NO322133B1

NO322133B1 - Fremgangsmate for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus.

Info

Publication number: NO322133B1
Application number: NO19964862A
Authority: NO
Inventors: Kathrin Ute Jansen; Iii James C Cook; Hugh A George; Kathryn J Hofmann; Joseph G Joyce; Ernest Dale Lehman; Henry Z Markus; Mark Rosolowsky; Loren D Schultz
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1994-05-16
Filing date: 1996-11-15
Publication date: 2006-08-21
Also published as: DK0757717T3; DE69535018T2; AU693203B2; EP0757717B1; PL183781B1; CA2189882C; CN1152935A; BR9507657A; NO964862D0; NZ285941A; NO964862L; AU2549595A; ES2264126T3; HUT76354A; WO1995031532A1; ATE328068T1; EP0757717A4; HU9603155D0; EP0757717A1; JPH10500847A

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus.

Oppfinnelsens bakgrunn

Papillomavirusinfeksjoner forekommer hos mange forskjellige dyr, inkludert mennesker, sauer, hunder, katter, kaniner, aper, slanger og kuer. Papillomavirus infiserer epitelceller og induserer generelt benigne epiteltumorer eller fibroepiteltumorer på infeksjonsstedet. Papillomavirus er artsspesifikke, infeksiøse materialer; et humant papillomavirus kan ikke infisere et ikke-humant dyr.

Papillomavirus kan klassifiseres i atskilte grupper basert på verten som de infiserer. Humane papillomavirus (HPV) klassifiseres videre i flere enn 60 typer basert på DNA-sekven-shomologi (for en oversikt, se Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (red.), CRC Press, Inc., 1990). Papillomavirustyper synes å være typespesifikke immunogener ved at en nøytraliserende immunitet overfor infeksjon av én type papillomavirus ikke gir immunitet overfor en annen type papillomavirus .

Hos mennesker forårsaker forskjellige HPV-typer forskjellige sykdommer. HPV-typer 1, 2, 3, 4, 7, 10 og 26-29 forårsaker benigne vorter hos både normale og immunkompromitterte individer. HPV-typer 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 og 46-50 forårsaker flate lesjoner hos immunkompromitterte individer. HPV-typer 6, 11, 34, 39, 41-44 og 51-55 forårsaker ikke-maligne kondylomer i de genitale eller respiratoriske slimhinner. HPV-typer 16 og 18 forårsaker epiteldysplasi av genitalslimhinnen og er forbundet med hovedmengden av in situ og invasive karsinomer i cervix, vagina, vulva og analkanalen. HPV6 og HPV11 er årsakene til mer enn 90% av alle kondylomer (genitalvorter) og laryngealpapillomer. Den hyppigst forekommende undertype av HPV type 6 er HPV6a.

Immunologiske undersøkelser i dyr har vist at produksjonen av nøytraliserende antistoffer mot papillomavirusanti-gener forhindrer infeksjon av et homologt virus. Utviklingen av effektive papillomavirusvaksiner er blitt forsinket på grunn av vanskeligheter forbundet med dyrkning av papillomavirus in vitro. Utviklingen av en effektiv HPV-vaksine er blitt spesielt forsinket på grunn av fraværet av en egnet dyremodell.

Nøytralisering av papillomavirus ved hjelp av antistoffer synes å være typespesifikk og avhengig av tilpassede epitoper på overflaten av viruset.

Papillomavirus er små (50-60 nm) , ikke-innkapslede, tyveflatede DNA-virus som koder for opptil åtte tidlige og to sene gener. De åpne avlesningsrammer (ORF) i virusgenomene er betegnet El til E7 og LI og L2, hvor "E" betegner tidlig og "L" betegner sen. Li og L2 koder for viruskapsidproteiner. De tidlige (E) gener er forbundet med funksjoner som virusrepli-kasjon og cellulær transformasjon.

Ll-proteinet er det viktigste kapsidprotein og har en molekylvekt på 55-60 kDa. L2-proteinet er et mindre kapsidprotein med en antatt molekylvekt på 55-60 kDa og en tilsynelatende molekylvekt på 75-100 kDa, som bestemt ved polyakryl-amidgelelektroforese. Immunologiske data antyder at det meste av L2-proteinet er internt i forhold til Ll-proteinet. L2-proteinene er konservert i høy grad blant forskjellige papillomavirus, spesielt de ti basiske aminosyrer ved C-terminalen. Li ORF er konservert i høy grad blant forskjellige papillomavirus.

LI- og L2-genene er blitt anvendt for å fremstille vaksiner for forebyggelse og behandling av papillomavirusinfeksjoner i dyr. Zhou et al. (Virology, 185(1), 1991, 251-257; Virology, 189, 1992, 592-599) klonet HPV type 16 Li- og L2-gener i en vacciniavirusvektor og infiserte CV-l-pattedyrceller med den rekombinante vektor for å produsere viruslignende partikler

(VLP).

Bakterielt avledet, rekombinant, bovint papillomavirus LI og L2 er blitt fremstilt. Nøytraliserende sera mot de rekombinante bakterieproteiner kryssreagerte med nativt virus ved lave nivåer, antakelig på grunn av forskjeller i konformasjonene av de native og bakterielt avledede proteiner.

Rekombinante baculovirus som uttrykker HPV6 LI, HPV11 LI, HPV16 LI, HPV18 LI, HPV31 Li eller HPV16 L2 ORF, er blitt anvendt for å infisere SF9-insektsceller og produsere Li- og Ll-proteiner. Western blot-analyser viste at de baculovirusavledede LI- og L2-proteiner reagerte med antistoff mot HPV16. Baculo-viruset avledet Ll-former VLP.

Carter et al. (Virology, 182(2), 1991, 513-521) demonstrerte produksjon av HPV16 LI- og HPV16 L2-proteiner ved hjelp av rekombinante stammer av Saccharomyces cerevisiae. Carter et al. demonstrerte også produksjon av HPV6b LI- og L2-proteiner. HPV6b Ll-proteinet var ikke fullengde Ll-protein. De rekombinante proteiner ble produsert som både intracellulære og som utskilte produkter. De rekombinante Li- og L2-proteiner hadde lignende molekylvekter som de native proteiner. Når proteinene ble uttrykt intracellulært, ble hovedmengden av proteinet funnet å være uoppløselig når cellene ble lysert i fravær av denatureringsreagenser. Selv om denne uoppløselighet kan lette rensing av proteinet, kan den hindre analyse av de native epitoper av proteinet.

Rekombinante proteiner utskilt fra gjær, ble vist å inneholde gjæravledede karbohydrater. Tilstedeværelsen av disse N-bundne oligosakkarider kan maskere native epitoper. De utskilte, rekombinante proteiner kan dessuten inneholde andre modifikasjoner, slik som retensjon av den sekretoriske leder-sekvens.

I WO 87/01375 (Institut Pasteur and Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) beskrives fremstillingen av HPV L2-, E6- og E7-proteiner.

I EP-A-0256321 (Behringwerke Aktiengesellschaft) beskrives DNA- og aminosyresekvensene til HPV18.

I Kirnbauer et al., Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 89, 1992, 12180-12184, beskrives effekten av å uttrykke Ll-proteinet i HPV og bovint PV i insektceller via en baculovirusvektor, og at Ll-protein setter seg selv sammen slik at det dannes et VLP.

Hagensee et al., Journal of Virology, 67(1), 1993, 315-322, beskriver selvsammensetningen av HPVl-kapsider ved hjelp av ekspresjonen av LI- eller LI- og L2-protein.

Rose et al., Journal of Virology, 67(4), 1993, 1936-1944, beskriver ekspresjonen av Ll-proteinet i HPVll i Sf-9-insektceller med den rekombinante baculovirusvektoren Acll Li, og identifikasjonen av VLP-er i de infiserte Sf-9-celler.

Zhou et al., Virology, 185(1), 1991, 251-257, beskriver at ekspresjonen av vaccinia rekombinant HPV16 LI- og L2 ORF-proteiner i epitelceller er tilstrekkelig for sammensetningen av HPV VLP-er.

Kirnbauer et al., Journal of Virology, 67(12), 1993, 6929-6936, beskriver selvsammensetningen av HPV16 og LI og L1-L2 til VLP-er.

I WO 94/00152 (Georgetown University) beskrives rekombinant produsert Ll-protein som etterligner konformasjonelle nøytraliserende epitoper på human- og dyrevirioner.

I WO-A-9405792 (The Government of the United States of America as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services), beskrives selvsammensetningen av rekombinante papilomavirus-capsidproteiner ved anvendelse av insekt- eller gjærceller som vertsceller.

I WO-A-9302184 (The University of Queensland and CLS Limited (sic)) beskrives en fremgangsmåte for å tilveiebringe papilloma-VLP-er for anvendelse ved diagnostiske formål eller inkorporering i en vaksine, for anvendelse i forhold til infeksjoner forårsaket av pipillomavirus, fra LI- eller Li- og L2-proteiner.

Det ville være nyttig å utvikle metoder for å produsere store mengder papillomaproteiner av enhver art og type ved dyrkning av rekombinant gjær. Det ville også være nyttig å produsere store mengder papillomavirusproteiner med samme immunitetsover-førende egenskaper som de native proteiner, slik som konformasjonen av det native protein.

Foreliggende oppfinnelse angår som nevnt fremgangsmåte for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus. Disse VLP-er er immunogene og forhindrer dannelse av vorter i en dyremodell. Foreliggende oppfinnelse anvender bomullshalekanin-papillomavirus (CRPV) og HPV type 6 (undertype 6a) som modellsystemer.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår som nevnt fremgangsmåte for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser en torettet gjærekspresjonsvektor anvendt for å uttrykke papillomavirus Li- og/eller L2-kapsidproteiner. Figur 2 viser ekspresjon av HPV6a LI i gjær (immunblot) . Figur 3 viser ekspresjon av HPV6a L2 i gjær. Immunblot av HPV6a L2 uttrykt i gjær; felt 1, molekylvektsmarkører; felt 2, trpE-L2-fusjonsprotein uttrykt i E. coli som positiv kontroll; felt 4, HPV6a LI uttrykt i gjær som negativ kontroll; felt 5, HPV6a L2 uttrykt i gjær (for eksperimentelle detaljer, se teksten). Figur 4 er et elektronmikroskopfotografi av HPV6a LI VLP uttrykt i gjær. Figur 5 er et elektronmikroskopfotografi av HPV6a L1/L2 VLP uttrykt i gjær. Figur 6: Immunblot av CRPV LI, L2, og Ll+L2-proteiner uttrykt i gjær. Felt (A) : Ekspresjon av CRPV LI som målt ved reaktivitet med anti-CRPV Ll-antiserum. Felt (B): Ekspresjon av CRPV L2 som målt ved reaktivitet med anti-CRPV L2-antiserum. Felt 1, molekylvektsmarkører i kDa ("Amersham Rainbow"-markører, 14 300-200 000 dalton); felt 2, BJ5462 inneholdende CRPV Ll-ekspresjonsvektoren; felt 3, stamme 1569 inneholdende CRPV L2-ekspresjonsvektoren; felt 4 og 5, to isolater av stamme 1569 kotransformert med to plasmider for ekspresjon av CRPV LI og CRPV L2; felt 6-8, tre isolater av stamme 1569 inneholdende en enkelt vektor for koekspresjon av CRPV LI- og L2-proteiner; felt 9 og 10, to isolater av BJ54 62 inneholdende en enkelt vektor for koekspresjon av CRPV LI- og L2-proteiner. Posisjonen for vandring av LI og L2 er markert på den høyre akse på figuren. Figur 7 er en skjematisk oversikt over konstruksjonen av S. cerevisiae stamme 1558. Figur 8 er en skjematisk oversikt over konstruksjonen av S. cerevisiae stamme 1569. Figur 9 viser hovedtrinn i en rensningsprosedyre.

Figur 10 er en liste over stammer.

Figur 11 viser sett av SDS-PAGE-analyser av HPV16 L1+L2 renset fra gjær. I tillegg til det ferdig rensede VLP er rester fra mellomliggende trinn i rensingsprosessen inkludert. Tabellen tilveiebringer identifikasjon av prøven i hvert felt. En gel farget med kolloidal Coomassie så vel som Western blots probet med antisera mot LI- og L2-proteiner, er inkludert. Figur 12 er en skjematisk oversikt over alternative rensingsprosesser for bomullshalekanin-papillomavirus LI. Figur 13 og 14 er SDS/PAGE-analyser av renset VLP.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus, kjennetegnet ved at: a) en gjær transformeres med et DNA-molekyl, hvor DNA-molekylet koder for HPV-L1- eller HPV-Ll+L2-proteiner, hvorved

det fremstilles en transformert gjærcelle,

b) den transformerte celle dyrkes under betingelser som muliggjør fremstilling av rekombinante proteiner og deres

spontane sammensetning til VLP-er, og

(c) VLP-ene innhøstes fra den transformerte celle og

(d) VLP-ene renses ved hjelp av ionebytterkromatografi og størrelsesutelukkelseskromatografi.

Fremgangsmåten er basert på produksjon av rekombinante Ll-eller rekombinante LI- og L2-proteiner i gjær. De rekombinante proteiner er i stand til å etterligne konformasjonen av de nøytraliserende epitoper i nativt PV. De rekombinante LI- eller Li- og L2-proteiner danner viruslignende partikler (VLP). VLP-ene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i farmasøytiske preparater, farmasøytiske preparater, vaksinepreparater, immunogene preparater og diagnostiske sett. De rekombinante VLP-er eller preparatene kan administreres til et dyr, inkludert, men ikke begrenset til mennesker. Egnede vertsceller inkluderer, men er ikke begrenset til, gjærstammer av slektene Saccharomyces, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharo-myces og Hansenula.

Papillomavirusinfeksjoner forekommer hos mange forskjellige dyr, inkludert mennesker, sauer, hunder, katter, kaniner, aper, slanger og kuer. Papillomavirus infiserer epitelceller og induserer generelt benigne epiteltumorer eller fibroepiteltumorer på infeksjonsstedet.

Papillomavirus kan klassifiseres i atskilte grupper basert på verten de infiserer. Humane papillomavirus (HPV) klassifiseres videre i mer enn 60 typer basert på DNA-sekvens-homologi (for en oversikt, se Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (red.), CRC Press, Inc., 1990). Papillomavirustyper synes å være typespesifikke immunogener ved at en nøytraliserende immunitet overfor infeksjon av én type papillomavirus ikke gir immunitet mot en annen type papillomavirus.

Hos mennesker forårsaker forskjellige HPV-typer forskjellige sykdommer. HPV-typer 1, 2, 3, 4, 7, 10 og 26-29 forårsaker benigne vorter i både normale og immunkompromitterte individer. HPV-typer 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 og 46-50 forårsaker flate lesjoner i immunkompromitterte individer. HPV-typer 6, 11, 34, 39, 41-44 og 51-55 forårsaker ikke-maligne kondylomer i de genitale og respiratoriske slimhinner. HPV-typer 16 og 18 forårsaker epiteldysplasi i genitalkanalen og er forbundet med hovedmengden av in situ og invasive karsinomer i cervix, vagina, vulva og analkanalen. HPV6 og HPV11 forårsaker hovedmengden av genitalvorter og laryngealpapillomer.

Immunologiske undersøkelser i dyr har vist at produksjonen av nøytraliserende antistoffer mot papillomaviruskap-sidproteiner forhindrer infeksjon av det homologe virus. Utviklingen av effektive papillomavirusvaksiner er blitt forsinket på grunn av vanskeligheter forbundet med dyrkning av papillomavirus in vitro. Utviklingen av en effektiv HPV-vaksine er spesielt blitt forsinket på grunn av fravær av en egnet dyremodell.

