das HPV6/11-Hybridgen keine von Hefe erkannten internen Transkriptionsterminationssignale; als Folge wird eine Vollängen-HPV6/11-mRNA gebildet und die Expression des HPV11-L1-Proteins wird erhöht.
Die Erfindung umfaßt auch Verfahren, mit denen rekombinante Papillomavirus-Proteine, welche die immunitätsverleihenden Eigenschaften der nativen Papillomavirus-Proteine aufweisen, hergestellt und gereinigt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung prophylaktischer und therapeutischer Vakzine für eine Papillomavirus-Infektion. Elektronenmikroskopie und die Bindung an Konformations-Antikörper demonstrieren, daß die rekombinanten Proteine der vorliegenden Erfindung zur Bildung virusähnlicher Partikel imstande sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein synthetisches DNA-Molekül, das für gereinigtes Human-Papillomavirus Typ 11-L1-Protein kodiert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein synthetisches DNA-Molekül, das für gereinigtes Human-Papillomavirus Typ 11-L1-Protein kodiert.
HPV6 und 11 sind die Ursachen für ~90% der gutartigen Genitalwarzen und sind nur selten mit malignen Tumoren assoziiert (Gissmann et l 1983, PNAS 80, 560–563). Arztbesuche wegen Genitalwarzen (Condyloma acuminatum oder planum) nahmen in den letzten Jahren zu und es wird geschätzt, daß ~10% der allgemeinen Bevölkerung (Alter 15–49) HPV-Infektionen des Genitaltrakts aufweisen (Koutsky et al., 1988, Epidemiol. Rev. 10, 122– 163). Während die Mehrheit der Condylome mit HPV6 assoziiert ist, ist im Falle von lanngealer Papillomatose HPV11 der dominierende Typ. Die HPV11-Replikation in den Epithelzellen des Atemtrakts stimuliert die Proliferation dieser Zellen, welche zu isolierten Läsionen von geringerer klinischer Relevanz oder zu multiplen, sich ausbreitenden Läsionen und Wiederauftreten der Krankheit führen kann. Wiederkehrende respiratorische Papillomatose, eine Erkrankung, welche häufiger die jugendliche Population betrifft, kann eine lebensbedrohende Erkrankung sein, indem sie Blockaden des Atemtrakts verursacht. Kürzlich wurde ein Tiermodell entwickelt, welches die Replikation von infektiösem HPV11 erlaubt (Kreider et al., 1985, Nature 317, 639–640; Kreider et al., 1987, J. Virol. 61, 590–593). Das Modell ermöglichte die Identifizierung von neutralisierenden Konformationsepitopen auf nativen Virionen und baculovirus-exprimierten VLPs unter Verwendung monoklonaler Antikörper (Christensen et al., 1990, J. Virol. 64, 5678–5681; Christensen und Kreider, 1991, Virus Res. 21, 169–179; Christensen und Kreider, 1993, Virus Res. 28, 195–202; Christensen et al., 1994, 75, 2271–2276).
Die Entwicklung und kommerzielle Verwendung prophylaktischer und therapeutischer Vakzine für eine PV-Infektion und -Erkrankung, welche L1-Protein, L1- + L2-Proteine oder modifizierte L1- oder L1- + L2-Proteine enthalten, wurde durch den Mangel an großen Mengen von gereinigtem Virus und gereinigtem Protein behindert. Nachdem PV nicht ohne weiteres in vitro kultiviert wird, ist es schwierig, die erforderlichen Mengen an L1- und L2-Protein durch in vitro-Vermehrung von PV herzustellen. Die mit der in vitro-Kultivierung von PV verbundenen Schwierigkeiten führen auch zu Schwierigkeiten bei der chemischen, immunologischen und biologischen Charakterisierung von PV und PV-Proteinen. Dementsprechend wäre es von Nutzen, eine unschwer erneuerbare Quelle von rohen PV-Proteinen, insbesondere PV-L1- und -L2-Proteinen oder modifizierten L1- und L2-Proteinen, zu entwickeln. Es wäre auch von Nutzen, Verfahren zur Reinigung großer Mengen der rohen Papillomavirus-Proteine auf Niveaus einer für immunologische Studien und Vakzin-Entwicklung geeigneten Reinheit zu entwickeln. Es wäre auch von Nutzen, große Mengen an Papillomavirus-Proteinen mit den immunitätsverleihenden Eigenschaften der nativen Proteine, wie z. B. der Konformation des nativen Proteins, herzustellen. Darüber hinaus wäre es von Nutzen, Verfahren zur Analyse der PV-Proteine und Verfahren zur Bestimmung der relativen Reinheit der Proteine sowie von Zusammensetzungen, welche die Proteine enthalten, zu entwickeln. Solche hochgereinigten Proteine wären auch von Nutzen bei der Herstellung einer Vielfalt von Reagenzien, die sich für das Studium der PV-Infektion eignen; solche Reagenzien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und analytische Standards.
Virusähnliche Partikel, die HPV11-L1-Protein enthalten, wurden sowohl in Insekten- als auch in Säugerzellsystemen exprimiert. Die Expression von VLPs in Hefezellen bietet die Vorteile, kosteneffektiv zu sein und leicht an die Züchtung in großem Maßstab in Fermentern adaptiert zu werden. Jedoch wird das HPV11-L1-Protein in Hefezellen in niedrigen Niveaus exprimiert. Es wurde festgestellt, daß dies ein Ergebnis der Verkürzung der HPV11-L1-mRNA ist. Im Gegensatz dazu wird das HPV6-L1-Gen als Vollängen-mRNA transkribiert und in hohen Niveaus exprimiert. Durch Modifizierung der HPV6-L1-DNA, um für das HPV11-L1-Protein zu kodieren, ist es möglich, die Transkription von Vollängen-mRNA zu erleichtern, was zu erhöhter HPV11-L1-Protein-Expression führt. Die vorliegende Erfindung stellt ein HPV6/11-Hybrid-L1-Gen bereit sowie ein Verfahren zur Konstruktion des HPV6/11-Hybrid-L1-Gens unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide. Das Hybridgen wurde unter Verwendung der HPV6a-L1-Sequenz konstruiert, enthält jedoch die minimale Anzahl an Basenaustauschen, welche erforderlich ist, um das HPV11-L1-Protein zu kodieren. Im Gegensatz zu dem Wildtyp-HPV11-L1-Gen enthält das HPV6/11-Hybridgen keine von Hefe erkannten internen Transkriptionsterminationssignale; dies führt zu höheren mRNA-Niveaus und folglich erhöhter Expression des HPV11-L1-Proteins.
Pharmazeutisch geeignete Zusammensetzungen, welche die DNA umfassen, können nach bekannten Verfahren formuliert werden, wie z. B. durch die Zumischung eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers. Beispiele solcher Träger und Formulierungsverfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences zu finden. Zur Bildung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, die für eine wirksame Verabreichung geeignet ist, werden solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge des Proteins oder VLP enthalten. Solche Zusammensetzungen können Proteine oder VLP enthalten, die von mehr als einem HPV-Typ stammen.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen der Erfindung werden einem Individuum in ausreichenden Mengen verabreicht, um PV-Infektionen zu behandeln oder zu diagnostizieren. Die wirksame Menge kann entsprechend einer Vielfalt von Faktoren, wie z. B. dem Zustand, Gewicht, Geschlecht und Alter des Individuums, variieren. Andere Faktoren umfassen den Verabreichungsmodus. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen in Dosen verabreicht werden, die von etwa 1 μg bis etwa 1 mg reichen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf einer Vielfalt von Routen, wie z. B. subkutan, topisch, oral, mukosal, intravenös und intramuskulär, verabreicht werden.
Es werden Vakzine offenbart, die DNA, RNA umfassen. Solche Vakzine sind auch sicher genug, um ohne Gefahr einer klinischen Infektion verabreicht zu werden, besitzen keine toxischen Nebenwirkungen, können auf einem effektiven Weg verabreicht werden, sind stabil und kompatibel mit Vakzin-Trägern.
Die Vakzine können auf einer Vielfalt von Routen verabreicht werden, z. B. oral, parenteral, subkutan, mukosal, intravenös oder intramuskulär. Die verabreichte Dosis kann mit dem Zustand, Geschlecht, Gewicht und Alter des Individuums, dem Verabreichungsweg und dem PV-Typ des Vakzins variieren. Das Vakzin kann in Dosierungsformen wie Kapseln, Suspensionen, Elixieren oder flüssigen Lösungen eingesetzt werden. Das Vakzin kann mit einem immunologisch annehmbaren Träger formuliert werden.
Die Vakzine werden in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht, d. h., in ausreichenden Mengen, um eine immunologisch schützende Reaktion hervorzurufen. Die therapeutisch wirksame Menge kann entsprechend dem PV-Typ variieren. Das Vakzin kann in Einzeldosen oder mehreren Dosen verabreicht werden.
