CZ291375B6 - Molekula nukleové kyseliny a expresní vektor - Google Patents

Abstract

Řešení se týká molekuly nukleové kyseliny, kódující čištěný protein L1 lidského papilomaviru typu 11, která je prostá kvasinkových signálů ukončení transkripce, a jejích derivátů a expresního vektoru.ŕ

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká molekuly nukleové kyseliny kódující protein LI čištěného lidského papilomaviru typu 11 a jeho derivátů a vektorů pro expresi.

Dosavadní stav techniky

Tato přihláška navazuje na projednávané US přihlášky No. 08/413,572 z 30.3.1995 a No. 08/413,571 z 30. 3. 1995.

Infekce papilomaviry (PV) se vy skytují u řady zvířat i člověka, u ovcí, psů, koček, králíků, opic, hadů a krav. Papilomaviry infikují epiteliální buňky a obecně indukují v místě infekce benigní epiteliální nebo fibroepiteliální tumory. Infekce PV je druhově specifická; lidský papilomavirus neinfikuje zvíře.

Papilomaviry je možno rozdělit do určitých skupin v závislosti na hostiteli, kterého infikují. Lidské papilomaviry (HPV) jsou dále tříděny do více než sedmdesáti typů, založených na sekvenční homologii DNA. PV typy se zdají být typově specifické imunogeny, u kterých neutralizační imunita proti infekci jednoho typu papilomaviru nevyvolává imunitu proti jinému typu papilomaviru.

U člověka způsobují rozdílné typy HPV různá onemocnění. HPV typů 1, 2, 3, 4, 7, 10 a 26 až 29 způsobují benigní bradavice jak u normálních jedinců, tak i u jedinců s oslabenou imunitou. HPV typů 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19 až 25, 36 a 46 až 50 způsobují u pacientů s oslabenou imunitou ploché léze. HPV typů 6, 11, 34, 39, 41 až 44 a 51 až 55 způsobují benigní kondylomata genitální sliznice nebo sliznice respiračního traktu. HPV typů 16, 18, 31, 33, 35, 45 a 58 způsobují epiteliální dysplasii genitální sliznice a jsou spojeny s většinou místních a invazivních karcinomů děložního hrdla, vagíny, vulvy a análního kanálu.

Papilomaviry jsou malé (50 až 60 nm), ikosahedrální viry DNA bez pouzdra, které kódují až osm časných a dva pozdní geny. Otevřené čtecí rámce (ORF) virových genomů jsou označovány El až E7 a LI a L2, kde „E“ označuje časný a „L“ označuje pozdní. LI a L2 kódují virové kapsidové proteiny. Časné (E) geny jsou spojeny s funkcemi jako je replikace viru a transformace buněk.

Hlavním proteinem kapsidy je protein LI, který má molekulovou hmotnost 55 až 60 kDa. Protein L2 je menší kapsidový protein, jehož předpovězená molekulová hmotnost je 55 až 60 kDa a elektroforézou na polyakrylamidovém gelu určená zdánlivá molekulová hmotnost je 75 až 100 kDa. Imunologická data ukazují, že uvnitř virové kapsomery je většina proteinu L2 vzhledem k proteinu LI vnitřní. ORF LI je mezi rozdílnými papilomaviry vysoce konzervován. Proteiny L2 jsou mezi různými papilomaviry konzervovány méně.

Geny LI a L2 byly identifikovány jako dobré cíle pro imunoproíylaxi. Studie v systémech papilomaviru amerického králíka (cottontail rabbit) (CRPV) a bovinního papilomaviru (BPV) ukázaly, že imunizace proteiny LI a L2, exprimovanými v bakterii nebo s použitím vektorů vakcínie chránila zvířata od virové infekce. Expresí genů LI papilomaviru v bakulovirových expresních systémech nebo s použitím vektorů vakcínie vznikaly uspořádané viru podobné částice (virus-like particles, VLP), kterých bylo použito pro indukci odpovědí virus neutralizujících protilátek s vysokým titrem, která koreluje s ochranou vyvolanou podáním viru. Navíc bylo použito genů LI a L2 pro vytváření vakcín pro prevenci a léčení infekce papilomaviry u lidí a zvířat.

-1 CZ 291375 B6

Vývoj a komerční produkce profylaktických a terapeutických vakcín proti infekci PV a onemocnění, obsahujících protein LI, proteiny LI + L2 nebo modifikované proteiny LI nebo L1+L2 byl omezován nedostatkem většího množství čištěného viru a čištěného proteinu. Protože PV se nesnadno kultivuje in vitro, je obtížné vyprodukovat in vitro propagací PV požadovaná množství proteinů LI a L2. Tyto potíže se zdroji znesnadňují charakterizaci PV a proteinů PV. Bylo by tedy výhodné vyvinout snadno obnovitelný zdroj surových PV proteinů, zvláště PV proteinů LI a L2 nebo modifikovaných proteinů LI a L2. Bylo by také užitečné vyvinout způsoby čištění velkých množství surových papilomavirových proteinů až na čistotu vhodnou pro imunologické studie a vývoj vakcín. Bylo by také užitečné vyprodukovat velké množství proteinů papilomaviru s vlastnostmi, vyvolávajícími imunitu, jako nativní proteiny, jako je například konformace nativního proteinu. Navíc by bylo užitečné vyvinout způsoby analýzy proteinů PV a způsoby určení relativní čistoty proteinů stejně jako prostředků obsahujících proteiny. Takové vysoce vyčištěné proteiny by rovněž byly užitečné při přípravě řady reagencií, použitelných při studiu infekce PV; takové reagencie bez omezení zahrnují polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a analytické standardy.

HPV6 a 11 jsou vyvolávajícími činiteli pro ~ 90 % benigních genitálních bradavic a jsou pouze zřídka spojeny s maligním zvrhnutím (Gissmann a další, 1983, PNAS 80, 560-563). V případě condyloma accuminata je HPV6a pokládán za nejhojnější subtyp HPV6 (Brown, D. B., a další, J. Clin. Microbiol. 31: 1667-1673). V posledních letech jsou na vzestupu návštěvy z důvodu genitálních bradavic (condyloma accuminatum nebo pianům). Odhaduje se, že ~ 10 % z celkové populace (ve věku 15-49 let) má infekce genitálního traktu HPV (Koutsky a další, 1988, Epidemiol. Rév. 10, 122-163). Zatímco většina kondylomat je spojena s HPV6, v případě hrtanové papilomatózy je dominantním typem HPV11. Replikace HPV11 v epiteliálních buňkách respiračního traktu stimuluje proliferaci těchto buněk, která může vést k izolovaným změnám s menším klinickým významem nebo kmnohočetným rozšiřujícím se změnám a recidivujícímu onemocnění. Recidivující papifomatóza respiračního traktu, onemocnění, které častěji postihuje mladou populaci, může být život ohrožujícím onemocněním, protože způsobuje obstrukce v respiračním traktu. V poslední době byl vyvinut zvířecí model, který dovoluje replikaci infekčního HPV11 (Kreider a další, 1985, Nátuře 317, 639-640; Kreider a další, 1987, J. Virol. 61, 590-593). Model umožnil identifikaci konformačních neutralizačních epitopů na nativních virionech a bakulovirem exprimovaných virům podobných částic a použití monoklonálních protilátek (Christensen a další, 1990, J. Virol. 64, 5678-5681; Christensen a Kreider, 1991, Virus Res. 21, 169-179; Christensen a Kreider, 1993, Virus Res. 28, 195-202; Christensen a další, 1994,75,2271-2275).

Viru podobné částice obsahující protein HPV 11 LI byly exprimovány jak ve hmyzích, tak i savčích buněčných systémech. Exprese VLP v kvasinkových buňkách nabízí výhodu nižších nákladů a snadnějšího přizpůsobení k růstu ve fermentorech ve velkém měřítku. Protein HPV11 LI je však v kvasinkových buňkách exprimován v nízkých množstvích. Bylo pozorováno, že je to výsledek zkracování mRNA HPV11 LI. Naopak gen HPV6 LI se přepisuje jako mRNA s úplnou délkou a je exprimován ve vysokých koncentracích. Modifikací HPV6 LI DNA pro kódování proteinu HPV11 LI je možné dosáhnout transkripce mRNA s plnou délkou, což má za následek zvýšení exprese proteinu LI HPV11. Předkládaný vynález poskytuje genovou sekvenci hybridního genu LI HPV6/11 stejně jako způsob konstrukce hybridního genu LI HPV6/11 s použitím syntetických oligonukleotidů. Hybridní gen byl navržen s použitím sekvence LI HPV6a (Hofmann, K. J., a další, 1995, Virology, přijatý k publikaci), obsahuje však minimální počet změn bází, nutných pro kódování proteinu LI HPV11. Na rozdíl od genu LI HPV11 standardního typu neobsahuje hybridní gen HPV6/11 kvasinkou rozpoznávané vnitřní signály ukončeni transkripce; jako výsledek je dosaženo produkce mRNA HPV6/11 úplné délky a exprese proteinu LI HPV11 je zvýšena.

Předkládaný vynález lze využít pro přípravu vysoce čištěného proteinu LI papilomaviru. Rekombinantní proteiny papilomaviru mají vlastnosti vyvolávající imunitu stejně jako nativní

-2CZ 291375 B6 proteiny papilomaviru. Rekombinantní proteiny je možno použít na výrobu profylaktických a terapeutických vakcín proti infekci papilomaviry. Elektronová mikroskopie a vazba na konformační protilátky ukazují, že rekombinantní proteiny podle předkládaného vynálezu jsou schopny vytvořit viru podobné částice.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká molekuly nukleové kyseliny, kódující čištěný protein LI lidského papilomaviru typu 11, a jejích derivátů. Různá provedení \ynálezu zahrnují bez omezení rekombinantní molekuly HPV DNA a RNA komplementární k molekulám rekombinantní HPV DNA. Na základě molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu lze připravit proteiny kódované rekombinantními molekulami DNA, protilátky proti molekulám rekombinantní DNA a příbuzné proteiny, prostředky obsahující DNA, RNA, proteiny nebo protilátky stejně jako jejich deriváty. Tyto deriváty bez omezení zahrnují peptidy a proteiny kódované DNA, protilátky proti DNA nebo protilátky proti proteinům kódovaným DNA, vakcíny obsahující DNA nebo vakcíny obsahující proteiny, kódované DNA, imunologické prostředky obsahující DNA nebo proteiny kódované DNA, kity obsahující DNA nebo RNA, odvozené od DNA nebo proteinů kódovaných DNA.

