NO322133B1 - Fremgangsmate for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus. - Google Patents
Fremgangsmate for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus. Download PDFInfo
- Publication number
- NO322133B1 NO322133B1 NO19964862A NO964862A NO322133B1 NO 322133 B1 NO322133 B1 NO 322133B1 NO 19964862 A NO19964862 A NO 19964862A NO 964862 A NO964862 A NO 964862A NO 322133 B1 NO322133 B1 NO 322133B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- protein
- yeast
- crpv
- hpv
- gene
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 title claims description 61
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 143
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 127
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 93
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 71
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 71
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 40
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 abstract description 41
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 18
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 112
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 85
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 65
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 57
- 241000701646 Kappapapillomavirus 2 Species 0.000 description 47
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 43
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 35
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 32
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 30
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 28
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 28
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 25
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 25
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 24
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 24
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 24
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 21
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 description 20
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 20
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 20
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 19
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 19
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 18
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 18
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 18
- 101900163635 Cottontail rabbit papillomavirus Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 17
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 17
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 101900043895 Cottontail rabbit papillomavirus Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 15
- 101150075484 MNN9 gene Proteins 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 101150029183 PEP4 gene Proteins 0.000 description 14
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 14
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 13
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 13
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 13
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 13
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 12
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 12
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 11
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 10
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 10
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 10
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 10
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 10
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 10
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 10
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 9
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 9
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 9
- 101150027802 L2 gene Proteins 0.000 description 9
- 101150101314 PRB1 gene Proteins 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 8
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 7
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 7
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 101100049401 Human papillomavirus type 16 L2 gene Proteins 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 6
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 6
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 6
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 5
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100243377 Mus musculus Pepd gene Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 5
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 5
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 5
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 5
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 5
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 5
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101001125486 Homo sapiens Basic salivary proline-rich protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000742340 Human papillomavirus type 16 Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- 101150034230 LI gene Proteins 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100029516 Basic salivary proline-rich protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 208000000907 Condylomata Acuminata Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- 101000641177 Human papillomavirus type 16 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 3
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 3
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 101710191936 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 208000007842 Fibroepithelial Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 2
- 101000803413 Human papillomavirus type 18 Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 2
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 206010023849 Laryngeal papilloma Diseases 0.000 description 2
- 102000001109 Leukocyte L1 Antigen Complex Human genes 0.000 description 2
- 108010069316 Leukocyte L1 Antigen Complex Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000002255 anal canal Anatomy 0.000 description 2
- 208000025009 anogenital human papillomavirus infection Diseases 0.000 description 2
- 201000004201 anogenital venereal wart Diseases 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000012999 benign epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229910001679 gibbsite Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 2
- 208000024312 invasive carcinoma Diseases 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 201000000089 larynx squamous papilloma Diseases 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- YDSWCNNOKPMOTP-UHFFFAOYSA-N mellitic acid Chemical compound OC(=O)C1=C(C(O)=O)C(C(O)=O)=C(C(O)=O)C(C(O)=O)=C1C(O)=O YDSWCNNOKPMOTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBTMNFYXJYCQHQ-UHFFFAOYSA-N (2,3,4,5,6-pentasulfooxycyclohexyl) hydrogen sulfate Chemical compound OS(=O)(=O)OC1C(OS(O)(=O)=O)C(OS(O)(=O)=O)C(OS(O)(=O)=O)C(OS(O)(=O)=O)C1OS(O)(=O)=O NBTMNFYXJYCQHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000000073 Achillea millefolium Species 0.000 description 1
- 235000007754 Achillea millefolium Nutrition 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000641175 Human papillomavirus type 18 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 1
- 241001428582 Human papillomavirus type 6 Species 0.000 description 1
- 108700025391 Human papillomavirus type 6 L1 Proteins 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710157639 Minor capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N N(omega)-methyl-L-arginine Chemical compound CN=C(N)NCCC[C@H](N)C(O)=O NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 229940090047 auto-injector Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical class OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000006800 cellular catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000004374 forensic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 1
- 235000020706 garlic extract Nutrition 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L magnesium;aluminum;dihydroxide;trihydrate Chemical compound O.O.O.[OH-].[OH-].[Mg+2].[Al] ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- -1 nobility Proteins 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940114241 recombivax Drugs 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus.
Oppfinnelsens bakgrunn
Papillomavirusinfeksjoner forekommer hos mange forskjellige dyr, inkludert mennesker, sauer, hunder, katter, kaniner, aper, slanger og kuer. Papillomavirus infiserer epitelceller og induserer generelt benigne epiteltumorer eller fibroepiteltumorer på infeksjonsstedet. Papillomavirus er artsspesifikke, infeksiøse materialer; et humant papillomavirus kan ikke infisere et ikke-humant dyr.
Papillomavirus kan klassifiseres i atskilte grupper basert på verten som de infiserer. Humane papillomavirus (HPV) klassifiseres videre i flere enn 60 typer basert på DNA-sekven-shomologi (for en oversikt, se Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (red.), CRC Press, Inc., 1990). Papillomavirustyper synes å være typespesifikke immunogener ved at en nøytraliserende immunitet overfor infeksjon av én type papillomavirus ikke gir immunitet overfor en annen type papillomavirus .
Hos mennesker forårsaker forskjellige HPV-typer forskjellige sykdommer. HPV-typer 1, 2, 3, 4, 7, 10 og 26-29 forårsaker benigne vorter hos både normale og immunkompromitterte individer. HPV-typer 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 og 46-50 forårsaker flate lesjoner hos immunkompromitterte individer. HPV-typer 6, 11, 34, 39, 41-44 og 51-55 forårsaker ikke-maligne kondylomer i de genitale eller respiratoriske slimhinner. HPV-typer 16 og 18 forårsaker epiteldysplasi av genitalslimhinnen og er forbundet med hovedmengden av in situ og invasive karsinomer i cervix, vagina, vulva og analkanalen. HPV6 og HPV11 er årsakene til mer enn 90% av alle kondylomer (genitalvorter) og laryngealpapillomer. Den hyppigst forekommende undertype av HPV type 6 er HPV6a.
Immunologiske undersøkelser i dyr har vist at produksjonen av nøytraliserende antistoffer mot papillomavirusanti-gener forhindrer infeksjon av et homologt virus. Utviklingen av effektive papillomavirusvaksiner er blitt forsinket på grunn av vanskeligheter forbundet med dyrkning av papillomavirus in vitro. Utviklingen av en effektiv HPV-vaksine er blitt spesielt forsinket på grunn av fraværet av en egnet dyremodell.
Nøytralisering av papillomavirus ved hjelp av antistoffer synes å være typespesifikk og avhengig av tilpassede epitoper på overflaten av viruset.
Papillomavirus er små (50-60 nm) , ikke-innkapslede, tyveflatede DNA-virus som koder for opptil åtte tidlige og to sene gener. De åpne avlesningsrammer (ORF) i virusgenomene er betegnet El til E7 og LI og L2, hvor "E" betegner tidlig og "L" betegner sen. Li og L2 koder for viruskapsidproteiner. De tidlige (E) gener er forbundet med funksjoner som virusrepli-kasjon og cellulær transformasjon.
Ll-proteinet er det viktigste kapsidprotein og har en molekylvekt på 55-60 kDa. L2-proteinet er et mindre kapsidprotein med en antatt molekylvekt på 55-60 kDa og en tilsynelatende molekylvekt på 75-100 kDa, som bestemt ved polyakryl-amidgelelektroforese. Immunologiske data antyder at det meste av L2-proteinet er internt i forhold til Ll-proteinet. L2-proteinene er konservert i høy grad blant forskjellige papillomavirus, spesielt de ti basiske aminosyrer ved C-terminalen. Li ORF er konservert i høy grad blant forskjellige papillomavirus.
LI- og L2-genene er blitt anvendt for å fremstille vaksiner for forebyggelse og behandling av papillomavirusinfeksjoner i dyr. Zhou et al. (Virology, 185(1), 1991, 251-257; Virology, 189, 1992, 592-599) klonet HPV type 16 Li- og L2-gener i en vacciniavirusvektor og infiserte CV-l-pattedyrceller med den rekombinante vektor for å produsere viruslignende partikler
(VLP).
Bakterielt avledet, rekombinant, bovint papillomavirus LI og L2 er blitt fremstilt. Nøytraliserende sera mot de rekombinante bakterieproteiner kryssreagerte med nativt virus ved lave nivåer, antakelig på grunn av forskjeller i konformasjonene av de native og bakterielt avledede proteiner.
Rekombinante baculovirus som uttrykker HPV6 LI, HPV11 LI, HPV16 LI, HPV18 LI, HPV31 Li eller HPV16 L2 ORF, er blitt anvendt for å infisere SF9-insektsceller og produsere Li- og Ll-proteiner. Western blot-analyser viste at de baculovirusavledede LI- og L2-proteiner reagerte med antistoff mot HPV16. Baculo-viruset avledet Ll-former VLP.
Carter et al. (Virology, 182(2), 1991, 513-521) demonstrerte produksjon av HPV16 LI- og HPV16 L2-proteiner ved hjelp av rekombinante stammer av Saccharomyces cerevisiae. Carter et al. demonstrerte også produksjon av HPV6b LI- og L2-proteiner. HPV6b Ll-proteinet var ikke fullengde Ll-protein. De rekombinante proteiner ble produsert som både intracellulære og som utskilte produkter. De rekombinante Li- og L2-proteiner hadde lignende molekylvekter som de native proteiner. Når proteinene ble uttrykt intracellulært, ble hovedmengden av proteinet funnet å være uoppløselig når cellene ble lysert i fravær av denatureringsreagenser. Selv om denne uoppløselighet kan lette rensing av proteinet, kan den hindre analyse av de native epitoper av proteinet.
Rekombinante proteiner utskilt fra gjær, ble vist å inneholde gjæravledede karbohydrater. Tilstedeværelsen av disse N-bundne oligosakkarider kan maskere native epitoper. De utskilte, rekombinante proteiner kan dessuten inneholde andre modifikasjoner, slik som retensjon av den sekretoriske leder-sekvens.
I WO 87/01375 (Institut Pasteur and Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) beskrives fremstillingen av HPV L2-, E6- og E7-proteiner.
I EP-A-0256321 (Behringwerke Aktiengesellschaft) beskrives DNA- og aminosyresekvensene til HPV18.
I Kirnbauer et al., Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 89, 1992, 12180-12184, beskrives effekten av å uttrykke Ll-proteinet i HPV og bovint PV i insektceller via en baculovirusvektor, og at Ll-protein setter seg selv sammen slik at det dannes et VLP.
Hagensee et al., Journal of Virology, 67(1), 1993, 315-322, beskriver selvsammensetningen av HPVl-kapsider ved hjelp av ekspresjonen av LI- eller LI- og L2-protein.
Rose et al., Journal of Virology, 67(4), 1993, 1936-1944, beskriver ekspresjonen av Ll-proteinet i HPVll i Sf-9-insektceller med den rekombinante baculovirusvektoren Acll Li, og identifikasjonen av VLP-er i de infiserte Sf-9-celler.
Zhou et al., Virology, 185(1), 1991, 251-257, beskriver at ekspresjonen av vaccinia rekombinant HPV16 LI- og L2 ORF-proteiner i epitelceller er tilstrekkelig for sammensetningen av HPV VLP-er.
Kirnbauer et al., Journal of Virology, 67(12), 1993, 6929-6936, beskriver selvsammensetningen av HPV16 og LI og L1-L2 til VLP-er.
I WO 94/00152 (Georgetown University) beskrives rekombinant produsert Ll-protein som etterligner konformasjonelle nøytraliserende epitoper på human- og dyrevirioner.
I WO-A-9405792 (The Government of the United States of America as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services), beskrives selvsammensetningen av rekombinante papilomavirus-capsidproteiner ved anvendelse av insekt- eller gjærceller som vertsceller.
I WO-A-9302184 (The University of Queensland and CLS Limited (sic)) beskrives en fremgangsmåte for å tilveiebringe papilloma-VLP-er for anvendelse ved diagnostiske formål eller inkorporering i en vaksine, for anvendelse i forhold til infeksjoner forårsaket av pipillomavirus, fra LI- eller Li- og L2-proteiner.
Det ville være nyttig å utvikle metoder for å produsere store mengder papillomaproteiner av enhver art og type ved dyrkning av rekombinant gjær. Det ville også være nyttig å produsere store mengder papillomavirusproteiner med samme immunitetsover-førende egenskaper som de native proteiner, slik som konformasjonen av det native protein.
Foreliggende oppfinnelse angår som nevnt fremgangsmåte for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus. Disse VLP-er er immunogene og forhindrer dannelse av vorter i en dyremodell. Foreliggende oppfinnelse anvender bomullshalekanin-papillomavirus (CRPV) og HPV type 6 (undertype 6a) som modellsystemer.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår som nevnt fremgangsmåte for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser en torettet gjærekspresjonsvektor anvendt for å uttrykke papillomavirus Li- og/eller L2-kapsidproteiner. Figur 2 viser ekspresjon av HPV6a LI i gjær (immunblot) . Figur 3 viser ekspresjon av HPV6a L2 i gjær. Immunblot av HPV6a L2 uttrykt i gjær; felt 1, molekylvektsmarkører; felt 2, trpE-L2-fusjonsprotein uttrykt i E. coli som positiv kontroll; felt 4, HPV6a LI uttrykt i gjær som negativ kontroll; felt 5, HPV6a L2 uttrykt i gjær (for eksperimentelle detaljer, se teksten). Figur 4 er et elektronmikroskopfotografi av HPV6a LI VLP uttrykt i gjær. Figur 5 er et elektronmikroskopfotografi av HPV6a L1/L2 VLP uttrykt i gjær. Figur 6: Immunblot av CRPV LI, L2, og Ll+L2-proteiner uttrykt i gjær. Felt (A) : Ekspresjon av CRPV LI som målt ved reaktivitet med anti-CRPV Ll-antiserum. Felt (B): Ekspresjon av CRPV L2 som målt ved reaktivitet med anti-CRPV L2-antiserum. Felt 1, molekylvektsmarkører i kDa ("Amersham Rainbow"-markører, 14 300-200 000 dalton); felt 2, BJ5462 inneholdende CRPV Ll-ekspresjonsvektoren; felt 3, stamme 1569 inneholdende CRPV L2-ekspresjonsvektoren; felt 4 og 5, to isolater av stamme 1569 kotransformert med to plasmider for ekspresjon av CRPV LI og CRPV L2; felt 6-8, tre isolater av stamme 1569 inneholdende en enkelt vektor for koekspresjon av CRPV LI- og L2-proteiner; felt 9 og 10, to isolater av BJ54 62 inneholdende en enkelt vektor for koekspresjon av CRPV LI- og L2-proteiner. Posisjonen for vandring av LI og L2 er markert på den høyre akse på figuren. Figur 7 er en skjematisk oversikt over konstruksjonen av S. cerevisiae stamme 1558. Figur 8 er en skjematisk oversikt over konstruksjonen av S. cerevisiae stamme 1569. Figur 9 viser hovedtrinn i en rensningsprosedyre.
Figur 10 er en liste over stammer.
Figur 11 viser sett av SDS-PAGE-analyser av HPV16 L1+L2 renset fra gjær. I tillegg til det ferdig rensede VLP er rester fra mellomliggende trinn i rensingsprosessen inkludert. Tabellen tilveiebringer identifikasjon av prøven i hvert felt. En gel farget med kolloidal Coomassie så vel som Western blots probet med antisera mot LI- og L2-proteiner, er inkludert. Figur 12 er en skjematisk oversikt over alternative rensingsprosesser for bomullshalekanin-papillomavirus LI. Figur 13 og 14 er SDS/PAGE-analyser av renset VLP.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus, kjennetegnet ved at: a) en gjær transformeres med et DNA-molekyl, hvor DNA-molekylet koder for HPV-L1- eller HPV-Ll+L2-proteiner, hvorved
det fremstilles en transformert gjærcelle,
b) den transformerte celle dyrkes under betingelser som muliggjør fremstilling av rekombinante proteiner og deres
spontane sammensetning til VLP-er, og
(c) VLP-ene innhøstes fra den transformerte celle og
(d) VLP-ene renses ved hjelp av ionebytterkromatografi og størrelsesutelukkelseskromatografi.
Fremgangsmåten er basert på produksjon av rekombinante Ll-eller rekombinante LI- og L2-proteiner i gjær. De rekombinante proteiner er i stand til å etterligne konformasjonen av de nøytraliserende epitoper i nativt PV. De rekombinante LI- eller Li- og L2-proteiner danner viruslignende partikler (VLP). VLP-ene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i farmasøytiske preparater, farmasøytiske preparater, vaksinepreparater, immunogene preparater og diagnostiske sett. De rekombinante VLP-er eller preparatene kan administreres til et dyr, inkludert, men ikke begrenset til mennesker. Egnede vertsceller inkluderer, men er ikke begrenset til, gjærstammer av slektene Saccharomyces, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharo-myces og Hansenula.
Papillomavirusinfeksjoner forekommer hos mange forskjellige dyr, inkludert mennesker, sauer, hunder, katter, kaniner, aper, slanger og kuer. Papillomavirus infiserer epitelceller og induserer generelt benigne epiteltumorer eller fibroepiteltumorer på infeksjonsstedet.
Papillomavirus kan klassifiseres i atskilte grupper basert på verten de infiserer. Humane papillomavirus (HPV) klassifiseres videre i mer enn 60 typer basert på DNA-sekvens-homologi (for en oversikt, se Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (red.), CRC Press, Inc., 1990). Papillomavirustyper synes å være typespesifikke immunogener ved at en nøytraliserende immunitet overfor infeksjon av én type papillomavirus ikke gir immunitet mot en annen type papillomavirus.