Es ist bekannt, daß es ein erhebliches Maß an Redundanz in den verschiedenen Codons gibt, welche für spezielle Aminosäuren kodieren. Deshalb betrifft diese Erfindung auch diejenigen DNA-Sequenzen, welche alternative Codons enthalten, die für die schließliche Translation der identischen Aminosäure kodieren. Für die Zwecke dieser Patentbeschreibung wird eine Sequenz, die ein oder mehrere ersetztes) Codons) trägt, als Degenerationsvariante definiert werden. Ebenfalls vom Umfang dieser Erfindung umfaßt sind Mutationen in der DNA-Sequenz, welche die schließlichen physikalischen Eigenschaften des exprimierten Proteins nicht wesentlich ändern. Beispielsweise mag eine Substitution von Leucin durch Valin, Lysin durch Arginin oder Glutamin durch Asparagin keine Veränderung der Funktionalität des Polypeptids verursachen.
Es ist bekannt, daß DNA-Sequenzen, die für ein Peptid kodieren, verändert werden können, so daß sie für ein Peptid mit Eigenschaften kodieren, welche sich von denjenigen des in der Natur vorkommenden Peptids unterscheiden. Verfahren zur Veränderung der DNA-Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, stellengerichtete Mutagenese.
Die klonierte HPV6/11-DNA oder Fragmente davon, welche mit den hier beschriebenen Verfahren erhalten wurde(n), kann/können durch molekulare Klonierung in einen Expressionsvektor, der einen geeigneten Promotor und andere geeignete regula torische Transkriptionselemente enthält, rekombinant exprimiert werden und in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen überführt, um rekombinantes HPV11 zu bilden. Techniken für solche Manipulationen werden vollständig in Sambrook, J., et al., oben, beschrieben und sind im Stand der Technik bekannt.
Expressionsvektoren sind hier definiert als DNA-Sequenzen, welche für die Transkription klonierter Kopien von Genen und die Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können zur Expression eukaryotischer Gene in einer Vielfalt von Wirten, wie z. B. Bakterien, blaugrünen Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen und Tierzellen, eingesetzt werden. Speziell konstruierte Vektoren erlauben das Shuttling von DNA zwischen Wirten wie Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen oder Bakterien-Pilzzellen oder Bakterien-Invertebratenzellen. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für autonome Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine begrenzte Anzahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl und aktive Promotoren. Ein Promotor ist definiert als eine DNA-Sequenz, welche RNA-Polymerase zur Bindung an DNA und zur Initiierung von RNA-Synthese veranlaßt. Ein starker Promotor ist einer, welcher die Initiierung von mRNAs mit hoher Frequenz veranlaßt. Expressionsvektoren können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, speziell konstruierte Plasmide oder Viren.
Eine Vielzahl von Säuger-Expressionsvektoren kann zur Expression von HPV6/11-DNA oder von Fragmenten davon in Säugerzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Säuger-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante HPV6/11-DNA-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) und λZD35 (ATCC 37565).
Eine Vielfalt von bakteriellen Expressionsvektoren kann zur Expression von HPV6/11-DNA oder von Fragmenten davon in Bakterienzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche bakterielle Expressionsvektoren, welche für die rekombinante HPV6/11-DNA-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pET11a (Novagen), Lambda gt11 (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).
Eine Vielzahl von Pilzzell-Expressionsvektoren kann zur Expression von HPV6/11 oder von Fragmenten davon in Pilzzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Pilzzell-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante HPV6/11-DNA-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pYES2 (Invitrogen), Pichia-Expressionsvektor (Invitrogen) und Hansenula-Expression (Rhein Biotech, Düsseldorf, Deutschland).
Eine Vielzahl von Insektenzell-Expressionsvektoren kann zur Expression von HPV6/11-DNA oder von Fragmenten davon in Insektenzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Insektenzell-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante Expression von HPV6/11-DNA geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pBlueBac III (Invitrogen).
Ein Expressionsvektor, der HPV 6/11-DNA oder Fragmente davon enthält, kann zur Expression von HPV11-Proteinen oder Fragmenten von HPV11-Proteinen in einer Zelle, einem Gewebe, Organ oder Lebewesen eingesetzt werden. Ein Lebewesen, wie hier verwendet, schließt Menschen ein. Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterien wie E. coli, Pilzzellen wie Hefe, Säugerzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Zellinien von Menschen, Rindern, Schweinen, Affen und Nagetieren, und Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Drosophila und von Seidenraupen abgeleitete Zellinien. Zellinien, die sich von Säugerspezies ableiten, welche geeignet sein mögen und im Handel erhältlich sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, L-M(TK)-L-Zellen, (ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171).
Der Expressionsvektor kann in Wirtszellen mit irgendeiner aus einer Vielzahl von Techniken eingeführt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Transformation, Transfektion, Lipofektion, Protoplastenfusion und Elektroporation. Die Zellen, welche Expressionsvektor enthalten, werden klonal vermehrt und individuell analysiert, um festzustellen, ob sie HPV11-Protein produzieren. Die Identifizierung von HPV11-exprimierenden Wirtszellklonen kann auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, immunologische(n) Reaktivität mit Anti-HPV11-Antikörpern.
Die Expression von HPV-DNA-Fragmenten kann auch mit Hilfe von in vitro hergestellter synthetischer mRNA oder nativer mRNA durchgeführt werden. Synthetische mRNA oder aus Zellen, die HPV6/11-Hybrid-DNA exprimieren, isolierte mRNA kann sowohl effizient in verschiedenen zellfreien Systemen translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Weizenkeimextrakte und Retikulozytenextrakte, als auch effizient in Systemen auf Zellbasis translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Mikroinjektion in Frosch-Oozyten, wobei die Mikroinjektion in Frosch-Oozyten bevorzugt ist.
Es werden hier Verfahren zum Screening hinsichtlich Verbindungen, welche die Expression von DNA oder RNA, kodierend für HPV, sowie die Funktionen) von HPV11-Protein in vivo modulieren, offenbart. Verbindungen, welche diese Aktivitäten modulieren, können DNA, RNA, Peptide, Proteine oder nicht-proteinhaltige organische Moleküle sein. Die Verbindungen können durch Erhöhung oder Abschwächung der Expression von DNA oder RNA, kodierend für HPV11, oder der Funktion des HPV11-Proteins modulieren. Verbindungen, welche die Expression von DNA oder RNA, kodierend für HPV11, oder die Funktion von HPV11-Protein modulieren, können mit einer Vielfalt von Assays nachgewiesen werden. Der Assay kann ein einfacher "Ja/Nein"-Assay sein, um festzustellen, ob es eine Veränderung in der Expression oder Funktion gibt. Der Assay kann durch Vergleich der Expression oder Funktion einer Testprobe mit den Niveaus der Expression oder Funktion in einer Standardprobe quantitativ gemacht werden.
Es können Kits hergestellt werden, welche HPV6/11-Hybrid-DNA, Fragmente von HPV6/11-Hybrid-DNA, Antikörper gegen HPV6/11-DNA oder HPV11-Protein, HPV6/11-Hybrid-RNA oder HPV11-Protein enthalten. Solche Kits werden zum Nachweis von DNA eingesetzt, welche mit HPV6/11-DNA hybridisiert, oder zum Nachweis der Anwesenheit von HPV11-Protein oder Peptidfragmenten in einer Probe. Eine solche Charakterisierung ist für eine Vielzahl von Zwecken von Nutzen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, gerichtsmedizinische Analysen und epidemiologische Studien.
Nukleotidsequenzen, welche zu der HPV6/11-DNA-Sequenz komplementär sind, können für eine Antisense-Therapie synthetisiert werden. Diese Antisense-Moleküle können DNA, stabile Derivate von DNA, wie z. B. Phosphorothioate oder Methylphosphonate, RNA, stabile Derivate von RNA, wie z. B. 2'-O-Alkyl-RNA oder andere HPV6/11-Antisense-Oligonukleotid-Mimetika sein. HPV6/11-Antisense-Moleküle können durch Mikroinjektion, Liposomenverkapselung oder durch Expression von Vektoren, welche die Antisense-Sequenz beherbergen, in Zellen eingeführt werden. Eine HPV6/11-Antisense-Therapie kann insbesondere für die Behandlung von Krankheiten geeignet sein, bei denen es von Vorteil ist, die HPV11-Aktivität zu verringern.
Der Begriff "chemisches Derivat" beschreibt ein Molekül, welches zusätzliche chemische Gruppierungen enthält, die normalerweise nicht Teil des Grundmoleküls sind. Solche Gruppierungen können die Löslichkeit, Halbwertszeit, Absorption etc. des Grundmoleküls verbessern. Alternativ können die Gruppierungen unerwünschte Nebenwirkungen des Grundmoleküls abschwächen oder die Toxizität des Grundmoleküls verringern. Beispiele solcher Gruppierungen werden in einer Vielfalt von Texten, wie z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, beschrieben.