HPV6 a 11 jsou činiteli vyvolávajícími -90% benigních genitálních bradavic a jsou pouze zřídka spojeny s maligním zvrhnutím (Gissmann a další. 1983, PNAS 80, 560-563). V případě condyloma accuminata je HPV6a pokládán za nejhojnější subtyp HPV6 (Brown, D. B., a další, J. Clin. Microbiol. 31: 1667-1673). V posledních letech jsou na vzestupu návštěvy z důvodu genitálních bradavic (condyloma accuminatum nebo pianům). Odhaduje se, že - 10 % z celkové populace (ve věku 15-49 let) má infekce genitálního traktu HPV (Koutsky a další, 1988, Epidemiol. Rev. 10, 122-163). Zatímco většina kondylomat je spojena s HPV6, v případě hrtanové papilomatózyje dominantním typem HPV 11. Replikace HPV11 v epiteliálních buňkách respiračního traktu stimuluje proliferaci těchto buněk, která může vést k izolovaným změnám s menším klinickým významem nebo k mnohočetným rozšiřujícím se změnám a recidivujícímu onemocnění. Recidivující papilomatóza respiračního traktu, onemocnění, které nejčastěji postihuje mladou populaci, může být život ohrožujícím onemocněním, protože způsobuje obstrukce v respiračním traktu. V poslední době byl vyvinut zvířecí model, který dovoluje replikaci infekčního HPV11 (Kreider a další, 1985, Nátuře 317, 639-640; Kreider a další, 1987, J. Virol. 61, 590-593). Model umožnil identifikaci konformačních neutralizačních epitopů na nativních virionech a bakulovirem exprimovaných virům podobných částic a použití monoklonálních protilátek (Christensen a další, 1990, J. Virol. 64, 5678-5681; Christensen a Kreider, 1991, Virus Res. 21, 169-179; Christensen a Kreider, 1993, Virus Res. 28, 195-202; Christensen a další, 1994, 75,2271-2275).

Vývoj a komerční produkce profylaktických a terapeutických vakcín proti infekci PV a onemocnění, obsahujících protein LI, proteiny LI + L2 nebo modifikované proteiny LI nebo LI + L2 byl omezován nedostatkem většího množství čištěného viru a čištěného proteinu. Protože PV se nesnadno kultivuje in vitro, je obtížné vyprodukovat in vitro propagací PV požadovaná množství proteinů LI a L2. Tyto potíže se zdroji znesnadňují charakterizaci PV a proteinů PV. Bylo by tedy výhodné vyvinout snadno obnovitelný zdroj surových PV proteinů, zvláště PV proteinů LI a L2 nebo modifikovaných proteinů LI a L2. Bylo by také užitečné vyvinout způsoby čištění velkých množství surových papilomavirových proteinů až na čistotu vhodnou pro imunologické studie a vývoj vakcín. Bylo by také užitečné vyprodukovat velké množství proteinů papilomaviru s vlastnostmi, vyvolávajícími imunitu, jako nativní proteiny, jako je například konformace nativního proteinu. Navíc by bylo užitečné vyvinout způsoby analýzy proteinů PV a způsoby určení relativní čistoty proteinů stejně jako prostředků obsahujících proteiny. Takové vysoce vyčištěné proteiny by rovněž byly užitečné při přípravě řady reagencií, použitelných při studiu infekce PV; takové reagencie bez omezení zahrnují polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a analytické standardy.

-3CZ 291375 B6

Viru podobné částice obsahující protein HPV 11 LI byly exprimovány jak ve hmyzích, tak i savčích buněčných systémech. Exprese VLP v kvasinkových buňkách nabízí výhodu nižších nákladů a snadnějšího přizpůsobení k růstu ve fermentorech ve velkém měřítku. Protein HPV11 LI je však v kvasinkových buňkách exprimován v nízkých úrovních. Bylo pozorováno, že je to výsledek zkracování mRNA HPV11 LI. Naopak gen HPV6 LI se přepisuje jako mRNA s úplnou délkou a je exprimován ve vysokých koncentracích. Modifikací HPV6 LI DNA pro kódování proteinu HPV11 LI je možné dosáhnout transkripce mRNA s plnou délkou, což má za následek zvýšení exprese proteinu LI HPV11. Předkládaný vy nález poskytuje genovou sekvenci hybridního genu LI HPV6/11 stejně jako způsob konstrukce hybridního genu LI HPV6/11 s použitím syntetických oligonukleotidů. Hybridní gen by l navržen s použitím sekvence HPV6a LI (Hofmann, K. J., a další, 1995, Virology, přijatý k publikaci), obsahuje však minimální počet změn bází, nutných pro kódování proteinu LI HPVH. Na rozdíl od genu LI HPV11 standardního typu neobsahuje hybridní gen HPV6/11 kvasinkou rozpoznávané vnitřní signály ukončení transkripce; jako výsledek je dosaženo produkce mRNA HPV6/11 úplné délky a exprese proteinu LI HPV11 je zvýšena.

Složení farmaceuticky použitelných prostředků obsahujících DNA nebo proteiny kódované DNA může být vytvořeno v oboru známými způsoby, například přídavkem farmaceuticky přijatelného nosiče. Příklady takových nosičů a způsobů pro vytváření prostředků je možno nalézt v publikaci Remingtonů Pharmaceutical Sciences. Pro vytvoření farmaceuticky přijatelného prostředku, vhodného pro účinné podávání, budou takové prostředky obsahovat účinné množství DNA nebo proteinu nebo VLP. Takové prostředky mohou obsahovat DNA nebo proteiny nebo VLP, odvozené z více než jednoho typu HPV.

Terapeutické nebo diagnostické prostředky se pacientům podávají v dostatečném množství pro léčení nebo diagnostiku infekcí papilomavirem. Účinné množství se může lišit podle řady faktorů, jako je stav jednotlivce, jeho hmotnost, pohlaví a věk. Dalšími faktory jsou způsoby podávání. Obecně se prostředky budou podávat v dávkách od přibližně 1 pg do přibližně 1 mg.

Farmaceutické prostředky mohou být jednotlivci podávány různými cestami, jako subkutánně, místně, orálně, přes sliznici, intravenózně a intramuskulámě.

Vakcíny zahrnují DNA, RNA nebo proteiny, kódované DNA, která obsahuje antigenní determinanty, nutné pro indukci vytváření neutralizačních protilátek u hostitele. Tyto vakcíny jsou také dostatečně bezpečné pro podávání bez nebezpečí klinické infekce; nemají vedlejší toxické účinky; mohou být podávány cestou, která je účinná; jsou stabilní; a jsou kompatibilní s nosiči vakcín.

Vakcíny je možno podávat různými cestami, jako orálně, parenterálně, subkutánně, přes sliznici, intravenózně nebo intramuskulámě. Podávaná dávka se může lišit podle stavu, pohlaví, hmotnosti a věku pacienta, způsobu podávání a způsobu papilomaviru vakcíny. Vakcínu je možno použít v dávkovačích formách jako jsou kapsle, suspenze, elixíry nebo kapalné roztoky. Vakcína může obsahovat imunologicky přijatelný nosič.

Vakcíny se podávají v terapeuticky účinných množstvích, tj. v množstvích dostatečných pro vytvoření imunologické ochranné odezvy. Terapeuticky účinné množství se může lišit podle typu papilomaviru. Vakcína může být podávána v jediné dávce nebo ve více dávkách.

v

Čištěné proteiny založené na vynálezu mohou být použity při sestavování imunogenních prostředků. Takové prostředky jsou schopny při zavedení do vhodného hostitele indukovat u něj imunologickou odpověď.

Čištěné proteiny nebo jejich deriváty mohou být použity pro vytváření protilátek. Termín „protilátka“, jak se zde používá, zahrnuje jak polyklonální, tak i monoklonální protilátky stejně

-4CZ 291375 B6 jako jejich fragmenty, jako fragmenty Fv, Fab a F(ab)2. které jsou schopny vázat antigen nebo hapten.

Proteiny a deriváty proteinů založené na vynálezu mohou být použity pro určení sérotypu infekce HPV a screening HPV. Pro vytvářeni kitů pro detekci a určování sérotypu HPV je možno použít čištěných proteinů, VLP a protilátek. Takový kit by obsahoval soustavu nosných prvků, schopných pevně držet alespoň jednu nádobku. Nosná soustava by dále obsahovala reagencie, jako jsou proteiny LI nebo L2 nebo VLP, odvozené od rekombinantních molekul HPV 6/11 nebo jiných rekombinantních DNA molekul HPV nebo protilátky, zaměřené proti těmto proteinům. Nosná soustava může dále obsahovat prostředky pro detekci, jako je značený antigen nebo enzymové substráty apod.

Čištěné proteiny mohou být také použity jako imunologické standardy, markéry molekulové hmotnosti a velikosti molekuly.

Je známo, že u různých kodonů, kódujících specifické aminokyseliny, je podstatná míra redundance. Proto je vynález rovněž zaměřen na takové sekvence DNA, které kódují alternativní kodony, kódující při eventuálním překladu stejnou aminokyselinu. Pro účely této specifikace bude definována sekvence, nesoucí jeden nebo více nahrazených kodonů, jako degenerovaná varianta. V rámci vynálezu jsou rovněž zahrnuty mutace buď v sekvenci DNA nebo překládaném proteinu, které v podstatné míře nezmění konečné fyzikální vlastnosti exprimovaného proteinu. Například substituce valinu za leucin, argininu za lyzin nebo asparaginu na glutamin nemusí způsobit změnu funkce polypeptidu.

Je známo, že sekvence DNA kódující peptid mohou být změněny, aby kódovaly peptid s jinými vlastnostmi než má v přírodě se vyskytující peptid. Metody změny sekvencí DNA zahrnují bez omezení místně specifickou mutagenezi.

Jak se zde používá, „funkční derivát“ hybridního genu HPV 6/11 je sloučenina, která má biologickou aktivitu (buď funkční nebo strukturální), která je v podstatné míře podobná biologické aktivitě HPV 6/11. Termín „funkční deriváty “ má zahrnovat „fragmenty“, „varianty“, „degenerované varianty“, „analogy“, „homology“ nebo „chemické deriváty“ HPV 6/11.

Termín „analog“ označuje molekulu s v podstatě podobnou funkcí celé molekule HPV 6/11 nebo jejímu fragmentu.

Klonovaná DNA HPV 6/11 nebo její fragmenty, získané výše popisovanými způsoby, mohou být rekombinantním způsobem molekulárním klonováním do expresního vektoru obsahujícího vhodný promotor a jiné vhodné prvky pro regulaci transkripce a převedením vektoru do prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky exprimovány za vzniku rekombinantní HPV 11. Způsoby těchto manipulací jsou úplně popsány v Sambrook, J. a další, výše a jsou v oboru známy.