Hos mennesker forårsaker forskjellige HPV-typer forskjellige sykdommer. HPV-typer 1, 2, 3, 4, 7, 10 og 26-29 forårsaker benigne vorter i både normale og immunkompromitterte individer. HPV-typer 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 og 46-50 forårsaker flate lesjoner i immunkompromitterte individer. HPV-typer 6, 11, 34, 39, 41-44 og 51-55 forårsaker ikke-maligne kondylomer i de genitale og respiratoriske slimhinner. HPV-typer 16 og 18 forårsaker epiteldysplasi i genitalkanalen og er forbundet med hovedmengden av in situ og invasive karsinomer i cervix, vagina, vulva og analkanalen. HPV6 og HPV11 forårsaker hovedmengden av genitalvorter og laryngealpapillomer.
Immunologiske undersøkelser i dyr har vist at produksjonen av nøytraliserende antistoffer mot papillomaviruskap-sidproteiner forhindrer infeksjon av det homologe virus. Utviklingen av effektive papillomavirusvaksiner er blitt forsinket på grunn av vanskeligheter forbundet med dyrkning av papillomavirus in vitro. Utviklingen av en effektiv HPV-vaksine er spesielt blitt forsinket på grunn av fravær av en egnet dyremodell.
Nøytralisering av papillomavirus med antistoffer synes å være typespesifikk og avhenger av tilpassede epitoper på overflaten av viruset.
Papillomavirus er små (50-60 nm) , ikke-innkapslet, tyveflatede DNA-virus som koder for opptil 8 tidlige og to sene gener. De åpne avlesningsrammer (ORF) i virusgenomene er betegnet El til E7 og LI og L2, hvor "E" betegner tidlig og "L" betegner sen. LI og L2 koder for viruskapsidproteiner. De tidlige (E) gener er forbundet med funksjoner som virusrepli-kasjon og transformasjon.
Ll-proteinet er det viktigste kapsidprotein og har en molekylvekt på 55-60 kDa. L2-protein er et mindre kapsidprotein med en antatt molekylvekt på 55-60 kDa og en tilsynelatende
o
molekylvekt på 75-100 kDa som bestemt ved polyakryl-amidgelelektroforese.
Produksjon av HPV16 LI, HPV16 L2 og HPV type 6 Ll-proteiner ved hjelp av rekombinante stammer av Saccharomyces cerevisiae er blitt rapportert. Det ville være nyttig å utvikle fremgangsmåter for fremstilling av store mengder papillomavirusproteiner av enhver art og type ved dyrkning av rekombinant gjær. Det ville også være nyttig å produsere store mengder papillomavirusproteiner med samme immunoverførende egenskaper som de native proteiner, slik som konformasjonen av det native protein.
Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av rekombinante papillomavirusproteiner med samme immunoverførende egenskaper som de native papillomavirusproteiner. Foreliggende oppfinnelse angår spesielt produksjonen av en profylaktisk vaksine mot papillomavirusinfeksjon. Foreliggende oppfinnelse er eksemplifisert ved hjelp av bomullshalekanin-papillomavirus (CRPV) og humant papillomavirus type 6 (HPV type 6 eller HPV6) som modellsystemer. Eksemplifiseringen begrenser ikke rammen for foreliggende oppfinnelse som inkluderer andre typer og undertyper av papillomavirus (PV), inkludert, men ikke begrenset til HPV type 11, HPV type 16 og HPV type 18, så vel som HPV subtype 6a og HPV subtype 6b.
Farmasøytisk anvendelige preparater omfattende VLP kan formuleres i overensstemmelse med kjente metoder, slik som ved blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Eksempler på slike bærere og formuleringsmetoder kan finnes i Remington's Pharmaceutical Sciences. For å danne et farmasøytisk akseptabelt preparat som er egnet for effektiv administrering, vil slike preparater inneholde en effektiv mengde av VLP. Slike preparater kan inneholde VLP avledet fra mer enn én- type HPV.
Slike terapeutiske eller diagnostiske preparater administreres til et individ i mengder tilstrekkelige til å be-handle eller diagnostisere PV-infeksjoner. Den effektive mengde kan variere i overensstemmelse med mange forskjellige faktorer, slik som individets tilstand, vekt, kjønn og alder. Andre faktorer inkluderer administreringsmåten. Vanligvis vil preparatene administreres i doser som varierer fra ca. 1 ug til ca. 250 ug.
De farmasøytiske preparater kan gis til individet på mange forskjellige måter, slik som subkutant, topisk, oralt, mukosalt og intramuskulært.
Vaksinene omfatter VLP som inneholder de nødvendige antigene determinanter for å indusere dannelsen av nøytralis-erende antistoffer i verten. Slike vaksiner er også sikre nok til å kunne administreres uten fare for kliniske infeksjoner; de har ingen toksiske bivirkninger; de kan administreres på en effektiv måte; de er stabile; og de er forenlige med vaksine-bærere.
Vaksinene kan administreres på mange forskjellige måter, slik som oralt, parenteralt, subkutant, mukosalt eller intramuskulært. Den administrerte dose kan variere med individets tilstand, kjønn, vekt og alder; administreringsmåten; og typen PV inneholdt i vaksinen. Vaksinen kan anvendes i doseringsformer som kapsler, suspensjoner, eliksirer eller flytende løsninger. Vaksinen kan formuleres med en immunologisk akseptabel bærer.
Vaksinene administreres i terapeutisk effektive mengder, dvs. i mengder tilstrekkelige til å danne en immunologisk beskyttende respons. Den terapeutisk effektive mengde kan variere i overensstemmelse med typen PV. Vaksinen kan administreres i en enkelt dose eller i flere doser.
Det kan formuleres subvirale vaksiner for forebyggelse av PV-infeksjon. Det kan fremstilles enten monovalente eller multivalente PV-vaksiner. En monovalent HPV type 16-vaksine kan f.eks. fremstilles ved formulering av rekombinant HPV16 Ll-protein, eller LI- og L2-proteiner. En multivalent HPV-vaksine kan alternativt formuleres ved blanding av Li-, eller Li- og L2-proteiner, eller VLP fra forskjellige HPV-typer.
De rekombinante VLP-er fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved formulering av immunogene preparater. Slike preparater, når de innføres i en egnet vert, er i stand til å indusere en immunologisk respons i verten.
De rekombinante VLP-er kan anvendes for å danne antistoffer. Betegnelsen "antistoff" som anvendt heri, inkluderer både polyklonale og monoklonale antistoffer, så vel som fragmenter derav, slik som Fv-, Fab- og F(ab)2-fragmenter som er i stand til å binde antigen eller hapten.
De rekombinante VLP-er kan anvendes for å serumtype-bestemme HPV-infeksjon og HPV-screening. De rekombinante VLP-er og antistoffer kan anvendes for formulering av sett egnet for påvisning og serumtypebestemmelse av HPV. Et slikt sett vil omfatte en rominndelt bærer som er egnet til å oppbevare minst én tett tillukket beholder. Bæreren vil ytterligere omfatte reagenser som rekombinant HPV-protein eller VLP, eller anti-HPV-antistoffer egnet for påvisning av mange forskjellige HPV-typer. Bæreren kan også inneholde midler for påvisning, slik som merket antigen eller enzymsubstrater eller lignende.
De rekombinante VLP-er fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er også anvendelige som molekylvektsmarkører og molekylstørrelsesmarkører.
De følgende eksempler tilveiebringes for ytterligere
å definere foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 1
Fremstilling av gjærstamme U9
Saccharomyces cerevisiae stamme 2150-2-3 (MATa, leu2-04, adel, cir°) ble erholdt fra dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA). Celler av stamme 2150-2-3 ble formert over natten ved 30 °C i 5 ml YEHD-medium (Carty et al., J. Ind. Micro. 2 (1987) 117-121). Cellene ble vasket tre ganger i sterilt, destillert vann, resuspendert i 2 ml sterilt, destillert vann, og 0,1 ml cellesuspensjon ble utspredt på hver av seks 5-fluororotsyre(FOA)plater for å utvelge ura3-mutanter (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Platene ble inkubert ved 30 °C. Mediet inneholdt pr. 250 ml destillert vann: 3,5 g Difco gjær-nitrogen-base uten aminosyrer og ammoniumsulfat; 0,5 g 5-fluororotsyre;
25 mg uracil og 10,0 g dekstrose.
Mediet ble sterilisert ved filtrering gjennom 0,2 um membraner og deretter blandet med 250 ml 4% "Bacto-Agar"
(Difco) opprettholdt ved 50 °C, 10 ml av en 1,2 mg/ml løsning
av adenin og 5 ml L-leucinløsning (180 mg/50 ml). Det resulterende medium ble applisert på petriskåler i mengder på 20 ml pr. skål.
Etter 5 dagers inkubasjon var et stort antall kolonier fremkommet. Enkle kolonier ble isolert ved å strekover-føre kolonier fra de opprinnelige FOA-plater til nye FOA-plater som deretter ble inkubert ved 30 "C. Et antall kolonier fra det andre sett av FOA-plater ble testet for tilstedeværelse av ura3-mutasjonen ved kopiutspredning på både YEHD-plater og uracil-minus-plater. Det ønskede resultat var god vekst på YEHD og ingen vekst på uracil-minus-medium. Ett isolat (U9) ble erholdt som viste disse egenskaper. Det ble lagret som en frossen glyserolporsjon (stamme nr. 325) ved
-70 °C for senere anvendelse.
Eksempel 2
Fremstilling av en vektor for avbrytelse av gjær MNN9- genet
For å fremstille en vektor for avbrytelse av MNN9-genet var det først nødvendig å klone MNN9-genet fra S. cerevisiae-genomisk DNA. Dette ble oppnådd ved hjelp av standard polymerasekjedereaksjon(PCR)teknologi. En 5'-sense-primer og 3'-antisense-primer for PCR av den uforkortede MNN9-kodings-sekvens ble utformet basert på den publiserte sekvens for gjær MNN9-genet (Zymogenetics: EPO patentsøknad nr. 88117834.7, publikasjonsnr. 0-314-096-A2). De følgende oligodeoksynukleotidprimere inneholdende flankerende Hindlll-seter (understreket), ble anvendt:
Det innledende metioninkodon for MNN9-genet er fremhevet med fet skrift. PCR ble utført ved anvendelse av genomisk DNA fra S. cerevisiae stamme JRY188 som templat, Taq-DNA-polymerase (Perkin Eimer) og 25 amplifikasjonssykluser (94 "C 1 min., 37 °C 2 min., 72 °C 3 min.). Det resulterende 1,2 kbp PCR-fragment ble spaltet med Hindlll, gelrenset og ligert med Hindlll-spaltet, alkalisk fosfatasebehandlet pUC13 (Pharmacia). Det resulterende plasmid ble betegnet pll83.
For å avbryte MNN9-genet med gjær URA3-genet ble plasmid pBR322-URA3 (som inneholder 1,1 kbp Hind III-fragmentet som koder for S. cerevisiae URA3-genet subklonet i Hindlll-setet av pBR322) spaltet med Hindlll, og det 1,1 kbp DNA-fragment med det funksjonelle URA3-gen ble gelrenset, gjort buttendet med T4-DNA-polymerase og deretter ligert med Pmll-spaltet plasmid pll83 (PmlI-spaltninger innen MNN9-kodingssekvensen). Det resulterende plasmid pll99 inneholder et avbrudd i MNN9-genet med det funksjonelle URA3-gen.
Eksempel 3
Konstruksjon av U9- derivat stamme 1372 inneholdende avbrudd i MNN9- genet
For avbrytelse av MNN9-genet i stamme U9 (nr. 325) ble 30 ug plasmid pll99 spaltet med Hindi 11 for å danne en lineær mnn9: :URA3-avbrytelseskassett. Celler av stamme 325 ble transformert med det Hindlll-spaltede pll99-DNA ved hjelp av sferoplastmetoden (Hinnen et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 5:1929-1933), og transformanter ble utvalgt på et syntetisk agarmedium som manglet uracil og inneholdt 1,0 M sorbitol. Det syntetiske medium inneholdt pr. liter destillert vann: agar, 20 g; gjærnitrogenbase uten aminosyrer, 6,7 g; adenin, 0,04 g; L-tyrosin, 0,05 g; sorbitol, 182 g; glukose, 20 g og leucin minus-løsning nr. 2, 10 ml. Leucin minus-løsning nr. 2 inneholder pr. liter destillert vann: L-arginin, 2 g; L-histidin, 1 g; L-leucin, 6 g; L-isoleucin, 6 g; L-lysin, 4 g; li-met ionin, 1 g; L-fenylalanin, 6 g; L-treonin, 6 g; L-tryptofan, 4 g.
Platene ble inkubert ved 30 °C i 5 dager ved hvilket tidspunkt et stort antall kolonier var fremkommet. Kromosomale DNA-preparater ble fremstilt fra 10 kolonier og deretter spaltet med EcoRI pluss Hindlll. DNA-spaltningsproduktene ble deretter evaluert ved hjelp av Southern blots (J. Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) under anvendelse av
1,2 kbp Hindlll-fragmentet inneholdende MNN9-genet (isolert fra plasmid pll99) som en probe. Det ble identifisert et isolat (stamme nr. 1372) som viste de forventede DNA-båndskift på Southern blot, så vel som den ekstreme klumpethet som typisk
13
vises av MNN9-mutanter.
Eksempel 4
Konstruksjon av en vektor for avbrytelse av g- jær- HTS3- qenet
For å konstruere en avbrytelseskassett hvori S. cerevisiae HIS3-genet er avbrutt av 0RA3-genet, ble plasmid YEp6
(K. Struhl et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 76:1035)
spaltet med BamHI. 1,7 kbp BamHI-fragmentet inneholdende HIS3-genet, ble gelrenset, gjort buttendet med T4 DNA-polymerase og ligert med pUClB som tidligere var spaltet med BamHI og behandlet med T4 DNA-polymerase. Det resulterende plasmid (betegnet pl501 eller pUC18-HIS3) ble spaltet med Nhel (som spalter i HIS3-kodingssekvensen), og vektor fragmentet ble gelrenset, gjort buttendet med T4 DNA-polymerase og deretter behandlet med kalvetann-alkalisk fosfatase. URA3-genet ble isolert fra plasmid pBR322-URA3 ved spaltning med Hindlll, og 1,1 kbp-fragmentet inneholdende URA3-genet, ble gelrenset, gjort buttendet med T4 DNA-polymerase og ligert med det ovenfor angitte pUCl8-HIS3-Nhel-fragment. Det resulterende plasmid (betegnet pUC18-his3: :URA3 eller pl505) inneholder en avbrytelseskassett hvori gjær-HIS3-genet er avbrutt av det funksjonelle URA3-gen.
Eksempel 5
Konstruksjon av vektor av avbrytelse av gjær PRBl- aen med HIS3- genet
Plasmid FP8ÅH inneholdende S. cerevisiae PRB1-genet, ble tilveiebrakt av dr. E. Jones, Carnegie-Mellon Univ. (CM. Moehle et al., 1987; Genetics 115:255-263). Det ble spaltet med Hindlll pluss Xhol, og 3,2 kbp DNA-fragmentet inneholdende PRB1-genet, ble gelrenset og gjort buttendet med behandling med T4 DNA-polymerase. Plasmid pUC18 ble spaltet med BamHI, gelrenset og gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase. Det resulterende vektor fragment ble ligert med det ovenfor angitte PRBl-genfragment for å gi plasmid pUC18-PRBl. Plasmid YEp6 som inneholder HIS3-genet, ble spaltet med BamHI. Det resulterende 1,7 kbp BamHI-fragment inneholdende det funksjonelle HIS3-gen, ble gelrenset og deretter gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase. pUC18-PRBl ble spaltet med EcoRV pluss Ncol som spalter innen PRBl-kodingssekvensen og fjerner det protease B-aktive sete og flankeringssekvensen. 5,7 kbp EcoRV-NcoI-fragmentet som inneholder de resterende 5'-og 3'-deler av PRBl-kodingssekvensen i pUC18, ble gelrenset, gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase, defosforylert med kalvetarm-alkalisk fosfatase og ligert med det buttendete HIS3-fragment beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid (betegnet pUC18-prbl::HIS3, parti nr. 1245) inneholder det funksjonelle HIS3-gen istedenfor delen av PRBl-genet som var blitt delert ovenfor.
Eksempel 6
Konstruksjon av en U9- beslektet <q>jærstamme inneholdende av-brytelser av både MNN9- og PRB1- genene
Den U9-beslektede stamme 1372 som inneholder et MNN9-genavbrudd, ble beskrevet i eksempel 3. Kloningsisolater av stamme 1372 ble overført på FOA-plater for å utvelge ura3-mutanter. Et antall ura3-isolater av.stamme .1372 ble erholdt, og ett isolat (stamme 12930-190-S1-1) ble utvalgt for etter-følgende avbrytelse av HIS3-genet. pUC18-his3: :URA3-genavbryt-elsesvektoren (pl505) ble spaltet med Xbal pluss EcoRI for å danne en lineær his3: :URA3-avbrytelseskassett og anvendt for transformasjon av stamme 12930-190-S1-1 ved anvendelse av litiumacetatmetoden (Methods in Enzymology, 194:290 (1991). Ura<*->transformanter ble utvalgt på syntetisk agarmedium uten uracil, gjenutstreket for klonale isolater på det samme medium og deretter kopieringsutspredt på medium som manglet enten uracil eller histidin for å screene for de isolater som var både Ura<*> og His". Ett isolat (stamme 12930-230-1) ble utvalgt for etterfølgende avbrytelse av PRBl-genet. PRBl-genavbrytel-sesvektoren (pUC18-prbl::HIS3, parti nr. 1245) ble spaltet med SacI pluss Xbal for å danne en lindær prbl::HIS3-avbrytelseskassett og anvendt for transformasjon av stamme 12930-230-1 ved hjelp av litiumacetatmetoden. His<*->transformanter ble utvalgt på agarmedium uten histidin og ble gjenutstreket på det samme medium for klonale isolater. Genomisk DNA ble preparert fra et antall av de resulterende His<*->isolater, spaltet med EcoRI og deretter underkastet elektroforese på 0,8% agarose-geler. Southern blot-analyser ble deretter utført ved anvendelse av en radiomerket 617 bp probe for PRBl-genet som var blitt fremstilt ved hjelp av PCR ved anvendelse av de følgende oligodeoksynukleotidprimere:
Det ble erholdt 11 isolater som viste den forventede hybridisering av proben med et 2,44 kbp prbl::HIS3 DNA-fragment. Dette sto i motsetning til hybridisering av proben med 1,59 kbp-fragmentet for villtype PRBl-genet. Ett av disse isolater inneholdende den ønskede prbl::HIS3-avbrytelse, ble utvalgt for ytterligere anvendelse og ble betegnet stamme nr. 1558.
