CZ309197A3 - Izolovaná a čištěná molekula DNA, vektor pro expresi a vakcina - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká syntetické molekuly DNA kódující protein L1 čištěného lidského papilomaviru typu 11a jeho derivátů, vektorů expresi a vakcín.

Dosavadní stav techniky

Tato přihláška navazuje na projednávané US přihlášky No. io 08/413,572 z 30. 3. 1995 a No. 08/413,571 z 30. 3. 1995.

Infekce papilomaviry (PV) se vyskytují u řady zvířat i člověka, u ovcí, psů, koček, králíků, opic, hadů a krav. Papilomaviry infikují epiteliální buňky a obecně indukují v místě infekce benigní epiteliální nebo fibroepiteliální tumory. Infekce PV je druhově specifická; lidský papilomavirus neinfikuje zvíře.

Papilomaviry je možno rozdělit do určitých skupin v závislosti na hostiteli, kterého infikují. Lidské papilomaviry (HPV) jsou dále tříděny do více než sedmdesáti typů, založených na sekvenční homologii DNA. PV typy se zdají být typově specifické imunogeny, u kterých

2o neutralizační imunita proti infekci jednoho typu papilomaviru nevyvolává imunitu proti jinému typu papilomaviru.

U člověka způsobují rozdílné typy HPV různá onemocnění. HPV typů 1, 2, 3, 4, 7, 10 a 26 až 29 způsobují benigní bradavice jak u normálních jedinců, tak i u jedinců s oslabenou imunitou. HPV typů 5,

8, 9, 12, 14, 15, 17, 19 až 25, 36 a 46 až 50 způsobují u pacientů s oslabenou imunitou ploché léze. HPV typů 6, 11, 34, 39, 41 až 44 a 51 až 55 způsobují benigní kondylomata genitální sliznice nebo sliznice «··· ·· ··· ··· ··

- 2 respiračního traktu. HPV typů 16, 18, 31, 33, 35, 45 a 58 způsobují epiteliální dysplasii genitální sliznice a jsou spojeny s většinou místních a invazívních karcinomů děložního hrdla, vagíny, vulvy a análného kanálu..

Papilomaviry jsou malé (50 až 60 nm), ikosahedrální viry DNA bez pouzdra, které kódují až osm časných a dva pozdní geny. Otevřené čtecí rámce (ORF) virových genomů jsou označovány E1 až E7 a L1 a L2, kde „E“ označuje časný a „L“ označuje pozdní. L1 a L2 kódují virové kapsidové proteiny. Časné (E) geny jsou spojeny s io funkcemi jako je replikace viru a transformace buněk.

Hlavním proteinem kapsidy je protein L1, který má molekulovou hmotnost 55 až 60 kDa. Protein L2 je menší kapsidový protein, jehož předpovězená molekulová hmotnost je 55 až 60 kDa a elektroforézou na polyakrylamidovém gelu určená zdánlivá molekulová hmotnost je is 75 až 100 kDa. Imunologická data ukazují, že uvnitř virové kapsomery je většina proteinu L2 vzhledem k proteinu L1 vnitřní. ORF L1 je mezi rozdílnými papilomaviry vysoce konzervován. Proteiny L2 jsou mezi různými papilomaviry konzervovány méně.

Geny L1 a L2 byly identifikovány jako dobré cíle pro 2o imunoprofylaxi. Studie v systémech papilomaviru amerického králíka (cottontail rabbit) (CRPV) a bovinního papilomaviru (BPV) ukázaly, že imunizace proteiny L1 a L2, exprimovanými v bakterii nebo s použitím vektorů vakcínie chránila zvířata od virové infekce. Expresí genů L1 papilomaviru v bakulovirových expresních systémech nebo s použitím vektorů vakcínie vznikaly uspořádané viru podobné částice (virus-like particles, VLP), kterých bylo použito pro indukci odpovědí virus neutralizujících protilátek s vysokým titrem, která koreluje s ochranou vyvolanou podáním viru. Navíc bylo použito genů L1 a L2 pro vytváření vakcín pro prevenci a léčení infekce papilomaviry u lidí a zvířat.

• · · · · · • · ·

- 3 Vývoj a komerční produkce profylaktických a terapeutických vakcín proti infekci PV a onemocnění, obsahujících protein L1, proteiny L1 + L2 nebo modifikované proteiny L1 nebo L1 + L2 byl omezován nedostatkem většího množství čištěného viru a čištěného proteinu. Protože PV se nesnadno kultivuje in vitro, je obtížné vyprodukovat in vitro propagací PV požadovaná množství proteinů L1 a L2. Tyto potíže se zdroji znesnadňují charakterizaci PV a proteinů PV. Bylo by tedy výhodné vyvinout snadno obnovitelný zdroj surových PV proteinů, zvláště PV proteinů L1 a L2 nebo modifikovaných proteinů L1 a L2. Bylo by také užitečné vyvinout způsoby čištění velkých množství surových papilomavirových proteinů až na čistotu vhodnou pro imunologické studie a vývoj vakcín. Bylo by také užitečné vyprodukovat velké množství proteinů papilomaviru s vlastnostmi, vyvolávajícími imunitu, jako nativní proteiny, jako je například is konformace nativního proteinu. Navíc by bylo užitečné vyvinout způsoby analýzy proteinů PV a způsoby určení relativní čistoty proteinů stejně jako prostředků obsahujících proteiny. Takové vysoce vyčištěné proteiny by rovněž byly užitečné při přípravě řady reagencií, použitelných při studiu infekce PV; takové reagencie bez omezení zahrnují polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a analytické standardy.

HPV6 a 11 jsou vyvolávajícími činiteli pro ~ 90 % benigních genitálních bradavic a jsou pouze zřídka spojeny s maligním zvrhnutím (Gissmann a další, 1983, PNAS 80, 560 - 563). V případě condyloma accuminata je HPV6a pokládán za nejhojnější subtyp HPV6 (Brown, D. B., a další, J. din. Microbiol. 31: 1667 - 1673). V posledních letech jsou na vzestupu návštěvy z důvodu genitálních bradavic (condyloma accuminatum nebo pianům). Odhaduje se, že ~ 10 % z celkové populace (ve věku 15-49 let) má infekce genitálního traktu HPV

3o (Koutsky a další, 1988, Epidemiol. Rev. 10, 122 - 163). Zatímco většina kondylomat je spojena s HPV6, v případě hrtanové papilomatózy je dominantním typem HPV11. Replikace HPV11 v • · · ·

- 4 epiteliálních buňkách respiračního traktu stimuluje proliferací těchto buněk, která může vést k izolovaným změnám s menším klinickým významem nebo k mnohočetným rozšiřujícím se změnám a recidivujícímu onemocnění. Recidivující papilomatóza respiračního traktu, onemocnění, které častěji postihuje mladou populaci, může být život ohrožujícím onemocněním, protože způsobuje obstrukce v respiračním traktu. V poslední době byl vyvinut zvířecí model, který dovoluje replikaci infekčního HPV11 (Kreider a další, 1985, Nátuře 317, 639 - 640; Kreider a další, 1987, J. Virol. 61, 590 - 593). Model io umožnil identifikaci konformačních neutralizačních epitopů na nativních virionech a bakulovirem exprimovaných virům podobných částic a použitím monoklonálních protilátek (Christensen a další, 1990, J. Virol. 64, 5678 - 5681; Christensen a Kreider, 1991, Virus Res. 21, 169 - 179; Christensen a Kreider, 1993, Virus Res. 28, 195 is 202; Christensen a další, 1994, 75, 2271 - 2275).

Viru podobné částice obsahující protein HPV11 L1 byly exprimovány jak ve hmyzích, tak i savčích buněčných systémech. Exprese VLP v kvasinkových buňkách nabízí výhodu nižších nákladů a snadnějšího přizpůsobení k růstu ve fermentorech ve velkém měřítku.

2o Protein HPV11 L1 je však v kvasinkových buňkách exprimován v nízkých množstvích. Bylo pozorováno, že je to výsledek zkracování mRNA HPV11 L1. Naopak gen HPV6 L1 se přepisuje jako mRNA s úplnou délkou a je exprimován ve vysokých koncentracích. Modifikací HPV6 L1 DNA pro kódování proteinu HPV11 L1 je možné dosáhnout transkripce mRNA s plnou délkou, což má za následek zvýšení exprese proteinu L1 HPV11. Předkládaný vynález poskytuje genovou sekvenci hybridního genu L1 HPV6/11 stejně jako způsob konstrukce hybridního genu L1 HPV6/11 s použitím syntetických oligonukleotidú. Hybridní gen byl navržen s použitím sekvence L1 HPV6a (Hofmann, K.

J., a další, 1995, Virology, přijatý k publikaci), obsahuje však minimální počet změn bází, nutných pro kódování proteinu L1 HPV11. Na rozdíl od genu L1 HPV11 standardního typu neobsahuje hybridní

• · · ·

- 5 gen HPV6/11 kvasinkou rozpoznávané vnitřní signály ukončení transkripce; jako výsledek je dosaženo produkce mRNA HPV6/11 úplné délky a exprese proteinu L1 HPV11 je zvýšena.

Předkládaný vynález je zaměřen na vysoce čištěný protein L1 papilomaviru. Vynález rovněž zahrnuje způsoby produkce a čištění rekombinantních proteinů papilomaviru, které mají vlastnosti vyvolávající imunitu stejně jako nativní proteiny papilomaviru. Předkládaný vynález je zaměřen na výrobu profylaktických a terapeutických vakcín proti infekci papilomaviry. Elektronová mikroskopie a vazba na konformační protilátky ukazují, že rekombinantní proteiny podle předkládaného vynálezu jsou schopny vytvořit viru podobné částice.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká syntetické molekuly DNA, kódující čištěný protein L1 lidského papilomaviru typu 11 a jeho derivátů. Různá provedení vynálezu zahrnují bez omezení rekombinantní molekuly HPV DNA, RNA komplementární k molekulám rekombinantní HPV DNA, proteiny kódované rekombinantními molekulami DNA, protilátky proti molekulám rekombinantní DNA a příbuzné proteiny, prostředky obsahující DNA, RNA, proteiny nebo protilátky, způsoby použití DNA, RNA, proteinů nebo protilátek stejně jako jejich derivátů. Tyto deriváty bez omezení zahrnují peptidy a proteiny, kódované DNA, protilátky proti DNA nebo protilátky proti proteinům kódovaným DNA, vakcíny obsahující DNA nebo vakcíny obsahující proteiny, kódované

DNA, imunologické prostředky obsahující DNA nebo proteiny kódované DNA, kity obsahující DNA nebo RNA, odvozené od DNA nebo proteinů kódovaných DNA.

HPV6 a 11 jsou činiteli vyvolávajícími ~ 90 % benigních genitálních bradavic a jsou pouze zřídka spojeny s maligním zvrhnutím (Gissmann a další, 1983, PNAS 80, 560 - 563). V případě condyloma • · · · • ·

-6 accuminata je HPV6a pokládán za nejhojnější subtyp HPV6 (Brown, D. B., a další, J. Clin. Microbiol. 31: 1667 - 1673). V posledních letech jsou na vzestupu návštěvy z důvodu genitálních bradavic (condyloma accuminatum nebo pianům). Odhaduje se, že ~ 10 % z celkové populace (ve věku 15-49 let) má infekce genitálního traktu HPV (Koutsky a další, 1988, Epidemiol. Rev. 10, 122 - 163). Zatímco většina kondylomat je spojena s HPV6, v případě hrtanové papilomatózy je dominantním typem HPV11. Replikace HPV11 v epiteliálních buňkách respiračního traktu stimuluje proliferaci těchto io buněk, která může vést k izolovaným změnám s menším klinickým významem nebo k mnohočetným rozšiřujícím se změnám a recidivujícímu onemocnění. Recidivující papilomatóza respiračního traktu, onemocnění, které nejčastěji postihuje mladou populaci, může být život ohrožujícím onemocněním, protože způsobuje obstrukce v respiračním traktu. V poslední době byl vyvinut zvířecí model, který dovoluje replikaci infekčního HPV11 (Kreider a další, 1985, Nátuře 317, 639 - 640; Kreider a další, 1987, J. Virol. 61, 590 - 593). Model umožnil identifikaci konformačních neutralizačních epitopů na nativních virionech a bakulovirem exprimovaných virům podobných částic a použitím monoklonálních protilátek (Christensen a další, 1990, J. Virol. 64, 5678 - 5681; Christensen a Kreider, 1991, Virus Res. 21, 169 - 179; Christensen a Kreider, 1993, Virus Res. 28, 195 202; Christensen a další, 1994, 75, 2271 - 2275).