Expresní vektory jsou zde definovány jako sekvence DNA, požadované pro transkripci klonovaných kopií genů a translaci jejich mRNA ve vhodném hostiteli. Tyto vektory mohou být použity pro expresi eukaryotických genů v řadě hostitelů, jako jsou bakterie, modrozelené řasy, rostlinné buňky, hmyzí buňky, houbové buňky a zvířecí buňky. Specifickým způsobem navržené vektory dovolují přesun DNA mezi hostiteli jako například bakterie-kvasinka nebo bakterie-zvířecí buňky nebo bakterie-buňky hub nebo bakterie-buňky bezobratlých. Vhodně vytvořený expresní vektor by měl obsahovat: počátek replikace pro autonomní replikaci v hostitelských buňkách, volitelné markéry, omezené množství využitelných míst pro štěpení restrikčními enzymy, schopnost reprodukovat se ve vysokém počtu kopií a aktivní promotory. Promotor je definován jako sekvence DNA, která navede RNA polymerázu k vazbě na DNA a zahájení syntézy RNA. Silný promotor je ten, který způsobí iniciaci transkripce mRNA s vysokou frekvencí. Expresní vektory mohou bez omezení zahrnovat klonovací vektory, modifikované klonovací vektory, specificky navržené plazmidy nebo viry.

Pro expresi HPV 6/11 DNA nebo jejích fragmentů v savčích buňkách je možno použít různé savčí expresní vektory. Komerčně dostupné savčí expresní vektory, které mohou být vhodné pro expresi HPV 6/11, zahrnují bez omezení pcDNAS (Invitrogen), pMCIneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSGS (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-l(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), a XZD35 (ATCC 37565).

Pro expresi HPV 6/11 DNA nebo jejích fragmentů v bakteriálních buňkách je možno použít řady bakteriálních expresních vektorů. Možné vhodné komerčně dostupné bakteriální expresní vektory jsou bez omezení pETlla (Novagen), lambda gtll (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Pro expresi HPV 6/11 nebo jejích fragmentů v buňkách hub je možno použít řady houbových expresních vektorů. Možné vhodné komerčně dostupné expresní vektory houbových buněk, které mohou být vhodné pro expresi rekombinantní HPV 6/11 DNA, jsou bez omezení pYES2 (Invitrogen), expresní vektor Pichia (Invitrogen), a expresní vektor Hansenula (Rhein Biotech, Diisseldorf, Německo).

Pro expresi HPV 6/11 DNA nebo jejích fragmentů v hmyzích buňkách je možno použít řady expresních vektorů hmyzích buněk. Možné vhodné komerčně dostupné expresní vektory hmyzích buněk, kterých je možno použít pro rekombinantní expresi HPV 6/11, jsou bez omezení pBlue Bac III (Invitrogen).

Expresní vektor obsahující DNA kódující HPV 6/11 nebo jeho fragmenty je možno použít pro expresi HPV 11 proteinů nebo fragmentů HPV 11 proteinů v buňkách, tkáních, orgánech nebo zvířatech (včetně lidí). Hostitelské buňky mohou být prokaryotické nebo eukaryotické, včetně, bez omezení, bakterií jako je E. coli, houbových buněk jako jsou kvasinky, savčích buněk bez omezení na buněčné linie lidského, hovězího, vepřového, opičího nebo hlodavčího původu, včetně bez omezení buněčných linií odvozených z drozofíl a larev bource morušového. Buněčné linie, odvozené ze savčích druhů, které mohou být vhodné a které jsou komerčně dostupné, zahrnují bez omezení L buňky L-M(TK') (ATCC CCL 1.3), L buňky L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Ráji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650). COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61 ), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) aMRC-5 (ATCC CCL 171 ).

Expresní vektory mohou být do hostitelských buněk zavedeny jakýmkoliv z velkého množství způsobů včetně bez omezení transformace, transfekce, lipofekce, fůze protoplastů a elektroporace. Buňky obsahující expresní vektor jsou jako jednotlivé klony pomnožovány a individuálně analyzovány na produkci proteinu HPV 11. Identifikace klonů hostitelských exprimuj ících buněk HPV 11 může být provedena několika způsoby, včetně bez omezení pomocí imunologické reaktivity s protilátkami anti-HPV 11.

Exprese fragmentů HPV DNA může být také provedena s použitím syntetické mRNA nebo nativní mRNA, produkovaných in vitro. Syntetická mRNA nebo mRNA, izolovaná z buněk produkujících hybridní DNA HPV 6/11 může být účinně překládána v různých bezbuněčných systémech, včetně bez omezení v extraktech z pšeničných klíčků a retikulocytárních extraktech, stejně jako může být účinně překládána v buněčných systémech, včetně bez omezení mikroinjekcí do žabích oocytů, přičemž mikroinjekci do žabích oocytů se dává přednost.

Po expresi proteinu (proteinů) HPV 11 v hostitelské buňce může být protein HPV 11 oddělen, aby byl získán ve vyčištěné formě. Dostupných a vhodných pro použití je několik purifikačních

-6CZ 291375 B6 postupů pro HPV 11. Jak se zde popisuje, rekombinantní protein HPV 11 může být purifikován z buněčných lyzátů a extraktů různými kombinacemi nebo použitím jednotlivých způsobů izolace jako je frakcionace pomocí soli, iontoměničová chromatografie, gelová (size exclusion) chromatografie, chromatografie s adsorpcí na hydroxylapatit a chromatografie založená na hydrofobních interakcích.

Rekombinantní protein HPV 11 může být dále oddělen od jiných buněčných proteinů použitím imunoafinitní kolony, vyrobené s použitím monoklonálních nebo polyklonálních protilátek, specifických pro nascentní HPV 11 s plnou délkou nebo pro pólypeptidové fragmenty HPV 11. Monoklonální a polyklonální protilátky mohou být připraveny řadou v oboru známých způsobů. Monoklonální nebo monospecifická protilátka se zde definuje jako jediný druh protilátky nebo protilátka složená z více druhů protilátek s homogenními vazebnými charakteristikami pro HPV 11. Homogenní vazba zde označuje schopnost druhu protilátky vázat se na specifický antigen nebo epitop.

Je zřejmé, že způsoby produkce monospecifických protilátek mohou být použity pro výrobu protilátek specifických proti polypeptidovým fragmentům HPV nebo nascentním HPV polypeptidům s plnou délkou. Zvláště je zřejmé, že mohou být vytvořeny monospecifické protilátky, které jsou specifické proti plně funkčním HPV proteinům nebo jejich fragmentům.

Nukleové kyseliny podle vynálezu lze použít pro screening na sloučeniny, které modulují expresi DNA nebo RNA, kódující HPV stejně jako funkci (funkce) proteinu HPV 11 in vivo. Sloučeniny modulující tyto aktivity mohou být DNA, RNA, peptidy, proteiny nebo neproteinové organické molekuly. Sloučeniny mohou modulovat zvýšením nebo snížením exprese DNA nebo RNA kódující HPV 11 nebo funkce proteinu HPV 11. Sloučeniny modulující expresi DNA nebo RNA kódující HPV 11 nebo funkci proteinu HPV 11 mohou být detekovány pomocí různých testů. Test může být jednoduchý test ,,ano/ne“ pro určení, zda nastává změna v expresi nebo funkci. Test může být proveden kvantitativně porovnáním exprese nebo funkce testovaného vzorku s úrovněmi exprese nebo funkce ve standardním vzorku.

Mohou být připraveny kity, obsahující hybridní DNA HPV 6/11, fragmenty hybridní DNA HPV 6/8, protilátky proti HPV 6/11 DNA nebo proteinu HPV 11, HPV 6/11 hybridní RNA nebo protein HPV 11. Takové kity se používají pro detekci DNA, která hybridizuje s HPV 6/11 DNA, nebo pro detekci přítomnosti proteinu HPV 11 nebo peptidových fragmentů ve vzorku. Tato charakterizace je užitečná pro mnoho účelů včetně bez omezení forenzní analýzy a epidemiologických studií.

Je možno syntetizovat nukleotidové sekvence komplementární k DNA sekvenci kódující HPV 6/11 pro terapii antimolekulami (antisense therapy). Těmito antimolekulami mohou být DNA, stabilní deriváty DNA jako fosforothioáty nebo methylfosfonáty, RNA, stabilní deriváty NA jako 2’-O-alkylRNA nebo jiné antioligonukleotidy, napodobující PV 6/11. Antimolekuly HPV 6/11 mohou být zavedeny do buněk mikroinjekcí, enkapsulací lipozomů nebo expresí z vektorů, nesoucích antimediátorové sekvence. Terapie antimolekulami HPV 6/11 může být zvláště užitečná pro léčení onemocnění, při kterém je prospěšné snížit aktivitu HPV 11.

Termín „chemický derivát“ popisuje molekulu, obsahující další chemické skupiny, které normálně nejsou součástí základní molekuly. Tyto skupiny mohou zlepšit rozpustnost, poločas životnosti molekuly, absorpci apod. základní molekuly. Tyto skupiny mohou také alternativně zeslabit nežádoucí vedlejší účinky základní molekuly nebo snížit toxicitu základní molekuly. Příklady takových skupin se popisují v řadě textů, jako například Remingtonů Pharmaceutical Sciences.

Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být použity samostatně ve vhodných dávkách, které se určují rutinním testováním s cílem dosáhnout optimální inhibici HPV 11 nebo

-7CZ 291375 B6 jeho aktivity s minimalizací možné toxicity. Navíc může být žádoucí současné nebo následné podávání jiných prostředků.

S výhodou mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu podávány v jediné denní dávce, nebo může být celková denní dávka podána v několika dílčích dávkách. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být navíc podávány řadou cest včetně bez omezení cesty intranazální, orální, transdermální nebo použitím čípků.

Pro kombinační léčení více než jedním aktivním prostředkem, kde se aktivní složky nacházejí v oddělených dávkovačích prostředcích, mohou být aktivní složky podávány současně nebo zvlášť v odděleně uspořádaných časech.

Dávkovači režim použití sloučenin podle předkládaného vynálezu se volí podle řady faktorů včetně typu, druhu, věku, hmotnosti, pohlaví a klinického stavu pacienta; vážnosti léčeného stavu; cesty podávání; jatemí a ledvinové funkce pacienta; a konkrétní použité sloučeniny. Lékař s běžnými znalostmi v oboru může snadno určit a předepsat účinné množství léčiva, vyžadovaného pro prevenci, odvrácení nebo zamezení postupu léčeného onemocnění. Optimální přesnost v dosahování koncentrací léčiva uvnitř mezí, kdy je léčivo účinné a netoxické vyžaduje režim, založený na kinetice, dostupnosti léčiva cílovým místům, k tomu je nutno vzít v úvahu rozdělení, rovnováhu a vylučování léčiva.

V případě použití pro léčení nebo prevenci mohou tvořit zde podrobně popisované sloučeniny aktivní složku a typicky se podávají ve směsi s vhodnými farmaceutickými diluenty, pomocnými látkami nebo nosiči (souhrnně zde označovanými jako „nosné“ materiály), vhodně zvolenými s ohledem na zamýšlenou formu podávání, tj. orální tablety, kapsle, elixíry, sirupy, čípky, gely apod. v souladu s běžnou farmaceutickou praxí.

