NO320086B1 - Nukleinsyremolekyl som koder for humant papillomavirus type 11 L1-protein, ekspresjonsvektor som omfatter nukleinsyremolekylet, preparat som omfatter nukleinsyremolekylet og anvendelse av det for fremstilling av medikament. - Google Patents

Description

Dette er en fortsettelse av US patentsøknad

08/413 572 innsendt 30. mars 1995, og en fortsettelse av US patentsøknad 08/413 571, innsendt 30. mars 1995.

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår et syntetisk DNA-

molekyl som koder for renset humant papillomavirus type 11 Ll-protein og derivater av dette.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er en skjematisk oversikt over konstruksjonen

av HPV6/11 hybrid LI-genet ved anvendelse av syntetiske oligonukleotider.

Figur 2 viser nukleotidsekvensen av HPV6/ll-hybridgenet samt de publiserte HPV6a- og HPV11 LI-gener. Figur 3 viser den dobbeltrettede gjærekspresjons-vektor pGALl-10 anvendt for å uttrykke papillomavirus Ll-kaps i dp rot e i ne r. Figur 4 er en Northern-analyse av HPV11 LI mRNA fra gjær.

Figur 5 viser ekspresjon av HPV11 Ll-protein i gjær

ved hjelp av Western-analyse (immunoblot).

Figur 6 viser ELISA-reakt ivi teter av HPV11 LI VLP uttrykt fra villtype (wt) HPV11 sammenlignet med HPV6/11-hybrid-DNA. Figur 7 er et elektronmikrofotografi av HPVll LI VLP uttrykt i gjær. Figur 8 viser nukleotidsekvensen av HPV6/ll-hybridgenet.

Oppfinnelsens bakgrunn

Papillomavirus(PV)infeksjoner forekommer hos mange forskjellige dyr, inkludert mennesker, sauer, hunder, katter, kaniner, aper, slanger og kuer. Papillomaviruser infiserer epitelceller og induserer generelt benigne epitel- eller fibroepiteltumorer på infeksjonsstedet. PV er artsspesifikke infeksiøse midler; et humant papillomavirus kan ikke infisere

et ikke-humant dyr.

Papillomaviruser kan klassifiseres i to atskilte

grupper basert på verten de infiserer. Humane papillomaviruser (HPV) klassifiseres ytterligere i mer enn 70 typer basert på DNA-sekvenshomologi. PV-typer synes å være typespesifikke immunogener ved at en nøytraliserende immunitet mot infeksjon av én type papillomavirus ikke gir immunitet mot en annen type papillomavirus.

Hos mennesker forårsaker HPV-typer forskjellige sykdommer. HPV-typer 1, 2, 3, 4, 7, 10 og 26-29 forårsaker benigne vorter hos både normale og itnmunkompromiterte individer. HPV-typer 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 og 46-50 forårsaker flate lesjoner hos immunkompromiterte individer. HPV-typer 6, 11, 34, 39, 41-44 og 51-55 forårsaker ikke-

maligne kondylomer i de genitale eller respiratoriske slim-hinner. HPV-typer 16, 18, 31, 33, 35, 45 og 58 forårsaker epiteldysplasi av den genitale slimhinne og er forbundet med majoriteten av in situ- og invasive karsinomer i cervix,

vagina, vulva og analkanalen.

Papillomaviruser er små (50-60 nm) , ikke-innkapslede, ikosahedriske DNA-viruser som koder for opp til 8 tidlige og 2 sene gener. De åpne avlesningsrammer (ORF) av virusgenomene er betegnet El til E8 og LI og L2, hvor "E" betegner tidlig og "L" betegner sen. LI og L2 koder for viruskapsidproteiner. De tidlige (E) gener er forbundet med funksjoner som virus-replikasjon, transkripsjonsregulering og cellulær transformasjon. LI-proteinet er det viktigste kapsidprotein og har en molekylvekt på 55-60 kDa. L2-protein er et mindre viktig kapsidprotein som har en forutbestemt molekylvekt på 55-60 kDa og en tilsynelatende molekylvekt på 75-100 kDa, som bestemt ved polyakrylamidgelelektroforese. Immunologiske data antyder at mesteparten av L2-proteinet ligger innenfor LI-proteinet i viruskapsomeren. LI ORF er konservert i høy grad blant forskjellige papillomaviruser. L2-proteinene er mindre konservert blant forskjellige papillomaviruser.

LI- og L2-genene er blitt identifisert som gode mål

for immunprofylakse. Noen av de tidlige gener er også vist å

være potensielle mål for vaksineutvikling. Undersøkelser av "cottontail rabbit" papillomavirus (CRPV)- og bovine papillomavirus (BPV)-systemer har vist at immuniseringer med rekombinante LI- og/eller L2-proteiner (produsert i bakterier eller ved anvendelse av vaccinia-vektorer) beskyttet dyr mot virus-infeksjon. Ekspresjon av papillomavirus Ll-gener i baculo-virusekspresjonssystemer, eller anvendelse av vaccinia-vektorer, førte til samlingen av viruslignende partikler (VLP) som er blitt anvendt for å indusere høytiter-virusnøytraliser-ende antistoffresponser som overensstemmer med beskyttelse mot virusutfordring. LI- og L2-genene er dessuten anvendt for å

frembringe vaksiner for forebyggelse og behandling av papillomvirusinfeksjoner i dyr.

Utviklingen og kommersialiseringen av profylaktiske og terapeutiske vaksiner mot PV-infeksjon og sykdomsinnehold-ende Ll-protein, LI + L2-proteiner, eller modifiserte LI eller LI + L2-proteiner, er blitt hindret på grunn av mangelen på store mengder renset virus og renset protein. Fordi PV ikke lett kan dyrkes in vitro er det vanskelig å produsere de nød-vendige mengder av LI- og L2-protein ved hjelp av in vitro-formering av PV. De resulterende forsyningsproblemer gjør det vanskelig å karakterisere PV og PV-proteiner. Det ville føl-gelig være nyttig å utvikle en lett fornybar kilde for urensede PV-proteiner, spesielt PV LI- og L2-proteiner, eller modifiserte LI- og L2-proteiner. Det ville også være nyttig å utvikle fremgangsmåter for rensing av store mengder av papillomvirus-råproteinene til renhetsnivåer som er egnede for immunologiske undersøkelser og vaksineutvikling. Det ville også være nyttig å produsere store mengder av papillomvirusproteiner med de native proteiners immunitetsgivende egenskaper, slik som konformasjonen av det native protein. Det ville dessuten være nyttig å utvikle metoder for analysering av PV-proteinene og metoder for bestemmelse av den relative

.renhet av proteinene, så vel som preparater inneholdende proteinene. Slike høyrensede proteiner ville også være nyttige ved fremstilling av forskjellige reagenser anvendelige ved undersøkelse av PV-infeksjon; slike reagenser inkluderer, men er ikke begrenset til, polyklonale antistoffer, monoklonale

antistoffer og analytiske standarder.

HPV6 og 11 er stoffer som forårsaker tilnærmet 90 % av de benigne genitalvorter, og er kun sjelden forbundet med ondartethet (Gissmann et al., 1983, PNAS 80, 560-563). HPV6a betraktes som den mest tallrike HPV6-subtype ved condyloma acuminata (Brown, D. B., et al., J. Clin. Microbiol. 31:1667-1673). Legekonsultasjoner angående genitalvorter (condyloma accuminatum eller planum) har økt i de senere år. Det er beregnet at tilnærmet 10 % av den vanlige befolkning (alder 15-49) har HPV-infeksjoner i genitalorganene (Koutsky et al. 1988, Epidermiol. Rev. 10, 122-163). Selv om majoriteten av condylomata er forbundet med HPV6, er HPV11 den dominerende type ved laryngeal papillomatose. HPV11-replikasjon i epitelcellene i respirasjonskanalen stimulerer proliferasjon av disse celler, hvilket kan føre til isolerte lesjoner av mindre klinisk betydning, eller mange spredte lesjoner og tilbakevendende sykdom. Tilbakevendende respiratorisk papillomatose, en sykdom som oftere rammer ungdomspopulasjonen, kan være en livstruende sykdom ved å forårsake obstruksjoner i respirasjonskanalen. Nylig er det blitt utviklet en dyremodell som tillater replikasjon av infeksiøst HPV11 (Kreider et al-, 1985, Nature 317, 639-640; Kreider et al., 1987, J, Virol. 61, 590-593). Modellen muliggjorde identifikasjon av konforma-sjonsmessig nøytraliserende epitoper på native virioner og baculovirusuttrykte VLP, ved anvendelse av monoklonale antistoffer (Christensen et al., 1990, J. Virol. 64, 5678-5681; Christensen og Kreider 1991, Virus Res. 21, 169-179; Christensen og Kreider 1993, Virus Res. 28, 195-202; Christensen et al., 1994, 75, 2271-2276).

Viruslignende partikler inneholdende HPV11 LI-protein er blitt uttrykt i både insekt- og pattedyrcellesystemer. Ekspresjon av VLP i gjærceller gir fordelene med å være kost-nadseffektiv og lett tilpasningsdyktig til dyrkning i stor skala i fermentorer. HPV11 LI-proteiner blir imidlertid uttrykt i lave nivåer i gjærceller. Dette ble observert å være et resultat av trunkering av HPV11 LI mRNA. I motsetning til dette transkriberes HPV6 LI-genet som uforkortet mRNA og uttrykkes til høye nivåer. Ved å modifisere HPV6 LI DNA til å kode for HPV11 Ll-proteiner, er det mulig å lette transkripsjon av uforkortet mRNA som resulterer i økt HPV11 Ll-proteinekspresjon. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en HPV6/11 hybrid Ll-gensekvens, så vel som en fremgangsmåte for konstruksjon av HPV6/11 hybrid Ll-genet ved anvendelse av syntetiske oligonukleotider. Hybridgenet ble utformet ved anvendelse av HPV6a Ll-sekvensen (Hofmann, K. J. et al., 1995, Virology, akseptert for publikasjon), men inneholder det minimale antall baseendringer som er nødvendig for å kode for HPV11 LI-proteinet. I motsetning til villtype HPV11 Ll-genet, inneholder HPV6/11-hybridgenet ikke gjærgjenkj ente interne transkripsjonstermineringssignaler; som et resultat produseres uforkortet HPV6/11 mRNA og ekspresjon av HPV11 LI-protein økes.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår et syntetisk DNA-molekyl som koder for renset humant papillomvirus type 11 Ll-protein og derivater derav.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår et nukleinsyremolekyl, kjennetegnet ved at det koder for humant papillomavirus type 11 LI-protein, der nukleinsyremolekylet foreligger uten interne transkripsjonstermineringssignaler som gjenkjennes i gjær. Forskjellige utførelsesformer av oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, rekombinante HPV DNA-molekyler, RNA som er komplementære til de rekombinante HPV DNA-molekyler, preparater som omfatter DNA og RNA, og anvendelse av DNA og RNA for fremstilling av medikament.