Verbindungen, die nach den hier offenbarten Verfahren identifiziert wurden, können allein in geeigneten Dosierungen eingesetzt werden, welche durch Routinetests festgelegt wurden, um eine optimale Inhibierung des HPV11 oder dessen Aktivität zu erhalten, während eine etwaige potentielle Toxizität minimiert wird. Darüber hinaus kann eine gemeinsame oder sequenzielle Verabreichung anderer Mittel wünschenswert sein.
Vorteilhafterweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer einzigen Dosis verabreicht werden oder die gesamte Dosis kann in mehreren aufgeteilten Dosen verabreicht werden. Ferner können Verbindungen für die vorliegende Erfindung über eine Vielfalt von Routen verabreicht werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, intranasal, transdermal, mittels Zäpfchen und oral.
Für eine Kombinationsbehandlung mit mehr als einem Wirkstoff, wobei die Wirkstoffe in separaten Dosierungsformulierungen vorliegen, können die Wirkstoffe gleichzeitig verabreicht werden oder sie können jeweils zu separaten versetzten Zeiten verabreicht werden.
Der Dosierungsplan unter Anwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird entsprechend einer Vielfalt von Faktoren ausgewählt, welche Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischen Zustand des Patienten, die Schwere des zu behandelnden Krankheitszustands, den Verabreichungsweg, die Nieren- und Leberfunktion des Patienten und die speziell eingesetzte Verbindung einschließen. Ein durchschnittlich befähigter Arzt kann unschwer die wirksame Menge des Arzneiwirkstoffes, welche zur Verhinderung, Entgegenwirkung oder zum Stillstandbringen des Krankheitsfortschritts erforderlich ist, feststellen und verschreiben. Eine optimale Präzision bei der Erzielung von Arzneiwirkstoffkonzentrationen innerhalb des Bereichs, der eine Wirksamkeit ohne Toxizität ergibt, erfordert einen Plan, der auf der Kinetik der Verfügbarkeit des Arzneiwirkstoffs für Zielstellen basiert. Dies beinhaltet eine Berücksichtigung der Verteilung, des Gleichgewichts und der Eliminierung eines Arzneiwirkstoffs.
Die hier detailliert beschriebenen Verbindungen können den aktiven Bestandteil bilden und können in Mischung mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Exzipienten oder Trägern verabreicht werden (hier zusammen als "Träger"-Materialien bezeichnet), die in geeigneter Weise in Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsform, d. h., orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirup, Zäpfchen, Gele und dgl., und in Einklang mit herkömmlicher pharmazeutischer Praxis ausgewählt sind.
Beispielsweise kann für die orale Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel die aktive Wirkstoffkomponente mit einem oralen, nicht-toxischen, pharmazeutisch annehmbaren inerten Träger, wie z. B. Ethanol, Glycerin oder Wasser, kombiniert werden. Darüber hinaus können erforderlichen- oder gewünschtenfalls geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Desintegrationsmittel und Färbemittel ebenfalls in die Mischung eingeschlossen werden.
Geeignete Bindemittel umfassen, ohne Beschränkung, Stärke, Gelatine, natürliche Zucker wie Glucose oder Beta-Lactose, Maissüßstoffe, natürliche und synthetische Gummiarten wie Akaziengummi, Tragant, Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol und Wachse. Gleitmittel, welche in diesen Dosierungsformen verwendet werden, umfassen, ohne Beschränkung, Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat und Natriumchlorid. Desintegrationsmittel umfassen, ohne Beschränkung, Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit und Xanthangummi.
Für flüssige Formen kann die aktive Wirkstoffkomponente mit in geeigneter Weise aromatisierten Suspendier- oder Dispergiermitteln kombiniert werden, wie z. B. den synthetischen und natürlichen Gummiarten, z. B. Tragant, Akaziengummi und Methylcellulose. Andere Dispergiermittel, welche eingesetzt werden können, umfassen Glycerin und dgl. Für die parenterale Verabreichung sind sterile Suspensionen und Lösungen erwünscht. Isotonische Präparate, welche im allgemeinen geeignete Konservierungsmittel enthalten, werden eingesetzt, wenn eine intravenöse Verabreichung erwünscht ist.
Topische Präparate, welche die aktive Wirkstoffkomponente enthalten, können mit einer Vielfalt von Trägermaterialien gemischt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie z. B. Alkohole, Aloe Vera-Gel, Allantoin, Glycerin, Vitamin A- und -E-Öle, Mineralöl, PPG2-Myristylpropionat und dgl., um beispielsweise alkoholische Lösungen, topische Reiniger, Reinigungscremes, Hautgele, Hautlotions und Shampoos in Creme- oder Gel-Formulierungen zu bilden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Form von Liposomen-Abgabesystemen verabreicht werden, wie z. B. kleinen unilamellaren Vesikeln, großen unilamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln. Liposomen können aus einer Vielfalt von Phospholipiden, wie z. B. Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen, gebildet werden.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern als individuelle Träger, an welche die Verbindungsmoleküle gekoppelt sind, verabreicht werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch mit löslichen Polymeren als zielgerichtete Arzneiwirkstoffträger gekoppelt werden. Solche Polymere können Polyvinylpyrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartatamidphenol oder Polyethylenoxidpolylysin, substituiert mit Palmitoyl-Resten, einschließen. Ferner können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung an eine Klasse von biologisch abbaubaren Polymeren angekoppelt werden, die zur Erreichung einer kontrollierten Freisetzung eines Arzneiwirkstoffs geeignet sind, wie z. B. Polymilchsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydro pyrane, Polycyanoacrylate und vernetzte oder amphipathische Block-Copolymere von Hydrogelen.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung.
BEISPIEL 1
Konstruktion des synthetischen L1-Gens
Der offene Leserahmen von 1,5 kbp von HPV11-L1 wurde konstruiert unter Verwendung synthetischer DNA-Oligomere, die von Midland Reagent Company bezogen wurden. Diese Oligomere wurden mit 5'-terminalen Phosphaten geliefert. Insgesamt waren 24 Oligomere erforderlich und sind unten aufgelistet:
Oligomere, die komplementäre Paare bilden (#241-1 und #241-24, #241-2 und #241-23, #241-3 und #241-22, #241-4 und #241-21, #241-5 und #241-20, #241-6 und #241-19, #241-7 und #241-18, #241-8 und #241-17, #241-9 und #241-16, #241-10 und #241-15, #241-11 und #241-14, #241-12 und #241-13, 1), wurden in separaten Röhrchen, enthaltend 2,5 mM Tris, pH 7,5, 0,25 mM EDTA, verschmolzen. Die Röhrchen wurden 4 Minuten lang auf 98°C erwärmt und dann in 200 ml Wasser von 98°C in einem 250-ml-Becherglas gestellt, um langsam abzukühlen. Als das Wasser auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurden die verschmolzenen Paare Röhrchen wie angegeben zugegeben: Fragment A (Oligomerpaare #241-1 & -24 und -2 & -23); Fragment B (#241-3 & -22, -4 & -21, -5 & -20 und -6 & -19); Fragment C (#241-7 & -18, -8 & -17, -9 & -16 und -10 & -15) und Fragment D (#241-11 & -14 und -12 & -13). Diese Oligomerpaar-Mischungen wurden 2 Minuten lang auf 62°C erwärmt und dann langsam wie zuvor abgekühlt. Die Inhalte eines jeden Röhrchens wurden über Nacht bei 23°C unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim, Inc.) und den vom Hersteller zur Verfügung gestellten Reagenzien ligiert.
Nach der Ligierung benötigte das Fragment B eine PCR-Amplifizierung, um die Menge an Vollängen-Produkt zu erhöhen. Dies erforderte 10 Zyklen von 94°C, 1 Min.; 48°C, 1 Min.; 72°C, 1 Min., gefolgt von 10 Min. bei 72°C, in einem Applied Biosystems Thermocycler unter Verwendung von Boehringer Mannheim Taq-Polymerase und den Oligomer-Primern:
Die ligierten Produkte und das PCR-Produkt von Fragment B wurden mit Restriktionsenzymen (Boehringer Mannheim, Inc.) wie folgt verdaut: Das Fragment A wurde mit BglII und SphI verdaut; Fragment B, SphI und KpnI; Fragment C, KpnI und XhoI; und Fragment D, XhoI und BglII. Die verdauten Fragmente wurden auf Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC BioProducts) aufgetrennt und Fragmente mit der richtigen Größe durch Ausschneiden der Bande und Verdauung der Agarose mit Agarase^TM (Boehringer Mannheim, Inc.), wie vom Hersteller empfohlen, isoliert. Die Fragmente A, B und D wurden durch Ethanolfällung gewonnen und dann separat in den Vektor pSP72 (Promega, Inc.) ligiert, der gleichermaßen mit Restriktionsenzymen verdaut worden war, um dem jeweiligen Fragment, das ligiert wurde, zu entsprechen.
Das KpnI-XhoI-verdaute Fragment C wurde zuerst mit den verschmolzenen Oligomeren
5' TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACAC 3' (SEQ-ID-NR. 27) und
5' TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCT 3' (SEQ-ID-NR. 28) ligiert.