Například pro orální podávání ve formě tablety nebo kapsle může být aktivní složka léčiva kombinována s orálním netoxickým farmaceuticky přijatelným inertním nosičem, jako je ethanol, glycerol, voda apod. Kde je to žádoucí nebo nutné, mohou být navíc také do směsi zahrnuty vhodné vazné látky, kluzné látky, látky usnadňující rozpadávání a barviva. Vhodnými vaznými látkami jsou bez omezení škrob, želatina, přírodní cukry jako glukóza nebo beta-laktóza, obilná sladidla (com sweeteners), přírodní a syntetické gumy jako je akácie, tragakant nebo alginát sodný, karboxymethylcelulóza, polyethylenglykol, vosky apod. Kluzné látky, používané v těchto dávkovačích formách, zahrnují bez omezení oleát sodný, stearát sodný, stearát horečnatý, benzoát sodný, octan sodný, chlorid sodný apod. Látky pro usnadnění rozpadávání zahrnují bez omezení škrob, methylcelulózu, agar, bentonit, xantanovou gumu apod.

Pro kapalné formy může být aktivní složka léčiva kombinována ve vhodně ochucených suspendujících nebo dispergujících prostředcích, jako jsou syntetické a přírodní gumy, například tragakant, akácie, methylcelulóza apod. Další dispergující prostředky, které mohou být použity, zahrnují glycerin apod. Pro parenterální podávání se vyžadují sterilní suspenze a roztoky. Když se vyžaduje intravenózní podávání, používají se izotonické přípravky, které obsahují obvykle vhodné ochranné látky.

Místní přípravky obsahující aktivní složku léčiva mohou být připraveny smísením s řadou nosných materiálů, které jsou v oboru dobře známy, jako jsou například alkoholy, gel aloe vera, alantoin, glycerin, vitamíny A a E, oleje, minerální oleje, PPG2 myristyl propionát apod. za vytvoření například alkoholických roztoků, místních čisticích roztoků, čisticích krémů, kožních gelů, kožních omývacích roztoků a šamponů ve formě krémů nebo gelu.

Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu mohou být také podávány ve formě lipozomových dodávacích systémů, jako jsou malé jednomembránové (unilamellar) váčky, velké jednomembránové váčky a vícemembránové váčky. Lipozomy je možno vytvořit z řady fosfolipidů, jako je cholesterol, stearylamin nebo fosfatidylcholiny.

-8CZ 291375 B6

Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu mohou být také dodávány s použitím monoklonálních protilátek jako individuálních nosičů, na které jsou molekuly sloučenin podle vy nálezu navázány. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také navázány na vhodné polymery ve funkci cílených nosičů léčiv. Tyto polymery mohou zahrnovat polyvinylpyrrolidon, pyranový kopolymer. polyhydroxypropylmetakrylamidfenol, polyhydroxy-ethylaspartamidfenol nebo polyethylenoxidpolylyzin, substituovaný palmitoylovými zbytky. Navíc mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu navázány na látky třídy biodegradovatelných polymerů, použitelných pro získání léčiva s řízeným uvolňováním účinné látky, například na kyselinu polymléčnou, polyepsilon-kaprolakton, kyselinu polyhydroxymáselnou, polyortoestery, polyacetalv, polydihydropyrany, polykyanoakryláty a zesítěné nebo amfipatické blokové kopolymery hydrogelů.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je schéma konstrukce hybridního genu LI HPV 6/11 s použitím syntetických oligonukleotidů.

Obr. 2 ukazuje nukleotidovou sekvenci hybridu HPV 6/11, publikovanou sekvenci HPV 6a a publikované geny LI HPV 11.

Obr. 3 ukazuje obousměrný kvasinkový expresní vektor pGAL 1-10, použitý pro expresi kapsidových proteinů LI papilomaviru.

Obr. 4 ukazuje northemovou analýzu kvasinkové mRNA HPV 11 LI.

Obr. 5 ukazuje westernovou analýzu (imunoblot) proteinu HPV 11 LI, exprimovaného v kvasinkách.

Obr. 6 ukazuje reaktivity virům podobných částic HPV 11 LI, exprimovaných HPV 11 standardního typu ve srovnání s hybridní DNA HPV 6/11 metodou ELISA.

Obr. 7 ukazuje elektronovou mikrofotografii virům podobných částic HPV11 LI, exprimovaných v kvasinkách.

Obr. 8 ukazuje nukleotidovou sekvenci hybridního genu HPV 6/11.

Následující příklady ilustrují předkládaný vynález, aniž by jej však měly nějak omezovat.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce syntetického genu LI

S použitím syntetických oligomerů DNA, získaných od firmy Midland Reagent Company, byl zkonstruován otevřený čtecí rámec HPV 11 LI o velikosti 1,5 kbp. Použité oligomery byly dodány s 5'-koncovými fosfáty. Jak je vyjmenováno níže, bylo zapotřebí celkem 24 oligomerů:

-9CZ 291375 B6 #241-1

5’GAAGATCTCACAAAACAAAATGTGGCGGCCTAGCGACAGCA cagtatatgtgcctcctcctaaccctgtatccaaagttgttgcc ACGGATGCTTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCA GCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATT 3’ (SEQ ID NO:1) #2412

5'ATTCCATAAAAAAGGTTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGT CAGGATATCAATACAGAGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCC taacaaatttgcattgcctgactcgtctctttttgatcccacaa CACAACGTTTGGTATGGGCATGCATGT 3‘ (SEQ ID N0:2) #241-3 5ACATGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCCGGGGACAGCCAT TAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTACTAAATAAATATGA TGATGTTGAAAATTCAGGGGGTTACGGTGGTAACCCTGGACAG GATAACAGG 3’ (SEQ ID N0:3)

-10CZ 291375 B6 #241-4

5'GTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATG gttggatgtgccccccctttgggcgagcattggggtaaaggta

CACAGTGTAGTAATACATCTGTACAGAATGGTGACTGCCCGC 3’ (SEQ ID N0:4) #241-5

5’CCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGG TTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACC AATAAATCAGATGTTCCTCTTGACATATGTGGCACTGTA 3’ (SEQ ID N0:5) #241-6 5'TGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCATAT

GGTGATAGATTATTTTTTTATCTACGGAAGGAACAAATGTTTGC CaGACATTTTITTAACAGGGCTGGTACCCC 3'(SEQ ID N0:6) #241-7 5GGGGTACCGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGATCTTTTAGTTA AGGGTGGTAACAATCGCTCGTCTGTAGCGAGTAGTATATATGT TCACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACA 3’ (SEQ ID N0:7) #241-8

5ATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACA TAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCATCTGTTTGTTACTGTGG TAGATACCACACGCAGTACCAACATGA 3’(SEQ ID N0:8) #241-9

5’CATTATGTGCATCCGTATCTAAATCTGCCACATACACCAATTC TGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTTTGATTTA CAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATT 3*(SEQ ID N0:9)

-ii CZ 291375 B6 #241-10

5’ACAITGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAAT ccctctgttctcgaggactggaactttgggttatcgcctccccc

AAATGGTACACTCGAGCGG 3’(SEQ ID NO: 10) #241-11 5’CCGCTCGAGGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATT ACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGGAAAAGCAAGATCCCT ATAAGGACATGAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTT TTCTAGTGAATTGGATCAGTTTCCTTT 3' (SEQ ID NO:11) #241-12

SGGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGAC CTCTGCTCGTACCGGTATTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAACCCT CTACTGCCCCTAAACGTAAGCGCACCAAAACTAAAAAGTAAG ATCTTC 3' (SEQ ID NO: 12) #241-13

5OAAGATCTTACTTTTTAGTTTTGGTGCGCTTACGTTTAGGGGC AGTAGAGGGTTTGGAAACAGCAGGGCGCTTAATACCGGTACG AGCAGAGGTCCGTCCCCTATATCCACTTTGTAACAAAAACTTG CGTCCCAAAGGAAACTGATCCAATTC 3’ (SEQ CD NO: 13) #24 M 4

5'ACTAGAAAACTnTCTTn*AAATTAACCTCCCAAAAACTCATG TCCTTATAGGGATCTTGCTmCCnTrCAGGAGTGGGCTTTTG ACAGGTAATGGCCTGTGACTGCACATACCTATAGGTATCCTCG AGCGG 3* (SEQ ID NO: 14) #241-15

SOCGCTCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTT

CCAGTCCTCGAGAACAGAGGGATTCATTGTGTGAATATAGGCC

ATTACTTCAGCAGACAATGTAATGCTACATAATTG AAAAA 3' (SEQEDN0:15)

-12CZ 291375 B6 #241-16

5'TAAATTGTAAATCAAACTCTTCCACATGACGCATGTACTCTTT

ATAATCAGAATTGGTGTATGTGGCAGATTTAGATACGGATGCA

CATAATGTCATGTTGGTACTGCGTGTG 3’ (SEQ ID NO: 16) #241-17

5OTATCTACCACAGTAACAAACAGATGATTACCCCAACAAATA CCATTGTTATGTCCCTGGGCTTrTTGTAGCCAATATGGCTTATT AAACAATTGTGCCTCAGAGGACACCAA 3’ (SEQ ID NO: 17) #241-18

5’AGAGCCGCTTGGGGTGTGAACATATATACTACTCGCTACAGA CGAGCGATTGTTACCACCCTTAACTAAAAGATCATCAGGCACA GGTTCCCCCACGGTACCCC 3' (SEQ ID NO: 18) #241-19 5'GGGGTACCAGCCCTGTTAAAAAAATGTCTGGC.AAACATTTGT TCCTTCCGTAGATAAAAAAATAATCTATCACCATATGGGTCTG CAGCCATTTGTAAATAATCTGGATATTTACATACAGTGCCACA TATGTCAA 3’ (SEQ ID NO: 19) #241-20 5'GAGGAACATCTGATTTATTGGTCTGCAAATCAGCAAAATTCA TAGCACCAAAGCCTGTGTCAACCATATCGCCATCCTGTATAAC ACTGGTAATAAGTTCTAAGGGCGGGCAGTCACCATTCTGT 3’ (SEQ ID NO:20) #241-21 sacagatgtattactacactgtgtacctttaccccaatgctcgc CCAAAGGGGGGGCACATCCAACCATGCATAATTGTGTTTGTTT ATAATCCATACCTACATTAACCCTGTTATCCTGTCCAGGGT 3’ (SEQ (DNO-.21)

- 13 CZ 291375 B6 #241-22

5TACCACCGTAACCCCCTGAATTTTCAACATCATCATATTTATT

TAGTAAAGGATGTCCACTTACACCCACACCTAATGGCTGTCCC

CGGCCCACCTCTAGGCCTGTGCATGCATGT 3’(SEQ ID NO:22) #241-23

ÍACATGCATGCCCATACCAAACGTTGTGTTGTGGGATCAAAAA GAGACGAGTCAGGCAATGCAAATTTGTTAGGATCTGGTAACAC CACCTTAAATACTCTGTATTGATATCCTGACACCTTTGGCACAA CAGTTTTGTTAACCTTTTTTATGGAATAATAAGGATGACCC 3' (SEQ ID NO:23) #241-24