Nøytralisering av papillomavirus med antistoffer synes å være typespesifikk og avhenger av tilpassede epitoper på overflaten av viruset.

Papillomavirus er små (50-60 nm) , ikke-innkapslet, tyveflatede DNA-virus som koder for opptil 8 tidlige og to sene gener. De åpne avlesningsrammer (ORF) i virusgenomene er betegnet El til E7 og LI og L2, hvor "E" betegner tidlig og "L" betegner sen. LI og L2 koder for viruskapsidproteiner. De tidlige (E) gener er forbundet med funksjoner som virusrepli-kasjon og transformasjon.

Ll-proteinet er det viktigste kapsidprotein og har en molekylvekt på 55-60 kDa. L2-protein er et mindre kapsidprotein med en antatt molekylvekt på 55-60 kDa og en tilsynelatende

o

molekylvekt på 75-100 kDa som bestemt ved polyakryl-amidgelelektroforese.

Produksjon av HPV16 LI, HPV16 L2 og HPV type 6 Ll-proteiner ved hjelp av rekombinante stammer av Saccharomyces cerevisiae er blitt rapportert. Det ville være nyttig å utvikle fremgangsmåter for fremstilling av store mengder papillomavirusproteiner av enhver art og type ved dyrkning av rekombinant gjær. Det ville også være nyttig å produsere store mengder papillomavirusproteiner med samme immunoverførende egenskaper som de native proteiner, slik som konformasjonen av det native protein.

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av rekombinante papillomavirusproteiner med samme immunoverførende egenskaper som de native papillomavirusproteiner. Foreliggende oppfinnelse angår spesielt produksjonen av en profylaktisk vaksine mot papillomavirusinfeksjon. Foreliggende oppfinnelse er eksemplifisert ved hjelp av bomullshalekanin-papillomavirus (CRPV) og humant papillomavirus type 6 (HPV type 6 eller HPV6) som modellsystemer. Eksemplifiseringen begrenser ikke rammen for foreliggende oppfinnelse som inkluderer andre typer og undertyper av papillomavirus (PV), inkludert, men ikke begrenset til HPV type 11, HPV type 16 og HPV type 18, så vel som HPV subtype 6a og HPV subtype 6b.

Farmasøytisk anvendelige preparater omfattende VLP kan formuleres i overensstemmelse med kjente metoder, slik som ved blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Eksempler på slike bærere og formuleringsmetoder kan finnes i Remington's Pharmaceutical Sciences. For å danne et farmasøytisk akseptabelt preparat som er egnet for effektiv administrering, vil slike preparater inneholde en effektiv mengde av VLP. Slike preparater kan inneholde VLP avledet fra mer enn én- type HPV.

Slike terapeutiske eller diagnostiske preparater administreres til et individ i mengder tilstrekkelige til å be-handle eller diagnostisere PV-infeksjoner. Den effektive mengde kan variere i overensstemmelse med mange forskjellige faktorer, slik som individets tilstand, vekt, kjønn og alder. Andre faktorer inkluderer administreringsmåten. Vanligvis vil preparatene administreres i doser som varierer fra ca. 1 ug til ca. 250 ug.

De farmasøytiske preparater kan gis til individet på mange forskjellige måter, slik som subkutant, topisk, oralt, mukosalt og intramuskulært.

Vaksinene omfatter VLP som inneholder de nødvendige antigene determinanter for å indusere dannelsen av nøytralis-erende antistoffer i verten. Slike vaksiner er også sikre nok til å kunne administreres uten fare for kliniske infeksjoner; de har ingen toksiske bivirkninger; de kan administreres på en effektiv måte; de er stabile; og de er forenlige med vaksine-bærere.

Vaksinene kan administreres på mange forskjellige måter, slik som oralt, parenteralt, subkutant, mukosalt eller intramuskulært. Den administrerte dose kan variere med individets tilstand, kjønn, vekt og alder; administreringsmåten; og typen PV inneholdt i vaksinen. Vaksinen kan anvendes i doseringsformer som kapsler, suspensjoner, eliksirer eller flytende løsninger. Vaksinen kan formuleres med en immunologisk akseptabel bærer.

Vaksinene administreres i terapeutisk effektive mengder, dvs. i mengder tilstrekkelige til å danne en immunologisk beskyttende respons. Den terapeutisk effektive mengde kan variere i overensstemmelse med typen PV. Vaksinen kan administreres i en enkelt dose eller i flere doser.

Det kan formuleres subvirale vaksiner for forebyggelse av PV-infeksjon. Det kan fremstilles enten monovalente eller multivalente PV-vaksiner. En monovalent HPV type 16-vaksine kan f.eks. fremstilles ved formulering av rekombinant HPV16 Ll-protein, eller LI- og L2-proteiner. En multivalent HPV-vaksine kan alternativt formuleres ved blanding av Li-, eller Li- og L2-proteiner, eller VLP fra forskjellige HPV-typer.

De rekombinante VLP-er fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved formulering av immunogene preparater. Slike preparater, når de innføres i en egnet vert, er i stand til å indusere en immunologisk respons i verten.

De rekombinante VLP-er kan anvendes for å danne antistoffer. Betegnelsen "antistoff" som anvendt heri, inkluderer både polyklonale og monoklonale antistoffer, så vel som fragmenter derav, slik som Fv-, Fab- og F(ab)2-fragmenter som er i stand til å binde antigen eller hapten.

De rekombinante VLP-er kan anvendes for å serumtype-bestemme HPV-infeksjon og HPV-screening. De rekombinante VLP-er og antistoffer kan anvendes for formulering av sett egnet for påvisning og serumtypebestemmelse av HPV. Et slikt sett vil omfatte en rominndelt bærer som er egnet til å oppbevare minst én tett tillukket beholder. Bæreren vil ytterligere omfatte reagenser som rekombinant HPV-protein eller VLP, eller anti-HPV-antistoffer egnet for påvisning av mange forskjellige HPV-typer. Bæreren kan også inneholde midler for påvisning, slik som merket antigen eller enzymsubstrater eller lignende.

De rekombinante VLP-er fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er også anvendelige som molekylvektsmarkører og molekylstørrelsesmarkører.

De følgende eksempler tilveiebringes for ytterligere

å definere foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Fremstilling av gjærstamme U9

Saccharomyces cerevisiae stamme 2150-2-3 (MATa, leu2-04, adel, cir°) ble erholdt fra dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA). Celler av stamme 2150-2-3 ble formert over natten ved 30 °C i 5 ml YEHD-medium (Carty et al., J. Ind. Micro. 2 (1987) 117-121). Cellene ble vasket tre ganger i sterilt, destillert vann, resuspendert i 2 ml sterilt, destillert vann, og 0,1 ml cellesuspensjon ble utspredt på hver av seks 5-fluororotsyre(FOA)plater for å utvelge ura3-mutanter (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Platene ble inkubert ved 30 °C. Mediet inneholdt pr. 250 ml destillert vann: 3,5 g Difco gjær-nitrogen-base uten aminosyrer og ammoniumsulfat; 0,5 g 5-fluororotsyre;

25 mg uracil og 10,0 g dekstrose.

Mediet ble sterilisert ved filtrering gjennom 0,2 um membraner og deretter blandet med 250 ml 4% "Bacto-Agar"

(Difco) opprettholdt ved 50 °C, 10 ml av en 1,2 mg/ml løsning

av adenin og 5 ml L-leucinløsning (180 mg/50 ml). Det resulterende medium ble applisert på petriskåler i mengder på 20 ml pr. skål.

Etter 5 dagers inkubasjon var et stort antall kolonier fremkommet. Enkle kolonier ble isolert ved å strekover-føre kolonier fra de opprinnelige FOA-plater til nye FOA-plater som deretter ble inkubert ved 30 "C. Et antall kolonier fra det andre sett av FOA-plater ble testet for tilstedeværelse av ura3-mutasjonen ved kopiutspredning på både YEHD-plater og uracil-minus-plater. Det ønskede resultat var god vekst på YEHD og ingen vekst på uracil-minus-medium. Ett isolat (U9) ble erholdt som viste disse egenskaper. Det ble lagret som en frossen glyserolporsjon (stamme nr. 325) ved

-70 °C for senere anvendelse.

Eksempel 2

Fremstilling av en vektor for avbrytelse av gjær MNN9- genet

For å fremstille en vektor for avbrytelse av MNN9-genet var det først nødvendig å klone MNN9-genet fra S. cerevisiae-genomisk DNA. Dette ble oppnådd ved hjelp av standard polymerasekjedereaksjon(PCR)teknologi. En 5'-sense-primer og 3'-antisense-primer for PCR av den uforkortede MNN9-kodings-sekvens ble utformet basert på den publiserte sekvens for gjær MNN9-genet (Zymogenetics: EPO patentsøknad nr. 88117834.7, publikasjonsnr. 0-314-096-A2). De følgende oligodeoksynukleotidprimere inneholdende flankerende Hindlll-seter (understreket), ble anvendt:

Det innledende metioninkodon for MNN9-genet er fremhevet med fet skrift. PCR ble utført ved anvendelse av genomisk DNA fra S. cerevisiae stamme JRY188 som templat, Taq-DNA-polymerase (Perkin Eimer) og 25 amplifikasjonssykluser (94 "C 1 min., 37 °C 2 min., 72 °C 3 min.). Det resulterende 1,2 kbp PCR-fragment ble spaltet med Hindlll, gelrenset og ligert med Hindlll-spaltet, alkalisk fosfatasebehandlet pUC13 (Pharmacia). Det resulterende plasmid ble betegnet pll83.

For å avbryte MNN9-genet med gjær URA3-genet ble plasmid pBR322-URA3 (som inneholder 1,1 kbp Hind III-fragmentet som koder for S. cerevisiae URA3-genet subklonet i Hindlll-setet av pBR322) spaltet med Hindlll, og det 1,1 kbp DNA-fragment med det funksjonelle URA3-gen ble gelrenset, gjort buttendet med T4-DNA-polymerase og deretter ligert med Pmll-spaltet plasmid pll83 (PmlI-spaltninger innen MNN9-kodingssekvensen). Det resulterende plasmid pll99 inneholder et avbrudd i MNN9-genet med det funksjonelle URA3-gen.

Eksempel 3

Konstruksjon av U9- derivat stamme 1372 inneholdende avbrudd i MNN9- genet

For avbrytelse av MNN9-genet i stamme U9 (nr. 325) ble 30 ug plasmid pll99 spaltet med Hindi 11 for å danne en lineær mnn9: :URA3-avbrytelseskassett. Celler av stamme 325 ble transformert med det Hindlll-spaltede pll99-DNA ved hjelp av sferoplastmetoden (Hinnen et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 5:1929-1933), og transformanter ble utvalgt på et syntetisk agarmedium som manglet uracil og inneholdt 1,0 M sorbitol. Det syntetiske medium inneholdt pr. liter destillert vann: agar, 20 g; gjærnitrogenbase uten aminosyrer, 6,7 g; adenin, 0,04 g; L-tyrosin, 0,05 g; sorbitol, 182 g; glukose, 20 g og leucin minus-løsning nr. 2, 10 ml. Leucin minus-løsning nr. 2 inneholder pr. liter destillert vann: L-arginin, 2 g; L-histidin, 1 g; L-leucin, 6 g; L-isoleucin, 6 g; L-lysin, 4 g; li-met ionin, 1 g; L-fenylalanin, 6 g; L-treonin, 6 g; L-tryptofan, 4 g.

Platene ble inkubert ved 30 °C i 5 dager ved hvilket tidspunkt et stort antall kolonier var fremkommet. Kromosomale DNA-preparater ble fremstilt fra 10 kolonier og deretter spaltet med EcoRI pluss Hindlll. DNA-spaltningsproduktene ble deretter evaluert ved hjelp av Southern blots (J. Sambrook et

al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) under anvendelse av

1,2 kbp Hindlll-fragmentet inneholdende MNN9-genet (isolert fra plasmid pll99) som en probe. Det ble identifisert et isolat (stamme nr. 1372) som viste de forventede DNA-båndskift på Southern blot, så vel som den ekstreme klumpethet som typisk

13

vises av MNN9-mutanter.

Eksempel 4

Konstruksjon av en vektor for avbrytelse av g- jær- HTS3- qenet

For å konstruere en avbrytelseskassett hvori S. cerevisiae HIS3-genet er avbrutt av 0RA3-genet, ble plasmid YEp6

(K. Struhl et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 76:1035)

spaltet med BamHI. 1,7 kbp BamHI-fragmentet inneholdende HIS3-genet, ble gelrenset, gjort buttendet med T4 DNA-polymerase og ligert med pUClB som tidligere var spaltet med BamHI og behandlet med T4 DNA-polymerase. Det resulterende plasmid (betegnet pl501 eller pUC18-HIS3) ble spaltet med Nhel (som spalter i HIS3-kodingssekvensen), og vektor fragmentet ble gelrenset, gjort buttendet med T4 DNA-polymerase og deretter behandlet med kalvetann-alkalisk fosfatase. URA3-genet ble isolert fra plasmid pBR322-URA3 ved spaltning med Hindlll, og 1,1 kbp-fragmentet inneholdende URA3-genet, ble gelrenset, gjort buttendet med T4 DNA-polymerase og ligert med det ovenfor angitte pUCl8-HIS3-Nhel-fragment. Det resulterende plasmid (betegnet pUC18-his3: :URA3 eller pl505) inneholder en avbrytelseskassett hvori gjær-HIS3-genet er avbrutt av det funksjonelle URA3-gen.

Eksempel 5

Konstruksjon av vektor av avbrytelse av gjær PRBl- aen med HIS3- genet

Plasmid FP8ÅH inneholdende S. cerevisiae PRB1-genet, ble tilveiebrakt av dr. E. Jones, Carnegie-Mellon Univ. (CM. Moehle et al., 1987; Genetics 115:255-263). Det ble spaltet med Hindlll pluss Xhol, og 3,2 kbp DNA-fragmentet inneholdende PRB1-genet, ble gelrenset og gjort buttendet med behandling med T4 DNA-polymerase. Plasmid pUC18 ble spaltet med BamHI, gelrenset og gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase. Det resulterende vektor fragment ble ligert med det ovenfor angitte PRBl-genfragment for å gi plasmid pUC18-PRBl. Plasmid YEp6 som inneholder HIS3-genet, ble spaltet med BamHI. Det resulterende 1,7 kbp BamHI-fragment inneholdende det funksjonelle HIS3-gen, ble gelrenset og deretter gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase. pUC18-PRBl ble spaltet med EcoRV pluss Ncol som spalter innen PRBl-kodingssekvensen og fjerner det protease B-aktive sete og flankeringssekvensen. 5,7 kbp EcoRV-NcoI-fragmentet som inneholder de resterende 5'-og 3'-deler av PRBl-kodingssekvensen i pUC18, ble gelrenset, gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase, defosforylert med kalvetarm-alkalisk fosfatase og ligert med det buttendete HIS3-fragment beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid (betegnet pUC18-prbl::HIS3, parti nr. 1245) inneholder det funksjonelle HIS3-gen istedenfor delen av PRBl-genet som var blitt delert ovenfor.