Oppfinnelsen angår også en ekspresjonsvektor som omfatter slike DNA-molekyler, preparat som omfatter slike DNA-molekyler eller RNA som er komplementært med slike DNA-molekyler og anvendelse av nukleinsyremolekyler som beskrevet ovenfor for fremstilling av et medikament til bruk mot infeksjon eller sykdom forårsaket av humant papillomavirus.

HPV6 og 11 er forårsakende midler for tilnærmet 90 % av benigne genitalvorter og er kun sjeldent forbundet med ondartetheter (Gissmann et al., 1983, PNAS 80, 560-563). Lege-kontorvisitter for genitalvorter (condyloma accuminatum eller planum) har økt i de siste år og det er beregnet at tilnærmet 10 % av den vanlige befolkning (alder 15-49) har HPV-infeksjoner i genitalorganene (Koutsky et al. 1988, Epidermiol. Rev. 10, 122-163). Selv om majoriteten av condylomata er forbundet med HPV6, er HPV11 den dominerende type ved laringal papillomatose. HPV11-replikasjon i epitelcellene i respirasjonskanalen stimulerer proliferasjon av disse celler, hvilket kan føre til isolerte lesjoner av mindre klinisk betydning, eller mange spredte lesjoner og tilbakevendende sykdom. Tilbakevendende respiratorisk papillomatose, en sykdom som mer ofte rammer ungdomspopulasjonen, kan være en livstruende sykdom ved å forårsake obstruksjoner i respirasjonskanalen. En dyremodell som tillater replikasjon av infeksiøs HPV11 er nylig utviklet (Kreider et al., 1985, Nature 317, 639-640; Kreider et al., 1987, J. Virol. 61, 590-593). Modellen muliggjorde identifikasjon av konformasjonelle nøytraliserende epitoper på native virioner og baculovirusuttrykte VLP ved anvendelse av monoklonale antistoffer (Christensen et al., 1990, J. Virol. 64, 5678-5681; Christensen og Kreider 1991, Virus Res. 21, 169-179; Christensen og Kreider 1993, Virus Res. 28, 195-202; Christensen et al., 1994, 75, 2271-2276).

Utviklingen og kommersialiseringen av profylaktiske og terapeutiske vaksiner mot PV-infeksjon og sykdom inneholdende Ll-protein, LI + L2-proteiner eller modifiserte LI eller LI + L2-proteiner er blitt hindret ved mangelen på store mengder renset virus og renset protein. Fordi PV ikke lett kan dyrkes in vitro er det vanskelig å produsere den nødvendige mengde av LI- og L2-protein ved in vi tro-formering av PV. Vanskelighetene forbundet med in vi tro-dyrkning av PV resulterer også i vanskeligheter ved kjemisk, immunologisk og biologisk karakterisering av PV og PV-proteiner. Det ville følge-lig være nyttig å utvikle en lett fornybar kilde av urensede PV-proteiner, spesielt PV LI- og L2-proteiner, eller modifiserte LI- og L2-proteiner. Det ville også være nyttig å utvikle metoder for å rense store mengder av de urensede papillomvirusproteiner til renhetsnivåer egnede for immunologiske undersøkelser og vaksineutvikling. Det ville også være nyttig å produsere store mengder papillomvirusproteiner som har de native proteiners immunitetsgivende egenskaper, slik som konformasjonen av det native protein. Det ville dessuten være nyttig å utvikle fremgangsmåter for analysering av PV-proteinene og fremgangsmåter for bestemmelse av den relative renhet av proteinene, så vel som preparater inneholdende proteinene. Slike høyrensede proteiner ville også være anvendelige ved fremstilling av forskjellige reagenser anvendelige ved undersøkelse av PV-infeksjon; slike reagenser inkluderer, men er ikke begrenset til, polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer og analytiske standarder.

Viruslignende partikler som inneholder HPV11 Ll-protein er blitt uttrykt i både insekt- og pattedyrcellesystemer. Ekspresjon av VLP i gjærceller gir fordelene med å være kostnadseffektive og lett tilpasningsdyktige til dyrkning i stor skala i fermentorer. HPVll LI-proteinet uttrykkes imidlertid i lave nivåer i gjærceller. Dette ble observert å være et resultat av tronkering av HPVll LI mRNA. I motsetning til dette transkriberes HPV6 Ll-genet som uforkortet mRNA, og uttrykkes til høye nivåer. Ved å modifisere HPV6 LI DNA for å kode for HPVll Ll-proteinet, er det mulig å lette transkrip-sjonen av uforkortet mRNA, hvilket fører til økt HPVll Ll-proteinekspresjon. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et HPV6/11 hybrid Ll-gen, og beskriver en fremgangsmåte for konstruksjon av HPV6/11 hybrid Ll-genet ved anvendelse av syntetiske oligonukleotider. Hybridgenet ble utformet ved anvendelse av HPV6a LI-sekvensen, men inneholder det minimale antall baseendringer nødvendige for å kode for HPVll Ll-proteinet. I motsetning til villtype HPVll Ll-genet, inneholder HPV6/11-hybridgenet ikke gjærgjenkjente interne tran-skripsjonsavslutningssignaler, hvilket fører til høye nivåer av mRNA og følgelig økt HPVll Ll-proteinekspresjon.

Farmasøytisk anvendelige preparater som omfatter DNA eller proteiner som kodes for av DNA, kan formuleres i overensstemmelse med kjente metoder, slik som ved tilsetning av en farmasøytisk akseptabel bærer. Eksempler på slike bærere og formuleringsmetoder kan finnes i Remington's Pharmaceutical Sciences. For å danne et farmasøytisk akseptabelt preparat som er egnet for effektiv administrering, vil slike preparater inneholde en effektiv mengde av proteinet eller VLP. Slike preparater kan inneholde proteiner eller VLP avledet fra flere enn én type HPV.

Preparater ifølge oppfinnelsen administreres til et individ i mengde tilstrekkelige til å behandle eller diagnostisere PV-infeksjoner. Den effektive mengde kan variere i overensstemmelse med mange forskjellige faktorer, slik som individets forfatning, vekt,.kjønn og alder. Andre faktorer inkluderer administreringsmåten. Preparatene vil vanligvis administreres i doser som varierer fra ca. 1 ug til ca. 1 mg.

De farmasøytiske preparater kan gis til individet på mange forskjellige måter, slik som subkutant, topisk, oralt, mukosalt, intravenøst og intramuskulært.

Preparatene ifølge oppfinnelsen omfatter DNA eller RNA som inneholder de antigene determinanter nødvendige for å indusere dannelsen av nøytraliserende antistoffer hos verten. Slike preparater er også tilstrekkelig sikre til at de kan administreres uten fare for klinisk infeksjon,- de har ingen toksiske bivirkninger; de kan administreres på en effektiv måte; de er stabile; og de er forenlige med vaksinebærere.

Preparatene kan administreres på mange forskjellige måter, slik som oralt, parenteralt, subkutant, mukosalt, intravenøst eller intramuskulært. Den administrerte dose kan variere med individets forfatning, kjønn, vekt og alder; administreringsmåten; og PV-typen i preparatet. Preparatet kan anvendes i doseringsformer som kapsler, suspensjoner, eliksirer eller flytende løsninger. Preparatet kan formuleres med en immunologisk akseptabel bærer.

Preparatet administreres i terapeutisk effektive mengder, dvs. i mengder tilstrekkelig til å danne en immunologisk beskyttende respons. Den terapeutiske effektive mengde kan variere i overensstemmelse med typen av PV. Preparatet kan administreres i enkle eller multiple doser.

De rensede proteiner beskrevet i foreliggende oppfinnelse kan anvendes i form av immunogenpreparater. Slike preparater, når de innføres i en egnet vert, er i stand til å

indusere en immunrespons i verten.

De rensede proteiner, eller derivater, kan anvendes for å danne antistoffer. Betegnelsen "antistoff" som anvendt heri, inkluderer både polyklonale og monoklonale antistoffer, så vel som fragmenter derav, slik som Fv, Fab og F(ab)2-fragmenter som er i stand til å binde antigen eller hapten.

Proteinene og proteinderivatene kan anvendes for serotypebestemmelse av HPV-infeksjon og HPV-screening. De rensede proteiner, VLP og antistoffer kan anvendes for formulering av sett egnet for påvisning og serotypebestemmelse av HPV. Et slikt sett vil omfatte en bærer oppdelt i seksjoner egnet for å inneholde minst én tett tillukket beholder. Bæreren kan videre omfatte reagenser, slik som LI- eller L2-proteiner eller VLP avledet fra rekombinant HPV6/11 eller andre rekombinante HPV-type DNA-molekyler eller antistoffer mot disse proteiner. Bæreren kan også inneholde påvisningsmidler, slik som merkede antigen- eller enzymsubstrater eller lignende.

De rensede proteiner er også anvendelige som immunologiske standarder, molekylvektmarkører og molekylstørrelses-markører.