5ACTGCAAGAAGTCTAGAACTGCTGGCATCATAAAATATGTTG GTGCGTTTAACATAAGCATCCGTGGCAACAACTTTGGATACAG GGTTAGGAGGAGGCACATATACTGTGCTGTCGCTAGGCCGCCA CATTTTGTTTTGTGAGATCTTC 3' (SEQ ID NO:24)

V oddělených zkumavkách obsahujících 2,5 mM Tris, pH 7,5, 0,25 mM EDTA byly teplotně hybridizovány oligomery vytvářející komplementární páry (# 241-1 a # 241-24, # 241—2 a # 241-23, # 241-3 a # 241-22, = 241-4 a # 241-21, # 241-5 a # 241-20, # 241-6 a # 241-19, # 241-7 a # 241-18, # 241-8 a # 241-17, # 241-9 a # 241-16, # 241-10 a # 241-15, # 241-11 a # 241-14, # 241-12 a # 241-13-obr. 1). Zkumavky byly zahřívány 4 min na 98 °C a potom byly umístěny do 250 ml kádinky s obsahem 200 ml vody o teplotě 98 °C a ponechány pomalu ochlazovat. Když se voda ochladila na pokojovou teplotu, hybridizované páry byly přidány do zkumavek označených: fragment A (páry oligomerů # 241-1 & 24, a-2 & 23); fragment B (# 241-3 & 22,-4 & 21,-5 & 20, a-6 & 19); fragment C (# 241-7 & 18,-8 & 17,-9 & 16 a-10 & 15) a fragment D (# 241-11 & 14 a -12 & 13). Tyto směsi oligomemích párů byly zahřívány 2 minuty na 62 °C a potom pomalu ochlazeny jako dříve. Obsah každé zkumavky byl přes noc při 23 °C ligován s použitím T4 DNA ligázy (Boehringer Mannheim, lne.) s použitím reagencií, dodaných výrobcem.

Po ligaci bylo nutno provést amplifikaci fragmentu B pomocí PCR pro zvýšení množství produktu o plné délce. To vyžadovalo 10 cyklů 94 °C, 1 min; 48 °C, 1 min; 72 °C, 1 min následovaných 10 minutami při 72 °C, v přístroji Applied Biosystems thermocycler s použitím Taq polymerázy Boehringer Mannheim a oligomemích primerů:

5’GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG 3* (SEQ ID NO:25) a.

5’ GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA 3’ (SEQ ID NO:26).

Ligované produkty a fragment B z PCR byly štěpeny restrikčními enzymy (Boehringer Mannheim, lne.) podle následujícího schématu: Fragment A byl štěpen BglII a Sphl; fragment B, Sphl a Kpnl; fragment C, Kpnl a Xhol; a fragment D, Xhol a BglII. Štěpené fragmenty byly rozděleny na agaróze s nízkou teplotou tání (FMC BioProducts) a fragmenty se správnou velikostí byly izolovány vyříznutím pruhu a štěpením agarózy pomocí enzymu Agarase™ (Boehringer Mannheim, lne.) podle doporučení výrobce. Fragmenty A, B a D byly odděleny

- 14CZ 291375 B6 sráženým ethanolem a potom odděleně ligovány do vektoru pSP72 (Promega, lne.), který byl štěpen restrikčními enzymy odpovídajícím způsobem jako ligované fragmenty.

Fragment C štěpená Kpnl a Xhol byl nejprve ligován do tepelně hybridizovaných oligomerů. 5TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTA CAC 3'; (SEQ ID NO:27) a 5’TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAG TCT3’ (SEQ ID NO:28).

Fragment C byl potom znovu štěpen Xhol a fragment Kpnl Xhol o velikosti 450 bp byl ligován s vektorem pSP72, štěpeným Kpnl a Xhol. Ligační směsi byly použity pro transformaci kompetentních buněk Escherichia coli DH5 (Gibco BRL. Ghaithersburg, MD). Byl proveden screening transformantů na klony obsahující inzert hybridizací kolonií (J. Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Z pozitivních klonů byla izolována plazmidová DNA s použitím kitu Wizard miniprep kit (Promega Corp.) a sekvenována na sekvenátoru Applied Biosystems 373A DNA Sequencer. Klony, obsahující správnou sekvenci DNA pro každý ze čtyř fragmentů byly štěpeny jako výše pro uvolnění fragmentů z vektoru pSP72. Fragment C štěpený Kpnl a Xhol byl ligován s fragmentem D štěpeným Xhol Bglll a Kpnl, Bglll štěpem pSP72 pomocí třícestné (three-way) ligace. Produkty ligace byly použity pro transformaci E. coli. Výsledné transformanty byly sekvenovány a byl získán klon se správnou sekvencí (označený CD). Inzert Bglll Kpnl o délce 750 bp sekvence CD byl znovu vyštěpen z vektoru pSP72 a ligován s fragmentem A, štěpeným Bglll, Sphl a fragmentem B, štěpeným Sphl, Kpnl s použitím třícestné ligace jako výše s tím rozdílem, že pro snížení množství nežádoucích produktů ligace byl přidán enzym Bglll. Ligační produkty byly odděleny na agarózových gelech a byl izolován fragment o velikosti 1,5 kbp, který byl označen D361-1.

Příklad 2

Porovnání sekvencí

Na obrázku 2 je ukázáno porovnání nukleotidových sekvencí hybridu HPV 6/11, HPV 6a a HPV 11 LI. Pro převedení sekvence HPV 6 na translační rámec kódující HPV 11 je provedeno na kostře HPV 6 celkem 55 substitucí nukleotidů. Navíc byly přidány tři páry bází v poloze #411-413 bp, které kódují dodatečnou aminokyselinu (tyrozin¹³²), který se nalézá v HPV 11, ale ne v HPV 6. Tyto změny společně dovolují vazbu neutralizační monoklonální protilátky specifické proti typu 11, konformačně dependentní (Chemicon 8740 MAb), na protein LI HPV 6/11 LI DNA, exprimovaný v kvasinkách. Z toho plyne, že protein hybridního genu HPV 6/11 je patrně imunologicky nerozlišitelný od nativního proteinu HPV 11.

Z porovnání hybridní sekvence DNA HPV 6/11 s publikovanou sekvencí HPV 11/L1 vyplývají substituce 194 párů bází. To je vzhledem k sekvenci 11 LI standardního typu značně vysoký počet substitucí ajejich kombinace spolu se všemi celkovými změnami mohou být odpovědné za zvýšení exprese proteinu typu 11 LI v kvasinkách.

Příklad 3

Sekvenování DNA genu LI

Gen HPV 6/11 LI byl sekvenován na přístroji Applied Biosystems DNA Sequencer # 373A se sekvenačními reakcemi s barevným terminátorem (PRIZM™ Sequencing Kit) podle specifikace výrobce (ABI, lne., Poster City, CA).

-15CZ 291375 B6

Příklad 4

Konstrukce kvasinkových expresních vektorů HPV 6/11 11, HPV lilia HPV 6 LI

Kvasinkový expresní vektor pGALl-10 byl konstruován izolací fragmentu Sphl o velikosti

I, 4 kbp z plazmidu pUC18 s obousměrným GAL promotorem, který obsahuje divergentní promotory GAL1-GAL10 Saccharomyces cerevisiae z plazmidu pBM272 (poskytnuto od: Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). Divergentní promotory jsou z obou stran obklopeny kopií kvasinkového terminátoru transkripce (Bennetzen, J. L. a Halí, B. D., 1982,

J. Biol. Chem. 257: 3018-3025). přičemž klonovací místo BamHI je umístěno mezi promotorem GAL1 a první kopií terminátoru transkripce ADH1 a klonovací místo Smál je umístěno mezi promotorem GAL10 a druhou kopií terminátoru transkripce ADH1. Kvasinkový kyvadlový vektor sestávající zpBR322, kvasinkového genu LEL'2d (Erhart, E. a Hollenberg, C. P., 1983, J. Bacteriol. 156: 625-635) a kvasinkového plazmidu 2u (dar od: Benjamin Halí, University of Washington, Seattle, WA) (Broach, J. R. a Volkert. F. C., 1991, Circular DNA Plasmids of Yeasts, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) byl štěpen Sphl a ligován s Sphl fragmentem divergentního promotoru GAL o velikosti 1,4 kbp za vzniku plazmidu pGALl-10 (obr. 3).

Hybridní LI DNA HPV 6/11 kódující LI protein HPV 11 (vzorek D 361-1 z příkladu 1) obsahuje kvasinkovou nepřekládanou úvodní sekvenci (Kniskem, P. J. a další, 1986, Gene 46: 135-141) bezprostředně proti směru vzhledem k iniciačnímu methioninovému kodonů HPV 6/11 LI. Plazmid pGALl-10 byl linearizován BamHI, který štěpí mezi promotorem GAL1 a terminátorem transkripce ADH1 a ligován s fragmentem genu HPV 6/11 LI (vzorek D 361-1) o velikosti 1,5 kbp. Byl proveden výběr transformantů E. coli DH5 (Gibco BRL, lne.) a byl izolován plazmid pGALl-10, obsahující gen HPV 6/11 LI, který byl označen jako D362-1.

Z léze condyloma accuminatum (laskavý dar od. Dr. Darron Brown), byla klonována DNA standardního typu HPV 11 (wt-HPV 11 DNA). Celková lidská genomová DNA byla extrahována a štěpena restrikčními endonukleázami. Frakce obsahující wt-HPV 11 DNA byla ligována do klonovacího vektoru E. coli pro použití jako templát pro PCR. Gen wt-HPV 11 LI byl amplifikován PCR s použitím polymerázy Vent (New Ensland Biolabs, lne.) při deseti cyklech amplifikace (94 °C 1 min, 48 °C 1 min, 72 °C 1 min 45 s) a s použitím následujících oligonukleotidových primerů, obsahujících obklopující místa BglII (podtržená):

negativní primer: 5'-CTC AGATCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC

GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3’ (SEQ ID NO:29) pozitivní primer: 5’-GAG AGA TCT TAC TTT TTG GTT TTG GTA CGT TTT CG-3' (SEQ ID NO:30)

Negativní primer zavádí kvasinkovou nepřekládanou úrovní sekvenci (Kniskem, P. J. a další, 1986, Gene 46: 135-141) bezprostředně proti směru vzhledem k iniciačnímu methioninovému kodonů wt-HPV 11 LI (zvýrazněn tučně). PCR produkt wt-HPV 11 LI o velikosti 1,5 kbp byl štěpen BglII, čištěn na gelu a ligován splazmidem pGALl-10, štěpeným BamHI za vytvoření plazmidu p329—1.

Z HPV 6a pozitivní leze condyloma accuminatum (laskavý dar od: Dr. Darron Brown) byla extrahována celková genomická DNA. Gen HPV 6a LI byl amplifikován pomocí PCR s použitím vzorku z biopsie jako templátu, polymerázy Vent (New England Biolabs, lne.), 35 cyklů amplifikace (94 °C 1 min, 48 °C 1 min, 72 °C 1 min 45 s), přičemž negativní primer je jak uveden výše pro PCR wt-HPV 11 LI a pozitivní primer má sekvenci

-16CZ 291375 B6

5’~GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3' (SEQ ED NO:3I).