Eksempel 6

Konstruksjon av en U9- beslektet <q>jærstamme inneholdende av-brytelser av både MNN9- og PRB1- genene

Den U9-beslektede stamme 1372 som inneholder et MNN9-genavbrudd, ble beskrevet i eksempel 3. Kloningsisolater av stamme 1372 ble overført på FOA-plater for å utvelge ura3-mutanter. Et antall ura3-isolater av.stamme .1372 ble erholdt, og ett isolat (stamme 12930-190-S1-1) ble utvalgt for etter-følgende avbrytelse av HIS3-genet. pUC18-his3: :URA3-genavbryt-elsesvektoren (pl505) ble spaltet med Xbal pluss EcoRI for å danne en lineær his3: :URA3-avbrytelseskassett og anvendt for transformasjon av stamme 12930-190-S1-1 ved anvendelse av litiumacetatmetoden (Methods in Enzymology, 194:290 (1991). Ura<*->transformanter ble utvalgt på syntetisk agarmedium uten uracil, gjenutstreket for klonale isolater på det samme medium og deretter kopieringsutspredt på medium som manglet enten uracil eller histidin for å screene for de isolater som var både Ura<*> og His". Ett isolat (stamme 12930-230-1) ble utvalgt for etterfølgende avbrytelse av PRBl-genet. PRBl-genavbrytel-sesvektoren (pUC18-prbl::HIS3, parti nr. 1245) ble spaltet med SacI pluss Xbal for å danne en lindær prbl::HIS3-avbrytelseskassett og anvendt for transformasjon av stamme 12930-230-1 ved hjelp av litiumacetatmetoden. His<*->transformanter ble utvalgt på agarmedium uten histidin og ble gjenutstreket på det samme medium for klonale isolater. Genomisk DNA ble preparert fra et antall av de resulterende His<*->isolater, spaltet med EcoRI og deretter underkastet elektroforese på 0,8% agarose-geler. Southern blot-analyser ble deretter utført ved anvendelse av en radiomerket 617 bp probe for PRBl-genet som var blitt fremstilt ved hjelp av PCR ved anvendelse av de følgende oligodeoksynukleotidprimere:

Det ble erholdt 11 isolater som viste den forventede hybridisering av proben med et 2,44 kbp prbl::HIS3 DNA-fragment. Dette sto i motsetning til hybridisering av proben med 1,59 kbp-fragmentet for villtype PRBl-genet. Ett av disse isolater inneholdende den ønskede prbl::HIS3-avbrytelse, ble utvalgt for ytterligere anvendelse og ble betegnet stamme nr. 1558.

Eksempel 7

Konstruksjon av en vektor for avbrytelse av gjær PEP4- qen

S. cerevisiae PEP4-genet ble klonet fra et gjærgenom-bibliotek på følgende måte. E. coli-celler inneholdende gjær-genombiblioteket pLSlOl (Schultz og Friesen, 1983, J. Bac-teriol. 155:8-14) ble formert over natten i 5 ml LB-medium inneholdende 100 ug/ml ampicillin. Fra denne kultur ble IO"<4> og 10"<5> fortynninger utspredt på LB-pluss-ampicillin-plater. Kolonier ble løftet fra platene ved anvendelse av nitrocellulosefiltre. En 600 bp probe for gjær PEP4-genet ble fremstilt ved hjelp av PCR ved anvendelse av Taq DNA-polymerase, totalt plasmid-DNA fra pLSlOl-gjærbiblioteket og de følgende oligodeoksynukleotidprimere utformet basert på den publiserte DNA-sekvens for PEP4 (CA. Woolford et al., Mol. Cell. Biol. 6:2500 (1986)). <\>

PCR ble utført med 25 amplifikasjonssykluser (94 °C 1 min.,

37 °C 2 min., 72 "C 3 min.). PCR-proben ble gelrenset, radiomerket og hybridisert med de ovenfor angitte kolonifiltre. Flere kolonier var positive for hybridisering med PEP4-proben og ble gjenutstrøket på LB-pluss-ampicillinplater for enkle kolonier. Plasmid-DNA ble preparert ved hjelp av alkalisk SDS-lyse (Sambrook et al., supra) fra flere av isolatene og spaltet med BamHI. Det forventede 14 kbp vektorbånd og 6,9 kbp PEP4-innføyelsesbåndet ble observert. Ved dobbelt spaltning med EcoRI pluss Xhol ble det forventede 1,5 kbp bånd for PEP4 observert. Ett isolat (stamme nr. 860) som viste de forventede resultater, ble utvalgt for videre anvendelse. Plasmid-DNA fra stamme nr. 860 ble spaltet med BamHI, og det 6,9 kbp BamHI-DNA-fragment inneholdende det kromosomale PEP4-gen, ble subklonet i BamHI-setet av pUC13 for å gi plasmid p890. Plasmid p890 ble deretter spaltet med Ncol (som spalter innen PEP4-kodingssekvensen), gelrenset, gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase og ligert med det 1,1 kbp buttendete fragment inneholdende det funksjonelle URA3-gen (fremstilt som i eksempel 2). Det resulterende plasmid inneholdende PEP4-genet avbrutt av URA3-genet, ble betegnet pUC13-pep4::URA3 (stamme nr. 906).

Eksempel 8

Konstruksjon av gjærs tamme nr. 1569 som er et derivat av stamme U9 inneholdende både prbl- og pep4- mutasjoner

For å avbryte HIS3-genet i stamme U9 ble avbrytelses-vektoren pUC18-his3::URA3 spaltet med EcoRI pluss Xbal og deretter anvendt for å transformere stamme U9 ved hjelp av litiumacetatmetoden. Ura<+->transformanter ble utvalgt på agarmedium uten uracil og gjenutstrøket på det samme medium for klonale isolater. Et antall av de resulterende Ura<*->isolater ble deretter kopieringsutspredt på agarmedium som manglet enten uracil eller histidin og screenet for de isolater som var både Ura<*> og His-. Ett isolat (stamme nr. 1524) ble utvalgt for etterfølg-ende avbrytelse av PRBl-genet. PRBl-genavbry tel ses vektor en pUC18-prbl::HIS3 ble spaltet med SacI pluss Xbal og deretter anvendt for transformasjon med stamme nr. 1524 ved hjelp av litiumacetatmetoden. His<*->transformanter ble utvalgt på agarmedium uten histidin og gjenutstrøket for klonale isolater på det samme medium. Genomisk DNA ble preparert fra et antall av His<+->isolatene og evaluert ved hjelp av Southern blot-hybridisering med en radiomerket PRBl-probe. Ett av isolatene (stamme nr. 1537) som viste den ønskede avbrytelse av PRBl-genet med HIS3 (dvs. prbl::HIS3), ble utvalgt for etterfølgende avbrytelse av PEP4-genet. Stamme nr. 1537 ble overført på FOA-plater for å erholde ura3-isolater, og ett isolat (stamme nr. 1541) ble utvalgt for videre anvendelse.

For å avbryte PEP4-genet i stamme nr. 1541 ble PEP4-genavbrytelsesvektoren pUC13-pep4: :URA3 spaltet med Xhol for å danne en lineær pep4: :URA3-avbrytelseskassett og anvendt for transformasjon av stamme nr. 1541 ved hjelp av litiumacetatmetoden. Ura<*->transformanter ble utvalgt på uracil-minus-agarmedium og utstreket for klonale isolater på det samme medium. Genomisk DNA ble preparert fra et antall av Ura<*->transforman-tene og evaluert ved hjelp av Southern blots ved anvendelse av en radiomerket probe for PEP4-genet. Ett isolat (stamme nr. 1569) som viste den ønskede avbrytelse av PEP4-genet med URA3-genet, ble utvalgt for videre anvendelse.

Eksempel 9

Konstruksjon av CRPV LI- ekspresjonsvektor

CRPV LI-genet ble amplifisert ved hjelp av PCR fra plasmid pLAII som inneholdt det komplette CRPV-virusgenom (dr. Peter Howley, NCI) ved anvendelse av Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.); 35 amplifikasjonssykluser (94 °C,

1 min.; 50 °C, 1 min.; 72 °C, 2 min.), og de følgende oligonukleotidprimere som inneholder flankerende Bglll-seter (understreket), ble anvendt:

Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det innledende CRPV Ll-metioninkodon (fremhevet med fet skrift). 1,6 kb LI PCR-produktet ble spaltet med Bglll, gelrenset og subklonet i Bglll-setet av vektor pSP72 (Promega) for å gi plasmid pSP72-CRPV-Ll (P12930-314-4-1).

Én subklon ble sekvensert fullstendig og funnet å være forskjellige i 4 nukleotider i forhold til den publiserte CRPV Ll-sekvens. Endringene fører ikke til aminosyreendringer. Ll-genet ble spaltet fra pSP72-CRPV-Ll som et Bglll-fragment og subklonet i det unike BamHI-sete lokalisert mellom gjær-GAL10-promotoren og ADHl-transkripsjonstermina toren i gjær eks-presjonsvektoren pCl/l-GAL10p-ADHlt som inneholder GAL10-promotoren fra YEp52 (Broach et al., Exp. Manipulation of Gene Expression, 1983, 83:81-116) og ADHl-transkripsjonsterminatoren i en pCl/l-vektorryggrad). Det resulterende plasmid ble betegnet pl2930-323-6-l.

Eksempel 10

Konstruksjon av CRPV L2- ekspresjonsvektor

CRPV L2-genet ble amplifisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.) fra plasmid pLAIl etter spaltning av plasmidet med Sali, gelren-sing av det 7,9 kb fragment og ligering av dette med seg selv. Det ble anvendt 35 amplifikasjonssykluser (90 °C, 1 min.;

50 °C, 1 min.; 72 °C, 2 min.) og oligonukleotidprimere som inneholder flankerende EcoRI-seter (understreket):

Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det CRPV LI-innledende metioninkodon (fremhevet med fet skrift). 1,5 kb PCR-produktet ble spaltet med EcoRI, gelrenset og subklonet i EcoRI-setet av den toveis promotorvektor pUC18-GALlp-GAL10p inneholdende den divergente gjær GALl/GALlO-promotor. Denne vektor inneholder et unikt BamHI-sete mellom GALI-promotoren og en første kopi av ADHl-transkripsjonsterminatoren, unike EcoRI- og Smal-seter lokalisert mellom GALlO-promotoren, og en andre kopi av ADHl-transkripsjonsterminatoren. Den resulterende ekspresjonskassett bæres på et 1,4 kb SphI-fragment. Én klon (pl2930-295-2-2) inneholdende den ønskede L2-innføyelse tilstøtende GAL10-promotoren, ble fullstendig sekvensert og vist å inneholde 6 nukleotidendringer i forhold til den publiserte sekvens av hvilke 4 fører til aminosyreendringer. Sekvensanalyse av det opprinnelige templat-DNA bekreftet at endringene også var til stede i pLAII og ikke ble innført ved PCR. pUC18-GALlp-GAL10p-vektoren inneholdende L2-genet, ble spaltet med SphI og 2,9 kb-fragmentet inneholdende ADHlt-GALlp-GALl0p-L2-ADHlt-ekspre-sjonskassetten, ble ligert med det store Sphl-fragment av gjær-shuttlevektoren pCl/1. Det resulterende plasmid ble betegnet pl2930-323-2-3 (pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV-L2).

Eksempel 11

Ekspresjon av CRPV LI- oa CRPV L2- kapsidprotein i gjær

Plasmider pl2930-323-6-l og pl2930-323-2-3 (pCl/1-GALlOp-CRPV/Ll og pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV/L2) ble anvendt for å transformere S. cerevisiae- stammer nr. 1569, BJ5462 [E.W. Jones, Methods in Enzymology 194 (1991) 428-453] og BJ1995 [Jones, iJbid.]. Klonale isolater ble dyrket ved 30 °C i YEHD-medium inneholdende 2% galaktose i 48-72 timer. Etter innhøs-ting av cellene ble cellepelletene nedbrutt med glasskuler,

"Triton x-100" ble tilsatt til 0,5% sluttkonsentrasjon, og de resulterende cellelysater ble evaluert for ekspresjon av CRPV LI og L2 ved immunblotanalyser. Prøver inneholdende 40 ug totalt, cellulært protein, ble underkastet elektroforese på 12% Tris-glysingeler (Novex) under ^reduserende og denaturerende betingelser og elektroblottet på PVDF-membraner (Novex). CRPV LI- og L2-proteiner ble påvist ved anvendelse av polyklonale kanin-anti-Ll- eller anti-L2-antisera (gave fra dr.

John Kreider, Hershey Medical Center) som primære antistoffer, og protein A koblet til pepperrotperoksidase (Amersham, Inc.) som det andre antistoff. Membranene ble bearbeidet ved anven-deise av kjemilumlnescens "ECL"-påvisningssettet (Amersham, Inc.). Et 55-61 kDa Ll-proteinbånd ble påvist i alle prøver

som inneholdt Ll-ekspresjonsplasmidet, og et -90 kDa L2-proteinbånd ble påvist i alle prøver fra gjærkloner som inneholdt L2-ekspresj onsplasmidet.

Det ble ikke påvist noe signal i prøver avledet fra gjærkloner som inneholdt Ll-ekspresjonsplasmidet med anti-L2-antisera, eller vice versa.

Eksempel 12

A. Rensin<g> av rekombinant CRPV LI- kapsidprotein

Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt. Celler lagret ved -70 °C, ble tint og suspendert i et like stort volum "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2,

100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved hjelp av 10 passeringer i et mikrofluidiseringsapparat. Lysatet ble klaret ved sentr i fuger ing ved 5 000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% sukrose (vekt/volum) i Ll-buffer, og LI ble pelletert ved sentrifugering ved 100 000 x g i 4 timer. Pelleten ble resuspendert i 1/10 volum Ll-buf f er og klaret ved sentrifuger ing ved 5 000 x g i 10 minutter. "Tween-80" ble tilsatt til supernatanten til en sluttkonsentrasjon på 0,01% (volum/volum), og supernatanten ble fraksjonert ved romtemperatur ved størrelsesutelukkelses-kromatografi på en 1 700 ml kolonne (5 cm ID) "Sephacryl S-1000"-resin (Pharmacia). Elueringsbuffer for denne kolonne var 10 mM natriumfosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,01% (volum/volum) "Tween-80". Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale ved immun-dot blot, ble sammenslått og konsentrert til 1/6

volum ved ultrafiltrering ved anyendelse av en Amicon-omrørt celle med en YM-100 flatplatemembran med diameter 76 mm (100 000 MWCO). Produktet ble sterilfiltrert gjennom en "Millex-GV" 0,22 um membran (Millipore). Renset CRPV Ll-kapsidprotein ble adsorbert til aluminiumhydroksid ved en konsentrasjon på 100 ug/ml.

B. Karakterisering av rekombinant CRPV LI- kapsidprotein

Identiteten av sluttproduktet ble bekreftet ved Western-blotting og ved N-terminal sekvensanalyse. Renhet ble bestemt ved SDS/PA6E med Coomassie og sølvfarging og ved løs-ningssiling-kapillarelektroforese (SSCE) med optisk påvisning ved 215 nm. Preparatet var 75% rent LI bestemt ved SSCE.

Eksempel 13

Rensing av rekombinant CRPV L2- kapsidprotein

Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt. Celler lagret ved -70 "C, ble tint og suspendert i et like stort volum "Ll-buf f er" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2,

100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved 10 passeringer i et mikrofluidiseringsapparat. Lysatet ble klaret ved sentrifuger ing ved 5 000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% sukrose (vekt/volum) i LI-buffer, og L2 ble pelletert ved sentrifuger ing ved 100 000 x g i 4 timer. Pelleten ble resuspendert i 1/10 volum Ll-buffer. Den resuspenderte pellet ble klaret ved sentrifuger ing ved 5 000 x g i 10 minutter. "Tween-80" ble tilsatt til supernatanten til en sluttkonsentrasjon på 0,01% (volum/- volum), og supernatanten ble fraksjonert ved romtemperatur ved størrelsesutelukkelseskromatografi på en 1 700 ml kolonne

(5 cm ID) av "Sephacryl S-1000"-resin (Pharmacia). Elueringsbuffer for denne kolonne var 10 mM natriumfosfat, pH 7,2,

150 mM NaCl, 0,01% (volum/volum) "Tween-80". Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale ved immun-dot blot, ble sammenslått. Sammenslåtte fraksjoner ble analysert ved SDS/PAGE (sølv) og ved Western-blotting.