Das Fragment C wurde dann erneut mit XhoI gespalten und das KpnI-XhoI-Fragment von 450 bp wurde mit dem KpnI, Xho-I-verdauten Vektor pSP72 ligiert. Die Ligierungsmischungen wurden zur Transformation kompetenter Zellen des Escherichia coli-Stammes DH5 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) eingesetzt. Die Transformanten wurden hinsichtlich Klone, die Inserts enthielten, durch Koloniehybridisierung (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) gescreent. Plasmid-DNA wurde aus den positiven Klonen mit Hilfe eines Wizard Miniprep-Kits (Promega Corp.) isoliert und dann mit Hilfe eines Applied Biosystems 373A-DNA-Sequenzierer sequenziert. Klone, welche die korrekte DNA-Sequenz für jedes der vier Fragmente enthielten, wurden wie zuvor verdaut, um die Fragmente aus dem pSP72-Vektor freizusetzen. Das mit KpnI, XhoI-verdaute Fragment C wurde mit dem XhoI, BglII-verdauten Fragment D und KpnI, BglII-gespaltenen pSP72 in einer Dreifachligierung ligiert. Die Ligierungsprodukte wurden dann zur Transformation von E. coli eingesetzt. Die resultierenden Transformanten wurden sequenziert und ein Klon der korrekten Sequenz erhalten (als CD bezeichnet). Das 750-bp-BglII-KpnI-Insert von CD wurde erneut aus dem pSP72-Vektor gespalten und mit BglII, SphI-verdautem Fragment A und SphI, KpnI-verdautem Fragment B in einer Dreifachligierung ligiert wie zuvor, mit Ausnahme dessen, daß BglII zugegeben wurde, um unerwünschte Ligierungsprodukte zu vermindern. Die Ligierungsprodukte wurden auf Agarosegelen aufgetrennt, das 1,5-kpb-Fragment wurde isoliert und als D361-1 bezeichnet.
BEISPIEL 2
Vergleich von Sequenzen
Ein Vergleich der Nukleotidsequenz für die HPV6/11-Hybrid-, HPV6a- und HPV11-L1-DNA-Sequenzen ist in 2 gezeigt. Es gibt insgesamt 55 Nukleotidsubstitutionen, die in der HPV6-Gerüstsequenz vorgenommen wurden, um sie in einen für HPV11 kodierenden Translationsrahmen zu überführen. Darüber hinaus wurden drei Basenpaarinsertionen bei #411-413 bp hinzugefügt, um für die zusätzliche Aminosäure (Tyrosin¹³²) zu kodieren, welche in HPV11, nicht jedoch in HPV6, gefunden wird. Zusammen erlauben diese Veränderungen dem für Typ 11 spezifischen, konformationsabhängigen, neutralisierenden monoklonalen Antikörper (Chemicon 8740 MAb), an das L1-Protein der HPV6/11-L1-DNA zu binden, das in Hefe exprimiert wird. Dies legt nahe, daß das Protein von dem HPV6/11-Hybridgen immunologisch von nativem HPV11 nicht unterscheidbar zu sein scheint.
Ein Vergleich der HPV6/11-Hybrid-DNA-Sequenz mit der veröffentlichten HPV11-L1-Sequenz zeigt 194 Basenpaarsubstitutionen. Es gibt eine beträchtliche Anzahl Substitu tionen im Vergleich zur Wildtyp 11-L1-Sequenz, wovon irgendeine Kombination davon oder alle Veränderungen insgesamt für die erhöhte Typ 11-L1-Proteinexpression in Hefe verantwortlich sein mögen.
BEISPIEL 3
DNA-Sequenzierung des L1-Gens
Das HPV6/11-L1-Gen wurde mit Hilfe eines Applied Biosystems DNA-Sequenzierers #373A mit Farbstoffterminator-Sequenzierungsreaktionen (PRIZM^TM Sequencing Kit) wie vom Hersteller (ABI, Inc., Foster City, CA) angegeben sequenziert.
BEISPIEL 4
Konstruktion von HPV6/11-L1-, HPV11-L1- und HPV6-L1-Hefe-Expressionsvektoren
Der Hefe-Expressionsvektor pGAL1-10 wurde konstruiert durch Isolierung eines 1,4-kbp-SphI-Fragments aus einem bidirektionalen GAL-Promotor-pUC18-Plasmid, welches die divergenten Saccharomyces cerevisiae-GAL1-GAL10-Promotoren aus dem Plasmid pBM272 enthält (bereitgestellt von Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). Die divergenten Promotoren sind auf jeder Seite von einer Kopie des Hefe-ADH1-Transkriptionsterminators (Bennetzen, J. L., und Hall, B. D., 1982, J. Biol. Chem. 257: 3018–3025), einer zwischen dem GAL1-Promotor und der ersten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators gelegenen BamHI-Klonierungsstelle und einer zwischen dem GAL10-Promotor und der zweiten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators gelegenen SmaI-Klonierungsstelle flankiert. Ein Hefe-Shuttle-Vektor, bestehend aus pBR322, dem Hefe-LEU2d-Gen (Erhart, E., und Hollenberg, C. P., 1983, J. Bacteriol. 156: 625–635) und dem Hefe-2μ-Plasmid (Gabe von Benjamin Hall, University of Washington, Seattle, WA) (Broach, J. R., und Volkert, F. C., 1991, Circular DNA Plasmids of Yeasts, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) wurde mit SphI gespalten und mit dem 1,4-kbp-SphI-Fragment mit dem divergenten GAL-Promotor ligiert, was pGAL1-10 ergab (3).
Die HPV6/11-Hybrid-L1-DNA, kodierend für das HPV11-L1-Protein (Probe D361-1 aus Beispiel 1), enthält eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz (Kniskern, P. J., et al., 1986, Gene 46: 135–141) unmittelbar stromaufwärts des HPV6/11-L1-Initiations-Methionin-Codons. Das Plasmid pGAL1-10 wurde mit BamHI linearisiert, welches zwischen dem GAL1-Promotor und dem ADH1-Transkriptionsterminator spaltet, und mit dem HPV6/11-L1-Genfragment von 1,5 kbp (Probe D361-1) ligiert. Transformanten von E. coli DH5 (Gibco BRL, Inc.) wurden gescreent und ein pGAL1-10-Plasmid, enthaltend das HPV6/11-L1-Gen, wurde isoliert und als D362-1 bezeichnet.
Die Wildtyp-HPV11 (Wt-HPV11)-DNA wurde aus einer Condyloma-acuminatum-Läsion (freundliche Gabe von Dr. Darron Brown) kloniert. Genomische Human-Gesamt-DNA wurde extrahiert und mit Restriktionsendonukleasen verdaut. Die Fraktion, welche Wt-HPV11-DNA enthielt, wurde in einen E. coli-Klonierungsvektor ligiert, der als Matrize für PCR verwendet werden sollte. Das Wt-HPV11-L1-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung von Vent-Polymerase (New England Biolabs, Inc.), 10 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min., 48°C, 1 Min., 72°C, 1 Min. 45 s) und den folgenden Oligonukleotidprimern, welche flankierende Bgl II-Stellen (unterstrichen) enthalten, amplifiziert:
Der Sense-Primer führt eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz (Kniskern, P. J., et al., 1986, Gene 46: 135–141) unmittelbar stromaufwärts des Wt-HPV11-L1-Initiations-Methionin-Codons (in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das Wt-HPV11-L1-PCR-Produkt von 1,5 kbp wurde mit BglII verdaut, gelgereinigt und mit dem BamHI-verdauten Plasmid pGAL1-10 ligiert, um das Plasmid p329-1 zu ergeben.
Genomische Gesamt-DNA wurde aus einer HPV6a-positiven Condyloma-acuminatum-Läsion (freundliche Gabe von Dr. Darron Brown) extrahiert. Das HPV6a-L1-Gen wurde mittels PCR unter Einsatz der Biopsieproben-DNA als Matrize, von Vent-Polymerase (New England Biolabs, Inc.), 35 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min., 48°C, 1 Min., 72°C, 1 Min. 45 s), des oben angeführten Sense-Primers für die PCR von Wt-HPV11-L1 und eines Antisense-Primers mit der Sequenz
amplifiziert.
Das HPV6a-L1-PCR-Produkt von 1,5 kbp wurde mit BglII verdaut, gelgereinigt und mit dem BamHI-verdauten Plasmid pGAL1-10 ligiert, um das Plasmid D128 zu ergeben.
BEISPIEL 5
Herstellung des Stammes 1558
Schritt a: Herstellung des Hefestammes U9
Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm 2150-2-3 (MATalpha, leu2-04, ade1, cir°) wurde von Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA) erhalten. Zellen des Stammes 2150-2-3 wurden über Nacht bei 30°C in 5 ml YEHD-Medium (Carty et al., J. Ind. Micro. 2 (1987), 117–121) vermehrt. Die Zellen wurden dreimal in sterilem destilliertem Wasser gewaschen, in 2 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und 0,1 ml Zellsuspension wurde auf jede von sechs 5-Fluororotsäure (FOA)-Platten ausplattiert, um hinsichtlich ura3-Mutanten zu selektionieren (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Die Platten wurden bei 30°C inkubiert. Das Medium enthielt auf 250 ml destilliertes Wasser: 3,5 g Difco-Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 0,5 g 5-Fluororotsäure, 25 mg Uracil und 10,0 g Dextrose.