PCR produkt HPV 6a LI o velikosti 1,5 kbp byl štěpen BglII, vyčištěn na gelu a ligován s plazmidem pGALl-10 štěpeným BamHI za získání plazmidů D128.

Příklad 5

Příprava kmene 1558

Krok a: Příprava kvasinkového kmene U9

Od Dr. Lelanda Hartwella (University of Washington, Seattle, WA) byl získán kmen Saccharomyces cerevisiae 2150-2-3 (MATalfa, leu2-04, adel, cir°). Buňky kmene 2150-2-3 byly přes noc pomnoženy při 30 °C v 5 ml média YEHD (Carty a další, J. Ind. Micro. 2(1987) 117-121). Buňky byly třikrát promyty sterilní destilovanou vodou, resuspendovány ve 2 ml sterilní destilované vody a 0,1 ml buněčné suspenze bylo vyseto vždy na 6 ploten s kyselinou 5-fluoroorotovou (FOA) pro selekci mutantů ura3 (Cold Spring Harbor Laboratory Manuál for Yeast Genetics). Plotny byly inkubovány při 30 °C. Médium obsahovalo na 250 ml destilované vody: 3,5 g kvasničné dusíkaté báze bez aminokyselin a síranu amonného Difco; 0,5 g kyseliny 5-fluoroorotové; 25 ml uracilu a 10,0 g dextrózy.

Médium bylo sterilizováno filtrací přes membrány 0,2 um a potom smíšeno s 250 ml 4% Bacto-Agaru (Difco), udržovaného při 50 °C, 10 ml roztoku adeninu 1,2 mg/ml a 5 ml roztoku L-leucinu (180 mg/50 ml). Výsledné médium bylo rozplněno po 20 ml do Petriho misek.

Po 5 dnech inkubace se objevily početné kolonie. Rozetřením kolonií z výchozích ploten FOA byly rozetřením na čerstvé plotny FOA izolovány jednotlivé kolonie; inkubace probíhala při 30 °C. Větší množství kolonií z druhé série z ploten FOA bylo testováno na přítomnost ura3 mutací replikativním vysetím na plotny YEHD a uracil-minus. Byl získán jeden izolát (U9) s těmito vlastnostmi. Byl skladován v zásobní giycerolové konzervě při -70 °C (označení # 325) pro pozdější použití.

Krok b: Příprava vektoru pro přerušení kvasničného genu MNN9

Pro přípravu vektoru pro přerušení genu MNN9 bylo nejprve nutné klonovat gen MNN9 zgenomové DNA S. cerevisiae. To bylo uskutečněno standardní technologií polymerázové řetězové reakce (PCR). 5' negativní primer a 3' pozitivní primer pro PCR kódující sekvence MNN9 s úplnou délkou byly navrženy podle publikované sekvence kvasničného genu MNN9 (Zymogenetics: Evropská patentová přihláška No. 88117834.7, č. zveřejnění 0-314-096-A2). Bylo použito následujících oligodeoxynukleotidových primerů, obsahujících obklopující štěpící místa HindlII (podtržená):

negativní primer: 5'4377 AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3’ (SEQ ID NO:32) pozitivní primer: 5’-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3’. (SEQ ID NO:33)

Iniciační methioninový kodon genu MNN9 je zvýrazněn tučné. PCR byla prováděna s použitím genomové DNA S. cerevisiae kmene JRY188 jako templátu, TaqDNA polymerázy (Perkin Elmer) a 25 cyklů amplifikace (94 °C, 1 min; 37 °C, 2 min; 72 °C, 3 min). Výsledný fragment

-17CZ 291375 B6

PCR o délce 1,2 kbp byl štěpen Hindlll, čištěn na gelu a ligován s plazmidem pUC13 (Pharmacia), štěpeným Hindlll a alkalickou fosfatázou. Výsledný plazmid byl označen pl 183.

Aby bylo možno přerušit gen MNN9 kvasničným genem URA3, byl plazmid pBR322-URA3 (který obsahuje fragment Hindlll o délce 1,1 kbp, kódující gen S. cerevisiae u RAS, subklonovaný do místa Hindlll plazmidu pBR322) štěpen Hindlll a fragment DNA o velikosti 1,1 kbp, nesoucí funkční gen URA3 byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA polymerázy zakončen tupým koncem a potom ligován s plazmidem pl 183, štěpeným Pmll (enzym Pmll štěpí uvnitř kódující sekvence MNN9). Výsledný plazmid pl 199 obsahuje přerušení genu MNN9 funkčním genem URA3.

Krok c: Konstrukce derivátu U9 kmene 1372. obsahující přerušení genu MNN9

Pro přerušení genu MNN9 v kmenu U9 (#325) bylo štěpeno 30 pg plazmidu pl 199 enzymem Hindlll pro vytvoření lineární přerušující kazety mnn9::URA3. Buňky kmene 325 byly transformovány sféroplastovou metodou (Hinnen a další, 1978, Proč. Nati. Acad. Se/. USA 75: 19291933) DNA pl 199, štěpenou Hindlll a byla prováděna selekce transformantů na syntetickém agarovém médiu bez uracilu s obsahem 1,0 M sorbitolu. Syntetické médium obsahovalo na litr destilované vody: agar, 20 g; kvasničná dusíkatá báze bez aminokyselin, 6,7 g; adenin, 0,04 g; L-tyrozin, 0,05 g; sorbitol, 182 g; glukóza, 20 g; a bezleucinový roztok #2, 10 ml. Bezleucinový roztok #2 obsahuje na litr destilované vody: L-arginin, 2 g; L-histidin, 1 g; L-leucin, 6 g; L-izoleucin, 6 g; L-lyzin, 4 g; L-methionin, 1 g; L-fenylalanin, 6 g; L-threonin, 6 g; a L-tryptofan, 4 g.

Plotny byly inkubovány 5 dnů při 30 °C, přičemž se objevily početné kolonie. Preparáty chromozomální DNA byly připraveny z 10 kolonií a potom byly štěpeny směsí EcoRI a Hindlll. DNA štěpy byly potom vyhodnoceny Southemovým blotem (J. Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) s použitím fragmentu Hindlll o délce 1,2 kbp nesoucího gen MNN9 (izolovaný z plazmidu pl 199) jako sondy. Byl identifikován izolát (kmen #1372), který vykazoval očekávaný posun pruhů DNA na Southemově blotu stejně jako extrémní shlukování, které typicky vykazují mutanty mnn9.

Krok d: Konstrukce vektoru pro přerušení kvasničného genu HIS3

Aby bylo možno zkonstruovat přerušující kazetu, ve které je gen HIS3 S. cerevisiae přerušen genem URA3, plazmid YEp6 (K. Struh! a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 76: 1035) byl štěpen BamHI a fragment BamHI o délce 1,7 kbp, nesoucí gen HIS3 byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA polymerázy byl zakončen tupými konci a ligován s plazmidem pUC18, který byl předtím štěpen BamHI a poté T4 DNA polymerázou. Výsledný plazmid (označený pl501 nebo pUC18-HIS3) byl štěpen Nhel (který štěpí uvnitř kódující sekvence HIS3) a fragment vektoru byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA polymerázy zakončen tupými konci a potom Štěpen telecí žaludeční alkalickou fosfatázou. Gen URA3 byl izolován z plazmidu pBR322-URA3 štěpením Hindlll a fragment o délce 1,1 kbp, nesoucí gen URA3 byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA polymerázy zakončen tupými konci a ligován svýše uvedeným Nhel fragmentem pUC18-HIS3. Výsledný plazmid (označený pUCI8-his3::URA3 nebo pl505) obsahuje přerušující kazetu, ve které je kvasničný gen H1S3 přerušen funkčním genem URA3.

Krok e: Konstrukce vektoru pro přerušení kvasničného genu PRB1 genem HIS3

Plazmid FP8AH nesoucí gen PRB1 S. cerevisiae byl poskytnut od: Dr. E. Jones, Camegie-Mellon Univ. (C. M. Moehle a další, 1987, Genetics 115: 255-263). Tento plazmid byl štěpen směsí Hindlll a Xhol a fragment DNA nesoucí gen PRB1 o délce 3,2 kbp byl čištěn na gelu a zakončen pomocí T4 DNA polymerázy tupými konci. Plazmid pUC18 byl štěpen BamHI, čištěn na gelu a zakončen pomocí T4 DNA polymerázy tupými konci. Výsledný vektorový fragment byl ligován svýše uvedeným genovým fragmentem PRB1 za vzniku plazmidu

-18CZ 291375 B6 pUC18-PRBl. Plazmid YEp6, který obsahuje gen HIS3, byl štěpen BamHI. Výsledný fragment BamHI o délce 1,7 kbp. nesoucí funkční gen HIS3 byl vyčištěn na gelu a zakončen pomocí T4 DNA polymerázy tupými konci. Plazmid pUC18-PRBl byl štěpen EcoRV aNcol, které štěpí uvnitř kódující sekvence PRB1 a odstraňují aktivní místo proteázy B a obklopující sekvence. Fragment EcoRV-Ncol o délce 5,7 kbp nesoucí zbytkové části 5' a 3' kódující sekvence PRB1 vpUC18 byl vyčištěn na gelu, zakončen pomocí T4 DNA polymerázy tupými konci, defosforylován telecí žaludeční alkalickou fosfatázou a ligován s výše popsaným fragmentem HIS3 s tupými konci. Výsledný plazmid (označený pUC18-prbl::HIS3, zásobní vzorek #1245) obsahuje na místě části genu PRB1, který byl výše odstraněn funkční gen HIS3.