Vývoj a komerční produkce profylaktických a terapeutických vakcín proti infekci PV a onemocnění, obsahujících protein L1, proteiny L1 + L2 nebo modifikované proteiny L1 nebo L1 + L2 byl omezován nedostatkem většího množství čištěného viru a čištěného proteinu. Protože PV se nesnadno kultivuje in vitro, je obtížné vyprodukovat in vitro propagací PV požadovaná množství proteinů L1 a L2. Tyto potíže se zdroji znesnadňují charakterizaci PV a proteinů PV. Bylo by tedy výhodné vyvinout snadno obnovitelný zdroj surových PV proteinů, zvláště PV proteinů L1 a L2 nebo modifikovaných • · proteinů L1 a L2. Bylo by také užitečné vyvinout způsoby čištění velkých množství surových papilomavirových proteinů až na čistotu vhodnou pro imunologické studie a vývoj vakcín. Bylo by také užitečné vyprodukovat velké množství proteinů papilomaviru s vlastnostmi, vyvolávajícími imunitu, jako nativní proteiny, jako je například konformace nativního proteinu. Navíc by bylo užitečné vyvinout způsoby analýzy proteinů PV a způsoby určení relativní čistoty proteinů stejně jako prostředků obsahujících proteiny. Takové vysoce vyčištěné proteiny by rovněž byly užitečné při přípravě řady reagencií, použitelných při studiu infekce PV; takové reagencie bez omezení zahrnují polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a analytické standardy.

Viru podobné částice obsahující protein HPV11 L1 byly exprimovány jak ve hmyzích, tak i savčích buněčných systémech, ís Exprese VLP v kvasinkových buňkách nabízí výhodu nižších nákladů a snadnějšího přizpůsobení k růstu ve fermentorech ve velkém měřítku. Protein HPV11 L1 je však v kvasinkových buňkách exprimován v nízkých úrovních. Bylo pozorováno, že je to výsledek zkracování mRNA HPV11 L1. Naopak gen HPV6 L1 se přepisuje jako mRNA s úplnou délkou a je exprimován ve vysokých koncentracích. Modifikací HPV6 L1 DNA pro kódování proteinu HPV11 L1 je možné dosáhnout transkripce mRNA s plnou délkou, což má za následek zvýšení exprese proteinu L1 HPV11. Předkládaný vynález poskytuje genovou sekvenci hybridního genu L1 HPV6/11 stejně jako způsob konstrukce hybridního genu L1 HPV6/11 s použitím syntetických oligonukleotidů. Hybridní gen byl navržen s použitím sekvence HPV6a L1 (Hofmann, K. J., a další, 1995, Virology, přijatý k publikaci), obsahuje však minimální počet změn bází, nutných pro kódování proteinu L1 HPV11. Na rozdíl od genu L1 HPV11 standardního typu neobsahuje hybridní gen HPV6/11 kvasinkou rozpoznávané vnitřní signály ukončení transkripce; jako výsledek je dosaženo produkce mRNA HPV6/11 úplné délky a exprese proteinu L1 HPV11 je zvýšena.

- 8 Složení farmaceuticky použitelných prostředků obsahujících

DNA nebo proteiny kódované DNA může být vytvořeno v oboru známými způsoby, například přídavkem farmaceuticky přijatelného nosiče. Příklady takových nosičů a způsobů pro vytváření prostředků je možno nalézt v publikaci Remingtons Pharmaceutical Sciences. Pro vytvoření farmaceuticky přijatelného prostředku, vhodného pro účinné podávání, budou takové prostředky obsahovat účinné množství DNA nebo proteinu nebo VLP. Takové prostředky mohou obsahovat DNA nebo proteiny nebo VLP, odvozené z více než jednoho typu HPV.

Terapeutické nebo diagnostické prostředky podle vynálezu se pacientům podávají v dostatečném množství pro léčení nebo diagnostiku infekcí papilomavirem. Účinné množství se může lišit podle řady faktorů, jako je stav jednotlivce, jeho hmotnost, pohlaví a věk. Dalšími faktory jsou způsoby podávání. Obecně se prostředky budou podávat v dávkách od přibližně 1 pg do přibližně 1 mg.

Farmaceutické prostředky mohou být jednotlivci podávány různými cestami, jako subkutánně, místně, orálně, přes sliznici, intravenozně a intramuskulárně.

Vakcíny podle vynálezu zahrnují DNA, RNA nebo proteiny, 20 kódované DNA, která obsahuje antigenní determinanty, nutné pro indukci vytváření neutralizačních protilátek u hostitele. Tyto vakcíny jsou také dostatečně bezpečné pro podávání bez nebezpečí klinické infekce; nemají vedlejší toxické účinky; mohou být podávány cestou, která je účinná; jsou stabilní; a jsou kompatibilní s nosiči vakcín.

Vakcíny je možno podávat různými cestami, jako orálně, parenterálně, subkutánně, přes sliznici, intravenozně nebo intramuskulárně. Podávaná dávka se může lišit podle stavu, pohlaví, hmotnosti a věku pacienta, způsobu podávání a způsobu papilomaviru vakcíny. Vakcínu je možno použít v dávkovačích formách jako jsou

3o kapsle, suspenze, elixíry nebo kapalné roztoky. Vakcína může obsahovat imunologicky přijatelný nosič.

- 9 Vakcíny se podávají v terapeuticky účinných množstvích, tj. v množstvích dostatečných pro vytvoření imunologické ochranné odezvy. Terapeuticky účinné množství se může lišit podle typu papilomaviru. Vakcína může být podávána v jediné dávce nebo ve více dávkách.

Čištěné proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být použity při sestavování imunogenních prostředků. Takové prostředky jsou schopny při zavedení do vhodného hostitele indukovat u něj imunologickou odpověď.

Čištěné proteiny podle vynálezu nebo jejich deriváty mohou být použity pro vytváření protilátek. Termín „protilátka“, jak se zde používá, zahrnuje jak polyklonální, tak i monoklonální protilátky stejně jako jejich fragmenty, jako fragmenty Fv, Fab a F(ab)2, které jsou schopny vázat antigen nebo hapten.

Proteiny a deriváty proteinů podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro určení sérotypu infekce HPV a screening HPV. Pro vytváření kitů pro detekci a určování sérotypů HPV je možno použít čištěných proteinů, VLP a protilátek. Takový kit by obsahoval soustavu nosných prvků, schopných pevně držet alespoň jednu nádobku. Nosná soustava by dále obsahovala reagencie, jako jsou proteiny L1 nebo L2 nebo VLP, odvozené od rekombinantních molekul HPV 6/11 nebo jiných rekombinantních DNA molekul HPV nebo protilátky, zaměřené proti těmto proteinům. Nosná soustava může dále obsahovat prostředky pro detekci, jako je značený antigen nebo enzymové substráty apod.

Čištěné proteiny mohou být také použity jako imunologické standardy, markéry molekulové hmotnosti a velikosti molekuly.

Je známo, že u různých kodonů, kódujících specifické aminokyseliny, je podstatná míra redundance. Proto je vynález rovněž zaměřen na takové sekvence DNA, které kódují alternativní kodony, kódující při eventuálním překladu stejnou aminokyselinu. Pro účely

- 10 této specifikace bude definována sekvence, nesoucí jeden nebo více nahrazených kodonů, jako degenerovaná varianta. V rámci vynálezu jsou rovněž zahrnuty mutace buď v sekvenci DNA nebo překládaném proteinu, které v podstatné míře nezmění konečné fyzikální vlastnosti exprimovaného proteinu. Například substituce valinu za leucin, argininu za lyzin nebo asparaginu na glutamin nemusí způsobit změnu funkce polypeptidů.

Je známo, že sekvence DNA kódující peptid mohou být změněny, aby kódovaly peptid s jinými vlastnostmi než má v přírodě se vyskytující peptid. Metody změny sekvencí DNA zahrnují bez omezení místně specifickou mutagenezi.

Jak se zde používá, „funkční derivát“ hybridního genu HPV 6/11 je sloučenina, která má biologickou aktivitu (buď funkční nebo strukturální), která je v podstatné míře podobná biologické aktivitě

HPV 6/11. Termín „funkční deriváty“ má zahrnovat „fragmenty“, „varianty“, „degenerované varianty“, „analogy“, „homology“ nebo „chemické deriváty“ HPV 6/11.

Termín „analog“ označuje molekulu s v podstatě podobnou funkcí celé molekule HPV 6/11 nebo jejímu fragmentu.

2o Klonovaná DNA HPV 6/11 nebo její fragmenty, získané výše popisovanými způsoby, mohou být rekombinantním způsobem molekulárním klonováním do expresního vektoru obsahujícího vhodný promotor a jiné vhodné prvky pro regulaci transkripce a převedením vektoru do prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky exprimovány za vzniku rekombinantní HPV 11. Způsoby těchto manipulací jsou úplně popsány v Sambrook, J. a další, výše a jsou v oboru známy.

Expresní vektory jsou zde definovány jako sekvence DNA, požadované pro transkripci klonovaných kopií genů a translaci jejich mRNA ve vhodném hostiteli. Tyto vektory mohou být použity pro expresi eukaryotických genů v řadě hostitelů, jako jsou bakterie, • · • · · ·

- 11 modrozelené řasy, rostlinné buňky, hmyzí buňky, houbové buňky a zvířecí buňky. Specifickým způsobem navržené vektory dovolují přesun DNA mezi hostiteli jako například bakterie-kvasinka nebo bakterie-zvířecí buňky nebo bakterie-buňky hub nebo bakterie-buňky bezobratlých. Vhodně vytvořený expresní vektor by měl obsahovat: počátek replikace pro autonomní replikaci v hostitelských buňkách, volitelné markéry, omezené množství využitelných míst pro štěpení restrikčními enzymy, schopnost reprodukovat se ve vysokém počtu kopií a aktivní promotory. Promotor je definován jako sekvence DNA, která navede RNA polymerázu k vazbě na DNA a zahájení syntézy RNA. Silný promotor je ten, který způsobí iniciaci transkripce mRNA s vysokou frekvencí. Expresní vektory mohou bez omezení zahrnovat klonovací vektory, modifikované klonovací vektory, specificky navržené plazmidy nebo viry.

is Pro expresi HPV 6/11 DNA nebo jejích fragmentů v savčích buňkách je možno použít různé savčí expresní vektory. Komerčně dostupné savčí expresní vektory, které mohou být vhodné pro expresi HPV 6/11, zahrnují bez omezení pcDNA3 (Invitrogen), pMCIneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), a XZD35 (ATCC 37565).