Das Medium wurde mittels Filtration durch 0,2 μm-Membranen sterilisiert und dann mit 250 ml 4%igem Bacto-Agar (Difco), gehalten bei 50°C, 10 ml einer 1,2-mg/ml-Lösung von Adenin und 5 ml L-Leucin-Lösung (180 mg/50 ml) gemischt. Das resultierende Medium wurde mit 20 ml pro Petrischale aufgeteilt.
Nach 5 Tagen Inkubation waren zahlreiche Kolonien erschienen. Einzelkolonien wurden isoliert durch erneutes Ausstreichen von Kolonien von den ursprünglichen FOA-Platten auf frische FOA-Platten, welche dann bei 30°C inkubiert wurden. Eine Anzahl Kolonien von dem zweiten Satz von FOA-Platten wurde hinsichtlich der Anwesenheit der ura3-Mutation durch Replica-Plattierung auf sowohl YEHD-Platten als auch Uracil-Minus-Platten getestet. Das gewünschte Ergebnis war gutes Wachstum auf YEHD- und kein Wachstum auf Uracil-Minus-Medium. Ein Isolat (U9) wurde erhalten, welches diese Eigenschaften zeigte. Es wurde als eingefrorene Glycerinstammlösung (Stamm #325) bei –70°C für die spätere Verwendung gelagert.
Schritt b: Herstellung eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-MNN9-Gens
Zur Herstellung eines Vektors für die Unterbrechung des MNN9-Gens war es erforderlich, zuerst das MNN9-Gen aus genomischer S. cerevisiae-DNA zu klonieren. Dies wurde erreicht durch eine Standard-Polymerasekettenreaktion (PCR)-Technik. Ein 5'-Sense-Primer und ein 3'-Antisense-Primer für die PCR der für MNN9 kodierenden Vollängen-Sequenz wurden auf Grundlage der veröffentlichten Sequenz für das Hefe-MNN9-Gen konstruiert (Zymogenetics: EP-Patentanmeldung Nr. 88 117 834.7, Veröffentlichungsnummer 0-314-096-A2). Es wurden die folgenden Oligodesoxynukleotid-Primer eingesetzt, welche flankierende HindIII-Stellen (unterstrichen) enthielten:
Das initiierende Methionincodon für das MNN9-Gen ist in Fettdruck hervorgehoben. Die PCR erfolgte unter Einsatz von genomischer DNA aus dem S. cerevisiae-Stamm JRY188 als Matrize, Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) und 25 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min., 37°C, 2 Min., 72°C, 3 Min.). Das resultierende 1,2-kbp-PCR-Fragment wurde mit HindIII verdaut, gelgereinigt und mit HindIII-verdautem, mit alkalischer Phosphatase behandeltem pUC13 (Pharmacia) ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als p1183 bezeichnet.
Zur Unterbrechung des MNN9-Gens mit dem Hefe-URA3-Gen wurde das Plasmid pBR322-URA3 (welches das 1,1-kbp-HindIII-Fragment, kodierend für das S. cerevisiae-URA3-Gen, subkloniert in die HindIII-Stelle von pBR322 enthält) mit HindIII verdaut und das 1,1-kbp-DNA-Fragment, welches das funktionelle URA3-Gen trug, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann mit dem PmlI-verdauten Plasmid p1183 (PmlI spaltet innerhalb der für MNN9 kodierenden Sequenz) ligiert. Das resultierende Plasmid p1199 enthält eine Unterbrechung des MNN9-Gens durch das funktionelle URA3-Gen.
Schritt c: Konstruktion des U9-Derivat-Stammes 1372 welcher eine Unterbrechung des MNN9-Gens enthält
Zur Unterbrechung des MNN9-Gens in dem Stamm U9 (#325) wurden 30 μg des Plasmids p1199 mit HindIII verdaut, um eine lineare mnn9::URA3-Unterbrechungskassette zu schaffen. Zellen des Stamms 325 wurden mit der HindIII-verdauten p1199-DNA nach dem Sphäroplasten-Verfahren (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929–1933) transformiert und Transformanten wurden auf einem synthetischen Agarmedium, dem Uracil fehlte und das 1,0 M Sorbit enthielt, selektioniert. Das synthetische Medium enthielt pro Liter destilliertes Wasser: Agar, 20 g, Hefe-Stickstoffbase w/o Aminosäuren, 6,7 g, Adenin, 0,04 g, L-Tyrosin, 0,05 g, Sorbit, 182 g, Glucose, 20 g, und Leucin-Minus-Lösung #2, 10 ml. Leucin-Minus-Lösung #2 enthält pro Liter destilliertes Wasser: L-Arginin, 2 g, L-Histidin, 1 g, L-Leucin, 6 g, L-Isoleucin, 6 g, L-Lysin, 4 g, L-Methionin, 1 g, L-Phenylalanin, 6 g, L-Threonin, 6 g, L-Tryptophan, 4 g.
Die Platten wurden bei 30°C fünf Tage lang inkubiert, zu welchem Zeitpunkt zahlreiche Kolonien erschienen waren. Chromosomale DNA-Präparationen wurden von 10 Kolonien hergestellt und dann mit EcoRI plus HindIII verdaut. Die DNA-Verdauungen wurden dann mittels Southernblots (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) unter Verwendung des 1,2-kbp-HindIII-Fragments, welches das MNN9-Gen trägt (isoliert aus dem Plasmid p1199), als Sonde beurteilt. Ein Isolat wurde identifiziert (Stamm #1372), welches die erwarteten DNA-Banden- Verschiebungen auf dem Southernblot sowie die extreme Klumpigkeit zeigte, die typischerweise von mnn9-Mutanten gezeigt wird.
Schritt d: Konstruktion eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-HIS3-Gens
Zur Konstruktion einer Unterbrechungskassette, bei der das S. cerevisiae-HIS3-Gen durch das URA3-Gen unterbrochen wird, wurde das Plasmid YEp6 (K. Struhl et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76: 1035) mit BamHI verdaut und das 1,7-kbp-BamHI-Fragment, welches das HIS3-Gen trägt, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit pUC18 ligiert, welches zuvor mit BamHI verdaut und mit T4-DNA-Polymerase behandelt worden war. Das resultierende Plasmid (als p1501 oder pUC18-HIS3 bezeichnet) wurde mit NheI verdaut (welches innerhalb der für HIS3 kodierenden Sequenz spaltet) und das Vektorfragment wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase behandelt. Das URA3-Gen wurde aus dem Plasmid pBR322-URA3 durch Verdauung mit HindIII isoliert und das 1,1-kbp-Fragment, welches das URA3-Gen trug, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit dem obigen pUC18-HIS3-NheI-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid (als pUC18-his3::URA3 oder p1505 bezeichnet) enthält eine Unterbrechungskassette, bei der das Hefe-HIS3-Gen durch das funktionelle URA3-Gen unterbrochen ist.
Schritt e: Konstruktion eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-PR81-Gens durch das HIS3-Gen
Das Plasmid FP8ΔH, welches das S. cerevisiae-PRB1-Gen trägt, wurde von Dr. E. Jones von der Carnegie-Mellon University (C. M. Moehle et al., 1987, Genetics 115: 255–263) zur Verfügung gestellt. Es wurde mit HindIII plus XhoI verdaut und das 3,2-kbp-DNA-Fragment, welches das PR81-Gen trug, wurde gelgereinigt und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das Plasmid pUC18 wurde mit BamHI verdaut, gelgereinigt und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das resultierende Vektorfragment wurde mit dem obigen PR81-Gen-Fragment ligiert, um das Plasmid pUC18-PRB1 zu ergeben. Das Plasmid YEp6, welches das HIS3-Gen enthält, wurde mit BamHI verdaut. Das resultierende 1,7-kbp-BamHI-Fragment, welches das funktionelle HIS3-Gen trägt, wurde gelgereinigt und dann durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das Plasmid pUC18-PRB1 wurde mit EcoRV plus NcoI verdaut, welches innerhalb der für PRB1 kodierenden Sequenz spaltet und die aktive Stelle der Protease B und flankierende Sequenz entfernt. Das 5,7-kbp-EcoRV-NcoI-Fragment, welches die restlichen 5'- und 3'-Abschnitte der für PR81 kodierenden Sequenz in pUC18 trägt, wurde gelgereinigt, durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht, mit alkalischer Kalbsdarm-Phos phatase dephosphoryliert und mit dem oben beschriebenen glattendigen HIS3-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid (als pUC18-prbI::HIS3 bezeichnet, Stamm #1245) enthält das funktionelle HIS3-Gen anstelle des PR81-Gen-Abschnitts, welcher oben deletiert worden war.