Eksempel 7
Konstruksjon av en vektor for avbrytelse av gjær PEP4- qen
S. cerevisiae PEP4-genet ble klonet fra et gjærgenom-bibliotek på følgende måte. E. coli-celler inneholdende gjær-genombiblioteket pLSlOl (Schultz og Friesen, 1983, J. Bac-teriol. 155:8-14) ble formert over natten i 5 ml LB-medium inneholdende 100 ug/ml ampicillin. Fra denne kultur ble IO"<4> og 10"<5> fortynninger utspredt på LB-pluss-ampicillin-plater. Kolonier ble løftet fra platene ved anvendelse av nitrocellulosefiltre. En 600 bp probe for gjær PEP4-genet ble fremstilt ved hjelp av PCR ved anvendelse av Taq DNA-polymerase, totalt plasmid-DNA fra pLSlOl-gjærbiblioteket og de følgende oligodeoksynukleotidprimere utformet basert på den publiserte DNA-sekvens for PEP4 (CA. Woolford et al., Mol. Cell. Biol. 6:2500 (1986)). <\>
PCR ble utført med 25 amplifikasjonssykluser (94 °C 1 min.,
37 °C 2 min., 72 "C 3 min.). PCR-proben ble gelrenset, radiomerket og hybridisert med de ovenfor angitte kolonifiltre. Flere kolonier var positive for hybridisering med PEP4-proben og ble gjenutstrøket på LB-pluss-ampicillinplater for enkle kolonier. Plasmid-DNA ble preparert ved hjelp av alkalisk SDS-lyse (Sambrook et al., supra) fra flere av isolatene og spaltet med BamHI. Det forventede 14 kbp vektorbånd og 6,9 kbp PEP4-innføyelsesbåndet ble observert. Ved dobbelt spaltning med EcoRI pluss Xhol ble det forventede 1,5 kbp bånd for PEP4 observert. Ett isolat (stamme nr. 860) som viste de forventede resultater, ble utvalgt for videre anvendelse. Plasmid-DNA fra stamme nr. 860 ble spaltet med BamHI, og det 6,9 kbp BamHI-DNA-fragment inneholdende det kromosomale PEP4-gen, ble subklonet i BamHI-setet av pUC13 for å gi plasmid p890. Plasmid p890 ble deretter spaltet med Ncol (som spalter innen PEP4-kodingssekvensen), gelrenset, gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase og ligert med det 1,1 kbp buttendete fragment inneholdende det funksjonelle URA3-gen (fremstilt som i eksempel 2). Det resulterende plasmid inneholdende PEP4-genet avbrutt av URA3-genet, ble betegnet pUC13-pep4::URA3 (stamme nr. 906).
Eksempel 8
Konstruksjon av gjærs tamme nr. 1569 som er et derivat av stamme U9 inneholdende både prbl- og pep4- mutasjoner
For å avbryte HIS3-genet i stamme U9 ble avbrytelses-vektoren pUC18-his3::URA3 spaltet med EcoRI pluss Xbal og deretter anvendt for å transformere stamme U9 ved hjelp av litiumacetatmetoden. Ura<+->transformanter ble utvalgt på agarmedium uten uracil og gjenutstrøket på det samme medium for klonale isolater. Et antall av de resulterende Ura<*->isolater ble deretter kopieringsutspredt på agarmedium som manglet enten uracil eller histidin og screenet for de isolater som var både Ura<*> og His-. Ett isolat (stamme nr. 1524) ble utvalgt for etterfølg-ende avbrytelse av PRBl-genet. PRBl-genavbry tel ses vektor en pUC18-prbl::HIS3 ble spaltet med SacI pluss Xbal og deretter anvendt for transformasjon med stamme nr. 1524 ved hjelp av litiumacetatmetoden. His<*->transformanter ble utvalgt på agarmedium uten histidin og gjenutstrøket for klonale isolater på det samme medium. Genomisk DNA ble preparert fra et antall av His<+->isolatene og evaluert ved hjelp av Southern blot-hybridisering med en radiomerket PRBl-probe. Ett av isolatene (stamme nr. 1537) som viste den ønskede avbrytelse av PRBl-genet med HIS3 (dvs. prbl::HIS3), ble utvalgt for etterfølgende avbrytelse av PEP4-genet. Stamme nr. 1537 ble overført på FOA-plater for å erholde ura3-isolater, og ett isolat (stamme nr. 1541) ble utvalgt for videre anvendelse.
For å avbryte PEP4-genet i stamme nr. 1541 ble PEP4-genavbrytelsesvektoren pUC13-pep4: :URA3 spaltet med Xhol for å danne en lineær pep4: :URA3-avbrytelseskassett og anvendt for transformasjon av stamme nr. 1541 ved hjelp av litiumacetatmetoden. Ura<*->transformanter ble utvalgt på uracil-minus-agarmedium og utstreket for klonale isolater på det samme medium. Genomisk DNA ble preparert fra et antall av Ura<*->transforman-tene og evaluert ved hjelp av Southern blots ved anvendelse av en radiomerket probe for PEP4-genet. Ett isolat (stamme nr. 1569) som viste den ønskede avbrytelse av PEP4-genet med URA3-genet, ble utvalgt for videre anvendelse.
Eksempel 9
Konstruksjon av CRPV LI- ekspresjonsvektor
CRPV LI-genet ble amplifisert ved hjelp av PCR fra plasmid pLAII som inneholdt det komplette CRPV-virusgenom (dr. Peter Howley, NCI) ved anvendelse av Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.); 35 amplifikasjonssykluser (94 °C,
1 min.; 50 °C, 1 min.; 72 °C, 2 min.), og de følgende oligonukleotidprimere som inneholder flankerende Bglll-seter (understreket), ble anvendt:
Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det innledende CRPV Ll-metioninkodon (fremhevet med fet skrift). 1,6 kb LI PCR-produktet ble spaltet med Bglll, gelrenset og subklonet i Bglll-setet av vektor pSP72 (Promega) for å gi plasmid pSP72-CRPV-Ll (P12930-314-4-1).
Én subklon ble sekvensert fullstendig og funnet å være forskjellige i 4 nukleotider i forhold til den publiserte CRPV Ll-sekvens. Endringene fører ikke til aminosyreendringer. Ll-genet ble spaltet fra pSP72-CRPV-Ll som et Bglll-fragment og subklonet i det unike BamHI-sete lokalisert mellom gjær-GAL10-promotoren og ADHl-transkripsjonstermina toren i gjær eks-presjonsvektoren pCl/l-GAL10p-ADHlt som inneholder GAL10-promotoren fra YEp52 (Broach et al., Exp. Manipulation of Gene Expression, 1983, 83:81-116) og ADHl-transkripsjonsterminatoren i en pCl/l-vektorryggrad). Det resulterende plasmid ble betegnet pl2930-323-6-l.
Eksempel 10
Konstruksjon av CRPV L2- ekspresjonsvektor
CRPV L2-genet ble amplifisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.) fra plasmid pLAIl etter spaltning av plasmidet med Sali, gelren-sing av det 7,9 kb fragment og ligering av dette med seg selv. Det ble anvendt 35 amplifikasjonssykluser (90 °C, 1 min.;
50 °C, 1 min.; 72 °C, 2 min.) og oligonukleotidprimere som inneholder flankerende EcoRI-seter (understreket):
Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det CRPV LI-innledende metioninkodon (fremhevet med fet skrift). 1,5 kb PCR-produktet ble spaltet med EcoRI, gelrenset og subklonet i EcoRI-setet av den toveis promotorvektor pUC18-GALlp-GAL10p inneholdende den divergente gjær GALl/GALlO-promotor. Denne vektor inneholder et unikt BamHI-sete mellom GALI-promotoren og en første kopi av ADHl-transkripsjonsterminatoren, unike EcoRI- og Smal-seter lokalisert mellom GALlO-promotoren, og en andre kopi av ADHl-transkripsjonsterminatoren. Den resulterende ekspresjonskassett bæres på et 1,4 kb SphI-fragment. Én klon (pl2930-295-2-2) inneholdende den ønskede L2-innføyelse tilstøtende GAL10-promotoren, ble fullstendig sekvensert og vist å inneholde 6 nukleotidendringer i forhold til den publiserte sekvens av hvilke 4 fører til aminosyreendringer. Sekvensanalyse av det opprinnelige templat-DNA bekreftet at endringene også var til stede i pLAII og ikke ble innført ved PCR. pUC18-GALlp-GAL10p-vektoren inneholdende L2-genet, ble spaltet med SphI og 2,9 kb-fragmentet inneholdende ADHlt-GALlp-GALl0p-L2-ADHlt-ekspre-sjonskassetten, ble ligert med det store Sphl-fragment av gjær-shuttlevektoren pCl/1. Det resulterende plasmid ble betegnet pl2930-323-2-3 (pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV-L2).
Eksempel 11
Ekspresjon av CRPV LI- oa CRPV L2- kapsidprotein i gjær
Plasmider pl2930-323-6-l og pl2930-323-2-3 (pCl/1-GALlOp-CRPV/Ll og pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV/L2) ble anvendt for å transformere S. cerevisiae- stammer nr. 1569, BJ5462 [E.W. Jones, Methods in Enzymology 194 (1991) 428-453] og BJ1995 [Jones, iJbid.]. Klonale isolater ble dyrket ved 30 °C i YEHD-medium inneholdende 2% galaktose i 48-72 timer. Etter innhøs-ting av cellene ble cellepelletene nedbrutt med glasskuler,
"Triton x-100" ble tilsatt til 0,5% sluttkonsentrasjon, og de resulterende cellelysater ble evaluert for ekspresjon av CRPV LI og L2 ved immunblotanalyser. Prøver inneholdende 40 ug totalt, cellulært protein, ble underkastet elektroforese på 12% Tris-glysingeler (Novex) under ^reduserende og denaturerende betingelser og elektroblottet på PVDF-membraner (Novex). CRPV LI- og L2-proteiner ble påvist ved anvendelse av polyklonale kanin-anti-Ll- eller anti-L2-antisera (gave fra dr.
John Kreider, Hershey Medical Center) som primære antistoffer, og protein A koblet til pepperrotperoksidase (Amersham, Inc.) som det andre antistoff. Membranene ble bearbeidet ved anven-deise av kjemilumlnescens "ECL"-påvisningssettet (Amersham, Inc.). Et 55-61 kDa Ll-proteinbånd ble påvist i alle prøver
som inneholdt Ll-ekspresjonsplasmidet, og et -90 kDa L2-proteinbånd ble påvist i alle prøver fra gjærkloner som inneholdt L2-ekspresj onsplasmidet.
Det ble ikke påvist noe signal i prøver avledet fra gjærkloner som inneholdt Ll-ekspresjonsplasmidet med anti-L2-antisera, eller vice versa.
Eksempel 12
A. Rensin<g> av rekombinant CRPV LI- kapsidprotein
Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt. Celler lagret ved -70 °C, ble tint og suspendert i et like stort volum "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2,
100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved hjelp av 10 passeringer i et mikrofluidiseringsapparat. Lysatet ble klaret ved sentr i fuger ing ved 5 000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% sukrose (vekt/volum) i Ll-buffer, og LI ble pelletert ved sentrifugering ved 100 000 x g i 4 timer. Pelleten ble resuspendert i 1/10 volum Ll-buf f er og klaret ved sentrifuger ing ved 5 000 x g i 10 minutter. "Tween-80" ble tilsatt til supernatanten til en sluttkonsentrasjon på 0,01% (volum/volum), og supernatanten ble fraksjonert ved romtemperatur ved størrelsesutelukkelses-kromatografi på en 1 700 ml kolonne (5 cm ID) "Sephacryl S-1000"-resin (Pharmacia). Elueringsbuffer for denne kolonne var 10 mM natriumfosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,01% (volum/volum) "Tween-80". Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale ved immun-dot blot, ble sammenslått og konsentrert til 1/6
volum ved ultrafiltrering ved anyendelse av en Amicon-omrørt celle med en YM-100 flatplatemembran med diameter 76 mm (100 000 MWCO). Produktet ble sterilfiltrert gjennom en "Millex-GV" 0,22 um membran (Millipore). Renset CRPV Ll-kapsidprotein ble adsorbert til aluminiumhydroksid ved en konsentrasjon på 100 ug/ml.
B. Karakterisering av rekombinant CRPV LI- kapsidprotein
Identiteten av sluttproduktet ble bekreftet ved Western-blotting og ved N-terminal sekvensanalyse. Renhet ble bestemt ved SDS/PA6E med Coomassie og sølvfarging og ved løs-ningssiling-kapillarelektroforese (SSCE) med optisk påvisning ved 215 nm. Preparatet var 75% rent LI bestemt ved SSCE.
Eksempel 13
Rensing av rekombinant CRPV L2- kapsidprotein
Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt. Celler lagret ved -70 "C, ble tint og suspendert i et like stort volum "Ll-buf f er" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2,
100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved 10 passeringer i et mikrofluidiseringsapparat. Lysatet ble klaret ved sentrifuger ing ved 5 000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% sukrose (vekt/volum) i LI-buffer, og L2 ble pelletert ved sentrifuger ing ved 100 000 x g i 4 timer. Pelleten ble resuspendert i 1/10 volum Ll-buffer. Den resuspenderte pellet ble klaret ved sentrifuger ing ved 5 000 x g i 10 minutter. "Tween-80" ble tilsatt til supernatanten til en sluttkonsentrasjon på 0,01% (volum/- volum), og supernatanten ble fraksjonert ved romtemperatur ved størrelsesutelukkelseskromatografi på en 1 700 ml kolonne
(5 cm ID) av "Sephacryl S-1000"-resin (Pharmacia). Elueringsbuffer for denne kolonne var 10 mM natriumfosfat, pH 7,2,
150 mM NaCl, 0,01% (volum/volum) "Tween-80". Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale ved immun-dot blot, ble sammenslått. Sammenslåtte fraksjoner ble analysert ved SDS/PAGE (sølv) og ved Western-blotting.
Eksempel 14
A. Rensing av rekombinant CRPV Ll- kapsidprotein- skiema 1
Celler lagret ved -70 "C, ble tint og suspendert i et like stort volum Breaking-buffer (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen til sluttkonsentrasjoner
på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved 10 passeringer i
et mikrofluidiseringsapparat. Lysatet ble klaret ved sentrifugering ved 5 000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% sukrose (vekt/volum) i Ll-buf f er, og LI ble pelletert ved sentr i fuger ing ved 100 000 x g i 4 timer. Pelleten ble resuspendert i 1/10 volum LI-buffer. Den resuspenderte pellet ble klaret ved sentrifuger ing ved 5 000 x g i 10 minutter. "Tween-80" ble tilsatt til supernatanten til en sluttkonsentrasjon på 0,01%, og supernatanten ble fraksjonert ved romtemperatur ved størrelsesutelukkelseskromatografi på en 1 700 ml kolonne (5 cm ID) av "Sephacryl S-1000"-resin (Pharmacia). Elueringsbuffer for denne kolonne var 10 mM natriumfosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,01% "Tween-80". Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale ved immun-dot blot-analyse, ble sammenslått og konsentrert til 1/6 volum ved ultrafiltrering ved anvendelse av en Amicon-omrørt celle med en YM-100 flatplatemembran med diameter 76 mm (100 000 MWCO). Produktet ble sterilfiltrert gjennom en "Mlllex-GV" 0,22 pm membran (Millipore).
B. Karakterisering av rekombinant CRPV Ll- kapsidprotein
Identiteten av sluttproduktet ble bekreftet ved Western-blotting og ved N-terminal sekvensanalyse. Renhet ble bestemt ved SDS/PAGE med Coomassie- og sølvfarging, og ved løsningssiling-kapillarelektroforese (SSCE) med optisk påvisning ved 215 nm. LI var 75% rent ved SSCE. Elektronmikroskopi viste at VLP i størrelsesområdet 50-55 nm diameter var til stede.
C. Analytisk størrelsesutelukkelses- HPLC
For å analysere for VLP ble prøver fraksjonert etter størrelse ved størrelsesutelukkelseskromatografi. Kromatogra-fien ble utført med en Perkin-Elmer serie 410 "Biopump HPLC" med en ISS 100-autoinjektor utstyrt med en 200 mikroliter in-jeksjonsløkke. Kolonnen var en TSK-gel G5000PW, 7,5 x 600 mm (T0S0HAAS, Montgomeryville, PA). For å overvåke eluering av protein fra kolonnen ble optisk påvisning ved 280 nm utført med en Perkin-Elmer LC-235 diodeseriedetektor. Den mobile fase var 0,5 M NaCl i 10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,2. Gjennom-strømningshastigheten var 0,5 ml/min., og det ble oppsamlet fraksjoner på 1 ml. Kolonnekalibrering ble utført med protein-standarder fra Sigma, så vel som rekombinant hepatitt B-overflateantigen ("Recombivax", Merck & Co., West Point, PA). Påvisning av antigen i fraksjoner oppsamlet under elueringen, ble utført ved immun-dot blot-analyse.