Eksempel 14

A. Rensing av rekombinant CRPV Ll- kapsidprotein- skiema 1

Celler lagret ved -70 "C, ble tint og suspendert i et like stort volum Breaking-buffer (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen til sluttkonsentrasjoner

på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved 10 passeringer i

et mikrofluidiseringsapparat. Lysatet ble klaret ved sentrifugering ved 5 000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% sukrose (vekt/volum) i Ll-buf f er, og LI ble pelletert ved sentr i fuger ing ved 100 000 x g i 4 timer. Pelleten ble resuspendert i 1/10 volum LI-buffer. Den resuspenderte pellet ble klaret ved sentrifuger ing ved 5 000 x g i 10 minutter. "Tween-80" ble tilsatt til supernatanten til en sluttkonsentrasjon på 0,01%, og supernatanten ble fraksjonert ved romtemperatur ved størrelsesutelukkelseskromatografi på en 1 700 ml kolonne (5 cm ID) av "Sephacryl S-1000"-resin (Pharmacia). Elueringsbuffer for denne kolonne var 10 mM natriumfosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,01% "Tween-80". Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale ved immun-dot blot-analyse, ble sammenslått og konsentrert til 1/6 volum ved ultrafiltrering ved anvendelse av en Amicon-omrørt celle med en YM-100 flatplatemembran med diameter 76 mm (100 000 MWCO). Produktet ble sterilfiltrert gjennom en "Mlllex-GV" 0,22 pm membran (Millipore).

B. Karakterisering av rekombinant CRPV Ll- kapsidprotein

Identiteten av sluttproduktet ble bekreftet ved Western-blotting og ved N-terminal sekvensanalyse. Renhet ble bestemt ved SDS/PAGE med Coomassie- og sølvfarging, og ved løsningssiling-kapillarelektroforese (SSCE) med optisk påvisning ved 215 nm. LI var 75% rent ved SSCE. Elektronmikroskopi viste at VLP i størrelsesområdet 50-55 nm diameter var til stede.

C. Analytisk størrelsesutelukkelses- HPLC

For å analysere for VLP ble prøver fraksjonert etter størrelse ved størrelsesutelukkelseskromatografi. Kromatogra-fien ble utført med en Perkin-Elmer serie 410 "Biopump HPLC" med en ISS 100-autoinjektor utstyrt med en 200 mikroliter in-jeksjonsløkke. Kolonnen var en TSK-gel G5000PW, 7,5 x 600 mm (T0S0HAAS, Montgomeryville, PA). For å overvåke eluering av protein fra kolonnen ble optisk påvisning ved 280 nm utført med en Perkin-Elmer LC-235 diodeseriedetektor. Den mobile fase var 0,5 M NaCl i 10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,2. Gjennom-strømningshastigheten var 0,5 ml/min., og det ble oppsamlet fraksjoner på 1 ml. Kolonnekalibrering ble utført med protein-standarder fra Sigma, så vel som rekombinant hepatitt B-overflateantigen ("Recombivax", Merck & Co., West Point, PA). Påvisning av antigen i fraksjoner oppsamlet under elueringen, ble utført ved immun-dot blot-analyse.

D. Immun- dot blot- analvse

En 10 pl prøve av hver fraksjon ble applisert på en strimmel av PVDF-membran ("Immobilon-P", Millipore Corp., Bed-ford, MA) som var fuktet på forhånd og var plassert på dampet blottingspapir. Prøven ble tillatt å trekke seg inn i membranen, og membranen ble plassert i en blokkeringsløsning (5%

(vekt/volum) tørrmelk uten fett oppløst i 0,15 M NaCl, 0,02%

(vekt/volum) natriumazid og 0,01 M natriumfosfat, pH 7,2) og inkubert ved romtemperatur under forsiktig omrøring i minimalt 3 timer. Blokkeringsløsningen ble dekantert og erstattet med en løsning av primært antistoff. Det anvendte, primære antistoff varierte avhengig av antigenet som skulle påvises: CRPV LI ble probet med kanin-anti-CRPV-serum "sen respons" (Biodesign International, Kennebunk, ME). CRPV L2 ble probet med kanin-anti-CRPV L2-serum. HPV6a LI ble probet med monoklonalt antistoff MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). HPV6a L2 ble probet med mus-anti-HPV6a L2-trpE-fusj onsserum.

Visualisering av immunkompleksene ble utført ved standardmetoder under anvendelse av et andre antistoff konju-gert til alkalisk fosfatase og det kromogene substrat NBT/-

BCIP.

E. Løsninassilinq- kapillarelektroforese ( SSCE)

Prøver av CRPV VLP (-0,2 mg/ml) ble oppvarmet i

15 minutter ved 100 °C i 1% 2-merke^ptoetanol og 1% (vekt/- volum) SDS. Prøven ble applisert elektrokinetisk sammen med en referansemarkør, mellittsyre, i et sammensmeltet silisiumok-sidkapillær, 42 cm (22 cm til detektor) x 0,05 mm I.D., for-håndsekvilibrert med 10 kapillarvolumer 0,1 N NaOH, vann og "ProSort" silingsreagens (Applied Biosystems, Foster City, CA). En separasjonsspenning på 300 volt/cm ble påført ved anvendelse av Applied Biosystems modell 270A-HT CE-instrument.

Prøveeluering ble overvåket ved absorbans ved 215 nm, og data ble oppsamlet ved anvendelse av Nelson Turbochrom 3 software.

F. Fremstilling av vaksine fra rekombinant CRPV LI- kapsidprotein

Renset CRPV LI-kapsidprotein ble adsorbert til Al(OH)3 ved en konsentrasjon på 100 ug/ml.

Eksempel 15

Beskyttelse mot papillomautviklina forårsaket av CRPV ved vak-sinasjon med o- faeravledet CRPV LI VLP 5 hvite New Zealand-kaniner ble immunisert intramuskulært med 135 mg LI VLP (75% rent, se eksempel 17) adsorbert til alun eller 100 mg rekombinant hepatitt B-overflateantigen (99% rent) adsorbert til aluminiumhydroksid som en negativ kontroll. Dyrene mottok ytterligere 2 injeksjoner i løpet av 8 uker før de ble utfordret med CRPV 10 dager etter den siste injeksjon. Sera uttatt før immunisering, ved hver injeksjon og før utfordring, ble analysert ved hjelp av en LI-VLP-spesifikk ELISA. Bn indirekte ELISA-analyse ble anvendt for & bestemme serumantistof f responser mot gjærutt rykte CRPV LI VLP. De anvendte antigener i ELISA var CRPV LI VLP uttrykt i insektsceller med et rekombinant baculovirus vesentlig som beskrevet av Christensen et al. (J. Virol. 64:3151-3156, 1990; J. Gen. Virol. 75:2271-2276 (1994)). Geit-anti-kanin-IgG-alkalisk fosfatase ble anvendt som et andre antistoff og p-nitrofenylfos-fat som substrat (Kirkegaard og Perry Labs., Inc.). Absorbans ble målt ved 405 nm. Titeren ble bestemt ved endepunktsfortyn-ning (3 gangers fortynninger av sera med start ved 1:100) og ble betraktet som positiv dersom den LI-spesifikke absorbans overskred de gjennomsnittlige absorbansavlesninger pluss to standardavvik for kanin-preimmunsera. Nøyaktige titere ble beregnet fra disse data ved anvendelse av SOFTmax-programmet, versjon 2.3 (Molecular Devices Inc., Menlo Park, CA).

Anti-Ll VLP-antistofftitere var til stede 4 uker etter den første immunisering, og de Økte med hver ytterligere injeksjon. Kontrolldyr var negative. 6 uker etter CRPV-utfordring var de vaksinerte dyr vortefrie på 15 av 15 steder (1:2 fortynnet eller 1:12 fortynnet virusstamløsning) mens kon-trolldyrene viste vortedannelse på 12 av 15 steder (1:2 fortynnet virus) eller 9 av 15 (1:12 fortynnet virus). Etter 15 uker var de vaksinerte dyr fremdeles vortefrie.

Virusnøytraliseringsanalyser ble utført (i det vesentlige i overensstemmelse med metoden ifølge Christensen et al., 1991, Virology 181:572-579) ved å blande kaninsera med CRPV og deretter utfordre kaniner med behandlede CRPV. Stand-arden for bestemmelse av nøytraliserende antistoff var fullstendig virusnøytralisering (3/3 steder negative med hensyn til vortedannelse). Sera fra de 5 vaksinerte dyr og 5 kontrolldyr ble analysert. Sera oppsamlet etter 1 dose av CRPV LI VLP, inneholdt antistoffer som fullstendig nøytraliserte ufor-tynnet virus i 80% av kaninene (4/5). Etter 2 eller 3 doser av CRPV LI VLP hadde 100% av kaninene (5/5) virusnøytraliserende antistoffer. Kontrollsera viste ingen virusnøytraliserende aktivitet. Avhengig av endelige titere kunne sera fra ut-valgte, vaksinerte dyr fortynnes fra 10 til 1 000 ganger og var fremdeles 100% nøytraliserende.

For å teste hvorvidt den nøytraliserende antistoff-respons var spesifikk for native CRPV LI VLP, ble et immunserum utvalgt og inkubert med nitrocellulosekvadrater som var blitt belagt med enten native eller denaturerte, gjæravledede CRPV LI VLP. Nitrocellulosekvadrater (1 cm<2>) ble belagt med enten native eller denaturerte (reduserte og alkylerte med jodeddiksyre i 8 M urea), gjæruttrykte CRPV LI VLP. Native eller denaturerte gjæreks tr akter ble anvendt som kontroller. Kanin-immunserum ble inkubert 4 ganger i serie med nitrocel-lulosekvadråtene i 8-14 timer ved 4 °C før det ble testet i virusnøytraliseringsanalysen som beskrevet ovenfor. Kun native CRPV LI VLP var i stand til å absorbere antistoffene ansvar-lige for nøytralisering av CRPV, mens denaturerte eller kontroll-gjærproteiner ikke absorberte disse antistoffer. Native CRPV LI VLP fjernet også dessuten ELISA-reaktiviteten overfor CRPV LI VLP uttrykt i insektsceller (data ikke vist).

Eksempel 16

Konstruksjon av vektor for koekspresjon av CRPV L1/ L2 fra et enkelt plasmid

Plasmid pSP72-CRPV-Ll (pl2930-314-4-l) ble spaltet med Bglll, og det 1,5 kbp Bglll-fragment inneholdende CRPV LI ORF med en gjær 5'-utranslatert leder, ble gelrenset. Plasmid P12930-323-2-3 (pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV-L2) ble oppsluttet med BamHI som spalter mellom GALI-promotoren og ADHl-transkripsjonsterminatoren. Det lineære vektorfragment ble gelrenset og deretter ligert med det ovennevnte CRPV-L1 Bglll-fragment for å gi plasmidet pl2930-366-l-2 (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2). Dette dannede plasmid inneholder CRPV-L1 ORF under kontroll av GALI-promotoren og CRPV-L2 ORF under kontroll av GAL10-promotoren.

Eksempel 17

Konstruksjon av vektor for koekspresjon av CRPV L1/ L2 fra to plasmider

pUC18-GALlp-GAL10p-vektoren inneholdende L2-genet, ble spaltet med SphI, og 2,9 kb-fragmentet inneholdende ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt-ekspresjonskassetten, ble gelrenset og gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase. Gjær-shuttlevektoren YEp24 [Botstein et al., Gene 8:17 (1979)] ble spaltet med BamHI, gjort buttendet ved behandling med T4 DNA-polymerase, defosforylert med kalvetarm-alkalisk fosfatase og deretter ligert med den ovenfor angitte, buttendede L2-ekspresjonskassett for å gi plasmid pl594.

Eksempel 18

Koekspresjon av CRPV Li og L2 i gjær

Plasmid pl2930-366-l-2 (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2) ble anvendt for å transformere S. cerevisiae-stammer nr. 1569 og BJ5462 (ett plasmidsystem), og de resulterende transformanter ble utvalgt på syntetisk agarmedium uten leucin. I et parallelt eksperiment ble stamme 1569 kotransformert med pCl/l-GAL10p-CRPV-Ll-ekspresjonsvektoren pl2930-323-6-l pluss YEp24-GAL10p-L2-ekspresjonsvektoren pl594 (to-plasmidsystem), og de resulterende transformanter inneholdende begge vektorer. ble utvalgt på syntetisk agarmedium som manglet både leucin og uracil. Klonale isolater for både ett-plasmidsystemet og to-plasmidsysternet ble dyrket ved 30 °C i YEHD-komplekst medium inneholdende 2% galaktose i 48-72 timer. Etter innhøsting av cellene ble cellepelletene nedbrutt med glasskuler. "Triton X-100" ble tilsatt til 0,5% sluttkonsentrasjon, og cellelysater ble analysert for ekspresjon av CRPV LI og L2 ved immunblotanalyse. Prøver inneholdende 50 ug totalt, cellulært protein, ble underkastet elektroforese på 8-16% Tris-glysin-gradient-geler (Novex) under reduserende og denaturerende betingelser og elektroblottet på PVDF-membraner (Novex). CRPV LI- og L2-proteiner ble påvist ved anvendelse av polyklonale kanin-anti-Ll- eller anti-L2-antisera (gave fra dr. John Kreider, Hershey Medical Center) som primære antistoffer og protein A koblet til pepperrotperoksidase (Amersham, Inc.) som det sekundære antistoff. Membranene ble bearbeidet ved anvendelse av kjemi - luminescens "ECL"-påvisningssettet (Amersham, Inc.). Et 55-61 kDa Ll-proteinbånd og et ca. 90 kDa L2-proteinbånd ble påvist i alle prøver fra gjærkloner inneholdende LI + L2-ekspresjonsplasmidet. Intet signal for L2 ble påvist i prøver avledet fra gjærkloner inneholdende ekspresjonsplasmidet for LI. Intet signal for LI ble påvist i prøver fra celler inneholdende kun L2-ekspresjonsvektoren.

Eksempel 19

Rensing av CRPV LI oa CRPV LI + L2 VLP for EM- undersøkelser

De gjæruttrykte CRPV LI- og CRPV LI- og L2-proteiner ble delvis renset og konsentrert for elektronmikroskopi(EM)-undersøkelser. 1 til 1,5 liter YEHD-medium inneholdende 2% galaktose, ble inokulert med S. cerevisiae-stamme nr. 1569 eller BJ5462 transformert med LI + L2-ekspresjonsvektoren pl2930-366-l-2 (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll + L2) og dyrket ved

30 °C i 48-72 timer. I et parallelt eksperiment ble celler fra stamme nr. 1569 kotransformert med GAL10p-CRPV-Ll-ekspresjons-vektoren pl2930-323-6-l pluss YEp24-GAL10p-L2-plasmidet pl594, dyrket på lignende måte. Cellene ble høstet, og cellepelleter ble nedfrosset ved -70 °C. Alle etterfølgende trinn ble utført ved 4 °C. Cellepelleter ble tint og suspendert i et like stort volum "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteininhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen ved en sluttkonsentrasjon på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved 3-5 passeringer i et mikrofluidiseringsapparat. Lysatene ble klaret ved sentrifugering ved 5 000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% (volum/volum) sukrose i Ll-buffer, og LI-, L2- eller LI- og L2-proteiner ble pelletert ved sentr i-fugering ved 100 000 x g i 4 timer. Pel leten ble resuspendert i 1/10 av volumet av Ll-buffer. Den resuspenderte pellet ble klaret ved sentr i fugering ved 5 000 x g i 10 minutter.