Krokf: Konstrukce kvasničného kmene příbuzného U9, obsahujícího přerušení v genech MNN9ÍPRB1

V příkladu 5c byl popsán kmen 1372 příbuzný U9, který obsahuje přerušení genu MNN9. Klonální izoláty kmene 1372 byly pasážovány na plotnách FOA (jak bylo popsáno v příkladu 5a) pro selekci mutantů ura3. Bylo získáno větší množství ura3 izolátů kmene 1372 a pro následné přerušení genu HIS3 byl zvolen jeden z izolátů (kmen 12930—190—Sl—1). Přerušující vektor (pl505) genu pUC18-his3::URA3 byl štěpen Xbal a EcoRI pro vytvoření lineární přerušující kazety his3::URA3 a použit pro transformaci kmene 12930—190—Sl—1 lithiumacetátovou metodou (Methods in Enzymoloqy. 194: 290 (1991)). Na syntetickém agarovém médiu bez uracilu byla provedena selekce transformantů Ura⁺, které byly rozetřeny pro získání jednotlivých klonů na stejném médiu a potom replikačně vysety na médium buď bez uracilu nebo bez histidinu pro získání izolátů, které byly jak Ura⁺ tak His“. Pro následné přerušení genu PRB1 byl zvolen jeden z izolátů (kmen 12930-230-1). Vektor (pUC18-prbl::HIS3, zásobní vzorek #1245), přerušující gen PRB1, byl štěpen Sací a Xbal pro vytvoření lineární přerušující kazety prbl::HIS3 a použit pro transformaci kmene 12930-230-1 lithiumacetátovou metodou. Na agarovém médiu bez histidinu byly získány transformanty Hisp, které byly rozetřeny na stejném médiu pro získání jednotlivých kolonií. Z většího počtu Hisp izolátů byla připravena genomická DNA, štěpena EcoRI a potom provedena její elektroforéza na 0,8% agarózových gelech. Potom byla provedena analýza Southemovým blotem s použitím radioaktivně značené sondy o délce 617 bp na gen PRB1, která byla připravena pomocí PCR s použitím následujících oligodeoxynukleotidových primerů:

5’ TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3’ (SEQ ID NO:34); a

5’ CAC CGT AGT GTTTGG AAG CGA 3’ (SEQ ID NO:35)

Bylo získáno 11 izolátů, které vykazovaly očekávanou hybridizaci sondy s fragmentem 2,44 kbp prbl::HIS3 DNA. To bylo v kontrastu s hybridizaci sondy s fragmentem o délce 1,59 kbp u genu PRB1 standardního typu. Jeden z těchto izolátů obsahujících požadované přerušení prbl::HIS3 byl vybrán pro další použití a byl označen jako kmen #1558.

Příklad 6

Exprese HPV11 LI a HPV6 LI v kvasinkách

Pro transformaci kmene #1558 S. cerevisiae (MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°) pro transformaci kmene sféroplastovou metodou (Hinnen a další, 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933) byly použity plazmidy D362-1 (pGALl-10+HPV6/l 1 LI), p329-l (pGALl-10+wt-HPVll LI), D128 (pGALl-10+HPV6 LI) a pGALl-10. Kvasinkový kmen #1558 transformovaný plazmidem D362-1 byl označen jako kmen # 1782. Pro studie RNA rostly izoláty jednotlivých kolonií na komplexním mpdiu YEH (Carty a další, 1987, J. Ind. Micro. 2,

-19CZ 291375 B6

117-121), obsahujícím vždy 2 % glukózy nebo galaktózy při 30 °C 26 hodin. Po sklizení buněk byla kvasinková RNA extrahována metodou s použitím kyselého fenolu (Current Protocols in Molecular Biology, díl 2, Current Protocols, 1993). Pro analýzu proteinu byly identické izoláty ponechány růst při 30 °C v komplexním médiu YEH, obsahujícím 0,1 M sorbitol, 2% glukózu a 2% galaktózu po dobu 70 hodin. Po sklizení buněk byly zcentrifugované buňky rozbity skleněnými kuličkami a buněčné lyzáty analyzovány na expresi proteinu HPV 11 LI nebo HPV 6 LI analýzou imunobloty.

Příklad 7

Analýza RNA HPV LI, exprimované kvasinkami northemovými bloty

Vzorky obsahující 10 pg celkové DNA byly denaturovány působením glyoxalu a DMSO (Current Protocols in Molecular Biology, díl 1, Current Protocols, 1993) a provedena jejich elektroforéza na 1,2 % agarózovém gelu s fosfátovým pufrem. RNA byla převedena na nylonovou membránu a detekována pomocí oligonukleotidů značeného ³²P, komplementárního jak k sekvenci HPV 11, tak i HPV 6 LI DNA.

Northemový blot je ukázán na obr. 4. Ve vzorcích, které rostly na médiu s glukózou (dráhy 1, 3 a 5) nebyly detekovány žádné pruhy, odpovídající očekávané velikosti pro HPV LI RNA s úplnou délkou. To je v souladu s očekáváním, protože glukóza reprimuje transkripci kvasinkového promotoru GAL1. Naopak vzorky rostoucí na médiu sgalaktózou, která indukuje transkripci z promotoru GAL1, vykazují silné signály HPV LI RNA. HPV 6 LI byla transkribována jako molekula RNA šupinou délkou (dráha 2), zatímco většina HPV 11 LI standardního typu (wt) byla transkribována ve zkrácené formě (dráha 4). Tento výsledek ukazuje na to, že uvnitř wt-HPV 11 LI ORF je umístěn signál ukončení transkripce, který není přítomný v sekvenci HPV 6 LI. RNA přepisovaná z hybridního kmenu HPV 6/11 se zdá mít úplnou délku (dráha 6). V kontrolním kvasinkovém vzorku s pGALl-10 (dráha 7) není detekována žádná HPV specifická RNA.

Příklad 8

Analýza proteinů HPV LI exprimovaných kvasinkami westernovými bloty

Byla provedena elektroforéza vzorků obsahujících 20 pg celkového buněčného proteinu na 10% Tris-glycinových gelech (Novex, lne.) za denaturačních podmínek a proteiny byly elektroblotovány na nitrocelulózové filtry. Protein LI byl detekován imunologicky s použitím králičího antiséra proti fúznímu proteinu trpE-HPV 11 LI jako primární protilátky (Brown, D. R. a další, 1994, Virology, 201: 46-54) a oslího antikráličího IgG s navázanou křenovou peroxidázou (HRP) (Amersham, lne.) jako sekundární protilátky. Filtry byly zpracovány s použitím chemiluminiscenčního kitu ECL™ Detection Kit (Amersham, lne.). Ve všech vzorcích kromě negativní kontroly pGALl-10 (dráha 4) byl detekován pruh proteinu LI o velikosti 50-55 kDa (obr. 5). Navíc se zdá být množství proteinu HPV 11 LI, exprimovaného hybridním genem HPV 6/11 (dráha 3) ~10* větší než množství proteinu LI, exprimovaného buď genem wt-HPV 11 (dráha 2) nebo genem HPV 6 LI (dráha 1).

Příklad 9

ELISA virům podobných částic HPV11 LI, exprimovaných kvasinkami

Pro určení relativních množství virům podobných částic, produkovaných kvasinkovými klony exprimujícími buď wt-HPV 11 nebo hybrid HPV 6/11 byla použita ELISA. ELISA také byla

-20CZ 291375 B6 použita pro demonstraci, že na virům podobných částicích odvozených od hybridní DNA HPV 6/11 je zachován konformační epitop, jehož působením vznikají silné odpovědi neutralizační protilátky. Tento konformační epitop byl definován monoklonální protilátkou Hll. B2 (Christensen a další, 1990, J. Virol. 64, 5678-5681), dostupnou od firmy Chemicon Intemational (Temecula, CA) jako Chemicon Mab8740. Stručně, jamky destiček ELISA (Maxisorb, Nunc lne., Naperville, IL) byly pokryty klesajícími množstvími celkového kvasinkového proteinu, obsahujícího hybridní HPV 6/11 nebo wt-HPV 11 virům podobné částice ve 100 μΐ PBS. Jako kontroly byly použity viriony wt-HPV 11, čištěné v CsCI (laskavý dar od Dr. D. Brown) a kontrolní kvasinkový protein. Destičky byly před odsátím a blokováním 250 μΐ 10% sušeného mléka (Camation) v TTBS (50 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20) po dobu 2 hod při pokojové teplotě inkubovány přes noc při 4 °C. Před inkubací jamek se 100 μΐ monoklonální protilátky proti virionům HPV 11 Chemicon MAB7840 v 1% sušeném mléku v TTBS 1 hod při pokojové teplotě byly destičky jednou promyty PBS/0,1 % Tween 20. Destičky byly třikrát promyty roztokem PBS/Tween 20 a potom inkubovány se 100 μΐ protimyšího IgG s navázanou alkalickou fosfatázou (Kierkegard & Perry, Gaithersburg, MD) zředěným v poměru 1 : 1000 v 1 % mléku + TTBS 1 hod při pokojové teplotě. Destičky byly opět třikrát promyty PBS/Tween 20 a potom bylo přidáno 100 μΐ fosfatázového substrátu (p-nitrofenylfosfát v diethanolaminovém pufru). Destičky byly inkubovány 30 min při pokojové teplotě.-Reakce byla zastavena přídavkem 50 μΐ 3N NaOH. Destičky byly odečítány na čtecím zařízení destiček ELISA při 405 nm.

Průměrná OD₄₀5 „m ze dvou jamek korigovaná na výsledky pozadí, získané z kontrolních kvasinkových proteinů, byla vynesena proti celkové koncentraci kvasinkového proteinu v jamkách a je ukázána na obr. 6. Hybridní kvasinkový klon HPV 6/11 produkoval více než 10^x více nativních virům podobných částic ve srovnání se standardním klonem. Navíc je na virům podobných částicích přítomen silně neutralizující epitop, rozpoznávaný protilátkou Chemicon Mab8740.

Příklad 10

Elektronmikroskopické studie

Pro elektronmikroskopickou analýzu (Structure Probe, West Chester, PA) byl alikvot každého vzorku (surový vyčeřený lyzát vyčištěných virům podobných částic) umístěn na uhlíkem pokryté měděné mřížky 200 mesh. Po 20 s byla na mřížku umístěna kapka dvouprocentní kyseliny fosfowolframové (PTA), pH 7,0. Mřížky byly ponechány před vyšetřením transmisní elektronovou mikroskopií usušit na vzduchu. Veškerá mikroskopická pozorování byla prováděna s použitím transmisního elektronového mikroskopu JEOL 100CX (JEOL USA, lne.) s urychlovacím napětím 100 kV. Vytvořené mikrofotografie měly konečné zvětšení 100 000*. Jak je ukázáno na obr. 7, byly pozorovány virům podobné částice v rozmezí průměrů 45-55 nm ve všech vzorcích HPV 11, ale ne ve vzorcích kontrolních kvasinek.