D. Immun- dot blot- analvse
En 10 pl prøve av hver fraksjon ble applisert på en strimmel av PVDF-membran ("Immobilon-P", Millipore Corp., Bed-ford, MA) som var fuktet på forhånd og var plassert på dampet blottingspapir. Prøven ble tillatt å trekke seg inn i membranen, og membranen ble plassert i en blokkeringsløsning (5%
(vekt/volum) tørrmelk uten fett oppløst i 0,15 M NaCl, 0,02%
(vekt/volum) natriumazid og 0,01 M natriumfosfat, pH 7,2) og inkubert ved romtemperatur under forsiktig omrøring i minimalt 3 timer. Blokkeringsløsningen ble dekantert og erstattet med en løsning av primært antistoff. Det anvendte, primære antistoff varierte avhengig av antigenet som skulle påvises: CRPV LI ble probet med kanin-anti-CRPV-serum "sen respons" (Biodesign International, Kennebunk, ME). CRPV L2 ble probet med kanin-anti-CRPV L2-serum. HPV6a LI ble probet med monoklonalt antistoff MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). HPV6a L2 ble probet med mus-anti-HPV6a L2-trpE-fusj onsserum.
Visualisering av immunkompleksene ble utført ved standardmetoder under anvendelse av et andre antistoff konju-gert til alkalisk fosfatase og det kromogene substrat NBT/-
BCIP.
E. Løsninassilinq- kapillarelektroforese ( SSCE)
Prøver av CRPV VLP (-0,2 mg/ml) ble oppvarmet i
15 minutter ved 100 °C i 1% 2-merke^ptoetanol og 1% (vekt/- volum) SDS. Prøven ble applisert elektrokinetisk sammen med en referansemarkør, mellittsyre, i et sammensmeltet silisiumok-sidkapillær, 42 cm (22 cm til detektor) x 0,05 mm I.D., for-håndsekvilibrert med 10 kapillarvolumer 0,1 N NaOH, vann og "ProSort" silingsreagens (Applied Biosystems, Foster City, CA). En separasjonsspenning på 300 volt/cm ble påført ved anvendelse av Applied Biosystems modell 270A-HT CE-instrument.
Prøveeluering ble overvåket ved absorbans ved 215 nm, og data ble oppsamlet ved anvendelse av Nelson Turbochrom 3 software.
F. Fremstilling av vaksine fra rekombinant CRPV LI- kapsidprotein
Renset CRPV LI-kapsidprotein ble adsorbert til Al(OH)3 ved en konsentrasjon på 100 ug/ml.
Eksempel 15
Beskyttelse mot papillomautviklina forårsaket av CRPV ved vak-sinasjon med o- faeravledet CRPV LI VLP 5 hvite New Zealand-kaniner ble immunisert intramuskulært med 135 mg LI VLP (75% rent, se eksempel 17) adsorbert til alun eller 100 mg rekombinant hepatitt B-overflateantigen (99% rent) adsorbert til aluminiumhydroksid som en negativ kontroll. Dyrene mottok ytterligere 2 injeksjoner i løpet av 8 uker før de ble utfordret med CRPV 10 dager etter den siste injeksjon. Sera uttatt før immunisering, ved hver injeksjon og før utfordring, ble analysert ved hjelp av en LI-VLP-spesifikk ELISA. Bn indirekte ELISA-analyse ble anvendt for & bestemme serumantistof f responser mot gjærutt rykte CRPV LI VLP. De anvendte antigener i ELISA var CRPV LI VLP uttrykt i insektsceller med et rekombinant baculovirus vesentlig som beskrevet av Christensen et al. (J. Virol. 64:3151-3156, 1990; J. Gen. Virol. 75:2271-2276 (1994)). Geit-anti-kanin-IgG-alkalisk fosfatase ble anvendt som et andre antistoff og p-nitrofenylfos-fat som substrat (Kirkegaard og Perry Labs., Inc.). Absorbans ble målt ved 405 nm. Titeren ble bestemt ved endepunktsfortyn-ning (3 gangers fortynninger av sera med start ved 1:100) og ble betraktet som positiv dersom den LI-spesifikke absorbans overskred de gjennomsnittlige absorbansavlesninger pluss to standardavvik for kanin-preimmunsera. Nøyaktige titere ble beregnet fra disse data ved anvendelse av SOFTmax-programmet, versjon 2.3 (Molecular Devices Inc., Menlo Park, CA).
Anti-Ll VLP-antistofftitere var til stede 4 uker etter den første immunisering, og de Økte med hver ytterligere injeksjon. Kontrolldyr var negative. 6 uker etter CRPV-utfordring var de vaksinerte dyr vortefrie på 15 av 15 steder (1:2 fortynnet eller 1:12 fortynnet virusstamløsning) mens kon-trolldyrene viste vortedannelse på 12 av 15 steder (1:2 fortynnet virus) eller 9 av 15 (1:12 fortynnet virus). Etter 15 uker var de vaksinerte dyr fremdeles vortefrie.
Virusnøytraliseringsanalyser ble utført (i det vesentlige i overensstemmelse med metoden ifølge Christensen et al., 1991, Virology 181:572-579) ved å blande kaninsera med CRPV og deretter utfordre kaniner med behandlede CRPV. Stand-arden for bestemmelse av nøytraliserende antistoff var fullstendig virusnøytralisering (3/3 steder negative med hensyn til vortedannelse). Sera fra de 5 vaksinerte dyr og 5 kontrolldyr ble analysert. Sera oppsamlet etter 1 dose av CRPV LI VLP, inneholdt antistoffer som fullstendig nøytraliserte ufor-tynnet virus i 80% av kaninene (4/5). Etter 2 eller 3 doser av CRPV LI VLP hadde 100% av kaninene (5/5) virusnøytraliserende antistoffer. Kontrollsera viste ingen virusnøytraliserende aktivitet. Avhengig av endelige titere kunne sera fra ut-valgte, vaksinerte dyr fortynnes fra 10 til 1 000 ganger og var fremdeles 100% nøytraliserende.
For å teste hvorvidt den nøytraliserende antistoff-respons var spesifikk for native CRPV LI VLP, ble et immunserum utvalgt og inkubert med nitrocellulosekvadrater som var blitt belagt med enten native eller denaturerte, gjæravledede CRPV LI VLP. Nitrocellulosekvadrater (1 cm<2>) ble belagt med enten native eller denaturerte (reduserte og alkylerte med jodeddiksyre i 8 M urea), gjæruttrykte CRPV LI VLP. Native eller denaturerte gjæreks tr akter ble anvendt som kontroller. Kanin-immunserum ble inkubert 4 ganger i serie med nitrocel-lulosekvadråtene i 8-14 timer ved 4 °C før det ble testet i virusnøytraliseringsanalysen som beskrevet ovenfor. Kun native CRPV LI VLP var i stand til å absorbere antistoffene ansvar-lige for nøytralisering av CRPV, mens denaturerte eller kontroll-gjærproteiner ikke absorberte disse antistoffer. Native CRPV LI VLP fjernet også dessuten ELISA-reaktiviteten overfor CRPV LI VLP uttrykt i insektsceller (data ikke vist).
Eksempel 16
Konstruksjon av vektor for koekspresjon av CRPV L1/ L2 fra et enkelt plasmid
Plasmid pSP72-CRPV-Ll (pl2930-314-4-l) ble spaltet med Bglll, og det 1,5 kbp Bglll-fragment inneholdende CRPV LI ORF med en gjær 5'-utranslatert leder, ble gelrenset. Plasmid P12930-323-2-3 (pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV-L2) ble oppsluttet med BamHI som spalter mellom GALI-promotoren og ADHl-transkripsjonsterminatoren. Det lineære vektorfragment ble gelrenset og deretter ligert med det ovennevnte CRPV-L1 Bglll-fragment for å gi plasmidet pl2930-366-l-2 (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2). Dette dannede plasmid inneholder CRPV-L1 ORF under kontroll av GALI-promotoren og CRPV-L2 ORF under kontroll av GAL10-promotoren.
Eksempel 17
Konstruksjon av vektor for koekspresjon av CRPV L1/ L2 fra to plasmider
pUC18-GALlp-GAL10p-vektoren inneholdende L2-genet, ble spaltet med SphI, og 2,9 kb-fragmentet inneholdende ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt-ekspresjonskassetten, ble gelrenset og gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase. Gjær-shuttlevektoren YEp24 [Botstein et al., Gene 8:17 (1979)] ble spaltet med BamHI, gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase, defosforylert med kalvetarm-alkalisk fosfatase og deretter ligert med den ovenfor angitte, buttendede L2-ekspresjonskassett for å gi plasmid pl594.
Eksempel 18
Koekspresjon av CRPV Li og L2 i gjær
Plasmid pl2930-366-l-2 (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2) ble anvendt for å transformere S. cerevisiae-stammer nr. 1569 og BJ5462 (ett plasmidsystem), og de resulterende transformanter ble utvalgt på syntetisk agarmedium uten leucin. I et parallelt eksperiment ble stamme 1569 kotransformert med pCl/l-GAL10p-CRPV-Ll-ekspresjonsvektoren pl2930-323-6-l pluss YEp24-GAL10p-L2-ekspresjonsvektoren pl594 (to-plasmidsystem), og de resulterende transformanter inneholdende begge vektorer. ble utvalgt på syntetisk agarmedium som manglet både leucin og uracil. Klonale isolater for både ett-plasmidsystemet og to-plasmidsysternet ble dyrket ved 30 °C i YEHD-komplekst medium inneholdende 2% galaktose i 48-72 timer. Etter innhøsting av cellene ble cellepelletene nedbrutt med glasskuler. "Triton X-100" ble tilsatt til 0,5% sluttkonsentrasjon, og cellelysater ble analysert for ekspresjon av CRPV LI og L2 ved immunblotanalyse. Prøver inneholdende 50 ug totalt, cellulært protein, ble underkastet elektroforese på 8-16% Tris-glysin-gradient-geler (Novex) under reduserende og denaturerende betingelser og elektroblottet på PVDF-membraner (Novex). CRPV LI- og L2-proteiner ble påvist ved anvendelse av polyklonale kanin-anti-Ll- eller anti-L2-antisera (gave fra dr. John Kreider, Hershey Medical Center) som primære antistoffer og protein A koblet til pepperrotperoksidase (Amersham, Inc.) som det sekundære antistoff. Membranene ble bearbeidet ved anvendelse av kjemi - luminescens "ECL"-påvisningssettet (Amersham, Inc.). Et 55-61 kDa Ll-proteinbånd og et ca. 90 kDa L2-proteinbånd ble påvist i alle prøver fra gjærkloner inneholdende LI + L2-ekspresjonsplasmidet. Intet signal for L2 ble påvist i prøver avledet fra gjærkloner inneholdende ekspresjonsplasmidet for LI. Intet signal for LI ble påvist i prøver fra celler inneholdende kun L2-ekspresjonsvektoren.
Eksempel 19
Rensing av CRPV LI oa CRPV LI + L2 VLP for EM- undersøkelser
De gjæruttrykte CRPV LI- og CRPV LI- og L2-proteiner ble delvis renset og konsentrert for elektronmikroskopi(EM)-undersøkelser. 1 til 1,5 liter YEHD-medium inneholdende 2% galaktose, ble inokulert med S. cerevisiae-stamme nr. 1569 eller BJ5462 transformert med LI + L2-ekspresjonsvektoren pl2930-366-l-2 (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll + L2) og dyrket ved
30 °C i 48-72 timer. I et parallelt eksperiment ble celler fra stamme nr. 1569 kotransformert med GAL10p-CRPV-Ll-ekspresjons-vektoren pl2930-323-6-l pluss YEp24-GAL10p-L2-plasmidet pl594, dyrket på lignende måte. Cellene ble høstet, og cellepelleter ble nedfrosset ved -70 °C. Alle etterfølgende trinn ble utført ved 4 °C. Cellepelleter ble tint og suspendert i et like stort volum "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteininhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen ved en sluttkonsentrasjon på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved 3-5 passeringer i et mikrofluidiseringsapparat. Lysatene ble klaret ved sentrifugering ved 5 000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% (volum/volum) sukrose i Ll-buffer, og LI-, L2- eller LI- og L2-proteiner ble pelletert ved sentr i-fugering ved 100 000 x g i 4 timer. Pel leten ble resuspendert i 1/10 av volumet av Ll-buffer. Den resuspenderte pellet ble klaret ved sentr i fugering ved 5 000 x g i 10 minutter.
For EM-analyse (Structure Probe, West Chester, PA) ble en aliguot av hver prøve plassert på 200 mesh karbonbe-lagte kobbergittere. En dråpe av 2% fosfowolframsyre (PTA), pH 7,0, ble plassert på gitteret i 20 sekunder. Gitterne ble tillatt å lufttørke før TEM-undersøkelse. All mikroskopi ble ut-ført ved anvendelse av et "JEOL 100CX"-transmisjonselektronmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 KV. De resulterende mikrofotografier har en endelig for-størrelse på 100 000 x.
I alle gjærprøver som inneholder enten CRPV Ll-ekspresjonsplasmidet eller -plasmidene for koekspresjonen av CRPV LI og L2, ble VLP observert i størrelsesområdet 50-55 nm diameter. Intet VLP ble observert i gjærkontrollprøver eller gjærprøver inneholdende L2-ekspresjonsplasmidet alene (figurene 7, 8, 9).
Eksempel 20
Rensing av rekombinant CRPV LI- kapsidprotein - skjema 2
Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.
Celler lagret ved -70 °C,xble tint og suspendert i et like stort volum Breaking-buffer (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved anvendelse av et "BioNeb" cellenedbrytningssystem (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lysatet ble klaret ved sentrifugering ved
5 000 x g i 10 minutter.
Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% sukrose (vekt/volum) i Ll-buffer, og LI ble pelletert ved sentrifugerlng ved 100 000 x g i 4 timer. Pelleten ble resuspendert i 1/10 volum Ll-buffer. Den resuspenderte pellet ble klaret ved sentrifugerlng ved 5 000 x g i 10 minutter.
Supernatanten ble fortynnet 1:5 med PBS, klaret på nytt ved sentrifugering i "Sorvall SA-600"-rotor ved 6 500 rpm i 10 minutter ved 4 "C. Supernatanten ble filtrert gjennom et 0,22 mikron sprøytefilter og fraksjonert ved anionbytterkromatografi.
Anionbytterkromatografi ble utført med en Perkin-Elmer serie 410 "Biopump HPLC" med en 5 ml injeksjonsløkke. Kro-matograferingsmediet var en "Fractogel EMF TMAE-650 (S)" 25-40 mikron resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) i en 150 mm x 10 mm ID-glasskolonne. For å overvåke eluering av protein fra kolonnen ble optisk påvisning ved 280 nm utført med en Perkin-Elmer LC-235 diodeseriedetektor. Kolonnen ble forhåndsekvi-librert med 0,15 M NaCl i 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH 7,2 (buffer A). Kolonnen ble eluert med en gjennomstrømningshas-tighet på 0,75 ml/min. Prøven ble applisert på kolonnen, og kolonnen ble vasket med buffer A for å fjerne ubundet materiale. Bundet materiale ble eluert med en lineær konsentrasjons-gradient av natriumklorid, 0,15 M til 0,65 M i 5 minutter, etterfulgt av en 0,65 M til 1,15 M lineær gradient i 30 minutter. Påvisning av antigen i fraksjoner oppsamlet under eluering, ble utført ved immun-dot blot-analyse. Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale (dvs. fraksjoner som eluerte mellom 0,81 M og 1,05 M NaCl), ble sammenslått.
De sammenslåtte fraksjoner ble konsentrert i "Macro-sep" sentrifugerings-konsentrasjonsutstyr (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) til 1/5 volum.
Konsentratet ble fraksjonert ved størrelsesutelukkel-seskromatografi ved anvendelse av "Sephacryl S-1000 SF"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ) i en 87 cm x 27 mm ID-kolonne. Kolonnen ble eluert ved en gjennomstrømningshastighet på
2,5 ml/min. Eluering av protein ble overvåket ved absorbans ved 280 nm. Antigen ble påvist ved immunblot.
Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale, ble sammenslått og konsentrert ved ultrafiltrering ved anvendelse av en omrøringscelle (Amicon, Inc., Beverly, MA) med en 43 mm diameter YM-100 flatplatemembran (Amicon, Inc., Beverly, MA) under nitrogen ved et trykk på 0,7 kg/cm<2>.
Sluttproduktet ble karakterisert ved SDS/PAGE med Coomassie-farging og ved løsning-siling-kapillarelektroforese (SSCE). Sluttproduktet fra skjema 2 var 88% rent bestemt ved
SSCE.
Eksempel 21
A. Rensing av rekombinant CRPV LI- kapsidprotein - skjema 3
Alle trinn ble utført ved 4 "C dersom ikke annet er angitt.
Celler lagret ved -70 °C, ble tint og suspendert i et like stort volum Breaking-buffer (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved anvendelse av et "BioNeb" cellenedbrytningssystem (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lysatet ble klaret ved sentrifugering ved
5 000 x g i 10 minutter.
Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% sukrose (vekt/volum) i Ll-buffer, og LI ble pelletert ved sentrifugerlng ved 100 000 x g i 4 timer. Pelleten ble resuspendert i 1/10 volum Ll-buffer. Den resuspenderte pellet ble klaret ved sentrifugerlng ved 5 000 x g i 10 minutter.