For EM-analyse (Structure Probe, West Chester, PA) ble en aliguot av hver prøve plassert på 200 mesh karbonbe-lagte kobbergittere. En dråpe av 2% fosfowolframsyre (PTA), pH 7,0, ble plassert på gitteret i 20 sekunder. Gitterne ble tillatt å lufttørke før TEM-undersøkelse. All mikroskopi ble ut-ført ved anvendelse av et "JEOL 100CX"-transmisjonselektronmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 KV. De resulterende mikrofotografier har en endelig for-størrelse på 100 000 x.

I alle gjærprøver som inneholder enten CRPV Ll-ekspresjonsplasmidet eller -plasmidene for koekspresjonen av CRPV LI og L2, ble VLP observert i størrelsesområdet 50-55 nm diameter. Intet VLP ble observert i gjærkontrollprøver eller gjærprøver inneholdende L2-ekspresjonsplasmidet alene (figurene 7, 8, 9).

Eksempel 20

Rensing av rekombinant CRPV LI- kapsidprotein - skjema 2

Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.

Celler lagret ved -70 °C,xble tint og suspendert i et like stort volum Breaking-buffer (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved anvendelse av et "BioNeb" cellenedbrytningssystem (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lysatet ble klaret ved sentrifugering ved

5 000 x g i 10 minutter.

Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% sukrose (vekt/volum) i Ll-buffer, og LI ble pelletert ved sentrifugerlng ved 100 000 x g i 4 timer. Pelleten ble resuspendert i 1/10 volum Ll-buffer. Den resuspenderte pellet ble klaret ved sentrifugerlng ved 5 000 x g i 10 minutter.

Supernatanten ble fortynnet 1:5 med PBS, klaret på nytt ved sentrifugering i "Sorvall SA-600"-rotor ved 6 500 rpm i 10 minutter ved 4 "C. Supernatanten ble filtrert gjennom et 0,22 mikron sprøytefilter og fraksjonert ved anionbytterkromatografi.

Anionbytterkromatografi ble utført med en Perkin-Elmer serie 410 "Biopump HPLC" med en 5 ml injeksjonsløkke. Kro-matograferingsmediet var en "Fractogel EMF TMAE-650 (S)" 25-40 mikron resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) i en 150 mm x 10 mm ID-glasskolonne. For å overvåke eluering av protein fra kolonnen ble optisk påvisning ved 280 nm utført med en Perkin-Elmer LC-235 diodeseriedetektor. Kolonnen ble forhåndsekvi-librert med 0,15 M NaCl i 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH 7,2 (buffer A). Kolonnen ble eluert med en gjennomstrømningshas-tighet på 0,75 ml/min. Prøven ble applisert på kolonnen, og kolonnen ble vasket med buffer A for å fjerne ubundet materiale. Bundet materiale ble eluert med en lineær konsentrasjons-gradient av natriumklorid, 0,15 M til 0,65 M i 5 minutter, etterfulgt av en 0,65 M til 1,15 M lineær gradient i 30 minutter. Påvisning av antigen i fraksjoner oppsamlet under eluering, ble utført ved immun-dot blot-analyse. Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale (dvs. fraksjoner som eluerte mellom 0,81 M og 1,05 M NaCl), ble sammenslått.

De sammenslåtte fraksjoner ble konsentrert i "Macro-sep" sentrifugerings-konsentrasjonsutstyr (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) til 1/5 volum.

Konsentratet ble fraksjonert ved størrelsesutelukkel-seskromatografi ved anvendelse av "Sephacryl S-1000 SF"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ) i en 87 cm x 27 mm ID-kolonne. Kolonnen ble eluert ved en gjennomstrømningshastighet på

2,5 ml/min. Eluering av protein ble overvåket ved absorbans ved 280 nm. Antigen ble påvist ved immunblot.

Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale, ble sammenslått og konsentrert ved ultrafiltrering ved anvendelse av en omrøringscelle (Amicon, Inc., Beverly, MA) med en 43 mm diameter YM-100 flatplatemembran (Amicon, Inc., Beverly, MA) under nitrogen ved et trykk på 0,7 kg/cm<2>.

Sluttproduktet ble karakterisert ved SDS/PAGE med Coomassie-farging og ved løsning-siling-kapillarelektroforese (SSCE). Sluttproduktet fra skjema 2 var 88% rent bestemt ved

SSCE.

Eksempel 21

A. Rensing av rekombinant CRPV LI- kapsidprotein - skjema 3

Alle trinn ble utført ved 4 "C dersom ikke annet er angitt.

Celler lagret ved -70 °C, ble tint og suspendert i et like stort volum Breaking-buffer (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved anvendelse av et "BioNeb" cellenedbrytningssystem (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lysatet ble klaret ved sentrifugering ved

5 000 x g i 10 minutter.

Supernatanten ble ekstrahert med 1/2 volum kloroform. Det vandige lag ble fjernet og klaret ved sentrifugering ved 12 000 rpm i en Beckman mikrosentrifuge i 5 minutter ved romtemperatur .

Supernatanten ble fortynnet 1:5 med PBS, klaret på

nytt ved sentrifugerlng i "Sorvall SA-600"-rotor ved 6 500 rpm i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten ble filtrert gjennom et 0,22 mikron sprøytefilter og fraksjonert ved anionbytterkromatografi.

Anionbytterkromatografi ble utført med en Perkin-Elmer serie 410 "Biopump HPLC" med en 5 ml injeksjonsløkke. Kro-matograferingsmediet var en "Fractogel EMF TMAE-650 (S)" 25-40 mikron resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) i en 150 mm x

10 mm ID-glasskolonne. For å overvåke eluering av protein fra kolonnen ble optisk påvisning ved 280 nm utført med en Perkin-Elmer LC-235 diodeseriedetektor. Kolonnen ble forhåndsekvl-librert med 0,15 M NaCl i 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH 7,2 (buffer A). Kolonnen ble eluert med en gjennomstrømningshas-tighet på 0,75 ml/min. Prøven ble applisert på kolonnen, og kolonnen ble vasket med buffer A for å fjerne ubundet materiale. Bundet materiale ble eluert med en lineær konsentrasjons-gradient av natriumklorid, 0,15 M til 0,65 M, i 5 minutter, etterfulgt av en 0,65 M til 1,15 M lineær gradient i 30 minutter. Påvisning av antigen i fraksjoner oppsamlet under elueringen, ble utført ved immun-dot blot-analyse. Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale (dvs. fraksjoner som eluerte mellom 0,81 M og 1,05 M NaCl), ble sammenslått.

2,5 ml/min. Eluering av protein ble overvåket ved 280 nm. Antigen ble påvist ved immunblot.

Fraksjoner inneholdende immunreaktivt materiale, ble sammenslått og konsentrert ved ultrafiltrering under anvendelse av en omrøringscelle (Amicon, Inc., Beverly, MA) med en 43 mm diameter YM-100 flatplatemembran (Amicon, Inc., Beverly, MA) under nitrogen ved et trykk på 0,7 kg/cm<2>.

Sluttproduktet ble karakterisert ved SDS/PAGE med Coomassie-farging og ved oppløsning-siling-kapillarelektroforese (SSCE). Sluttproduktet fra skjema 3 var 95% rent som bestemt ved SSCE.

Eksempel 22

Ekspresjon av CRPV LI og HPV type 6a LI ( stamme 1644) i anriket kompleks og kjemisk definerte medier

Inokulater for disse stammer ble utviklet i leucinfritt, syntetisk medium som beskrevet ovenfor, for overføring til risteflaskekulturer. De anvendte risteflasker ble utstyrt med ledeplater for høy gj ennomluftningskapasitet (70 ml væske pr. 300 ml flaske, Tunair Labware), og media ble supplert med ca. 0,5 ml/l av et antiskummemiddel ("UCON LB-625", Union Carbide). Anriket, komplekst medium inneholdt (pr. liter): 40 g Difco gjærekstrakt; 20 g Sheffield HySoy pepton; 30 g glukose; 50 g galaktose; mediet ble justert til pH 5,3 før sterilisering. Det anvendte kjemisk definerte medium var lignende mediet beskrevet av Oura (Biotechnol. Bioengineer. 16:1197-1212, 1974), men supplert med (pr. liter): 0,1 g kolin-Cl; 0,4 g adenin; 30 g mononatriumglutamat som nitrogenkilde; 0,2 g uracil; 20 g glukose; 40 g galaktose. Flaskene ble inokulert med 3 ml inokulat og inkubert i 66 timer ved 28 °C, 250 rpm på et rotasjonsristeapparat. Det ble uttatt prøver fra flaskene med jevne mellomrom for bekreftelse av ekspresjon ved hjelp av immunblot ved anvendelse av anti-CRPV LI- og anti-HPV6a Ll-antisera.

Eksempel 23

Kloning av HPV- 6a- qenom

Vev fra en pasient diagnostisert med alvorlig condylomata acuminata (tilveiebrakt av dr. Darron Brown, In-diana University School of Medicine) ble typebestemt ved res-triksjonsenzymspalting og polymerasekjedereaksjon (PCR) og ble vist å inneholde HPV type 6a. DNA ble ekstrahert fra vevs-prøven og spaltet med HindiII-enzym. Etter størrelsesfraksjon-er ing gjennom en 0,8% lavtsmeltende, preparativ agarosegel ble 8 kb-området utskåret fra gelen, og agarosen ble spaltet med "Gelase"-enzym (Epicentre Technologies, Inc.). Prøven ble ligert med pUC18 som var spaltet med Hindlll og defosforylert (Pharmacia, Inc.). Etter transformasjon av kompetente E. coli DH5-celler (BRL) ble plasmidbiblioteket screenet for HPV-6a-positive kloner ved anvendelse av et "P-merket oligodeoksynuk-leotid som var komplementært med HPV-6a Ll-genet. Et pUC18-.plasmid inneholdende det 8 kb HPV-6a-genom, ble isolert og karakterisert ved restriksjonsenzym- og Southern blot-analyser. Dette plasmid ble betegnet pUC18-HPV-6a. Det komplette 8 kb HPV-6a-genom ble sekvensert ved anvendelse av det ABI-automatiserte sekvenseringsapparat (nr. 373A) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner.

En stor vulvar condyloma acuminatunr-lesjon ble erholdt fra en 25 år gammel kvinnelig pasient etter nedkomst. Et fragment av lesjonen ble nedfrosset i flytende nitrogen og deretter bearbeidet med en Braun mikrodismembrator II (B. Braun Instruments, Melsungen, Tyskland). Det resulterende materiale ble oppløst med 0,6% (vekt/volum) natriumdodecylsul-fat (SDS), behandlet med proteinase K (50 ug/ml) og ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol. DNA ble utfelt med etanol og kvantifisert ved UV-spektrofotometri. Tilstedeværelse av høymolekylært DNA ble bestemt ved agarosegelelektroforese etterfulgt av farging med etidiumbromid.

HPV DNA-typen ble bestemt ved anvendelse av hybrid-innfangingsanalysen markedsført som "Vira Type Plus" (Digene Diagnostics, Beltsville, MD). De anvendte HPV-prober ble delt i to porsjoner hvis sammensetning er basert på sammenhengen av hver type med genitalkanalsykdommer. Probegruppe A inneholdt "lavrisiko"-typene HPV6, 11, 42, 43 og 44, mens probe B inneholdt "høyrisiko"-typene 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 og 56. Totalt DNA ble spaltet med Pstl, BamHI og Hindlll, og Southern blots ble utført under svært strenge betingelser (TB-15 °C) for å bestemme HPV-subtypen.

For å bestemme den komplette HPV6a-sekvens ble sek-venseringsprimere syntetisert basert på den publiserte HPV6b-sekvens. Begge tråder av det komplette 8,1 kbp HPV6a-genom ble sekvensert ved hjelp av dideoksykjedetermineringsmetoden ved anvendelse av "PRI SM "-settet og et Applied Biosystems (ABI) automatisert sekvenseringsapparat (nr. 373A) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner (ABI, Inc., Foster City, CA). I tilfeller hvor sense- og antisense-sekvensen ikke pas-set til hverandre, ble ytterligere HPV6a-spesifikke primere syntetisert for å sekvensere på nytt.i begge retninger i det aktuelle område for å oppnå en konsensus.

DNA-sekvensen av HPV6a og HPV6b oppviste mer enn 97% identitet med totalt 229 bp endringer identifisert av 8 010 bp. De mest signifikante forskjeller sammenlignet med HPV6b-sekvensen, ble funnet i det lange kontrollområde (LCR; nt 7205 - nt 106). Foruten flere enkle nukleotid(nt)endringer i HPV6a LCR ble det funnet en 94 bp innføyelse ved nt 7350 og en annen 19 bp innføyelse ved nt 7804. Ved nt 7615 var 6 base-

par delert fra HPV6a-genomet.

Eksempel 24

Konstruksjon av HPV6a Ll- qjærekspresjonsvektor

HPV type 6a-DNA ble anvendt som et templat for PCR. HPV6a Ll-genet ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.), 35 amplifikasjonssykluser (94 °C 1 min., 48 °C 1 min., 72 °C 1 min. 45 sek.) og de følgende oligodeoksynukleotidprimere som inneholder flankerende Bglll-seter (understreket):

Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det HPV6a LI-innledende metioninkodon (uthevet med fet skrift). 1,5 kbp LI PCR-produktet ble spaltet med Bglll og gelrenset. pCl/l-GAL-ekspre-sjonsvektoren ble konstruert ved isolering av det 1,4 kbp SphI-fragment fra den dobbeltrettede promotorvektor pUC18-GALlp-GALlOg som inneholder den divergente GALI/GALlO-promotor fra plasmid pBM272 (tilveiebrakt av dr. Mark Johnston, Washington University, St. Louis) flankert på hver side av en kopi av gjær-ADHl-transkripsjonsterminatoren [Bennetzen, J.L. og Hall, B.D. (1982), J. Biol. Chem. 257:3018-3025]. I den resulterende ekspresjonskassett er et BamHI-sete lokalisert mellom GALI-promotoren og den første, kopi av ADH1-transkrip-sjons terminatoren, og et SmaI-kloni\ngssete er lokalisert mellom den divergente GALI 0-promotor og den andre kopi av ADH1-transkripsjonsterminatoren. Gjær-shuttlevektoren pCl/1 (Rosen-berg et al., Nature 312 (1984) 77-80) ble spaltet med SphI og ligert med 1,4 kbp SphI GAL-promotorfragmentet. Den resulterende vektor, pCl/l-GAL, ble linearisert med BamHI som spalter mellom GALI-promotoren og ADHl-transkripsjonsterminatoren. Den BamHI-spaltede pCl/l-GAL-vektor og det Bglll-spaltede HPV6a LI-PCR-fragment ble ligert og anvendt for å transformere £. coil DH5-celler (BRL). Det ble isolert et pCl/l-GAL-plasmid som inneholder HPV-6a LI-genet og ble betegnet pl3173-357-6. Ll-genet i pl3173-357-6 ble sekvensert (ABI-sekvenseringsapparat nr. 373A) og vist å være identisk med Ll-genet i pUC18-HPV6a-klonen.