Det er kjent at det foreligger betydelig overflødig-het i de forskjellige kodoner som koder for spesifikke aminosyrer. Foreliggende oppfinnelse angår derfor også de DNA-sekvenser som inneholder alternative kodoner som koder for den eventuelle translasjon av den identiske aminosyre. For denne beskrivelses formål vil en sekvens som inneholder ett eller flere erstattede kodoner bli definert som en degenerert varia-sjon. Også inkludert innen rammen for oppfinnelsen er muta-sjoner, enten i DNA-sekvensen eller det translaterte protein, som ikke vesentlig endrer de endelige fysikalske egenskaper til det uttrykte protein. Erstatning av leucin med valin, lysin med arginin eller glutamin med asparagin, behøver f.eks. ikke forårsake en endring av polypeptidets funksjonalitet.

Det er kjent at DNA-sekvenser som koder for et peptid kan endres til å kode for et peptid med egenskaper som er forskjellige fra egenskapene til det naturlig forekommende peptid. Fremgangsmåten for endring av DNA-sekvensene inklu-peptid. Fremgangsmåten for endring av DNA-sekvensene inkluderer, men er ikke begrenset til, setedirigert mutagenese.

Som anvendt heri er et "funksjonelt derivat" av HPV6/11-hybridgenet en forbindelse som har en biologisk aktivitet (enten funksjonell eller strukturell) som er hoved-sakelig lik den biologiske aktivitet av HPV6/11. Betegnelsen "funksjonelle derivater" er ment å inkludere "fragmenter", "varianter", "degenererte varianter", "analoger" og "homo-loger", eller "kjemiske derivater" av HPV6/11.

Betegnelsen "analog" refererer til et molekyl med vesentlig den samme funksjon som enten hele HPV6/11-molekylet eller et fragment derav.

Det klonede HPV6/11 DNA eller fragmenter derav fremstilt ved fremgangsmåtene beskrevet heri, kan uttrykkes rekombinant ved molekylær kloning i en ekspresjonsvektor som inneholder en egnet promoter og andre passende transkripsjons-regulatoriske elementer, og overføres til prokaryote eller eukaryote vertsceller for å produsere rekombinant HPVll. Teknikker for slike manipulasjoner er grundig beskrevet i Sambrook, J. et al., supra, og er kjent i teknikken.

Ekspresjonsvektorer defineres heri som DNA-sekvenser som fordres for transkripsjon av klonede kopier av gener og translasjonen av deres mRNA i en egnet vert. Slike vektorer kan anvendes for å uttrykke eukaryote gener i mange forskjellige verter, slik som bakterier, blågrønnalger, planteceller, insektceller, soppceller og dyreceller. Spesielt utformede vektorer tillater skytteltrafikk av DNA mellom verter, slik som bakterie-gjærceller, bakterie-dyreceller, bakterie-soppceller eller bakterie-invertebratceller. En korrekt konstruert ekspresjonsvektor bør inneholde: Et replikasjonsstartområde for autonom replikasjon i vertsceller, valgbare markører, et begrenset antall anvendelige restriksjonsenzymseter, et potensial for høyt kopiantall og aktive promotorer. En promotor er definert som en DNA-sekvens som dirigerer RNA-polymerase til å bindes til DNA og starte RNA-syntese. En sterk promotor er en som forårsaker at mRNA-syntese innledes med høy frekvens. Ekspresjonsvektorer kan inkludere, men er ikke begrenset til, kloningsvektorer, modifiserte klonings-

vektorer spesielt utformede plasmider eller viruser.

Mange forskjellige pattedyrekspresjonsvektorer kan anvendes for å uttrykke HPV6/11 DNA eller fragmenter derav i pattedyrceller. Kommersielt tilgjengelige pattedyrekspresjonsvektorer som kan være egnede for rekombinant HPV6/11 DNA-ekspresjon, inkluderer, men er ikke begrenset til, pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EB0-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-l(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) og AZD35 (ATCC 37565).

Forskjellige bakterielle ekspresjonsvektorer kan anvendes for å uttrykke HPV6/11 DNA eller fragmenter derav i bakterieceller. Kommersielt tilgjengelige bakterielle ekspresjonsvektorer som kan være egnede for rekombinant HPV6/11 DNA-ekspresjon inkluderer, men er ikke begrenset til, pETlla (Novagen), lambda gt11 (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Forskjellige soppcelleekspresjonsvektorer kan anvendes for å uttrykke HPV6/11 eller fragmenter derav i soppceller. Kommersielt tilgjengelige soppcelleekspresjonsvektorer som kan være egnede for rekombinant HPV6/11 DNA-ekspresjon inkluderer, men er ikke begrenset til, pYES2 (Invitrogen), Pichia-ekspresjonsvektor (Invitrogen) og Hansenula-ekspresjon (Rhein Biotech, Dusseldorf, Tyskland).

Forskjellige insektcelleekspresjonsvektorer kan anvendes for å uttrykke HPV6/11 DNA eller fragmenter derav i insektceller. Kommersielt tilgjengelige insektcelleekspresjonsvektorer som kan være egnede for rekombinant ekspresjon av HPV6/11 DNA inkluderer, men er ikke begrenset til, pBlue Bae III (Invitrogen).

En ekspresjonsvektor som inneholder HPV6/11 DNA eller fragmenter derav kan anvendes for ekspresjon av HPVll-proteiner eller fragmenter av HPVll-proteiner i en celle, vev, organ eller et dyr. Dyr, som anvendt heri, inkluderer mennesker. Vertsceller kan være prokaryote eller eukaryote, inkludert, men ikke begrenset til, bakterier som E. coli, soppceller som gjær, pattedyrceller inkludert, men ikke begrenset til, cellelinjer med opprinnelse fra menneske, kveg, gris, ape og gnager, og insektceller inkludert, men ikke begrenset til, Drosophila- og silkeormavledete cellelinjer. Cellelinjer avledet fra pattedyr som kan være egnede og som er kommersielt tilgjengelige inkluderer, men er ikke begrenset til, L-celler L-M(TK") (ATCC CCL 1.3), L-celler L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raij (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K2 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) og MRC-5 (ATCC CCL 171).

Ekspresjonsvektoren kan innføres i vertceller via enhver av et antall teknikker inkludert, men ikke begrenset til, transformasjon, transfeksjon, lipofeksjon, protoplast-fusjon og elektroporering. De ekspresjonsvektorinneholdende celler formeres klonalt og analyseres individuelt for å bestemme hvorvidt de produserer HPVll-protein. Identifikasjon av HPVll-uttrykkende vertcellekioner kan utføres på mange forskjellige måter, inkludert, men ikke begrenset til, immunologisk reaktivitet med anti-HPVll-antistoffer.

Ekspresjon av HPV DNA-fragmenter kan også utføres ved anvendelse av in vi fcro-produsert syntetisk mRNA eller nativt mRNA. Syntetisk mRNA eller mRNA isolert fra celler som uttrykker HPV6/11 hybrid-DNA kan effektivt translateres i forskjellige cellefrie systemer, inkludert, men ikke begrenset til, hvetekimekstrakter og retikulocyttekstrakter, og de kan også effektivt translateres i cellebaserte systemer, inkludert, men ikke begrenset til, mikroinjeksjon i froskeoocytter, idet mikroinjeksjon i froskeoocytter er foretrukket.

Etter ekspresjon av HPVll-protein i en vertcelle kan HPVll-protein gjenvinnes for å tilveiebringe HPVll-protein i renset form. Atskillige HPVll-rensingsprosedyrer er tilgjengelige og egnede for anvendelse. Som beskrevet heri kan rekombinant HPVll-protein renses fra cellelysater og ekstrakter ved hjelp av forskjellige kombinasjoner av, eller individuell anvendelse av, saltfraksjonering, ionebytterkromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi, hydroksylapatittadsorp-sjonskromatografi og hydrofob interaksjonskromatografi.

Rekombinant HPVll-protein kan dessuten separeres fra andre cellulære proteiner ved anvendelse av en immunaffini-tetskolonne dannet med monoklonale eller polyklonale antistoffer spesifikke for uforkortet tilblivende HPVll eller polypeptidfragmenter av HPVll. Monoklonale og polyklonale antistoffer kan fremstilles i overensstemmelse med mange forskjellige metoder kjent i teknikken. Monoklonalt eller mono-spesifikt antistoff som anvendt heri er definert som en enkel antistofftype eller flere antistofftyper med homogene bind-ingskarakteristika for HPVll. Homogen binding, som anvendt heri, refererer til antistofftypenes evne til å bindes til spesifikt antigen eller en epitop.

Det fremgår for fagfolk at fremgangsmåten for fremstilling av monospesifikke antistoffer kan anvendes for å produsere antistoffer spesifikke for HPV-polypeptidfragmenter, eller uforkortede tilblivende HPV-polypeptider. Det fremgår spesielt for fagfolk at det kan dannes monospesifikke antistoffer som er spesifikke for de fullstendig funksjonelle HPV-proteiner eller fragmenter derav.

Foreliggende oppfinnelse angår også fremgangsmåter for screening for forbindelser som modulerer ekspresjonen av DNA eller RNA som koder for HPV, så vel som funksjonen (funksjonene) av HPVll-protein in vivo. Forbindelser som modulerer disse aktiviteter kan være DNA, RNA, peptider, proteiner eller ikke-proteinaktige organiske molekyler. Forbindelser kan modulere ved å øke eller minske ekspresjonen av DNA eller RNA som koder for HPVll eller funksjonen av HPVll-protein. Forbindelser som modulerer ekspresjonen av DNA eller RNA som koder for HPVll eller funksjonen av HVPll-protein, kan påvises ved hjelp av mange forskjellige analyser. Analysen kan være en enkel "ja/nei" analyse for å bestemme hvorvidt det foreligger en endring i ekspresjon eller funksjon. Analysen kan gjøres kvantitativ ved å sammenligne ekspresjon eller funksjon av en testprøve med nivåene for ekspresjon eller funksjon i en standardprøve.