Pro expresi HPV 6/11 DNA nebo jejích fragmentů v bakteriálních buňkách je možno použít řady bakteriálních expresních vektorů. Možné vhodné komerčně dostupné bakteriální expresní vektory jsou bez omezení pET11a (Novagen), lambda gt11 (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Pro expresi HPV 6/11 nebo jejích fragmentů v buňkách hub je možno použít řady houbových expresních vektorů. Možné vhodné komerčně dostupné expresní vektory houbových buněk, které mohou • 9 •ΦΦΦ ··

- 12 být vhodné pro expresi rekombinantní HPV 6/11 DNA, jsou bez omezení pYES2 (Invitrogen), expresní vektor Pichia (Invitrogen), a expresní vektor Hansenula (Rhein Biotech, Dusseldorf, Německo).

Pro expresi HPV 6/11 DNA nebo jejích fragmentů v hmyzích buňkách je možno použít řady expresních vektorů hmyzích buněk. Možné vhodné komerčně dostupné expresní vektory hmyzích buněk, kterých je možno použít pro rekombinantní expresi HPV 6/11, jsou bez omezení pBlue Bac III (Invitrogen).

Expresní vektor obsahující DNA kódující HPV 6/11 nebo jeho io fragmenty je možno použít pro expresi HPV 11 proteinů nebo fragmentů HPV 11 proteinů v buňkách, tkáních, orgánech nebo zvířatech (včetně lidí). Hostitelské buňky mohou být prokaryotické nebo eukaryotické, včetně, bez omezení, bakterií jako je E. coli, houbových buněk jako jsou kvasinky, savčích buněk bez omezení na buněčné linie lidského, hovězího, vepřového, opičího nebo hlodavčího původu, včetně bez omezení buněčných linií odvozených z drozofil a larev bource morušového. Buněčné linie, odvozené ze savčích druhů, které mohou být vhodné a které jsou komerčně dostupné, zahrnují bez omezení L buňky L-M(TK‘) (ATCC CCL 1.3), L buňky L-M (ATCC CCL

1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Ráji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL

70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61 ), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) a MRC-5 (ATCC CCL 171 ).

Expresní vektory mohou být do hostitelských buněk zavedeny jakýmkoliv z velkého množství způsobů včetně bez omezení transformace, transfekce, lipofekce, fúze protoplastů a elektroporace. Buňky obsahující expresní vektor jsou jako jednotlivé klony pomnožovány a individuálně analyzovány na produkci proteinu HPV

11. Identifikace klonů hostitelských exprimujících buněk HPV 11 může «· ···· • · · • · · • ··· * • · ·· · • · · ·

- 13 4« ·· ft · · • ·· ···· ·· být provedena několika způsoby, včetně bez omezení pomocí imunologické reaktivity s protilátkami anti-HPV 11.

Exprese fragmentů HPV DNA může být také provedena s použitím syntetické mRNA nebo nativní mRNA, produkovaných in vitro.

Syntetická mRNA nebo mRNA, izolovaná z buněk produkujících hybridní DNA HPV 6/11 může být účinně překládána v různých bezbuněčných systémech, včetně bez omezení v extraktech z pšeničných klíčků a retikulocytárních extraktech, stejně jako může být účinně překládána v buněčných systémech, včetně bez omezení io mikroinjekcí do žabích oocytů, přičemž mikroinjekci do žabích oocytů se dává přednost.

Po expresi proteinu (proteinů) HPV 11 v hostitelské buňce může být protein HPV 11 oddělen, aby byl získán ve vyčištěné formě. Dostupných a vhodných pro použití je několik purifikačních postupů pro HPV 11. Jak se zde popisuje, rekombinantní protein HPV 11 může být purifikován z buněčných lyzátů a extraktů různými kombinacemi nebo použitím jednotlivých způsobů izolace jako je frakcionace pomocí soli, iontoměničová chromatografie, gelová (size exclusion) chromatografie, chromatografie s adsorpcí na hydroxylapatit a

2o chromatografie založená na hydrofobních interakcích.

Rekombinantní protein HPV 11 může být dále oddělen od jiných buněčných proteinů použitím imunoafinitní kolony, vyrobené s použitím monoklonálních nebo polyklonálních protilátek, specifických pro nascentní HPV 11 s plnou délkou nebo pro polypeptidové fragmenty HPV 11. Monoklonální a polyklonální protilátky mohou být připraveny řadou v oboru známých způsobů. Monoklonální nebo monospecifická protilátka se zde definuje jako jediný druh protilátky nebo protilátka složená z více druhů protilátek s homogenními vazebnými charakteristikami pro HPV 11. Homogenní vazba zde

3o označuje schopnost druhu protilátky vázat se na specifický antigen nebo epitop.

Je zřejmé, že způsoby produkce monospecifických protilátek mohou být použity pro výrobu protilátek specifických proti polypeptidovým fragmentům HPV nebo nascentním HPV polypeptidům s plnou délkou. Zvláště je zřejmé, že mohou být vytvořeny monospecifické protilátky, které jsou specifické proti plně funkčním HPV proteinům nebo jejich fragmentům.

Předkládaný vynález je také zaměřen na způsoby screeningu na sloučeniny, které modulují expresi DNA nebo RNA, kódující HPV stejně jako funkci (funkce) proteinu HPV 11 in vivo. Sloučeniny io modulující tyto aktivity mohou být DNA, RNA, peptidy, proteiny nebo neproteinové organické molekuly. Sloučeniny mohou modulovat zvýšením nebo snížením exprese DNA nebo RNA kódující HPV 11 nebo funkce proteinu HPV 11. Sloučeniny modulující expresi DNA nebo RNA kódující HPV 11 nebo funkci proteinu HPV 11 mohou být detekovány pomocí různých testů. Test může být jednoduchý test „ano/ne“ pro určení, zda nastává změna v expresi nebo funkci. Test může být proveden kvantitativně porovnáním exprese nebo funkce testovaného vzorku s úrovněmi exprese nebo funkce ve standardním vzorku.

Mohou být připraveny kity, obsahující hybridní DNA HPV 6/11, fragmenty hybridní DNA HPV 6/8, protilátky proti HPV 6/11 DNA nebo proteinu HPV 11, HPV 6/11 hybridní RNA nebo protein HPV 11. Takové kity se používají pro detekci DNA, která hybridizuje s HPV 6/11 DNA, nebo pro detekci přítomnosti proteinu HPV 11 nebo peptidových fragmentů ve vzorku. Tato charakterizace je užitečná pro mnoho účelů včetně bez omezení forenzní analýzy a epidemiologických studií.

Je možno syntetizovat nukleotidové sekvence komplementární k

DNA sekvenci kódující HPV 6/11 pro terapii antimolekulami (antisense therapy). Těmito antimolekulami mohou být DNA, stabilní deriváty

DNA jako fosforothioáty nebo methylfosfonáty, RNA, stabilní deriváty • · _ ή 5 - ······ .····· ··

RNA jako 2'-0-alkylRNA nebo jiné antioligonukleotidy, napodobující HPV 6/11. Antimolekuly HPV 6/11 mohou být zavedeny do buněk mikroinjekcí, enkapsulací lipozomů nebo expresí z vektorů, nesoucích antimediátorové sekvence. Terapie antimolekulami HPV 6/11 může být zvláště užitečná pro léčení onemocnění, při kterém je prospěšné snížit aktivitu HPV 11.

Termín „chemický derivát“ popisuje molekulu, obsahující další chemické skupiny, které normálně nejsou součástí základní molekuly. Tyto skupiny mohou zlepšit rozpustnost, poločas životnosti molekuly, io absorpci apod. základní molekuly. Tyto skupiny mohou také alternativně zeslabit nežádoucí vedlejší účinky základní molekuly nebo snížit toxicitu základní molekuly. Příklady takových skupin se popisují v řadě textů, jako například Remingtonů Pharmaceutical Sciences.

Popisovanými metodami identifikované sloučeniny mohou být 15 použity samostatně ve vhodných dávkách, které se určují rutinním testováním s cílem dosáhnout optimální inhibici HPV 11 nebo jeho aktivity s minimalizací možné toxicity. Navíc může být žádoucí současné nebo následné podávání jiných prostředků.

S výhodou mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu 2o podávány v jediné denní dávce, nebo může být celková denní dávka podána v několika dílčích dávkách. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být navíc podávány řadou cest včetně bez omezení cesty intranazální, orální, transdermální nebo použitím čípků.

Pro kombinační léčení více než jedním aktivním prostředkem, 25 kde se aktivní složky nacházejí v oddělených dávkovačích prostředcích, mohou být aktivní složky podávány současně nebo zvlášť v odděleně uspořádaných časech.

Dávkovači režim použití sloučenin podle předkládaného vynálezu se volí podle řady faktorů včetně typu, druhu, věku, hmotnosti, pohlaví a klinického stavu pacienta; vážnosti léčeného stavu; cesty podávání; jaterní a ledvinové funkce pacienta; a konkrétní

použité sloučeniny. Lékař s běžnými znalostmi v oboru může snadno určit a předepsat účinné množství léčiva, vyžadovaného pro prevenci, odvrácení nebo zamezení postupu léčeného onemocnění. Optimální přesnost v dosahování koncentrací léčiva uvnitř mezí, kdy je léčivo účinné a netoxické vyžaduje režim, založený na kinetice, dostupnosti léčiva cílovým místům. K tomu je nutno vzít v úvahu rozdělení, rovnováhu a vylučování léčiva.

Při způsobech podle předkládaného vynálezu mohou tvořit zde podrobně popisované sloučeniny aktivní složku a typicky se podávají ve směsi s vhodnými farmaceutickými diluenty, pomocnými látkami nebo nosiči (souhrnně zde označovanými jako „nosné“ materiály), vhodně zvolenými s ohledem na zamýšlenou formu podávání, tj. orální tablety, kapsle, elixíry, sirupy, čípky, gely apod. v souladu s běžnou farmaceutickou praxí.

Například pro orální podávání ve formě tablety nebo kapsle může být aktivní složka léčiva kombinována s orálním netoxickým farmaceuticky přijatelným inertním nosičem, jako je ethanol, glycerol, voda apod. Kde je to žádoucí nebo nutné, mohou být navíc také do směsi zahrnuty vhodné vazné látky, kluzné látky, látky usnadňující rozpadávání a barviva. Vhodnými vaznými látkami jsou bez omezení škrob, želatina, přírodní cukry jako glukóza nebo beta-iaktóza, obilná sladidla (corn sweeteners), přírodní a syntetické gumy jako je akácie, tragakant nebo alginát sodný, karboxymethylcelulóza, polyethylenglykol, vosky apod. Kluzné látky, používané v těchto dávkovačích formách, zahrnují bez omezení oleát sodný, stearát sodný, stearát hořečnatý, benzoát sodný, octan sodný, chlorid sodný apod. Látky pro usnadnění rozpadávání zahrnují bez omezení škrob, methylcelulózu, agar, bentonit, xantanovou gumu apod.

Pro kapalné formy může být aktivní složka léčiva kombinována

3o ve vhodně ochucených suspendujících nebo dispergujících prostředcích, jako jsou syntetické a přírodní gumy, například • · · · ···· · · »· ·· • · · · φ · · • · · · · · · · · φ φ • · · φ φ · 1 . 17 - ..........* ’* tragakant, akácie, methylcelulóza apod. Další dispergující prostředky, které mohou být použity, zahrnují glycerin apod. Pro parenterální podávání se vyžadují sterilní suspenze a roztoky. Když se vyžaduje intravenozní podávání, používají se izotonické přípravky, které obsahují obvykle vhodné ochranné látky.