Eksempel 25

Konstruksjon av HPV6a LI- oa L2- a1 ær ekspresjonsvektor en

Plasmid pl3173-357-6 (pCl/l-GAL + HPV6a LI) ble spaltet med Smal som spalter mellom GALlO-promotoren og ADH1-transkripsjonsterminatoren. Det 1,4 kbp HPV6a L2-gen ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av pUC18-HPV6a-DNA som templat, Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.), 10 sykluser med PCR-amplifikasjon (94 °C, 1 min.; 48 <*>C, 1 min.; 72 °C,

1 min. 45 sek.) og de følgende oligodeoksynukleotidprimere som inneholder flankerende Smal-seter (understreket):

Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det HPV6a L2-innledende metioninkodon (uthevet med fet skrift). PCR-fragmentet ble spaltet med Smal, gelrenset og ligert med det Smal-spaltede pl3173-357-6-plasmid. Et pCl/l-GAL-plasmid inneholdende både HPV6a LI- og L2-genene, ble isolerog betegnet pl4049-7-2. L2-genet ble sekvensert (ABI-sekvenseringsapparat nr. 373A) og funnet å være identisk med L2-genet i pUC18-HPV6a-klonen.

Eksempel 26

Ekspresjon av HPV6a LI oa koekspresjon av HPV6a LI og L2 1 gjær

Plasmider pl3173-357-6 (pCl/l-GAL + HPV6a LI) og pl4049-7-2 (pCl/l-GAL + HPV6a LI og L2) ble anvendt for å transformere 5. cerevisiae-stammer nr. 1569 (MATa, leu2-04, prbl, adel, pep4, cir<e>) og nr. 1558 (MATa, leu2-04, prbl, mnn9, adel, eir"). De resulterende, rekombinante stammer erholdt ved anvendelse av vertsstamme nr. 1558, var stammer nr. 1644 (HPV6a LI) og nr. 1670 (HPV6a L1+L2) som vist i tabellen. Klonale isolater ble dyrket ved 30 <*>C i YEHD-medium inneholdende 2% galaktose i 68-78 timer. Etter innhøsting av cellene ble cellepelletene nedbrutt med glasskuler, og cellelysater ble analysert for ekspresjon av HPV6a LI- eller HPV6a L2-protein ved immunblotanalyse. Prøver inneholdende 40 ug totalt, cellulært protein, ble underkastet elektroforese på 10% Tris-glysingeler under reduserende og denaturerende betingelser og elektroblottet på nitrocellulosefiltre. Ll-proteinet ble immunpåvist ved anvendelse av kanin-antisera mot et trpE-HPVll-fusjonsprotein (Brown, D.R. et al., Virology 201:46-54) som primært antistoff og esel-anti-kanin-IgG-pepperrotperoksidase-bundet (HRP), komplett antistoff (Amersham, Inc.) som det sekundære antistoff. Filtrene ble bearbeidet ved anvendelse av kjemiluminescens "ECL"-påvisningssettet (Amersham, Inc.). Et 50-55 kDa Ll-proteinbånd ble påvist i alle prøver med unntak av den negative kontroll (pCl/1 uten LI- eller L2-gen).

L2-proteinet ble påvist som et 70 kDa proteinbånd ved Western-analyse ved anvendelse av 1:250 fortynnet sera fra mus som var blitt immunisert tre ganger med et trpE-HPV6a L2-fusjonsprotein fremstilt vesentlig i overensstemmelse med metoden ifølge Carter et al. som det primære antistoff, og HRP-bundet sau-ant i-mus-IgG (Amersham, Inc.) som et andre antistoff (1:1 000 fortynning).

For EM-analyse (Structure Probe, West Chester, PA) ble en aliquot av hver prøve plassert på 200 mesh karbonbelagt kobbergitter. En dråpe av 2% fosfowolframsyre (PTA), pH 7,0, ble plassert på gitteret i 20 sekunder. Gitterne ble tillatt å lufttørke før TEM-undersøkelse. All mikroskopi ble utført ved anvendelse av et "JEOL 100CX" transmisjonselektronmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 KV. De frembrakte mikrofotografler har en endelig forstørrelse på 100 000 x.

VLP ble observert i størrelsesområdet 50-55 nm diameter 1 alle gjærprøver som enten inneholdt HPV6a LI eller HPV6a LI- og L2-koekspresjonsplasmidene. Ingen VLP ble observert i gjærkontrollprøver.

Eksempel 27

Fermentering av HPV6a L1+ L2 ( stamme nr. 1670)

Overflatevekst av en platekultur av stamme 1670 ble aseptisk overført til et leucinfritt, flytende medium inneholdende (pr. liter): 8,5 g Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer og ammoniumsulfat; 0,2 g adenin; 0,2 g uracil; 10 g ravsyre; 5 g ammoniumsulfat; og 0,25 g L-tyrosin; dette medium ble justert til pH 5,0-5,3 med NaOH før sterilisering. Etter dyrkning i 25 timer ved 28 °C, 250 rpm på et rotasjonsristeapparat, ble frosne kulturampuller preparert ved tilsetning av steril glyserol til en sluttkonsentrasjon på 17% (vekt/volum) før lagring ved" -70 "C (1 ml pr. kryoampulle). Inokulum for fermentering av stamme 1670 ble utviklet i det samme medium (500 ml pr. 2-liters flaske) og ble startet ved overføring av det tinte innhold av to frosne kulturampuller til 2-liters-flaskene og inkubasjon ved 28 °C, 250 rpm, på et rotasjonsristeapparat i 25 timer. Ved fermentering av stamme 1670 ble det anvendt en New Brunswick SF-116-fermentor med et arbeidsvolum på 10 1 etter inokulering. Det anvendte produksjons-medium inneholdt (pr. liter); 20 g Difco gjærekstrakt; 10 g Sheffield HySoy pepton; 20 g glukose; 20 g galaktose; mediet ble justert til pH 5,3 før sterilisering. Hele innholdet (500 ml) av 2-liters-inokuleringsfjasken ble overført til fermentoren som ble inkubert ved 28 °C, 5 1 luft pr. min.,

400 rpm, trykk 0,25 kg/cm<2>. Omrøringen ble økt etter behov for å opprettholde nivåer av oppløst oksygen høyere enn 40% metning. Fermenteringsforløpet ble overvåket ved off-line-glukosemålinger (Beckman glukose 2-analysator) og on-line-massespektrometri (Perkin-Elmer 1200). Etter 69 timers inkubasjon var det nådd en celletetthet på 9,9 g tørr cellevekt pr.

liter. Kulturen ble konsentrert ved hulfiberfiltrering (Amicon H5MP01-43-patron i et Amicon DC-10-filtreringssystem) til ca. 2 1, diafiltrert til 2 1 fosfatbufret saltløsning og konsentrert ytterligere (til ca. 1 1) før overføring i 500 ml sentr ifugeflasker. Cellepelleter ble oppsamlet ved sentrifugerlng ved 8 000 rpm ("Sorval GS3"-rotor) i 20 minutter ved 4 °C. Etter dekantering av supernatanten ble pelletene (totalt 225 g våte celler) lagret ved -70 °C inntil anvendelse.

Eksempel 28

Rensing av rekombinante HPV6a LI + L2- kapsidproteiner

Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.

Celler av stamme nr. 1670 ble lagret nedfrosne ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 38,0 g) ble tint ved 20-23 °C og resuspendert i 50 ml "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorene PMSF og pepstatin A ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 560 kg/cm<2> ved tre passeringer i et M110 mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Den nedbrutte celleoppslemming ble sentrifugert ved 5 000 x g i 10 minutter for å fjerne nedbrutt cellemateriale. Supernatantvæsken inneholdende LI -i- L2-antigen ble oppsamlet.

Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 ved tilsetning av buffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) og applisert på en anionbytter-innfangingskolonne (5,0 cm ID x 4,0 cm) av "Fractogel" EMD TMAE-650 (S)-resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrert i buffer A. Etter vask med buffer A ble antigenet eluert med en gradient fra 0 til 1,0 M NaCl i buffer A. Immun-dot blotting ble utført for å bestemme hvilke, fraksjoner fra kolonnen som inneholdt LI-protein. v

Fraksjoner inneholdende LI-protein som bestemt ved immun-dot blot, ble analysert for totalt protein ved hjelp av Bradford-metoden etterfulgt av SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western-blotting.

TMAE-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av LI-protein, ble sammenslått. Antigenet ble konsentrert ved ammoniumsulfatfraksjonering. Løsningen ble justert til 63% mettet ammoniumsulfat ved tilsetning av fast reagens under forsiktig omrøring i 30 minutter. Prøven ble plassert på is, og utfelling ble tillatt å foregå i 30 minutter. Prøven ble sentrifugert ved 12 000 x g. Pelleten ble resuspendert i 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl).

Den resuspenderte pellet ble kromatografert på en størrelsesutelukkelseskolonne (2,6 cm ID x 89 cm) med "Sephacryl 500 HR"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluér-ingsbuffer var PBS. Kromatograferingen ble utført ved 20-23 °C. Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western blot-påvisning. De reneste fraksjoner ble sammenslått. Den resulterende porsjon ble konsentrert.

Sluttproduktet ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av kolloidal Coomassie-farging. LI- og L2-proteinene ble beregnet til å være 85% homogene. Identiteten av LI- og L2-proteiner ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse av de egnede antisera. Sluttproduktet ble delt i aliguoter og lagret ved -70 "C. Denne prosess ga totalt 3,0 mg protein.

Elektronmikroskopianalyse ble utført ved hjelp av Structure Probe (West Chester, PA). En aliquot av prøven ble plassert på 200 mesh karbonbelagt kobbergitter. En dråpe av 2% fosfowolframsyre, pH 7,0, ble plassert på gitteret i 20 sekunder. Gitteret ble tillatt å lufttørke før TEM-undersøkelse. All mikroskopi ble utført ved anvendelse av et "JEOL 100 CX" transmisjonselektronmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 kV. De frembrakte mikrofotografier har en endelig forstørrelse på 100 000 x. Tilstedeværelse av viruslignende partikler i størrelsesområdet 50-55 nm ble bekreftet.

Eksempel 29

Rensing av HPV- 6a LI og L1/ L2 VLP for EM- undersøkelser

De gjæruttrykte HPV-6a LI- og HPV-6a LI + L2-proteiner ble delvis renset og konsentrert for elektronmikroskopi (EM) undersøkelser. 1 til 1,5 1 YEHD-medium inneholdende 2% galaktose og 0,1 M sorbitol, ble inokulert med S. cerevisiae stamme nr. 1558 inneholdende enten plasmid pl3173-357-6 (LI-ekspresjonsvektor) eller plasmid pl4049-7-2 (LI- og L2-koekspresjonsvektor) og dyrket ved 30 °C i 68-78 timer. Cellene ble høstet ved sentrifugerlng ved 4 000 g i 10 minutter, og cellepelleter ble nedfrosset ved -70 °C. Alle følgende trinn ble utført ved 4 °C. Cellepelleter ble tint og suspendert i et like stort volum "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorer PMSF og pepstatin A ble tilsatt til oppslemmingen av sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celler ble lysert ved 3-5 passeringer i et mikrofluidiseringsapparat. Lysatet ble klaret ved sentrifugerlng ved 5 000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble lagt på toppen av et 5 cm lag av 45% (vekt/volum) sukrose i Ll-buffer, og LI- eller LI + L2-proteinene ble pelletert ved sentrifugerlng ved 100 000 x g i 4 timer. Pelleten ble resuspendert i 1/10 volum Ll-buffer og klaret ved sentrifugerlng ved 5 000 x g i 10 minutter. Prøver ble undersøkt ved EM og ble vist å inneholde viruslignende partikler.

Eksempel 30

Kloning av HPV16 Li- oa L2- gener

Totalt genomisk.DNA ble ekstrahert fra Caski-celler (ATCC nr. CRL 1550) ved hjelp av standardteknikker (Sambrook et al., supra). DNA ble spaltet med Bstl 1071- og Sphl-endo-nukleaser og underkastet elektroforese gjennom en 0,8% lavtsmeltende, preparativ agarosegel. Et område tilsvarende DNA på ca. 3,5 kbp, ble utskåret fra gelen, og agarosen ble spaltet med "Gelase"-enzym (Epicentre Technologies, Inc.). Det gelrensede DNA ble gjort buttendet med T4 DNA-polymerase og ligert med buttendede, fosforylerte oligodeoksynukleotidlinkere som inneholder et "begravet" HindiII-sete. Ligeringsblandingen ble fullstendig spaltet med Hindlll, og det ca. 3,5 kbp DNA ble størrelsesfraksjonert gjennom en agarosegel som beskrevet ovenfor. Det gelrensede DNA ble ligert med pUC18 plasmid-DNA som var spaltet med Hindlll og defosforylert. Etter transformasjon av kompetente E. coli DH5-celler (BRL) ble plasmidbiblioteket screenet for HPV16-positive kloner ved koloni-hybridisering ved anvendelse av et antisense <32>P-merket oligo-deoksynukleotid som er komplementært med 3'-enden av HPV-16 Ll-genet (5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3'). Et pUCl8-plasmid inneholdende et 3,3 kbp HPV16 genomisk fragment, ble isolert og karakterisert ved restriksjonsenzym-og Southern blot-analyser. Dette plasmid ble betegnet pUC18-HPV16 L1/L2 og inneholder alle LI- og L2-kodende DNA-sek-venser . Plasmid-DNA ble fremstilt ved anvendelse av "Qiagen" plasmid-maksisettet (Qiagen, Inc.).

Eksempel 31

Konstruksjon av HPV16 Ll- aiærekspresionsvektor

Klonen pUC18-HPV16 L1/L2 ble anvendt som et templat for PCR. HPV16 Ll-genet ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.), 10 amplifikasjonssykluser (94 °C, 1 min.; 48 °C, 1 min.; 72 °C, 1 min.

45 sek.), og de følgende oligodeoksynukleotidprimere som inneholder flankerende Bglll-seter (understreket).

Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det HPV16 Ll-innledende metioninkodon (uthevet med fet skrift). Det 1,5 kbp LI PCR-produkt ble spaltet med Bglll, gelrenset og ligert med den BamHI-spaltede pCl/l-GAL-vektor. Et pCl/l-GAL-plasmid inneholdende HPV16 Ll-genet, ble isolert og betegnet pl4049-37-l. Ll-genet i pl4049-37-l ble sekvensert ved anvendelse av "PRISM"-settet (ABI, Inc.) og et ABI-sekvenseringsapparat, modell nr. 373A, i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Ll-genet i dette isolat ble vist å inneholde tre nukleotidendringer i forhold til den korrigerte, publiserte prototypesekvens (Kirnbauer, R. et al. (1993), J. Virol. 67:6929-6936) som resulterer i to aminosyreendringer: His-202 til Asp; Thr-266 til Ala. Sekvensanalyse av det opprinnelige templat-DNA bekreftet at disse endringer også var til stede i den genomiske

klon pUC18-HPV16 L1/L2 og ikke ble innført ved PCR.

Eksempel 32

Konstruksjon av HPV16 LI- og L2- gjærekspresjonsvektor

Plasmid pl4049-37-l (pCl/l-GAL+HPV16 LI) ble spaltet med Smal som spalter mellom GALlO-promotoren og ADHl-transkripsjonsterminatoren. Det 1,4 kbp HPV16 L2-gen ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av pUC18-HPV16 L1/L2-DNA som templat, Vent-polymerase (New England Biolabs, Inc.),

10 PCR-amplifikasjonssykluser (94 °C, 1 min.; 48 °C, 1 min.; 72 °C, 1 min. 45 sek.) og de følgende oligodeoksynukleotidprimere som inneholder flankerende Smal-seter (understreket):

Sense-primeren innfører en gjær-utranslatert leder-sekvens umiddelbart oppstrøms for det HPV16 L2-innledende metioninkodon (uthevet med fet skrift). Det 1,4 kbp L2 PCR-produkt ble spaltet med Smal, gelrenset og ligert med den Smal-spaltede pl4049-37-l-vektor. Et pCl/l-GAL-plasmid inneholdende både HPV16 LI- og L2-genene, ble isolert og betegnet pl4049-42-2. L2-genet i pl4049-42-2 ble sekvensert ved anvendelse av "PRISM"-settet (ABI, Inc.) og et ABI-sekvenseringsapparat, modell nr. 373A i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. L2-genet i dette isolat ble vist å inneholde fem nukléotidendringer i forhold til den korrigerte, publiserte prototypesekvens (Kirnbauer, R. et \al. (1993) supra) som resulterer i én aminosyreendring: Ser-269 til Pro. Sekvensanalyse av den genomiske klon pUC18-HPV16 L1/L2 bekreftet at denne endring også var til stede i det opprinnelige templat-DNA og ikke var innført ved PCR.