Schritt f: Konstruktion eines U9-verwandten Hefestammes, der Unterbrechungen sowohl des MNN9- als auch des PR81-Gens enthält
Der U9-verwandte Stamm 1372, welcher eine MNN9-Gen-Unterbrechung enthält, wurde in Beispiel 5c beschrieben. Klonale Isolate des Stammes 1372 wurden einer Passage auf FOA-Platten (wie in Beispiel 5a beschrieben) unterworfen, um ura3-Mutanten zu selektionieren. Eine Anzahl von ura3-Isolaten des Stammes 1372 wurde erhalten und ein spezielles Isolat (Stamm 12930-190-S1-1) wurde für die nachfolgende Unterbrechung des HIS3-Gens ausgewählt. Der pUC18-his3::URA3-Genunterbrechungsvektor (p1505) wurde mit XbaI plus EcoRI verdaut, um eine lineare his3:: URA3-Unterbrechungskassette zu schaffen, und zur Transformation des Stammes 12930-190-S1-1 nach dem Lithiumacetatverfahren (Methods in Enzymology, 194: 290 (1991)) verwendet. Ura⁺-Transformanten wurden auf synthetischem Agarmedium ohne Uracil selektioniert, für klonale Isolate auf demselben Medium erneut ausgestrichen und dann auf Medium, dem entweder Uracil oder Histidin fehlte, replikaplattiert, um hinsichtlich derjenigen Isolate zu screenen, welche sowohl Ura⁺ als auch His^– waren. Ein Isolat (Stamm 12930-230-1) wurde für die anschließende Unterbrechung des PR81-Gens ausgewählt. Der PR81-Genunterbrechungsvektor (pUC18-prb1::HIS3, Stamm # 1245) wurde mit SacI plus XbaI verdaut, um eine lineare prb1::HIS3-Unterbrechungskassette zu schaffen, und zur Transformation des Stammes 12930-230-1 nach dem Lithiumacetat-Verfahren eingesetzt. His⁺-Transformanten wurden auf Agarmedium ohne Histidin selektioniert und auf demselben Medium für klonale Isolate erneut ausgestrichen. Genomische DNA wurde aus einer Reihe der resultierenden His⁺-Isolate präpariert, mit EcoRI verdaut und dann auf 0,8%igen Agarosegelen elektrophoresiert. Southernblot-Analysen erfolgten dann mit Hilfe einer radioaktiv markierten 617-bp-Sonde für das PR81-Gen, welche mittels PCR mit Hilfe der folgenden Oligodesoxynukleotid-Primer hergestellt worden war:
Es wurden 11 Isolate erhalten, welche die erwartete Hybridisierung der Sonde mit einem prb1::HlS3-DNA-Fragment von 2,44 kbp zeigten. Dies stand im Gegensatz zur Hybridisierung der Sonde mit dem 1,59-kbp-Fragment für das Wildtyp-PR81-Gen. Eines dieser Isolate, enthaltend die gewünschte prb1::HIS3-Unterbrechung, wurde für die weitere Verwendung ausgewählt und als Stamm #1558 bezeichnet.
BEISPIEL 6
Expression von HPV11-L1 und HPV6-L1 in Hefe
Die Plasmide D362-1 (pGAL1-10 + HPV6/11-L1), p329-1 (pGAL1-10 + Wt-HPV11-L1), D128 (pGAL1-10 + HPV6-L1) und pGAL1-10 wurden zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes #1558 (MATα, leu2-04, prb1::HIS3, mnn9::URA3, ade1, cir°) nach dem Sphäroplastenverfahren (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929–1933) eingesetzt. Der mit dem Plasmid D362-1 transformierte Hefestamm #1558 wurde als Stamm #1782 bezeichnet. Für RNA-Studien wurden klonale Hefe-Isolate bei 30°C in YEH-Komplexmedium (Carty of al., 1987, J. Ind. Micro. 2, 117–121), enthaltend 0,1 M Sorbit und entweder 2% Glucose oder Galactose, 26 h lang gezüchtet. Nach Ernten der Zellen wurde Hefe-RNA unter Anwendung des Verfahrens mit heißem saurem Phenol wie beschrieben extrahiert (Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2, Current Protocols, 1993). Für die Proteinanalyse wurden die identischen Isolate bei 30°C in YEH-Komplexmedium, enthaltend 0,1 M Sorbit, 2% Glucose und 2% Galactose, 70 h lang gezüchtet. Nach Ernten der Zellen wurden die Zellpellets mit Glasperlen aufgebrochen und Zellysate hinsichtlich der Expression von HPV11-L1- oder HPV6-L1-Protein durch Immunblot-Analyse analysiert.
BEISPIEL 7
Northernblot-Analyse von in Hefe exprimierten HPV-L1-RNAs
Proben, die 10 μg Gesamt-RNA enthielten, wurden durch Behandlung mit Glyoxal und DMSO (Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, Current Protocols, 1993) denaturiert und einer Elektrophorese durch ein phosphatgepuffertes 1,2%iges Agarosegel unterworfen. Die RNA wurde auf eine Nylonmembran überführt und mit einem ³²P-markierten Oligonukleotid nachgewiesen, das komplementär zu sowohl den HPV11- als auch HPV6-L1-DNA-Sequenzen ist.
Der Northernblot ist in 4 gezeigt. Es wurden keine Banden, welche der erwarteten Größe für Vollängen-HPV-L1-RNA entsprachen, in den Proben nachgewiesen, die auf Glucosemedium gezüchtet worden waren (Spuren 1, 3 und 5). Dies wird erwartet, da Glucose die Transkription von dem Hefe-GAL1-Promotor unterdrückt. Im Gegensatz dazu zeigen Proben, die in Galactosemedium gezüchtet wurden, welches die Transkription von dem GAL1-Promotor induziert, starke HPV-L1-RNA-Signale. Das HPV6-L1 wurde als Vollängen-RNA-Spezies transkribiert (Spur 2), während die Mehrheit des Wildtyp (Wt)-HPV11-L1 als verkürzte Form transkribiert wurde (Spur 4). Dieses Ergebnis legte nahe, daß ein Hefe- Transkriptionsterminationssignal sich innerhalb des Wt-HPV11-L1-ORF befindet, jedoch nicht in der HPV6-L1-Sequenz vorliegt. Die RNA, die von dem HPV6/11-Hybridgen transkribiert wird, scheint vollständiger Länge zu sein (Spur 6). Keine HPV-spezifische RNA wird in der pGAL1-10-Kontrollhefeprobe nachgewiesen (Spur 7).
BEISPIEL 8
Western-Analyse von in Hefe exprimierten HPV-L1-Proteinen
Proben, die 20 μg zelluläres Gesamtprotein enthielten, wurden durch 10%ige Tris-Glycin-Gele (Novex, Inc.) unter denaturierenden Bedingungen elektrophoresiert und auf Nitrocellulosefilter elektrogeblottet. L1-Protein wurde unter Verwendung von Kaninchen-Antiserum, das gegen ein trpE-HPV11-L1-Fusionsprotein induziert worden war, als primärer Antikörper (Brown, D. R., et al., 1994, Virology 201: 46–54) und an Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppeltes Anti-Kaninchen-EseI-IgG (Amersham, Inc.) als sekundärer Antikörper immunologisch nachgewiesen. Die Filter wurden mit Hilfe des chemolumineszierenden ECL^TM-Detection Kit (Amersham, Inc.) aufgearbeitet. Eine L1-Proteinbande von 50–55 kD wurde in allen Proben mit Ausnahme der negativen pGAL1-10-Kontrolle (Spur 4) nachgewiesen (5). Ferner scheint die Menge an HPV11-L1-Protein, die von dem HPV6/11-Hybridgen exprimiert wird (Spur 3), ~10fach größer zu sein als die Menge an L1-Protein, die von entweder dem Wt-HPV11-Gen (Spur 2) oder dem HPV6-L1-Gen (Spur 1) exprimiert wird.
BEISPIEL 9
ELISA von in Hefe exprimierten HPV11-L1-VLPs
Ein ELISA wurde eingesetzt, um relative Mengen an VLPs zu bestimmen, welche aus Hefeklonen hergestellt wurden, die entweder Wt-HPV11 oder das HPV6/11-Hybrid exprimierten. Der ELISA wurde auch verwendet, um zu zeigen, daß ein Konformationsepitop, das zu stark neutralisierenden Antikörperreaktionen führt, auf den VLPs erhalten blieb, die sich von der HPV6/11-Hybrid-DNA ableiteten. Dieses Konformationsepitop wurde durch den monoklonalen Antikörper H11.B2 (Christensen et al., 1990, J. Virol. 64, 5678–5681) definiert, welcher von Chemicon International (Temecula, CA) als Chemicon Mab8740 erhältlich ist.