Sett som inneholder HPV6/11 hybrid-DNA, fragmenter av HPV6/11 hybrid-DNA, antistoffer mot HPV6/11 DNA eller HVPll-protein, HPV6/11 hybrid-RNA eller HPVll-protein, kan prepareres. Slike sett anvendes for å påvise DNA som hybridiserer til HPV6/11 DNA, eller for å påvise tilstedeværelse av HPVll-protein eller peptidfragmenter i en prøve. En slik karakterisering er anvendelig for mange forskjellige formål inkludert, men ikke begrenset til, rettsmedisinske analyser og epidemiologiske undersøkelser. Nukleotidsekvenser som er komplementere til HPV6/11 DNA-sekvensen kan syntetiseres for antisens-terapi. Disse antisenB-molekyler kan være DNA, stabile derivater av DNA som fosfortioater eller metylfosfonater, RNA, stabile derivater av RNA som 2'-O-alkyl-RNA, eller andre HPV6/ll-antisens-oligonukleotidetterligninger. HPV6/ll-anti-sensmolekyler kan innføres i celler ved mikroinjeksjon, liposominnkapsling eller ved ekspresjon fra vektorer som inneholder antisenssekvensen. HPV6/ll-antisensterapi kan være spesielt anvendelig for behandling for sykdommer hvor det er fordelaktig å redusere HPVll-aktivitet.

Betegnelsen "kjemisk derivat" beskriver et molekyl som inneholder ytterligere kjemiske komponenter som ikke vanligvis er en del av basismolekylet. Slike komponenter kan forbedre oppløseligheten, halveringstiden, absorpsjonen etc. av basismolekylet. Alternativt kan komponentene minske uønskede bivirkninger fra basismolekylet eller redusere toksisiteten av basismolekylet. Eksempler på slike komponenter er beskrevet i atskillige tekster, slik som Remington's Pharmaceutical Sciences.

Forbindelser identifisert i overensstemmelse med metoden beskrevet heri kan anvendes alene i egnede doseringer definert ved hjelp av rutinetesting, for å oppnå optimal inhibering av HPVll eller dets aktivitet under minimalisering av enhver potensiell toksisitet. Samtidig administrering eller sekvensiell administrering av andre midler kan også være ønskelig.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan fordelaktig administreres i en enkel dose, eller den totale dose kan administreres ved hjelp av flere delte doser. Forbindelser anvendt ved foreliggende oppfinnelse kan dessuten administreres på mange forskjellige måter, inkludert, men ikke begrenset til, intranasalt, transdermalt, ved hjelp av supposi-

torium, oralt og lignende.

For kombinasjonsbehandling med flere enn ett aktivt middel der de aktive midler foreligger i separate doserings-formuleringer, kan de aktive midler administreres samtidig, eller hver av forbindelsene kan administreres på separat for-skjøvne tidspunkter.

Doseringsregimet som anvender forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse utvelges i overensstemmelse med forskjellige faktorer, inkludert type, art, alder, vekt, kjønn og pasientens medisinske tilstand; alvorligheten av tilstanden som skal behandles; administreringsmåten; pasientens nyre- og leverfunksjon; og den spesielle forbindelse som benyttes. En vanlig lege kan lett bestemme og foreskrive den effektive mengde av legemidlet som fordres for å forebygge, motvirke eller stanse utviklingen av tilstanden. Optimal presisjon for å oppnå konsentrasjoner av legemidler som ligger innenfor det område som gir virkningsfullhet uten toksisitet, fordrer et regime basert på kinetikken for legemidlets evne til mål-retting. Dette involverer en vurdering av fordeling, likevekt og eliminering av legemiddel.

Ved fremgangsmåtene kan forbindelsene beskrevet heri i detalj danne den aktive bestanddel og kan administreres i blanding med egnede farmasøytiske fortynningsmidler, eksipienser eller bærere (kollektivt referert til heri som "bærer" materialer) som passende utvelges med hensyn til den tilsiktede administreringsform, dvs. orale tabletter, kapsler, eliksirer, siruper, suppositorier, geler og lignende, og i overensstemmelse med konvensjonell farmasøytisk praksis.

For oral administrering i form av en tablett eller kapsel kan den aktive legemiddelkomponent f.eks. kombineres med en oral, ikke-toksisk farmasøytisk akseptabel inert bærer, slik som etanol, glyserol, vann og lignende. Når det er ønsket eller nødvendig kan dessuten egnede bindemidler, smøremidler, desintegrasjonsmidler og fargemidler også inkorporeres i blandingen. Egnede bindemidler inkluderer uten begrensning, stivelse, gelatin, naturlige sukkere som glukose eller p-laktose, maissøtningsmidler, naturlige og syntetiske gummier som akasie, tragant, natriumalginat, karboksymetylcellulose, polyetylenglykol, voks og lignende. Smøremidler anvendt i disse doseringsformer inkluderer uten begrensning, natrium-oleat, natriumstearat, magnesiumstearat, natriumbenzoat, natriumacetat, natriumklorid og lignende. Desintegrasjonsmidler inkluderer uten begrensning, stivelse, metylcellulose, agar, bentonitt, xantangummi og lignende.

For flytende former kan den aktive legemiddelkomponent kombineres i egnet smaksatte suspensjons- eller dispersjonsmidler, slik som de syntetiske og naturlige gummier, f.eks. tragant, akasie, metylcellulose og lignende. Andre dispersjonsmidler som kan benyttes inkluderer glyserol og lignende. For parenteral administrering er sterile suspensjoner og oppløsninger ønskelige. Isotone preparater som vanligvis inneholder egnede konserveringsmidler anvendes når intravenøs administrering er ønsket.

Topiske preparater som inneholder den aktive legemiddelkomponent kan blandes med forskjellige bærermaterialer velkjente i teknikken, slik som f.eks. alkoholer, aloe vera-gel, allantoin, glyserol, vitamin A og E-oljer, mineraloljer, PPG2-myristylpropionat og lignende, for å danne f.eks. alkoholiske oppløsninger, topiske rengjøringsmidler, rense-kremer, hudgeler, hudlotions og sjampoer i krem- eller gel-formuleringer.

Forbindelsene kan også administreres i form av liposomutleveringssystemer, slik som små unilamellær vesikler, store unilamellær vesikler og multilamellære vesikler. Liposomer kan dannes fra forskjellige fosfolipider, slik som kolesterol, stearylamin eller fosfatidylcholiner.

Forbindelser kan også utleveres ved anvendelse av monoklonale antistoffer som individuelle bærere som forbindelsesmolekylene er koblet til. Forbindelsene kan også kobles med egnede polymerer som målrettingsbare legemiddel-bærere. Slike polymerer kan inkludere polyvinylpyrrolidon, pyrankopolymer, polyhydroksypropylmetakrylamidfenol, polyhydroksyetylaspartamidfenol eller polyetylenoksidpolylysin substituert med palmitoylrester. Forbindelsen kan dessuten kobles til en klasse av biologisk nedbrytbare polymerer anvendelige for å oppnå kontrollert frigivelse av et legemiddel, f.eks. polymelkesyre, polyepsilonkaprolakton, polyhydroksysmørsyre, polyortoestere, polyacetaler, polydihydropyraner, polycyanakrylater og kryssbundne eller amfifatiske blokk-kopolymerer av hydrogeler.

De følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse uten imidlertid å begrense oppfinnelsen til disse.

Eksempel 1

Konstruksjon av det syntetiske LI- gen

Den 1,5 kbp åpne avlesningsramme av HPVll LI ble konstruert ved anvendelse av syntetisk DNA-oligomerer bestilt fra Midland Reagent Company. Disse oligomerer ble levert inneholdende 5'-terminale fosfater. Det var behov for totalt 24 oligomerer som er oppført nedenfor:

Oligomerer som danner komplementære par (nr. 241-1 og nr. 241-24, nr. 241-2 og nr. 241-23, nr. 241-3 og nr. 241-22, nr. 241-4 og nr. 241-21, nr. 241-5 og nr. 241-20, nr. 241-6 og nr. 241-19, nr. 241-7 og nr. 241-18, nr. 241-8 og nr. 241-17, nr. 241-9 og nr. 241-16, nr. 241-10 og nr. 241-15, nr. 241-11 og nr. 241-14, nr. 241-12 og nr. 241-13-figur 1), ble annealed i separate rør inneholdende 2,5 mM tris, pH 7,5, 0,25 mM EDTA. Rørene ble oppvarmet til 98 °C i 4 minutter og deretter plassert i 200 ml vann ved 98 °C i et 250 ml begerglass for å avkjøles langsomt. Når vannet var avkjølt til romtemperatur ble de annealede par tilsatt til rør som angitt: Fragment A (oligomerpar nr. 241-1 og 24, og -2 og 23); fragment B (nr.

241-3 og 22, og -4 og 21, -5 og 20 og -6 og 19); fragment C (nr. 241-7 og 18, og -8 og 17, -9 og 16 og -10 og 15) og fragment D (nr. 241-11 og 14, og -12 og 13). Disse oligomerpar-blandinger ble oppvarmet til 62 °C i 2 minutter og deretter avkjølt langsomt som beskrevet ovenfor. Innholdet i hvert rør ble ligert over natten ved 23 °C ved anvendelse av T4 DNA-ligase (Boehringer Mannheim, Inc.) og reagensene levert av fabrikanten.

Etter ligering fordret fragment B PCR-ampiifikasjon for å øke mengden av fullengde produkt. Dette fordrer 10 sykluser ved 94 °C, ett minutt; 48 °C, ett minutt; 72 °C, ett minutt, etterfulgt av 10 minutter ved 72 °C i et Applied Biosystems termosykliseringsapparat ved anvendelse av Boehringer Mannheim Taq-polymerase og oligomerprimere:

De ligerte produkter og fragment B PCR-produktet ble spaltet med restriksjonsenzymer (Boehringer Mannheim, Inc.) som følger: fragment A ble spaltet med Bgl II og Sph I; fragment B, Sph I og Kpn I; fragment C, Kpn I og Xho I; og fragment C, Xho I og Bgl II. De spaltede fragmenter ble separert på lavtsmeltende agarosegeler (FMC BioProducts) og fragmenter med korrekt størrelse ble isolert ved utskjæring av båndet og spaltning av agarosen ved anvendelse av "Agarase" (Boehringer Mannheim, Inc.) som anbefalt av leverandøren. Fragmentene A, B og D ble isolert ved etanolutfelling og deretter ligert separat i vektoren pSP72 (Promega, Inc.) som likeledes var spaltet med restriksjonsenzymer for å passe til hvert fragment som ble ligert.