Eksempel 33

A. Ekspresjon av HPV16 LI og koekspresjon av HPV16 LI og L2 i gjær

Plasmider pl4049-37-l (pCl/l-GAL+HPV16 Li) og pl4049-42-2 (pCl/l-GAL+HPV16 LI og L2) ble anvendt for å transformere S. cerevisiae-stamme nr. 1558. De resulterende, rekombinante stammer var nr. 1678 (HPV16-L1) og nr. 1679 (HPV16 L1+L2) som vist i tabellen. Klonale isolater ble dyrket ved 30 "C i YEHD-medium inneholdende 2% galaktose i 68-78 timer. Etter innhøs-ting av cellene ble cellepelletene nedbrutt med glasskuler, og cellelysater ble analysert for ekspresjon av HPV16 LI- eller HPV16 L2-protein ved immunblotanalyse. Prøver inneholdende 40 ug totalt, cellulært protein, ble underkastet elektroforese på 10% Tris-glysingeler under reduserende og denaturerende betingelser og elektroblottet på nitrocellulosefiltre. HPV16 Ll-proteinet ble immunpåvist ved anvendelse av kanin-polyklonale antisera mot et trpE-HPVll LI-fusjonsprotein (D. Brown et al., Virology 201:46-54) som primært antistoff og HRP-bundet esel-anti-kanin-IgG-antistoff (Amersham, Inc.) som det sekundære antistoff. Filtrene ble bearbeidet ved anvendelse av kjemiluminescens ECL-påvisningssettet (Amersham, Inc.). Et 50-55 kDa Ll-proteinbånd ble påvist i alle prøver unntatt den negative kontroll (pCl/1 uten LI- eller L2-gen). L2-proteinet ble påvist som et 70 kDa proteinbånd ved immunblot ved anvendelse av mus-anti-HPVl6 L2-sera mot trpE-L2-fusjonsproteiner uttrykt i E. coil som primært antistoff. Geit-anti-mus-IgG HRP-bundet (Amersham, Inc.) ble anvendt som sekundært antistoff, og filtrene ble bearbeidet som beskrevet ovenfor.

B. Rensing av rekombinante HPV type 16 LI + L2- kapsidproteiner

Alle trinn ble utført ved\ 4 °C dersom ikke annet er angitt.

Celler ble lagret nedfrosset ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 27,6 g) ble tint ved 20-23 °C og resuspendert i 40 ml "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorene PMSF og pepstatin A ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på henholdsvis 2 mM og 1,7 uM. Celleoppsleromingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 560 kg/cm<2> ved tre passeringer i et Ml 10 mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Den nedbrutte celleoppslemming ble sentrifugert ved 5 000 x g i 10 minutter for å fjerne cellulært nedbrytningsmateriale. Supernatantvæsken inneholdende Li + L2-antigen, ble oppsamlet.

Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 ved tilsetning av buffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) og applisert på en anionbytter-innfangingskolonne (5,0 cm ID x 4,8 cm) av "Fractogel" EMD TMAE-650 (S)-resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrert i buffer A. Etter vask med buffer A ble antigenet eluert med en gradient fra 0 til 1,0 M NaCl i buffer A. Immun-dot blotting ble utført for å bestemme hvilke fraksjoner fra kolonnen som inneholdt LI-protein.

TMAE-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av LI-protein, ble sammenslått. Antigenet ble konsentrert ved ammoniumsulfat fraksjonering. Løsningen ble justert til 48% mettet ammoniumsulfat ved tilsetning av fast reagens under forsiktig omrøring i 30 minutter. Prøvene ble plassert på is, og utfelling ble tillatt å foregå over natten. Prøvene ble sentrifugert ved 12 000 x g. Pel leten ble resuspendert i 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl).

Resuspenderte pelleter ble kromatografert separat på en størrelsesutelukkelseskolonne (2,6 cm ID x 89 cm) med "Sephacryl 500 HR"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ) ved 20-23 °C. Elueringsbuffer var PBS. Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western blot-påvisning. De reneste fraksjoner ble sammenslått. De resulterende porsjoner ble konsentrert i en 50 ml omrøringscelle ved anvendelse av 43 mm YM-100 flatplåtemembraner (Amicon, Beverly, MA) ved et N2-trykk på 0,28-0,42 kg/cm<2>.

Sluttproduktet ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av kolloidal Coomassie-farging. Li- og L2-proteinene ble beregnet til å være 70% homogene. Identiteten av LI- og L2-proteiner ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse av de egnede antisera. Sluttproduktet ble delt i aliquoter og lagret ved -70 °C. Denne prosess ga totalt 0,53 mg protein.

Elektronmikroskopianalyse ble utført ved hjelp av Structure Probe (West Chester, PA). En aliquot av prøven ble plassert på et 200 mesh karbonbelagt kobbergitter. En dråpe av 2% fosfowolframsyre, pH 7,0, ble plassert på gitteret i 20 sekunder. Gitteret ble tillatt å lufttørke før TEM-under-søkelse. All mikroskopi ble utført ved anvendelse av et "JEOL 100 CX" transmisjonselektronmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 kV. De frembrakte mikrofotografier har en endelig forstørrelse på 100 000 x. Tilstedeværelsen av viruslignende partikler i størrelsesområdet 50-55 nm ble bekreftet.

C. Rensing av rekombinante HPV type 16 LI + L2- kapsidproteiner

Alle trinn ble utført ved 4 "C dersom ikke annet er angitt.

Celler ble lagret nedfrosset ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 92,8 g) ble tint ved 20-23 °C og resuspendert i 105 ml "Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaseinhibitorene PMSF og pepstatin A ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 825 kg/cm<2 >ved tre passeringer i et M110-Y mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Den nedbrutte celleoppslemming ble sentrifugert ved 6 100 x g i 15 minutter for å fjerne cellulært nedbrytningsmateriale, Supernatantvæsken inneholdende LI + L2-antigen, ble oppsamlet.

Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 ved tilsetning av buffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) og applisert på en anionbytter-innfangingskolonne (5,0 cm ID x 4,2 cm) av "Fractogel" EMD TMAE-650 (S)-resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrert i buffer A. Etter en vask med buffer A ble antigenet eluert med en gradient fra 0 til 1,0 M NaCl i buffer A. Immun-dot-blotting ble utført for å bestemme hvilke fraksjoner fra kolonnen som inneholdt Ll-protein.

Fraksjoner inneholdende Ll-protein som bestemt ved immun-dot blot, ble analysert for totalt protein ved hjelp av Bradford-metoden etterfulgt av SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western-blotting.

TMAE-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av Ll-protein, ble sammenslått. Antigenet ble konsentrert ved ammoniumsulfatfraksjonering. Prøver ble justert til 35% mettet ammoniumsulfat ved tilsetning av fast reagens under forsiktig omrøring i 10 minutter. Prøvene ble plassert på is, og utfelling ble tillatt å foregå i 4 timer. Prøvene ble sentrifugert ved 12 000 x g. Pelleten ble resuspendert i 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl) som inneholdt 1 mM EDTA.

Resuspenderte pelleter ble kromatografert separat på en størrelsesutelukkelseskolonne (2,6 cm ID x 89 cm) med "Sephacryl 500 HR"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ). Elueringsbuffer var PBS + 1 mM EDTA. Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western blot-påvisning. De reneste fraksjoner ble sammenslått. De resulterende porsjoner ble konsentrert i en 50 ml omrøringscelle ved anvendelse av 43 mm YM-100 flatplatemembraner (Amicon, Beverly, MA) ved et N2-trykk på 0,28-0,42 kg/cm<2>.

Sluttproduktet ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av kolloidal Coomassie-farging. Li- og L2-proteinene ble beregnet til å være 70% homogene. Identiteten av Li- og L2-proteiner ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse av de egnede antisera. Sluttproduktet ble delt i aliguoter og lagret ved -70 "C. Denne prosess ga totalt 3,8 mg protein.

Eksempel 34

A. Fermentering av stamme 1679 ( HPV type 16 L1+ L2)

Anvendte prosedyrer for fremstilling av frosne stam-kulturer, inokulatutvikling, fermentering og celleoppsamling av stamme 1679 var vesentlig som beskrevet ovenfor. Etter inkubasjon i 67 timer ble det nådd en celletetthet på 4,2 g tørr cellevekt pr. liter, og dette ga totalt 93 g våt cellepellet etter oppsamling.

B. Fermentering av stamme 1678 ( HPV type 16 LI)

Prosedyrer anvendt for fremstilling av frosne stam-kulturer, inokulatutvikling, fermentering og celleoppsamling av stamme 1678 var vesentlig som beskrevet ovenfor. Etter inkubasjon i 70,5 timer ble innholdet fra to 10 1 fermenter-inger sammenslått (en celletetthet på 8,7 g tørrcellevekt pr. 1), hvilket ga totalt 258 g våt cellepellet etter oppsamling.

C. Rensing av rekombinante HPV type 16 Ll- kapsidproteiner

Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.

Celler av stamme nr. 1678 ble lagret nedfrosset ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 128 g) ble tint ved 20-23 °C og resuspendert i 140 ml "modifisert Ll-buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl). Proteaseinhibitorene PMSF og pepstatin A ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 825 kg/cm<2> ved tre passeringer i et M110-Y mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Den nedbrutte celleoppslemming ble sentrifugert ved 11 000 x g i 40 minutter for å fjerne cellulært nedbrytningsmateriale. Supernatantvæsken inneholdende Ll-antigen, ble oppsamlet.

Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 ved tilsetning av buffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) og applisert på en anionbytter-innfangingskolonne (5,0 cm ID x 6,4 cm) av "Fractogel" EMD TMAE-650 (S)-resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrert i buffer A. Etter en vask med buffer A ble antigenet eluert med en gradient fra 0 til 1,0 M NaCl i buffer A. Immun-dot-blotting ble utført for å bestemme hvilke fraksjoner fra kolonnen som inneholdt Ll-protein.

Fraksjoner inneholdende Ll-protein som bestemt ved immun-dot blot, ble analysert for totalt protein ved hjelp av Bradford-metoden etterfulgt av SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western-blotting. \

TMAE-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av Ll-protein, ble sammenslått. Antigenet ble konsentrert ved ammoniumsulfatfraksjonering. Prøver ble justert til 35% mettet ammoniumsulfat ved tilsetning av fast reagens under forsiktig omrøring i 10 minutter. Prøvene ble plassert på is, og utfelling ble tillatt å foregå i 5 timer. Prøvene ble sentrifugert ved 12 000 x g. Pelleten ble resuspendert i 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl).

Resuspenderte pelleter ble kromatografert separat på en størrelsesutelukkelseskolonne (2,6 cm ID x 89 cm) med "Sephacryl 500 HR"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ). Elueringsbuffer var PBS. Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av sølvfarging og Western blot-påvisning. De reneste fraksjoner ble sammenslått. Resulterende porsjoner ble konsentrert i en 50 ml omrøringscelle ved anvendelse av 43 mm YM-100 flatplatemembraner (Amicon, Beverly, MA) ved et N2-trykk på 0,28-0,42 kg/cm<2>.

Sluttproduktet ble analysert ved SDS-PAGE ved anvendelse av kolloidal Coomassie-farging. Ll-proteinet ble beregnet til å være 70% homogent. Identiteten av LI ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse av de egnede antisera. Sluttproduktet ble delt i aliquoter og lagret ved -70 °C. Denne prosess ga totalt 7,4 mg protein.

D. Analytiske prosedyrer

Immun- dot blot- prosedyre

Prøver ble fortynnet (når nødvendig) 1:10 i Milli-Q-H20, og 10 ul prøve ble punktapplisert på "PolyScreen" PVDF-membraner (NEN Research Products, Boston, MA). Etter at flekkene var tørket, ble membranene vasket i vann og tillatt å tørke. Primær antistoffløsning ble preparert ved fortynning av det egnede antiserum i blottingsbuffer (5% melk uten fett i 6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3). Inkubasjon var i minst 1 time ved 20-23 °C. Flekken ble vasket i 1 minutt tre ganger med PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl). Sekundær antistoffløsning ble preparert ved fortynning av det egnede alkalisk fosfatasebundne konjugat-antiserum i blottingsbuf f er. Inkubasjon ble utført under de samme betingelser i minst 1 time. Flekkene ble vasket som beskrevet ovenfor og påvist ved anvendelse av et 1-trinns NBT/BCIP-substrat (Pierce, Rockford, IL).

Antistoffer anvendt for påvisning, var som følger: HPV6a LI ble påvist med MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). HPV6a L2 ble påvist med mus-anti-HPV6a L2-trpE-fusjonsserum, porsjon nr. 641 og 647. HPV16 LI ble påvist med MAB 885 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). HPV16 L2 ble påvist med mus-anti-HPV16 L2-trpE-fusjonsserum, porsjon nr. 611.

Bradford- analvse for totalt protein

Totalt protein ble analysert ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig "Coomassie Plus"-sett (Pierce, Rockford, IL). Prøver ble fortynnet til passende nivåer i Milli-Q-H20. Fordrede volumer var 0,1 ml og 1,0 ml for henholdsvis standard- og mikroanalyseprotokollene. For begge protokoller ble BSA (Pierce, Rockford, IL) anvendt for å frembringe stand-ardkurven. Analysen ble utført i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Standardkurver ble plottet ved anvendelse av "CricketGraph" software på en Macintosh IIci-computer.

Eksempel 35

Rensing av rekombinante HPV type 11 LI- kapsidproteiner

Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.

Celler ble nedfrosset ved -70 "C. Frosne celler (våtvekt = 180 g) ble tint ved 20-23 "C og resuspendert i 900 ml "Breaking Buffer" (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2). Proteaseinhibitorene AEBSF og pepstatin A ble tilsatt til s lut tkonsentr as joner på hhv. 1 mM og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 825 kg/cm<2> ved 4 passeringer i et M110-Y mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Et tilstrekkelig volum 10% "Triton X100"-detergent (Pierce, Rockford, IL) ble tilsatt til den nedbrutte celleoppslemming for å bringe konsentrasjonen av TX100 til 0,5%. Oppslemmingen ble omrørt i 20 timer. Det "Triton XI00"-behandlede lysat ble sentrifugert ved 12 000 x g i 40 minutter for å fjerne cellulære nedbrytningsmaterialer. Supernatantvæsken inneholdende Ll-protein, ble oppsamlet.

Supernatantvæsken ble diafiltrert mot 5 volumer 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, ved anvendelse av en 300K tangentiell gjennomstrømningsmembrankassett (Filtron, Northborough, MA). Materialet tilbakeholdt av membranen, ble vist ved radioimmunanalyse og Western-blotting å inneholde Ll-proteinet .