In Kürze, Mulden von ELISA-Platten (Maxisorb, Nunc Inc., Naperville, IL) wurden mit abnehmenden Mengen an Hefe-Gesamtprotein, enthaltend die HPV6111- (Hybrid) oder Wt-HPV11-VLPs in 100 μl PBS, beschichtet. CsCl-gereinigte Wt-HPV11-Virionen (eine großzügige Gabe von Dr. D. Brown) und Kontroll-Hefeprotein wurden als Kontrollen eingesetzt. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert, bevor abgesaugt und die Platten mit 250 μl 10%iger Trockenmilch (Carnation) in TTBS (50 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 2 h lang bei Raumtemperatur blockiert wurden. Die Platten wurden einmal mit PBS/0,1% Tween 20 gewaschen, bevor die Mulden mit 100 μl einer 1 : 1000-Verdünnung des monoklonalen Anti-HPV11-Virionen-Antikörpers Chemicon MAB 8740 in 1%iger Trockenmilch in TTBS für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die Platten wurden dreimal mit PBS/Tween 20 gewaschen und dann mit 100 μl Antimaus-IgG, gekoppelt an alkalische Phosphatase (Kierkegard & Perry, Gaithersburg, MD), in einer Verdünnung von 1 : 1000 in 1 % Milch + TTBS für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden erneut dreimal mit PBS/Tween 20 gewaschen, bevor 100 μl Phosphatasesubstrat (p-Nitrophenylphosphat in Diethanolamin-Puffer) zugegeben wurde. Die Platten wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch die Zugabe von 50 μl 3 N NaOH. Die Platten wurden bei 405 nm in einem ELISA-Plattenlesegerät abgelesen.
Die mittleren OD_405nm-Ablesungen von 2 Mulden, korrigiert um die Hintergrundablesungen, die von Kontroll-Hefeproteinen erhalten wurden, wurden gegen das Gesamthefeprotein in den Mulden graphisch aufgetragen und sind in 6 dargestellt. Der HPV6/11-Hybrid-Hefeklon produzierte im Vergleich zu dem Wt-Klon die mehr als zehnfache Menge an nativen VLPs. Darüber hinaus wird das stark neutralisierende Epitop, das von Chemicon Mab 8740 erkannt wird, auf diesen VLPs gezeigt.
BEISPIEL 10
Elektronenmikroskopische Untersuchungen
Für die EM-Analyse (Structure Probe, West Chester, PA) wurde ein Aliquot einer jeden Probe (rohes geklärtes Lysat oder gereinigte VLPs) auf Kohlenstoff-beschichtete 200-Mesh-Kupfergitter plaziert. Ein Tropfen von 2%iger Phosphorwolframsäure (PTA), pH 7,0, wurde 20 Sekunden lang auf das Gitter plaziert. Das Gitter wurde vor der Transmissionselektronenmikroskop-Untersuchung lufttrocknen gelassen. Die gesamte Mikroskopie wurde mit Hilfe eines JEOL 100CX-Transmissionselektronenmikroskops (JEOL USA, Inc.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV durchgeführt. Die gemachten mikroskopischen Aufnahmen haben eine 100.000fache Endvergrößerung. Wie in 7 gezeigt, wurden VLPs im Größenbereich von 45–55 nm bei allen HPV11-Proben beobachtet, jedoch nicht in Hefe-Kontrollproben.
BEISPIEL 11
Fermentation von HPV6/11-L1 (Stamm #1782)
Das Oberflächenwachstum einer Plattenkultur des Stammes 1782 wurde steril auf ein leucin-freies flüssiges Medium überführt, das (pro Liter) enthielt: 8,5 g Difco-Hefe-Stickstoff- Base ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 0,2 g Adenin, 0,2 g Uracil, 10 g Bernsteinsäure, 5 g Ammoniumsulfat und 0,25 g L-Tyrosin; dieses Medium wurde vor der Sterilisation mit NaOH auf pH 5,0–5,3 eingestellt. Nach Wachstum für 25 h bei 28°C, 250 UpM, auf einem Rotationsschüttler wurden eingefrorene Kulturgefäße vorbereitet durch Zugabe von sterilem Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 17% (Gew./Vol.) vor der Lagerung bei –70°C (1 ml pro Kryogefäß). Das Impfgut für die Fermentation des Stammes 1782 wurde im gleichen Medium (750 ml pro 2-l-Kolben) entwickelt und gestartet durch Überführung der aufgetauten Inhalte von zwei eingefrorenen Kulturgefäßen in die 2-l-Kolben und Inkubation für 25 h bei 28°C, 250 UpM, auf einem Rotationsschüttler. Bei der Fermentation des Stammes 1782 wurde ein Chemap 23 L-Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 18 l nach der Animpfung verwendet. Das verwendete Produktionsmedium enthielt (pro l): 20 g Difco-Hefeextrakt, 10 g Sheffield-HySoy-Pepton, 20 g Glucose, 20 g Galactose; das Medium wurde vor der Sterilisation auf pH 5,3 eingestellt. Der gesamte Inhalt (500 ml) des 2-l-Impfkolbens wurde in den Fermenter überführt, welcher bei 28°C, 9 l Luft pro Minute, 500 UpM, 3,5 psi Druck inkubiert wurde. Die mechanische Bewegung wurde erforderlichenfalls erhöht, um Niveaus an gelöstem Sauerstoff von mehr als 40% Sättigung aufrechtzuerhalten. Der Fortschritt der Fermentation wurde durch Oftline-Glucose-Messungen (Beckman Glucose 2 Analysator) und Online-Massenspektroskopie (Perkin-Elmer 1200) überwacht. Nach 66 h Inkubation wurde eine Zelldichte von 9,32 g Trockenzellgewicht pro Liter erreicht. Die Inhalte zweier solcher Fermentationen (insgesamte 17,5 Bouillon) wurden vor der Zellgewinnung vereinigt. Die Kultur wurde durch Hohlfaserfiltration (Amicon N5MP01-43-Kartusche in einem Amicon DC-10-Filtrationssystem) auf etwa 2 konzentriert, mit 2 l phosphatgepufferter Salzlösung diafiltriert und vor dem Abfüllen in 500-ml-Zentrifugenflaschen weiter konzentriert (auf etwa 1 l). Zellpellets wurden durch Zentrifugation bei 8000 UpM (Sorvall GS3-Rotor) für 20 Minuten bei 4°C gewonnen. Nach Dekantierung des Überstands wurden die Pellets (insgesamt 358 g nasse Zellen) bis zur Verwendung bei –70°C gelagert.
BEISPIEL 12
Reinigung von rekombinanten HPV Typ 11-L1-Kapsidproteinen
Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt, soweit nicht anders angegeben.
Die Zellen wurden bei –70°C eingefroren gelagert. Eingefrorene Zellen (Naßgewicht = 180 g) wurden bei 20–23°C aufgetaut und in 900 ml „Aufbruchpuffer" (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl₂) resuspendiert. Die Proteaseinhibitoren AEBSF und Pepstatin A wurden bis zu Endkonzentrationen von 1 mM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellaufschlämmung wurde bei einem Druck von etwa 16.000 psi durch 4 Passagen in einem M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen. Ein ausreichendes Volumen an 10%igem Triton X100^®-Detergens (Pierce, Rockford, IL) wurde der aufgebrochenen Zellaufschlämmung zugegeben, um die Konzentration an TX100 auf 0,5% zu bringen. Die Aufschlämmung wurde 20 Stunden lang gerührt. Das mit Triton X100 behandelte Lysat wurde mit 12.000 × g 40 Minuten lang zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstandsflüssigkeit, enthaltend L1-Protein, wurde gewonnen.
Die Überstandsflüssigkeit wurde gegen 5 Volumina 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, unter Verwendung einer 300K-Tangentialströmungs-Membrankassette (Filtron, Northborough, MA) diafiltriert. Das von der Membran zurückgehaltene Material wurde mittels Radioimmunoassay und Westernblots befunden, das L1-Protein zu enthalten.
Das Retentat wurde auf eine hochauflösende Affinitätssäule (11,0 cm ID × 5,3 cm) von SP-Spherodex (M)^®-Harz (IBF, Villeneuve-Ia-Garenne, Frankreich), äquilibriert in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, aufgetragen. Nach einem Waschschritt mit Äquilibrierungspuffer und einer Stufenwaschung mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 1,0 M NaCl, wurde das L1-Protein mit einer Stufenwaschung von 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 2,5 M NaCl, eluiert. Fraktionen wurden während der Waschschritte und Elution gesammelt. Die Säulenfraktionen wurden einem Assay hinsichtlich Gesamtprotein nach dem Bradford-Verfahren unterworfen. Die Fraktionen wurden dann durch Westernblots und SDS-PAGE mit kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Fraktionen wurden auch durch Radioimmunoassay analysiert.
SP-Spherodex-Fraktionen, die eine vergleichbare Reinheit und Anreicherung von L1-Protein zeigten, wurden gepoolt.
Das Endprodukt wurde durch Westernblots und SDS-PAGE mit kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Das L1-Protein wurde als > 90% homogen abgeschätzt. Die Identität des L1-Proteins wurde durch Westernblots bestätigt. Das Endprodukt wurde steril durch eine 0,22-μm-Membran filtriert und bei 4°C gelagert. Diese Prozedur führte zu insgesamt 100 mg Protein.