Det Kpn I, Xho I-spaltede fragment C ble først ligert til de annealed oligomerer

Fragment C ble deretter spaltet på nytt med Xho I og det 450 bp Kpnl Xhol-fragment ble ligert med den Kpn I, Xho I-spaltede pSP72-vektor. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere Escherichia coli-stamme DH5-kompetente celler (Gibco BRL, Gaithesburgh, MD). Transformanter ble screenet for innføyelsesinneholdende kloner ved hjelp av kolonihybridiser-ing (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Plasmid DNA ble isolert fra de positive kloner ved anvendelse av et Wizard miniprep-sett (Promega Corp.) og deretter sekvensert ved anvendelse av et Applied Biosystems 373 A DNA-sekvenseringsapparat. Kloner som inneholder den korrekte DNA-sekvens for hvert av de fire fragmenter ble spaltet som tidligere for å frigjøre fragmentene fra pSP72-vektoren. Det Kpn I, Xho I-spaltede fragment C ble ligert med det Xho I, Bgl II-spaltede fragment D og Kpn I, Bgl II-spaltet pSP72 i en treveis ligering. Ligeringsproduktene ble deretter anvendt for å transformere E. coli. Resulterende transformanter ble sekvensert og en klon med korrekt sekvens ble oppnådd (betegnet CD). Den 750 bp Bgl II, Kpn I-innføyelse av CD ble på nytt spaltet fra pSP72-vektoren og ligert med det Bgl II, Sph I-spaltede fragment A og Sph I, Kpn I-spaltede fragment B i en treveis ligering som ovenfor, med unntak av at Bgl II ble tilsatt for å redusere uønskede ligeringsprodukter. Ligeringsproduktene ble separert på agarosegeler, det 1,5 kbp-fragment ble isolert og betegnet D361-1.

Eksempel 2

Sammenligning mellom sekvenser

En sammenligning mellom nukleotidsekvensen for HPV6/11-hybrid, HPV6a og HPVll LI DNA-sekvensene er vist i figur 2. Det er utført totalt 55 nukleotidsubstitusjoner i HPV6-skjelettsekvensen for å omdanne den til en HPVll-kodende translasjonsramme. Tre baseparinnføyelser ble dessuten utført ved basepar nr. 411-413 for å kode for den ytterligere aminosyre (tyrosin<132>) funnet i HPVll, men ikke i HPV6. Til sammen tillater disse endringer at det type 11-spesifikke, konforma-sjonsavhengige, nøytraliserende monoklonale antistoff

(Chemicon 8740 MAb) binder Ll-proteinet fra HPV6/11 LI DNA uttrykt i gjær. Dette antyder at proteinet fra HPV6/ll-hybridgenet ikke synes å kunne skjelnes immunologisk fra nativt HPVll.

En sammenligning mellom HPV6/11 hybrid-DNA-sekvensen og den publiserte HPVll Ll-sekvens viser 194 baseparsubstitu-sjoner. Det foreligger et betydelig antall substitusjoner i forhold til villtype 11 Ll-sekvensen der enhver kombinasjon av disse, eller alle endringer totalt, kan være det som er ansvarlig for den økte type 11 Ll-proteinekspresjon i gjær.

Eksempel 3

DNA- sekvensering av Ll- genet

HPV6/11 Ll-genet ble sekvensert ved anvendelse av et Applied Biosystems DNA-sekvenseringsapparat nr. 373A med fargeterminatorsekvenseringsreaksjoner ("PRIZM" sekvenserings-sett) som spesifisert av fabrikanten (ABI, Inc., Foster City,

CA) .

Eksempel 4

Konstruksjon av HPV6/ 11 LI-, HPVll LI- og HPV6 Ll- gjærekspre-sj onsvektorer

pGALl-10-gjærekspresjonsvektoren ble konstruert ved isolering av et 1,4 kbp SphI-fragment fra et pUCl8/dobbelt-rettet GAL-promotorplasmid som inneholder de Saccharomyces cerevisiae-divergente GALI-GALIO-promotorer fra plasmidet pBM272 (levert av Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). De divergente promotorer er flankert på hver side av en kopi av gjær-ADHl-transkripsjonsterminatoren (Bennetzen, J.L. og Hall, B.D., 1982, J. Biol. Chem. 257:3018-3025), et BamHI-kloningssete lokalisert mellom GALI-promotoren og den første kopi av ADHl-transkripsjonsterminatoren, og et Smal-kloningssete lokalisert mellom GAL10-promotoren og den andre kopi av ADHl-transkripsjonsterminator. En gjærskyttelvektor bestående av pBR322, gjær-LEU2d-genet (Erhart, E. og Hollenberg, C.P., 1983, J. Bacteriol. 156:625-635) og gjær-2u-plasmidet (gave fra Benjamin Hall, University of Washington, Seattle, WA) (Broach, J.R. og Volkert, F.C., 1991, Circular

DNA Plasmids of Yeasts, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ble spaltet med SphI og ligert med det 1,4 kbp Sphl-divergente GAL-promoterfragmentet, hvilket fører til pGALl-10 (figur 3).

HPV6/ll-hybrid-Ll DNA som koder for HPVll Ll-proteinet (prøve D361-1 fra eksempel 1) inneholder en utranslatert gjær-ledersekvens (Kniskern, P.J. et al., 1986, Gene 46:135-141) umiddelbart oppstrøms for det HPV6/11 Ll-initierende metioninkodon. pGALl-10-plasmidet ble linearisert med BamHI som kutter mellom GALI-promotoren og ADHl-transkripsjonsterminatoren, og ligert med det 1,5 kbp, HPV6/11 Ll-genfragment (prøve D361-1). E. coli DH5 (Gibco BRL, Inc.) transformanter ble screenet, og et pGALl-10-plasmid inneholdende HPV6/11 Ll-genet ble isolert og betegnet som D362-1.

Villtype HPVll (wt-HPVll) DNA ble klonet fra en condyloma acuminatum-lesjon (gave fra Dr. Darron Brown). Totalt humant genomisk DNA ekstrahert og spaltet med restrik-sjonsendonukleaser. Fraksjonen som inneholder wt-HPVll DNA ble ligert i en E. coli-kloningsvektor for å anvendes som et templat for PCR. wt-HPVll Ll-genet ble amplifisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av Vent polymerase (New England Biolabs, Inc.), 10 amplifikasjonssykluser (94 °C 1 minutt, 48 °C

1 minutt, 72 °C 1 minutt 45 sekunder), og de følgende oligo-nukleotidprimere som inneholder flankerende Bgl II-seter (understreket):

Sens-primeren innfører en utranslatert gjær-ledersekvens (Kniskern, P.J. et al., 1986, Gene 46:135-141) umiddelbart oppstrøms for det wt-HPVll Ll-initierende metioninkodon (uthevet med fet skrift). Det 1,5 kbp wt-HPVll LI PCR-produkt ble spaltet med Bglll, gelrenset og ligert med det BamHI-spaltede pGALl-10-plasmid for å gi plasmid p329-l.

Totalt genomisk DNA ble ekstrahert fra en HPV6a-positiv, condyloma acuminatum-lesjon (gave fra Dr. Darron Brown). HPV6a Ll-genet ble amplifisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av biopsiprøve-DNA som et templat, Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.), 35 amplifikasjonssykluser (94 °C

1 minutt, 48 °C 1 minutt, 72 °C 1 minutt 45 sekunder), primeren oppført ovenfor for PCR av wt-HPVll LI og en antisens-primer med sekvensen,

Det 1,5 kbp HPV6a LI PCR-produkt ble spaltet med Bglll, gelrenset og ligert med det BamHI-spaltede pGALl-10-plasmid for å gi plasmid D128.

Eksempel 5

Fremstilling av stamme 1558

Trinn a: Fremstilling av gjærstamme U9

Saccharomycea cerevisiae stamme 2150-2-3 (MATalpha, leu2-04, adel, eir<0>) ble erholdt fra Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA). Celler av stamme 2150-2-3 ble formert over natten ved 30 °C i 5 ml YEHD-medium (Carty et al., J. Ind. Micro 2 (1987) 117-121). Cellene ble vasket tre ganger i sterilt, destillert vann, resuspendert i 2 ml sterilt, destillert vann og 0,1 ml cellesuspensjon ble utspredt på hver av 6 5-fluororotsyre (FOA) plater for å utvelge ura3-mutanter (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics) . Platene ble inkubert ved 30 °C. Mediet inneholdt pr. 250 ml destillert vann: 3,5 g Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer og ammoniumsulfat; 0,5 g 5-fluororotsyre;

25 mg Uracil; og 10,0 g dekstrose.

Mediet ble sterilisert ved filtrering gjennom 0,2 um membraner og deretter blandet med 250 ml 4 % Bacto-Agar (Difco) opprettholdt ved 50 °C, 10 ml av en 1,2 mg/ml oppløs-ning av adenin og 5 ml L-leucinoppløsning (180 mg/50 ml). 20 ml av det resulterende medium ble tilført pr. petriBkål.

Etter 5 dagers inkubasjon var det fremkommet et stort antall kolonier. Enkle kolonier ble isolert ved på nytt å streke kolonier fra de opprinnelige FOA-plater på nye FOA-plater som deretter ble inkubert ved 30 °C. Et antall kolonier fra det andre sett av FOA-plater ble testet for tilstedeværelse av ura3-mutasjonen ved kopieringsavtrykk på både YEHD-plater og uracil-minus-plater. Det ønskede resultat var god vekst på YEHD og ingen vekst på uracil-minus-medium. Det ble erholdt et isolat (U9) som viste disse egenskaper. Det ble lagret som et nedfrosset glyserolforråd (stamme nr. 325) ved

-70 °C for senere anvendelse.