Retentatet ble applisert på en affinitetskolonne med høy oppløsning (11,0 cm ID x 5,3 cm) med "SP Spherodex (M)"-resin (IBF, Villeneuve-la-Garenne, Frankrike) ekvilibrert i 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 0,5 M NaCl. Etter en vask med ek-vilibreringsbuffer og en trinnvis vask med 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 1,0 M NaCl, ble Ll-proteinet eluert med en trinnvis vask med 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 2,5 M NaCl. Fraksjoner ble oppsamlet under vask og eluering. Kolonnefraksjoner ble analysert for totalt protein ved Bradford-metoden. Fraksjoner ble deretter analysert ved Western-blotting og SDS-PAGE med kolloidal Coomassie-påvisning. Fraksjoner ble også påvist ved radioimmunanalyse.

"SP Spherodex"-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av Ll-protein, ble sammenslått.

Sluttproduktet ble analysert ved Western-blotting og SDS-PAGE med kolloidal Coomassie-påvisning. Ll-proteinet ble vist ved densitometri av de Coomassie-fargede geler å være

>90% homogene. Identiteten av Ll-protein ble bekreftet ved Western-blotting. Sluttproduktet ble filtrert aseptisk gjennom en 0,22 pm membran og lagret ved 4 °C. Denne prosess ga totalt 202 mg protein.

Elektronmikroskopianalyse ble utført ved hjelp av Structure Probe (West Chester, PA). En prøvealiquot plasseres på et 200 mesh karbonbelagt kobbergitter. En dråpe av 2% fosfowolframsyre, pH 7,0, plasseres på gitteret i 20 sekunder. Gitteret tillates å lufttørke før TEM-undersøkelse. All mikroskopi utføres ved anvendelse av et "JEOL 100 CX" transmi-sjonsmikroskop (JEOL USA, Inc.) ved en akselererende spenning på 100 kV. De frembrakte mikrofotografier har en endelig for-størrelse på 100 000 x.

SDS- PAGE og Western blot- analvser

Alle geler, buffere og elektroforeseapparatur ble erholdt fra Novex (San Diego, CA) og ble utført i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Kort beskrevet, ble prøver fortynnet til like proteinkonsentrasjoner i Milli-Q-H20 og blandet 1:1 med prøveinkubasjonsbuffer inneholdende 200 mM DTT. Prøver ble inkubert i 15 minutter ved 100 °C og applisert på forhåndsstøpte 12% Tris-glysingeler. Prøvene ble underkastet elektroforese ved 125V i 1 time og 45 minutter. Geler ble fremkalt ved kolloidal Coomassle-farging ved anvendelse av et kommersielt sett (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

For Western blots ble proteiner overført til PVDF-membraner ved 25V i 40 minutter. Membraner ble vasket med Milli-Q-H20 og lufttørket. Primært antistoff var polyklonalt kanin-antiserum mot et TrpE-HPVll LI-fusjonsprotein (gave fra dr. D. Brown). Antistoff løsningen ble preparert ved fortynning av ant i serum i blottingsbuf fer (5% melk uten fett i 6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3). Inkubasjon fore-gikk i minst én time ved 20-23 °C. Flekken ble vasket tre ganger å 1 minutt i PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2, 150 mM NaCl). Sekundær antistoffløsning ble preparert ved fortynning av geit-anti-kanin-IgG alkalisk fosfatasebundet konjugat-antiserum (Pierce, Rockford, IL) i blottingsbuffer. Inkubasjon ble utført under de samme betingelser i minst én time. Flekker ble vasket som beskrevet tidligere og påvist ved anvendelse av et 1-trinns NBT/BCIP-substrat (Pierce, Rockford, IL).

Eksempel 36

Ekspresjon av HPV18 LI og L2 i gjær

Plasmider pl91-6 (pGALl-10+HPV18 LI) og pl95-ll (pGALl-10+HPV18 L1+L2) ble anvendt for å transformere S. cerevisiae- stamme nr. 1558 (MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°). Klonale isolater ble dyrket ved 30 °C i YEHD-medium inneholdende 2% galaktose i 88 timer. Etter høsting av cellene ble cellepelletene nedbrutt med glasskuler, og cellelysater ble analysert for ekspresjon av HPV18 LI- og/eller HPV18 L2-protein ved immunblotanalyse. Prøver inneholdende

25 ug totalt, cellulært protein, ble underkastet elektroforese gjennom 10% Tris-glysingeler (Novex, Inc.) under denaturerende betingelser og elektroblottet på nitrocellulosefiltre. Ll-protein ble immunpåvist ved anvendelse av kanin-antiserum mot et trpE-HPVll LI-fusjonsprotein som primært antistoff (Brown et al., 1994, Virology 201:46-54) og pepperrotperoksidase(HRP)-bundet esel-anti-kanin-IgG (Amersham, Inc.) som sekundært antistoff. Filterne ble bearbeidet ved anvendelse av kjemiluminescens "ECL"-påvisningssettet (Amersham, Inc.). Et 50-55 kDa Ll-proteinbånd ble påvist i både LI- og LI + L2-koeks-pressorgjærklonene (hhv. stammer 1725 og 1727) og ikke i den negative kontroll (pGALl-10 uten LI- eller L2-gener).

HPV18 L2-proteinet ble påvist ved Western-analyse ved anvendelse av geit-polyklonalt antiserum mot et trpE-HPV18 L2-fusjonsprotein som primært antistoff, etterfulgt av HRP-kon-jugert kanin-anti-geit-IgG (Kirkegaard og Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Filterne ble bearbeidet som beskrevet ovenfor. Ll-proteinet ble påvist som et 75 kDa proteinbånd i LI + L2-koekspressorgjærklonen (stamme 1727), men ikke i hverken den negative kontroll eller Ll-ekspressorklonen.

Eksempel 37

Fermentering av HPV18 Li ( stamme 1725) oa 18 L1+ ÅL2 ( stamme 1727)

Overflatevekst av en platekultur av stammer 1725 og 1727 ble overført aseptisk til et leucinfritt, flytende medium inneholdende (pr. liter): 8,5 g Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer og ammoniumsulfat; 0,2 g adenin; 0,2 g uracil; 10 g ravsyre; 5 g ammoniumsulfat; 40 g glukose; 0,25 g L-tyrosin; 0,1 g L-arginin; 0,3 g L-isoleucin, 0,05 g L-metionin; 0,2 g L-tryptofan; 0,05 g L-histidin; 0,2 g L-lysin; 0,3 g L-fenylalanin; dette medium ble justert til pH 5,0-5,3 med NaOH før sterilisering. Etter dyrkning ved 28 °C, 250 rpm, på et rotasjonsristeapparat, ble frosne kulturampuller preparert ved tilsetning av steril glyserol til en sluttkonsentrasjon på 17%

(vekt/volum) før lagring ved -70 °C (1 ml pr. kryoampulle). Inokulater ble utviklet i det samme medium (500 ml pr. 2-liters flaske) og ble startet ved å overføre det tinte innhold i en frossen kulturampulle etterfulgt av inkubasjon ved 28 °C, 250 rpm, på et rotasjonsristeapparat i 29 timer. Fermenter-inger av hver stamme benyttet en New Brunswick SF-116-fermen-tor med et arbeidsvolum på 10 1 et^er inokulasjon. Produk-sjonsmediet inneholdt (pr. 1): 20 g Difco gjærekstrakt; 10 g Sheffield HySoy pepton; 20 g glukose; 20 g galaktose; 0,3 ml Union Carbide "UCON LB-625" antiskummemiddel; mediet ble justert til pH 5,3 før sterilisering. Hele innholdet (500 ml) av inokulumflasken på 2 1 ble overført til fermentoren som ble inkubert ved 28 °C, 5 1 luft pr. min., 400 rpm, 0,25 kg/cm<2 >trykk. Omrøringen ble økt etter behov for å opprettholde

nivåer av oppløst oksygen høyere enn 40% metning. Fermenter-ingsutviklingen ble overvåket ved off-line glukosemålinger (Beckman-glukose 2-analysator) og on-line massespektrometri (Perkin-Elmer 1200). Etter inkubasjon i 66 timer ble det oppnådd celletettheter på 9,5 til 9,7 g tørr cellevekt pr. 1. Kulturene ble konsentrert ved hulfiberfiltrering ("Amicon H5MP01-43"-patron i et "Amicon DC-10"-filtreringssystem) til ca. 2 1, diafiltrert med 2 1 fosfatbufret saltløsning og konsentrert ytterligere (til ca. 1 1) før overføring til 500 ml sentrifugekolber. Cellepelleter ble oppsamlet ved sentrifugerlng ved 8 000 rpm ("Sorval GS-3"-rotor) i 20 minutter ved 4 °C. Etter dekantering av supernatanten ble pelletene (totalt 191 til 208 g våte celler) lagret ved -70 °C inntil anvendelse.

Eksempel 38

Rensing av rekombinant HPV type 18 Ll- kapsidproteiner

Alle trinn ble utført ved 4 °C dersom ikke annet er angitt.

Celler ble lagret nedfrosne ved -70 °C. Frosne celler (våtvekt = 126 g) ble tint ved 20-23 °C og resuspendert i 70 ml "Breaking Buffer" (20 mM natriumfosfat, pH 7,2, 100 mM NaCl). Proteaseinhibitorene PMSF og pepstatin A ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på hhv. 2 mM og 1,7 uM. Celleoppslemmingen ble nedbrutt ved et trykk på ca. 1 125 kg/cm<2> ved 4 passeringer i et M110-Y mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics Corp., Newton, MA). Den nedbrutte celleoppslemming ble sentrifugert ved 12 000 x g i 40 minutter for å fjerne cellulært nedbrytningsmateriale. Supernatantvæsken inneholdende Ll-antigen, ble oppsamlet.

Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 ved tilsetning av buffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) og applisert på en anionbytter-innfangingskolonne (9,0 cm ID x 3,9 cm) av "Fractogel" EMD TMAE-650 (M)-resin (EM Separations, Gibbstown, NJ) ekvilibrert i buffer A. Etter en vask med buffer A ble antigenet eluert med en gradient fra 0 til 1,0 M NaCl i buffer A. Kolonnefraksjoner ble analysert for totalt protein ved Bradford-metoden. Fraksjoner ble deretter analysert ved like, totale proteininn-hold ved Western-blotting og SDS-PAGE med sølvfargingspåvis-

ning.

TMAE-fraksjoner som viste sammenlignbar renhet og anrikning av Ll-protein, ble sammenslått. Antigenet ble konsentrert ved ammoniumsulfatfraksjonering. Løsningen ble jus-, tert til 35% mettet ammoniumsulfat ved tilsetning av fast reagens under forsiktig omrøring i 10 minutter. Prøven ble plassert på is, og utfelling ble tillatt å foregå i 4 timer. Prøven ble sentrifugert ved 16 000 x g i 45 minutter. Pelleten ble-resuspendert i 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-fosfat, pH 7,2,

150 mM NaCl).

Den resuspenderte pellet ble kromatografert på en størrelsesutelukkelseskolonne (2,6 cm ID x 89 cm) med "Sephacryl 500 HR"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ). Elueringsbuffer var PBS. Fraksjoner ble analysert ved Western-blotting og SDS-PAGE med sølvfargingspåvisning. De reneste fraksjoner ble sammenslått. Den resulterende porsjon ble konsentrert i en 50 ml omrøringscelle ved anvendelse av 43 mm YM-100 flatplatemembraner (Amicon, Beverly, MA) ved et N2-trykk på 0,28-0,42 kg/cm<2>.

Sluttproduktet ble analysert ved Western-blotting og SDS-PAGE med kolloidal Coomassie-påvisning. Ll-proteinet ble beregnet til å være 50-60% homogent. Identiteten av Ll-protein ble bekreftet ved Western-blotting. Sluttproduktet ble delt i aliquoter og lagret ved -70 °C. Denne prosess ga totalt 12,5 mg protein.

Eksempel 39

Fremstilling av immunogene preparater

Renset VLP formuleres i overensstemmelse med kjente metoder, slik som ved blanding av farmasøytisk akseptable bærere, stabilisatorer eller en vaksineadjuvans. Det immunogene VLP fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan prepareres for anvendelse som vaksine ved kombinasjon med et fysiologisk akseptabelt preparat, slik som f.eks. PBS, salt-løsning eller destillert vann. Det immunogene VLP administreres i et doseområde på ca. 0,1 til 100 ug, fortrinnsvis ca. 1 til ca. 20 ug, for å oppnå den ønskede, immunogene virkning. Mengden av VLP pr. formulering kan variere i overensstemmelse med mange faktorer, inkludert, men ikke begrenset til, individets tilstand, vekt, alder og kjønn. Administrering av VLP-formuleringen kan foregå på mange forskjellige måter, inkludert, men ikke begrenset til, oral, subkutan, topisk, mukosal og intramuskulær. Slike VLP-formuleringer kan være sammensatt av en enkel type VLP (dvs. VLP fra HPV6a) eller en blanding av VLP (dvs. VLP fra HPV6a, HPV11, HPV16 og HPV18).

Et antimikrobielt konserveringsmiddel, f.eks. timero-sal, kan eventuelt være til stede. De immunogene antigener fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan, om ønsket, benyttes i kombinasjon med vaksinestabilisatorer og vaksine-adjuvanser. Typiske stabilisatorer er spesifikke forbindelser, f.eks. polyanioner som heparin, inositolheksasulfat, sulfatert betasyklodekstrin, mindre spesifikke eksipienser, f.eks. aminosyrer, sorbitol, mannitol, xylitol, glyserol, sukrose, dekstrose, trehalose, og variasjoner i løsningsbetingelser, f.eks. nøytral pH, høy ionestyrke (ca. 0,5-2,0 M salter), divalente kationer (Ca<2+>, Mg2+) . Eksempler på adjuvanser er Al(OH)3 og A1(P04). Vaksinen kan lagres under avkjøling eller i lyofilisert form.

Eksempel 40

Fremstilling av antistoffer mot VLP

Renset VLP anvendes for å danne antistoffer. Betegnelsen "antistoff" som anvendt heri, inkluderer både polyklonale og monoklonale antistoffer så vel som fragmenter derav, slik som Fv, Fab og F(ab)2-fragmenter som er i stand til å binde antigen eller hapten. Antistoffene anvendes på mange forskjellige måter, inkludert, men ikke begrenset til, rensing av rekombinant VLP, rensing av native LI- eller L2-proteiner, og sett. Sett vil omfatte en rominndelt bærer egnet til å inneholde minst én tett tillukket beholder. Bæreren vil videre omfatte reagenser som anti-VLP-antistoff eller VLP egnet for påvisning av HPV eller fragmenter av HPV eller antistoffer mot HPV. Bæreren kan også inneholde påvisningsmidler, slik som merkét antigen eller enzymsubstrater eller lignende. Antistoffene eller VLP eller settene er anvendelige for mange forskjellige formål, inkludert, men ikke begrenset til, rettsmedisinske analyser og epidemiologiske undersøkelser.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av rensede viruslignende partikler (VLP-er) av humant papillomavirus, karakterisert ved at: a) en gjær transformeres med et DNA-molekyl, hvor DNA-molekylet koder for HPV-Ll- eller HPV-Ll+L2-proteiner, hvorved det fremstilles en transformert gjærcelle, b) den transformerte celle dyrkes under betingelser som muliggjør fremstilling av rekombinante proteiner og deres spontane sammensetning til VLP-er, og (c) VLP-ene innhøstes fra den transformerte celle og (d) VLP-ene renses ved hjelp av ionebytterkromatografi og størrelsesutelukkelseskromatografi.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gjæren er Saccharomyces cerevisiae.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet fra humant papillomavirus (HPV) er valgt fra gruppen bestående av: HPV type 6a, HPV type 6b, HPV type 11, HPV type 16 og HPV type 18.