Místní přípravky obsahující aktivní složku léčiva mohou být připraveny smísením s řadou nosných materiálů, které jsou v oboru dobře známy, jako jsou například alkoholy, gel aloe vera, alantoin, glycerin, vitamíny A a E, oleje, minerální oleje, PPG2 myristyl io propionát apod. za vytvoření například alkoholických roztoků, místních čisticích roztoků, čisticích krémů, kožních gelů, kožních omývacích roztoků a šamponů ve formě krémů nebo gelu.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také podávány ve formě lipozomových dodávacích systémů, jako jsou malé jednomembránové (unilamellar) váčky, velké jednomembránové váčky a vícemembránové váčky. Lipozomy je možno vytvořit z řady fosfolipidů, jako je cholesterol, stearylamin nebo fosfatidylcholiny.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také dodávány s použitím monoklonálních protilátek jako individuálních

2o nosičů, na které jsou molekuly sloučenin podle vynálezu navázány. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také navázány na vhodné polymery ve funkci cílených nosičů léčiv. Tyto polymery mohou zahrnovat polyvinylpyrrolidon, pyranový kopolymer, polyhydroxypropylmetakrylamidfenol, polyhydroxy25 ethylaspartamidfenol nebo polyethylenoxidpolylyzin, substituovaný palmitoylovými zbytky. Navíc mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu navázány na látky třídy biodegradovatelných polymerů, použitelných pro získání léčiva s řízeným uvolňováním účinné látky, například na kyselinu polymléčnou, polyepsilon30 kaprolakton, kyselinu polyhydroxymáselnou, polyortoestery, • · • · ·· · 4 4 4 4 ·· ·· 4 · · 4444

4 4 4 4 4 4

4444 44 444 444 44 4

- 18 polyacetaly, polydihydropyrany, polykyanoakryláty a zesítěné nebo amfipatické blokové kopoloymery hydrogelů.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je schéma konstrukce hybridního genu L1 HPV 6/11 s použitím syntetických oligonukleotidů.

Obr. 2 ukazuje nukleotidovou sekvenci hybridu HPV 6/11, publikovanou sekvenci HPV 6a a publikované geny L1 HPV11.

Obr. 3 ukazuje obousměrný kvasinkový expresní vektor pGAL 1-10, io použitý pro expresi kapsidových proteinů L1 papilomaviru.

Obr. 4 ukazuje northernovou analýzu kvasinkové mRNA HPV11 L1. Obr. 5 ukazuje westernovou analýzu (imunoblot) proteinu HPV 11 L1, exprimovaného v kvasinkách.

Obr. 6 ukazuje reaktivity virům podobných částic HPV11 L1, is exprimovaných HPV11 standardního typu ve srovnání s hybridní

DNA HPV 6/11 metodou ELISA.

Obr. 7 ukazuje elektronovou mikrofotografii virům podobných částic HPV11 L1, exprimovaných v kvasinkách.

Obr. 8 ukazuje nukleotidovou sekvenci hybridního genu HPV 6/11.

Následující příklady ilustrují předkládaný vynález, aniž by jej však měly nějak omezovat.

- 19 ·· ·« · · · · · · · • · · · · · ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce syntetického genu L1

S použitím syntetických oligomerů DNA, získaných od firmy

Midland Reagent Company, byl zkonstruován otevřený čtecí rámec HPV 11 L1 o velikosti 1,5 kbp. Použité oligomery byly dodány s 5’koncovými fosfáty. Jak je vyjmenováno níže, bylo zapotřebí celkem 24 oligomerů:

#241-1

5'GAAGATCTCACAAAACAAAATGTGGCGGCCTAGCGACAGCA CAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCC ACGGATGCTTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCA GCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATT 3’ (SEQ ID NO:1) #2412 ¹⁵ 5’ATTCCATAAAAAAGGTTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGT CAGGATATCAATACAGAGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCC TAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAA CACAACGTTTGGTATGGGCATGCATGT 3’ (SEQ ID NO:2) #241-3

5’ACATGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCCGGGGACAGCCAT

2θ TAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTACTAAATAAATATGA TGATGTTGAAAATTCAGGGGGTTACGGTGGTAACCCTGGACAG GATAACAGG 3' (SEQ ID NO:3)

-20 #241-4

5'GTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATG GTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTA CACAGTGTAGTAATACATCTGTACAGAATGGTGACTGCCCGC 3' (SEQ ED NO:4) #241-5

5’CCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGG TTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACC AATAAATCAGATGTTCCTCTTGACATATGTGGCACTGTA 3' (SEQ ID NO:5) #241-6

5’TGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCATAT GGTGATAGATTATTTTTTTATCTACGGAAGGAACAAATGTTTGC CAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGTACCCC 3’(SEQ ED NO:6) #241-7

5’GGGGTACCGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGATCTTTTAGTTA AGGGTGGTAACAATCGCTCGTCTGTAGCGAGTAGTATATATGT TCACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACA 3’ (SEQ ID NO:7) #241-8

5’ATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACA TAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCATCTGTTTGTTACTGTGG TAGATACCACACGCAGTACCAACATGA 3'(SEQ ED NO:8) #241-9

5'CATTATGTGCATCCGTATCTAAATCTGCCACATACACCAATTC TGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTTTGATTTA CAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATT 3*(SEQ ID NO:9) • ·

- 21 #241-10

5’ACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAAT CCCTCTGTTCTCGAGGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCC AAATGGTACACTCGAGCGG 3'(SEQ ID NO: 10) #241-11

5’CCGCTCGAGGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATT ACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGGAAAAGCAAGATCCCT ATAAGGACATGAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTT TTCTAGTGAATTGGATCAGTTTCCTTT 3' (SEQ ID NO:11) #241-12

5’GGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGAC CTCTGCTCGTACCGGTATTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAACCCT CTACTGCCCCTAAACGTAAGCGCACCAAAACTAAAAAGTAAG ATCTTC 3’ (SEQ ID NO: 12) #241-13

5OAAGATCTTACTTTTTAGTTTTGGTGCGCTTACGTTTAGGGGC AGTAGAGGGTTTGGAAACAGCAGGGCGCTTAATACCGGTACG AGCAGAGGTCCGTCCCCTATATCCACTTTGTAACAAAAACTTG CGTCCCAAAGGAAACTGATCCAATTC 3’ (SEQ ID NO: 13) #241-14

5'ACTAGAAAACTTTTCTTTTAAATTAACCTCCCAAAAACTCATG TCCTTATAGGGATCTTGCTTTTCCTTTTCAGGAGTGGGCTTTTG ACAGGTAATGGCCTGTGACTGCACATACCTATAGGTATCCTCG AGCGG 3' (SEQ ID NO: 14) #241-15

5’CCGCTCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTT CCAGTCCTCGAGAACAGAGGGATTCATTGTGTGAATATAGGCC ATTACTTCAGCAGACAATGTAATGCTACATAATTGAAAAA 3' (SEQIDNO:15) ft · « · · ·

- 22 #241-16

5'TAAATTGTAAATCAAACTCTTCCACATGACGCATGTACTCTTT ATAATCAGAATTGGTGTATGTGGCAGATTTAGATACGGATGCA CATAATGTCATGTTGGTACTGCGTGTG 3' (SEQ ID NO: 16) #241-17

5'GTATCTACCACAGTAACAAACAGATGATTACCCCAACAAATA CCATTGTTATGTCCCTGGGCTTTTTGTAGCCAATATGGCTTATT AAACAATTGTGCCTCAGAGGACACCAA 3’ (SEQ ID NO: 17) #241-18

5'AGAGCCGCTTGGGGTGTGAACATATATACTACTCGCTACAGA CGAGCGATTGTTACCACCCTTAACTAAAAGATCATCAGGCACA GGTTCCCCCACGGTACCCC 3' (SEQ ID NO: 18) #241-19

5'GGGGTACCAGCCCTGTTAAAAAAATGTCTGGCAAACATTTGT TCCTTCCGTAGATAAAAAAATAATCTATCACCATATGGGTCTG CAGCCATTTGTAAATAATCTGGATATTTACATACAGTGCCACA TATGTCAA 3' (SEQ ID NO: 19) #241-20

5’GAGGAACATCTGATTTATTGGTCTGCAAATCAGCAAAATTCA TAGCACCAAAGCCTGTGTCAACCATATCGCCATCCTGTATAAC ACTGGTAATAAGTTCTAAGGGCGGGCAGTCACCATTCTGT 3' (SEQ ID NO:20) #241-21

5'ACAGATGTATTACTACACTGTGTACCTTTACCCCAATGCTCGC CCAAAGGGGGGGCACATCCAACCATGCATAATTGTGTTTGTTT ATAATCCATACCTACATTAACCCTGTTATCCTGTCCAGGGT 3' (SEQIDNO:21) • ·

#241-22

5’TACCACCGTAACCCCCTGAATTTTCAACATCATCATATTTATT TAGTAAAGGATGTCCACTTACACCCACACCTAATGGCTGTCCC CGGCCCACCTCTAGGCCTGTGCATGCATGT 3'(SEQ ID NO:22) #241-23 ⁵ 5'ACATGCATGCCCATACCAAACGTTGTGTTGTGGGATC.XAAAA GAGACGAGTCAGGCAATGCAAATTTGTTAGGATCTGGTAACAC CACCTTAAATACTCTGTATTGATATCCTGACACCTTTGGCACAA (SEQ ID NO:23) #241-24

5'ACTGCAAGAAGTCTAGAACTGCTGGCATGATAAAATATGTTG GTGCGTTTAACATAAGCATCCGTGGCAACAACTTTGGATACAG GGTTAGGAGGAGGCACATATACTGTGCTGTCGCTAGGCCGCCA CATTTTGTTTTGTGAGATCTTC 3' (SEQ ID NO:24)

V oddělených zkumavkách obsahujících 2,5 mM Tris, pH 7,5,

0,25 mM EDTA byly teplotně hybridizovány oligomery vytvářející komplementární páry (# 241-1 a # 241-24, # 241-2 a # 241-23, # 241-3 a # 241-22, # 241-4 a # 241-21, # 241-5 a # 241-20, # 241-6 a # 24119, # 241-7 a # 241-18, # 241-8 a # 241-17, # 241-9 a # 241-16, # 24110a# 241-15, # 241-11 a # 241-14, # 241-12 a # 241-13 - obr. 1).

2o Zkumavky byly zahřívány 4 min na 98 °C a potom byly umístěny do 250 ml kádinky s obsahem 200 ml vody o teplotě 98 °C a ponechány pomalu ochlazovat. Když se voda ochladila na pokojovou teplotu, hybridizované páry byly přidány do zkumavek označených: fragment A (páry oligomerú # 241-1 & 24, a - 2 & 23); fragment B (# 241-3 & 22, 25 4 & 21, - 5 & 20, a - 6 & 19); fragment C (# 241-7 & 18, - 8 & 17, - 9 &

a - 10 & 15) a fragment D (# 241-11 & 14 a -12 & 13). Tyto směsi oligomerních párů byly zahřívány 2 minuty na 62 °C a potom pomalu ochlazeny jako dříve. Obsah každé zkumavky byl přes noc při 23 °C

- 24 ligován s použitím T4 DNA ligázy ( Boehringer Mannheim, Inc.) s použitím reagencií, dodaných výrobcem.

Po ligaci bylo nutno provést amplifikaci fragmentu B pomocí PCR pro zvýšení množství produktu o plné délce. To vyžadovalo 10 cyklů 94 °C, 1 min; 48 °C, 1 min; 72 °C, 1 min následovaných 10 minutami při 72 °C, v přístroji Applied Biosystems thermocycler s použitím Taq polymerázy Boehringer Mannheim a oligomerních primerů;

5'GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG 3' (SEQ ID NO:25) a.

5’ GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA 3’ (SEQ ID NO:26).