Příklad 11

Fermentace HPV 6/11 (kmen #1782)

Nárůst z povrchové kultivace kmene 1728 byl asepticky přenesen do bezleucinového kapalného média, obsahujícího na 1 1: 8,5 g kvasničné dusíkaté báze bez aminokyselin a síranu amonného Difco; 0,2 g adeninu; 0,2 g uracilu; 10 g kyseliny jantarové; 5 g síranu amonného a 0,25 g L-tyrozinu; před sterilizací bylo pH média nastaveno na 5,0 až 5,3 pomocí NaOH. Po růstu 25 hod při 28 °C a 250 ot/min na rotační třepačce byly přídavkem sterilního glycerolu na konečnou koncentraci 17 % (hmotnost/objem) před skladováním při -70 °C (1 ml na zamražovací nádobku) připraveny zamrazené kultury. Ve stejném médiu (750 ml na 2 I baňku) bylo připraveno inokulum pro fermentací kmene 1782, které bylo zaočkováno převedením

-21 CZ 291375 B6 roztaveného obsahu dvou zamrazených nádobek s kulturou do 2 1 baněk a inkubováno při 28 °C a 250 ot/min 25 hod na rotační třepačce. Při fermentaci kmene 1782 byl použit fermentor Chemap 23 L s pracovním objemem po inokulaci 18 1. Produkční médium obsahovalo (na litr): 20 g kvasničného extraktu Difco; 10 g peptonu Sheffield HySoy; 20 g glukózy a 20 g galaktózy; pH 5 média bylo před sterilizací nastaveno na 5,3. Celý obsah (500 ml) dvoulitrové inokulační baňky byl převeden do fermentoru, kde probíhala inkubace při 28 °C, 500 ot/min a 9 1 vzduchu za minutu při tlaku 21,3 kPa. Podle potřeby bylo zvyšováno míchání pro udržení koncentrace rozpuštěného kyslíku větší než 40 % saturace. Postup fermentace byl monitorován měřením glukózy ve vzorcích (analyzátor Beckman Glucose 2 Analyzer) a on-line hmotovou spektro10 metrií (Perkin-Elmer 1200). Po 66 hod inkubace byla dosažena buněčná denzita 9,32 g suché biomasy na litr. Před oddělením buněk byl objem dvou takových fermentaci (celkem 17,5 1 média) spojen. Kultura byla zakoncentrována filtrací dutými vlákny (patrona Amicon H5MP01-43 ve filtračním systému Amicon DC-10) na přibližně 2 1 diafiltrována s2 I roztoku soli s fosfátovým pufrem a dále zakoncentrována (na přibližně 1 1) před rozplněním do 500 ml 15 centrifugačních lahví. Buňky byly odděleny centrifiigací při 7 000 ot/min (rotor Sorval GS3) min při 4 °C. Po odlití supematant byla biomasa skladována při—70 °C až do použití (celkem 358 g mokré biomasy).

Příklad 12

Purifikace rekombinantních kapsidových proteinů HPV typ 11 LI

Všechny kroky byly prováděny při 4 °C, pokud není uvedeno jinak.

Buňky byly skladovány ve zmrazeném stavu při -70 °C. Zmrazené buňky (mokrá hmotnost = 180 g) byly roztaveny při 20-23 °C a resuspendovány v 900 ml pufru „Breaking Buffer“ (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCh). Byíy přidány inhibitory proteáz AEBSF a pepstatin A na konečnou koncentraci 1 mM, popřípadě 1,7 uM. Buněčná kaše byla rozbita při 30 tlaku přibližně 110 MPa čtyřmi průchody zařízením M110-Y Microfluidizer (Microfluidics

Corp., Newton, MA). k rozbité kaši buněk bylo přidáno dostatečné množství 10% detergentu Triton X100® (Pierce, Rockford, IL) pro dosažení koncentrace TX100 0,5 %. Kaše byla míchána 20 hodin. Lyzát s Tritonem XI00 byl centrifugován pro odstranění rozdrcených buněk 40 min při 12 000 x g. Supematant obsahující protein LI byl oddělen.

Supematant byl diafiltrován proti pěti objemům 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 0,5 M NaCl s použitím membránové kazety s tangenciálním tokem (Filtron, Northborough, MA). Materiál zachycený membránou obsahoval podle zjištění radioimunologickým testem a westernovým blotováním protein LI.

Supematant byl nanesen na afinitní kolonu s vysokým rozlišením (vnitřní průměr 11,0 cm ^x 5,3 cm) s náplní pryskyřice SP Spherodex (M)® (IBF, Villeneuve-la-Garenne, Francie), ekvilibrovanou 20 mM fosfátem sodným pH 7,2, 0,5 M NaCl. Po promytí ekvilibračním pufrem a pufrem s 20 mM fosfátem sodným, pH 7,2, 1,0 M NaCl byl eluován protein LI s použitím 45 pufru 20 mM fosfát sodný, pH 7,2, 2,5 M NaCl. V průběhu promývání a eluce byly sbírány frakce. Frakce z kolony byly testovány Bradfordovou metodou na celkový obsah proteinů. Frakce potom byly analyzovány westernovým blotováním a SDS-PAGE s detekcí koloidní Coomassie. Frakce byly také analyzovány radioimunologicky.

Konečný produkt byl analyzován westernovým blotováním a SDS-PAGE s detekcí koloidní Coomassie. Bylo odhadnuto, že protein LI je z> 90% homogenní. Identita proteinu LI byla potvrzena westernovým blotováním. Konečný produkt byl asepticky filtrován membránou 0,22 pm a skladován při 4 °C. Tímto postupem bylo získáno celkem 100 mg proteinu.

-22CZ 291375 B6

Pro elektronmikroskopickou analýzu (Structure Probe, West Chester, PA) byl alikvot každého vzorku umístěn na uhlíkem pokryté měděné mřížky 200 mesh. Po 20 s byla na mřížku umístěna kapka dvouprocentní kyseliny fosfowolframové (PTA), pH 7,0. Mřížky byly ponechány před vyšetřením transmisní elektronovou mikroskopií usušit na vzduchu. Veškerá mikroskopická pozorování byla prováděna s použitím transmisního elektronového mikroskopu JEOL 100CX (JEOL USA, lne.) s urychlovacím napětím 100 kV. Vytvořené mikrofotografie měly konečné zvětšení 100 000 *.

Bradfordův test na celkový protein

Celkový protein byl stanoven s použitím komerčně dostupného kitu Coomassie Plus® kit (Pierce, Rockford, IL). Vzorky byly na potřebnou koncentraci zředěny vodou Mílii—Q. Bylo zapotřebí objemů 0,1 ml a 1,0 ml pro standardizaci, popřípadě pro protokoly mikrostanovení. Pro oba protokoly byl použit pro vytvoření standardní křivky BSA (Pierce, Rockford, IL). Test byl prováděn podle doporučení výrobce. Standardní křivky byly vyneseny na počítači Macintosh líci s použitím software Cricket Graph®.

SDS-PAGE a westernové blotování

Všechny gely, pufry a elektroforetické přístroje byly získány od firmy Novex (Saň Diego, CA) a testy byly prováděny podle doporučení výrobce. Stručně, vzorky byly zředěny na stejné koncentrace proteinu vodou Mílii—Q a smíšeny v poměru 1 : 1 se vzorkovým inkubačním pufrem, obsahujícím 200 mM DTT. Vzorky byly inkubovány 15 min při 100 °C a naneseny na předem připravené 12% Tris-glycinové gely. Elektroforéza probíhala při 125 V 1 hodinu 45 min. Gely byly vyvinuty koloidním barvením Coomassie s použitím komerčně získaného kitu (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Pro westernové blotování byly proteiny převedeny při 25 V po dobu 40 min na membrány PVDF. Membrány byly omyty vodou Mílii—Q a usušeny na vzduchu. Primární protilátkou bylo polyklonální králičí antisérum vytvořené proti fúznímu proteinu TrpE-HPVllUl (dar od Dr. D. Browna). Roztok protilátky byl připraven zředěním antiséra v blotovacím pufru (5 % odtučněné mléko v 6,25 mM fosforečnanu sodném, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃). Inkubace probíhala alespoň 1 hodinu při 20-23 °C. Blot byl promýván třikrát vždy 1 min v čerstvém PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 150 mM NaCl). Roztok druhé protilátky byl připraven zředěním kozího protikráličího IgG antiséra, konjugovaného s alkalickou fosfatázou (Pierce, Rockford, IL) v blotovacím pufru. Inkubace probíhala alespoň 1 hodinu za stejných podmínek. Bloty byly promyty jako dříve a detekovány pomocí jednostupňového substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

Příklad 13

Příprava imunogenních prostředků

Čištěné virům podobné částice se v přípravcích použijí podle známých metod, jako například přídavkem farmaceuticky přijatelných nosičů, stabilizátorů nebo vakcínových adjuvans. Imunogenní VLP podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny pro použití jako vakcíny spojením s fyziologicky přijatelným prostředkem, jako je PBS, roztok soli nebo destilovaná voda. Imunogenní VLP se podávají pro dosažení imunologického účinku v rozmezí dávek přibližně 0,1 až 100 pg, s výhodou přibližně 1 až přibližně 20 pg. Množství VLP v prostředku bude záviset na řadě faktorů, včetně bez omezení na stavu jednotlivce, jeho hmotnosti, věku a pohlaví. Podávání prostředku s VLP je možno uskutečnit řadou cest, včetně bez omezení orální, subkutánní, místní, přes sliznice a intramuskulámí. Takové prostředky s VLP mohou být složeny z jediného typu VLP (tj. VLP z HPV 11 nebo směsi VLP (tj. VLP z HPV 6, HPV 11, HPV 16 a HPV 18).

-23CZ 291375 B6

Mohou být přítomny antimikrobiální ochranné látky, například thimerosal. Imunogenní antigeny podle předkládaného vynálezu mohou být v případě potřeby použity v kombinaci se stabilizátory vakcíny a vakcinovými adjuvans. Typickými stabilizátory jsou specifické sloučeniny, například polyanionty jako je heparin, inozitolhexasulfát, sulfatovany beta-cyklodextrin, méně specifické pomocné látky, jako aminokyseliny, sorbitol, mannitol, xy litol, glycerol, sacharóza, dextróza, trehalóza a změny ve složení roztoku, například neutrální pH, vysoká iontová síla (přibližně 0,5 až 2,0 M soli), dvojmocné kationty (Ca , Mg²⁺). Příklady adjuvans jsou A1(OH)₃ a A1(PO)₄. Vakcína podle předkládaného vynálezu může byl skladována chlazená nebo v lyofilizované formě.

Příklad 14

Příprava protilátek proti VLP

Čištěných VLP se používá pro vytváření protilátek. Termín „protilátky“, jak se zde používá, zahrnuje jak polyklonální tak monoklonální protilátky stejně jako jejich fragmenty, jako Fv, Fab a F(ab)2, které jsou schopny vázat se na antigen nebo hapten. Protilátky se používají mnoha způsoby, včetně bez omezení čištění rekombinantní VLP, čištění nativních proteinů LI nebo L2 a v kitech. Takový kit by obsahoval soustavu nosných prvků, schopných pevně držet alespoň jednu nádobku. Nosná soustava by dále obsahovala reagencie, jako je protilátka anti-VLP nebo VLP, vhodnou pro detekci HPV nebo fragmentů HPV nebo protilátek proti HPV. Nosná soustava může dále obsahovat prostředky pro detekci, jako je značený antigen nebo enzymové substráty apod. Protilátky nebo VLP nebo kity jsou použitelné pro řadu účelů, včetně bez omezení forenzních analýz a epidemiologických studií.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (5)

1. Molekula nukleové kyseliny, kódující protein LI lidského papilomaviru typu 11, přičemž tato molekula je prostá vnitřních signálů ukončení transkripce rozpoznávaných kvasinkou.

2. Nukleová kyselina podle nároku 1, kterou je DNA.

3. Molekula DNA podle nároku 2 se sekvencí uvedenou na obr. 8.

4. Expresní vektor obsahující molekulu DNA podle nároku 2.

5. Expresní vektor obsahující molekulu DNA podle nároku 3.