Supernatanten ble ekstrahert med 1/2 volum kloroform. Det vandige lag ble fjernet og klaret ved sentrifugering ved 12 000 rpm i en Beckman mikrosentrifuge i 5 minutter ved romtemperatur .
Supernatanten ble fortynnet 1:5 med PBS, klaret på
nytt ved sentrifugerlng i "Sorvall SA-600"-rotor ved 6 500 rpm i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten ble filtrert gjennom et 0,22 mikron sprøytefilter og fraksjonert ved anionbytterkromatografi.
Anionbytterkromatografi ble utført med en Perkin-Elmer serie 410 "Biopump HPLC" med en 5 ml injeksjonsløkke. Kro-matograferingsmediet var en "Fractogel EMF TMAE-650 (S)" 25-40 mikron resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) i en 150 mm x
10 mm ID-glasskolonne. For å overvåke eluering av protein fra kolonnen ble optisk påvisning ved 280 nm utført med en Perkin-Elmer LC-235 diodeseriedetektor. Kolonnen ble forhåndsekvl-librert med 0,15 M NaCl i 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH 7,2 (buffer A). Kolonnen ble eluert med en gjennomstrømningshas-tighet på 0,75 ml/min. Prøven ble applisert på kolonnen, og kolonnen ble vasket med buffer A for å fjerne ubundet materiale. Bundet materiale ble eluert med en lineær konsentrasjons-gradient av natriumklorid, 0,15 M til 0,65 M, i 5 minutter, etterfulgt av en 0,65 M til 1,15 M lineær gradient i 30 minutter. Påvisning av antigen i fraksjoner oppsamlet under elueringen, ble utført ved immun-dot blot-analyse. Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale (dvs. fraksjoner som eluerte mellom 0,81 M og 1,05 M NaCl), ble sammenslått.
De sammenslåtte fraksjoner ble konsentrert i "Macro-sep" sentrifugerings-konsentrasjonsutstyr (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) til 1/5 volum.
Konsentratet ble fraksjonert ved størrelsesutelukkel-seskromatografi ved anvendelse av "Sephacryl S-1000 SF"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ) i en 87 cm x 27 mm ID-kolonne. Kolonnen ble eluert ved en gjennomstrømningshastighet på
2,5 ml/min. Eluering av protein ble overvåket ved 280 nm. Antigen ble påvist ved immunblot.
Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale, ble sammenslått og konsentrert ved ultrafiltrering under anvendelse av en omrøringscelle (Amicon, Inc., Beverly, MA) med en 43 mm diameter YM-100 flatplatemembran (Amicon, Inc., Beverly, MA) under nitrogen ved et trykk på 0,7 kg/cm<2>.
Sluttproduktet ble karakterisert ved SDS/PAGE med Coomassie-farging og ved oppløsning-siling-kapillarelektroforese (SSCE). Sluttproduktet fra skjema 3 var 95% rent som bestemt ved SSCE.
Eksempel 22
Ekspresjon av CRPV LI og HPV type 6a LI ( stamme 1644) i anriket kompleks og kjemisk definerte medier
Inokulater for disse stammer ble utviklet i leucinfritt, syntetisk medium som beskrevet ovenfor, for overføring til risteflaskekulturer. De anvendte risteflasker ble utstyrt med ledeplater for høy gj ennomluftningskapasitet (70 ml væske pr. 300 ml flaske, Tunair Labware), og media ble supplert med ca. 0,5 ml/l av et antiskummemiddel ("UCON LB-625", Union Carbide). Anriket, komplekst medium inneholdt (pr. liter): 40 g Difco gjærekstrakt; 20 g Sheffield HySoy pepton; 30 g glukose; 50 g galaktose; mediet ble justert til pH 5,3 før sterilisering. Det anvendte kjemisk definerte medium var lignende mediet beskrevet av Oura (Biotechnol. Bioengineer. 16:1197-1212, 1974), men supplert med (pr. liter): 0,1 g kolin-Cl; 0,4 g adenin; 30 g mononatriumglutamat som nitrogenkilde; 0,2 g uracil; 20 g glukose; 40 g galaktose. Flaskene ble inokulert med 3 ml inokulat og inkubert i 66 timer ved 28 °C, 250 rpm på et rotasjonsristeapparat. Det ble uttatt prøver fra flaskene med jevne mellomrom for bekreftelse av ekspresjon ved hjelp av immunblot ved anvendelse av anti-CRPV LI- og anti-HPV6a Ll-antisera.
Eksempel 23
Kloning av HPV- 6a- qenom
Vev fra en pasient diagnostisert med alvorlig condylomata acuminata (tilveiebrakt av dr. Darron Brown, In-diana University School of Medicine) ble typebestemt ved res-triksjonsenzymspalting og polymerasekjedereaksjon (PCR) og ble vist å inneholde HPV type 6a. DNA ble ekstrahert fra vevs-prøven og spaltet med HindiII-enzym. Etter størrelsesfraksjon-er ing gjennom en 0,8% lavtsmeltende, preparativ agarosegel ble 8 kb-området utskåret fra gelen, og agarosen ble spaltet med "Gelase"-enzym (Epicentre Technologies, Inc.). Prøven ble ligert med pUC18 som var spaltet med Hindlll og defosforylert (Pharmacia, Inc.). Etter transformasjon av kompetente E. coli DH5-celler (BRL) ble plasmidbiblioteket screenet for HPV-6a-positive kloner ved anvendelse av et "P-merket oligodeoksynuk-leotid som var komplementært med HPV-6a Ll-genet. Et pUC18-.plasmid inneholdende det 8 kb HPV-6a-genom, ble isolert og karakterisert ved restriksjonsenzym- og Southern blot-analyser. Dette plasmid ble betegnet pUC18-HPV-6a. Det komplette 8 kb HPV-6a-genom ble sekvensert ved anvendelse av det ABI-automatiserte sekvenseringsapparat (nr. 373A) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner.
En stor vulvar condyloma acuminatunr-lesjon ble erholdt fra en 25 år gammel kvinnelig pasient etter nedkomst. Et fragment av lesjonen ble nedfrosset i flytende nitrogen og deretter bearbeidet med en Braun mikrodismembrator II (B. Braun Instruments, Melsungen, Tyskland). Det resulterende materiale ble oppløst med 0,6% (vekt/volum) natriumdodecylsul-fat (SDS), behandlet med proteinase K (50 ug/ml) og ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol. DNA ble utfelt med etanol og kvantifisert ved UV-spektrofotometri. Tilstedeværelse av høymolekylært DNA ble bestemt ved agarosegelelektroforese etterfulgt av farging med etidiumbromid.
HPV DNA-typen ble bestemt ved anvendelse av hybrid-innfangingsanalysen markedsført som "Vira Type Plus" (Digene Diagnostics, Beltsville, MD). De anvendte HPV-prober ble delt i to porsjoner hvis sammensetning er basert på sammenhengen av hver type med genitalkanalsykdommer. Probegruppe A inneholdt "lavrisiko"-typene HPV6, 11, 42, 43 og 44, mens probe B inneholdt "høyrisiko"-typene 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 og 56. Totalt DNA ble spaltet med Pstl, BamHI og Hindlll, og Southern blots ble utført under svært strenge betingelser (TB-15 °C) for å bestemme HPV-subtypen.
For å bestemme den komplette HPV6a-sekvens ble sek-venseringsprimere syntetisert basert på den publiserte HPV6b-sekvens. Begge tråder av det komplette 8,1 kbp HPV6a-genom ble sekvensert ved hjelp av dideoksykjedetermineringsmetoden ved anvendelse av "PRI SM "-settet og et Applied Biosystems (ABI) automatisert sekvenseringsapparat (nr. 373A) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner (ABI, Inc., Foster City, CA). I tilfeller hvor sense- og antisense-sekvensen ikke pas-set til hverandre, ble ytterligere HPV6a-spesifikke primere syntetisert for å sekvensere på nytt.i begge retninger i det aktuelle område for å oppnå en konsensus.
DNA-sekvensen av HPV6a og HPV6b oppviste mer enn 97% identitet med totalt 229 bp endringer identifisert av 8 010 bp. De mest signifikante forskjeller sammenlignet med HPV6b-sekvensen, ble funnet i det lange kontrollområde (LCR; nt 7205 - nt 106). Foruten flere enkle nukleotid(nt)endringer i HPV6a LCR ble det funnet en 94 bp innføyelse ved nt 7350 og en annen 19 bp innføyelse ved nt 7804. Ved nt 7615 var 6 base-
par delert fra HPV6a-genomet.
Eksempel 24
Konstruksjon av HPV6a Ll- qjærekspresjonsvektor
HPV type 6a-DNA ble anvendt som et templat for PCR. HPV6a Ll-genet ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.), 35 amplifikasjonssykluser (94 °C 1 min., 48 °C 1 min., 72 °C 1 min. 45 sek.) og de følgende oligodeoksynukleotidprimere som inneholder flankerende Bglll-seter (understreket):
Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det HPV6a LI-innledende metioninkodon (uthevet med fet skrift). 1,5 kbp LI PCR-produktet ble spaltet med Bglll og gelrenset. pCl/l-GAL-ekspre-sjonsvektoren ble konstruert ved isolering av det 1,4 kbp SphI-fragment fra den dobbeltrettede promotorvektor pUC18-GALlp-GALlOg som inneholder den divergente GALI/GALlO-promotor fra plasmid pBM272 (tilveiebrakt av dr. Mark Johnston, Washington University, St. Louis) flankert på hver side av en kopi av gjær-ADHl-transkripsjonsterminatoren [Bennetzen, J.L. og Hall, B.D. (1982), J. Biol. Chem. 257:3018-3025]. I den resulterende ekspresjonskassett er et BamHI-sete lokalisert mellom GALI-promotoren og den første, kopi av ADH1-transkrip-sjons terminatoren, og et SmaI-kloni\ngssete er lokalisert mellom den divergente GALI 0-promotor og den andre kopi av ADH1-transkripsjonsterminatoren. Gjær-shuttlevektoren pCl/1 (Rosen-berg et al., Nature 312 (1984) 77-80) ble spaltet med SphI og ligert med 1,4 kbp SphI GAL-promotorfragmentet. Den resulterende vektor, pCl/l-GAL, ble linearisert med BamHI som spalter mellom GALI-promotoren og ADHl-transkripsjonsterminatoren. Den BamHI-spaltede pCl/l-GAL-vektor og det Bglll-spaltede HPV6a LI-PCR-fragment ble ligert og anvendt for å transformere £. coil DH5-celler (BRL). Det ble isolert et pCl/l-GAL-plasmid som inneholder HPV-6a LI-genet og ble betegnet pl3173-357-6. Ll-genet i pl3173-357-6 ble sekvensert (ABI-sekvenseringsapparat nr. 373A) og vist å være identisk med Ll-genet i pUC18-HPV6a-klonen.
Eksempel 25
Konstruksjon av HPV6a LI- oa L2- a1 ær ekspresjonsvektor en
Plasmid pl3173-357-6 (pCl/l-GAL + HPV6a LI) ble spaltet med Smal som spalter mellom GALlO-promotoren og ADH1-transkripsjonsterminatoren. Det 1,4 kbp HPV6a L2-gen ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av pUC18-HPV6a-DNA som templat, Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.), 10 sykluser med PCR-amplifikasjon (94 °C, 1 min.; 48 <*>C, 1 min.; 72 °C,
1 min. 45 sek.) og de følgende oligodeoksynukleotidprimere som inneholder flankerende Smal-seter (understreket):
Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det HPV6a L2-innledende metioninkodon (uthevet med fet skrift). PCR-fragmentet ble spaltet med Smal, gelrenset og ligert med det Smal-spaltede pl3173-357-6-plasmid. Et pCl/l-GAL-plasmid inneholdende både HPV6a LI- og L2-genene, ble isolerog betegnet pl4049-7-2. L2-genet ble sekvensert (ABI-sekvenseringsapparat nr. 373A) og funnet å være identisk med L2-genet i pUC18-HPV6a-klonen.
Eksempel 26
Ekspresjon av HPV6a LI oa koekspresjon av HPV6a LI og L2 1 gjær
Plasmider pl3173-357-6 (pCl/l-GAL + HPV6a LI) og pl4049-7-2 (pCl/l-GAL + HPV6a LI og L2) ble anvendt for å transformere 5. cerevisiae-stammer nr. 1569 (MATa, leu2-04, prbl, adel, pep4, cir<e>) og nr. 1558 (MATa, leu2-04, prbl, mnn9, adel, eir"). De resulterende, rekombinante stammer erholdt ved anvendelse av vertsstamme nr. 1558, var stammer nr. 1644 (HPV6a LI) og nr. 1670 (HPV6a L1+L2) som vist i tabellen. Klonale isolater ble dyrket ved 30 <*>C i YEHD-medium inneholdende 2% galaktose i 68-78 timer. Etter innhøsting av cellene ble cellepelletene nedbrutt med glasskuler, og cellelysater ble analysert for ekspresjon av HPV6a LI- eller HPV6a L2-protein ved immunblotanalyse. Prøver inneholdende 40 ug totalt, cellulært protein, ble underkastet elektroforese på 10% Tris-glysingeler under reduserende og denaturerende betingelser og elektroblottet på nitrocellulosefiltre. Ll-proteinet ble immunpåvist ved anvendelse av kanin-antisera mot et trpE-HPVll-fusjonsprotein (Brown, D.R. et al., Virology 201:46-54) som primært antistoff og esel-anti-kanin-IgG-pepperrotperoksidase-bundet (HRP), komplett antistoff (Amersham, Inc.) som det sekundære antistoff. Filtrene ble bearbeidet ved anvendelse av kjemiluminescens "ECL"-påvisningssettet (Amersham, Inc.). Et 50-55 kDa Ll-proteinbånd ble påvist i alle prøver med unntak av den negative kontroll (pCl/1 uten LI- eller L2-gen).
L2-proteinet ble påvist som et 70 kDa proteinbånd ved Western-analyse ved anvendelse av 1:250 fortynnet sera fra mus som var blitt immunisert tre ganger med et trpE-HPV6a L2-fusjonsprotein fremstilt vesentlig i overensstemmelse med metoden ifølge Carter et al. som det primære antistoff, og HRP-bundet sau-ant i-mus-IgG (Amersham, Inc.) som et andre antistoff (1:1 000 fortynning).
For EM-analyse (Structure Probe, West Chester, PA) ble en aliquot av hver prøve plassert på 200 mesh karbonbelagt kobbergitter. En dråpe av 2% fosfowolframsyre (PTA), pH 7,0, ble plassert på gitteret i 20 sekunder. Gitterne ble tillatt å lufttørke før TEM-undersøkelse. All mikroskopi ble utført ved anvendelse av et "JEOL 100CX" transmisjonselektronmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 KV. De frembrakte mikrofotografler har en endelig forstørrelse på 100 000 x.
VLP ble observert i størrelsesområdet 50-55 nm diameter 1 alle gjærprøver som enten inneholdt HPV6a LI eller HPV6a LI- og L2-koekspresjonsplasmidene. Ingen VLP ble observert i gjærkontrollprøver.
Eksempel 27
Fermentering av HPV6a L1+ L2 ( stamme nr. 1670)
Overflatevekst av en platekultur av stamme 1670 ble aseptisk overført til et leucinfritt, flytende medium inneholdende (pr. liter): 8,5 g Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer og ammoniumsulfat; 0,2 g adenin; 0,2 g uracil; 10 g ravsyre; 5 g ammoniumsulfat; og 0,25 g L-tyrosin; dette medium ble justert til pH 5,0-5,3 med NaOH før sterilisering. Etter dyrkning i 25 timer ved 28 °C, 250 rpm på et rotasjonsristeapparat, ble frosne kulturampuller preparert ved tilsetning av steril glyserol til en sluttkonsentrasjon på 17% (vekt/volum) før lagring ved" -70 "C (1 ml pr. kryoampulle). Inokulum for fermentering av stamme 1670 ble utviklet i det samme medium (500 ml pr. 2-liters flaske) og ble startet ved overføring av det tinte innhold av to frosne kulturampuller til 2-liters-flaskene og inkubasjon ved 28 °C, 250 rpm, på et rotasjonsristeapparat i 25 timer. Ved fermentering av stamme 1670 ble det anvendt en New Brunswick SF-116-fermentor med et arbeidsvolum på 10 1 etter inokulering. Det anvendte produksjons-medium inneholdt (pr. liter); 20 g Difco gjærekstrakt; 10 g Sheffield HySoy pepton; 20 g glukose; 20 g galaktose; mediet ble justert til pH 5,3 før sterilisering. Hele innholdet (500 ml) av 2-liters-inokuleringsfjasken ble overført til fermentoren som ble inkubert ved 28 °C, 5 1 luft pr. min.,
400 rpm, trykk 0,25 kg/cm<2>. Omrøringen ble økt etter behov for å opprettholde nivåer av oppløst oksygen høyere enn 40% metning. Fermenteringsforløpet ble overvåket ved off-line-glukosemålinger (Beckman glukose 2-analysator) og on-line-massespektrometri (Perkin-Elmer 1200). Etter 69 timers inkubasjon var det nådd en celletetthet på 9,9 g tørr cellevekt pr.
liter. Kulturen ble konsentrert ved hulfiberfiltrering (Amicon H5MP01-43-patron i et Amicon DC-10-filtreringssystem) til ca. 2 1, diafiltrert til 2 1 fosfatbufret saltløsning og konsentrert ytterligere (til ca. 1 1) før overføring i 500 ml sentr ifugeflasker. Cellepelleter ble oppsamlet ved sentrifugerlng ved 8 000 rpm ("Sorval GS3"-rotor) i 20 minutter ved 4 °C. Etter dekantering av supernatanten ble pelletene (totalt 225 g våte celler) lagret ved -70 °C inntil anvendelse.