Ligované produkty a fragment B z PCR byly štěpeny restrikčními enzymy (Boehringer Mannheim, Inc.) podle následujícího schématu: Fragment A byl štěpen Bglll a Sphl; fragment B, Sphl a Kpnl; fragment

C, Kpnl a Xhol; a fragment D, Xhol a Bglll. Štěpené fragmenty byly rozděleny na agaróze s nízkou teplotou tání (FMC BioProducts) a fragmenty se správnou velikostí byly izolovány vyříznutím pruhu a štěpením agarózy pomocí enzymu Agarase™ (Boehringer Mannheim, Inc.) podle doporučení výrobce. Fragmenty A, B a D byly odděleny

2o sráženým ethanolem a potom odděleně ligovány do vektoru pSP72 (Promega, Inc.), který byl štěpen restrikčními enzymy odpovídajícím způsobem jako ligované fragmenty.

Fragment C štěpená Kpnl a Xhol byl nejprve ligován do tepelné hybridizovaných oligomerů.

5’TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTA CAC 3'; (SEQ ID NO:27) a

5’TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAG TCT3' (SEQ ID NO:28).

- 25 Fragment C byl potom znovu štěpen Xhol a fragment Kpnl Xhol o velikosti 450 bp byl ligován s vektorem pSP72, štěpeným Kpnl a Xhol. Ligační směsi byly použity pro transformaci kompetentních buněk Escherichia coli DH5 (Gibco BRL, Ghaithersburg, MD). Byl proveden screeníng transformantů na klony obsahující inzert hybridizací kolonií (J. Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Z pozitivních klonů byla izolována plazmidová DNA s použitím kitu Wizard miniprep kit (Promega Corp.) a sekvenována na io sekvenátoru Applied Biosystems 373A DNA Sequencer. Klony, obsahující správnou sekvenci DNA pro každý ze čtyř fragmentů byly štěpeny jako výše pro uvolnění fragmentů z vektoru pSP72. Fragment C štěpený Kpnl a Xhol byl ligován s fragmentem D štěpeným Xhol Bglll a Kpnl, Bglll štěpem pSP72 pomocí třícestné (three-way) ligace.

Produkty ligace byly použity pro transformaci E. coli. Výsledné transformanty byly sekvenovány a byl získán klon se správnou sekvencí (označený CD). Inzert Bglll Kpnl o délce 750 bp sekvence CD byl znovu vyštěpen z vektoru pSP72 a ligován s fragmentem A, štěpeným Bglll, Sphl a fragmentem B, štěpeným Sphl, Kpnl s použitím

2o třícestné ligace jako výše s tím rozdílem, že pro snížení množství nežádoucích produktů ligace byl přidán enzym Bglll. Ligační produkty byly odděleny na agarózových gelech a byl izolován fragment o velikosti 1,5 kbp, který byl označen D361-1.

Příklad 2

Porovnání sekvencí

Na obrázku 2 je ukázáno porovnání nukleotidových sekvencí hybridu HPV 6/11, HPV 6a a HPV 11 L1. Pro převedení sekvence HPV 6 na translační rámec kódující HPV 11 je provedeno na kostře HPV 6

3o celkem 55 substitucí nukleotidů. Navíc byly přidány tři páry bází v poloze # 411-413 bp, které kódují dodatečnou aminokyselinu ·· ·· · to toto to to to to • •toto · · · · · · to • toto · · · · · • « · · · · · ···· • · · ·· ·· ···· ·· ··· ··· ·· ·

- 26 (tyrozin¹³²), který se nalézá v HPV 11, ale ne v HPV 6. Tyto změny společně dovolují vazbu neutralizační monoklonální protilátky specifické proti typu 11, konformačně dependentní (Chemicon 8740 MAb), na protein L1 HPV 6/11 L1 DNA, exprimovaný v kvasinkách. Z toho plyne, že protein hybridního genu HPV 6/11 je patrně imunologicky nerozlišitelný od nativního proteinu HPV 11.

Z porovnání hybridní sekvence DNA HPV 6/11 s publikovanou sekvencí HPV 11/L1 vyplývají substituce 194 párů bází. To je vzhledem k sekvenci 11 L1 standardního typu značně vysoký počet io substitucí a jejich kombinace spolu se všemi celkovými změnami mohou být odpovědné za zvýšení exprese proteinu typu 11 L1 v kvasinkách.

Příklad 3

Sekvenování DNA genu L1

Gen HPV 6/11 L1 byl sekvenován na přístroji Applied Biosystems DNA Sequencer # 373A se sekvenačními reakcemi s barevným terminátorem (PRIZM™ Sequencing Kit) podle specifikace výrobce (ABI, lne., Foster City, CA).

Příklad 4

Konstrukce kvasinkových expresních vektorů HPV 6/11 L1, HPV 11 L1 a HPV 6 L1

Kvasinkový expresní vektor pGAL1-10 byl konstruován izolací 25 fragmentu Sphl o velikosti 1,4 kbp z plazmidu pUC18 s obousměrným GAL promotorem, který obsahuje divergentní promotory GAL1-GAL10 Saccharomyces cerevisiae z plazmidu pBM272 (poskytnuto od: Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). Divergentní promotory jsou z obou stran obklopeny kopií kvasinkového terminátoru

-27 transkripce (Bennetzen, J. L. a Halí, B. D., 1982, J. Biol. Chem. 257: 3018 - 3025), přičemž klonovací místo BamHI je umístěno mezi promotorem GAL1 a první kopií terminátoru transkripce ADH1 a klonovací místo Smál je umístěno mezi promotorem GAL10 a druhou kopií terminátoru transkripce ADH1. Kvasinkový kyvadlový vektor sestávající z pBR322, kvasinkového genu LEU2d (Erhart, E. a Hollenberg, C. P., 1983, J. Bacteriol. 156: 625 - 635) a kvasinkového plazmidu 2u (dar od: Benjamin Halí, University of Washington, Seattle, WA) (Broach, J. R. a Volkert, F. C., 1991, Circular DNA io Plasmids of Yeasts, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) byl štěpen Sphl a ligován s Sphl fragmentem divergentního promotoru GAL o velikosti 1,4 kbp za vzniku plazmidu pGAL1-10 (obr. 3).

Hybridní L1 DNA HPV 6/11 kódující L1 protein HPV 11 (vzorek D

361-1 z příkladu 1) obsahuje kvasinkovou nepřekládanou úvodní sekvenci (Kniskern, P. J. a další, 1986, Gene 46: 135 - 141) bezprostředně proti směru vzhledem k iniciačnímu methioninovému kodonu HPV 6/11 L1. Plazmid pGAL1-10 byl linearizován BamHI, který štěpí mezi promotorem GAL1 a terminátorem transkripce ADH1 a ligován s fragmentem genu HPV 6/11 L1 (vzorek D 361-1) o velikosti 1,5 kbp. Byl proveden výběr transformantů E. coli DH5 (Gibco BRL, lne.) a byl izolován plazmid pGAL1-10, obsahující gen HPV 6/11 L1, který byl označen jako D362-1.

Z léze condyloma accuminatum (laskavý dar od. Dr. Darron

Brown), byla klonována DNA standardního typu HPV 11 (wt-HPV 11 DNA). Celková lidská genomová DNA byla extrahována a štěpena restrikčními endonukleázami. Frakce obsahující wt-HPV 11 DNA byla ligována do klonovacího vektoru E. coli pro použití jako templát pro PCR. Gen wt-HPV 11 L1 byl amplifikován PCR s použitím polymerázy

Vent (New England Biolabs, lne.) při deseti cyklech amplifikace (94 °C min, 48 °C 1 min, 72 °C 1 min 45 s) a s použitím následujících

• · oligonukleotidových příměrů, obsahujících obklopující místa BglII (podtržená):

negativní primer: 5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3’ (SEQ ID NO:29) pozitivní primer: 5’-G AG AGA TCT TAC TTT TTG GTT TTG GTA CGT TTT CG-3’ (SEQ ED NO:30)

Negativní primer zavádí kvasinkovou nepřekládanou úrovní sekvenci (Kniskern, P. J. a další, 1986, Gene 46: 135 - 141) bezprostředně proti směru vzhledem k iniciačnímu methioninovému io kodonu wt-HPV 11 L1 (zvýrazněn tučně). PCR produkt wt-HPV 11 L1 o velikosti 1,5 kbp byl štěpen BglII, čištěn na gelu a ligován s plazmidem pGAL1-10, štěpeným BamHI za vytvoření plazmidu p329-1.

Z HPV 6a pozitivní léze condyloma accuminatum (laskavý dar od: Dr. Darron Brown) byla extrahována celková genomická DNA. Gen

HPV 6a L1 byl amplifikován pomocí PCR s použitím vzorku z biopsie jako templátu, polymerázy Vent (New England Biolabs, lne.), 35 cyklů amplifikace (94 °C 1 min, 48 °C 1 min, 72 °C 1 min 45 s), přičemž negativní primer je jak uveden výše pro PCR wt-HPV 11 L1 a pozitivní primer má sekvenci ²⁰ 5’-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3' (SEQ ID NO:31).

PCR produkt HPV 6a L1 o velikosti 1,5 kbp byl štěpen BglII, vyčištěn na gelu a ligován s plazmidem pGAL1-10 štěpeným BamHI za získání plazmidu D128.

- 29 Příklad 5

Příprava kmene 1558

Krok a: Příprava kvasinkového kmene U9

Od Dr. Lelanda Hartwella (University of Washington, Seattle,

WA) byl získán kmen Saccharomyces cerevisiae 2150-2-3 (MATalfa, Ieu2-O4, ade1, cir°). Buňky kmene 2150-2-3 byly přes noc pomnoženy při 30 °C v 5 ml média YEHD (Carty a další, J. Ind. Micro. 2(1987) 117 - 121). Buňky byly třikrát promyty sterilní destilovanou vodou, resuspendovány ve 2 ml sterilní destilované vody a 0,1 ml buněčné io suspenze bylo vyseto vždy na 6 ploten s kyselinou 5-fluoroorotovou (FOA) pro selekci mutantů ura3 (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Plotny byly inkubovány při 30 °C. Médium obsahovalo na 250 ml destilované vody: 3,5 g kvasničné dusíkaté báze bez aminokyselin a síranu amonného Difco; 0,5 g kyseliny 5-fluoroorotové; 25 ml uracilu a 10,0 g dextrózy.

Médium bylo sterilizováno filtrací přes membrány 0,2 pm a potom smíseno s 250 ml 4 % Bacto-Agaru (Difco), udržovaného při 50 °C, 10 ml roztoku adeninu 1,2 mg/ml a 5 ml roztoku L-leucinu (180 mg/50 ml). Výsledné médium bylo rozplněno po 20 ml do Petriho

2o misek.

Po 5 dnech inkubace se objevily početné kolonie. Rozetřením kolonií z výchozích ploten FOA byly rozetřením na čerstvé plotny FOA izolovány jednotlivé kolonie; inkubace probíhala při 30 °C. Větší množství kolonií z druhé série z ploten FOA bylo testováno na přítomnost ura3 mutací replikativním vysetím na plotny YEHD a uracilminus. Byl získán jeden izolát (U9) s těmito vlastnostmi. Byl skladován v zásobní glycerolové konzervě při - 70 °C (označení # 325) pro pozdější použití.

• · ·· · · ······ ···· ·· · · · · · • ·· · · · · · ···· · ······ • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·

- 30 Krok b: Příprava vektoru pro přerušení kvasničného genu MNN9

Pro přípravu vektoru pro přerušení genu MNN9 bylo nejprve nutné klonovat gen MNN9 z genomové DNA S. cerevisiae. To bylo uskutečněno standardní technologií polymerázové řetězové reakce (PCR). 5’ negativní primer a 3’ pozitivní primer pro PCR kódující sekvence MNN9 s úplnou délkou byly navrženy podle publikované sekvence kvasničného genu MNN9 (Zymogenetics: Evropská patentová přihláška No. 88117834.7, č. zveřejnění 0-314-096-A2). Bylo použito následujících oligodeoxynukleotidových primerů, io obsahujících obklopující štěpící místa Hindlll (podtržená):

negativní primer: ₅’_CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3’ (SEQ ED NO:32) pozitivní primer: 5’.TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC

CTC-3’. (SEQ ID NO:33)

Iniciační methioninový kodon genu MNN9 je zvýrazněn tučně. PCR byla prováděna s použitím genomové DNA S. cerevisiae kmene JRY188 jako templátu, TaqDNA poiymerázy (Perkin Elmer) a 25 cyklů

2o ampiifikace (94 °C, 1 min; 37 °C, 2 min; 72 °C, 3 min). Výsledný fragment PCR o délce 1,2 kbp byl štěpen Hindlll, čištěn na gelu a ligován s plazmidem pUC13 (Pharmacia), štěpeným Hindlll a alkalickou fosfatázou. Výsledný plazmid byl označen p1183.