Trinn b: Fremstilling av en vektor for oppsplitting av MNN9-gjærgenet

For å fremstille en vektor for oppsplitting av MNN9-genet var det nødvendig først å klone MNN9-genet fra S. cerevisiae-genomisk DNA. Dette ble oppnådd ved hjelp av standard polymerasekjedereaksjons(PCR)teknologi. En 5' sens-primer og 3' antisens-primer for PCR av den uforkortede MNN9-kodingssekvens ble utformet basert på den publiserte sekvens for MNN9-gjærgenet (Zymogenetics: EPO patentsøknad nr. 88117834.7, publikasjon nr. 0-314-096-A2). De følgende oligodeoksynukleotidprimere inneholdende flankerende HindiII-seter (understreket) ble anvendt:

Det innledende metioninkodon for MNN9-genet er uthevet med fet skrift. PCR ble utført ved anvendelse av genomisk DNA fra S. cerevisiae stamme JRY188 som templat, Taq DNA-polymerase (Perkin Eimer) og 25 amplifikasjonssykluser (94 °C 1 minutt, 37 °C 2 minutter, 72 °C 3 minutter). Det resulterende 1,2 kbp PCR-fragment ble spaltet med Hindlll, gelrenset og ligert med Hindlll-spaltet, alkalisk fosfatasebehandlet pUC13 (Pharmacia). Det resulterende plasmid ble betegnet pll83.

For å splitte MNN9-genet med URA3-gjærgenet, ble plasmidet pBR322-URA3 (som inneholder 1,1 Kbp HindiII-fragmentet som koder for S. cerevisiae URA3-genet subklonet i Hindlll-setet av pBR322) spaltet med Hindlll, og 1,1 kbp DNA-fragmentet som inneholder det funksjonelle URA3-gen ble gelrenset, gjort butt-endet med T4 DNA-polymerase og deretter ligert med Pmll-spaltet plasmid pll83 (Pmll kutter innen MNN9-kodingssekvensen). Det resulterende plasmid pll99 inneholder en oppsplitting av MNN9-genet med det funksjonelle URA3-gen.

Trinn c: Konstruksjon av U9- derivatstamme 1372 inneholdende oppsplitting av MNN9- genet

For oppsplitting av MNN9-genet i stamme U9 (nr. 325), ble 30 ug plasmid pll99 spaltet med Hindlll for å danne en lineær MNN9::URA3-oppslittingskassett. Celler av stamme 325 ble transformert med det Hindlll-spaltede pll99 DNA ved hjelp av seroplastmetoden (Hinnen et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:1929-1933) og transformanter ble utvalgt på et syntetisk agarmedium som manglet uracil og inneholdt 1,0 M sorbitol. Det syntetiske medium inneholdt pr. liter destillert vann: Agar, 20 g; gjærnitrogenbase uten aminosyrer, 6,7 g; adenin, 0,04 g; L-tyrosin, 0,05 g; sorbitol, 182 g,- glukose, 20 g; og leucin-minus oppløsning nr. 2, 10 ml. Leucin-minus oppløsning nr. 2 inneholder pr. liter destillert vann: L-arginin, 2 g; L-histidin, 1 g; L-leucin, 6 g; L-isoleucin, 6 g; L-lysin, 4 g; L-metionin, 1 g; L-fenylalanin, 6 g; L-treonin, 6 g; L-tryptofan, 4 g.

Platene ble inkubert ved 30 °C i 5 dager, , og ved dette tidspunkt var det fremkommet et stort antall kolonier. Kromosomale DNA-preparater ble fremstilt fra 10 kolonier og deretter spaltet med EcoRI pluss Hindlll. DNA-spaltnings-produktene ble deretter evaluert ved hjelp av Southern blots (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ved anvendelse av 1,2 kbp HindiII-fragmentet inneholdende MNN9-genet (isolert fra plasmid pll99) som en probe. Det ble identifisert et isolat (stamme nr. 1372) som viste de forventede DNA-skift på Southern blot, så vel som den ekstreme sammenklumping som

typisk vises av MNN9-mutanter.

Trinn d: Konstruksjon av en vektor for oppsplitting av gjær HIS3- gen

For å konstruere en oppsplittingskassett i hvilken S. cerevisiae HIS3-genet er splittet med URA3-genet, ble plasmid YEp6 (K. Struhl et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 76:1035) spaltet med BamHI og 1,7 kbp BamHI-fragmentet inneholdende HIS3-genet ble gelrenset, gjort butt-endet med T4 DNA-polymerase og ligert med pUC18 som tidligere var blitt spaltet med BamHI og behandlet med T4 DNA-polymerase. Det resulterende plasmid (betegnet pl501 eller pUC18-HIS3) ble spaltet med Nhel (som kutter i HIS3-kodingssekvensen), og vektorfragmentet ble gelrenset, gjort butt-endet med T4 DNA-polymerase og deretter behandlet med kalvetarm-alkalisk fosfatase. URA3-genet ble isolert fra plasmidet pBR322-URA3 ved spaltning med Hindlll, og 1,1 kbp fragmentet inneholdende URA3-genet ble gelrenset, gjort butt-endet med T4 DNA-polymerase og ligert med det ovenfor angitte pUC18-HIS Nhel-fragment. Det resulterende plasmid (betegnet pUC18-HIS3::URA3 eller pl505) inneholder en oppsplittingskassett i hvilken HIS3-gjærgenet er oppsplittet med det funksjonelle URA3-gen.

Trinn e: Konstruksjon av vektor for oppsplitting av gjær PRB1-genet med HIS3- genet

Plasmid FP8AH inneholdende S. cerevisiae PRBl-genet, ble fremskaffet av Dr. E. Jones ved Carnegie-Mellon Univ.

(CM. Moehle et al., 1987, Genetics 115:255-263). Det ble spaltet med Hindlll pluss Xhol, og 3,2 kbp DNA-fragmentet inneholdende PRBl-genet ble gelrenset og gjort butt-endet ved behandling med T4 DNA-polymerase. Plasmidet pUC18 ble spaltet med BamHI, gelrenset og gjort butt-endet ved behandling med T4 DNA-polymerase. Det resulterende vektorfragment ble ligert med det ovenfor anvendte PRBl-genfragment for å gi plasmidet pUC18-PRBl. Plasmid YEp6 som inneholder HIS3-genet ble spaltet med BamHI. Det resulterende 1,7 kbp BamHI-fragment inneholdende det funksjonelle HIS3-gen, ble gelrenset og deretter gjort butt-endet ved behandling med T4 DNA-polymerase. Plasmid

pUC18-PRBl ble spaltet med EcoRV pluss Ncol som kutter innen PRBl-kodingssekvensen og fjerner det protease B-aktive sete og den flankerende sekvens. 5,7 kbp EcoRV-NcoI-fragmentet inneholdende de resterende 5'- og 3'-deler av PRBl-kodingssekvensen i pUCl8, ble gelrenset, gjort butt-endet ved behandling med T4 DNA-polymerase, defosforylert med kalvetarm-alkalisk fosfatase og ligert med det butt-endede HIS3-fragment beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid (betegnet pUC18-prbl::HIS3, forråd nr. 1245) inneholder det funksjonelle HIS3-gen i stedet for delen av PRBl-genet som var blitt deletert ovenfor.

Trinn f: Konstruksjon av en U9- beslektet gjærstamme inneholdende oppsplittinger av både MNN9- og PRBl- genene

Den U9-beslektede stamme 1372 som inneholder en MNN9-genoppsplitting ble beskrevet i eksempel 5c. Klonale isolater av stamme 1372 ble passert på FOA-plater (som beskrevet i eksempel 5a) for å utvelge URA3-mutanter. Et antall URA3-isolater av stamme 1372 ble erholdt, og et spesielt isolat (stamme 12930-190-S1-1) ble utvalgt for etterfølgende oppsplitting av HIS3-genet. pUC18-HIS3::URA3-genoppsplittings-vektoren (pl505) ble spaltet med Xbal pluss EcoRI for å danne en lineær HIS3::URA3-oppsplittingskassett og anvendt for transformasjon av Btamme 12930-190-S1-1 ved hjelp av litiumacetatmetoden (Methods in Enzymology, 194:290 (1991)). Ura<+ >transformanter ble utvalgt på syntetisk agarmedium som manglet uracil, streket på nytt for klonale isolater på det samme medium og deretter kopieringsoverført på medium som enten manglet uracil eller histidin for å screene for disse isolater som begge var Ura<+> og His". Ett isolat (stamme 12930-230-1) ble utvalgt for etterfølgende oppsplitting av PRBl-genet. PRB1-genoppsplittingsvektoren (pUC18-prbl::HIS3, forråd nr. 1245) ble spaltet med SacI pluss Xbal for å danne en lineær prbl::HIS3-oppsplittingskassett og anvendt for transformasjon av stamme 12930-230-1 ved hjelp av litiumacetatmetoden. His<+ >transformanter ble utvalgt på agarmedium som manglet histidin, og streket på nytt på det samme medium for klonale isolater. Genomisk DNA be preparert fra et antall av de resulterende His<+->isolater, spaltet med EcoRI og deretter underkastet elektroforese på 0,8 % agarosegeler. Southern blot-analyser ble deretter utført ved anvendelse av en radiomerket 617 bp-probe for PRBl-genet som var blitt fremstilt ved hjelp av PCR ved anvendelse av de følgende oligodeoksynukleotidprimere: 11 isolater ble erholdt som viste den forventede hybridisering av proben med et 2,44 kbp prbl::HIS3 DNA-fragment . Dette stod i motsetning til hybridisering av proben med 1,59 kbp fragmentet for villtype PRBl-genet. Ett av disse isolater som inneholdt den ønskede prbl::HIS3-oppsplitting ble utvalgt for ytterligere anvendelse og ble betegnet stamme nr. 1558.

Eksempel 6

Ekspresjon av HPVll LI og HPV6 LI i gjær

Plasmider D362-1 (pGALl-10 + HPV6/11 LI), p329-l (pGALl-10 + wt-HPVll LI), D128 (pGALl-10 + HPV6 LI) og pGALl-10 ble anvendt for å transformere S. cerevisiae stamme nr. 1558 (MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°) ved hjelp av sferoblastmetoden {Hinnen et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929-1933). Gjærstamme nr. 1558 transformert med plasmid D362-1 ble betegnet som stamme nr. 1782. For RNA-undersøkelser ble klonale gjærisolater dyrket ved 30 °C i YEH-komplekst medium (Carty et al., 1987, J. Ind. Micro. 2, 117-121) inneholdende 0,1 M sorbitol og enten 2 % glukose eller galaktose, i 26 timer. Etter innhøsting av cellene ble gjær-RNA ekstrahert ved anvendelse av metoden med varm sur fenol som beskrevet i Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols, 1993). For proteinanalyse ble de identiske isolater dyrket ved 30 °C i YEH-kompleksmedium inneholdende 0,1 M sorbitol, 2 % glukose og 2 % galaktose i 70 timer. Etter innhøsting av cellene ble cellepelletene nedbrutt med glasskuler og cellelysater ble analysert for ekspresjon av HPVll LI- eller HPV6 LI-protein ved hjelp av immun-

blotanalyser.

Eksempel 7

Northern blot- analyse av gjæruttrykte HPV LI- RNA

Prøver inneholdende 10 ug totalt RNA ble denaturert ved behandling med glyoksal og DMSO (Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Current Protocols, 1993) og underkastet elektroforese gjennom en fosfatbufret 1,2 % agarosegel. RNA ble overført til en nylonmetnbran og påvist med et <32>P-merket oligonukleotid som er komplementært med både HPVll- og HPV6 LI DNA-sekvensene.

Northern-blot er vist i figur 4. Ingen bånd som til-svarer den forventede størrelse for uforkortet HPV LI RNA ble påvist i prøvene dyrket på glykosemedium (felt 1, 3 og 5). Dette er forventet fordi glukose undertrykker transkripsjon fra gjær-GAL 1-promotoren. I motsetning til dette viser prøver dyrket i galaktosemedium som induserer transkripsjon fra GAL1-promotoren, sterke HPV LI RNA-signaler. HPV6 LI ble transkribert som en uforkortet RNA-type (felt 2), mens hoveddelen av villtype (wt)-HPVll LI ble transkribert som en trunkert form (felt 4). Dette resultat antyder at et gjærtranskrip-sjonsstoppsignal er lokalisert i wt-HPVll LI ORF, men er ikke til stede i HPV6 Ll-sekvensen. RNA transkribert fra HPV6/11-hybridgenet synes å være uforkortet (felt 6). Intet HPV-spesifikt DNA påvises i pGALl-10-kontrollgjærprøven (felt 7).

Eksempel 8

Western- analyse av gjæruttrykte HPV Ll- proteiner

Prøver inneholdende 20 ug totalt cellulært protein ble underkastet elektroforese gjennom 10 % tris-glysingeler (Novex, Inc.) under denatureringsbetingelser, og elektro-blottet på nitrocellulosefiltere. LI-protein ble immunpåvist ved anvendelse av kanin-antiserum mot et trpE-HPVll Ll-fusjonsprotein som primært antistoff (Brown, D.R. et al., 1994, Virology 201:46-54) og pepperrotperoksidase (HRP)-bundet esel-anti-kanin-IgG (Amersham, Inc.) som sekundært antistoff. Filtrene ble bearbeidet ved anvendelse av kjemiluminescens "ECL"-påvisningssettet (Amersham, Inc.). Et 50-55 kDa LI-proteinbånd ble påvist i alle prøver med unntak av den pGALl-10 negative kontroll (felt 4) (figur 5). Mengden av HPVll Ll-protein uttrykt av HPV6/11-hybridgenet (felt 3), synes dessuten å være ca. 10 ganger større enn mengden av Ll-protein uttrykt av enten wt-HPVll-genet (felt 2) eller HPV6 Ll-genet (felt 1).

Eksempel 9

ELISA av gjæruttrykt HPVll LI- VLP

En ELISA ble anvendt for å bestemme relative mengder av VLP produsert fra gjærkloner som uttrykker enten wt-HPVll eller HPV6/11-hybriden. ELISA ble også anvendt for å demon-strere at den strukturelle epitop som forårsaker sterk nøytraliserende antistoffresponser ble bibeholdt på VLP avledet fra HPV6/11 hybrid DNA. Denne strukturelle epitop er blitt definert ved hjelp av monoklonalt antistoff H11.B2 (Christensen et al., 1990, J. Virol. 64, 5678-5681) som er tilgjengelig fra Chemicon International (Temecula, CA) som Chemicon Mab8740. Kort beskrevet ble brønner i ELISA-plater (Maxisorb, Nunc. Inc., Naperville, IL) belagt med minskende mengder av totalt gjærprotein inneholdende HPV6/11 (hybrid) eller wt-HPVll VLP i 100 ul PBS. CsCl-rensede wt-HPVll-virioner (en generøs gave fra Dr. D. Brown) og gjærprotein-kontroll, ble anvendt som kontroller. Platene ble inkubert over natten ved 4 °C før avsuging og blokkering av platene med 250 ul 10 % tørket melk (Carnation) i TTBS (50 mM tris, pH 7,6, 150 nM NaCl, 0,1 % Tween 20) i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble vasket én gang med PBS/0,1 % Tween 20 før brønnene ble inkubert med 100 ul av en 1:1 000-fortynning av det anti-HPVll-virion-monoklonale antistoff Chemicon MAB 8740 i 1 % tørket melk i TTBS, i én time ved romtemperatur. Plater ble vasket tre ganger med PBS/Tween 20 og deretter inkubert med 100 ul anti-mus-IgG koblet til alkalisk fosfatase (Kierkegard & Perry, Gaithersburg, MD) ved en fortynning på 1:1 000 i 1 % melk + TTBS i én time ved romtemperatur. Platene ble på nytt vasket tre ganger, med PBS/Tween 20 før tilsetning av 100 ul fosfatsubstrat (p-nitrofenylfosfat i dietanolaminbuffer). Platene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Reak-sjonen ble stanset ved tilsetning av 50 pl 3 N NaOH. Platene ble avlest ved 405 nm i en ELISA-plateavleser.

De gjennomsnittlige OD40s nm-avlesninger for to brønner, korrigert mot bakgrunnsavlesningene erholdt fra kontrollgjær proteiner, ble plottet mot det totale innhold av gjærprotein i brønnene og er vist i figur 6. HPV6/ll-hybrid-gjærklonen produserte mer enn 10 ganger lengden av nativ VLP sammenlignet med wt-klonen. Den sterkt nøytraliserende epitop gjenkjent ved hjelp av Chemicon Mab 8740 blir dessuten frem-vist på disse VLP.

Eksempel 10

Elektronmikroskopiske undersøkelser

For EM-analyse (Structure Probe, West Chester, PA) ble en aliquot av hver prøve (urenset klaret lysat eller rensede VLP) plassert på 200-mesh karbonbelagte koppernett. En dråpe av 2 % fosfowolframsyre (PTA), pH 7,0, ble plassert på nettet i 20 sekunder. Nettene ble tillatt å lufttørke før transmisjons-EM-undersøkelse. All mikroskopi ble utført ved anvendelse av et JEOL 100CX transmisjonselektronmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 kV. De dannede mikrofotografier er en endelig forstørrelse på

100 000x. Som vist i figur 4 ble VLP observert i diameter-størrelsesområdet 45-55 nm i alle HPVll-prøver, men ikke i gj ærkontroilprøver.

Eksempel 11

Fermentering av HPV6/ 11 LI ( stamme nr. 1782)

Overflatevekst av en platekultur av stamme 1782 ble aseptisk overført til et leucinfritt flytende medium inneholdende (pr. liter): 8,5 g Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer og ammoniumsulfat; 0,2 g adenin; 0,2 g uracil; 10 g ravsyre; 5 g ammoniumsulfat; og 0,25 g L-tyrosin; dette medium ble justert til pH 5,0-5,3 med NaOH før sterilisering. Etter dyrk-ing i 25 timer ved 28 °C, 250 rpm på et rotasjonsristeapparat, ble frosne kulturampuller preparert ved tilsetning av steril glyserol til en sluttkonsentrasjon på 17 % (vekt/volum) før lagring ved -70 °C (1 ml pr. kryoampulle) . Inokulum for fermentering av stamme 1782 ble utviklet i det samme medium (750 ml pr. 2 liter flaske) og ble startet ved overføring av det opptinte innhold av to frosne kulturampuller til 2 liters flaskene, etterfulgt av inkubasjon ved 28 °C, 250 rpm på et rotasjonsristeapparat, i 25 timer. Fermentering av stamme 1782 benyttet en Chemap 23 liter fermentor med et arbeidsvolum på 18 liter etter inokulering. Det anvendte produksjonsmedium inneholdt (pr. liter) : 20 g Difco-gjærekstrakt,- 10 g Sheffield HySoyapepton; 20 g glukose; 20 g galaktose; mediet ble justert til pH 5,3 før sterilisering. Alt innhold (500 ml) i 2 liters inokulumflasken ble overført til fermentoren som ble inkubert ved 28 °C, 9 liter luft pr. minutt, 500 rpm, trykk 0,25 kg/cm<2. >Omrøringen ble økt etter behov for å opprettholde nivåer av oppløst oksygen høyere enn 40 % metning. Utviklingen av fermenteringen ble overvåket ved "offline" glukosemålinger (Beckman glukose 2 analysator) og "online" massespektrometri (Perkin-Elmer 1200). Etter inkubasjon i 66 timer ble det nådd en celletetthet på 9,32 g tørre celler pr. liter. Innholdet fra to slike fermenteringer (totalt 17,5 liter fermenterings-løsning) ble sammenslått før utvinning av celler. Kulturen ble konsentrert ved hulfiberfiltrering (Amicon H5MP01-43 patron i et Amicon DC-10 filtreringssystem) til ca. 2 liter, diafiltrert med ca. 2 liter fosfatbufret saltløsning og konsentrert ytterligere (til ca. 1 liter) før overføring i 500 ml sentrifugeflasker. Cellepelleter ble oppsamlet ved sentri-fugering ved 8 000 rpm (Sorval GS3 rotor) i 20 minutter ved 4 °C. Etter dekantering av supernatanten ble pelletene (totalt 358 g våte celler) lagret ved -70 °C inntil bruk.

Eksempel 12

Rensing av rekombinante HPV type 11 Ll- kapsidproteiner

Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.

Cellene ble lagret nedfrosne ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 180 g) ble opptinet ved 20-23 °C og resuspendert i 900 ml "Breaking Buffer" (50 mM MOPS, pH 7,2,

500 mM NaCl, 1 mM CaCl2) . Proteaseinhibitorene AEBSF og pepstatin A ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på hhv. 1 mM

og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 1125 kg/cm<2> ved fire passeringer i et MllO-Y mikrofluidiser-ingsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Et tilstrekkelig volum av 10 % "Triton X100" detergent {Pierce, Rockford, IL) ble tilsatt til den nedbrutte celleoppslemming for å bringe konsentrasjonen av TX100 til 0,5 %. Oppslemmingen ble omrørt i 20 timer. Det Triton XI00-behandlede lysat ble sentrifugert ved 12 000 x g i 40 minutter for å fjerne nedbrutt cellemateriale. Supernatantvæsken inneholdende Ll-protein ble isolert.

Supernatantvæsken ble diafiltrert mot 5 volumer 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, ved anvendelse av en 300K tangentiell strømningsmembrankassett (Filtron, Northborough, MA). Materialet tilbakeholdt av membranen ble vist ved radioimmunanalyse og western-blotting og inneholder Ll-proteinet.

Retentatet ble applisert på en høyoppløsningsaffini-tetskolonne (11,0 cm ID x 5,3 cm) av "SP Spherodex (M)" resin (IBF, Villeneuve-la-Garenne, Frankrike) ekvilibrert i 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 0,5 mM NaCl. Etter en vask med ekvili-breringsbuffer og et vasketrinn med 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 1,0 M NaCl, ble Ll-proteinet eluert med et vasketrinn med 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 2,5 M NaCl. Fraksjoner ble oppsamlet under vask og eluering. Kolonnefraksjoner ble analysert for totalt protein ved hjelp av Bradford-metoden. Fraksjoner ble deretter analysert ved hjelp av western-blotting og SDS-PAGE, under påvisning med kolloidalt coomassie. Fraksjoner ble også analysert ved radioimmunanalyse.

SP Spherodex-fraksjoner som oppviste sammenlignbar renhet og anrikning av Ll-protein, ble sammenslått.

Sluttproduktet ble analysert ved western-blotting og SDS-PAGE under påvisning med kolloidalt coomassie. Ll-proteinet ble beregnet til å være mer enn 90 % homogent. Identiteten av Ll-protein ble bekreftet ved western-blotting. Sluttproduktet ble filtrert aseptisk gjennom en 0,22 um membran og lagret ved 4 °C. Denne prosess resulterte i totalt 100 mg protein.

Elektronmikroskopianalyse utføres ved hjelp av strukturprobe (West Chester, PA). En prøvealiquot plasseres på et 200 tnesh karbonbelagt koppernett. En dråpe 2 % fosfor-wolframsyre, pH 7,0, plasseres på nettet i 20 sekunder. Nettet tillates å lufttørke før TEM-undersøkelse. All mikroskopi ut-føres ved anvendelse av et JEOL 100 CX transmisjonselektronmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 kV. De resulterende mikrofotografier har en endelig for-størrelse på 100 000 x.

Bradford- analyse for totalt protein

Totalt protein ble analysert ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig "Coomassie Pluss" sett (Pierce, Rockford, IL). Prøver ble fortynnet til egnede nivåer i Milli-Q-HaO. Nødvendige volumer var 0,1 ml og 1,0 ml for hhv. standard- og mikroanalyseprotokollene. For begge protokoller ble BSA (Pierce, Rockford, IL) anvendt for å tilveiebringe standardkurven. Analyser ble utført i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Standardkurver ble plottet ved anvendelse av "CricketGraph" software på en Macintos Ilci computer.

SDS- PAGE og Western Blot- analyser

Alle geler, buffere og elektroforeseapparatur ble erholdt fra Novex (San Diego, CA) og ble behandlet i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Kort beskrevet ble prøver fortynnet til like proteinkonsentrasjoner i Milli-Q-H20 og blandet 1:1 med prøveinkubasjonsbuffer inneholdende 200 mM DTT. Prøver ble inkubert i 15 minutter ved 100 °C og applisert på ferdigstøpte 12 % tris-glysingeler. Prøvene ble underkastet elektroforese ved 125 V i 1 time og 45 minutter. Geler ble fremkalt ved farging med kolloidalt coomassie ved anvendelse av et kommersielt anskaffet sett (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

For western-blots ble proteiner overført til PVDF-membraner ved 25 V i 40 minutter. Membraner ble vasket med Milli-Q-H20 og lufttørket. Primært antistoff var polyklonalt kaninantiserum mot et TrpE-HPVll LI-fusjonsprotein (gave fra Dr. D. Brown). Antistoffoppløsningen ble preparert ved fortynning av antiserum i blottingsbuffer (5 % melk uten fett i 6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN3) . Inkuba-sjonen foregikk i minst én time ved 20-23 °C. Blottet ble vasket tre ganger å 1 minutt i PBS {6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl). Sekundær antistoffoppløsning ble preparert ved fortynning av geit-anti-kanin IgG-alkalisk fosfatasebundet konjugat-antiserum (Pierce, Rockford, IL) i blottingsbuffer. Inkubasjon foregikk under de samme betingelser i minst én

time. Blottene ble vasket som beskrevet tidligere og påvist ved anvendelse av et ett-trinns NBT/BCIP-substrat {Pierce, Rockford, IL).

Eksempel 13

Fremstilling av itnmunogene preparater

Rensede VLP formuleres i overensstemmelse med kjente metoder, slik som ved blanding med farmasøytisk akseptable bærere, stabilisatorer eller et vaksineadjuvans. De immunogene VLP ifølge foreliggende oppfinnelse kan prepareres for anvendelse som vaksine, ved kombinasjon med et fysiologisk akseptabelt preparat, slik som f.eks. PBS, saltløsning eller destillert vann. De immunogene VLP administreres i et dose-område fra ca. 0,1 til 100 ug, fortrinnsvis fra ca. 1 til 20 ug, for å oppnå den ønskede immunogene effekt. Mengden av VLP pr. formulering kan variere i overensstemmelse med forskjellige faktorer, inkludert, men ikke begrenset til, individets tilstand, vekt, alder og kjønn. Administrering av VLP-formuleringen kan foregå på mange forskjellige måter inkludert, men ikke begrenset til, subkutan, topisk, mukosal og intramuskulær. Slike VLP-formuleringer kan bestå av en enkel type VLP (dvs. VLP fra HPVll) eller en blanding av VLP (dvs. VLP fra HPV6, HVP11, HPV16 og HPV18).

Et antimikrobielt konserveringsmiddel, f.eks. timerosal, kan eventuelt være til stede. De immunogene anti-gener ifølge foreliggende oppfinnelse kan hvis ønskelig benyttes i kombinasjon med vaksinestabilisatorer og vaksine-adjuvanser. Typiske stabilisatorer er spesifikke forbindelser, f.eks. polyanioner som heparin, inositolheksasulfat, sulfatert betasyklodekstrin, mindre spesifikke eksipienser, f.eks. aminosyrer, sorbitol, mannitol, xylitol, glyserol, sukrose, dekstrose, trehalose, og variasjoner av disse under oppløs-ningsbetingelser, f.eks. nøytral pH, høy ionestyrke (ca. 0,5-2,0 M salter), divalente kationer (Ca<2+>, Mg2+) . Eksempler på adjuvanser er Al(OH)3 og A1P04. Vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse kan lagres under avkjøling eller i lyofilisert form.

Eksempel 14

Fremstilling av antistoffer mot VLP

Renset VLP anvendes for å danne antistoffer. Betegnelsen "antistoff" som anvendt heri, inkluderer både polyklonale og monoklonale antistoffer så vel som fragmenter derav, slik som Fv, Fab og F (ab)2-f ragmenter som er i stand til å binde antigen eller hapten. Antistoffene anvendes på mange forskjellige måter, inkludert, men ikke begrenset til, rensing av rekombinant VLP, rensing av native LI- eller L2-proteiner, og sett. Sett vil omfatte en seksjonsinndelt bærer som er i stand til å inneholde minst én tett tillukket beholder. Bæreren vil videre omfatte reagenser, slik som anti-VLP-antistoffer eller VLP egnet for påvisning av HPV eller fragmenter av HPV eller antistoffer mot HPV. Bæreren kan også inneholde påvisningsmidler, slik som merkede antigensubstrater eller enzymsubstrater eller lignende. Antistoffene eller VLP eller settene er anvendelige for mange forskjellige formål, inkludert, men ikke begrenset til, rettsmedisinske analyser og epidemiologiske undersøkelser.

Claims (8)

1. Nukleinsyremolekyl, karakterisert ved at det koder for humant papillomavirus type 11 Ll-protein, der nukleinsyremolekylet foreligger uten interne transkripsjonstermineringssignaler som gjenkjennes i gjær.

2. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det er DNA.

3. DNA-molekyl ifølge krav 2, karakterisert ved at det består av sekvensen som er vist i Figur 8.

4. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter DNA-molekyl ifølge krav 2.

5. Ekspresj onsvektor, karakterisert ved at den omfatter DNA-molekyl ifølge krav 3.

6. Ekspresjonsvektor ifølge krav 5, karakterisert ved at den er pGALl-10.

7. Preparat, karakterisert ved at det omfatter DNA-molekyl ifølge krav 2 eller at det omfatter RNA som er komplementært med DNA-molekyl ifølge krav 2.

8. Anvendelse av nukleinsyremolekyl ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament til bruk mot infeksjon eller sykdom forårsaket av humant papillomavirus.