Eksempel 28
Rensing av rekombinante HPV6a LI + L2- kapsidproteiner
Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.
Celler av stamme nr. 1670 ble lagret nedfrosne ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 38,0 g) ble tint ved 20-23 °C og resuspendert i 50 ml "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorene PMSF og pepstatin A ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 560 kg/cm<2> ved tre passeringer i et M110 mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Den nedbrutte celleoppslemming ble sentrifugert ved 5 000 x g i 10 minutter for å fjerne nedbrutt cellemateriale. Supernatantvæsken inneholdende LI -i- L2-antigen ble oppsamlet.
Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 ved tilsetning av buffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) og applisert på en anionbytter-innfangingskolonne (5,0 cm ID x 4,0 cm) av "Fractogel" EMD TMAE-650 (S)-resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrert i buffer A. Etter vask med buffer A ble antigenet eluert med en gradient fra 0 til 1,0 M NaCl i buffer A. Immun-dot blotting ble utført for å bestemme hvilke, fraksjoner fra kolonnen som inneholdt LI-protein. v
Fraksjoner inneholdende LI-protein som bestemt ved immun-dot blot, ble analysert for totalt protein ved hjelp av Bradford-metoden etterfulgt av SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western-blotting.
TMAE-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av LI-protein, ble sammenslått. Antigenet ble konsentrert ved ammoniumsulfatfraksjonering. Løsningen ble justert til 63% mettet ammoniumsulfat ved tilsetning av fast reagens under forsiktig omrøring i 30 minutter. Prøven ble plassert på is, og utfelling ble tillatt å foregå i 30 minutter. Prøven ble sentrifugert ved 12 000 x g. Pelleten ble resuspendert i 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl).
Den resuspenderte pellet ble kromatografert på en størrelsesutelukkelseskolonne (2,6 cm ID x 89 cm) med "Sephacryl 500 HR"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluér-ingsbuffer var PBS. Kromatograferingen ble utført ved 20-23 °C. Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western blot-påvisning. De reneste fraksjoner ble sammenslått. Den resulterende porsjon ble konsentrert.
Sluttproduktet ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av kolloidal Coomassie-farging. LI- og L2-proteinene ble beregnet til å være 85% homogene. Identiteten av LI- og L2-proteiner ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse av de egnede antisera. Sluttproduktet ble delt i aliguoter og lagret ved -70 "C. Denne prosess ga totalt 3,0 mg protein.
Elektronmikroskopianalyse ble utført ved hjelp av Structure Probe (West Chester, PA). En aliquot av prøven ble plassert på 200 mesh karbonbelagt kobbergitter. En dråpe av 2% fosfowolframsyre, pH 7,0, ble plassert på gitteret i 20 sekunder. Gitteret ble tillatt å lufttørke før TEM-undersøkelse. All mikroskopi ble utført ved anvendelse av et "JEOL 100 CX" transmisjonselektronmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 kV. De frembrakte mikrofotografier har en endelig forstørrelse på 100 000 x. Tilstedeværelse av viruslignende partikler i størrelsesområdet 50-55 nm ble bekreftet.
Eksempel 29
Rensing av HPV- 6a LI og L1/ L2 VLP for EM- undersøkelser
De gjæruttrykte HPV-6a LI- og HPV-6a LI + L2-proteiner ble delvis renset og konsentrert for elektronmikroskopi (EM) undersøkelser. 1 til 1,5 1 YEHD-medium inneholdende 2% galaktose og 0,1 M sorbitol, ble inokulert med S. cerevisiae stamme nr. 1558 inneholdende enten plasmid pl3173-357-6 (LI-ekspresjonsvektor) eller plasmid pl4049-7-2 (LI- og L2-koekspresjonsvektor) og dyrket ved 30 °C i 68-78 timer. Cellene ble høstet ved sentrifugerlng ved 4 000 g i 10 minutter, og cellepelleter ble nedfrosset ved -70 °C. Alle følgende trinn ble utført ved 4 °C. Cellepelleter ble tint og suspendert i et like stort volum "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen av sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved 3-5 passeringer i et mikrofluidiseringsapparat. Lysatet ble klaret ved sentrifugerlng ved 5 000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% (vekt/volum) sukrose i Ll-buffer, og LI- eller LI + L2-proteinene ble pelletert ved sentrifugerlng ved 100 000 x g i 4 timer. Pelleten ble resuspendert i 1/10 volum Ll-buffer og klaret ved sentrifugerlng ved 5 000 x g i 10 minutter. Prøver ble undersøkt ved EM og ble vist å inneholde viruslignende partikler.
Eksempel 30
Kloning av HPV16 Li- oa L2- gener
Totalt genomisk.DNA ble ekstrahert fra Caski-celler (ATCC nr. CRL 1550) ved hjelp av standardteknikker (Sambrook et al., supra). DNA ble spaltet med Bstl 1071- og Sphl-endo-nukleaser og underkastet elektroforese gjennom en 0,8% lavtsmeltende, preparativ agarosegel. Et område tilsvarende DNA på ca. 3,5 kbp, ble utskåret fra gelen, og agarosen ble spaltet med "Gelase"-enzym (Epicentre Technologies, Inc.). Det gelrensede DNA ble gjort buttendet med T4 DNA-polymerase og ligert med buttendede, fosforylerte oligodeoksynukleotidlinkere som inneholder et "begravet" HindiII-sete. Ligeringsblandingen ble fullstendig spaltet med Hindlll, og det ca. 3,5 kbp DNA ble størrelsesfraksjonert gjennom en agarosegel som beskrevet ovenfor. Det gelrensede DNA ble ligert med pUC18 plasmid-DNA som var spaltet med Hindlll og defosforylert. Etter transformasjon av kompetente E. coli DH5-celler (BRL) ble plasmidbiblioteket screenet for HPV16-positive kloner ved koloni-hybridisering ved anvendelse av et antisense <32>P-merket oligo-deoksynukleotid som er komplementært med 3'-enden av HPV-16 Ll-genet (5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3'). Et pUCl8-plasmid inneholdende et 3,3 kbp HPV16 genomisk fragment, ble isolert og karakterisert ved restriksjonsenzym-og Southern blot-analyser. Dette plasmid ble betegnet pUC18-HPV16 L1/L2 og inneholder alle LI- og L2-kodende DNA-sek-venser . Plasmid-DNA ble fremstilt ved anvendelse av "Qiagen" plasmid-maksisettet (Qiagen, Inc.).
Eksempel 31
Konstruksjon av HPV16 Ll- aiærekspresionsvektor
Klonen pUC18-HPV16 L1/L2 ble anvendt som et templat for PCR. HPV16 Ll-genet ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.), 10 amplifikasjonssykluser (94 °C, 1 min.; 48 °C, 1 min.; 72 °C, 1 min.
45 sek.), og de følgende oligodeoksynukleotidprimere som inneholder flankerende Bglll-seter (understreket).
Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det HPV16 Ll-innledende metioninkodon (uthevet med fet skrift). Det 1,5 kbp LI PCR-produkt ble spaltet med Bglll, gelrenset og ligert med den BamHI-spaltede pCl/l-GAL-vektor. Et pCl/l-GAL-plasmid inneholdende HPV16 Ll-genet, ble isolert og betegnet pl4049-37-l. Ll-genet i pl4049-37-l ble sekvensert ved anvendelse av "PRISM"-settet (ABI, Inc.) og et ABI-sekvenseringsapparat, modell nr. 373A, i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Ll-genet i dette isolat ble vist å inneholde tre nukleotidendringer i forhold til den korrigerte, publiserte prototypesekvens (Kirnbauer, R. et al. (1993), J. Virol. 67:6929-6936) som resulterer i to aminosyreendringer: His-202 til Asp; Thr-266 til Ala. Sekvensanalyse av det opprinnelige templat-DNA bekreftet at disse endringer også var til stede i den genomiske
klon pUC18-HPV16 L1/L2 og ikke ble innført ved PCR.
Eksempel 32
Konstruksjon av HPV16 LI- og L2- gjærekspresjonsvektor
Plasmid pl4049-37-l (pCl/l-GAL+HPV16 LI) ble spaltet med Smal som spalter mellom GALlO-promotoren og ADHl-transkripsjonsterminatoren. Det 1,4 kbp HPV16 L2-gen ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av pUC18-HPV16 L1/L2-DNA som templat, Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.),
10 PCR-amplifikasjonssykluser (94 °C, 1 min.; 48 °C, 1 min.; 72 °C, 1 min. 45 sek.) og de følgende oligodeoksynukleotidprimere som inneholder flankerende Smal-seter (understreket):
Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det HPV16 L2-innledende metioninkodon (uthevet med fet skrift). Det 1,4 kbp L2 PCR-produkt ble spaltet med Smal, gelrenset og ligert med den Smal-spaltede pl4049-37-l-vektor. Et pCl/l-GAL-plasmid inneholdende både HPV16 LI- og L2-genene, ble isolert og betegnet pl4049-42-2. L2-genet i pl4049-42-2 ble sekvensert ved anvendelse av "PRISM"-settet (ABI, Inc.) og et ABI-sekvenseringsapparat, modell nr. 373A i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. L2-genet i dette isolat ble vist å inneholde fem nukléotidendringer i forhold til den korrigerte, publiserte prototypesekvens (Kirnbauer, R. et \al. (1993) supra) som resulterer i én aminosyreendring: Ser-269 til Pro. Sekvensanalyse av den genomiske klon pUC18-HPV16 L1/L2 bekreftet at denne endring også var til stede i det opprinnelige templat-DNA og ikke var innført ved PCR.
Eksempel 33
A. Ekspresjon av HPV16 LI og koekspresjon av HPV16 LI og L2 i gjær
Plasmider pl4049-37-l (pCl/l-GAL+HPV16 Li) og pl4049-42-2 (pCl/l-GAL+HPV16 LI og L2) ble anvendt for å transformere S. cerevisiae-stamme nr. 1558. De resulterende, rekombinante stammer var nr. 1678 (HPV16-L1) og nr. 1679 (HPV16 L1+L2) som vist i tabellen. Klonale isolater ble dyrket ved 30 "C i YEHD-medium inneholdende 2% galaktose i 68-78 timer. Etter innhøs-ting av cellene ble cellepelletene nedbrutt med glasskuler, og cellelysater ble analysert for ekspresjon av HPV16 LI- eller HPV16 L2-protein ved immunblotanalyse. Prøver inneholdende 40 ug totalt, cellulært protein, ble underkastet elektroforese på 10% Tris-glysingeler under reduserende og denaturerende betingelser og elektroblottet på nitrocellulosefiltre. HPV16 Ll-proteinet ble immunpåvist ved anvendelse av kanin-polyklonale antisera mot et trpE-HPVll LI-fusjonsprotein (D. Brown et al., Virology 201:46-54) som primært antistoff og HRP-bundet esel-anti-kanin-IgG-antistoff (Amersham, Inc.) som det sekundære antistoff. Filtrene ble bearbeidet ved anvendelse av kjemiluminescens ECL-påvisningssettet (Amersham, Inc.). Et 50-55 kDa Ll-proteinbånd ble påvist i alle prøver unntatt den negative kontroll (pCl/1 uten LI- eller L2-gen). L2-proteinet ble påvist som et 70 kDa proteinbånd ved immunblot ved anvendelse av mus-anti-HPVl6 L2-sera mot trpE-L2-fusjonsproteiner uttrykt i E. coil som primært antistoff. Geit-anti-mus-IgG HRP-bundet (Amersham, Inc.) ble anvendt som sekundært antistoff, og filtrene ble bearbeidet som beskrevet ovenfor.
B. Rensing av rekombinante HPV type 16 LI + L2- kapsidproteiner
Alle trinn ble utført ved\ 4 °C dersom ikke annet er angitt.
Celler ble lagret nedfrosset ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 27,6 g) ble tint ved 20-23 °C og resuspendert i 40 ml "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorene PMSF og pepstatin A ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på henholdsvis 2 mM og 1,7 uM. Celleoppsleromingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 560 kg/cm<2> ved tre passeringer i et Ml 10 mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Den nedbrutte celleoppslemming ble sentrifugert ved 5 000 x g i 10 minutter for å fjerne cellulært nedbrytningsmateriale. Supernatantvæsken inneholdende Li + L2-antigen, ble oppsamlet.
Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 ved tilsetning av buffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) og applisert på en anionbytter-innfangingskolonne (5,0 cm ID x 4,8 cm) av "Fractogel" EMD TMAE-650 (S)-resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrert i buffer A. Etter vask med buffer A ble antigenet eluert med en gradient fra 0 til 1,0 M NaCl i buffer A. Immun-dot blotting ble utført for å bestemme hvilke fraksjoner fra kolonnen som inneholdt LI-protein.
Fraksjoner inneholdende Li-protein som bestemt ved immun-dot blot, ble analysert for totalt protein ved hjelp av Bradford-metoden etterfulgt av SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western-blotting.
TMAE-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av LI-protein, ble sammenslått. Antigenet ble konsentrert ved ammoniumsulfat fraksjonering. Løsningen ble justert til 48% mettet ammoniumsulfat ved tilsetning av fast reagens under forsiktig omrøring i 30 minutter. Prøvene ble plassert på is, og utfelling ble tillatt å foregå over natten. Prøvene ble sentrifugert ved 12 000 x g. Pel leten ble resuspendert i 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl).
Resuspenderte pelleter ble kromatografert separat på en størrelsesutelukkelseskolonne (2,6 cm ID x 89 cm) med "Sephacryl 500 HR"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ) ved 20-23 °C. Elueringsbuffer var PBS. Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western blot-påvisning. De reneste fraksjoner ble sammenslått. De resulterende porsjoner ble konsentrert i en 50 ml omrøringscelle ved anvendelse av 43 mm YM-100 flatplåtemembraner (Amicon, Beverly, MA) ved et N2-trykk på 0,28-0,42 kg/cm<2>.
Sluttproduktet ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av kolloidal Coomassie-farging. Li- og L2-proteinene ble beregnet til å være 70% homogene. Identiteten av LI- og L2-proteiner ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse av de egnede antisera. Sluttproduktet ble delt i aliquoter og lagret ved -70 °C. Denne prosess ga totalt 0,53 mg protein.
Elektronmikroskopianalyse ble utført ved hjelp av Structure Probe (West Chester, PA). En aliquot av prøven ble plassert på et 200 mesh karbonbelagt kobbergitter. En dråpe av 2% fosfowolframsyre, pH 7,0, ble plassert på gitteret i 20 sekunder. Gitteret ble tillatt å lufttørke før TEM-under-søkelse. All mikroskopi ble utført ved anvendelse av et "JEOL 100 CX" transmisjonselektronmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 kV. De frembrakte mikrofotografier har en endelig forstørrelse på 100 000 x. Tilstedeværelsen av viruslignende partikler i størrelsesområdet 50-55 nm ble bekreftet.
C. Rensing av rekombinante HPV type 16 LI + L2- kapsidproteiner
Alle trinn ble utført ved 4 "C dersom ikke annet er angitt.
Celler ble lagret nedfrosset ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 92,8 g) ble tint ved 20-23 °C og resuspendert i 105 ml "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorene PMSF og pepstatin A ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 825 kg/cm<2 >ved tre passeringer i et M110-Y mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Den nedbrutte celleoppslemming ble sentrifugert ved 6 100 x g i 15 minutter for å fjerne cellulært nedbrytningsmateriale, Supernatantvæsken inneholdende LI + L2-antigen, ble oppsamlet.
Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 ved tilsetning av buffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) og applisert på en anionbytter-innfangingskolonne (5,0 cm ID x 4,2 cm) av "Fractogel" EMD TMAE-650 (S)-resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrert i buffer A. Etter en vask med buffer A ble antigenet eluert med en gradient fra 0 til 1,0 M NaCl i buffer A. Immun-dot-blotting ble utført for å bestemme hvilke fraksjoner fra kolonnen som inneholdt Ll-protein.
Fraksjoner inneholdende Ll-protein som bestemt ved immun-dot blot, ble analysert for totalt protein ved hjelp av Bradford-metoden etterfulgt av SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western-blotting.
TMAE-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av Ll-protein, ble sammenslått. Antigenet ble konsentrert ved ammoniumsulfatfraksjonering. Prøver ble justert til 35% mettet ammoniumsulfat ved tilsetning av fast reagens under forsiktig omrøring i 10 minutter. Prøvene ble plassert på is, og utfelling ble tillatt å foregå i 4 timer. Prøvene ble sentrifugert ved 12 000 x g. Pelleten ble resuspendert i 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl) som inneholdt 1 mM EDTA.
Resuspenderte pelleter ble kromatografert separat på en størrelsesutelukkelseskolonne (2,6 cm ID x 89 cm) med "Sephacryl 500 HR"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ). Elueringsbuffer var PBS + 1 mM EDTA. Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western blot-påvisning. De reneste fraksjoner ble sammenslått. De resulterende porsjoner ble konsentrert i en 50 ml omrøringscelle ved anvendelse av 43 mm YM-100 flatplatemembraner (Amicon, Beverly, MA) ved et N2-trykk på 0,28-0,42 kg/cm<2>.
Sluttproduktet ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av kolloidal Coomassie-farging. Li- og L2-proteinene ble beregnet til å være 70% homogene. Identiteten av Li- og L2-proteiner ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse av de egnede antisera. Sluttproduktet ble delt i aliguoter og lagret ved -70 "C. Denne prosess ga totalt 3,8 mg protein.