Aby bylo možno přerušit gen MNN9 kvasničným genem URA3, byl plazmid pBR322-URA3 (který obsahuje fragment Hindlll o délce 1,1 kbp, kódující gen S. cerevisiae URA3, subklonovaný do místa Hindlll plazmidu pBR322) štěpen Hindlll a fragment DNA o velikosti 1,1 kbp, nesoucí funkční gen URA3 byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA poiymerázy zakončen tupým koncem a potom ligován s plazmidem p1183, štěpeným Pmll (enzym Pmll štěpí uvnitř kódující

- 31 sekvence MNN9). Výsledný plazmid p1199 obsahuje přerušení genu MNN9 funkčním genem URA3.

Krok c: Konstrukce derivátu U9 kmene 1372, obsahující přerušení genu MNN9

Pro přerušení genu MNN9 v kmenu U9 (#325) bylo štěpeno 30 pg plazmidu p1199 enzymem Hindlll pro vytvoření lineární přerušující kazety mnn9::URA3. Buňky kmene 325 byly transformovány sféroplastovou metodou (Hinnen a další, 1978, Proč. io Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929 - 1933) DNA p1199, štěpenou Hindlll a byla prováděna selekce transformantů na syntetickém agarovém médiu bez uracilu s obsahem 1,0 M sořbitolu. Syntetické médium obsahovalo na litr destilované vody: agar, 20 g; kvasničná dusíkatá báze bez aminokyselin, 6,7 g; adenin, 0,04 g; L-tyrozin, 0,05 g;

sorbitol, 182 g; glukóza, 20 g; a bezleucinový roztok #2, 10 ml. Bezleucinový roztok #2 obsahuje na litr destilované vody: L-arginin, 2 g; L-histidin, 1 g; L-leucin, 6 g; L-izoleucin, 6 g; L-lyzin, 4 g; Lmethionin, 1 g; L-fenylalanin, 6 g; L-threonin, 6 g; a L-tryptofan, 4 g.

Plotny byly inkubovány 5 dnů při 30 °C, přičemž se objevily

2o početné kolonie. Preparáty chromozomální DNA byly připraveny z 10 kolonií a potom byly štěpeny směsí EcoRI a Hindlll. DNA štěpy byly potom vyhodnoceny Southernovým blotem (J. Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) s použitím fragmentu Hindlll o délce

1,2 kbp nesoucího gen MNN9 (izolovaný z plazmidu p1199) jako sondy. Byl identifikován izolát (kmen #1372), který vykazoval očekávaný posun pruhů DNA na Southernově blotu stejně jako extrémní shlukování, které typicky vykazují mutanty mnn9.

- 32 ·· ·· · · ······ • · · · · o · · • « · · · · · *·· · • · · · · · · ···· ·« ··· ··· ·· ·

Krok d: Konstrukce vektoru pro přerušení kvasničného genu HIS3

Aby bylo možno zkonstruovat přerušující kazetu, ve které je gen HIS3 S. cerevisiae přerušen genem URA3, plazmid YEp6 (K. Struhl a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 76: 1035) byl štěpen BamHI a fragment BamHI o délce 1,7 kbp, nesoucí gen HIS3 byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA polymerázy byl zakončen tupými konci a ligován s plazmidem pUC18, který byl předtím štěpen BamHI a poté T4 DNA polymerázou. Výsledný plazmid (označený p1501 nebo pUC18-HIS3) byl štěpen Nhel (který štěpí uvnitř kódující sekvence HIS3) a fragment io vektoru byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA polymerázy zakončen tupými konci a potom štěpen telecí žaludeční alkalickou fosfatázou. Gen URA3 byl izolován z plazmidu pBR322-URA3 štěpením Hindlll a fragment o délce 1,1 kbp, nesoucí gen URA3 byl vyčištěn na gelu, pomocí T4 DNA polymerázy zakončen tupými konci a ligován s výše is uvedeným Nhel fragmentem pUC18-HIS3. Výsledný plazmid (označený pUC18-his3::URA3 nebo p1505) obsahuje přerušující kazetu, ve které je kvasničný gen HIS3 přerušen funkčním genem

URA3.

Krok e: Konstrukce vektoru pro přerušení kvasničného genu PRB1 genem HIS3

Plazmid FP8AH nesoucí gen PRB1 S. cerevisiae byl poskytnut od: Dr. E. Jones , Carnegie-Mellon Univ. (C. M. Moehle a další, 1987, Genetics 115: 255 - 263). Tento plazmid byl štěpen směsí Hindlll a

Xhol a fragment DNA nesoucí gen PRB1 o délce 3,2 kbp byl čištěn na gelu a zakončen pomocí T4 DNA polymerázy tupými konci. Plazmid pUC18 byl štěpen BamHI, čištěn na gelu a zakončen pomocí T4 DNA polymerázy tupými konci. Výsledný vektorový fragment byl ligován s výše uvedeným genovým fragmentem PRB1 za vzniku plazmidu

3o pUC18-PRB1. Plazmid YEp6, který obsahuje gen HIS3, byl štěpen

BamHI. Výsledný fragment BamHI o délce 1,7 kbp, nesoucí funkční ·· ···· ·· ·· φφφφ ·· ·· φ · · • ·· φ · · · φ • φ * · · · * ··· φ φφφ φ φ φ φ

ΦΦΦΦ ΦΦ Μ· ΦΦΦ ΦΦ φ

- 33 gen HIS3 byl vyčištěn na gelu a zakončen pomocí T4 DNA polymerázy tupými konci. Plazmid pUC18-PRB1 byl štěpen EcoRV a Ncol, které štěpí uvnitř kódující sekvence PRB1 a odstraňují aktivní místo proteázy B a obklopující sekvence. Fragment EcoRV-Ncol o délce 5,7 kbp nesoucí zbytkové části 5’ a 3’ kódující sekvence PRB1 v pUC18 byl vyčištěn na gelu, zakončen pomocí T4 DNA polymerázy tupými konci, defosforylován telecí žaludeční alkalickou fosfatázou a ligován s výše popsaným fragmentem HIS3 s tupými konci. Výsledný plazmid (označený pUC18-prb1::HIS3, zásobní vzorek #1245) obsahuje na io místě části genu PRB1, který byl výše odstraněn funkční gen HIS3.

Krok f:_Konstrukce kvasničného kmene příbuzného U9, obsahujícího přerušení v genech MNN9 i PRB1

V příkladu 5c byl popsán kmen 1372 příbuzný U9, který is obsahuje přerušení genu MNN9. Klonální izoláty kmene 1372 byly pasážovány na plotnách FOA (jak bylo popsáno v příkladu 5a) pro selekci mutantů ura3. Bylo získáno větší množství ura3 izolátů kmene 1372 a pro následné přerušení genu HIS3 byl zvolen jeden z izolátů (kmen 12930-190-S1-1). Přerušující vektor (p1505) genu pUC182o his3::URA3 byl štěpen Xbal a EcoRI pro vytvoření lineární přerušující kazety his3::URA3 a použit pro transformaci kmene 12930-190-S1-1 lithiumacetátovou metodou (Methods in Enzymology, 194: 290 (1991)).

Na syntetickém agarovém médiu bez uracilu byla provedena selekce transformantů Ura⁺, které byly rozetřeny pro získání jednotlivých klonů na stejném médiu a potom replikačně vysety na médium buď bez uracilu nebo bez histidinu pro získání izolátů, které byly jak Ura⁺ tak His'. Pro následné přerušení genu PRB1 byl zvolen jeden z izolátů (kmen 12930-230-1). Vektor (pUC18-prb1::HIS3, zásobní vzorek #1245), přerušující gen PRB1, byl štěpen Sací a Xbal pro vytvoření lineární přerušující kazety prb1::HIS3 a použit pro transformaci kmene

12930-230-1 lithiumacetátovou metodou. Na agarovém médiu bez ·· ···· • · · · • · · · ·’ ·**: · : :···:; •Z··*·· ··· ··· ·· * histidinu byly získány transformanty His*, které byly rozetřeny na stejném médiu pro získání jednotlivých kolonií. Z většího počtu His* izolátu byla připravena genomická DNA, štěpena EcoRI a potom provedena její elektroforéza na 0,8 % agarózových gelech. Potom byla provedena analýza Southernovým blotem s použitím radioaktivně značené sondy o délce 617 bp na gen PRB1, která byla připravena pomocí PCR s použitím následujících oligodeoxynukleotidových primerú:

5' TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3’ (SEQ CD NO;34); a

5’ CAC CGT AGT GTTTGG AAG CGA 3’ (SEQ ED NO:35)

Bylo získáno 11 izolátů, které vykazovaly očekávanou hybridizací sondy s fragmentem 2,44 kbp prb1::HIS3 DNA. To bylo v kontrastu s hybridizací sondy s fragmentem o délce 1,59 kbp u genu

PRB1 standardního typu. Jeden z těchto izolátů obsahujících požadované přerušení prb1::HIS3 byl vybrán pro další použití a byl označen jako kmen #1558.

Příklad 6

2o Exprese HPV11 L1 a HPV6 L1 v kvasinkách

Pro transformaci kmene #1558 S. cerevisiae (MATa, Ieu2-O4, prb1::HIS3, mnn9::URA3, ade1, ciť) pro transformaci kmene sféroplastovou metodou (Hinnen a další, 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75, 1929 - 1933) byly použity plazmidy D362-1 (pGAL125 10+HPV6/11 L1), p329-1 (pGAL1-10+wt-HPV11 L1), D128 (pGAL110+HPV6 L1) a pGAL1-10. Kvasinkový kmen # 1558 transformovaný plazmidem D362-1 byl označen jako kmen # 1782. Pro studie RNA rostly izoláty jednotlivých kolonií na komplexním médiu YEH (Carty a další, 1987, J. Ind. Micro. 2, 117 - 121), obsahujícím vždy 2 % glukózy nebo galaktózy při 30 °C 26 hodin. Po sklizení buněk byla kvasinková

- 35 RNA extrahována metodou s použitím kyselého fenolu (Current Protocols in Molecular Biology, díl 2, Current Protocols, 1993). Pro analýzu proteinu byly identické izoiáty ponechány růst při 30 °C v komplexním médiu YEH, obsahujícím 0,1 M sorbitol, 2 % glukózu a 2 % galaktózu po dobu 70 hodin. Po sklizení buněk byly zcentrifugované buňky rozbity skleněnými kuličkami a buněčné lyzáty analyzovány na expresi proteinu HPV 11 L1 nebo HPV 6 L1 analýzou imunobloty.

Příklad 7 io Analýza RNA HPV L1, exprimovaná kvasinkami northernovymi bloty

Vzorky obsahující 10 pg celkové DNA byly denaturovány působením glyoxalu a DMSO (Current Protocols in Molecular Biology, díl 1, Current Protocols, 1993) a provedena jejich elektroforéza na 1,2 % agarózovém gelu s fosfátovým pufrem. RNA byla převedena na nylonovou membránu a detekována pomocí oligonukleotidů značeného ³²P, komplementárního jak k sekvenci HPV 11, tak i HPV 6 L1 DNA.