Eine elektronenmikroskopische Analyse wird mittels Structure Probe (West Chester, PA) durchgeführt. Ein Aliquot der Probe wird auf ein kohlenstoffbeschichtetes 200-Mesh-Kupfergitter plaziert. Ein Tropfen von 2%iger Phosphorwolframsäure, pH 7,0, wird 20 Sekunden lang auf das Gitter plaziert. Das Gitter wird vor der TEM-Untersuchung lufttrocknen gelassen. Die gesamte Mikroskopie wird mit Hilfe eines JEOL 100 CX-Transmissionselektronenmikroskops (JEOL USA, Inc.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV durchgeführt. Die gemachten mikroskopischen Aufnahmen haben eine 100.000fache Endvergrößerung.
Bradford-Assay hinsichtlich Gesamtprotein
Gesamtprotein wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Coomassie Plus^®-Kits (Pierce, Rockford, IL) untersucht. Die Proben wurden auf geeignete Niveaus in Milli-Q-H₂O verdünnt. Die erforderlichen Volumina waren 0,1 ml und 1,0 ml für die Standard- bzw. Mikroassay-Protokolle. Für beide Protokolle wurde BSA (Pierce, Rockford, IL) verwendet, um die Standardkurve zu erstellen. Ein Assay wurde nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Standardkurven wurden mit Hilfe von CricketGraph^®-Software auf einem Macintosh IIci-Computer graphisch dargestellt.
SDS-PAGE und Westernblot-Assays
Alle Gele, Puffer und elektrophoretischen Apparaturen wurden von Novex (San Diego, CA) erhalten und nach den Empfehlungen des Herstellers betrieben. In Kürze, Proben wurden auf gleiche Proteinkonzentrationen in Milli-Q-H₂O verdünnt und 1 : 1 mit Probeninkubationspuffer gemischt, der 200 mM DTT enthielt. Die Proben wurden 15 Min. lang bei 100°C inkubiert und auf vorgegossene 12%ige Tris-Glycin-Gele aufgetragen. Die Proben wurden bei 125 V 1 h 45 Min. lang elektrophoresiert. Die Gele wurden durch Anfärbung mit kolloidalem Coomassie unter Verwendung eines im Handel erhaltenen Kits (Integrated Separation Systems, Natick, MA) entwickelt.
Für Westernblots wurden Proteine bei 25 V für 40 Min. auf PVDF-Membranen überführt. Die Membranen wurden mit Milli-Q-H₂O gewaschen und luftgetrocknet. Der primäre Antikörper war polyklonales Kaninchen-Antiserum, induziert gegen ein TrpE-HPV11-L1-Fusionsprotein (Gabe von Dr. D. Brown). Die Antikörperlösung wurde hergestellt durch Verdünnung von Antiserum in Blottingpuffer (5% fettfreie Milch in 6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃). Die Inkubation fand für mindestens 1 h bei 20–23°C statt. Der Blot wurde für jeweils 1 Minute in drei Austauschen von PBS (6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl) gewaschen. Eine Lösung von sekundärem Antikörper wurde präpariert durch Verdünnung von Konjugat-Antiserum von an alkalische Phosphatase gekoppeltem Antikaninchen-Ziegen-IgG (Pierce, Rockford, IL) in Blottingpuffer. Die Inkubation fand unter denselben Bedingungen mindestens 1 h lang statt. Die Blots wurden wie zuvor gewaschen und mit Hilfe eines einstufigen NBT/BCIP-Substrats (Pierce, Rockford, IL) nachgewiesen.
BEISPIEL 13
Herstellung von immunogenen Zusammensetzungen
Gereinigte VLPs werden nach bekannten Verfahren formuliert, wie z. B. durch die Zumischung von pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Stabilisatoren oder einem Vakzin-Adjuvans. Die immunogenen VLPs der vorliegenden Erfindung können für die Verwendung als Vakzin durch Kombination mit einer physiologisch annehmbaren Zusammensetzung, wie z. B. PBS, Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser, präpariert werden. Die immunogenen VLPs werden in einem Dosisbereich von etwa 0,1 bis 100 μg, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20 μg, verabreicht, um die gewünschte immunogene Wirkung zu erhalten. Die VLP-Menge pro Formulierung kann gemäß einer Vielfalt von Faktoren variieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, den Zustand, das Gewicht, Alter und Geschlecht des Individuums. Die Verabreichung der VLP-Formulierung kann auf einer Vielfalt von Routen erfolgen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, oral, subkutan, topisch, mukosal und intramuskulär. Solche VLP-Formulierungen können einen einzigen VLP-Typ (d. h., VLP von HPV11) oder eine Mischung von VLPs (d. h., VLPs von HPV6, HPV11, HPV16 und HPV18) umfassen.
Ein antimikrobielles Konservierungsmittel, z. B. Thimerosal, kann gegebenenfalls vorhanden sein. Die immunogenen Antigene der vorliegenden Erfindung können gewünschtenfalls in Kombination mit Vakzin-Stabilisatoren und Vakzin-Adjuvantien eingesetzt werden. Typische Stabilisatoren sind spezielle Verbindungen, z. B. Polyanionen wie Heparin, Inosithexasulfat, sulfatiertes Betacyclodextrin, weniger spezielle Exzipienten, z. B. Aminosäuren, Sorbit, Mannit, Xylit, Glycerin, Sucrose, Dextrose, Trehalose, und Variationen der Lösungsbedingungen, z. B. neutraler pH-Wert, hohe Ionenstärke (ca. 0,5–2,0 M Salze), zweiwertige Kationen (Ca²⁺, Mg²⁺). Beispiele von Adjuvantien sind Al(OH)₃ und Al(PO₄). Das Vakzin der vorliegenden Erfindung kann gekühlt oder in lyophilisierter Form gelagert werden.
BEISPIEL 14
Herstellung von Antikörpern gegen VLP
Gereinigte VLP werden zur Bildung von Antikörpern eingesetzt. Der Begriff „Antikörper", wie hier verwendet, schließt sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sowie Fragmente davon ein, wie z. B. Fv-, Fab- und F(ab)₂-Fragmente, welche zur Bindung von Antigen oder Hapten in der Lage sind. Die Antikörper werden in vielfältiger Weise eingesetzt, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, Reinigung von rekombinanten VLP, Reinigung von nativen L1- oder L2-Proteinen und Kits. Kits würden einen aufgeteilten Träger umfassen, der dazu geeignet ist, in festem Einschluß mindestens einen Behälter zu enthalten. Der Träger würde ferner Reagenzien, wie z. B. den Anti-VLP-Antikörper oder das VLP, geeignet zum Nachweis von HPV oder Fragmenten von HPV oder Antikörpern gegen HPV, enthalten. Der Träger kann auch Nachweismittel, wie z. B. markiertes Antigen oder Enzymsubstrate oder dgl., enthalten. Die Antikörper oder VLP oder Kits eignen sich für eine Vielfalt von Zwecken, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, forensische Analysen und epidemiologische Studien.

Claims

Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein Human-Papillomavirus Typ 11-L1-Protein, wobei das Nukleinsäuremolekül frei von internen Transkriptionsterminationssignalen ist, die von Hefe erkannt werden.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches DNA ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 2 mit der in 8 gezeigten Sequenz.
Expressionsvektor, umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, welcher pGAL1-10 umfaßt.
RNA, die komplementär zu dem DNA-Molekül nach Anspruch 2 oder 3 ist.
Vakzin, umfassend ein Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 1, 2, 3 oder 6 definiert und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, 2, 3 oder 6 zur Verwendung in einem Verfahren der therapeutischen Behandlung des menschlichen Körpers.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1, 2, 3 oder 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung einer Erkrankung, die von HPV11 verursacht wird.
Verfahren zur Herstellung eines gereinigten rekombinanten Human-Papillomavirus Typ 11-L1-Proteins, umfassend: a) Transformation eines geeigneten Wirts mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 4 oder 5, um eine transformierte Zelle zu erzeugen, (b) Kultivierung der transformierten Zelle unter Bedingungen, welche die Expression des rekombinanten Human-Papillomavirus Typ 11-L1-Proteins erlauben, und (c) Reinigung des rekombinanten Human-Papillomavirus Typ 11-L1-Proteins.
Verfahren zur Herstellung von gereinigten HPV11-L1-Virus-ähnlichen Partikeln, umfassend: (a) Transformation eines geeigneten Wirts mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 4 oder 5, um eine transformierte Zelle zu erzeugen, (b) Kultivierung der transformierten Zelle unter Bedingungen, welche die Expression des rekombinanten Human-Papillomavirus Typ 11-L1-Proteins erlauben, (c) Reinigung des rekombinanten Human-Papillomavirus Typ 11-L1-Proteins, und (d) weitere Reinigung des Proteins, um ein virusähnliches Partikel herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Wirt Hefe ist.