Eksempel 34
A. Fermentering av stamme 1679 ( HPV type 16 L1+ L2)
Anvendte prosedyrer for fremstilling av frosne stam-kulturer, inokulatutvikling, fermentering og celleoppsamling av stamme 1679 var vesentlig som beskrevet ovenfor. Etter inkubasjon i 67 timer ble det nådd en celletetthet på 4,2 g tørr cellevekt pr. liter, og dette ga totalt 93 g våt cellepellet etter oppsamling.
B. Fermentering av stamme 1678 ( HPV type 16 LI)
Prosedyrer anvendt for fremstilling av frosne stam-kulturer, inokulatutvikling, fermentering og celleoppsamling av stamme 1678 var vesentlig som beskrevet ovenfor. Etter inkubasjon i 70,5 timer ble innholdet fra to 10 1 fermenter-inger sammenslått (en celletetthet på 8,7 g tørrcellevekt pr. 1), hvilket ga totalt 258 g våt cellepellet etter oppsamling.
C. Rensing av rekombinante HPV type 16 Ll- kapsidproteiner
Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.
Celler av stamme nr. 1678 ble lagret nedfrosset ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 128 g) ble tint ved 20-23 °C og resuspendert i 140 ml "modifisert Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl). Proteaseinhibitorene PMSF og pepstatin A ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 825 kg/cm<2> ved tre passeringer i et M110-Y mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Den nedbrutte celleoppslemming ble sentrifugert ved 11 000 x g i 40 minutter for å fjerne cellulært nedbrytningsmateriale. Supernatantvæsken inneholdende Ll-antigen, ble oppsamlet.
Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 ved tilsetning av buffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) og applisert på en anionbytter-innfangingskolonne (5,0 cm ID x 6,4 cm) av "Fractogel" EMD TMAE-650 (S)-resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrert i buffer A. Etter en vask med buffer A ble antigenet eluert med en gradient fra 0 til 1,0 M NaCl i buffer A. Immun-dot-blotting ble utført for å bestemme hvilke fraksjoner fra kolonnen som inneholdt Ll-protein.
Fraksjoner inneholdende Ll-protein som bestemt ved immun-dot blot, ble analysert for totalt protein ved hjelp av Bradford-metoden etterfulgt av SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western-blotting. \
TMAE-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av Ll-protein, ble sammenslått. Antigenet ble konsentrert ved ammoniumsulfatfraksjonering. Prøver ble justert til 35% mettet ammoniumsulfat ved tilsetning av fast reagens under forsiktig omrøring i 10 minutter. Prøvene ble plassert på is, og utfelling ble tillatt å foregå i 5 timer. Prøvene ble sentrifugert ved 12 000 x g. Pelleten ble resuspendert i 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl).
Resuspenderte pelleter ble kromatografert separat på en størrelsesutelukkelseskolonne (2,6 cm ID x 89 cm) med "Sephacryl 500 HR"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ). Elueringsbuffer var PBS. Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western blot-påvisning. De reneste fraksjoner ble sammenslått. Resulterende porsjoner ble konsentrert i en 50 ml omrøringscelle ved anvendelse av 43 mm YM-100 flatplatemembraner (Amicon, Beverly, MA) ved et N2-trykk på 0,28-0,42 kg/cm<2>.
Sluttproduktet ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av kolloidal Coomassie-farging. Ll-proteinet ble beregnet til å være 70% homogent. Identiteten av LI ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse av de egnede antisera. Sluttproduktet ble delt i aliquoter og lagret ved -70 °C. Denne prosess ga totalt 7,4 mg protein.
D. Analytiske prosedyrer
Immun- dot blot- prosedyre
Prøver ble fortynnet (når nødvendig) 1:10 i Milli-Q-H20, og 10 ul prøve ble punktapplisert på "PolyScreen" PVDF-membraner (NEN Research Products, Boston, MA). Etter at flekkene var tørket, ble membranene vasket i vann og tillatt å tørke. Primær antistoffløsning ble preparert ved fortynning av det egnede antiserum i blottingsbuffer (5% melk uten fett i 6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3). Inkubasjon var i minst 1 time ved 20-23 °C. Flekken ble vasket i 1 minutt tre ganger med PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl). Sekundær antistoffløsning ble preparert ved fortynning av det egnede alkalisk fosfatasebundne konjugat-antiserum i blottingsbuf f er. Inkubasjon ble utført under de samme betingelser i minst 1 time. Flekkene ble vasket som beskrevet ovenfor og påvist ved anvendelse av et 1-trinns NBT/BCIP-substrat (Pierce, Rockford, IL).
Antistoffer anvendt for påvisning, var som følger: HPV6a LI ble påvist med MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). HPV6a L2 ble påvist med mus-anti-HPV6a L2-trpE-fusjonsserum, porsjon nr. 641 og 647. HPV16 LI ble påvist med MAB 885 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). HPV16 L2 ble påvist med mus-anti-HPV16 L2-trpE-fusjonsserum, porsjon nr. 611.
Bradford- analvse for totalt protein
Totalt protein ble analysert ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig "Coomassie Plus"-sett (Pierce, Rockford, IL). Prøver ble fortynnet til passende nivåer i Milli-Q-H20. Fordrede volumer var 0,1 ml og 1,0 ml for henholdsvis standard- og mikroanalyseprotokollene. For begge protokoller ble BSA (Pierce, Rockford, IL) anvendt for å frembringe stand-ardkurven. Analysen ble utført i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Standardkurver ble plottet ved anvendelse av "CricketGraph" software på en Macintosh IIci-computer.
Eksempel 35
Rensing av rekombinante HPV type 11 LI- kapsidproteiner
Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.
Celler ble nedfrosset ved -70 "C. Frosne celler (våtvekt = 180 g) ble tint ved 20-23 "C og resuspendert i 900 ml "Breaking Buffer" (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2). Proteaseinhibitorene AEBSF og pepstatin A ble tilsatt til s lut tkonsentr as joner på hhv. 1 mM og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 825 kg/cm<2> ved 4 passeringer i et M110-Y mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Et tilstrekkelig volum 10% "Triton X100"-detergent (Pierce, Rockford, IL) ble tilsatt til den nedbrutte celleoppslemming for å bringe konsentrasjonen av TX100 til 0,5%. Oppslemmingen ble omrørt i 20 timer. Det "Triton XI00"-behandlede lysat ble sentrifugert ved 12 000 x g i 40 minutter for å fjerne cellulære nedbrytningsmaterialer. Supernatantvæsken inneholdende Ll-protein, ble oppsamlet.
Supernatantvæsken ble diafiltrert mot 5 volumer 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, ved anvendelse av en 300K tangentiell gjennomstrømningsmembrankassett (Filtron, Northborough, MA). Materialet tilbakeholdt av membranen, ble vist ved radioimmunanalyse og Western-blotting å inneholde Ll-proteinet .
Retentatet ble applisert på en affinitetskolonne med høy oppløsning (11,0 cm ID x 5,3 cm) med "SP Spherodex (M)"-resin (IBF, Villeneuve-la-Garenne, Frankrike) ekvilibrert i 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 0,5 M NaCl. Etter en vask med ek-vilibreringsbuffer og en trinnvis vask med 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 1,0 M NaCl, ble Ll-proteinet eluert med en trinnvis vask med 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 2,5 M NaCl. Fraksjoner ble oppsamlet under vask og eluering. Kolonnefraksjoner ble analysert for totalt protein ved Bradford-metoden. Fraksjoner ble deretter analysert ved Western-blotting og SDS-PAGE med kolloidal Coomassie-påvisning. Fraksjoner ble også påvist ved radioimmunanalyse.
"SP Spherodex"-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av Ll-protein, ble sammenslått.
Sluttproduktet ble analysert ved Western-blotting og SDS-PAGE med kolloidal Coomassie-påvisning. Ll-proteinet ble vist ved densitometri av de Coomassie-fargede geler å være
>90% homogene. Identiteten av Ll-protein ble bekreftet ved Western-blotting. Sluttproduktet ble filtrert aseptisk gjennom en 0,22 pm membran og lagret ved 4 °C. Denne prosess ga totalt 202 mg protein.
Elektronmikroskopianalyse ble utført ved hjelp av Structure Probe (West Chester, PA). En prøvealiquot plasseres på et 200 mesh karbonbelagt kobbergitter. En dråpe av 2% fosfowolframsyre, pH 7,0, plasseres på gitteret i 20 sekunder. Gitteret tillates å lufttørke før TEM-undersøkelse. All mikroskopi utføres ved anvendelse av et "JEOL 100 CX" transmi-sjonsmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 kV. De frembrakte mikrofotografier har en endelig for-størrelse på 100 000 x.
SDS- PAGE og Western blot- analvser
Alle geler, buffere og elektroforeseapparatur ble erholdt fra Novex (San Diego, CA) og ble utført i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Kort beskrevet, ble prøver fortynnet til like proteinkonsentrasjoner i Milli-Q-H20 og blandet 1:1 med prøveinkubasjonsbuffer inneholdende 200 mM DTT. Prøver ble inkubert i 15 minutter ved 100 °C og applisert på forhåndsstøpte 12% Tris-glysingeler. Prøvene ble underkastet elektroforese ved 125V i 1 time og 45 minutter. Geler ble fremkalt ved kolloidal Coomassle-farging ved anvendelse av et kommersielt sett (Integrated Separation Systems, Natick, MA).
For Western blots ble proteiner overført til PVDF-membraner ved 25V i 40 minutter. Membraner ble vasket med Milli-Q-H20 og lufttørket. Primært antistoff var polyklonalt kanin-antiserum mot et TrpE-HPVll LI-fusjonsprotein (gave fra dr. D. Brown). Antistoff løsningen ble preparert ved fortynning av ant i serum i blottingsbuf fer (5% melk uten fett i 6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3). Inkubasjon fore-gikk i minst én time ved 20-23 °C. Flekken ble vasket tre ganger å 1 minutt i PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl). Sekundær antistoffløsning ble preparert ved fortynning av geit-anti-kanin-IgG alkalisk fosfatasebundet konjugat-antiserum (Pierce, Rockford, IL) i blottingsbuffer. Inkubasjon ble utført under de samme betingelser i minst én time. Flekker ble vasket som beskrevet tidligere og påvist ved anvendelse av et 1-trinns NBT/BCIP-substrat (Pierce, Rockford, IL).
Eksempel 36
Ekspresjon av HPV18 LI og L2 i gjær
Plasmider pl91-6 (pGALl-10+HPV18 LI) og pl95-ll (pGALl-10+HPV18 L1+L2) ble anvendt for å transformere S. cerevisiae- stamme nr. 1558 (MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°). Klonale isolater ble dyrket ved 30 °C i YEHD-medium inneholdende 2% galaktose i 88 timer. Etter høsting av cellene ble cellepelletene nedbrutt med glasskuler, og cellelysater ble analysert for ekspresjon av HPV18 LI- og/eller HPV18 L2-protein ved immunblotanalyse. Prøver inneholdende
25 ug totalt, cellulært protein, ble underkastet elektroforese gjennom 10% Tris-glysingeler (Novex, Inc.) under denaturerende betingelser og elektroblottet på nitrocellulosefiltre. Ll-protein ble immunpåvist ved anvendelse av kanin-antiserum mot et trpE-HPVll LI-fusjonsprotein som primært antistoff (Brown et al., 1994, Virology 201:46-54) og pepperrotperoksidase(HRP)-bundet esel-anti-kanin-IgG (Amersham, Inc.) som sekundært antistoff. Filterne ble bearbeidet ved anvendelse av kjemiluminescens "ECL"-påvisningssettet (Amersham, Inc.). Et 50-55 kDa Ll-proteinbånd ble påvist i både LI- og LI + L2-koeks-pressorgjærklonene (hhv. stammer 1725 og 1727) og ikke i den negative kontroll (pGALl-10 uten LI- eller L2-gener).
HPV18 L2-proteinet ble påvist ved Western-analyse ved anvendelse av geit-polyklonalt antiserum mot et trpE-HPV18 L2-fusjonsprotein som primært antistoff, etterfulgt av HRP-kon-jugert kanin-anti-geit-IgG (Kirkegaard og Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Filterne ble bearbeidet som beskrevet ovenfor. Ll-proteinet ble påvist som et 75 kDa proteinbånd i LI + L2-koekspressorgjærklonen (stamme 1727), men ikke i hverken den negative kontroll eller Ll-ekspressorklonen.
Eksempel 37
Fermentering av HPV18 Li ( stamme 1725) oa 18 L1+ ÅL2 ( stamme 1727)
Overflatevekst av en platekultur av stammer 1725 og 1727 ble overført aseptisk til et leucinfritt, flytende medium inneholdende (pr. liter): 8,5 g Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer og ammoniumsulfat; 0,2 g adenin; 0,2 g uracil; 10 g ravsyre; 5 g ammoniumsulfat; 40 g glukose; 0,25 g L-tyrosin; 0,1 g L-arginin; 0,3 g L-isoleucin, 0,05 g L-metionin; 0,2 g L-tryptofan; 0,05 g L-histidin; 0,2 g L-lysin; 0,3 g L-fenylalanin; dette medium ble justert til pH 5,0-5,3 med NaOH før sterilisering. Etter dyrkning ved 28 °C, 250 rpm, på et rotasjonsristeapparat, ble frosne kulturampuller preparert ved tilsetning av steril glyserol til en sluttkonsentrasjon på 17%
(vekt/volum) før lagring ved -70 °C (1 ml pr. kryoampulle). Inokulater ble utviklet i det samme medium (500 ml pr. 2-liters flaske) og ble startet ved å overføre det tinte innhold i en frossen kulturampulle etterfulgt av inkubasjon ved 28 °C, 250 rpm, på et rotasjonsristeapparat i 29 timer. Fermenter-inger av hver stamme benyttet en New Brunswick SF-116-fermen-tor med et arbeidsvolum på 10 1 et^er inokulasjon. Produk-sjonsmediet inneholdt (pr. 1): 20 g Difco gjærekstrakt; 10 g Sheffield HySoy pepton; 20 g glukose; 20 g galaktose; 0,3 ml Union Carbide "UCON LB-625" antiskummemiddel; mediet ble justert til pH 5,3 før sterilisering. Hele innholdet (500 ml) av inokulumflasken på 2 1 ble overført til fermentoren som ble inkubert ved 28 °C, 5 1 luft pr. min., 400 rpm, 0,25 kg/cm<2 >trykk. Omrøringen ble økt etter behov for å opprettholde
nivåer av oppløst oksygen høyere enn 40% metning. Fermenter-ingsutviklingen ble overvåket ved off-line glukosemålinger (Beckman-glukose 2-analysator) og on-line massespektrometri (Perkin-Elmer 1200). Etter inkubasjon i 66 timer ble det oppnådd celletettheter på 9,5 til 9,7 g tørr cellevekt pr. 1. Kulturene ble konsentrert ved hulfiberfiltrering ("Amicon H5MP01-43"-patron i et "Amicon DC-10"-filtreringssystem) til ca. 2 1, diafiltrert med 2 1 fosfatbufret saltløsning og konsentrert ytterligere (til ca. 1 1) før overføring til 500 ml sentrifugekolber. Cellepelleter ble oppsamlet ved sentrifugerlng ved 8 000 rpm ("Sorval GS-3"-rotor) i 20 minutter ved 4 °C. Etter dekantering av supernatanten ble pelletene (totalt 191 til 208 g våte celler) lagret ved -70 °C inntil anvendelse.
Eksempel 38
Rensing av rekombinant HPV type 18 Ll- kapsidproteiner
Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.
Celler ble lagret nedfrosne ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 126 g) ble tint ved 20-23 °C og resuspendert i 70 ml "Breaking Buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl). Proteaseinhibitorene PMSF og pepstatin A ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 1 125 kg/cm<2> ved 4 passeringer i et M110-Y mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Den nedbrutte celleoppslemming ble sentrifugert ved 12 000 x g i 40 minutter for å fjerne cellulært nedbrytningsmateriale. Supernatantvæsken inneholdende Ll-antigen, ble oppsamlet.
Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 ved tilsetning av buffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) og applisert på en anionbytter-innfangingskolonne (9,0 cm ID x 3,9 cm) av "Fractogel" EMD TMAE-650 (M)-resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrert i buffer A. Etter en vask med buffer A ble antigenet eluert med en gradient fra 0 til 1,0 M NaCl i buffer A. Kolonnefraksjoner ble analysert for totalt protein ved Bradford-metoden. Fraksjoner ble deretter analysert ved like, totale proteininn-hold ved Western-blotting og SDS-PAGE med sølvfargingspåvis-
ning.
TMAE-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av Ll-protein, ble sammenslått. Antigenet ble konsentrert ved ammoniumsulfatfraksjonering. Løsningen ble jus-, tert til 35% mettet ammoniumsulfat ved tilsetning av fast reagens under forsiktig omrøring i 10 minutter. Prøven ble plassert på is, og utfelling ble tillatt å foregå i 4 timer. Prøven ble sentrifugert ved 16 000 x g i 45 minutter. Pelleten ble-resuspendert i 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2,
150 mM NaCl).
Den resuspenderte pellet ble kromatografert på en størrelsesutelukkelseskolonne (2,6 cm ID x 89 cm) med "Sephacryl 500 HR"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ). Elueringsbuffer var PBS. Fraksjoner ble analysert ved Western-blotting og SDS-PAGE med sølvfargingspåvisning. De reneste fraksjoner ble sammenslått. Den resulterende porsjon ble konsentrert i en 50 ml omrøringscelle ved anvendelse av 43 mm YM-100 flatplatemembraner (Amicon, Beverly, MA) ved et N2-trykk på 0,28-0,42 kg/cm<2>.
Sluttproduktet ble analysert ved Western-blotting og SDS-PAGE med kolloidal Coomassie-påvisning. Ll-proteinet ble beregnet til å være 50-60% homogent. Identiteten av Ll-protein ble bekreftet ved Western-blotting. Sluttproduktet ble delt i aliquoter og lagret ved -70 °C. Denne prosess ga totalt 12,5 mg protein.