Northernový blot je ukázán v obr. 4. Ve vzorcích, které rostly na médiu s glukózou (dráhy 1, 3 a 5) nebyly detekovány žádné pruhy,

2o odpovídající očekávané velikosti pro HPV L1 RNA s úplnou délkou. To je v souladu s očekáváním, protože glukóza reprimuje transkripci kvasinkového promotoru GAL1. Naopak vzorky rostoucí na médiu s galaktózou, která indukuje transkripci z promotoru GAL1, vykazují silné signály HPV L1 RNA. HPV 6 L1 byla transkribována jako molekula RNA s úplnou délkou (dráha 2), zatímco většina HPV 11 L1 standardního typu (wt) byla transkribována ve zkrácené formě (dráha 4). Tento výsledek ukazuje na to, že uvnitř wt-HPV 11 L1 ORF je umístěn signál ukončení transkripce, který není přítomný v sekvenci HPV 6 L1. RNA přepisovaná z hybridního kmenu HPV 6/11 se zdá mít úplnou délku (dráha 6). V kontrolním kvasinkovém vzorku s pGAL1-10 (dráha 7) není detekována žádná HPV specifická RNA.

• · · ·· · • ·

- 36 - ’

Příklad 8

Analýza proteinů HPV L1 exprimovanych kvasinkami westernovými blotv

Byla provedena elektroforéza vzorků obsahujících 20 pg celkového buněčného proteinu na 10 % Tris-glycinových gelech (Novex, lne.) za denaturačních podmínek a proteiny byly elektroblotovány na nitrocelulózové filtry. Protein L1 byl detekován imunologicky s použitím králičího antiséra proti fúznímu proteinu trpEio HPV 11 L1 jako primární protilátky (Brown, D. R. a další, 1994, Virology, 201: 46 - 54) a oslího antikráličího IgG s navázanou křenovou peroxidázou (HRP) (Amersham, lne.) jako sekundární protilátky. Filtry byly zpracovány s použitím chemiluminiscenčního kitu ECL™ Detection Kit (Amersham, lne.). Ve všech vzorcích kromě negativní kontroly pGAL1-10 (dráha 4) byl detekován pruh proteinu L1 o velikosti 50 - 55 kDa (obr. 5). Navíc se zdá být množství proteinu HPV 11 L1, exprimovaného hybridním genem HPV 6/11 (dráha 3) ~ 10 x větší než množství proteinu L1, exprimovaného buď genem wtHPV 11 (dráha 2) nebo genem HPV 6 L1 (dráha 1).

Příklad 9

ELISA virům podobných částic HPV 11 L1, exprimovaných kvasinkami

Pro určení relativních množství virům podobných částic, produkovaných kvasinkovými klony exprimujícími buď wt-HPV 11 nebo hybrid HPV 6/11 byla použita ELISA. ELISA také byla použita pro demonstraci, že na virům podobných částicích odvozených od hybridní DNA HPV 6/11 je zachován konformační epitop, jehož působením vznikají silné odpovědi neutralizační protilátky. Tento konformační epitop byl definován monoklonální protilátkou H11. B2 (Christensen a další, 1990, J. Virol. 64, 5678 - 5681), dostupnou od firmy Chemicon • · · · · ·

- 37 International (Temecula, CA) jako Chemicon Mab8740. Stručně, jamky destiček ELISA (Maxisorb, Nunc lne., Naperville, IL) byly pokryty klesajícími množstvími celkového kvasinkového proteinu, obsahujícího hybridní HPV 6/11 nebo wt-HPV 11 virům podobné částice ve 100 μΙ

PBS. Jako kontroly byly použity viriony wt-HPV 11, čištěné v CsCI (laskavý dar od Dr. D. Brown) a kontrolní kvasinkový protein. Destičky byly před odsátím a blokováním 250 μΙ 10 % sušeného mléka (Carnation) v TTBS (50 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20) po dobu 2 hod při pokojové teplotě inkubovány přes noc při 4 °C. io Před inkubací jamek se 100 μΙ monoklonální protilátky proti virionům HPV 11 Chemicon MAB7840 v 1 % sušeném mléku v TTBS 1 hod při pokojové teplotě byly destičky jednou promyty PBS/0,1 % Tween 20. Destičky byly třikrát promyty roztokem PBS/Tween 20 a potom inkubovány se 100 μΙ protimyšího IgG s navázanou alkalickou fosfatázou (Kierkegard & Perry, Gaithersburg, MD) zředěným v poměru 1 : 1000 v 1 % mléku + TTBS 1 hod při pokojové teplotě. Destičky byly opět třikrát promyty PBS/Tween 20 a potom bylo přidáno 100 μΙ fosfatázového substrátu ( p-nitrofenylfosfát v diethanolaminovém pufru). Destičky byly inkubovány 30 min při

2o pokojové teplotě. Reakce byla zastavena přídavkem 50 μΙ 3N NaOH. Destičky byly odečítány na čtecím zařízení destiček ELISA při 405 nm.

Průměrná OD405 nm ze dvou jamek korigovaná na výsledky pozadí, získané z kontrolních kvasinkových proteinů, byla vynesena proti celkové koncentraci kvasinkového proteinu v jamkách a je ukázána v obr. 6. Hybridní kvasinkový klon HPV 6/11 produkoval více než 10 x více nativních virům podobných částic ve srovnání se srandardním klonem. Navíc je na virům podobným částicím přítomen silně neutralizující epitop, rozpoznávaný protilátkou Chemicon Mab8740.

- 38 • ·

Příklad 10

Elektronmikroskopické studie

Pro elektronmikroskopickou analýzu (Structure Probe, West Chester, PA) byl alikvot každého vzorku (surový vyčeřený lyzát vyčištěných virům podobných částic) umístěn na uhlíkem pokryté měděné mřížky 200 mesh. Po 20 s byla na mřížku umístěna kapka dvouprocentní kyseliny fosfowolframové (PTA), pH 7,0. Mřížky byly ponechány před vyšetřením transmisní elektronovou mikroskopií usušit na vzduchu. Veškerá mikroskopická pozorování byla prováděna io s použitím transmisního elektronového mikroskopu JEOL 100CX (JEOL USA, lne.) s urychlovacím napětím 100 kV. Vytvořené mikrofotografie měly konečné zvětšení 100 000 x. Jak je ukázáno v obr. 7, byly pozorovány virům podobné částice v rozmezí průměrů 45 55 nm ve všech vzorcích HPV 11, ale ne ve vzorcích kontrolních kvasinek.

Příklad 11

Fermentace HPV 6/11 L1 (kmen # 1782)

Nárůst z povrchové kultivace kmene 1728 byl asepticky přenesen do bezleucinového kapalného média, obsahujícího na 1 I: 8,5 g kvasničné dusíkaté báze bez aminokyselin a síranu amonného Difco; 0,2 g adeninu; 0,2 g uracilu; 10 g kyseliny jantarové; 5 g síranu amonného a 0,25 g L-tyrozinu; před sterilizací bylo pH média nastaveno na 5,0 až 5,3 pomocí NaOH. Po růstu 25 hod při 28 °C a

250 ot/min na rotační třepačce byly přídavkem sterilního glycerolu na konečnou koncentraci 17 % (hmotnost/objem) před skladováním při 70 °C (1 ml na zamražovací nádobku) připraveny zamražené kultury. Ve stejném médiu (750 ml na 2 I baňku) bylo připraveno inokulum pro fermentaci kmene 1782, které bylo zaočkováno převedením

3o roztaveného obsahu dvou zamražených nádobek s kulturou do 2 I baněk a inkubováno při 28 °C a 250 ot/min 25 hod na rotační třepačce. Při fermentaci kmene 1782 byl použit fermentor Chemap 23

L s pracovním objemem po inokulaci 18 I. Produkční médium obsahovalo (na litr): 20 g kvasničného extraktu Difco; 10 g peptonu

Sheffield HySoy; 20 g glukózy a 20 g galaktózy; pH média bylo před sterilizací nastaveno na 5,3. Celý obsah (500 ml) dvoulitrové inokulační baňky byl převeden do fermentoru, kde probíhala inkubace při 28 °C, 500 ot/min a 9 I vzduchu za minutu při tlaku 21,3 kPa. Podle potřeby bylo zvyšováno míchání pro udržení koncentrace ío rozpuštěného kyslíku větší než 40 % saturace. Postup fermentace byl monitorován měřením glukózy ve vzorcích (analyzátor Beckman Glucose 2 Analyzer) a on-line hmotovou spektrometrií (Perkin-Elmer 1200). Po 66 hod inkubace byla dosažena buněčná denzita 9,32 g suché biomasy na litr. Před oddělením buněk byl objem dvou takových fermentaci (celkem 17,5 I média) spojen. Kultura byla zakoncentrována filtrací dutými vlákny (patrona Amicon H5MP01-43 ve filtračním systému Amicon DC-10) na přibližně 2 I diafiltrována s 2 I roztokem soli s fosfátovým pufrem a dále zakoncentrována (na přibližně 1 I) před rozplněním do 500 ml centrifugačních lahví. Buňky

2o byly odděleny centrifugací při 7000 ot/min (rotor Sorval GS3) 20 min při 4 °C. Po odlití supernatantu byla biomasa skladována při - 70 °C až do použití (celkem 358 g mokré biomasy).

Příklad 12

Purifikace rekombinantních kapsidových proteinů HPV typ 11 L1

Všechny kroky byly prováděny při 4 °C, pokud není uvedeno jinak.

Buňky byly skladovány ve zmrazeném stavu při - 70 °C. Zmrazené buňky (mokrá hmotnost = 180 g) byly roztaveny při 20 30 23 °C a resuspendovány v 900 ml pufru „Breaking Buffer“ (50 mM

MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCI₂). Byly přidány inhibitory • · ·

- 40 proteáz AEBSF a pepstatin A na konečnou koncentraci 1 mM, popřípadě 1,7 μΜ. Buněčná kaše byla rozbita při tlaku přibližně 110 MPa čtyřmi průchody zařízením M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA). K rozbité kaši buněk bylo přidáno dostatečné množství 10 % detergentu Triton X100® (Pierce, Rockford, IL) pro dosažení koncentrace TX100 0,5 %. Kaše byla míchána 20 hodin. Lyzát s Tritonem X100 byl centrifugován pro odstranění rozdrcených buněk 40 min při 12 000 x g. Supernatant obsahující protein L1 byl oddělen.

w Supernatant byl diafiltrován proti pěti objemům 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 0,5 M NaCl s použitím membránové kazety s tangenciálním tokem (Filtron, Northborough, MA). Materiál zachycený membránou obsahoval podle zjištění radioimunologickým testem a westernovým blotováním protein L1.

Supernatant byl nanesen na afinitní kolonu s vysokým rozlišením (vnitřní průměr 11,0 cm x 5,3 cm) s náplní pryskyřice SP Spherodex (M)® (IBF, Villeneuve-la-Garenne, Francie), ekvilibrovanou 20 mM fosfátem sodným pH 7,2, 0,5 M NaCl. Po promytí ekvilibračním pufrem a pufrem s 20 mM fosfátem sodným, pH

2o 7,2, 1,0 M NaCl byl eluován protein L1 s použitím pufru 20 mM fosfát sodný, pH 7,2, 2,5 M NaCl. V průběhu promývání a eluce byly sbírány frakce. Frakce z kolony byly testovány Bradfordovou metodou na celkový obsah proteinů. Frakce potom byly analyzovány westernovým blotováním a SDS-PAGE s detekcí koloidní Coomassie. Frakce byly také analyzovány radioimunologicky.

Konečný produkt byl analyzován westernovým blotováním a SDS-PAGE s detekcí koloidní Coomassie. Bylo odhadnuto, že protein L1 je z > 90 % homogenní. Identita proteinu L1 byla potvrzena westernovým blotováním. Konečný produkt byl asepticky filtrován membránou 0,22 pm a skladován při 4 °C. Tímto postupem bylo získáno celkem 100 mg proteinu.

Pro elektronmikroskopickou analýzu (Structure Probe, West Chester, PA) byl alikvot každého vzorku umístěn na uhlíkem pokryté měděné mřížky 200 mesh. Po 20 s byla na mřížku umístěna kapka dvouprocentní kyseliny fosfowolframové (PTA), pH 7,0. Mřížky byly ponechány před vyšetřením transmisní elektronovou mikroskopií usušit na vzduchu. Veškerá mikroskopická pozorování byla prováděna s použitím transmisního elektronového mikroskopu JEOL 100CX (JEOL USA, lne.) s urychlovacím napětím 100 kV. Vytvořené mikrofotografie měly konečné zvětšení 100 000 x.

Bradfordův test na celkový protein

Celkový protein byl stanoven s použitím komerčně dostupného kitu Coomassie Plus® kit (Pierce, Rockford, IL). Vzorky byly na potřebnou koncentraci zředěny vodou Milli-Q. Bylo zapotřebí objemů

0,1 ml a 1,0 ml pro standardizaci, popřípadě pro protokoly mikrostanovení. Pro oba protokoly byl použit pro vytvoření standardní křivky BSA (Pierce, Rockford, IL). Test byl prováděn podle doporučení výrobce. Standardní křivky byly vyneseny na počítači Macintosh líci s použitím software Cricket Graph®.

SDS-PAGE a westernové blotování

Všechny gely, pufry a elektroforetické přístroje byly získány od firmy Novex (San Diego, CA) a testy byly prováděny podle doporučení výrobce. Stručně, vzorky byly zředěny na stejné koncentrace proteinu vodou Milli-Q a smíseny v poměru 1 : 1 se vzorkovým inkubačním pufrem, obsahujícím 200 mM DTT. Vzorky byly inkubovány 15 min při 100 °C a naneseny na předem připravené 12 % Tris-glycinové gely. Elektroforéza probíhala při 125 V 1 hodinu 45 min. Gely byly vyvinuty koloidním barvením Coomassie s použitím komerčně získaného kitu (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Pro westernové blotování byly proteiny převedeny při 25 V po dobu 40 min na membrány PVDF. Membrány byly omyty vodou Milli-Q a usušeny na vzduchu. Primární protilátkou bylo polyklonální králičí antisérum vytvořené proti fúznímu proteinu TrpE-HPV11L1 (dar od Dr.

D. Browna). Roztok protilátky byl připraven zředěním antiséra v blotovacím pufru (5 % odtučněné mléko v 6,25 mM fosforečnanu sodném, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃). Inkubace probíhala alespoň 1 hodinu při 20 - 23 °C. Blot byl promýván třikrát vždy 1 min v čerstvém PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 150 mM NaCl). io Roztok druhé protilátky byl připraven zředěním kozího protikráličího IgG antiséra, konjugovaného s alkalickou fosfatázou (Pierce, Rockford, IL) v blotovacím pufru. Inkubace probíhala alespoň 1 hodinu za stejných podmínek. Bloty byly promyty jako dříve a detekovány pomocí jednostupňového substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

Příklad 13

Příprava imunogenních prostředků

Čištěné virům podobné částice se v přípravcích použijí podle známých metod, jako například přídavkem farmaceuticky přijatelných

2o nosičů, stabilizátorů nebo vakcínových adjuvans. Imunogenní VLP podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny pro použití jako vakcíny spojením s fyziologicky přijatelným prostředkem, jako je PBS, roztok soli nebo destilovaná voda. Imunogenní VLP se podávají pro dosažení imunologického účinku v rozmezí dávek přibližně 0,1 až 100 pg, s výhodou přibližně 1 až přibližně 20 pg. Množství VLP v prostředku bude záviset na řadě faktorů, včetně bez omezení na stavu jednotlivce, jeho hmotnosti, věku a pohlaví. Podávání prostředku s VLP je možno uskutečnit řadou cest, včetně bez omezení orální, subkutánní, místní, přes sliznice a intramuskulární. Takové prostředky

3o s VLP mohou být složeny z jediného typu VLP (tj. VLP z HPV 11 nebo směsi VLP (tj. VLP z HPV 6, HPV 11, HPV 16 a HPV 18).

·· ····

Mohou být přítomny antimikrobiální ochranné látky, například thimerosal. Imunogenní antigeny podle předkládaného vynálezu mohou být v případě potřeby použity v kombinaci se stabilizátory vakcíny a vakcinovými adjuvans. Typickými stabilizátory jsou specifické sloučeniny, například polyanionty jako je heparin, inozitolhexasulfát, sulfatovaný beta-cyklodextrin, méně specifické pomocné látky, jako aminokyseliny, sorbitol, mannitol, xylitol, glycerol, sacharóza, dextróza, trehalóza a změny ve složení roztoku, například neutrální pH, vysoká iontová síla (přibližně 0,5 až 2,0 M soli), io dvojmocné kationty (Ca²⁺, Mg²⁺). Příklady adjuvans jsou AI(OH)₃ a AI(PO)₄. Vakcína podle předkládaného vynálezu může být skladována chlazená nebo v lyofilizované formě.

Příklad 14

Příprava protilátek proti VLP

Čištěných VLP se používá pro vytváření protilátek. Termín „protilátky“, jak se zde používá, zahrnuje jak polyklonální tak monoklonální protilátky stejně jako jejich fragmenty, jako Fv, Fab a F(ab)2, které jsou schopny vázat se na antigen nebo hapten.

2o Protilátky se používají mnoha způsoby, včetně bez omezení čištění rekombinantní VLP, čištění nativních proteinů L1 nebo L2 a v kitech. Takový kit by obsahoval soustavu nosných prvků, schopných pevně držet alespoň jednu nádobku. Nosná soustava by dále obsahovala reagencie, jako je protilátka anti-VLP nebo VLP, vhodnou pro detekci

HPV nebo fragmentů HPV nebo protilátek proti HPV. Nosná soustava může dále obsahovat prostředky pro detekci, jako je značený antigen nebo enzymové substráty apod. Protilátky nebo VLP nebo kity jsou použitelné pro řadu účelů, včetně bez omezení forenzních analýz a epidemiologických studií.

Zastupuje:

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná a čištěná molekula DNA, kódující protein L1 lidského

   5 papilomaviru typu 11 nebo jeho funkční derivát, přičemž molekula DNA neobsahuje vnitřní signály ukončení transkripce, rozpoznávané kvasinkou.
2. 2. Molekula DNA podle nároku 1 se sekvencí uvedenou v obr. 8.
3. 3. Expresní vektor, vyznačující se tím, ž e obsahuje molekulu DNA podle nároku 1.
4. 4. Expresní vektor, vyznačující se tím,

   15 že obsahuje molekulu DNA podle nároku 2.
5. 5. Expresní vektor podle nároku 4, kterým je D361-2.
6. 6. Protilátka, vyznačující se tím, že je

   2o imunologicky reaktivní se sloučeninou, zvolenou z molekuly

   DNA podle nároku 1, RNA komplementární k molekule DNA podle nároku 1 nebo proteinu, kódovaného molekulou DNA podle nároku 1.

   25
7. 7. Kapsidy, vyznačující se tím, že obsahují protein kódovaný molekulou DNA podle nároku 1.

   • · « ··· · • · • 9 · ·« ·· • · · · • ·· *· « · ·

   -45
8. 8. Virům podobné částice, vyznačující se tím, ž e obsahují protein kódovaný molekulou DNA podle nároku 1.

   5
9. 9. Prostředky, vyznačující se tím, že obsahují molekulu DNA podle nároku 1, RNA komplementární k molekule DNA podle nároku 1 nebo protein, kódovaný molekulou DNA podle nároku 1.
10. 10. Vakcíny, vyznačující prostředky podle nároku 9.

    se tím, že obsahují
11. 11. Prostředek schopný vyvolat imunologickou odpověď u subjektu léčeného tímto prostředkem, vyznačující se

    15 t í m , ž e obsahuje sloučeninu zvolenou z molekuly DNA podle nároku 1, peptidů kódovaných molekulou DNA podle nároku 1, RNA komplementární k molekule DNA podle nároku 1 nebo jejich kombinací.

    2o
12. 12. Vakcína pro prevenci nebo léčení lidské infekce papilomaviry, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu zvolenou ze skupiny molekuly DNA podle nároku 1, peptidů kódovaných molekulou DNA podle nároku 1, RNA komplementární k molekule DNA podle nároku 1 nebo jejich

    25 kombinací.

    ·· ·· 4 • · · · ·· · • ·· · • · · · · • · · · «··· ·· ··· 9 • · • ··· ··

    -46
13. 13. Způsob indukce imunologických odpovědí proti infekci nebo onemocnění, způsobeným lidským papilomavirem, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení molekuly DNA podle nároku 1, RNA komplementární k

    5 molekule DNA podle nároku 1, proteinu kódovaného molekulou

    DNA podle nároku 1 nebo jejich kombinací do pacienta.
14. 14. Rekombinantní protein L1 lidského papilomaviru typu 11.

    io 15. Způsob výroby čištěného rekombinantního proteinu L1 lidského papilomaviru typu 11, vyznačující se tím, ž e zahrnuje:

    (a) transformaci vhodného hostitele expresním vektorem, obsahujícím molekulu DNA kódující protein L1 lidského
15. 15 papilomaviru typu 11 za vytvoření transformované buňky;

    (b) kultivaci transformované buňky za podmínek, které dovolí expresi rekombinantního proteinu L1 lidského papilomaviru typu 11; a (c) čištění rekombinantního proteinu L1 lidského papilomaviru

    2o typu 11.
16. 16. Rekombinantní protein L1 lidského papilomaviru typu 11, vyznačující se tím, že je vyroben způsobem podle nároku 15.
17. 17. Virům podobné částice, obsahující protein podle nároku 16.

    ·· ····
18. 18. Prostředky, vyznačující se tím, že obsahují purifikovaný protein podle nároku 16.
19. 19. Vakcíny, vyznačující se tím, že obsahují

    5 čištěný protein podle nároku 16.
20. 20. Způsob léčení stavu pacienta, který je vyvolaný lidským papilomavirem typu 11, v případě potřeby podáváním proteinu podle nároku 14 pacientovi.
21. 21. Způsob výroby čištěných virům podobných částic, obsahujících protein podle nároku 14, vyznačující se tím, ž e zahrnuje:

    (a) transformaci vhodného hostitele expresním vektorem, is obsahujícím molekulu DNA kódující protein L1 lidského papilomaviru typu 11 za vytvoření transformované buňky;

    (b) kultivaci transformované buňky za podmínek, které dovolí expresi rekombinantního proteinu L1 lidského papilomaviru typu 11;

    2o (c) čistění rekombinantního proteinu L1 lidského papilomaviru typu 11;

    (d) další čištění proteinu za vytvoření viru podobných částic.

    Zastupuje:

    • · » · · « • · ·

    .... ??

    1/12

    Označení oligomerů: (# 241-1) Xhol Bg / Bgl I Sphl Kpnl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 io| 11 12 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13

    Uspořádání fragmentů:

    Teplotní hybridizace oligomerů Ligace

    C D

    Subklonování A, B, C, D odděleně do sekvence pSP72 Štěpení pro uvolnění inzertů Ligace C a D do pSP72

    A B CD

    Uvolnění CD z pSP72 Kpnl, Bglll Ligace A, štěpeného Bglll a Sphl a B, štěpeného Sphl a Kpnl Izolace fragmentu Bglll 1,5 kb

    Ligace s pGal1-10, štěpeným BamHI Bam/BglII Bam/BglII