Eksempel 39
Fremstilling av immunogene preparater
Renset VLP formuleres i overensstemmelse med kjente metoder, slik som ved blanding av farmasøytisk akseptable bærere, stabilisatorer eller en vaksineadjuvans. Det immunogene VLP fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan prepareres for anvendelse som vaksine ved kombinasjon med et fysiologisk akseptabelt preparat, slik som f.eks. PBS, salt-løsning eller destillert vann. Det immunogene VLP administreres i et doseområde på ca. 0,1 til 100 ug, fortrinnsvis ca. 1 til ca. 20 ug, for å oppnå den ønskede, immunogene virkning. Mengden av VLP pr. formulering kan variere i overensstemmelse med mange faktorer, inkludert, men ikke begrenset til, individets tilstand, vekt, alder og kjønn. Administrering av VLP-formuleringen kan foregå på mange forskjellige måter, inkludert, men ikke begrenset til, oral, subkutan, topisk, mukosal og intramuskulær. Slike VLP-formuleringer kan være sammensatt av en enkel type VLP (dvs. VLP fra HPV6a) eller en blanding av VLP (dvs. VLP fra HPV6a, HPV11, HPV16 og HPV18).
Et antimikrobielt konserveringsmiddel, f.eks. timero-sal, kan eventuelt være til stede. De immunogene antigener fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan, om ønsket, benyttes i kombinasjon med vaksinestabilisatorer og vaksine-adjuvanser. Typiske stabilisatorer er spesifikke forbindelser, f.eks. polyanioner som heparin, inositolheksasulfat, sulfatert betasyklodekstrin, mindre spesifikke eksipienser, f.eks. aminosyrer, sorbitol, mannitol, xylitol, glyserol, sukrose, dekstrose, trehalose, og variasjoner i løsningsbetingelser, f.eks. nøytral pH, høy ionestyrke (ca. 0,5-2,0 M salter), divalente kationer (Ca<2+>, Mg2+) . Eksempler på adjuvanser er Al(OH)3 og A1(P04). Vaksinen kan lagres under avkjøling eller i lyofilisert form.
Eksempel 40
Fremstilling av antistoffer mot VLP
Renset VLP anvendes for å danne antistoffer. Betegnelsen "antistoff" som anvendt heri, inkluderer både polyklonale og monoklonale antistoffer så vel som fragmenter derav, slik som Fv, Fab og F(ab)2-fragmenter som er i stand til å binde antigen eller hapten. Antistoffene anvendes på mange forskjellige måter, inkludert, men ikke begrenset til, rensing av rekombinant VLP, rensing av native LI- eller L2-proteiner, og sett. Sett vil omfatte en rominndelt bærer egnet til å inneholde minst én tett tillukket beholder. Bæreren vil videre omfatte reagenser som anti-VLP-antistoff eller VLP egnet for påvisning av HPV eller fragmenter av HPV eller antistoffer mot HPV. Bæreren kan også inneholde påvisningsmidler, slik som merkét antigen eller enzymsubstrater eller lignende. Antistoffene eller VLP eller settene er anvendelige for mange forskjellige formål, inkludert, men ikke begrenset til, rettsmedisinske analyser og epidemiologiske undersøkelser.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus, karakterisert ved at: a) en gjær transformeres med et DNA-molekyl, hvor DNA-molekylet koder for HPV-Ll- eller HPV-Ll+L2-proteiner, hvorved det fremstilles en transformert gjærcelle, b) den transformerte celle dyrkes under betingelser som muliggjør fremstilling av rekombinante proteiner og deres spontane sammensetning til VLP-er, og (c) VLP-ene innhøstes fra den transformerte celle og (d) VLP-ene renses ved hjelp av ionebytterkromatografi og størrelsesutelukkelseskromatografi.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at gjæren er Saccharomyces cerevisiae.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at proteinet fra humant papillomavirus (HPV) er valgt fra gruppen bestående av: HPV type 6a, HPV type 6b, HPV type 11, HPV type 16 og HPV type 18.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US24279494A | 1994-05-16 | 1994-05-16 | |
PCT/US1995/006006 WO1995031532A1 (en) | 1994-05-16 | 1995-05-15 | Papillomavirus vaccines |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO964862D0 NO964862D0 (no) | 1996-11-15 |
NO964862L NO964862L (no) | 1997-01-16 |
NO322133B1 true NO322133B1 (no) | 2006-08-21 |
Family
ID=22916213
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19964862A NO322133B1 (no) | 1994-05-16 | 1996-11-15 | Fremgangsmate for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus. |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0757717B1 (no) |
JP (1) | JP3863559B2 (no) |
CN (1) | CN1152935A (no) |
AT (1) | ATE328068T1 (no) |
AU (1) | AU693203B2 (no) |
BG (1) | BG100974A (no) |
BR (1) | BR9507657A (no) |
CA (1) | CA2189882C (no) |
CZ (1) | CZ336696A3 (no) |
DE (1) | DE69535018T2 (no) |
DK (1) | DK0757717T3 (no) |
ES (1) | ES2264126T3 (no) |
FI (1) | FI119815B (no) |
HU (1) | HUT76354A (no) |
MX (1) | MXPA96005662A (no) |
NO (1) | NO322133B1 (no) |
NZ (1) | NZ285941A (no) |
PL (1) | PL183781B1 (no) |
PT (1) | PT757717E (no) |
RO (1) | RO117541B1 (no) |
RU (1) | RU2206608C2 (no) |
SI (1) | SI0757717T1 (no) |
SK (1) | SK147696A3 (no) |
WO (1) | WO1995031532A1 (no) |
Families Citing this family (48)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6153201A (en) * | 1993-03-09 | 2000-11-28 | University Of Rochester | Oral immunization with papillomavirus virus-like particles |
BR9509076A (pt) * | 1994-09-22 | 1998-07-14 | Merck & Co Inc | Molécula de dna isolada e purificada vetor de expressão proteína anticorpo monoespecífico composto composição farmacêutica vacina e processos para expressar preteina de papilomavírus humano tipo 6a para identificar compostos e para induzir respostas imunes contra infecção ou doença provocada por papilomavírus humano |
AR004464A1 (es) * | 1994-11-14 | 1998-12-16 | Merck Sharp & Dohme | Un metodo para producir una proteina de capside de papilomavirus |
GB9621091D0 (en) | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
PT1105466E (pt) | 1998-08-14 | 2006-07-31 | Merck & Co Inc | Processo para a purificacao de particulas tipo virus do papilomavirus humano |
DE69935606T9 (de) | 1998-10-16 | 2021-03-11 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Adjuvanzsysteme und impfstoffe |
AUPP765398A0 (en) * | 1998-12-11 | 1999-01-14 | University Of Queensland, The | Treatment of papillomavirus infections |
AU764138B2 (en) * | 1999-02-05 | 2003-08-14 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Human papilloma virus vaccine formulations |
DE10137102A1 (de) | 2001-07-30 | 2003-02-27 | Deutsches Krebsforsch | Polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
GB0206360D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
JP2005523722A (ja) | 2002-04-30 | 2005-08-11 | オンコリティクス バイオテック, インコーポレイティッド | 改善されたウイルス精製方法 |
US7858098B2 (en) | 2002-12-20 | 2010-12-28 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Vaccine |
MY140664A (en) * | 2003-09-29 | 2010-01-15 | Merck Sharp & Dohme | Optimized expression of hpv 45 l1 in yeast |
NZ588616A (en) | 2004-09-30 | 2012-05-25 | Bayer Healthcare Llc | An apparatus for separating a protein of interest comprising a purification system integrated with a particle removal system |
US7901921B2 (en) | 2004-10-22 | 2011-03-08 | Oncolytics Biotech Inc. | Viral purification methods |
HUE032422T2 (en) | 2006-09-29 | 2017-09-28 | Takeda Vaccines Inc | Norovirus vaccine preparations |
PE20081723A1 (es) * | 2007-01-30 | 2008-12-14 | Transgene Sa | Vacuna contra el papilomavirus |
AU2008224877B2 (en) * | 2007-03-14 | 2013-07-11 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Virus like particle purification |
MX2009014246A (es) | 2007-06-26 | 2010-03-31 | Japan Health Science Found | Antigeno de vacuna con la capacidad de inducir anticuerpo de neutralizacion y reaccion cruzada contra virus de papiloma humano del tipo de alto riesgo. |
US20100266636A1 (en) | 2007-09-18 | 2010-10-21 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Method of conferring a protective immune response to norovirus |
CA2698397C (en) | 2007-09-18 | 2018-03-27 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Method of conferring a protective immune response to norovirus |
MY162658A (en) * | 2007-11-23 | 2017-06-30 | Shanghai Zerun Biotechnology Co Ltd | Genes encoding major capsid protein l1 of human papilloma virus and use of the same |
CN104911154A (zh) | 2008-08-08 | 2015-09-16 | 武田疫苗股份有限公司 | 交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒 |
CN102215861B (zh) * | 2009-06-19 | 2014-10-08 | 艾金株式会社 | 宫颈癌疫苗 |
CN102234661A (zh) * | 2010-04-23 | 2011-11-09 | 北京生物制品研究所 | 人乳头瘤病毒类病毒颗粒的制备方法和外源蛋白表达盒、表达系统 |
AU2011336410B2 (en) | 2010-12-02 | 2015-01-22 | Oncolytics Biotech Inc. | Lyophilized viral formulations |
SG190418A1 (en) | 2010-12-02 | 2013-07-31 | Oncolytics Biotech Inc | Liquid viral formulations |
RU2445358C1 (ru) * | 2011-02-15 | 2012-03-20 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 18 |
RU2445357C1 (ru) * | 2011-02-15 | 2012-03-20 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 16 |
KR102151890B1 (ko) * | 2011-04-29 | 2020-09-03 | 온콜리틱스 바이오테크 인코포레이티드 | 겔 침투 크로마토그래피를 이용한 바이러스의 정제방법 |
JP6208659B2 (ja) | 2011-07-11 | 2017-10-04 | タケダ ワクチン,インコーポレイテッド | 非経口ノロウイルスワクチン製剤 |
BR112014012491A2 (pt) * | 2011-12-01 | 2017-06-06 | Univ Cape Town | partícula tipo vírus, método para produzir uma partícula tipo vírus, método para impedir ou tratar a infecção pelo hpv ou câncer cervical em um indivíduo, uso de uma partícula tipo vírus, e, composição farmacêutica |
CN103215302B (zh) * | 2012-01-21 | 2019-01-15 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv18 l1蛋白的方法 |
CN103361377B (zh) * | 2012-03-28 | 2017-12-05 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv6 l1蛋白的方法 |
JOP20130186B1 (ar) | 2012-06-22 | 2021-08-17 | Takeda Vaccines Montana Inc | تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات |
CN110484554B (zh) * | 2013-04-26 | 2024-04-16 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv52 l1蛋白的方法 |
CN110423774A (zh) * | 2013-04-26 | 2019-11-08 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv58 l1蛋白的方法 |
CN104164374B (zh) * | 2013-05-17 | 2019-10-22 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv31 l1蛋白的方法 |
CN104673760B (zh) * | 2013-11-29 | 2018-01-02 | 南京赛威信生物医药有限公司 | 一种原核细胞表达类病毒颗粒的纯化方法 |
RU2546241C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 16 |
RU2546242C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 18 |
RU2546243C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантная вакцина для профилактики папилломавирусной инфекции человека и способ ее получения |
RU2546240C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 56 |
KR101825996B1 (ko) * | 2014-12-26 | 2018-02-09 | 아이진 주식회사 | 인유두종 바이러스의 바이러스 유사 입자 제조방법 |
US10758606B2 (en) * | 2015-09-04 | 2020-09-01 | Inventprise, Llc | VLP stabilized vaccine compositions |
RU2676160C1 (ru) * | 2018-02-14 | 2018-12-26 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент главного капсидного белка L1 вируса папилломы человека типа 11 |
RU2681174C1 (ru) * | 2018-07-12 | 2019-03-04 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Способ получения рекомбинантной вакцины для профилактики папилломавирусной инфекции человека, рекомбинантная вакцина |
CN116426396B (zh) * | 2023-06-09 | 2023-09-01 | 内蒙古工业大学 | 一株耐硫酸铵酿酒酵母及其筛选方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2586428B1 (fr) * | 1985-08-26 | 1988-11-25 | Pasteur Institut | Polypeptides et anticorps, caracteristiques du papillomavirus et leurs applications au diagnostic in vitro, a la prevention et/ou la lutte contre des infections a papillomavirus |
DE3625257A1 (de) * | 1986-07-23 | 1988-02-04 | Behringwerke Ag | Expressionsprodukte der menschlichen papillomviren typ 16 und 18, fuer diese proteine spezifische antikoerper und diese antikoerper bzw. entsprechende dna enthaltende diagnostika |
DK0595935T3 (da) * | 1991-07-19 | 2003-07-21 | Csl Ltd | Papillomavirusvaccine |
EP1835029A1 (en) * | 1992-06-25 | 2007-09-19 | Georgetown University | Papillomavirus vaccines |
US5437951A (en) * | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
DE4332596A1 (de) * | 1993-09-24 | 1995-03-30 | Martin Josef Dr Sapp | Monoklonale Antikörper |
AUPM566794A0 (en) * | 1994-05-17 | 1994-06-09 | University Of Queensland, The | Process and product |
-
1995
- 1995-05-15 JP JP52980895A patent/JP3863559B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 AT AT95919820T patent/ATE328068T1/de active
- 1995-05-15 SI SI9530726T patent/SI0757717T1/sl unknown
- 1995-05-15 HU HU9603155A patent/HUT76354A/hu unknown
- 1995-05-15 EP EP95919820A patent/EP0757717B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 AU AU25495/95A patent/AU693203B2/en not_active Expired
- 1995-05-15 PL PL95317234A patent/PL183781B1/pl unknown
- 1995-05-15 CZ CZ963366A patent/CZ336696A3/cs unknown
- 1995-05-15 BR BR9507657A patent/BR9507657A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-05-15 SK SK1476-96A patent/SK147696A3/sk unknown
- 1995-05-15 PT PT95919820T patent/PT757717E/pt unknown
- 1995-05-15 CA CA002189882A patent/CA2189882C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 WO PCT/US1995/006006 patent/WO1995031532A1/en active IP Right Grant
- 1995-05-15 CN CN95194158A patent/CN1152935A/zh active Pending
- 1995-05-15 RO RO96-02165A patent/RO117541B1/ro unknown
- 1995-05-15 ES ES95919820T patent/ES2264126T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 RU RU96123707/13A patent/RU2206608C2/ru active
- 1995-05-15 DK DK95919820T patent/DK0757717T3/da active
- 1995-05-15 MX MXPA96005662A patent/MXPA96005662A/es active IP Right Grant
- 1995-05-15 DE DE69535018T patent/DE69535018T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-02 NZ NZ285941A patent/NZ285941A/en not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-11-12 BG BG100974A patent/BG100974A/xx unknown
- 1996-11-15 NO NO19964862A patent/NO322133B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-11-15 FI FI964592A patent/FI119815B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK0757717T3 (da) | 2006-09-25 |
DE69535018T2 (de) | 2007-02-15 |
AU693203B2 (en) | 1998-06-25 |
EP0757717B1 (en) | 2006-05-31 |
PL183781B1 (pl) | 2002-07-31 |
CA2189882C (en) | 2005-09-20 |
CN1152935A (zh) | 1997-06-25 |
BR9507657A (pt) | 1997-09-09 |
NO964862D0 (no) | 1996-11-15 |
NZ285941A (en) | 1998-05-27 |
NO964862L (no) | 1997-01-16 |
AU2549595A (en) | 1995-12-05 |
ES2264126T3 (es) | 2006-12-16 |
HUT76354A (en) | 1997-08-28 |
WO1995031532A1 (en) | 1995-11-23 |
ATE328068T1 (de) | 2006-06-15 |
EP0757717A4 (en) | 1998-04-15 |
HU9603155D0 (en) | 1997-01-28 |
EP0757717A1 (en) | 1997-02-12 |
JPH10500847A (ja) | 1998-01-27 |
FI119815B (fi) | 2009-03-31 |
PT757717E (pt) | 2006-09-29 |
SI0757717T1 (sl) | 2006-08-31 |
CA2189882A1 (en) | 1995-11-23 |
DE69535018D1 (de) | 2006-07-06 |
CZ336696A3 (en) | 1997-07-16 |
BG100974A (en) | 1998-04-30 |
SK147696A3 (en) | 1997-08-06 |
FI964592A0 (fi) | 1996-11-15 |
JP3863559B2 (ja) | 2006-12-27 |
PL317234A1 (en) | 1997-03-17 |
FI964592A (fi) | 1996-11-15 |
RU2206608C2 (ru) | 2003-06-20 |
MXPA96005662A (es) | 2004-08-19 |
RO117541B1 (ro) | 2002-04-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0757717B1 (en) | Papillomavirus vaccines | |
JP3918877B2 (ja) | ヒトパピローマウイルス11型l1タンパク質をコードする合成hpv6/11ハイブリッドl1 dna | |
US5821087A (en) | Production of recombinant human papillomavirus type II protein utilizing papillomavirus 6/11 hybrid DNA | |
EP0789767B1 (en) | A method for producing purified papillomavirus proteins | |
EP0973546B1 (en) | Stabilized human papillomavirus formulations | |
EP0817851B9 (en) | Dna encoding human papilloma virus type 18 | |
US5888516A (en) | Recombinant papillomavirus vaccines | |
WO1996015247A9 (en) | Purified papillomavirus proteins | |
CA2204266C (en) | Purified papillomavirus proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |