FI119815B - Papilloomavirusproteiinin valmistusmenetelmä - Google Patents
Papilloomavirusproteiinin valmistusmenetelmä Download PDFInfo
- Publication number
- FI119815B FI119815B FI964592A FI964592A FI119815B FI 119815 B FI119815 B FI 119815B FI 964592 A FI964592 A FI 964592A FI 964592 A FI964592 A FI 964592A FI 119815 B FI119815 B FI 119815B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- protein
- hpv
- yeast
- crpv
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 167
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 134
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 title abstract description 40
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 30
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 82
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 81
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 51
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 claims 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims 1
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 claims 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 claims 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 claims 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 20
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 18
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 120
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 85
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 85
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 62
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 51
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 43
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 39
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 38
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 35
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 34
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 33
- 101900163635 Cottontail rabbit papillomavirus Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 32
- 241000701646 Kappapapillomavirus 2 Species 0.000 description 32
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 31
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 28
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 27
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 26
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 23
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 23
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 20
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 20
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 20
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 19
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 19
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 19
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 19
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 19
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 18
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 18
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 17
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 16
- 101900043895 Cottontail rabbit papillomavirus Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 15
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 15
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 15
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 15
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 14
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 14
- 101150029183 PEP4 gene Proteins 0.000 description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 14
- 101150075484 MNN9 gene Proteins 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 101100049401 Human papillomavirus type 16 L2 gene Proteins 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 12
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 12
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 12
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 11
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 11
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 10
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 10
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 10
- 101150101314 PRB1 gene Proteins 0.000 description 10
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 10
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 10
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 101150027802 L2 gene Proteins 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 8
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 7
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 7
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 7
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 7
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 7
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 6
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 6
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 101100243377 Mus musculus Pepd gene Proteins 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 6
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 description 5
- 101000617808 Homo sapiens Synphilin-1 Proteins 0.000 description 5
- 101000641177 Human papillomavirus type 16 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 5
- 101000641175 Human papillomavirus type 18 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 102100021997 Synphilin-1 Human genes 0.000 description 5
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 5
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 5
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101001125486 Homo sapiens Basic salivary proline-rich protein 1 Proteins 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 4
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100029516 Basic salivary proline-rich protein 1 Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101000742340 Human papillomavirus type 16 Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 3
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 3
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 101150055869 25 gene Proteins 0.000 description 2
- PNUYRSUEKBRISA-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-6-[4-(2-hydroxyethyl)piperidin-1-yl]-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1CC(CCO)CCN1C1=NC(O)=NC(O)=C1Br PNUYRSUEKBRISA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710191936 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101100065885 Caenorhabditis elegans sec-15 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 208000000907 Condylomata Acuminata Diseases 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 2
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 101150034230 LI gene Proteins 0.000 description 2
- 206010023849 Laryngeal papilloma Diseases 0.000 description 2
- 102000001109 Leukocyte L1 Antigen Complex Human genes 0.000 description 2
- 108010069316 Leukocyte L1 Antigen Complex Proteins 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000002255 anal canal Anatomy 0.000 description 2
- 208000025009 anogenital human papillomavirus infection Diseases 0.000 description 2
- 201000004201 anogenital venereal wart Diseases 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 208000024312 invasive carcinoma Diseases 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 201000000089 larynx squamous papilloma Diseases 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- PXQPEWDEAKTCGB-UHFFFAOYSA-N orotic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(=O)NC(=O)N1 PXQPEWDEAKTCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- KUUVQVSHGLHAKZ-UHFFFAOYSA-N thionine Chemical compound C=1C=CC=CSC=CC=1 KUUVQVSHGLHAKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBTMNFYXJYCQHQ-UHFFFAOYSA-N (2,3,4,5,6-pentasulfooxycyclohexyl) hydrogen sulfate Chemical compound OS(=O)(=O)OC1C(OS(O)(=O)=O)C(OS(O)(=O)=O)C(OS(O)(=O)=O)C(OS(O)(=O)=O)C1OS(O)(=O)=O NBTMNFYXJYCQHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OXIKLRTYAYRAOE-CMDGGOBGSA-N (e)-3-(1-benzyl-3-pyridin-3-ylpyrazol-4-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound N1=C(C=2C=NC=CC=2)C(/C=C/C(=O)O)=CN1CC1=CC=CC=C1 OXIKLRTYAYRAOE-CMDGGOBGSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- RWWZYORFHGIOOC-UHFFFAOYSA-N 5-chloro-6-[4-(2-hydroxyethyl)piperidin-1-yl]-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1CC(CCO)CCN1C1=NC(O)=NC(O)=C1Cl RWWZYORFHGIOOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100407317 Arabidopsis thaliana PDE338 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700031454 Bovine papillomavirus L1 Proteins 0.000 description 1
- 108700031455 Bovine papillomavirus L2 Proteins 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100351811 Caenorhabditis elegans pgal-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 101100176848 Escherichia phage N15 gene 15 gene Proteins 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 208000007842 Fibroepithelial Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000742950 Homo sapiens Retinol dehydrogenase 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000803413 Human papillomavirus type 18 Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 1
- 241001428582 Human papillomavirus type 6 Species 0.000 description 1
- 108700025391 Human papillomavirus type 6 L1 Proteins 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000785747 Mavirus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000505494 Omegavirus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101150110789 RA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038053 Retinol dehydrogenase 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100120176 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FKS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003082 abrasive agent Substances 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 229940090047 auto-injector Drugs 0.000 description 1
- 208000012999 benign epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical class OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000658 coextraction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 108010000306 endodeoxyribonuclease PaeI Proteins 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000004374 forensic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007434 lytic lesion Effects 0.000 description 1
- ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L magnesium;aluminum;dihydroxide;trihydrate Chemical compound O.O.O.[OH-].[OH-].[Mg+2].[Al] ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 150000004682 monohydrates Chemical group 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229960005010 orotic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 235000001954 papillon Nutrition 0.000 description 1
- 244000229285 papillon Species 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 108010006230 protelin Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 229940114241 recombivax Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- CMPGARWFYBADJI-UHFFFAOYSA-L tungstic acid Chemical compound O[W](O)(=O)=O CMPGARWFYBADJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N uranium Chemical compound [U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U] DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- -1 · V 1 25 si Chemical compound 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
119815
Papilloomavirusprofceiinin valmistusmenetelmä
Thteydet muihin patenttihakemuksiin Tämä on jatkohakemus US-patenttihakemukselle sarja-· 5 nro 08/242 794, pantu vireille 16. toukokuuta 1994, nyt vireillä.
Keksinnön ala Tämä keksintö liittyy puhdistetun, ihmisen papil-loomavirus (HPV) proteiinin valmistusmenetelmään, proteii-10 nin käsittäessä HPV-viruksen kaltaisia partikkeleita (VLP). Keksinnön tausta
Papiiloomavirusinfektioita ilmenee monissa eri eläimissä/ mukaan lukien ihmiset, lampaat, koirat, kissat, kanit, apinat, käärmeet ja naudat. Papil1oomavirukset infek-15 toivat epiteelisoluja ja saavat yleensä aikaan hyvänlaatuisia epiteeli- tai fibroepiteelikasvaimia infektiokohdassa. Papilloomavirukset ovat lajispesifisiä inf ektiivisi ä agens-seja: ihmisen papiiloomavirus ei voi infektoida eläintä, joka ei ole ihminen.
20 Papilloomavirukset voidaan luokitella eri ryhmiin niiden infektoiman isännän perusteella. Uimisen papillooma- • · virukset (HPV) luokitellaan lisäksi yli 60 tyypiksi DHA-: sekvenssihomo 1 ogian perusteella (katsauksena katso Papillo- * :*: maviruses and Human Cancer, toim, H. Pfister, CRC Press, • ·· · 25 Inc. , 1990). Papilloomavirukset; vaikuttavat olevan tyyppis- * · · · . .·. pesifisiä immunogeenejä sikäli, että neutraloiva immuni- • * · teetti yhden papilloomavirustyypin infektiota kohtaan ei • · · anna immuniteettia toista papiiloomavirustyyppiä vastaan.
. . Ihmisissä eri HPV-'tyypit saavat aikaan eri tauteja.
• · · *·]·* 30 HPV-tyypit 1, 2, 3, 4, 7, 10 ja 26 - 29 saavat aikaan hy- *···* vänlaatuisia syyliä sekä normaaleissa että immuunijärjes- :***: telmän suhteen vajavaisissa yksilöissä. HPV-tyypit 5, 8, 9, ··· ·;··{ 12, 14, 15, 17, 19 - 25, 36 ja 46 ^ 50 saavat aikaan lit- * . teitä leesioita immuunijärjestelmäh suhteen vajavaisissa 35 yksilöissä. HPV-tyypit 6, 11, 34, 39, 41 - 44 ja 51 - 55 • · • ··* 119815 a saavat aikaan ei-maiigneja kondyloomia genitaalien tai hengitysteiden limakalvoilla. HPV-tyypit 16 ja 18 saavat aikaan epiteelien dysplasiaa genitaalien limakalvoilla ja ne liittyvät suureen osaan in situ ja invasiivisia karsinoomia 5 kohdunkaulassa, vaginassa, vaivassa ja anaalikanavassa.
K pv 6 ja Ή pvli ovat kausatiivisia agensseja yli 90 prosentissa kaikista kondyloomista (genitaalisista syylistä) ja kurkunpään papilloomista. HPV tyyppi 6:ii yleisin alatyyppi on HPV6a.
10 Immunologiset tutkimukset eläimissä ovat osoitta neet, että papi1loomavirusantigeeneihin kohdistuvien neutraloivien vasta-aineiden tuotanto estää infektion homologisella viruksella. Vaikeudet, jotka liittyvät papilloomavirusten viljelyyn in vitro, ovat hidastaneet tehokkaiden pa-15 pii1oomavirusrokoLteiden kehittämistä. Tehokkaan HPV rokotteen kehittämistä on hidastanut erityisesti soveliaan eläinmalIin puuttuminen,
Papilloomaviruksen neutraloituminen vasta-ainei1la vaikuttaa olevan tyyppispesifistä ja riippuvaista viruksen 20 pinnalla olevista konformationaalisista epitoopeista.
Pap i 11 o oma v i r uks e t ovat pieniä (50 - 60 nm) , vai- i#*.j pat tornia, ikosahedr aal is i a DNA-viruksia, jotka koodit tav at jopa kahdeksaa varhaista ja kahta myöhäistä geeniä. Virus- j ;*· genomien avoimille lukukehyksille (ORF) on annettu nimeksi · * · 2 5 El - E7 ja Li ja L2, jossa "E" tarkoittaa varhaista ja "L" • ·· · . .·, tarkoittaa myöhäistä. Li ja L2 koodit tavat viruksen kapsi- * * * !!!< diproteiineja. Varhaiset (E) geenit liittyvät sellaisiin • · · * toimintoihin kuten viruksen replikaatio ja solun transformaatio .
• * • · · ’·*·* 30 Ll-proteiini on pääkapsidiproteiini., ja sillä on * * · *...· 55 ··· 60 kDa:n molekyylipaino . L2-proteiini on vähäIukuisem- Φ ;***. pi kapsidiproteiinijonka ennustettu molekyylipaino on • · · 55 - 60 kDa ja sillä on näennäinen molekyylipaino 75 - • # 100 kDa polyakryyliamidigeelielekr.roforeesin perusteella, 35 Immunologiset tulokset viittaavat siihen, että suurin osa M» • · • · • · · 3 119815 L2-proteiinista on Ll-proteiinin suhteen sisäpuolella* L2-proteiinit ovat hyvin konservoi tiine itä eri pap i 11 oomavi r us -ten joukossa, erityisesti C-päässä olevat 10 emäksistä aminohappoa. Ll-ORF on hyvin konservoitunut eri papi31oomavi- 5 ruston joukossa.
LI- ja L2-geenejä on käytetty tuottamaan rokotteita papiiloomavirusinfektioiden estämistä ja hoitamista varten eläimissä.. Zhou ym. (1991, 1992} kloonasivat HPV tyyppi 16;n Li- ja L2-geenit vacciniavirusvektoriin ja infektoivat 10 CV-1-nisäkässoluja rekombinanttivektorilla, jolloin saatiin viruksen kaltaisia partikkeleita (VLP).
On saatu aikaan bakteerissa tuotetut rekombinantti-set naudan papi11oomaviruksen Li ja L2. Rekombinanttisia bakteeriperäisiä proteiineja vastaan suunnatut neutraloivat 15 seerumit ristireagoivat iuonnonviruksen kanssa matalilla tasoilla, mikä johtui oletettavasti eroista natiivien ja bakteeriperäisten proteiinien konformaatioissa.
Rekombinanttisia baku1oviruksia, jotka ekspressoivat HPV6 LI;n, HPVll Li:n, HPV16 Li-n, HPV18 Ll:n, HPV31 20 Li:n tai HPV16 L2:n ORP;eja, on käytetty infektoimaan SF9- hyönteissoluja ja tuottamaan LI- ja L2-proteiineja. Western blot -analyysit osoittivat, että bakulovirusperäiset LI- ja ·'·*; L2-proteiinit reagoivat HPV16-vasta-aineen kanssa. Bakulo- : .·. virusperäinen Li muodostaa VL.p-partikkeleita.
• · · · 25 Carter ym. (1991) osoittivat, että rekombinantti- silla Saccharomyces cerevisiae -karmoilla voidaan tuottaa lii HPV16:n LI- ja HPV16 m L2-p.roteiineja. Carter ym. osoitti- i » · vat myös HPV6b:n LI- ja L2-proteiinien tuotannon. HPV6b:n LI-proteiini ei ollut täyspitkä LI-proteiini. Rekombinant- • « · *·*·* 30 tiset proteiinit tuotettiin solunsisäisinä samoin kuin eri- ··· tettyinä tuotteina. Rekombinant tiset Li- ja L2-proteiinit ;***· olivat molekyylipainoiltaan samanlaisia kuin natiivit pro- ·* teiinit. Kun nämä proteiinit ekspressoiLiin solunsisäises-* # ti, suurimman osan proteiinista havaittiin olevan liukene- ’ ’ 35 matonta kun solut hajotettiin denaturoivien reagenssien • · • * ··« 4 119815 poissaollessa,. Vaikka tämä liukenemattomuus voi edistää proteiinin puhdistusta, se voi estää proteiinin natiivien epitooppien analyysiä.
Hiivasta eritettyjen rekombinanttiprotei inien osoi-5 tettiin sisältävän hiivasta peräisin olevia hiilihydraatteja. Häiden N-sidoksellisten oligosakkaa'idien läsnäolo voi peittää natiiveja epitooppeja. Lisäksi eritetyt rekombinanttiprotei init voivat sisältää muita modifikaatioita, kuten sekretorisen leader-sekvenssin säilymisen.
10 Olisi hyödyllistä kehittää menetelmiä, joilla voi taisiin tuottaa suuria määriä minkä tahansa lajin ja tyypin papilloomaviruksen proteiineja rekombinanttihiivoja viljelemällä, Olisi myös hyödyllistä tuottaa suuria määriä sellaisia papi1loomaviruspro tei inej a, joissa olisi natiivien 15 proteiinien immuniteetin antavia ominaisuuksia, kuten na-tiiviu proteiini n Iconformaatio.
Tämä keksintö koskee sellaisten rekombinanttisten papilloomavirusproteiinien tuotantoa, joilla olisi natiivien papilloomavirusproteiinien immuniteetin antavia ominai-20 suuksia, samoin kuin niiden käyttö - ja tuotantomenetelmiä. Tämä keksintö koskee profylaktisen ja mahdollisesti terä·· it1.| peuttisen rokotteen valmistusta papi lloomavirus infektio ta silmällä pitäen. Tämän keksinnön mukaiset r ekombinan 11 ipr o - • teiinit kykenevät muodostamaan viruksen kaltaisia partikke-·« · 25 leita. Nämä VLP:t ovat immunogeenisiä ja estävät syylien ···· ..·, muodostumisen eläinmallissa. Tämä keksintö käyttää malli φ · V.'.' järjestelminä pumpulihäntäkaniinin papi 11 oomavirusta (CRPV) • · · * ja HPV tyyppi 6:ta (alatyyppi 6a).
Keksinnön yhteenveto • · · *·11 30 Tarjotaan. rekombinantt i siä ekspressiovektoreita, *...· jotka koodattavat papilloomaviruksen LI- ja L2-pro teline ja, rekombinanttiproteiinien valmistusmenetelmiä ja rekombi- ··· nant tiproteiini en käy ttömene telmiä.
« *·· * · · ·«· 5: 119815
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 esittää kaksisuuntaisen hiivaekspressiovek-torin, jota käytettiin ekspressoitaessa papi.iloomaviruksen Li- j,a/tai L2-kapsidiproteiineja.
5 Kuvio 2 esittää HPV6a:n Li tn ekspression hiivassa (.iminunoblotti > .
Kuvio 3 esittää HPV6a:n L2:n ekspression hiivassa. Hiivassa ekspressoidun HPV6a :n L2:n iminunoblotti: kaista 1, molekyylipainomarkker.it; kaista 2, positiivikontrollina K 10 colissa ekspressoitu trpIi-L2-fuusioproteiini; kaista 4, ne-gatiivikontro11ina hiivassa ekspressoitu HPV6a:n Li; kaista 5, hiivassa ekspressoitu HPV6a:n 1.2 (katso tekstistä kokeen yksityiskohdat).
Kuvio 4 on hiivassa ekspressoitujen HPV6a:n Ll-VLP-15 partikkeleiden elekironimikrovalokuva.
Kuvio 5 on hiivassa ekspressoitujen HFV6a:n L1/L2-VLP-molekyylien elektronimikrovalokuva.
Kuvio 6; hiivassa ekspressoitujen CRPV:n Li-, L2-ja LI+L2-proteiinien immunoblotit. Osakuva A: CRPV LI:n 20 ekspressio mitattuna reaktiivisuudella CRPV:n Llttä vastaan suunnatun antiseerumin kanssa. Kaista 1: molekyylipaino- :/.j markkerit (kDa) (Amersham Rainbow™ -markkerit, 14 300 -
200 000 daltonia), kaista 2, BJ5462, joka sisältää CRPV LI
• -ekspressiovektorin, kaista 3, kanta 1569, joka sisltää • · · · 25 CRPV L2 “ekspressiovektorin, kaistat 4 ja 5, kaksi kannan . ,·, 1569 isolaattia, jotka on kotransformoitu kahdella plasmi- • · · dii la CRPV Li: n ja CRPV L2 :n ekspressiota varten, kaistat • · · * 6-8, kolme kannan 1569 isolaattia, jotka sisältävät yksittäisen vektorin CRPV:n Li- ja L2-proteiinien koekspres- '·’·1 30 s iota varten, kaistat 9 ja 10, kaksi BJ5462 :n isolaattia, »2· jotka sisältävät yksittäisen vektorin CRPV Li- ja L2- .3. proteiinien koekspressiota varten. Li:n ja L2:n migraation ··· asema on merkitty asianmukaisen osakuvan oikeanpuoleiseen • · • akseliin. Kuvio 6 on ···»1 * 1i • 1 2 • · 3 »1· 6 119815
Kuvio 7 on kaavamainen tiivistelmä S. cerevisiae -kannan 1558 muodostamisesta.
Kuvio 8 on kaavamainen tiivistelmä S. cerevisiae -kannan 1569 muodostamisesta.
5 Kuvio 9 hahmottelee päävaiheet puhdistusmenetelmäs sä .
Kuvio 10 on lista kannoista.
Kuvio 11 esittää joukon SDS-PAGE-ana1yysoj ä koskien hiivasta puhdistettuja HPV16:n LI:tä ja L2:ta. Lopullisen 10 puhdistetun VLP;n lisäksi mukaan sisällytetään puhdistusprosessin välivaiheista säilyttää ("retains"). Taulukko tarjoaa nimen kussakin kaistassa olevalle näytteelle. Mukaan on sisällytetty geeli, joka on värjätty kolloidisella Cöo-massiella, samoin kuin Western hiotit, jotka on tutkittu 15 LI- ja L2-proteiineja vastaan suunnatuilla antiseerumeilla.
Kuvio 12 on kaavamainen esitys pumpulihäntäkaniinin papilloomaviruksen Li:n puhdistusmenetelmistä.
Kuviot 13 ja 14 Ovat puhdistetun VLP: n: SDS/PAGE-analyysejä.
20 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus . , Tämä keksintö tarjoaa käyttöön puhdistetun, ihmisen • · · *·"/ papilloomavirus (HPV) proteiinin valmistusmenetelmän, prote- • · · '·* * iinin käsittäessä HPV-viruksen kaltaisia partikkeleita (VLP), • · : jolle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä kuvataan patent- 25 tivaa tilauksessa 1.
: Tarjotaan menetelmiä, koostumuksia ja prosesseja ;*·*: papilloömaviruS (PV) -infektion estämiseksi, karakterisoi- * miseksi, havaitsemiseksi ja hoitamiseksi. Menetelmät poh-jautuvat r ekombinan 11 i s en Li- tai rekombinan 11 i s en T,2- tai • · · ('.’f 30 rekprabinanttxsen Li· ja L2-proteiinin tuottamiseen hiivas- • * *" sa. Rekombinanttiproteiinit kykenevät jäljittelemään natii- ··· vin pv·: n konformationaalisia neutraloivia epitooppeja. Re-*;**: kombinanttiset Li- tai Li- ja L2-proteiinit saattavat myös kyetä muodostamaan viruksen kaltaisia partikkeleita (VLP) .
* · ... 35 Keksinnön mukaisiin koostumuksiin kuuluvat, näihin rajoit- • · • · ··· 7 119815 tumatta, yhdistelmä DNA molekyylit, jotka koodittavat Lite.! L2- tai Li- ja L2-proteiineja, rekombinant tiprotei init joko yksin tai yhdistelmänä toisten rekombinanttiprot eiini-en kanssa, VLP, joka koostuu ainakin yhdestä rekombinantti-5 proteiinista, rekombinant tiproteiinien fragmentit, farmaseuttiset koostumukset, jotka sisältävät rekombinanttipro-teiineja, rokotekoostumukset, jotka sisältävät rekombiiiänt-tiproteiineja, vasta-aineet rekombinant t ipro telineille tai VLP: lie, unmunogeeniset koostumukset, jotka sisältävät ai-10 nakin yhden rekombinanttiprotei inin, ja diagnostiset tarvi-kesarjat, jotka sisältävät yhd i s t e 1 mä - DNA - mo 1 ekyy 1 e j ä tai rekombinanttiproteiineja. Tämän keksinnön mukaisiin menetelmiin kuuluvat, näihin rajoittumatta, menetelmä, jolla voidaan tuottaa rekombinanttipruteiini, jolle on tunnusmer-15 killistä, että sovelias hiivaisäntäsolu transformoidaan re-kombinanttisella DNA-molekyyIillä, transformoitua hiivaa viljellään olosuhteissa, jotka sallivat rekombinanttiprotοι inia koodittavan DNA:n ekspression, ja rekombinanttiprote-iini puhdistetaan. Tämän keksinnön mukaisiin menetelmiin 20 kuuluu myös rekombinanttiproteiinin, rekombinanttiproteii-nikoostumuksien tai VLP:n antaminen eläimeen, mukaan luki- • · *. *: en, tähän rajoittumatta, ihmiset. soveliaisiin isäntäso- ·*· y * luihin kuuluvat, näihin rajoittumatta, hiivakannat, jotka ;t| j kuuluvat sukuihin Saccharomyces, Pichia, Kluyvennyces, •j* 25 Schizosaccharomyces ja Hansenula.
• ·*· PapilloOmavirusinfektioita ilmenee monissa eri ··· eläimissä, mukaan lukien ihmiset, lampaat, koirat, kissat, kanit, apinat, käärmeet ja naudat. Pap.illoomavirukset in.-· . ^ fektoivat epiteelisoluja ja aiheuttavat yleensä hyvänlaa- ψ · · M 30 tuisia epiteeli- tai fibroepiteelikasvaimia infektiokohdas- t * • » ·;· sa.
Peipi 11 oomavi rukset. voidaan luokitella eri ryhmiin ····· niiden infektoiman, isännän perusteella. Uimisen papillooma- virukset (HPV) luokitellaan lisäksi yli 60 tyypiksi DNA- • · ... 35 sekvenssihomo.logiän perusteella (katsauksena katso Papillo- • « • · ··» 8 119815 maviruses and Human Cancer, fcoim. II. Pfister, CRC Press, Inc., 1990). Pap illoomavirukset vaikuttavat olevan tyyppis-pesifi siä immunogeenej ä sikäli, että neutraloiva immuniteetti- yhden papilloomavirustyypin infektiota kohtaan ei 5 anna immuniteettia toista papilloomavirustyyppiä vastaan.
Ihmisissä eri HPV-tyypit saavat aikaan eri tauteja. HPV-tyypit 1, 2, 3, 4, 7, 10 ja 26 - 29 saavat aikaan hyvänlaatuisia syyliä sekä normaaleissa että immuunijärjestelmän suhteen vajavaisissa yksilöissä. HPV-tyypit 5, 8, 9, 10 12, 14, 15, 17, 19 - 25, 36 ja 46 - 50 saavat aikaan lit teitä leesioita immuunijärjestelmän suhteen vajavaisissa yksilöissä, HPV-tyypit 6, 11, 34, 39, 41 - 44 ja 51 - 55 saavat aikaan ei maligneja kondyloomia genikaalien tai hengitysteiden limakalvoilla. HPV-tyypit 16 ja 18 saavat ai-15 kaan epiteelien dysplasiaa qenitaalien limakalvoilla ja ne liittyvät suureen osaan in situ ja invasiivi siä karsinoomia kohdunkaulassa, vaginassa, vaivassa ja anaalikanavassa. HPV6 ja HPVll saavat aikaan valtaosan genitaalisista syylistä ja kurkunpään papilloomista.
20 Immunologiset tutkimukset eläimissä ovat osoitta- , , neat, että papilloomaviruksen kapsidiproteiineja vastaan • · · *; " suunnattujen neutraloivien vasta-aineiden tuotanto estää * * * * V * homologisen viruksen aiheuttamaa infektiota. Tehokkaiden • · · papilloomavirusrokotteiden kehitystä ovat hidastaneet vai- „*·* 25 keudet, jotka liittyvät pap i 11 ooma v i r u s t en viljelyyn in : vitro. Tehokkaan HPV-rokotteen kehittämistä on hidastanut • · ® :*·*: erityisesti soveliaan eläinmallin puuttumin®!..
Vasta-aineiden aikaansaama papilloomaviruksen neut-raloituminen vaikuttaa olevan tyyppispesifistä ja riippu- • · · (.'»t 30 väistä viruksen pinnalla olevista konforraationaalisista • · *Γ epitoopeista.
···
Papilloomavirukset ovat pieniä (50 - 60 nm) , vai- *i"i pattomia, ikosahedraalisia DNA-viruksia, jotka koodittavat jopa kahdeksaa varhaista ja kahta myöhäistä geeniä. Virus- • · #... 35 genomien avoimille lukukehyksille (OR? : t) on annettu nimik- * · • · · 9 119815 si El ~ E7 ja LI ja L2, jossa "E" tarkoittaa varhaista ja "L": t arkoittaa myöhäistä, LI ja L2 koodittavat viruksen kapsirliproteiineja. Varhaiset (E) geenit liittyvät sellaisiin toimintoihin kuten viruksen replikaatio ja transfor-5 maatio.
LI-proteiini on pääkapsidiproteiini ja sen molekyylipaino on 55 ··· 60 kDa. L2-proteiini oh vähäisempi kapsidipr o t ei ini, jonka ennustettu molekyylipaino on 55 - 60 kDa ja näennäinen molekyylipaino 75 - 100 kDa polyakryyliamidi-10 geelielektroforeesin perusteella.
HPV 16: n Li-, HPVl6:n L2-, ja HPV tyyppi 6:n Ll-proteiinien tuotanto Saccharomyces cerevisiaen rekombinant-tikannoissa on kuvattu. Olisi hyödyllistä kehittää menetelmiä;, joilla voitaisiin tuottaa suuria määriä minkä tahansa 15 lajin ja minkä tahansa tyypin papilloomavirusten proteiineja rekombinanttihiivoja viljelemällä. Olisi myös hyödyllis tä tuottaa suuria määriä sellaisia papilloomavirusprote-iineja, joissa olisi natiivien proteiinien immuniteetin an-, tavia ominaisuuksia, kuten natiivin proteiinin konformaa-20 tio.
Tämä keksintö koskee sellaisten puhdistettujen re- • * · *· *! kombinant ti s ten papi 1 loomavirusprotei inien tuottamista, jois- (·· V · sa on natiivien papilloomavirusproteiinien immuniteetin an- * · ;,· J tavia ominaisuuksia, samoin kuin niiden tuotanto- ja käytti* 25 tömenetelmiä. Tämä keksintö koskee erityisesti profylakti- : :*· sen rokotteen tuotantoa papilloomavirusinfektiota silmällä ·· · ;*r. pitäen. Tästä keksinnöstä on esimerkkinä pumpulihantakanii- nin papilloomavirus (CRPV) ja ihmisen papilloomavirus tyyp-pi 6 (HPV tyyppi 6 tai HPV6) mallijärjestelminä. Valaisemi- * * * M 30 nen esimerkein ei rajoita keksinnön suojapiiriä, joka kä-* · • · "* sittää muut papilloomaviruksen (PV) tyypit 3a alatyypit, • » *
ϊ.,.ϊ mukaan lukien, näihin rajoittumatta, HPV tyyppi 11, HPV
*:**: tyyppi 16 ja HPV tyyppi 18, samoin kuin HPV alatyyppi 6a ja HPV alatyyppi 6b.
• · • · · « · • · • · · 10 119815
Farmaseuttisesti hyödyllisiä koostumuksia, jotka sisältävät proteiinit tai VLP:n, voidaan formuloida tunnettujen menetelmien mukaisesti, kuten sekoittamalla farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa. Esimerkkejä sei-5 laisista kantajista ja formulointimenetelmistä voidaan löytää teoksesta Remington's Pharmaceutical Sciences. Sellaisen farmaseuttisesti hyväksyttävän koostumuksen muodostamiseksi, joka soveltuu tehokasta antamista varten, sellaiset koostumukset sisältävät tehokkaan määrän proteiinia tai 10 VLP:tä. Sellaiset koostumukset voivat sisältää proteiineja tai VLP:n, jotka ovat peräisin useammasta kuin yhdestä HPV-tyypistä.
Terapeuttiset tai diagnostiset koostumukset annetaan yksilölle määrinä, jotka riittävät PV--infektio iden hoi-15 terni seen. tai diagnosoimiseen. Tehokas määrä voi vaihdella monien eri tekijöiden mukaan, kuten yksilön tila, paino, sukupuoli ja ikä. Muut tekijät sisältävät antotavan. Koostumukset annetaan yleensä annoksina, jotka ovat välillä 1 yg - noin 250 yg.
20 Farmaseuttiset koostumukset voidaan tarjota yksi- . . lölle monia eri reittejä pitkin, kuten ihonalaisesti, pai- • # · *· *: ka 11.is es ti, suun kautta, limakalvon kautta ja lihaksen- • · · V * sisäisesti.
• · : Keksinnön mukaiset rokotteet käsittävät rekombi- 25 nanttisia proteiineja tai. VLP:n, jotka sisältävät anfci- : geenisiä determinantteja, jotka ovat välttämättömiä neutra- ··· ;'·*· loivien vasta-aineiden muodostumisen indusoimiseksi isän- nässä. Sellaiset rokotteet ovat myös riittävän tehokkaita, jotta, niitä voitaisiin antaa ilman kliinisen infektion vaa- • · · ,··.^ 30 raa, niillä ei ole toksisia sivuvaikutuksia, ne voidaan an- • * T taa tehokasta reittiä pitkin, ne ovat stabiileja ja ne ovat • · *...: yhteensopivia rokötekantajien kanssa.
*ϊ": Rokotteet voidaan antaa monia eri reittejä pitkin, kuten suun kautta, parenteraalisesti, ihonalaisesti, lima- • · ... 35 kalvon kautta tai lihaksensisäisesti. Annettava annos voi · • · • · · 11 119815 vaihdella yksilön tilan, sukupuolen, painon ja iän mukai-sesti, antoreitin mukaisesti ja rokotteen PV-tyypin mukaisesti. Rokotetta voidaan käyttää sellaisina amlosmuotöinä kuten kapselit, suspensiot, eliksiirit tai nestemäiset liu-5 okset. Rokote voidaan formuloida immunologisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.
Rokotteet annetaan terapeuttisesti tehokkaina määrinä, se on: määrinä, jotka riittävät tuottamaan immur.olo-cf is esti suo j aavan vasteen. Terapeuttisesti tehokas määrä 10 voi vaihdella PV-tyypin mukaisesti. Rokote voidaan antaa yksittäisinä tai moninkertaisina annoksina.
Nämä menetelmät mahdollistavat subviraalisten rokotteiden formuloimisen PV~infektion estämistä silmällä pitäen. Menetelmiä käyttäen voidaan tehdä joko monovalentteja 15 tai multivalentteja PV-rokotfei ta. Esimerkiksi monovalentti HPV tyyppi 16 -rokote voidaan tehdä formuloimalla rekombi-nanttinen HPV 16 :n Li proteiini tai L2-proteiini tai Li- ja L2-proteiini. Vaihtoehtoisesti multivalentti HFV-rokote voidaan formuloida sekoittamalla LI- tai L2- tai LI- ja L2-20 proteiinit tai vlp, jotka ovat peräisin eri HPV-tyypeistä.
Rekombinanttiproteiineja ja VLP:tä voidaan käyttää • · immunogeenisia koostumuksia sisältävässä f ormulaatiossa.
• · · V * Sellaiset koostumukset, soveliaaseen isäntään tuotuna, ky- |tj ί ken evät saamaan aikaan isännässä immunologisen vasteen.
*·· 25 Rekombinanttiproteiineja ja VLP:ta voidaan käyttää ··*· ; vasta-aineiden tuottamiseen. Termi "vasta-aine" tässä käy- • · · tettynä käsittää sekä polyk i onaaliset että monoklonaaliset *^· · vasta-aiheet, samoin kuin niiden fragmentit, kuten Fv-, . Fab- ja F(ab)2-fragmentit, jotka kykenevät sitomaan anti- • · · h; 30 geeniä tai kapteenia.
• φ *·;·* Rekombinanttiproteiineja, VLP: tä ja vasta-aineita voidaan käyttää HPV-infektion serotyypityksessä ja HPV-seu- ·:··· lonnassa. Rekombinanttiset proteiinit, VLP ja vasta-aineet ' soveltuvat sellaisten tarvikesarjojen formuloimiseen, jotka · ... 35 soveltuvat HPV:n detektioon ja serotyypitykseen. Sellainen • · • ·
• M
12 119815 tarvikesarja sisältäisi osastoihin jaetun telineen, joka soveltuisi pitämään ainakin yhden säiliön tiukasti kiinni. Teline sisältäisi lisäksi reagensseja kuten rekombinaril Sisen HPV-proteiinin tai VLP:n tai HPV-vasta-aineita, jotka 5 soveltuisivat monien eri HPV-fcyyppien detektioon. Teline sisältäisi myös mahdollisesti havaitsemiskeinoja, kuten leimatun antigeenin tai entsyymisubstraatteja tai vastaavia.
Eekombinanttiproteiinit ja VLP ovat myös hyödyllisiä molekyylipaino- ja molekyyl i kokomarJokereina.
10 Seuraavat esimerkit tarjotaan keksinnön määrittele miseksi edelleen, rajoittamatta kuitenkaan keksintöä näiden esimerkkien yksityiskohdi11a.
Esimerkki 1
Hiivakannan U9 valmistus 15 Saccharomyces cerevisiae kanta 2150-2-3 (MATa, leu2-04, adel, cirpj hankittiin tri Leland Hartwellilta (University of Washington, Seattle, WA) . Kannan 2150-2-3 soluja kasvatettiin yli yön 30 °C:n lämpötilassa 5 ml:ssa YEHD-elatusainetta (Carty ym., J. Ind. Micro. 2 (1987) 117-20 121}. Solut pestiin 3 kertaa steriilissä, tislatussa vedes sä, resuspensoitiin 2 ml:aan steriiliä tislattua vettä ja ^· · *.**:* 0,1 ml solususpensiota ma 1 jättiin kukin kuudelle 5-fluoro- • · V · oroottihappo (POA) -maljoille ura3-mutanttien selektoimi- jfj*: seksi (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Gene· ··· 25 tics) . Maljoja inkuboitiin 30 °C:n lämpötilassa. Elatusaine ···· ; j*; sisälsi per 250 ml tislattua vettä: 3,5 g Difcon "Yeast ···
Nitrogen Base" ilman aminohappoja ja ammoniumsulfaattia; 0,5 g 5-fluoro -oroottihappoa, 25 mg urasiilia ja 10,0 g . . dekstroosia.
* * ♦ 30 Elatusaine steriloitiin suodattamalla 0,2 μπι mem- * · ’·;·* Uraanien kautta ja sekoitettiin sitten 250 ml:aan 4 % Bac- to-Agaria (Difco) , joka oli pidetty 50 °C:n lämpötilassa, ·:··· 10 ml:aan adeniiniliuosta (1,2 mg/ml) ja 5 ml:aan L-leu- *, siiniliuosta (180 mg/50 ml). Tuloksena olevaa elatusainetta [,,* 35 jaettiin 20 ml per petrimalja.
• · • · • · · 13 119815 5 päivän inkubaation jälkeen oli ilmaantunut useita pesäkkeitä. Yksittäisiä pesäkkeitä eristettiin vetämällä pesäkkeitä viiruiksi alkuperäisiltä FOA-maljoilta tuoreille FOA-maljoille, joita inkuboitiin sitten 30 eC:n lämpö-5 tilassa. Toisesta FOA-maljojen joukosta peräisin oleva pesäkkeiden joukko testattiin ura3-mutaation läsnäoloa silmällä pitäen tekemällä replikamaljaus sekä YEHD-mal-joille että urasiili-miinus-maljoille. Haluttu tulos oli hyvä kasvu YEHDillä eikä kasvua urasiili-miinus-maljoilla. 10 Saatiin yksi isolaatti (U9), jossa ilmeni nämä ominaisuudet. Se varastoitiin pakastettuna glyserolistokkina (kanta nro 325) -70 °C:n lämpötilaan myöhempää käyttöä varten.
Esimerkki 2
Vektorin valmistus hiivan MNN9-geenin rikkomista 15 varten
Vektorin valmistamiseksi MNN9-geenin hajottamista varten oli ensin välttämätöntä kloonata MNN9-geeni S. cerevisiaen genomisesta DNA: sta. Tämä saatiin aikaan polymeraasiketjureaktio (PCR) -standarditeknologialla. 5’-20 "sense"-aluke ja 3’-"antisense"-aluke täyspitkän MNN9:n koodattavan sekvenssin PCR:ää varten suunniteltiin hiivan ·.: MNN9-geenin julkaistun sekvenssin pohjalta (Zymogenetics: ···! EP-patenttihakemus nro 88 117 834.7, julkaisunro 0-314- * · * , 096-A2). Käytettiin seuraavia oligodeoksinukleotidialuk- • ! · *·*,* 25 keitä, jotka sisälsivät reunassa HindiII-kohdat (allevii- • f f ··* vattu):
*·»* "sense"-aluke: 5’-CTT AAA GCT tat GTC ACT TTC TCT TGT ATC
« · *.* * G-3' (sekvenssi nro 1) "antisense"-aluke: 5'-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC J iI 30 CTC-3' (sekvenssi nro 2) jT: MNN9-geenin aloittava metioniinikodoni on korostet- tu lihavoinnilla. PCR suoritettiin käyttämällä templaat- S · , tina genomista DNA:ta S. cerevisiae -kannasta JRY188, Taq- DNA-polymeraasia (Perkin Elmer) ja 25 sykliä monistusta • J · 35 (94 °C 1 min, 37 °C 2 min, 72 eC 3 min). Tuloksena oleva • » 14 119815 1,2 kiloemäsparln PCR-fragmentti digestoitiin HindIII:lla, geelipuhdistettiin ja ligoitiin Hindlll-digestoidun, emäksisellä fosfataasilla käsitellyn pUC13:n kanssa (Pharmacia). Tuloksena olevalle plasmidille annettiin ni-5 meksi pll83.
Jotta MNN9-geeni saataisiin rikottua hiivan I7RA3-geenillä, plasmidi pBR322-URA3 (joka sisältää 1,1 kilo-emäsparin HindiII-fragmentin, joka koodittaa S. cerevi-siaen URA3-geeniä ja joka on subkloonattu pBR322:n 10 HindiII-kohtaan) digestoitiin HindIII:lla ja toiminnalli sen l/RA3-geenin sisältävä 1,1 kiloemäsparin DNA-fragmentti geelipuhdistettiin, päät saatettiin tasaisiksi T4 DNA-po-lymeraasilla ja sitten tämä ligoitiin Pmll-digestoituun plasmidiin pll83 (Pmll katkaisee MNN9:n koodittavan sek-15 venssin sisältä). Tuloksena oleva plasmidi pll99 sisältää MNN99-geenin, joka on rikottu toiminnallisella I7RA3-gee-nillä.
Esimerkki 3
Sellaisen U9:stä johdetun 1372-kannan muodostani! -20 nen, joka sisältää rikotun MNN9-geenin MNN9-geenin rikkomista varten kannassa U9 (nro 325) 30 pg plasmidia pll99 digestoitiin Hindlllin kanssa, jol-,···, loin saatiin aikaan lineaarinen mnn9: ;URA3-rikkomiskaset- f · · .*t.t ti. 325-kannan solut transformoitiin Hindlll-digestoidulla "V 25 pll99-DNA:11a sferoplastimenetelmällä (Hinnen ym. 1978, **" Proc. Natl. Acad. Sei. USA £5:1929-1933) ja transformantit i S * »··" selektoitiin synteettisellä agarelatusaineella, josta V* puuttuu urasiili ja joka sisältää 1,0 M sorbitolin. Syn teettinen elatusaine sisälsi per litra tislattua vettä: ϊ30 agaria 20 g, hiivan typenlähdettä ilman aminohappoja, ΓΓί 6,7 g; adeniinia 0,04 g; L-tyrosiinia 0,05 g; sorbitolia 182 g; glukoosia 20 g ja "Leucine Minus Solution #2":ta , 10 ml. "Leucine Minus Solution #2" sisältää litrassa «· »♦* tislattua vettä: L-arginiinia 2 g, L-histidiiniä 1 g, M*! 35 L-leusiinia 6 g, L-isoleusiinia 6 g, L-lysiiniä 4 g, L-me- # · 15 119815 tioniinia 1 g, L-fenylalaniinia 6 g, L-treoniinia 6 g, L-tryptofaania 4 g.
Maljoja inkuboitiin 30 °C:n lämpötilassa viisi päivää, missä ajassa oli ilmaantunut monia eri pesäkkeitä.
5 Kromosomaaliset DNA-preparaatit tehtiin 10 pesäkkeestä ja sitten nämä digestoitiin EcoRl:llä ja Hindlll:lla. DNA-digestiotuotteet arvioitiin sitten Southernin blottien perusteella (J. Sambrook ym., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2. laitos, Cold Spring Harbor 10 Laboratory Press, 1989) käyttämällä koettimena 1,2 kilo-emäsparin HindiII-fragmenttia, joka sisältää MWN9-geenin (eristetty plasmidista pll99). Tunnistettiin isolaatti (kanta 1372), jossa ilmeni odotetut DNA-juovien siirtymät Southern blotissa, samoin kuin äärimmäinen kokkareisuus, 15 joka ilmenee tyypillisesti MNN9-mutanteissa.
Esimerkki 4
Vektorin muodostaminen hiivan ffXS3-geenin rikkomista varten
Jotta saataisiin muodostettua rikkomiskasetti, jos- 20 sa S. cerevisiaen HIS3-geeni on rikottu URA3-geenillä, plasmidi YEp6 (K. Struhl ym. 1979, Proc. Natl. Acad. Sei.
•t ; USA 76:1035) digestoitiin BamHI:lla. 1,7 kiloemäsparin • · · *..* BamHI-fragmentti, joka sisälsi HIS3-geenin, puhdistettiin • · * .* , geelissä, saatettiin tasapäiseksi T4 DNA-polymeraasilla ja • · * i,: · 25 ligoitiin sellaisen pUC18:n kanssa, joka oli digestoitu * · · • ••1 aikaisemmin BamHI:11a ja käsitelty T4-polymeraasilla. Tu- *.:/ loksena oleva plasmidi (jolle annettiin nimeksi pl501 tai · PUC18-HIS3) digestoitiin Nhel:llä (joka katkaisee HIS3:n koodittavan sekvenssin sisällä) ja vektorifragmentti gee- ::*: 30 lipuhdistettiin, saatettiin tasapäiseksi T4 DNA-polymeraa- • · · silla ja käsiteltiin sitten naudan emäksisellä fosfataa- * . silla. URA3-geeni eristettiin plasmidista pBR322-URA3 | Hindlll-digestiolla ja URA3-geenin sisältävä 1,1 kiloemäs- * ’ parin fragmentti geelipuhdistettiin, saatettiin tasapäi- » • 35 seksi T4 DNA-polymeraasilla ja ligoitiin edellä mainitun
Mi · ***** » · 16 119815 pUC18-H!S3:n Nhel-fragmentin kanssa. Tuloksena oleva plas-midi (jolle annettiin nimeksi pUC18-his3::URA3 tai pl505) sisältää rikkomiskasetin, jossa hiivan HIS3-geeni on toiminnallisen Z7RA3-geenin rikkoma.
5 Esimerkki 5
Vektorin muodostaminen hiivan PRBl-geenin rikkomista varten HJS3-geenillä
Plasmidi FP8ÄH, joka sisältää S. cerevisiaen PRBl-geenin, saatiin tri E. Jonesilta, Carnegie-Mellon 10 University (C. M. Moehle ym. 1987, Genetics 155:255-263). Se digestoitiin HindIIl:lla ja XhoI:llä ja 3,2 kb:n DNA-fragmentti, joka sisälsi PRBl-geenin, geelipuhdistettiin ja saatettiin tasapäiseksi käsittelemällä T4 DNA-polyme-raasilla. Plasmidi pUC18 digestoitiin BamHI:llä, geelipuh-15 distettiin ja saatettiin tasapäiseksi käsittelemällä T4 DNA-polymeraasilla. Tuloksena oleva vektorifragmentti li-goitiin edellä mainitun PBRl-geenifragmentin kanssa, jolloin saatiin pUC18-PRBl. Plasmidi YEp6, joka sisältää HIS3-geenin, joka digestoitiin BamHI:llä. Tuloksena oleva 20 1,7 kiloemäsparin BamHI-fragmentti, joka sisälsi toimin nallisen HlS3-geenin, geelipuhdistettiin ja saatettiin ; sitten tasapäiseksi käsittelemällä T4 DNA-polymeraasilla.
*,,* pUC18-PRBl digestoitiin EcoRV:llä ja NcoI:llä, jotka kat- • · * / , kaisevat PRBl:n koodittavan sekvenssin sisällä, ja mikä • · # ί·ϊ ! 25 poistaa proteaasi B:n aktiivisen kohdan ja reunustavan ·.!: sekvenssin. 5,7 kiloemäsparin EcoRV-Ncol-fragmentti, joka *sisälsi jäljelle jääneet 5'- ja 3'-osat PRBl:n kooditta-• ·· ϊ,ϊ · vassa sekvenssissä pUC18:ssa, gelipuhdistettiin, saatet tiin tasapäiseksi käsittelemällä T4 DNA-polymeraasilla, : ;*; 30 defosforyloitiin naudan suoliston emäksisellä fosfataasil- **» la ja ligoitiin edellä kuvatun tasapäiseksi saatetun HIS3-• # fragmentin kanssa. Tuloksena oleva plasmidi (jolle annet tiin nimeksi pUC18-prbl::HIS3, stokki nro 1245) sisältää ’’ * toiminnallisen RIS3-geenin PRBI-geenin sen osan tilalla, I ;*; 35 joka oli deletoitu edellä.
• · · · «·»»* · 17 119815
Esimerkki 6
Sellaisen U9:lle sukua olevan hiivakannan muodostaminen, joka sisälsi sekä MNN9- että PRBl-geenit rikkoutuneina 5 U9:lle sukua oleva kanta 1372, joka sisältää rik koutuneen MNN9-geenin, kuvattiin esimerkissä 3. Kannan 1372 klonaalisia isolaatteja pasasoitiin FOA-maljoilla ura3-mutanttien selektoimiseksi. Saatiin joukko kannan 1372:n ura3-isolaatteja ja yksi isolaatti (kanta 12930-10 190-S1-1) selektoitiin HIS3-geenin myöhempää rikkomista varten. pUC18-his3::URA3-geeninrikkomisvektori (pl505) digestoitiin Xbalillä ja EcoRI:llä, jolloin saatiin lineaarinen his3::URA3-rikkomiskasetti, ja tätä käytettiin transformoimaan kanta 12930-190-S1-1 litiumasetaattimene-15 telmällä (Methods in Enzymology, 194:290 (1991). Ura*- transformantit selektoitiin synteettisellä agarelatusai-neella, josta puuttui urasiili, vedettiin viiruiksi uudelleen saman elatusaineen pinnalle klonaalisia isolaatteja varten, ja sitten replikamaljättiin sellaisen elatusaineen 20 pinnalle, josta puuttui joko urasiili tai histidiini, sellaisten isolaattien seulomiseksi, jotka olivat sekä Ura+ . . että His'. Yksi isolaatti (kanta 12930-230-1) selektoitiin « « ·„* PRBl-geenin myöhempää rikkomista varten. PRBl-geeninrik- • » · [·’/ komisvektori (pUC18-prbl: :HIS3, kanta nro 1245) digestoi- ϊ 25 tiin Sedillä ja Xbalillä, jolloin saatiin lineaarinen prbl: :HlS3~rikkomiskasetti ja tätä käytettiin transformoi-maan kanta 12930-230-1 litiumasetaattimenetelmällä. His* # · · ί#ί ϊ transformantit selektoitiin agarelatusaineella, josta puuttui histidiini, ja vedettiin uudelleen viiruiksi saman . 30 elatusaineen pinnalle klonaalisia isolaatteja varten. Ge- »«« .*:·. nominen DNA valmistettiin joukosta tuloksena olevia His* • * ♦ *· ^ isolaatteja, digestoitiin EcoRl:llä ja ajettiin sitten * * elektroforeesissa 0,8 % agaroosigeeleissä. Southernin *·*" blottaus -analyysit suoritettiin sitten käyttämällä sei- : .*. 35 laista radioleimattua 617 emäsparin koetinta PRBl-geenil- • «· · ♦ · 18 119815 le, joka oli valmistettu PCR:llä käyttämällä seuraavia oligodeoksinukleotidialukkeita: 5'TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3' (sekvenssi nro 3) 5'CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3' (sekvenssi nro 4) 5 Saatiin yksitoista isolaattia, joissa ilmeni koettimen odotettu hybridisaatio 2,44 kiloemäsparin prbl::HIS3-DNA-fragmentin kanssa. Koetin ei sitä vastoin hybridisoitunut villityyppisestä PRBl-geenistä peräisin olevan 1,59 kiloemäsparin fragmentin kanssa. Yksi näistä 10 isolaateista, jotka sisälsivät halutun prbl::HIS3-rikkou-tumisen, selektoitiin jatkokäyttöä varten ja sille annettiin nimeksi kanta 1558.
Esimerkki 7
Vektorin muodostaminen hiivan PEP4-geenin rikkomis-15 ta varten S. cerevisiaen PEP4-geeni kloonattiin hiivan geno- misesta kirjastosta seuraavalla tavalla. E. coli -soluja,
jotka sisälsivät hiivan genomisen kirjaston pLSIOI
(Schultz ja Friesen, 1983, J. Bacteriol. 155:8 - 14), kas- 20 vatettin yli yön 5 mlrssa LB-elatusainetta, joka sisälsi ampisilliinia 100 pg/ml. Tästä viljelmästä maljättiin lai- . mennoksia 10“4 ja 10"5 LB+ampisilliini-maljoille. Nitrosel- *„' luloosafilttereitä käyttämällä tehtiin kopiot pesäkemal- • · /*,* joista. 600 emäsparin koetin hiivan PEP4-geeni lie valmis- ί*: : 25 tettiin PCR: llä käyttämällä Taq-DNA-polymeraasia, totaali- plasmidi-DNA:ta pLSIOl-hiivakirjastosta ja seuraavia oli-godeoksinukleotidialukkeita, jotka oli suunniteltu PEP4:n • · * im' ί julkaistun DNA-sekvenssin pohjalta (C.A. Wool ford ym.,
Mol. Cell. Biol. 6:2500 (1986)).
: 30 "Sense"-aluke: 5'-GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3' sekvenssi ··· nro 5) • · "Antisense"-aluke: 5'-GGC CAG TGG GCC AAC AGG TTC-3' (sekvenssi nro 6).
t '* PCR suoritettiin 25 monistussyklillä (94 °C 1 min, : .*; 35 37 eC 2 min, 72 eC 3 min). PCR-koetin geelipuhdistettiin, • ·· · *·#·· • * 19 119815 radioleimattiin ja hybridisoitiin edellä mainittujen pesä-kefilttereiden kanssa. Useat pesäkkeet olivat positiivisia PEP4-koettimella hybridisoitumisen suhteen ja ne vedettiin viiruiksi LB+ampisilliini-maljoille yksittäisiä pesäkkeitä 5 silmällä pitäen. Plasmidi-DNA valmistettiin emästä ja SDS:ää käyttävällä hajotuksella (Sambrook ym. edellä) useista isolaateista ja digestoitiin BamHI:llä. Havaittiin odotettu 14 kiloemäsparin vektorijuova ja 6,9 kiloemäspa-rin PEP4-inserttijuova. Kun tehtiin kaksoisdigestio 10 EcoRX:llä ja XhoI:llä, havaittiin odotettu 1,5 kiloemäsparin juova PEP4:lle. Yksi isolaatti (nro 860), jossa näkyi odotetut tulokset, valittiin jatkokäyttöä varten. Kannasta nro 860 peräisin oleva plasmidi-DNA digestoitiin BamHX:llä, ja 6,9 kiloemäsparin BamHI-DNA-fragmentti, joka 15 sisälsi kromosomaalisen PEP4-geenin, subkloonattiin pUC13:n BamHI-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi p890. Plasmidi p890 digestoitiin sitten NcoI:llä (joka katkaisee PEP4:n koodattavan sekvenssin sisältä), geelipuhdistet-tiin, saatettiin tasapäiseksi T4 DNA-polymeraasilla ja 20 ligoitiin 1,1 kiloemäsparin tasapäiseksi saatetun fragmentin kanssa, joka sisälsi toiminnallisen URA3-geenin (val-•#· mistettu kuten esimerkissä 2). Tuloksena olevalle plasmi- » t1 I..1 dille, joka sisälsi URA3-geenillä rikotun PEP4-geenin, • S 1 ,1 , annettiin nimeksi pUC13-pep4::URA3 (kanta nro 906).
:·· 25 Esimerkki 8 ·1· ·..! Sellaisen hiivakannan nro 1569 muodostaminen, joka on peräisin kannasta U9 ja joka sisältää sekä prbl- • · · *,! ί että pep4-mutaatiot
Jotta saataisiin rikottua HXS3-geeni kannassa U9, : 30 rikkomisvektori pUC18-his3: :URA3 digestoitiin EcoRI:llä ja ···
Xbal:llä ja sitä käytettiin sitten transformoimaan kanta • t U9 litiumasetaattimenetelmällä. Ura+-transformantit se^ek- toitiin agarelatusaineella, josta puuttui urasiili, ja ve-" 1 dettiin viiruiksi samalle elatusaineelle klonaalisia iso- • ;1· 35 laatteja varten. Joukko tuloksena olevia Ura+-isolaatteja • · · · · 20 119815 replikamaljättiin sitten agarelatusaineelle, josta puuttui joko urasiili tai histidiini, ja seulottiin niitä, jotka olivat sekä Ura1 että His". Yksi isolaatti (kanta nro 1524) selektoitiin PRB1-geenin myöhempää rikkomista varten.
5 PRBl-geeninrikkomisvektori pUCl8-prbl::HIS3 digestoitiin Saclillä ja Xbalillä ja sitten sitä käytettiin transformoitaessa kanta nro 1524 litiumasetaattimenetelmällä. His+-transformantit selektoitiin agarelatusaineella, josta puuttui histidiini, ja vedettiin viiruiksi samalle elatus-10 aineelle klonaalisia isolaatteja varten. Genominen DNA
valmistettiin joukosta His+-isolaatteja ja nämä arvioitiin Southernin blottaus -hybridisaatiolla radioleimatulla PRB1-koettimella. Yksi isolaatti (kanta nro 1537), jossa ilmeni haluttu PRBl-geenin rikkoutuminen HIS3:11a (se on: 15 prbl::HIS3), selektoitiin PEP4-geenin myöhempää rikkomista varten. Kanta nro 1537 kasvatettiin FOA-maljoilla ura3-isolaattien hankkimiseksi ja yksi isolaatti (kanta nro 1541) selektoitiin jatkokäyttöä varten.
PEP4-geenin rikkomiseksi kannassa nro 1541 PEP4-20 geeninrikkomisvektori pUC13-pep4::URA3 digestoitiin
XhoI:llä, jolloin saatiin lineaarinen pep4::URA3-rikkomis-. kasetti, ja tätä käytettiin transformoitaessa kanta nro 1541 litiumasetaattimenetelmällä. Ura+-transformantit se- • i · ]·1/ lektoitiin urasiili-miinus-agarelatusaineella ja vedettiin • · · :·ϊ : 25 viiruiksi samalla elatusaineella klonaalisia isolaatteja varten. Genominen DNA valmistettiin joukosta Ura+-transfor- * *.·.1 mänttejä ja arvioitiin Southernin blottauksilla käyttämäl- ϊ: ί lä radioleimattua koetinta PEP4-geenille. Yksi isolaatti (kanta nro 1569), josta näkyi PEP4~geenin haluttu rikkou- . 30 tuminen URA3-geenillä, valittiin jatkokäyttöä varten.
m
Esimerkki 9 • · ♦ *· ( CRPV LI -ekspressiovektorin muodostaminen * 1 CRPV:n Ll-geeni monistettiin PCR:llä plasmidista pLAII, joka sisältää täydellisen CRPV-virusgenomin (tri j .1; 35 Peter Howley, NCI), käyttämällä Vent-polymeraasia (New ·«· · · 21 119815
England Biolabs, Inc.); 35 monistussykliä (94 °C 1 min, 50 "C 1 min, 72 °C 2 min) ja käytettiin seuraavia oligo-nukleotidialukkeita, jotka sisältävät reunassa Bglll-koh-dat (alleviivattu):
5 "sense"-aluke: 5'-GAA_GAI_CIT CAA AAC AAA ATG GCA GTG
TGG CTG TCT AC-3' (sekvenssi nro 7) "antisense"-aluke: R'-gaa gat CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG
CGT TTAG-3' (sekvenssi nro 8) "Sense”-aluke tuo hiivan ei-transloituvan leader-10 sekvenssin heti ylävirtaan CRPV:n LI:n aloittavasta me-tioniinikodonista (korostettu lihavoinnilla). 1,6 kilo- emäksen Ll-PCR-tuote digestoitiin BglII:lla, geelipuhdis-tettiin ja subkloonattiin vektorin pSP72 (Promega) Bglll-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi pSP72-CRPV-Ll (pl2930-15 314-4-1).
Yksi subklooni sekvensoitiin täydellisesti ja sen havaittiin eroavan 4 nukleotidin kohdalla julkaistusta CRPV Li -sekvenssistä. Muutokset eivät saa aikaan amino-happomuutoksia. Ll-geeni leikattiin irti pSP72-CRPV-Ll:stä 20 Bglll-fragmenttina ja subkloonattiin ainutkertaiseen BamHI-kohtaan, joka sijaitsi hiivan GALlO-promoottorin ja . ADHl-transkriptionterminaattorin välissä hiivan ekspres- siovektorissa pCl/l-GAL10p-ADHlt, joka sisälsi GAL10-pro- • · · [Ύ moottorin YEp52:ssa (Broach ym., Exp. Manipulation of Gene ϊ.ϊ: 25 Expression, 1983, 83:81-116) ja ADHl:n transkriptiontermi- naattorin pCl/1-vektorirungossa. Tuloksena olevalle plas- ‘.j.1 midille annettiin nimeksi pl2930-323-6-l.
i !1: Esimerkki 10 CRPV L2 -ekspressiovektorin muodostaminen . 30 CRPV:n L2-geeni monistettiin PCR:llä Vent-polyme- ··· raasia (New England Biolabs, Inc.) käyttämällä plasmidista ** t pLAII, sen jälkeen kun plasmidi oli digestoitu Sällillä, * ' 7,9 kb:n fragmentti puhdistettu geelissä ja ligoitu se
*:**· itsensä kanssa. Käytettiin 35 syklin monistusta (90 °C
: .·. 35 1 min, 50 eC 1 min, 72 eC 2 min) ja oligonukleotidialuk- ♦ ·· · ♦ 22 119815 keitä, jotka sisälsivät reunassa EcoRI-kohdat (alleviivattu) :
"sense"-aluke: 5’GGA ATT CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC
GGT CAC GAA AAC-3' (sekvenssi nro 9)
5 "antisense"-aluke: 5'-GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA
CAC TG-31 (sekvenssi nro 10) "Sense"-aluke tuo hiivan ei-transloituvan leader-sekvenssin heti ylävirtaan CRPV LI: n aloittavasta me-tioniinikodonista (korostettu lihavoinnilla). 1,5 kb: n 10 PCR-tuote digestoitiin EcoRI:llä, geelipuhdistettiin ja subkloonattiin EcoRI-kohtaan kaksisuuntaisessa promoottori vektorissa pUC18-GALlp-GAL10p, joka sisälsi erisuuntaisen GALl/GALlO-hiivapromoottorin. Tämä vektori sisältää ainutkertaisen BamHl-kohdan GAL1-promoottorin ja ADHl-15 transkriptionterminaattorin ensimmäisen kopion välissä, ainutkertaiset EcoRI- ja Smal-kohdat, jotka sijaitsevat GALlO-promoottorin ja ADHl-transkriptionterminaattorin toisen kopion välissä. Tuloksena oleva ekspressiokasetti sisältyy 1,4 kb:n Sphl-fragmenttiin. Yksi klooni (pl2930-20 295-2-2), joka sisälsi halutun L2-insertin GALlO-promoot torin vieressä, sekvensoitiin täydellisesti ja sen osoi-. tettiin sisältävän 6 nukleotidimuutosta julkaistusta sek- venssistä, joista 4 johtaa aminohappomuutoksiin. Alkupe- • · 1 ]·1 1 räisen templaatti-DNA:n sekvenssianalyysi vahvisti, että • 1 · ί 25 muutokset olivat läsnä myös pLAII:ssa eivätkä ne olleet PCR:n tuomia. pUC18-GALlp-GAL10p-vektori, joka sisälsi L2-*.·,! geenin, leikattiin Sphl:llä ja 2,9 kb:n fragmentti, joka sisälsi ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt-ekspressiokasetin, ligoitiin hiivan sukkulavektorin pCl/l:n ison Sphl-frag-. .1. 30 mentin kanssa. Tuloksena olevalle plasmidille annettiin nimeksi pl2930-323-2-3 (pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV-L2).
• « *#·1· • · a · i · 1 • m a ·♦· 1 a a · 23 119815
Esimerkki 11 CRPV Li- ja CRPV L2 -kapsidiproteiinin ekspressio hiivassa
Plasmideja pl2930-323-6-l ja pl2930-323-2-3 (pCl/1-5 GAL10p-CRPV/Ll ja pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV/L2) käytettiin transformoitaessa S. cerevisiae -kannat nro 1569, BJ5462 [E. W. Jones, Methods in Enzymology 194 (1991) 428-453] ja BJ1995 [Jones, sama]. Klonaalisia isolaatteja kasvatettiin 30C:n lämpötilassa YEHD-elatusaineessa, joka oli 2-10 prosenttinen galaktoosin suhteen, 48 - 72 tunnin ajan. Solujen keräämisen jälkeen solusakat rikottiin lasipalloilla, Triton X-100 lisättiin niin että sen loppukonsen-traatio oli 0,5 %, ja tuloksena olevat solulysaatit arvioitiin immunoblottausanalyyseillä silmällä pitäen CRPV:n 15 LI:n ja L2:n ekspressiota. Näytteet, jotka sisälsivät 40 pg totaalisoluproteiinia, ajettiin elektroforeesissa 12 % Tris-Glysiini-geeleissä (Novex) pelkistävissä ja denaturoivissa olosuhteissa ja elektroblotattiin PVDF-memb-raaneille (Novex). CRPVin LI- ja L2-proteiinit detektoi-20 tiin käyttämällä primäärisinä vasta-aineina polyklonaali-sia kanin antiseerumeita Liitä tai L2:ta vastaan (lahja •t . tri John Kreiderilta, Hershey Medical Center) ja sekundää-
• M
*„* risenä vasta-aineena piparjuuriperoksidaasiin kytkettyä • · · ]*'t proteiini Aita (Amersham, Inc.). Membraanit prosessoitiin : 25 käyttämällä kemiluminesoivaa ECL™ Detection Kit -tarvike- sarjaa (Amersham, Inc.). 55 - 61 kDam Ll-proteiini detek-toitiin kaikissa näytteissä, jotka sisälsivät Ll-ekspres- :[i : sioplasmidin, ja noin 90 kDain L2-proteiinijuova havait tiin kaikissa näytteissä, jotka olivat peräisin hiivakloo- . 30 neista, jotka sisälsivät L2-ekspressioplasmidin.
··*
Mitään signaalia ei havaittu L2-antiseerumilla * « * ** t näytteissä, jotka olivat peräisin hiivaklooneista, jotka ! * sisälsivät Ll-ekspressioplasmidin, ja päinvastoin.
» «MM • * • · · • · · * ♦· ♦ ««·*· • « 24 119815
Esimerkki 12 A. Rekombinanttisen CRPV Li -kapsidiproteiinin puhdistus
Kaikki vaiheet suoritettiin 4 °C:n lämpötilassa 5 ellei toisin ilmaista. Solut, jotka oli varastoitu -70 °C:n lämpötilaan, sulatettiin ja suspensoitiin yhtä suureen tilavuuteen "LI-puskuria" (20 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaasin inhibiittorit PMSF ja pepstatiini A lisättiin lietteeseen niin että 10 niiden loppukonsentraatiot olivat 2 mM ja vastaavasti 1,7 μΜ. Solut hajotettiin viemällä ne 10 kertaa "micro-fluidizer"-laitteen läpi. Lysaatti kirkastettiin sentrifu-goimalla 5 000 g:n kiihtyvyydellä 10 minuutin ajan. Super-natantti sijoitettiin kerrokseksi 5 cm:n tyynyn päälle, 15 joka oli 45 % sakkaroosi (w/v) LI-puskurissa, ja LI ajettiin pohjaan sentrifugoimalla 100 000 g:n kiihtyvyydellä 4 tunnin ajan. Sakka resuspensoitiin 1/10-tilavuuteen Ll-puskuria ja se kirkastettiin sentrifugoimalla 5 000 g:n kiihtyvyydellä 10 minuutin ajan. Tween~80 lisättiin super-20 natanttiin niin että sen loppukonsentraatio oli 0,01 % (v/v) ja supernatantti fraktioitiin huoneenlämpötilassa . kokoekskluusiokromatografialla 1700 ml:n Sephacryl S-1000 · · hartsipylväässä (Pharmacia) (sisähalkaisija 5 cm). Ajopus-kuri tälle pylväälle oli 10 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, *·ϊ ‘ 25 joka oli 150 mM NaCltn ja 0,01 % (v/v) Tween-80:n suhteen.
·.!: Fraktiot, jotka sisälsivät immunoreaktiivisen materiaalin immuno-dot-blotin perusteella, yhdistettiin ja konsentroisi ϊ tiin 1/6-tilavuuteen ultrasuodattamalla käyttämällä
Amiconin sekoituksessa olevaa kammiota, jossa oli vaaka- . 30 suora YM-100-membraani (halkaisija 76 mm) (molekyylipainon «* · ekskluusioraja 100 000). Tuote steriilisuodatettiin • 0,22 pm:n Millex-GV -membraanin läpi (Millipore). Puhdis- • * tettu CRPV LI -kapsidiproteiini adsorboitiin aluminiumhyd- roksidiin konsentraationa 100 pg/ml.
• · • * · • * 4 »·· · a · 25 119815 B. Rekomblnanttisen CRPV LI -kapsidiproteiinin karakterisointi
Lopullisen tuotteen identiteetti vahvistettiin Western-blottauksella ja N-pään sekvenssianalyysillä. Puh-5 taus arvioitiin SDS/PA6E:lla Coomassie- ja hopeavärjäyk-sellä ja "Solution Sieving" -kapillaarielektroforeesilla (SSCE), jossa optinen detektio tehtiin 215 nm:n aallonpituudella. Valmiste oli 75-prosenttisen puhdasta LI:n suhteen SSCE:n perusteella.
10 Esimerkki 13
Rekombinanttisen CRPV L2 -kapsidiproteiinin puhdistus
Kaikki vaiheet suoritettiin 4 eC:n lämpötilassa ellei toisin ilmaista. Solut, jotka oli varastoitu 15 -70 eC:n lämpötilaan, sulatettiin ja suspensoitiin yhtä suureen tilavuuteen "LI-puskuria" (20 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaasin inhibiittorit PMSF ja pepstatiini A lisättiin lietteeseen niin että niiden loppukonsentraatiot olivat 2 mM ja vastaavasti 20 1,7 μΜ. Solut hajotettiin viemällä ne 10 kertaa "micro- fluidizer"-laitteen läpi. Lysaatti kirkastettiin sentri- . fugoimalla 5 000 g:n kiihtyvyydellä 10 minuutin ajan. Su- % ·· ;„* pernatantti sijoitettiin kerrokseksi 5 cm:n tyynyn päälle, is* joka oli 45 % sakkaroosi (w/v) LI-puskurissa, ja L2 ajet- • f * *·ϊ ! 25 tiin pohjaan sentrifugoimalla 100 000 g:n kiihtyvyydellä 4 ..I" tunnin ajan. Sakka resuspensoitiin 1/10-tilavuuteen LI- ψ *,·,* puskuria ja se kirkastettiin sentri fugoimalla 5 000 g:n *Jt kiihtyvyydellä 10 minuutin ajan. Tween-80 lisättiin super- natanttiin niin että sen loppukonsentraatio oli 0,01 % • *’j 30 (v/v), ja supernatantti fraktioitiin huoneenlämpötilassa ··· kokoekskluusiokromatograf iällä 1 700 ml: n Sephacryl • i S-1000-hartsipylväässä (Pharmacia) (5 cm:n sisähalkaisi- • ja). Ajopuskuri tälle pylväälle oli 10 mM natriumfosfaat- v'! ti, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,01 % (v/v) Tween-80. Fraktiot, :j*. 35 jotka sisälsivät immunoreaktiivista materiaalia immuno- • · · · » • •«il • * 26 119815 dot~blotin perusteella, yhdistettiin. Yhdistetyt fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla (hopea) ja Western-blottauksel-la.
Esimerkki 14 5 A. Rekombinanttisen CRPV Li -kapsidiproteiinin puh distus - kaavio 1
Solut, jotka oli varastoitu -70 #C:n lämpötilaan, sulatettiin ja suspensoitiin yhtäsuureen tilavuuteen ha-jotuspuskuria (20 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, 100 mM
10 NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaasin inhibiittorit PMSF ja pepstatiini A lisättiin lietteeseen niin että niiden lop-pukonsentraatiot olivat 2 mM ja vastaavasti 1,7 μΜ. Solut hajotettiin viemällä ne 10 kertaa "microfluidizer"-laitteen läpi. Lysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla 15 5 000 g:n kiihtyvyydellä 10 minuuttia. Supernatantti pan tiin 5 cm:n tyynyn päälle (45 % sakkaroosi (w/v) Ll-pusku-rissa), ja LI pelletoitiin sentrifugoimalla 100 000 g:n kiihtyvyydellä 4 tuntia. Sakka resuspensoitiin 1/10-tila-vuuteen LI-puskuria. Resuspensoitu sakka kirkastettiin 20 sentrifugoimalla 5 000 g:n kiihtyvyydellä 10 minuuttia. Tween-80 lisättiin supernatanttiin niin että loppukonsent- . raatio oli 0,01 % ja supernatantti fraktioitiin huoneen- * «· *..1 lämmössä kokoekskluusiokromatograf iässä 1700 ml: n I a 4 [**/ Sephacryl S-1000-hartsipylväässä (5 cm:n sisähalkaisija) II1 *·· ! 25 (Pharmacia). Ajopuskuri tälle pylväälle oli 10 mM natrium- •**i1 fosfaatti, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,01 % Tween-80. Fraktiot, * *,·.1 jotka sisälsivät immunodot-blot-määrityksellä immunoreak- ϊ tiivistä materiaalia, yhdistettiin ja konsentroitiin 1/6- tllavuuteen ultrasuodatuksella käyttämällä sekoituksessa • j1. 30 olevaa Amiconin kammiota, jossa oli vaakasuora YM-100- «•t .•Γ. membraani (halkaisija 76 mm) (molekyylipainoraja 100 000).
• e Tuote steriilisuodatettiin 0,22 pm:n Millex-GV-membraanin • ] läpi (Millipore).
» 1 • » • « · »il • M e ♦ 27 119815 B. Rekombinanttisen CRPV Li -kapsidiproteiinin karakterisointi
Lopputuotteen identiteetti vahvistettiin Western-blottauksella ja N-pään sekvenssianalyysillä. Puhdistus 5 arvioitiin SDS-PAGE:lla Coomassie- ja hopeavärjäyksellä, ja "Solution Sieving" -kapillaarielektroforeesilla (SSCE), jossa optinen detektio tehtiin 215 nm:n aallonpituudella. LI oli 75-prosenttisen puhdas SSCE:n perusteella. Elektronimikroskopia osoitti, että läsnä oli VLP-partikkeleita, 10 halkaisijan kokoluokka 50 - 55 nm.
C. Analyyttinen kokoekskluusio-HPLC
VLP:n määrittämiseksi näytteitä fraktioitiin koon mukaan kokoekskluusiokromatografiällä. Kromatografia suoritettiin Perkin-Elmerin Series 410 Biopump HPLC:llä, jos-15 sa oli ISS 100 autoinjektori, johon oli sovitettu 200 mik-rolitran injektiosilmukka. Pylväs oli TSK-gel G5000PW, 7,5 x 600 mm (T0S0HAAS, Montgomeryville, PA). Proteiinin pylväästä eluoitumisen monitoroimiseksi tehtiin optinen detektio 280 nm:n aallonpituudella Perkin-Elmerin LC-235 20 diodirividetektorilla. Liikkuva faasi oli 0,5 M NaCl 10 mM natriumfosfaattipuskurissa, pH 7,2. Virtausnopeus oli 0,5 ml/min ja kerättiin yhden millilitran fraktioita. Pylvään . kalibrointi suoritettiin Sigman proteiinistandardeilla samoin kuin rekombinanttisella hepatiitti B -pinta-anti- • · ♦ [·’/ 25 geenillä (Recombivax, Merck. & Co., West Point, PA). Anti- • · · • : geenin detektio eluution aikana kerätyissä fraktioissa ..I" saadaan aikaan immunodot-blot-määrityksellä.
•.j,· D. Immunodot-blot-määritys :#ϊ : 10 μΐ näyte kutakin fraktiota applikoidaan PVDF- 30 membraaniliuskalle (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, ; .*. MA), joka esikasteltiin ja pantiin kostutetun blottauspa- *·« .*:*. perin päälle. Näytteen annettiin imeytyä membraanille, ja • # membraani sijoitettiin tukkimisliuokseen (5 % (w/v) rasva- * * ton kuivamaito, joka on liuotettu liuokseen, joka on *:**· 35 0,15 M NaCl:n, 0,02 % (w/v) natriumatsidin ja 0,01 M nat- • · • · · • ♦ * • · · · »«··· • · 28 119815 riumfosfaatin suhteen, pH 7,2) ja inkuboitiin huoneenlämmössä hellävaraisesti heilutellen ainakin kolmen tunnin ajan. Tukkimisliuos kaadettiin pois ja se korvattiin primäärisellä vasta-aineliuoksella.
5 Käytetty primäärinen vasta-aine vaihteli riippuen detektoitavasta aineesta: CRPV LI tutkittiin CRPV:tä vastaan suunnatulla ka-niseerumilla "late response" (Biodesign International, Kennebunk, ME). CRPV L2 tutkittiin CRPV L2:ta vastaan 10 suunnatulla kaniseerumilla. HPVöa LI tutkittiin monoklo-naalisella vasta-aineella MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). HPVöa L2 tutkittiin HPVöa L2-trpE-fuusiota vastaan suunnatulla hiiren seerumilla.
Immuunikompleksien visualisointi tehtiin standardi-15 menetelmillä käyttämällä toista vasta-ainetta, joka oli konjugoitu emäksiseen fosfataasiin, ja kromogeenistä substraattia NBT/BCIP.
E. "Solution Sieving" -kapillaarielektroforeesi (SSCE) 20 CRPV VLP:n näytteitä (noin 0,2 mg/ml) kuumennettiin 15 minuutin ajan 100 °C:n lämpötilassa liuoksessa, joka oli 1 % 2-merkaptoetanolin ja 1 % (w/v) SDS:n suhteen.
. . Näyte applikoitiin elektrokineettisesti referenssimarkke- • 1 *,,· rin, mellitiinihapon, kanssa fuusioituun piidioksidikapil- • · · ]·1/ 25 laariin, 42 cm (22 cm detektoriin), jonka sisähalkaisija • · · · oli 0,05 mm, esitasapainotettiin 10 sisäosan tilavuudella 0,1 N NaOH:ta, vettä, ja ProSort- suodatusreagenssia (Applied Biosystems, Foster City, CA). Käytettiin erotussa : jännitettä 300 volttia/cm käyttämällä Applied Biosystems 30 Model 270A-HT CE -laitetta. Näytteen eluutiota monitoroi- ; .1· tiin absorbanssilla 215 nm:n aallonpituudella ja tulokset ··· kerättiin käyttämällä Nelson Turbochrom 3 -ohjelmaa.
• · • · * · • · · • · 1 • · · · · ·· · • · 29 119815 F. Rokotteen valmistus rekombinanttisesta CRPV LI -kapsidiproteiinista
Puhdistettu CRPV LI -kapsidiproteiini adsorboitiin Al(OH)3:een konsentraationa 100 pg/ml.
5 Esimerkki 15 CRPV:n aikaansaaman papillooman kehittymiseltä suojaaminen rokottamalla hiivaperäisillä CRPV LI VLP-partikkelei11a 5 New Zealand White -kania immunisoitiin lihaksen-10 sisäisesti joko 135 mg:11a LI VLP-partikkeleita (75-pro-senttisen puhdas, katso esimerkki 17), jotka oli adsorboitu alunaan, tai negatiivikontrollina 100 mg:11a rekombi-nanttista hepatiitti B -pinta-antigeeniä (99-prosenttisen puhdas), joka oli adsorboitu aluminiumhydroksidiin. Eläi-15 met saivat 2 lisätehostetta 8 viikon ajan ennen kuin ne altistettiin CRPV:llä 10 päivää viimeisen tehosteen jälkeen. Seerumit, jotka oli otettu ennen immunisaatiota, kunkin tehosteen kohdalla, ja ennen altistusta, analysoitiin Ll-VLP-spesifisellä ELISA:11a. Epäsuoraa ELISA-määri-20 tystä käytettiin määrittämään seerumin vasta-aine-vasteet hiivassa ekspressoidulle CRPV LI VLP -partikkeleille. ELISA:ssa käytetyt antigeenit olivat CRPV LI VLP -partik- . keleita, jotka oli ekspressoitu hyönteissoluissa rekombi- • 1 · *..1 nanttisella bakuloviruksella oleellisesti Christensenin • · · /’.1 25 ym. kuvaamalla tavalla (J. Virol. 64:3151-3156, 1990; J.
*·ϊ · Gen. Virol. 75:2271-2276 (1994). Emäksiseen fosfataasiin .·.: kytkettyä, kanin IgG:tä vastaan suunnattua vuohen vasta- * *.·.· ainetta käytettiin toisena vasta-aineena ja p-nitrofenyy- ··· i/· ί lifosfaattia substraattina (Kirkegaard and Perry Labs., 30 Inc.). Absorbanssi mitattiin 405 nm:n aallonpituudella.
; Tiitteri määritettiin laimennossarjalla (seerumin 3-ker- ·· · .1:1· täisiä laimennoksia lähtien laimennoksesta 1:100) ja se * , määritettiin positiiviseksi jos Ll-spesifinen absorbanssi * ylitti kanin esi-immuuniseerumin keskimääräiset absorbans- * 1 35 silukemat plus kaksi keskihajontaa. Tarkat tiitterit las- * · • 1 1 • · · • · · · · kettiin näistä tuloksista käyttämällä SOFTmax-ohjelman versiota 2.3 (Molecular Devices Inc., Menlo Park, CA).
30 119815
Li VLPrtä vastaan suunnatun vasta-aineen tiitterei-tä oli läsnä 4 viikkoa ensimmäisen immunisaation jälkeen 5 ja ne nousivat kullakin lisätehosteella. Kontrollieläimet olivat negatiivisia. 6 viikkoa CRPV-altistuksen jälkeen rokotetut eläimet olivat syylättömiä 15 kohdassa 15:stä (1:2 laimennettu tai 1:12 laimennettu virusstokki) kun taas kontrollieläimissä näkyi syylän muodostusta 12 koh-10 dassa 15:stä (1:2 laimennettu virus) tai 9 kohdassa 15:stä (1:12 laimennettu virus). 15 viikon jälkeen rokotetut eläimet olivat edelleen syylättömiä.
Virusneutralointimääritykset suoritettiin (oleellisesti Christensenin ym. menetelmän mukaisesti, 1991, 15 Virology 181:572-579) sekoittamalla kaniseerumeita CRPVrhen ja altistamalla tämän jälkeen kaneja käsitellyllä CRPV:llä. Standardi neutraloivan vasta-aineen määrittämiseen oli viruksen täydellinen neutraloituminen (kolme kohtaa kolmesta negatiivisia syylän muodostumisen suhteen). 20 Analysoitiin seerumit 5 rokotetusta eläimestä ja 5 kont-rollieläimestä. Seerumit, jotka oli kerätty 1 CRPV LI VLP-partikkeliannoksen jälkeen, sisälsivät vasta-aineita, jot-. ka neutraloivat täysin laimentamattoman viruksen 80 % ka- neista (4/5). 2 tai 3 CRPV Li VLP -annoksen jälkeen 100 • 1 ,1. 25 prosentilla kaneista (5/5) oli viruksen neutraloivia vas- • t · · ta-aineita. Kontrolliseerumeissa ei näkynyt mitään virusta • 1 · neutraloivaa aktiivisuutta. Lopputiittereistä riippuen valittujen rokotettujen eläinten seerumit voitiin laimensi ϊ taa 10 - 1000-kertaisesti ja ne olivat edelleen 100-pro- 30 senttisen neutraloivia.
• ;1· Sen testaamiseksi, oliko neutraloiva vasta-ainevas- • · · te spesifinen natiiveille CRPV LI VLP-partikkeleille, va- • t Iittiin yksi immuuniseerumi ja sitä inkuboitiin nitrosel-
luloosaneliöiden kanssa, jotka oli päällystetty joko na-35 tiiveilla tai denaturoiduilla hiivaperäisillä CRPV LI VLP
* • • 1 1 • · · ·♦· ··1·» • 31 119815 -partikkeleilla. Nitroselluloosaneliöt (1 cm2) päällystettiin joko natiiveilla tai denaturoiduilla (pelkistetty tai alkyloitu jodietikkahapolla 8 M ureassa), hiivassa eks-pressoiduilla CRPV LI VLP -partikkeleilla. Natiiveja tai 5 denaturoituja hiivaekstrakteja käytettiin kontrolleina. Kanin immuuniseerumia inkuboitiin peräkkäin neljä kertaa nitroselluloosaneliöiden kanssa 8-14 tuntia 4 °C:n lämpötilassa, ennen kuin se testattiin edellä kuvatulla tavalla virusneutralointimäärityksessä. Vain natiivit CRPV 10 LI VLP:t kykenivät absorboimaan vasta-aineet, jotka olivat spesifisiä CRPV:n neutraloinnin suhteen, kun taas denaturoidut tai kontrollihiivaproteiinit eivät absorboineet näitä vasta-aineita. Lisäksi natiivit CRPV LI VLP:t poistivat myös ELISA:n reaktiivisuuden hyönteissoluissa eks-15 pressoiduille CRPV LI VLP -partikkeleille (tuloksia ei esitetä).
Esimerkki 16
Vektorin muodostaminen CRPV Ll/L2:n koekspressiota varten yksittäisestä plasmidista 20 Plasmidi pSP72-CRPV-Ll (pl2930-314-4-l) digestoi- tiin BglII:lla, ja 1,5 kiloemäsparin Bglll-fragmentti, joka sisälsi CRPV LI ORF:n ja hiivan 5'-pään ei-transloi- . , tuvan leaderin, puhdistettiin geelissä. Plasmidi pl293Q- • · *;,/ 323-2-3 (pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV-L2) digestoitiin • · · V 1 25 BamHI:llä, joka katkaisee GAL1-promoottorin ja ADHl-trans- : kriptionterminaattorin välistä. Lineaarinen vektorifrag- mentti puhdistettiin geelissä ja sitten se ligoitiin edel- « ij/ lä mainitun CRPV-L1 Bglll-fragmentin kanssa, jolloin saa- tiin plasmidi pl2930-366-l-2 (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2). 30 Tämä tuloksena oleva plasmidi sisältää CRPV-Ll:n 0RF:n . GAL1-promoottorin kontrollin alaisena ja CRPV-L2:n 0RF:n • 1 · GALlO-promoottorin alaisena.
• 1 t • · • · * • · • 1 · • 1 · • · · · 32 119815
Esimerkki 17
Vektorin muodostaminen CRPV Ll/L2:n koekspressiota varten kahdesta plasmidista pUC18-GALlp-GAL10p-vektori, joka sisältää L2-gee-5 nin, leikattiin Sphlrllä ja 2,9 kb:n fragmentti, joka sisältää ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt-ekspressiokasetin, puhdistettiin geelissä ja se saatettiin tasapäiseksi käsittelemällä T4 DNA-polymeraasilla. Hiivan sukkulavektori YEp24 [Botstein ym., Gene 8:17 (1979)] digestoitiin BamHI:llä, 10 saatettiin tasapäiseksi käsittelemällä T4 DNA-polymeraasilla, defosforyloitiin naudan suoliston emäksisellä fos-fataasilla ja sitten se ligoitiin edellä mainitun tasapäiseksi saatetun L2-ekspressiokasetin kanssa, jolloin saatiin plasmidi pl594.
15 Esimerkki 18 CRPV LI:n ja L2:n koekspressio hiivassa Plasmidia pl2930-366-l-2 (pCl/l-GALl/10p-CRPV/ L1+L2) käytettiin transformoitaessa S. cerevisiae -kannat nro 1569 ja BJ5462 (yhden plasmidin järjestelmä) ja tulok-20 sena olevat transformantit selektoitiin synteettisellä leusiini-miinus-agaralustalla. Rinnakkaisessa kokeessa kanta 1569 kotransformoitiin pCl/l-GAL10p-CRPV-Ll-ekspres-·, · siovektorilla pl2930-323-6-l sekä YEp24-GAL10p-L2-ekspres-
• M
siovektorilla pl594 (kahden plasmidin järjestelmä) ja tu- • « · ,*. 25 loksena olevat transformantit, jotka sisälsivät molemmat • t · *··/ vektorit, selektoitiin synteettisellä agaralustalla, josta ··· *··ί puuttui sekä leusiini että urasiili. Klonaaliset isolaatit 1 .:.: kasvatettiin sekä yhden plasmidin järjestelmän että kahden ··· *.· : plasmidin järjestelmän tapauksessa 30 °C:n lämpötilassa 30 YEHD-kompleksielatusaineessa, joka sisälsi 2 % galaktoo- : siä, 48 - 72 tunnin ajan. Solujen keräyksen jälkeen solu- ··· ·*·’· sakat rikottiin lasipalloilla. Triton X-100 lisättiin niin * . että sen loppukonsentraatio oli 0,5 % ja solulysaatit ana- \ lysoitiin CRPV LI:n ja L2:n ekspressiota silmällä pitäen 35 immunoblottausanalyysillä. Näytteet, jotka sisälsivät • * · « » 9 ··· 9 • • · 33 119815 50 pg totaalisoluproteiinia, ajettiin elektroforeesissa 8-16 Tris-glysiini-gradienttigeelissä (Novex) pelkistävissä ja denaturoivissa olosuhteissa ja blotattiin sähkövirran avulla PVDF-membraaneille (Novex). CRPV LI- ja L2-5 proteiinit detektoitiin käyttämällä polyklonaalisia LI- ja L2-antiseerumeita (lahja tri John Kreiderilta, Hershey Medical Center) primäärisinä vasta-aineina ja piparjuuri-peroksidaasiin konjugoitua proteiini A:ta (Amersham, Inc.) sekundäärisenä vasta-aineena. Membraanit prosessoitiin 10 käyttämällä kemiluminesoivaa ECL™ Detection Kit -tarvike-sarjaa (Amersham, Inc.). 55 - 61 kDa:n Ll-proteiinijuova ja noin 90 kDa:n L2-proteiinijuova detektoitiin kaikissa näytteissä, jotka olivat peräisin hiivaklooneista, jotka sisälsivät Ll+L2-ekspressioplasmidin. Mitään L2-signaalia 15 ei havaittu näytteissä, jotka olivat peräisin hiivaklooneista, jotka sisälsivät ekspressioplasmidin LI:lie. Mitään Ll-signaalia ei havaittu näytteissä, jotka olivat peräisin soluista, jotka sisälsivät pelkän L2-ekspressio-vektorin.
20 Esimerkki 19 CRPV Li:n ja CRPV Ll+L2-VLP-partikkeleiden puhdistus EM-tutkimuksia varten : Hiivassa ekspressoidut CRPV LI- ja CRPV Li- ja L2- • p proteiinit puhdistettiin osittain ja konsentroitiin elek- » i » 25 tronimikroskopia (EM) -tutkimuksia varten. 1 - 1,5 litraa • » · ***,’ YEHD-elatusainetta, joka sisälsi 2 % galaktoosia, ympät-
PPP
··“ tiin S. cerevisiae -kannalla 1569 tai BJ5462, joka oli •|·* transformoitu LI + L2-koekspressiovektorilla pl2930-366-l- '.·* 1 2 (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2) ja kasvatettiin 30 eC:n läm- 30 pötilassa 48 - 72 tuntia. Rinnakkaiskokeessa kannan 1569 solut, jotka oli kotransformoitu GAL10p-CRPV-Ll-ekspres- :**: siovektorilla pl2930-323-6-l plus YEp24-GAL10p-L2-plasmi- p #. dilla pl594, kasvatettiin samalla tavalla. Solut kerättiin
p P
. ja solusakat pakastettiin -70 °C:n lämpötilaan. Kaikki , * 35 seuraavat vaiheet suoritettiin 4 eC:n lämpötilassa. Solu- • p 5 · · • I f • pp p
P
• * 34 119815 sakat sulatettiin ja suspensoitiin yhtä suureen tilavuuteen "LI-puskuria" (20 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteiinin inhibiittorit PMSF ja pepstatiini A lisättiin lietteeseen loppukonsentraationa 2 5 mM ja vastaavasti 1,7 pM. Solut hajotettiin viemällä ne 3-5 kertaa "microfluidizer"-laitteen läpi. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 5 000 g:n kiihtyvyydellä 10 minuutin ajan. Supernatantti pantiin kerrokseksi 5 cm:n tyynyn päälle, jossa oli 45 % (v/v) sakkaroosia Ll-pusku-10 rissa, ja LI-, L2- tai LI- ja L2-proteiinit ajettiin pohjaan sentrifugoimalla 100 000 g:n kiihtyvyydellä 4 tunnin ajan. Sakka resuspensoitiin 1/10-tilavuuteen Ll-puskuria. Resuspensoitu sakka kirkastettiin sentrifugoimalla 5 000 g:n kiihtyvyydellä 10 minuutin ajan.
15 EM-analyysiä varten (Structure Probe, West Chester, PA) erä kustakin näytteestä sijoitettiin hiilipäällystei-sille kuparihiloille (200 mesh). Tippa 2 % fosfovolframi-happoa (PTA), pH 7,0, sijoitettiin hilalle 20 sekunniksi. Hilojen annettiin kuivua ilmassa ennen TEM-tutkimusta. 20 Kaikki mikroskopia tehtiin käyttämällä JE0L 100CX-trans-missioelektronimikroskooppia (JE0L USA, Inc.) kiihdytys-jännitteellä 100 kV. Tuotetuissa mikrovalokuvissa lopulli- ·,; nen suurennos on 100 000-kertainen.
• ··
Kalkissa hiivanäytteissä, jotka sisälsivät joko [* . 25 CRPV LI -ekspressioplasmidin tai plasmidit CRPV LI:n ja • t · *··/ L2:n koekspressiota varten, havaittiin VLP-partikkeleita, ··· ··*! jotka olivat halkaisijaltaan luokkaa 50 - 55 nm. Mitään t VLP-partikkeleita ei havaittu kontrollihiivanäytteissä tai • ·· * hiivanäytteissä, jotka sisälsivät pelkän L2-ekspressio- 30 plasmidin. (Kuviot 7, 8, 9.) : ;*: Esimerkki 20 «··
Rekombinanttisen CRPV LI -kapsidiproteiinin puhdis- * a tus - kaavio 2 | Kaikki vaiheet suoritettiin 4 °C:n lämpötilassa * * 35 ellei toisin ilmaista.
* · » · t * · ♦ t • · 35 119815
-70 °C:n lämpötilaan varastoidut solut sulatettiin ja suspensoitiin yhtä suureen tilavuuteen hajotuspuskuria (20 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM
EDTA). Proteaasin inhibiittorit PMSF ja pepstatiini A 11-5 sättiin lietteeseen niin että niiden loppukonsentraatiot olivat 2 mM ja vastaavasti 1,7 μΜ. Solut hajotettiin käyttämällä BioNeb Cell Disruptor -järjestelmää (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla 5 000 g:n kiihtyvyydessä 10 minuuttia.
10 Supernatantti pantiin kerrokseksi 5 cm: n tyynyn päälle, joka oli 45 % sakkaroosi (w/v) Ll-puskurissa, ja LI ajettiin pohjaan sentrifugoimalla 100 000 g:n kiihtyvyydellä 4 tuntia. Sakka resuspensoitiin 1/10-tilavuuteen Ll-puskurissa. Resuspensoitu sakka kirkastettiin sentrifu-15 goimalla 5 000 g:n kiihtyvyydellä 10 minuuttia.
Supernatantti laimennettiin 1:5 PBS:llä, kirkastettiin uudelleen sentrifugoimalla Sorvailin SA-600-roottorissa 6500 rpm:n nopeudella 10 minuuttia 4 °C:n lämpötilassa. Supernatantti suodatettiin 0,22 mikronin ruiskusuo-20 dattimen läpi ja fraktioitiin anioninvaihtokromatografiällä.
Anioninvaihtokromatografia suoritettiin Perkin-. , Elmer Series 410 Biopump HPLC:llä, jossa oli 5 ml:n injek- • t tiosilmukka. Kromatografiaväliaine oli Fractogel EMF V ’ 25 TMAE-650 (S) 25 - 40 mikronin hartsi (EM Separations, a · :.: : Gibbs town, NJ) 150 mm: n (sisähalkaisija 10 mm) lasipyl- väässä. Proteiinin pylväästä eluoitumisen nopeuden monito-I,·.? roimiseksi optinen detektio 280 nm:n aallonpituudella saari*: tiin aikaan Perkin-Elmerin LC-235 diodirividetektorilla.
30 Pylväs esitasapainotettiin 0,15 M NaCl:llä, joka oli : .·. 0,01 M natriumfosfaattipuskurin suhteen, pH 7,2 (puskuri .···. A). Pylvästä ajettiin virtausnopeudella 0,75 ml/min. Näyte » · * ladattiin pylvääseen ja pylväs pestiin puskurilla A sitou-”** tumattoman materiaalin poistamiseksi. Sitoutunut materiaa- “**· 35 li eluoitiin natriumkloridin lineaarisella konsentraatio- • « • · · • « · ·*· » a · 36 119815 gradientilla 0,15 M - 0,65 M 5 minuutin ajan, mitä seurasi lineaarinen gradientti 0,65 M - 1,15 M 30 minuutin ajan. Eluution aikana kerätyissä fraktioissa olevan antigeenin detektio saatiin aikaan immuno-dot-blot-määrityksellä.
5 Immunoreaktiivista materiaalia sisältävät fraktiot (se on: fraktiot, jotka eluoituivat välillä 0,81 M ja 1,05 M NaCl) yhdistettiin.
Yhdistetyt fraktiot konsentroitiin Macrosep sentri-fugaalisilla konsentrointilaitteilla (Filtron Technology 10 Corp., Northborough, MA) 1/5-tilavuuteen.
Konsentraatti fraktioitiin kokoekskluusiokroma-tografialla käyttämällä Sephacryl S-1000 SF-hartsia (Pharmacia, Piscataway, NJ) 87 cm:n pylväässä (sisähalkai-sija 27 mm). Pylvästä ajettiin virtausnopeudella 2,5 ml/ 15 min. Proteiinin eluutiota monitoroitiin absorbanssilla 280 nm:n aallonpituudella. Antigeeni detektoitiin immuno-blottauksella.
Immunoreaktiivista materiaalia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin ultrasuodatuksella käyt-20 tämällä sekoituksessa olevaa kammiota (Amicon, Inc.,
Beverly, MA), jossa oli halkaisijaltaan 43 mm:n YM-100 vaakasuora membraani (Amicon, Inc., Beverly, MA) typen . alla 10 psi:n (68,88 kPa) paineessa.
Lopputuote karakterisoitiin SDS/PAGE:lla Coomassie-]·* * 25 värjäyksellä ja "Solution Sieving" -kapillaarielektrofo- ί.ϊ ! reesilla (SSCE). Lopputuote kaaviosta 2 oli 88-prosentti- sen puhdas SSCE:n perusteella.
Esimerkki 21 iTi A. Rekombinanttisen CRPV LI -kapsidiproteiinin puh- 30 distus - kaavio 3 . .·. Kaikki vaiheet suoritettiin 4 eC:n lämpötilassa ,···, ellei toisin ilmaista.
• · · ’· t -70 °C:n lämpötilaan varastoidut solut sulatettiin * * ja suspensoitiin yhtäsuureen tilavuuteen hajotuspuskuria
"**· 35 (20 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM
« • · • · · • · » 9 · 37 119815 EDTA). Proteaasin inhibiittorit PMSF ja pepstatiini A lisättiin lietteeseen niin että niiden loppukonsentraatiot olivat 2 mM ja vastaavasti 1,7 μΜ. Solut hajotettiin käyttämällä BioNeb Cell Disruptor -järjestelmää (Glas-Col 5 Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla 5 000 g:n kiihtyvyydessä 10 minuuttia.
Supernatantti pantiin kerrokseksi 5 cm: n tyynyn päälle, joka oli 45 % sakkaroosi (w/v) Ll-puskurissa, ja LI ajettiin pohjaan sentrifugoimalla 100 000 g:n kiihty-10 vyydellä 4 tuntia. Sakka resuspensoitiin 1/10-tilavuuteen Ll-puskurissa. Resuspensoitu sakka kirkastettiin sentrifugoimalla 5 000 g:n kiihtyvyydellä 10 minuuttia.
Supernatantti uutettiin 1/2-tilavuudella kloroformia. Vesikerros poistettiin ja kirkastettiin sentrifugoi-15 maila 12 000 rpm:n nopeudella Beckmanin mikrosentrifuugissa 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.
Supernatantti laimennettiin 1:5 PBS:llä, kirkastettiin uudelleen sentrifugoimalla Sorvailin SA-600-rootto-rissa 6500 rpm:n nopeudella 10 minuuttia 4 °C:n lämpöti-20 lassa. Supernatantti suodatettiin 0,22 mikronin ruiskusuo-dattimen läpi ja fraktioitiin anioninvaihtokromatografiällä.
. . Anioninvaihtokromatografia suoritettiin Perkin- • ·
Elmer Series 410 Biopump HPLCtllä, jossa oli 5 ml:n in- • · ·
't·** 25 jektiosilmukka. Kromatografiaväliaine oli Fractogel EMF
ί·ί 5 TMAE-650 (S) 25 - 40 mikronin hartsi (EM Separations, ,.'.Υ Gibbs town, NJ) 150 mm:n (sisähalkaisija 10 mm) lasipyl- väässä. Proteiinin pylväästä eluoitumisen nopeuden monito-!1Γ: roimiseksi optinen detektio 280 nm:n aallonpituudella saa- 30 tiin aikaan Perkin-Elmerin LC-235 diodirividetektorilla.
I Pylväs esitasapainotettiin 0,15 M NaCl:llä, joka oli «·· *;», 0,01 M natriumfosfaattipuskurin suhteen, pH 7,2 (puskuri ♦ · · *· A). Pylvästä ajettiin virtausnopeudella 0,75 ml/min. Näyte * 1 ladattiin pylvääseen ja pylväs pestiin puskurilla A sitou- ***** 35 tumattoman materiaalin poistamiseksi. Sitoutunut materiaa- • 1 # « « • · « e·· ♦ » 38 119815 li eluoitiin natriumkloridin lineaarisella konsentraatio-gradientilla 0,15 M - 0,65 M 5 minuutin ajan, mitä seurasi lineaarinen gradientti 0,65 M - 1,15 M 30 minuutin ajan. Eluution aikana kerätyissä fraktioissa olevan antigeenin 5 detektio saatiin aikaan immuno-dot-blot-määrityksellä.
Immunoreaktiivista materiaalia sisältävät fraktiot (se on: fraktiot, jotka eluoitulvat välillä 0,81 M ja 1,05 M NaCl) yhdistettiin.
Yhdistetyt fraktiot konsentroitiin Macrosep sentri-10 fugaalisilla konsentrointilaitteilla (Filtron Technology
Corp., Northborough, MA) 1/5-tilavuuteen.
Konsentraatti fraktioitiin kokoekskluusiokroma-tografialla käyttämällä Sephacryl S-1000 SF-hartsia (Pharmacia, Piscataway, NJ) 87 cm:n pylväässä (sisähalkai-15 sija 27 mm). Pylvästä ajettiin virtausnopeudella 2,5 ml/min. Proteiinin eluutiota monitoroitiin absorbanssilla 280 nm:n aallonpituudella. Antigeeni detektoitiin immuno-blottauksella.
Immunoreaktiivista materiaalia sisältävät fraktiot 20 yhdistettiin ja konsentroitiin ultrasuodatuksella käyttä mällä sekoituksessa olevaa kammiota (Amicon, Inc., Beverly, MA), jossa oli vaakasuora, halkaisijaltaan 43 . . mm:n YM-100-membraani (Amicon, Inc., Beverly, MA) typen • · alla 10 psi:n (68,88 kPa) paineessa.
♦ · f V 25 Lopputuote karakterisoitiin SDS/PAGE:lla Coomassie- • # ί värjäyksellä ja "Solution Sieving" -kapillaarielektrofo- « reesilla. Lopputuote kaaviosta 3 oli 95-prosenttisen puh- das SSCE:n perusteella.
ΓΓϊ Esimerkki 22 * 30 CRPV Ll:n ja HPV tyyppi 6a:n Ll:n (kanta 1644) 2 ,·. ekspressio rikastetussa kompleksisessa ja kemialli- sesti määritetyssä elatusaineessa » · · '» Ympit näitä kantoja varten kehitettiin leusiinitto- ·*” massa synteettisessä elatusaineessa edellä kuvatulla ta- 35 valla ravisteltavissa pulloissa olevia viljelmiä varten.
• * » 9 * • 99 ··» * 9 I * 39 119815 Käytettävien ravisteltavien pullojen suuntaa muutettiin hyvää ilmastuskykyä varten (70 ml nestettä per 300 ml:n pullo, Tunair Labware) ja elatusaineeseen lisättiin noin 0,5 ml/1 vaahtoamista estävää ainetta (UCON LB-625, Union 5 Carbide). Rikastettu kompleksinen elatusaine sisälsi (litraa kohti): 40 g Difcon hiivaekstraktia, 20 g Sheffieldin HySoy-peptonia, 30 g glukoosia, 50 g galaktoosia; elatus-aine säädettiin pH-arvoon 5,3 ennen sterilointia. Käytetty kemiallisesti määrätty elatusaine oli samanlainen kuin 10 Ouran kuvaama (Biotechnol. Bioengineer. 16:1197-1212. 1974) mutta siihen oli lisätty (litraa kohti): 0,1 g koliini Cl:ää, 0,4 g adeniinia, 30 g mononatriumglutamaattia typenlähteenä, 0,2 g urasiilia, 20 g glukoosia, 40 g galaktoosia. Pulloihin siirrostettiin 3 ml ymppiä ja niitä 15 inkuboitiin 66 tuntia 28 eC:n lämpötilassa pyörivällä ravisteli j alla, 250 rpm. Pulloista otettiin ajoittain näytteitä ekspression varmistamiseksi immunoblottauksella, jossa käytettiin CRPV:n Ll:tä ja HPV 6a:n Ll:tä vastaan suunnattuja antiseerumeita.
20 Esimerkki 23 HPV-6a:n genomin kloonaus
Kudos potilaasta, josta oli diagnosoitu vakava kon- . , dylomata acuminata (saatiin tri Darron Brownilta, Indiana * ·
University School of Medicine) tyypitettiin restriktioent- f. · · ” * 25 syymidigestiolla ja polymeraasiketjureaktiolla (PCR) ja • * ϊ.ϊ : sen osoitettiin sisältävän HPV tyyppi 6a:n. Kudosnäyttees- « ,.*·* tä uutettiin DNA ja se digestoitiin Hindlll-entsyymillä.
Ι#:]ί Sen jälkeen kun oli tehty kokofraktiointi 0,8-prosentti- i*j*· sen, alhaisessa lämpötilassa sulavan preparatiivisen aga-
S
30 roosigeelin läpi, 8 kb:n alue leikattiin irti geelistä ja i ,·. agaroosi digestoitiin Gelase™-entsyymillä (Epicentre ,···. Technologies, Inc.). Näyte ligoitiin pUC18:lla, joka oli digestoitu HindIII:lla ja defosforyloitu (Pharmacia, Inc). Kompetenttien E. coli DH5-solujen (BRL) transformaation *:·*: 35 jälkeen plasmidikirjasto seulottiin silmällä pitäen HPV- m • 9 • · · * · · « * 9 40 119815 6a-positi±visia klooneja käyttämällä 3ZP-leimattua oligo-deoksinukleotidia, joka oli komplementaarinen HPV-6a:n Li-geenille. pUC18-plasmidi, joka sisälsi 8 kb:n HPV-6a-geno-min, eristettiin ja karakterisoitiin restriktioentsyymi-5 ja Southern blot -analyyseillä. Tälle plasmidille annettiin nimeksi pUC18-HPV-6a. Täydellinen 8 kb:n HPV-6a-geno-mi sekvensoitiin käyttämällä ABI:n automaattista sekven-sointilaitetta (373A) valmistajan ohjeiden mukaan.
Iso vulvan condyloma acuminatum -leesio saatiin 25-10 vuotiaalta synnyttäneeltä naispuoliselta potilaalta. Pala leesiosta pakastettiin nestetypessä, sitten se käsiteltiin "Braun mikrodismembrator II" -laitteella (B. Braun Instruments, Melsungen, Saksa). Tuloksena saatu materiaali solu-bilisoitiin 0,6 % (w/v) natriumdodekyylisulfaatilla (SDS), 15 käsiteltiin proteinaasi K:11a (50 pg/ml) ja uutettiin fe-noli/kloroformi/isoamyylialkoholilla. DNA seostettiin etanolilla ja kvantitoitiin UV-spektrofotometriällä. Molekyy-lipainoltaan korkean DNA:n läsnäolo todettiin agaroosigee-lielektroforeesilla, jota seurasi värjäys etidiumbromidil-20 la.
HPV-DNA:n tyyppi määritettiin käyttämällä hybridi-sieppausmääritystä, jota markkinoidaan nimellä ViraType .# . Plus (Digene Diagnostics, Beltsville, MD). Käytetyt HPV- • ♦* koettimet jaettiin kahdeksi joukoksi, joiden koostumus • « * / , 25 perustuu kunkin tyypin assosiaatioon genitaaliteiden pa- • · * **· · hanlaatuisiin tiloihin. Koetinryhmä A sisälsi "pienen ris- *·.ί kin" tyypit HPV6, 11, 42, 43 ja 44, kun taas koetin B si- *.:.· sälsi "suuren riskin" tyypit 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, V · 52 ja 56. Totaali-DNA digestoitiin Pstl:llä, BamHI:llä ja 30 HindIII:lla ja Southernin blotit suoritettiin käyttämällä • hyvin vaativia olosuhteita (Tm-15 eC) HPV-alatyypin määrit- ·♦· .*:*. tämiseksi.
• · · * ( Täydellisen HPVöa-sekvenssin määrittämiseksi sek- vensointialukkeet syntetisoitiin julkaistun HPV6b~sekvens- * * 35 sin perusteella. Täydellisen 8,1 kiloemäsparin pituisen * ♦ • · · * ♦ · ··· ♦ ··««* • · 41 119815 HPV6a-genomin molemmat juosteet sekvensoitiin dideoksi-ketjunpäättämismenetelmällä käyttämällä PRlSM™-tarvikesar-jaa ja Applied Biosystems (ABI) automaattista sekvensoin-tilaitetta (373A) valmistajan ohjeiden mukaisesti (ABI, 5 Inc., Foster City, CA). Niissä tapauksissa, missä "sense"-ja "antisense"-sekvenssi eivät täsmänneet, syntetisoitiin muita HPV6a-spesifisiä alukkeita, joilla sekvensoitiin uudelleen molempiin suuntiin kyseessä olevan alueen yli konsensuksen saavuttamiseksi.
10 HPV6a:n ja HPV6b:n DNA-sekvensseissä ilmeni yli 97 %:n identiteetti, kaikkiaan 229 muuttunutta emäsparia tunnistettiin 8010 emäsparin joukosta. Merkittävimmät erot HPV6b-sekvenssiin verraten havaittiin pitkässä kontrolli-alueessa (LCR: nukleotidit 7205 - 106). Paitsi useita yk-15 sittäisiä nukleotidimuutoksia HPV6a:n LCR:ssä, havaittiin 94 emäsparin insertio nukleotidin 7350 kohdalla ja toinen 19 emäsparin insertio nukleotidin 7804 kohdalla. Nukleotidin 7615 kohdalla kuusi emäsparia oli deletoitunut HPV6a-genomissa.
20 Esimerkki 24 HPV6a LI -hiivaekspressiovektorin muodostaminen HPV tyyppi 6a: n DNA:ta käytettiin templaattina . . PCR:ää varten. HPV6a:n LI-geeni monistettiin PCR:llä käyt- * · · l„* tämällä Vent-polymeraasia (New England Biolabs, Inc.), • · · [•*#* 25 35:n syklin monistusta (94 eC 1 min, 48 eC 1 min, 72 eC 1 • · · ··· · min 45 sekuntia) ja seuraavia oligodeoksinukleotidialuk- * keitä, jotka sisältävät päässä sijaitsevat Bglll-kohdat *,·.· (alleviivattu):
•V*: "sense"-aluke: 5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC
30 GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3' (sekvenssi : nro 11) «*·
.*:·. "antisense"-aluke: 5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG
* # CGC TTA C-3'-(sekvenssi nro 12) "Sense"-aluke tuo hiivan ei-transloituvan leader- '* * 35 sekvenssin heti ylävirtaan HPV6a:n LI:n aloittavasta me- * * · • * · • · · • · · · » • f I·· • · 42 119815 tioniinikodonista (korostettu lihavoinnilla). 1,5 kilo-emäsparin LI PCR-tuote digestoitiin Bglll:lla ja puhdistettiin geelissä. pCl/1-GAL-ekspressiovektori muodostettiin eristämällä 1,4 kiloemäsparin Sphl-fragmentti kaksi-5 suuntaisesta promoottorivektorista pUC18-GALlp-GAL10p, joka sisältää kaksisuuntaisen GALI/GALlO-promoottorin plasmidista pBM272 (saatu tri Mark Johnstonilta, Washington University, St. Louis), jota reunustaa molemmin puolin yksi kopio hiivan ADffl-transkriptionterminaattorista 10 [Bennetzen, J. L. ja Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257:3018-3025]. Tuloksena olevassa ekspressiokasetissa BamHI-kohta sijaitsee GAL1 -promoottorin ja ADHl-transkrip-tionterminaattorin ensimmäisen kopion välissä, ja Smal-kloonauskohta sijaitsee erisuuntaisen GALI0-promoottorin 15 ja ADH1 -transkriptionterminaattorin toisen kopion välissä. Hiivan sukkulavektori pCl/1 (Rosenberg ym., Nature 312 (1984) 77 - 80) digestoitiin Sphl:llä ja ligoitiin 1,4 kiloemäsparin Sphl GAL-promoottorifragmentin kanssa. Tuloksena oleva vektori pCl/1-GAL linearisoitiin BamHI:llä, 20 joka katkaisee GAL!-promoottorin ja ADHl-transkription terminaattorin välistä. BamHI-digestoitu pCl/1-GAL-vektori ja BglII-digestoitu HPV6a:n LI-PCR-fragmentti ligoitiin ja • t . käytettiin transformoitaessa E. coli DH5-soluja (BRL).
Eristettiin pCl/1-GAL-plasmidi, joka sisältää HPV-6a LI
* · · [**/ 25 -geenin, ja sille annettiin nimeksi pl3173-357-6. Ll-geeni · pl3173-357-6 sekvensoitiin (ABI Sequencer #373A) ja sen osoitettiin olevan identtinen pUC18-HPV6a-kloonissa olevan Ll-geenin kanssa.
: : : Esimerkki 25 30 HPV6a LI- ja L2 -hiivaekspressiovektorin muodosta- . .1· minen • · · .·;·. Plasmidi pl3173-357-6 (pCl/l-GAL+HPV6a LI) diges- • # toitiin Smalrllä, joka katkaisee GAL10-promoottorin ja • 1 ADHI-transkriptionterminaattorin välistä. 1,4 kiloemäspa- 35 rin HPV6a L2-geeni monistettiin PCRtllä käyttämällä pUC18- • · • · · • · · · · ·
••M
• · 43 119815 HPV6a-DNA:ta templaattina, Vent-polymeraasia (New England Biolabs, Inc.)/ 10 sykliä PCR-monistusta (94 “C, 1 min, 48 eC, 1 min, 72 eC, 1 min 45 sekuntia) ja seuraavia oli-godeoksinukleotidialukkeita, jotka sisältävät reunassa 5 Smal-kohdan (alleviivattu):
"sense"-aluke: 5'-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGG CAC
ATA GTA GGG CCC GAC GAC-3' (sekvenssi nro 13) "antisense"-aluke: 5'-TCC CCC GGG CTA GGC CGC CAC ATC TGA 10 AAA AAA TAA GG-31 (sekvenssi nro 14) "Sense"-aluke tuo hiivan ei-transloituvan leader-sekvenssin heti ylävirtaan HPV6a L2:n aloittavasta metio-niinikodonista (korostettu lihavoinnilla). PCR-fragmentti 15 digestoitiin Smal:llä, geelipuhdistettiin ja ligoitiin
Smal:llä digestoidun pl3173-357-6-plasmidin kanssa. pCl/1-GAL-plasmidi, joka sisälsi sekä HPV6a LI- ja L2-geenit, eristettiin ja sille annettiin nimeksi pl4049-7-2. L2-gee-ni sekvensoitiin (ABI Sequencer #373A) ja sen havaittiin 20 olevan identtinen pUC18-HPV6a-kloonissa olevan L2-geenin kanssa.
Esimerkki 26 HPV6a Ll:n ekspressio ja HPV6a Ll:n ja L2:n ko-,···, ekspressio hiivassa • · φ .\.t 25 Plasmidit pl3173-357-6 (pCl/1-GAL + HPV6a LI) ja i,:.: P14049-7-2 (pCl/1-GAL + HPV6a LI ja L2) käytettiin trans- ·*· **·; formoitaessa S. cerevisiae -kannat nro 1569 (MATa, leu2- 04, prbl, adel, pep4, cir°) ja nro 1558 (MATa, leu2~04, V : prbl, mnn9, adel, cir°). Tuloksena olevat rekombinanttikan- 30 nat, jotka saatiin käyttämällä isäntäkantaa nro 1558, oli- : :** vat kannat nro 1644 (HPV6a LI) ja nro 1670 (HPV6a L1+L2) :T: kuten taulukossa on esitetty. Klonaalisia isolaatteja kas- t * . vatettiin 30 °C:n lämpötilassa YEHD-elatusaineessa, joka • * . sisälsi 2 % galaktoosia, 68 - 78 tunnin ajan. Solujen ke- 35 räyksen jälkeen solusakat rikottiin lasihelmillä ja solu- • · • · · * · · • · · · · 119815 44 lysaatteja analysoitiin immunoblot-analyysillä HPV6a:n LI-tai HPV6a:n L2-proteiinin ekspressiota silmällä pitäen. Näytteet, jotka sisälsivät 40 pg totaalisoluproteiinia, ajettiin elektroforeesilla 10 % Tris-glysiini-geeleissä 5 pelkistävissä ja denaturoivissa olosuhteissa ja blotattiin sähköllä nitroselluloosafilttereille. Ll-proteiini immuno-detektoitiin käyttäen primäärisenä vasta-aineena kanin antiseerumeita, jotka oli suunnattu trpE-HPVll-fuusiopro-teiinia vastaan (Brown, D.R. ym., Virology 201:46-54), ja 10 sekundäärisenä vasta-aineena kanin IgG:tä vastaan suunnattua aasin kokonaista vasta-ainetta, joka oli kytketty pi-parjuuriperoksidaasiin (HRP) (Amersham, Inc.). Filtterit käsiteltiin käyttämällä kerniluminesoivaa ECL™ Detection Kit -tarvikesarjaa (Amersham, Inc.). 50 - 55 kDa:n Ll-pro-15 teiinijuova detektoitiin kaikissa näytteissä paitsi nega- tiivikontrollissa (pCl/1 ilman LI- tai L2-geeniä).
L2-proteiini detektoitiin 70 kDa:n proteiini juovana Western-analyysillä käyttämällä primäärisenä vasta-aineena 1:250 laimennettua seerumia hiiristä, jotka oli immunisoi-20 tu 3 kertaa trpE-HPV6a L2-fuusioproteiinilla, joka oli valmistettu oleellisesti Carterin ym. menetelmällä, ja toisena vasta-aineena hiiren IgGitä vastaan suunnattua, ·. . HRPthen kytkettyä lampaan vasta-ainetta (Amersham, Inc.) • * (laimennos 1:1 000).
• * · /*,’ 25 EM-analyysiä varten (Structure Probe, West Chester, • · · ·'·· · PA) erä kustakin näytteestä sijoitettiin mesh-luvun 200 • * · ···: hiilipäällysteisille kuparihiloille. Tippa 2-prosenttista * fosfovolframihappoa (PTA), pH 7,0, sijoitettiin hilalle 20 • * * V : sekunniksi. Hilojen annettiin kuivua ilmassa ennen TEM-
30 tutkimusta. Kaikki mikroskopia tehtiin käyttämällä JEOL
: lOOCX-transmissioelektronimikroskooppia (JEOL USA, Inc.) · kiihdytys jännitteellä 100 kV. Tuotetuissa mikrovalokuvissa * , lopullinen suurennos on 100 000-kertainen.
| Kaikissa hiivanäytteissä, jotka sisälsivät joko * * 35 HPV6a LI:n tai HPV6a LI- ja L2-koekspressioplasmidit, ha- φ · • · * • · · • ·· · • · 119815 45 vaittiin VLP-partikkeleita, joiden halkaisija oli luokkaa 50 - 55 nm. Hiivakontrollinäytteissä ei havaittu mitään VLP-partikkeleita.
Esimerkki 27 5 HPV6a L1+L2 (kanta nro 1670) fermentointi
Kannan 1670 maljaviljelmän pintakasvusto siirrettiin aseptisesti leusiinittomaan nestemäiseen alustaan, joka sisälsi (litraa kohti) 8,5 g Difcon hiivatypenlähdet-tä ilman aminohappoja ja ammoniumsulfaattia, 0,2 g adenii-10 nia, 0,2 g urasiilia, 10 g meripihkahappoa, 5 g ammoniumsulfaattia ja 0,25 g L-tyrosiinia: tämä elatusaine säädettiin pH-arvoon 5,0 - 5,3 NaOH:lla ennen sterilointia. Sen jälkeen kun oli kasvatettu 25 tuntia 28 eC:n lämpötilassa, 250 rpm pyörivällä ravistelijalla, pakastetut viljelmäput-15 ket valmistettiin lisäämällä steriiliä glyserolia loppu-konsentraatioksi 17 % (w/v) ennen varastointia -70 eC:n lämpötilassa (1 ml per kryoputki). Ymppi kannan 1670 fer-mentointia varten kehitettiin samassa elatusaineessa (500 ml per 2 litran pullo) ja se aloitettiin siirtämällä kah-20 den pakastetun viljelmäputken sulatettu sisällys 2 litran pulloihin ja inkuboimalla 28 eC:n lämpötilassa, 250 rpm pyörivällä ravistelijalla 25 tuntia. Kannan 1670 fermen- ·, ; tointi käytti New Brunswick SF-116 -fermentoria, jonka • · · käyttötilavuus oli 10 litraa inokuloinnin jälkeen. Käytet- • « ,*. 25 ty tuotantoalusta sisälsi (litraa kohti): 20 g Difcon hii- * * » "·/ vaekstraktia, 10 g Sheffieldin HySoy-peptonia, 20 g glu- »·* *·« koosia, 20 g galaktoosia, elatusaine säädettiin pH-arvoon *.!.* 5,3 ennen sterilointia. Koko 2 litran ymppipullon sisältö • ·· 5 (500 ml) siirrettiin fermentoriin, jota inkuboitiin 30 28 °C:n lämpötilassa 5 litraa ilmaa per minuutti, 400 rpm, : paine 3,5 psi (24,108 kPa). Ravistusta lisättiin tarpeen ·«· mukaan, jotta liuenneen hapen tasot saatiin pidettyä kor- * , keammalla kuin 40-prosenttinen kyllästysaste. Fermentoin- «···· | nin edistymistä monitoroitiin erillisillä ("offline") glu- * * 35 koosin mittauksilla (Beckman Glucose 2 Analyzer) ja ajan- • · * · · * · · * ·♦ · • · 46 119815 tasaisella ("online") massaspektrometrialla (Perkin-Elmer 1200). 69 tunnin inkuboinnin jälkeen saavutettiin soluti-heys 9,9 g solukuivapainoa per litra. Viljelmä konsentroitiin onttokuitusuodatuksella (Amicon H5MP01-43-patruuna 5 Amicon DC-10-suodatusjärjestelmässä) noin 2 litraksi, dia-filtroitiin 2 litralla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta ja konsentroitiin edelleen (noin 1 litraksi) ennen jakamista 500 ml: n sentrifuugipulloihin. Solusakat kerättiin sentrifugoimalla 8000 rpm:n nopeudella (Sorval GS3-root-10 tori) 20 minuuttia 4 °C:n lämpötilassa. Supernatantin de-kantoinnin jälkeen sakat (kaikkiaan 225 g märkiä soluja) varastoitiin -70 °C:n lämpötilaan käyttöön asti.
Esimerkki 28
Rekombinanttisten HPV6a Ll+L2-kapsidiproteiinien 15 puhdistus
Kaikki vaiheet suoritettiin 4 °C:n lämpötilassa ellei toisin ilmaista.
Kannan nro 1670 solut varastoitiin pakastettuna -70 °C:n lämpötilassa. Pakastetut solut (märkäpaino 20 38,0 g) sulatettiin 20 - 23 eC:n lämpötilassa ja resuspen- soitiin 50 ml:aan "Ll-puskuria" (20 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaasin inhibiitto-·, ; rit PMSF ja pepstatiini A lisättiin niin että niiden lop- pukonsentraatiot olivat 2 mM ja vastaavasti 1,7 μΜ. Solu- • · · .* . 25 liete rikottiin noin 8 000 psi:n paineessa (55 104 kPa) · · ·**/ viemällä se kolme kertaa "M110 Microfluidizer" -laitteen i*· ***j läpi (Microfluidics Corp., Newton, MA). Rikottu soluliete sentrifugoitiin 5 000 g:n kiihtyvyydessä 10 minuutin ajan • ·· V * soluroskan poistamiseksi. Saatiin talteen supernatantti- 30 neste joka sisälsi Ll+L2-antigeenin.
; Supernatanttineste laimennettiin 1:5 lisäämällä »·· puskuri A (20 mM MOPS, pH 7,0) ja tämä pantiin anionin- * , vaihtosieppauspylvääseen (sisähalkaisija 5,0 cm, 4,0 cm),
* jossa oli Fractogel® EMD TMAE-650 (S) -hartsia (EM
35 Separations, Gibbstown, NJ), joka oli tasapainotettu pus- • · · • · * * ·· • · 47 1 1 98 1 5 kurissa A. Puskurilla A pesun jälkeen antigeeni eluoitiin gradientilla, jossa oli 0 - 1,0 M NaCl puskurissa A.
Immuno-dot-blottaus suoritettiin sen määrittämiseksi, mitkä pylväästä saadut fraktiot sisälsivät Ll-proteiinin.
5 Fraktiot, jotka sisälsivät immunodot-blottauksella analysoituina Ll-proteiinin, määritettiin totaaliproteii-nia silmällä pitäen Bradfordin menetelmällä, mitä seurasi SDS-PAGE jossa käytettiin hopeavärjäystä ja Western-blot-tausta.
10 TMAE-fraktiot, joissa näkyi vertailukelpoinen puh taus ja Ll-proteiinin rikastuminen, yhdistettiin. Antigeeni konsentroitiin ammoniumsulfaattifraktioinnilla. Liuos säädettiin ammoniumsulfaatin suhteen 63-prosenttisen kyllästetyksi lisäämällä kiinteää reagenssia samalla kun se-15 koitettiin hellävaroen 30 minuutin ajan. Näyte sijoitettiin jäille ja saostumisen annettiin jatkua 30 minuutin ajan. Näyte sentrifugoitiin 12 000 g:n kiihtyvyydellä. Sakka resuspensoitiin 20,0 ml:11a PBS:ää (6,25 mM Na-fos-faatti, pH 7,2, 150 mM NaCl).
20 Resuspensoitu sakka ajettiin kromatografiässä koko- ekskluusiopylväässä (sisähalkaisija 2,6 cm, 89 cm), jossa oli Sephacryl 500 HR -hartsia (Pharmacia, Piscataway, NJ).
. Ajopuskuri oli PBS. Kromatografia suoritettiin 20 - • ·· I,.' 23 °C:n lämpötilassa. Fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:11a • f » /*/ 25 käyttämällä hopeavärjäystä ja western blot -detektiota.
« · · · Puhtaimmat fraktiot yhdistettiin. Tuloksena oleva yhdis-• · · telmä konsentroitiin.
Lopputuote analysoitiin SDS-PAGE :11a käyttämällä • *· * värjäystä kolloidisella Coomassiella. LI- ja L2-proteii-30 nien arvioitiin olevan 85-prosenttisen homogeenisia. Ll- j ja L2-proteiinien identiteetti vahvistettiin Western-blot- tauksella käyttämällä soveliaista antiseerumeita. Loppu- * t tuote jaettiin eriin ja varastoitiin -70 °C:n lämpötilaan.
Tämä menetelmä tuotti kaikkiaan 3,0 mg proteiinia.
• · • i • · * ♦ · » »M · • · 48 1 1 981 5
Elektronimikroskopia-analyysin suoritti Structure Probe (West Chester, PA). Erä kustakin näytteestä sijoitettiin 200 mesh hiilipäällysteisille kuparihiloille. Tippa 2 % fosfovolframihappoa, pH 7,0, sijoitettiin hilalle 5 20 sekunniksi. Hilojen annettiin kuivua ilmassa ennen TEM- tutkimusta. Kaikki mikroskopia tehtiin käyttämällä JEOL lOOCX-transmissioelektronimikroskooppia (JEOL USA, Inc.) kiihdytysjännitteellä 100 kV. Tuotetuissa mikrovalokuvissa lopullinen suurennos on 100 000-kertainen. Viruksen kal-10 täisten partikkeleiden läsnäolo kokoalueella 50 - 55 nm vahvistettiin.
Esimerkki 29 HPV-6a Li:n ja Ll/L2-VLP-partikkeleiden puhdistus EM-tutkimuksia varten 15 Hiivassa ekspressoidut HPV-6a LI- ja HPV6a L1+L2- proteiinit puhdistettiin osittain ja konsentroitiin elektronimikroskopia (EM) -tutkimuksia varten. 1-1,5 litraa YEHD-elatusainetta, joka oli 2 % galaktoosin ja 0,1 M sorbitolin suhteen, ympättiin S. cerevisiae -kannalla nro 20 1558, joka sisälsi joko plasmidin pl3l73-357-6 (Ll-eks- pressiovektorin) tai plasmidin pl4049-7-2 (LI- ja L2-ko-ekspressiovektori), ja kasvatettiin 30 eC:n lämpötilassa ·, ; 68 - 78 tuntia. Solut kerättiin sentrifugoimalla 4 000 g:n lämpötilassa 10 minuutin ajan ja solusakat pakastettiin • · · . 25 -70 °C:n lämpötilassa. Kaikki seuraavat vaiheet suoritet- » t · ·**.* tiin 4 °C:n lämpötilassa. Solusakat sulatettiin ja suspen- »«♦ •••j soitiin yhtäsuureen tilavuuteen "Ll-puskuria" (20 mM nat- *.i.: riumfosfaatti, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Prote- ··· *.· * aasin inhibiittorit PMSF ja pepstatiini A lisättiin liet- 30 teeseen niin että niiden loppukonsentraatiot olivat 2 mM Χ.ϊ*ϊ ja vastaavasti 1,7 μΜ. Solut rikottiin viemällä ne 3 - 5 ;T: kertaa "microfluidizer"-laitteen läpi. Lysaatti kirkastetuin tiin sentrifugoimalla 5 000 g:n kiihtyvyydessä 10 minuutin • · . ajan. Supernatanttineste pantiin kerrokseksi 5 cm:n tyynyn 35 päälle (45 % (w/v) sakkaroosi LI-puskurissa) ja LI- tai • * • · * • · · ·»· · 9 · 49 119815
Ll+L2-proteiinit ajettiin pohjaan sentrifugoimalla 100 000 g:n kiihtyvyydellä 4 tuntia. Sakka resuspensoitiin 1/10-tilavuuteen Ll-puskuria ja kirkastettiin sentrifugoimalla 5 000 g:n kiihtyvyydellä 10 minuutin ajan. Näytteet 5 tutkittiin EM:llä ja niiden osoitettiin sisältävän viruksen kaltaisia partikkeleita.
Esimerkki 30 HPV16:n LI- ja L2-geenien kloonaus Genominen totaali-DNA uutettiin Caski-soluista 10 (ATCC CRL 1550) standardimenetelmin (Sambrook ym. edellä).
DNA digestoitiin Bstl 1071- ja SphI-endonukleaaseilla ja ajettiin elektroforeesissa 0,8 % matalassa lämpötilassa sulavan preparatiivisen agaroosigeelin läpi. Alue, joka vastasi noin 3,5 kiloemäsparin DNA:ta, leikattiin irti 15 geelistä ja agaroosi digestoitiin Gelase™-entsyymillä (Epicentre Technologies, Inc.). Geelissä puhdistettu DNA saatettiin tasapäiseksi T4 DNA-polymeraasilla ja ligoitiin tasapäisten, fosforyloitujen oligodeoksinukleotidilinkke-reiden kanssa, jotka sisältävät upotetun HindiII-kohdan. 20 Ligaatioseos digestoitiin täydellisesti HindIII:lla ja noin 3,5 kiloemäsparin DNA kokofraktioitiin agaroosigeelin läpi edellä kuvatulla tavalla. Geelipuhdistettu DNA ligoitiin pUC18-plasmidi-DNA:n kanssa, joka oli digestoitu Φ »·
Hindin:11a ja defosforyloitu. Kompetenttien E. coli DH5- « · « ***/ 25 solujen (BRL) transformaation jälkeen plasmidikirjasto c 1 · *·· · seulottiin silmällä pitäen HPV16-positiivisia klooneja * pesäkehybridisaatiolla käyttämällä 32P~leimattua "antisen-se"-oligodeoksinukleotidia, joka on komplementaarinen HPV-16 LI-geenin 3' -pään suhteen (5’-GAG AGA TCT TAC AGC TTA 30 CGT TTT TTG CGT TTA GC-3'). pUC18-plasmidi, joka sisälsi • ;‘· 3,3 kiloemäsparin genomisen HPV16-fragmentin, eristettiin *·» ja karakterisoitiin restriktioentsyymi- ja Southern blot * t -analyyseillä. Tälle plasmidille annettiin nimeksi pUC18- ’ ' HPV16 L1/L2 ja se sisältää kaikki LI:n ja L2:n koodittavat • ;··«« » Φ • · • « ♦ • M 1 t • 1 50 119815 DNA-sekvenssit. Plasmidi-DNA valmistettiin käyttämällä "Qiagen™ Plasmid Maxi kit" -tarvikesarjaa (Qiagen, Inc.)· Esimerkki 31 HPV 16 Li -hiivaekspressiovektorin muodostaminen 5 Kloonia pUC18-HPV16 L1/L2 käytettiin templaattina PCR:ssä. HPV16 Ll-geeni monistettiin PCRillä käyttämällä Vent-polymeraasia (New England Biolabs, Inc.), 10 sykliä monistusta (94 eC 1 min, 48 eC 1 min, 72 eC 1 min 45 sekuntia) ja seuraavia oligodeoksinukleotidialukkeita, jotka 10 sisältävät reunassa Bglll-kohdat (alleviivattu):
"sense"-aluke: 5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT
CTC TTT GGC TGC CTA TGT AGG CC-31 (sekvenssi nro 15)
"antisense"-aluke: 5’-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG
15 CGT TTA GC-3' (sekvenssi nro 16) "Sense"-aluke tuo hiivan ei-transloituvan leader- sekvenssin heti ylävirtaan HPV 16 LI:n aloittavasta metioniinikodonista (korostettu lihavoinnilla). 1,5 kiloemäsparin LI PCR-tuote digestoitiin BglII:lla, puhdis- 20 tettiin geelissä, ja ligoitiin BamHI-digestoidun pCl/1- GAL-vektorin kanssa. Eristettiin pCl/1-GAL-plasmidi, joka sisälsi HPV16:n Ll-geenin, ja sille annettiin nimeksi pl4049-37-l. Ll-geeni pl4049-37-l:ssä sekvensoitiin käyt- ;1·1· tämällä PRISM™-tarvikesarjaa (ABI, Inc.) ja ABI Sequencer : .·. 25 Model #373A:ta valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ll-geenin ··« 1 osoitettiin tässä isolaatissa sisältävän 3 nukleotidimuu-tosta verrattuna korjattuun, julkaistuun prototyyppi sek- ϊ 1 · venssiin (Kirnbauer, R. ym. (1993), J. Virol. 67:6929- • 1 1 * 6936), mitkä johtaa kahteen aminohappomuutokseen: His-202 30 Asp:ksi, Thr-266 Ala:ksi. Alkuperäisen templaatti-DNA:n *.:.1 sekvenssianalyysi vahvisti, että nämä muutokset olivat • ·· V · läsnä myös genomisessa kloonissa pUCl8-HPV16 L1/L2 ja ne ....: eivät olleet PCR:n tuomia.
• · • · • · • · · • · 1 • · · · ···1 • · 51 119815
Esimerkki 32 HPV16 Li- ja L2-hiivaekspressiovektorin muodostaminen
Plasmidi pl4049-37-l (pCl/l-GAL+HPV16Ll) digestoi-5 tiin Smalillä, joka katkaisee GALlO-promoottorin ja RDH1-transkriptionterminaattorin välistä. 1,4 kiloemäsparin HPV16 L2 -geeni monistettiin PCRillä käyttämällä pUC18-HPV16 L1/L2 -DNA:ta templaattina, Vent-polymeraasia (New England Biolabs, Inc.), 10 syklin PCR-monistusta (94 eC, 1 10 min, 48 eC, 1 min, 72 “C, 1 min 45 sekuntia) ja seuraavia oligodeoksinukleotidialukkeita, jotka sisältävät reunassa olevat Smal-kohdat (alleviivattu):
"sense-aluke": 5’-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA
TGC GAC ACA AAC GTT CTG CAA AAC-3' (sek-15 venssi nro 17)
"antisense-aluke": 5'-TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC
ATC TGA-31 (sekvenssi nro 18) "Sense"-aluke tuo hiivan ei-transloitavan leader-sekvenssin heti ylävirtaan HPV 16:n L2:n aloittavasta me-20 tioniinikodonista (korostettu lihavoinnilla). 1,4 kiloemäsparin L2 PCR-tuote digestoitiin Smal:llä, geelipuhdis-tettiin ja ligoitiin Smal-digestoidun pC14049-37-l-vekto-. 1.j rin kanssa. Eristettiin pCl/1-GAL-plasmidi, joka sisälsi HPVI6 LI- ja L2-geenit ja sille annettiin nimeksi pl4049-: 25 42-2. L2-geeni pl4049-42-2: ssä sekvensoitiin käyttämällä «M · PRISM™-tarvikesarjaa (ABI, Inc. ) ja ABI Sequencer Model *"t #373A -laitetta valmistajan ohjeiden mukaisesti. L2-geenin I · 1 osoitettiin tässä isolaatissa sisältävän 5 nukleotidimuu- • 1 1 • · · * tosta verrattuna korjattuun, julkaistuun prototyyppisek-30 venssiin (Kirnbauer, R. ym. (1993), edellä), mikä johtaa * · · yhteen aminohappomuutokseen: Ser-269 Pro:ksi. Alkuperäisen * 2 V 1 genomisen kloonin pUC18-HPV16 Ll/L2:n sekvenssianalyysi * ....{ vahvisti, että tämä muutos oli läsnä myös alkuperäisessä templaatti-DNA:ssa ja se ei ollut PCR:n tuoma.
* · • · * « 1 • · · • · · · · · · · 2 • 1 52 119815
Esimerkki 33 A. HPV16 Ll:n ekspressio ja HPV16 Ll:n ja L2:n ko-ekspressio hiivassa
Plasmideja pl4049-37-l (pCl/1-GAL + HPV16 LI) ja 5 pl4049-42~2 (pCl/1-GAL + HPV16 Li ja L2) käytettiin trans formoitaessa S. cerevisiae -kanta nro 1558. Tuloksena olevat rekombinanttikannat olivat kannat nro 1678 (HPV16-L1) ja nro 1679 (HPV16 L1+L2) kuten taulukossa on esitetty. Klonaalisia isolaatteja kasvatettiin 30 eC:n lämpötilassa 10 YEHD-elatusaineessa, joka sisälsi 2 % galaktoosia 68 - 78 tunnin ajan. Solujen keräyksen jälkeen solusakat rikottiin lasihelmillä ja solulysaatteja analysoitiin immunoblot-analyysillä HPV16 LI- tai HPV16 L2-proteiinin ekspressiota silmällä pitäen. Näytteet, jotka sisälsivät 40 pg totaali-15 soluproteiinia, ajettiin elektroforeesilla 10 % Tris-gly-siini-geeleissä pelkistävissä ja denaturoivissa olosuhteissa ja blotattiin sähkövirralla nitroselluloosafliitereille. HPV16:n Ll-proteiini immunodetektoitiin käyttäen primäärisenä vasta-aineena kanin antiseerumeita, jotka oli 20 suunnattu trpE-HPVll-fuusioproteiinia vastaan (D. Brown ym., Virology 201:46-54), ja sekundäärisenä vasta-aineena kanin lgG:tä vastaan suunnattua aasin kokonaista vasta-/·.: ainetta, joka oli kytketty HRPihen (Amersham, Inc.). Filt- ·*·*: terit käsiteltiin käyttämällä kemiluminesoivaa ECL™ : .*. 25 Detection Kit -tarvikesarjaa (Amersham, Inc.). 50 - 55 * · · * kDa:n LI-proteiinijuova detektoitiin kaikissa näytteissä "“t paitsi negatiivikontrollissa (pCl/1 ilman LI- tai L2-gee- niä). L2-proteiini detektoitiin 70 kDa:n proteiinijuovana * * immunoblottauksella käyttämällä primäärivasta-aineena 30 HPV16 L2:ta vastaan suunnattuja hiiren antiseerumeita, jotka oli tuotettu E. colissa ekspressoituja trpE-L2-fuu- • · · V : sioproteiineja vastaan. Toisena vasta-aineena käytettiin ....: hiiren IgG:tä vastaan suunnattua, HRPihen kytkettyä vuohen vasta-ainetta (Amersham, Inc.), ja filtterit käsiteltiin • · • 35 edellä kuvatulla tavalla.
• a • a · • · • · a a • · « · · • * 53 119815 B. Rekombinanttisten HPV tyyppi 16 L1+L2 -kapsidl-protelinien puhdistus
Kaikki vaiheet suoritettiin 4 eC:n lämpötilassa ellei toisin mainita.
5 Solut varastoitiin pakastettuna -70 °C:n lämpöti
lassa. Pakastetut solut (märkäpaino 27,6 g) sulatettiin 20 - 23 eC:n lämpötilassa ja resuspensoitiin 40 ml:aan "LI-puskuria" (20 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, 100 mM
NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaasin inhibiittorit PMSF ja 10 pepstatiini A lisättiin niin että niiden loppukonsentraa-tiot olivat 2 mM ja vastaavasti 1,7 μΜ. Soluiiete rikottiin noin 8000 psi:n paineessa (55 104 kPa) viemällä se kolme kertaa "M110 Microfluidizer" -laitteen läpi (Microf-luidics Corp., Newton, MA). Rikottu soluliete sentrifugoi-15 tiin 5 000 g:n kiihtyvyydessä 10 minuutin ajan soluroskan poistamiseksi. Saatiin talteen supernatanttineste, joka sisälsi LI+L2-antigeenin.
Supernatanttineste laimennettiin 1:5 lisäämällä puskuria A (20 mM MOPS, pH 7,0) ja tämä pantiin anionin-20 vaihtosieppauspylvääseen (sisähalkaisija 5,0 cm, 4,8 cm), jossa oli Fractogel® EMD TMAE-650 (S) hartsia (EM Separations, Gibbstown, NJ), joka oli tasapainotettu pus-kurissa A. Puskurilla A pesun jälkeen antigeeni eluoitiin gradientilla, jossa oli 0 - 1,0 M NaCl puskurissa A. Immu- # • ·*; 25 no-dot-blottaus suoritettiin sen määrittämiseksi, mitkä • · · · .:. pylväästä saadut fraktiot sisälsivät LI-proteiinin.
, .·, Fraktiot, jotka sisälsivät immunodot-blottauksella analysoituina LI-proteiinin, määritettiin totaaliproteii- ! · « * nia silmällä pitäen Bradfordin menetelmällä, mitä seurasi 30 SDS-PAGE, jossa käytettiin hopeavärjäystä ja Western-blot- * · # *·:·* tausta.
• · · V * TMAE-fraktiot, joissa näkyi vertailukelpoinen puh- ····· taus ja Ll-proteiinin rikastuminen, yhdistettiin. Antigee- ni konsentroitiin ammoniumsulfaattifraktioinnilla. Liuos • · 35 säädettiin ammoniumsulfaatin suhteen 48-prosenttisen kyl- • * · • · « ··· · 9 • •M* ♦ t 54 119815 Xästetyksi lisäämällä kiinteää reagenssia samalla kun sekoitettiin hellävaroen 30 minuutin ajan. Näyte sijoitettiin jäille ja saostumisen annettiin jatkua 30 minuutin ajan. Näyte sentrifugoitiin 12 000 g:n kiihtyvyydellä.
5 Sakka resuspensoitiin 20,0 ml:11a PBS:ää (6,25 mM Na-fos-faatti, pH 7,2, 150 mM NaCl).
Resuspensoidut sakat ajettiin erikseen 20 - 23 °C:n lämpötilassa kokoekskluusiopylväässä (sisähalkaisija 2,6 cm, 89 cm), jossa oli Sephacryl 500 HR -hartsia 10 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Ajopuskuri oli PBS. Kromato-grafia suoritettiin 20 - 23 eC:n lämpötilassa. Fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla käyttämällä hopeavärjäystä ja Western blot -detektiota. Puhtaimmat fraktiot yhdistettiin. Tuloksena oleva yhdistelmä konsentroitiin sekoituk-15 sessa olevassa 50 ml:n kammiossa, jossa käytettiin vaakatasossa olevia 43 mm:n YM-100-membraaneja (Amicon, Beverly, MA) typen paineessa 4-6 psi (27,552 - 41,328 kPa).
Lopputuote analysoitiin SDS-PAGE:lla käyttämällä 20 värjäystä kolloidisella Coomassiella. LI- ja L2-proteii- nien arvioitiin olevan 70-prosenttisen homogeenisia. Ll- ja L2-proteiinien identiteetti vahvistettiin Western-blot- tauksella käyttämällä soveliaita anti seerumeita. Loppu- ;1·1: tuote jaettiin eriin ja varastoitiin -70 °C:n lämpötilaan.
: 25 Tämä menetelmä tuotti kaikkiaan 0,53 mg proteiinia.
• ·· ·
Elektronimikroskopia-analyysin suoritti Structure Probe (West Chester, PA). Erä näytteestä sijoitettiin mesh f « · 200 hiilipäällysteiselle kuparihilalle. Tippa 2 % fosfori· * volframihappoa, pH 7,0, sijoitettiin hilalle 20 sekunnik-30 si. Hilojen annettiin kuivua ilmassa ennen TEM-tutkimusta.
*·ί·1 Kaikki mikroskopia tehtiin käyttämällä JEOL lOOCX-trans- »1» V 1 missioelektronimikroskooppia (JEOL USA, Inc.) kiihdytys- * ·.·.! jännitteellä 100 kV. Tuotetuissa mikrovalokuvissa lopulli- nen suurennos on 100 000-kertainen. Viruksen kaltaisten • • 1 • · · • · · • M · · 55 119815 partikkeleiden läsnäolo kokoalueella 50 - 55 nm vahvistettiin.
C. Rekombinanttisten HPV tyyppi 16 L1+L2 -kapsidi-proteiinien puhdistus 5 Kaikki vaiheet suoritettiin 4 eC:n lämpötilassa ellei toisin mainita.
Solut varastoitiin pakastettuna -70 °C:n lämpötilassa. Pakastetut solut (märkäpaino 92,8 g) sulatettiin 20 - 23 eC:n lämpötilassa ja resuspensoitiin 105 ml:aan 10 "Ll-puskuria" (20 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, 100 mM
NaCl, 1,7 mM EDTA). Proteaasin inhibiittorit PMSF ja peps-tatiini A lisättiin niin että niiden loppukonsentraatiot olivat 2 mM ja vastaavasti 1,7 μΜ. Soluliete rikottiin noin 16 000 psi:n paineessa (110 208 kPa) viemällä se kol-15 me kertaa "M110-Y Microfluidizer" -laitteen läpi (Micro-fluidics Corp., Newton, MA). Rikottu soluliete sentrifu-goitiin 6100 g:n kiihtyvyydessä 15 minuutin ajan soluros-kan poistamiseksi. Saatiin talteen supernatanttineste, joka sisälsi Ll+L2-antigeenin.
20 Supernatanttineste laimennettiin 1:5 lisäämällä puskuria A (20 mM MOPS, pH 7,0) ja tämä pantiin anionin- vaihtosieppauspylvääseen (sisähalkaisija 5,0 cm, 4,2 cm), .\j jossa oli Fractogel® EMD TMAE-650 (S) hartsia (EM Separ- ·1·': at ions, Gibbstown, NJ), joka oli tasapainotettu puskurissa : ,·. 25 A. Puskurilla A pesun jälkeen antigeeni eluoitiin gradien- ·«· » tiliä, jossa oli 0 - 1,0 M NaCl puskurissa A. Immuno-dot- · blottaus suoritettiin sen määrittämiseksi, mitkä pylväästä f · · saadut fraktiot sisälsivät Ll-proteiinin.
j · · * ’ Fraktiot, jotka sisälsivät immunodot-blottauksella 30 analysoituina Ll-proteiinin, määritettiin totaaliproteii-nia silmällä pitäen Bradfordin menetelmällä, mitä seurasi • · · V · SDS-PAGE, jossa käytettiin hopeavärjäystä ja Western-blot- tausta.
• · TMAE-fraktiot, joissa näkyi vertailukelpoinen puh- . 35 taus ja Ll-proteiinin rikastuminen, yhdistettiin. Antigee- • · · • · · *· · · 56 119815 ni konsentroitiin ammoniumsulfaattifraktioinnilla. Näytteet säädettiin ammoniumsulfaatin suhteen 35-prosenttisen kyllästetyksi lisäämällä kiinteää reagenssia samalla kun sekoitettiin hellävaroen 10 minuutin ajan. Näytteet sijoi-5 tettiin jäille ja saostumisen annettiin jatkua 5 tunnin ajan. Näytteitä sentrifugoitiin 12 000 g:n kiihtyvyydellä. Sakka resuspensoitiin 20,0 ml:aan PBS:ää (6,25 mM Na-fos-faatti, pH 7,2, 150 mM NaCl), joka oli 1 mM EDTAin suhteen.
10 Resuspensoidut sakat ajettiin erikseen kromatogra- fiassa kokoekskluusiopylväässä (sisähalkaisija 2,6 cm, 89 cm), jossa oli Sephacryl 500 HR -hartsia (Pharmacia, Fiscataway, NJ). Ajopuskuri oli PBS + 1 mM EDTA. Fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla käyttämällä hopeavärjäystä ja 15 western blot -detektiota. Puhtaimmat fraktiot yhdistettiin. Tuloksena olevat yhdistelmät konsentroitiin sekoituksessa olevassa 50 ml:n kammiossa, jossa käytettiin vaakatasossa olevia 43 mm:n YM-100-membraaneja (Amicon, Beverly, MA) typen paineessa 4-6 psi (27,552 - 41,328 20 kPa).
Lopputuote analysoitiin SDS-PAGE:lla käyttämällä värjäystä kolloidisella Coomassiella. LI- ja L2-proteii- /·.! nien arvioitiin olevan 70-prosenttisen homogeenisia. LI- • · ja L2-proteiinien identiteetti vahvistettiin Western-blot- • ,·. 25 tauksella käyttämällä soveliaita antiseerumeita. Lopputuo- • · · **V te jaettiin eriin ja varastoitiin -70 °C:n lämpötilaan.
**'1 Tämä menetelmä tuotti kaikkiaan 3,8 mg proteiinia.
| · ··1 Esimerkki 34 * ·· *·1 1 Ä. Kannan 1679 fermentointi (HPV tyyppi 16 L1+L2) 30 Menetelmät, joita käytettiin kannan 1679 pakastet- i,j.: tujen stokkiviljelmien valmistukseen, ympin kehittämiseen, :T: fermentointiin ja solujen talteenottoon, olivat oleelli- sesti edellä kuvatun kaltaisia. 67 tunnin inkubaation jäi- • · . keen saavutettiin solutiheys 4,2 g solukuivapainoa per · φ ♦ * « · » · · • M · · 57 119815 litra ja saatiin kaikkiaan 93 g:n märkäsolusakka talteenoton jälkeen.
B. Kannan 1678 fermentointi (HPV tyyppi 16 LI)
Menetelmät, joita käytettiin pakastettujen stokki- 5 viljelmien valmistukseen, ympin kehittämiseen, fermentoin-tiin ja kannan 1678 solujen talteenottoon, olivat oleellisesti edellä kuvatun kaltaisia. 70,5 tunnin inkubaation jälkeen kahden 10 litran fermentorin sisältö yhdistettiin (solutiheys 8,7 g solukuivapainoa per litra), mikä tuotti 10 kaikkiaan 258 g:n märkäsolusakan talteenoton jälkeen.
C. Rekombinanttisten HPV tyyppi 16 LI -kapsidipro-teiinien puhdistus
Kaikki vaiheet suoritettiin 4 eC:n lämpötilassa ellei toisin ilmaista, 15 Kannan nro 1678 solut varastoitiin pakastettuna -70 °C;n lämpötilassa. Pakastetut solut (märkäpaino 128 g) sulatettiin 20 - 23 °C:n lämpötilassa ja resuspensoitiin 140 ml:aan "modifioitua Ll-puskuria" (20 mM natriumfos-faatti, pH 7,2, 100 mM NaCl). Proteaasin inhibiittorit 20 PMSF ja pepstatiini A lisättiin niin että niiden loppukon-sentraatiot olivat 2 mM ja vastaavasti 1,7 μΜ. Soluiiete rikottiin noin 16 000 psi:n paineessa (110 208 kPa) vie-mällä se kolme kertaa "M110-Y Microfluidizer" -laitteen • · läpi (Microfluidics Corp., Newton, MA). Rikottu soluliete : .·. 25 sentrifugoitiin 11 000 g:n kiihtyvyydessä 40 minuutin ajan t · i **V soluroskan poistamiseksi. Saatiin talteen supernatantti- neste, joka sisälsi LI-antigeenin.
Supernatanttineste laimennettiin 1:5 lisäämällä | · · ** 1 2 3 puskuria A (20 mM MOPS, pH 7,0) ja tämä pantiin anionin- 30 vaihtosieppauspylvääseen (sisähalkaisija 5,0 cm, 6,4 cm),
\i.! jossa oli Fractogel® EMD TMAE-650 (S) hartsia (EM
··· V · Separations, Gibbstown, NJ), joka oli tasapainotettu pus- kurissa A. Puskurilla A pesun jälkeen antigeeni eluoitiin • i >ttt. gradientilla, jossa oli 0 - 1,0 M NaCl puskurissa A.
* 1 · • · · 2 • · t 3 · 58 119815
Immuno-dot-blottaus suoritettiin sen määrittämiseksi, mitkä pylväästä saadut fraktiot sisälsivät LI-proteiinin.
Fraktiot, jotka sisälsivät immunodot-blottauksella analysoituina LI-proteiinin, määritettiin totaaliproteii-5 nia silmällä pitäen Bradfordin menetelmällä, mitä seurasi SDS-PAGE, jossa käytettiin hopeavärjäystä ja Western-blot-tausta.
TMAE-fraktiot, joissa näkyi vertailukelpoinen puhtaus ja Ll-proteiinin rikastuminen, yhdistettiin. Antigee-10 ni konsentroitiin ammoniumsulfaattifraktioinnilla. Liuos säädettiin ammoniumsulfaatin suhteen 35-prosenttisen kyllästetyksi lisäämällä kiinteää reagenssia samalla kun sekoitettiin hellävaroen 10 minuutin ajan. Näytteet sijoitettiin jäille ja saostumisen annettiin jatkua 5 tunnin 15 ajan. Näyteitä sentrifugoitiin 12 000 g:n kiihtyvyydellä. Sakka resuspensoitiin 20,0 ml:aan PBS:ää (6,25 mM Na-fos-faatti, pH 7,2, 150 mM NaCl).
Resuspensoitu sakka ajettiin kromatografiässä koko-ekskluusiopylväässä (sisähalkaisija 2,6 cm, 89 cm), jossa 20 oli Sephacryl 500 HR -hartsia (Pharmacia, Piscataway, NJ). Ajopuskuri oli PBS. Fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:11a käyttämällä hopeavärjäystä ja Western blot -detektiota.
• · ·/· Puhtaimmat fraktiot yhdistettiin. Tuloksena olevat yhdis- telmät konsentroitiin sekoituksessa olevassa 50 ml:n kam- * • *** 25 miossa käyttämällä vaakatasossa olevia 43 mm:n YM-100- * · » membraaneja (Amicon, Beverly, MA) typen paineessa 4-6 ! /·. psi (27,552 - 41,328 kPa).
Lopputuote analysoitiin SDS-PAGE :11a käyttämällä t S ! värjäystä kolloidisella Coomassiella. Ll-proteiinin ar-30 vioitiin olevan 70-prosenttisen homogeeninen. LI:n identi- » » · **|·* teetti vahvistettiin Western-blottauksella käyttämällä i · · *.* * soveliaita antiseerumeita. Lopputuote jaettiin eriin ja ♦ ····· varastoitiin -70 eC:n lämpötilaan. Tämä menetelmä tuotti kaikkiaan 7,4 mg proteiinia.
• · • · · • · « ·*· · f • · 59 119815 D. Analyyttisiä menetelmiä Immuno-dot-blot-menetelmä
Näytteet laimennettiin (tarvittaessa) 1:10 Milli-Q-veteen ja 10 μΐ näytettä pantiin täpläksi Polyscreen™ 5 PVDF-membraaneille (NEN Research Products, Boston, MA). Sen jälkeen kun täplät olivat kuivuneet, membraanit pestiin vedessä ja niiden annettiin kuivua. Primäärinen vas-ta-aineliuos valmistettiin laimentamalla sovelias antiseerumi blottauspuskuriin (5-prosenttinen rasvaton maito pus-10 kurissa, joka oli 6,25 mM Na-fosfaatin, pH 7,2, 150 mM NaCl:n, 0,02 % NaN3:n suhteen). Inkubaatio kesti ainakin tunnin 20 - 23 eC:n lämpötilassa. Blotti pestiin 1 minuutti kerrallaan vaihtaen PBS:ää (6,25 mM Na-fosfaatti, pH
7,2, 150 mM NaCl) kolme kertaa. Toinen vasta-aine-liuos 15 valmistettiin laimentamalla sovelias emäksiseen fosfataa-siin kytketty konjugaattiantiseerumi blottauspuskuriin. Inkubaatio eteni samoissa olosuhteissa ainakin 1 tunnin ajan. Blotit pestiin kuten edellä ja havaittiin käyttämällä 1 vaiheen NBT/BCIP-substraattia (Pierce, Rockford, IL). 20 Detektioon käytetyt vasta-aineet olivat seuraavat: HPVöa LI detektoitiin MAB 837:llä (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). HPVöa L2 detektoitiin HPV6a /*.: L2-trpE-fuusiota vastaan suunnatulla hiiren seerumiyhdis- ·’:*· telmällä nro 641 ja 647. HPV16 LI detektoitiin MAB 885:llä t ! .*. 25 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). HPV16 L2 * · · » .:. detektoitiin HPV16 L2-trpeE-fuusiota vastaan suunnatulla • "I, hiiren seerumiyhdistelmällä nro 611.
t ' !)! Bradfordin määritys totaaliproteiinille | · · * Totaaliproteiini määritettiin käyttämällä kaupalli- 30 sesti saatavilla olevaa Coomassie Plus -tarvikesarjaa (Pierce, Rockford, IL). Näytteet laimennettiin soveliaiksi a » V · tasoiksi Milli-Q-vedellä. Tarvittavat tilavuudet olivat ....: 0,1 ml ja 1,0 ml standardi- ja vastaavasti mikromääritys-
.,,,· menetelmille. Molempien menetelmien tapauksessa BSA
. 35 (Pierce, Rockford, IL) käytettiin tuottamaan standardikäy- 4 4 • t • t · ·*· · • * 60 119815 rä. Määritys suoritettiin valmistajan suositusten mukaisesti. Standardikäyrät piirrettiin kuvaajaan käyttämällä CricketGraph-ohjelmaa Macintosh iici-tietokoneella. Esimerkki 35 5 Rekombinanttisten HPV tyyppi 11 Li -kapsidiproteii- nien puhdistus
Kaikki vaiheet suoritettiin 4 °C:n lämpötilassa ellei toisin ilmaista.
Solut varastoitiin pakastettuna -70 eC:n lämpöti-10 lassa. Pakastetut solut (märkäpaino 180 g) sulatettiin 20 - 23 °C:n lämpötilassa ja resuspensoitiin 900 ml:aan "hajotuspuskuria" (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2). Proteaasin inhibiittorit AEBSF ja pepstatiini A lisättiin niin että niiden loppukonsentraatiot olivat 1 mM 15 ja vastaavasti 1,7 μΜ. Soluliete rikottiin noin 16 000 psi:n paineessa (110 208 kPa) viemällä se 4 kertaa "M110-Y Microfluidizer" -laitteen läpi (Microfluidics Corp., Newton, MA). Riittävä tilavuus 10 % Triton Xl00®-deter-genttiä lisättiin rikottuun solulietteeseen, jotta TX100:n 20 konsentraatioksi tuli 0,5 %. Solulietettä sekoitettiin 20 tuntia. Triton X100:lla käsitelty lysaatti sentrifugoitiin 12 000 g:n kiihtyvyydessä 40 minuutin ajan soluroskan • · ·.*·· poistamiseksi. Otettiin talteen supernatanttineste, joka s*:*! sisälsi LI-antigeenin.
i 25 Supernatanttineste diafiltroitiin viittä sellaisen »·« · ··· puskurin tilavuutta vastaan, joka oli 20 mM natriumfosfaa-
1 .·. tin, pH 7,2, ja 0,5 M NaCl:n suhteen, käyttämällä 300K
• ♦· ,··*, tangentiaalivirtausmembraanikasettia (Filtron, North- • · · borough, MA). Membraanin säilyttämän materiaalin osoitet-. 30 tiin radioimmunomäärityksen ja western-blottauksen perus- 2 t · teella sisältävän LI-proteiinin.
• * · *·] ' Retentaatti pantiin korkean resoluution affiniteet- ·!··; tipylvääseen (sisähalkaisija 11,0 cm, 5,3 cm), jossa oli ····; SP Spherodex (M)® hartsia (IBF, Villeneuve-la-Garenne, . *, 35 Ranska), joka oli tasapainotettu 20 mM natriumfosfaatissa, « * · • * » *·» · 1 · 61 119815 pH 7,2, joka oli 0,5 M NaCl:n suhteen. Tasapainotuspusku-rilla pesun jälkeen ja kertapesun jälkeen 20 mM natrium-fosfaatilla, pH 7,2, joka oli 1,0 M NaClrn suhteen, Ll-proteiini eluoitiin kertapesulla puskurilla, joka oli 20 5 mM natriumfosfaatin, pH 7,2, ja 2,5 M NaCl:n suhteen. Fraktiot kerättiin pesujen ja eluution jälkeen. Pylvään fraktioista määritettiin totaaliproteiini Bradfordin menetelmällä. Fraktiot analysoitiin sitten Western-blottauk-sella ja SDS-PAGG:lla detektoimalla kolloidisella Coomas-10 siellä. Fraktiot analysoitiin myös radioimmunomäärityksel- lä.
SP Spherodex -fraktiot, joissa näkyi vertailukelpoinen puhtaus ja Ll-proteiinin rikastuminen, yhdistettiin.
15 Lopputuote analysoitiin western-blottsuksella ja SDS-PAGE:lla detektoimalla kolloidisella Coomassiella. Ll-proteiinin osoitettiin olevan yli 90-prosenttisen homogeeninen Coomassie-värjättyjen geelien densitometrian perusteella. Ll-proteiinin identiteetti vahvistettiin Western-20 blottauksella. Lopputuote suodatettiin aseptisesti 0,22 pm:n membraanin läpi ja se varastoitiin 4 °C:n lämpötilaan. Tämä menetelmä tuotti kaikkiaan 202 mg proteiinia.
* · ·/·· Elektronimikroskopia-analyysin suorittaa Structure !*ί*! Probe (West Chester, PA). Erä näytteestä sijoitetaan hii- ; ·*: 25 lipäällysteiselle kuparihilalle (200 mesh). Tippa 2 % fos- • M · fovolframihappoa, pH 7,0, sijoitetaan hilalle 20 sekunnik- ·*·« , .·. si. Hilojen annetaan kuivua ilmassa ennen TEM-tutkimusta.
It» ···, Kaikki mikroskopia tehdään käyttämällä JEOL 100CX-trans- 1 * · missioelektronimikroskooppia (JEOL USA, Inc.) kiihdytys-, 30 jännitteellä 100 kV. Tuotetuissa mikrovalokuvissa lopulli- « · i **:·* nen suurennos on 100 000-kertainen.
• 4 · ’** * SDS-PAGE ja Western blot -määritykset ·": Kaikki geelit, puskurit ja elektroforeesilaitteet ...·; hankittiin Novexilta (San Diego, CA), ja niitä käytettiin , *, 35 valmistajan suositusten mukaisesti. Lyhyesti ilmaisten • A * » t · ·#· · «•tl· 9 * 62 119815 näytteet laimennettiin yhtäsuuriksi proteiinikonsentraa-tioiksi Milli-Q-vedessä ja sekoitettiin 1:1 näyteinkubaa-tiopuskurin kanssa, joka sisälsi 200 mM DTT:tä. Näytteitä inkuboitiin 15 minuuttia 100 °C:n lämpötilassa ja ladat-5 tiin esivalettuihin 12 % Tris-glysiini-geeleihin. Näytteet ajettiin elektroforeesilla 125 V, 1 tunti 45 minuuttia. Geelit kehitettiin värjäämällä kolloidisella Coomassiella käyttämällä kaupallisesti hankittua tarvikesarjaa (Integrated Separation Systems, Natick, MA).
10 Western-blottauksia varten proteiinit siirrettiin PVDF-membraaneille 25 V:n jännitteellä 40 minuutissa. Membraanit pestiin Milli-Q-vedellä ja kuivattiin ilmassa. Primäärinen vasta-aine oli polyklonaalinen kaniantiseerumi, joka oli tuotettu TrpE-HPVllLl-fuusioproteiinia vas-15 taan (lahja tri D. Brownilta). Vasta-aine-liuos vahvistettiin laimentamalla antiseerumi blottauspuskurissa (5 % rasvaton maito puskurissa, joka oli 6,25 mM Na-fosfaatin, pH 7,2, 150 mM NaCl:n, ja 0,02 % NaN3:n suhteen). Inkubaa-tio suoritettiin ainakin 1 tunnin ajan 20 - 23 °C:n lämpö-20 tilassa. Blotti pestiin kolmesti vaihtaen PBS:ää (6,25 mM Na-fosfaatti, pH 7,2, 150 mM NaCl), 1 minuutin ajan kullakin kerralla. Toinen vasta-aine-liuos valmistettiin lai- * · *.**: mentamalla sovelias emäksiseen fosfataasiin kytketty, ka-
»M
ϊ,ϊ· nin IgG:tä vastaan suunnattu vuohen konjugaattivasta-aine |es": 25 (Pierce, Rockford, IL) blottauspuskuriin. Inkubaatio eteni ·;· samoissa olosuhteissa ainakin 1 tunnin ajan. Blotit pes- * »·« t .'· tiin kuten edellä ja havaittiin käyttämällä 1 vaiheen
Ml NBT/BCIP-substraattia (Pierce, Rockford, IL).
Esimerkki 36 . 30 HPV18 Li:n ja L2:n ekspressio hiivassa • · «
Plasmidit pl91-6 (pGALl/10 + HPV18 LI) ja pl95-ll *·) * (pGALl-10 + HPV18 LI ja L2) käytettiin transformoitaessa ·:**! S. cerevisiae -kanta nro 1558 (MATS, leu2-04, prbl: :HIS3, »;*·· mnn9: :URA3, adel, cir°). Klonaalisia isolaatteja kasvatet- ,*, 35 tiin 30 eC:n lämpötilassa YEHD-elatusaineessa, joka sisäl- f # * »·· « a · 63 119815 si 2 % galaktoosia, 88 tunnin ajan. Solujen keräyksen jälkeen solusakat rikottiin lasihelmillä ja solulysaatteja analysoitiin immunoblot-analyysillä HPV18 LI- ja/tai HPV18 L2 -proteiinin ekspressiota silmällä pitäen. Näytteet, 5 jotka sisälsivät 25 pg totaalisoluproteiinia, ajettiin elektroforeesilla 10 % Tris-glysiini-geeleissä (Novex, Inc.) pelkistävissä ja denaturoivissa olosuhteissa ja hiotettiin sähköllä nitroselluloosafilttereille. LI-proteiini immunodetektoitiin käyttäen kanin antiseerumeita, jotka 10 oli suunnattu trpE-HPVll Ll-fuusioproteiinia vastaan (Brown ym., 1994, Virology 201:46-54) primäärisenä vasta-aineena ja sekundäärisenä vasta-aineena kanin lgG:tä vastaan suunnattu aasin kokonainen vasta-aine, joka oli kytketty piparjuuriperoksidaasiin (HRP) (Amersham, Inc.). 15 Filtterit käsiteltiin käyttämällä kemiluminesoivaa ECL™ Detection Kit -tarvikesarjaa (Amersham, Inc.). 50 - 55 kDa:n LI-proteiinijuova detektoitiin sekä Li- että L1+L2-koekspressori-hiivaklooneissa (kannat 1725 ja vastaavasti 1727), ja ei negatiivikontrollissa (pGALl-10 ilman LI- tai 20 L2-geenejä).
HPVl8:n L2-proteiini detektoitiin Western-analyysillä käyttämällä primäärisenä vasta-aineena vuohen polyk- • · ·/»; lonaalista antiseerumia, joka oli tuotettu trpE-HPV18 L2- fuusioproteiinia vastaan, ja tätä seurasi vuohen IgG:tä j ϊ1; 25 vastaan suunnattu, HRP-konjugoitu kanin vasta-aine ·! (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD).
, Filtterit käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla. L2-prote- ···, iini detektoitiin 75 kDa:n proteiini juovana Ll+L2-ko- • · 1 ekspressorihiivakloonissa (kanta 1727) mutta ei kummassa-, 30 kaan negatiivikontrollissa tai Ll-ekspressorikloonissa.
*·1·1 Esimerkki 37 V 1 HPV 18 LI:n (kanta 1725) ja 18 Ll+AL2:n (kanta 9 *···; 1727) fermentointi ,...i Kantojen 1725 ja 1727 maljaviljelmän pintakasvusto 4 35 siirrettiin aseptisesti leusiinittomaan nestemäiseen alus- • 9 · 9 9 m <··« ♦ f 64 119815 taan, joka sisälsi (litraa kohti) 8,5 g Difcon hiivatypen-lähdettä ilman aminohappoja ja ammoniumsulfaattia, 0,2 g adeniinia, 0,2 g urasiilia, 10 g meripihkahappoa, 5 g ammoniumsulfaattia, 40 g glukoosia, 0,25 g L-tyrosiinia, 5 0,1 g L-arginiinia, 0,3 g L-isoleusiinia, 0,05 g L-metio- niinia, 0,2 g L-tryptofaania, 0,05 g L-histidiiniä, 0,2 g L-lysiiniä, 0,3 g L-fenyylialaniinia: tämä elatusaine säädettiin pH-arvoon 5,0 - 5,3 NaOH:lla ennen sterilointia. Sen jälkeen kun oli kasvatettu 28 eC:n lämpötilassa, 250 10 rpm, pyörivällä ravistelijalla, pakastetut viljelmäputket valmistettiin lisäämällä steriiliä glyserolia loppukon-sentraatioksi 17 % (w/v) ennen varastointia -70 °C:n lämpötilaan (1 ml per kryoputki). Ympit kehitettiin samassa elatusaineessa (500 ml per 2 litran pullo) ja ne aloitet-15 tiin siirtämällä pakastetun viljelmäputken sulatettu sisältö ja inkuboimalla 28 "C:n lämpötilassa, 250 rpm pyörivällä ravistelijalla 29 tuntia. Kunkin kannan fermentointi käytti New Brunswick SF-116 -fermentoria, jonka käyttöti-lavuus oli 10 litraa ymppäyksen jälkeen. Käytetty tuotan-20 toalusta sisälsi (litraa kohti): 20 g Difcon hiivaekstrak-tia, 10 g Sheffieldin HySoy-peptonia, 20 g glukoosia, 20 g galaktoosia, 0,3 ml Union Carbiden UCON LB-625 vaahtoami-senestoainetta, elatusaine säädettiin pH-arvoon 5,3 ennen *· " sterilointia. Koko 2 litran ymppipullon sisältö (500 ml) • 1 1 · 25 siirrettiin fermentoriin, jota inkuboitiin 28 eC:n lämpö- • · · tilassa, 5 litraa ilmaa per minuutti, 400 rpm, paine 3,5 . ;!1 psi (24,108 kPa). Ravistusta lisättiin tarpeen mukaan, • jotta liuenneen hapen tasot saatiin pidettyä korkeammalla • · 1 .1|·; kuin 40-prosenttinen kyllästysaste. Fermentoinnin edisty- 30 mistä monitoroitiin erillisillä ("off-line") glukoosin . mittauksilla (Beckman Glucose 2 Analyzer) ja ajantasaisel- • · · la ("on-line") massaspektrometrialla (Perkin-Elmer 1200).
• 1 1 66 tunnin inkuboinnin jälkeen saavutettiin solutiheys 9,5 - 9,7 g solujen kuivapainoa per litra. Viljelmä kon-*:**: 35 sentroitiin onttokuitusuodatuksella (Amicon H5MP01-43-pat- φ 1 • · · • · 1 · · 65 119815 ruuna Amicon DC-10-suodatusjärjestelmässä) noin 2 litraksi, diafiltroitiin 2 litralla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta ja konsentroitiin edelleen (noin 1 litraksi) ennen jakamista 500 ml:n sentrifuugipulloihin. Solusakat kerät-5 tiin sentrifugoimalla 8 000 rpm:n nopeudella (Sorval GS3-roottori) 20 minuuttia 4 °C:n lämpötilassa. Supernatantin dekantoinnin jälkeen sakat (kaikkiaan 191 - 208 g märkiä soluja) varastoitiin -70 °C:n lämpötilaan käyttöön asti. Esimerkki 38 10 Rekombinanttisten HPV tyyppi 18 LI -kapsidiproteii- nien puhdistus
Kaikki vaiheet suoritettiin 4 eC:n lämpötilassa ellei toisin ilmaista.
Solut varastoitiin pakastettuna -70 eC:n lämpöti-15 lassa. Pakastetut solut (märkäpaino 126 g) sulatettiin 20 - 23 °C:n lämpötilassa ja resuspensoitiin 70 ml:aan "hajotuspuskuria" (20 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, 100 mM NaCl). Proteaasin inhibiittorit PMSF ja pepstatiini A lisättiin niin että niiden loppukonsentraatiot olivat 2 mM 20 ja vastaavasti 1,7 μΜ. Soluliete rikottiin noin 16000 psi:n paineessa (110 208 kPa) viemällä se 4 kertaa "M110-Y Microfluidizer" -laitteen läpi (Microfluidics Corp., . , Newton, MA). Rikottu soluliete sentrifugoitiin 12000 g:n • · *· |· kiihtyvyydessä 40 minuutin ajan soluroskan poistamiseksi.
*.1 1 25 Saatiin talteen supernatanttineste, joka sisälsi LI-anti- • · i geenin.
..1·1 Supernatanttineste laimennettiin 1:5 lisäämällä : puskuri A (20 mM MOPS, pH 7,0) ja tämä pantiin anionin- vaihtosieppauspylvääseen (sisähalkaisija 9,0 cm, 3,9 cm),
30 jossa oli Fractogel® EMD TMAE-650 (S) hartsia (EM
. .·, Separations, Gibbstown, NJ) joka oli tasapainotettu pusku- • · » rissa A. Puskurilla A pesun jälkeen antigeeni eluoitiin • · · gradientilla, jossa oli 0 - 1,0 M NaCl puskurissa A. Pyi-*:2· vään fraktiot määritettiin silmällä pitäen totaaliproteii- a 35 nia Bradfordin menetelmällä. Fraktiot analysoitiin sitten • · · • 1 ♦ • · · 2
Mt · 66 119815 yhtäsuurilla totaaliproteiinin latauksilla Western-blot-tauksella ja SDS-PAGE:lla hopeavärjäysdetektiolla.
TMAE-fraktiot, joissa näkyi vertailukelpoinen puhtaus ja Ll-proteiinin rikastuminen, yhdistettiin1 Antigee-5 ni konsentroitiin ammoniumsulfaattifraktioinnilla. Liuos säädettiin ammoniumsulfaatin suhteen 35-prosenttisen kyllästetyksi lisäämällä kiinteää reagenssia samalla kun sekoitettiin hellävaroen 10 minuutin ajan. Näyte sijoitettiin jäille ja saostumisen annettiin jatkua 4 tunnin ajan. 10 Näyte sentrifugoitiin 16 000 g:n kiihtyvyydellä 45 minuutin ajan. Sakka resuspensoitiin 20,0 ml:aan PBS:ää (6,25 mM Na-fosfaatti, pH 7,2, 150 mM NaCl).
Resuspensoitu sakka ajettiin kromatografiässä ko-koekskluusiopylväässä (sisähalkaisija 2,6 cm, 89 cm), jos-15 sa oli Sephacryl 500 HR -hartsia (Pharmacia, Piscataway, NJ). Ajopuskuri oli PBS. Fraktiot analysoitiin western-blottauksella ja SDS-PAGE:lla hopeavärjäyksellä. Puhtaimmat fraktiot yhdistettiin. Tuloksena oleva yhdistelmä konsentroitiin sekoituksessa olevassa 50 ml:n kammiossa, jos-20 sa käytettiin vaakatasossa olevia 43 mm:n YM-100-membraa-neja (Amicon, Beverly, MA) typen paineessa 4-6 psi (27,552 - 41,328 kPa).
Lopputuote analysoitiin Western-blottauksella ja • · *.2: SDS-PAGE:lla käyttämällä värjäystä kolloidisella Coomas- • · · V · 25 siellä. Ll-proteiinin arvioitiin olevan 50 - 60-prosentti- • · · sen homogeeninen. Ll-proteiinin identiteetti vahvistettiin ·:1 Western-blottauksella. Lopputuote jaettiin eriin ja varas- • · · · • · ;1; toitiin -70 “C:n lämpötilaan. Tämä menetelmä tuotti kaik- l»4 2 .1:1. kiaan 12,5 mg proteiinia.
30 Esimerkki 39 .' Immunogeenisten koostumusten valmistus • · ·
Puhdistetut VLP:t formuloidaan tunnettujen menetel- • 1 · *\1 mien mukaisesti, kuten sekoittamalla farmaseuttisesti hy- ·:2: väksyttävien kantajien, stabilointiaineiden tai rokotead- *;··; 35 juvanttien kanssa. Tämän keksinnön mukaiset immunogeeniset • • · · • ♦ · • M · 67 119815 VLP:t voidaan valmistaa rokotekäyttöä varten yhdistämällä ne fysiologisesti hyväksyttävän koostumuksen kanssa, kuten esimerkiksi PBS, suolaliuos tai tislattu vesi. Immunogee-niset VLP-partikkelit annetaan annosalueella noin 0,1 -5 100 pg, mieluummin noin 1 - noin 20 pg, jotta saadaan ha luttu immunogeeninen vaikutus. VLP:n määrä per formulaatio voi vaihdella monien eri tekijöiden mukaan, mukaan lukien, näihin rajoittumatta, yksilön tila, paino, ikä ja sukupuo li. VLP-formulaation antaminen voidaan tehdä monia eri 10 reittejä, mukaan lukien, näihin rajoittumatta, suun kautta, ihonalaisesti, paikallisesti, limakalvon kautta ja lihaksensisäisesti. Sellaiset VLP-formulaatiot voivat koostua yhdestä VLP-tyypistä (se on: VLP HPV6a:sta) tai VLP-seoksesta (se on: VLP HPV6a:sta, HPVll:stä, HPV16:sta 15 ja HPV18:sta).
Mikrobien kasvua estävä aine, esimerkiksi timero-saali, voi mahdollisesti olla läsnä. Tämän keksinnön mukaisia immunogeenisia antigeenejä voidaan haluttaessa käyttää yhdistelmänä rokotteen stabilointiaineiden ja ro-20 koteadjuvanttien kanssa. Tyypilliset stabilointiaineet ovat spesifisiä yhdisteitä, esim. polyanioneita kuten he-pariini, inositoliheksasulfaatti, sulfatoitu betasyklo-dekstriini, vähemmän spesifiset apuaineet, esim. aminoha- • · *· ’· pot, sorbitoli, mannitoli, ksylitoli, glyseroli, sakkaroo- ♦ ·· V 1 25 si, dekstroosi, trehaloosi, ja variaatiot liuosolosuhteis- • · ·,♦ · sa, esim. neutraali pH, korkea ionivahvuus (noin 0,5 - <#1|· 2,0 M suolat), divalentit kationit (Ca2+, Mg21). Esimerkkejä : :1: adjuvanteista ovat A1(0H)3 ja A1(P04). Tämän keksinnön mu- }1·1; kainen rokote voidaan varastoida jääkaappilämpötilassa tai 30 lyofilisoidussa muodossa.
, .·, Esimerkki 40 « I 1 VLP-vasta-aineiden valmistus • · · • · ·
Puhdistettuja VLP-partikkeleita käytetään vasta- *:**· aineiden tuottamiseen. Termi "vasta-aine" tässä käytettynä • _ _ *:1" 35 käsittää sekä polyklonaaliset että monoklonaaliset vasta- « • · • · * · · ·«1 · · 68 119815 aineet, samoin kuin näiden fragmentit, kuten Fv-, Fab- ja F(ab)2-fragmentit, jotka kykenevät sitomaan antigeeniä tai hapteenia. Vasta-aineita käytetään monin eri tavoin, mukaan lukien, näihin rajoittumatta, rekombinanttisen VLP:n 5 puhdistamiseen, natiivien LI- tai L2-proteiinien puhdistamiseen, ja tarvikesarjoihin. Tarvikesarjat sisältäisivät osastoihin jaetun telineen, joka soveltuisi pitämään tiukasti kiinni ainakin yhden säiliön. Teline sisältäisi lisäksi reagensseja kuten VLPitä vastaan suunnattu vasta-10 aine tai VLP, joka soveltuisi detektoimaan HPV:tä tai HPV-fragmentteja tai HPV:tä vastaan suunnattuja vasta-aineita. Kantaja voi myös sisältää detektiokeinot kuten leimattuja antigeeni- tai entsyymisubstraatteja tai vastaavia. Vasta-aineet tai VLP tai tarvikesarjat ovat hyödyllisiä moniin 15 eri tarkoituksiin, mukaan lukien, näihin rajoittumatta, oikeuslääketieteelliset analyysit ja epidemiologiset tutkimukset.
• · • · • M • « « ·· • · « • · • • · · • · 1 • · · · *· 1 ««·1 * · t · · * · · ··· 9 1 1 2 · · • * · · • 1 1 • · · ··· • » · • t · • · • · • · 9 · * · · *·· · • ·
Claims (6)
1. Puhdistetun, ihmisen papilloomavirus (HFV) proteiinin valmistusmenetelmä, proteiinin käsittäessä HFV-viruksen 5 kaltaisia partikkeleita (VLP), joka menetelmä käsittää sen, että a) hiiva transformoidaan rekombinanttisella DNA-mole-kyylillä, rekombinanttisen DNA-molekyylin koodittaessa HPV Li- tai HPV Li- ja L2-proteiinia, 10 b) transformoitua hiivaa viljellään olosuhteissa, jotka mahdollistavat rekombinanttisen DNA-molekyylin ekspression epäpuhtaan HFV-proteiinin tuottamiseksi, ja c) epäpuhdas rekombinanttinen HFV-proteiini puhdistetaan käyttäen ioninvaihtokromatografiaa ja sen jälkeen koko-15 ekskluusiokromatografiaa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa hiiva on Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergen-sis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fra-gilis tai Schizosaccharomyces pombe.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jossa hiiva on Saccharomyces cerevisiae. • ·
4. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukai-nen menetelmä, jossa HPV on HFVöa, HFV6b, HPVll, HFV16, • • HFV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV41, HFV45 tai HPV58. *·· ·
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, jossa * "]·. HPV on HFV6a, HPV6b, HPVll, HFV16 tai HPV18. • 1 · IX
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, jossa • · · HPV on HFV6a Li, HPVll Li, HFV16 Li tai HFV18 LI. • · • · · • · · * 1 • · · • · • f · · · • · · • · · • · · · • · • · · • · · * · • · · 70 119815
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24279494A | 1994-05-16 | 1994-05-16 | |
| US24279494 | 1994-05-16 | ||
| PCT/US1995/006006 WO1995031532A1 (en) | 1994-05-16 | 1995-05-15 | Papillomavirus vaccines |
| US9506006 | 1995-05-15 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI964592A FI964592A (fi) | 1996-11-15 |
| FI964592A0 FI964592A0 (fi) | 1996-11-15 |
| FI119815B true FI119815B (fi) | 2009-03-31 |
Family
ID=22916213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI964592A FI119815B (fi) | 1994-05-16 | 1996-11-15 | Papilloomavirusproteiinin valmistusmenetelmä |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0757717B1 (fi) |
| JP (1) | JP3863559B2 (fi) |
| CN (1) | CN1152935A (fi) |
| AT (1) | ATE328068T1 (fi) |
| AU (1) | AU693203B2 (fi) |
| BG (1) | BG100974A (fi) |
| BR (1) | BR9507657A (fi) |
| CA (1) | CA2189882C (fi) |
| CZ (1) | CZ336696A3 (fi) |
| DE (1) | DE69535018T2 (fi) |
| DK (1) | DK0757717T3 (fi) |
| ES (1) | ES2264126T3 (fi) |
| FI (1) | FI119815B (fi) |
| HU (1) | HUT76354A (fi) |
| MX (1) | MXPA96005662A (fi) |
| NO (1) | NO322133B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ285941A (fi) |
| PL (1) | PL183781B1 (fi) |
| PT (1) | PT757717E (fi) |
| RO (1) | RO117541B1 (fi) |
| RU (1) | RU2206608C2 (fi) |
| SI (1) | SI0757717T1 (fi) |
| SK (1) | SK147696A3 (fi) |
| WO (1) | WO1995031532A1 (fi) |
Families Citing this family (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6153201A (en) * | 1993-03-09 | 2000-11-28 | University Of Rochester | Oral immunization with papillomavirus virus-like particles |
| CA2200582C (en) * | 1994-09-22 | 2007-03-27 | Merck & Co., Inc. | Dna encoding human papillomavirus type 6a |
| AR004464A1 (es) * | 1994-11-14 | 1998-12-16 | Merck Sharp & Dohme | Un metodo para producir una proteina de capside de papilomavirus |
| GB9621091D0 (en) | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
| KR20010072470A (ko) * | 1998-08-14 | 2001-07-31 | 폴락 돈나 엘. | 사람 유두종바이러스 바이러스-유사 입자의 정제방법 |
| CZ301212B6 (cs) | 1998-10-16 | 2009-12-09 | Smithkline Beecham Biologicals S. A. | Vakcinacní prostredek |
| AUPP765398A0 (en) * | 1998-12-11 | 1999-01-14 | University Of Queensland, The | Treatment of papillomavirus infections |
| PT1150712E (pt) * | 1999-02-05 | 2008-12-22 | Merck & Co Inc | Formulações para a vacina do vírus do papiloma humano |
| DE10137102A1 (de) | 2001-07-30 | 2003-02-27 | Deutsches Krebsforsch | Polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
| GB0206360D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
| ATE427990T1 (de) | 2002-04-30 | 2009-04-15 | Oncolytics Biotech Inc | Verbesserte reinigungsmethode fur viren |
| US7858098B2 (en) | 2002-12-20 | 2010-12-28 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Vaccine |
| MY140664A (en) * | 2003-09-29 | 2010-01-15 | Merck Sharp & Dohme | Optimized expression of hpv 45 l1 in yeast |
| ES2570006T3 (es) * | 2004-09-30 | 2016-05-13 | Bayer Healthcare Llc | Dispositivos y métodos de preparación continua integrada de moléculas biológicas |
| US7901921B2 (en) | 2004-10-22 | 2011-03-08 | Oncolytics Biotech Inc. | Viral purification methods |
| US7955603B2 (en) | 2006-09-29 | 2011-06-07 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Norovirus vaccine formulations |
| RU2482189C2 (ru) * | 2007-01-30 | 2013-05-20 | Трансген С.А. | Полипептиды е2 папилломавируса, применяемые для вакцинации |
| KR20170001720A (ko) | 2007-03-14 | 2017-01-04 | 다케다 백신즈 인코포레이티드 | 바이러스 유사 입자 정제 |
| RU2471807C2 (ru) * | 2007-06-26 | 2013-01-10 | Джапан Хелт Сайенсес Фаундейшн | Вакцинный антиген, способный индуцировать перекрестно реагирующее и нейтрализующее антитело против папилломавируса человека с высоким риском |
| US20100266636A1 (en) | 2007-09-18 | 2010-10-21 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Method of conferring a protective immune response to norovirus |
| SG10201601660YA (en) | 2007-09-18 | 2016-04-28 | Takeda Vaccines Inc | Method of conferring a protective immune response to norovirus |
| WO2009076824A1 (zh) * | 2007-11-23 | 2009-06-25 | Shanghai Zerun Biotechnology Co., Ltd. | 人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因及其用途 |
| JP5852883B2 (ja) * | 2008-08-08 | 2016-02-03 | タケダ ワクチン，インコーポレイテッド | 交差反応性の増強のための複合カプシドアミノ酸配列を含むウイルス様粒子 |
| MX2011013566A (es) * | 2009-06-19 | 2012-06-28 | Eyegene Inc | Vacunas para cancer cervical. |
| CN102234661A (zh) * | 2010-04-23 | 2011-11-09 | 北京生物制品研究所 | 人乳头瘤病毒类病毒颗粒的制备方法和外源蛋白表达盒、表达系统 |
| JP6034798B2 (ja) | 2010-12-02 | 2016-11-30 | オンコリティクス バイオテク，インコーポレーテッド | 液体ウイルス製剤 |
| JP6034797B2 (ja) | 2010-12-02 | 2016-11-30 | オンコリティクス バイオテク，インコーポレーテッド | 凍結乾燥されたウイルス製剤 |
| RU2445357C1 (ru) * | 2011-02-15 | 2012-03-20 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 16 |
| RU2445358C1 (ru) * | 2011-02-15 | 2012-03-20 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 18 |
| US20120273424A1 (en) * | 2011-04-29 | 2012-11-01 | Oncolytics Biotech Inc. | Methods of purifying viruses using gel permeation chromatography |
| AU2012282658B2 (en) | 2011-07-11 | 2014-11-27 | Takeda Vaccines, Inc. | Parenteral norovirus vaccine formulations |
| AU2012345443B2 (en) * | 2011-12-01 | 2017-10-26 | University Of Cape Town | HPV chimaeric particle |
| CN103215302B (zh) * | 2012-01-21 | 2019-01-15 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv18 l1蛋白的方法 |
| CN103361377B (zh) * | 2012-03-28 | 2017-12-05 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv6 l1蛋白的方法 |
| JOP20130186B1 (ar) | 2012-06-22 | 2021-08-17 | Takeda Vaccines Montana Inc | تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات |
| CN110423774A (zh) * | 2013-04-26 | 2019-11-08 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv58 l1蛋白的方法 |
| CN104120089B (zh) * | 2013-04-26 | 2019-09-24 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv52 l1蛋白的方法 |
| CN104164374B (zh) * | 2013-05-17 | 2019-10-22 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv31 l1蛋白的方法 |
| CN104673760B (zh) * | 2013-11-29 | 2018-01-02 | 南京赛威信生物医药有限公司 | 一种原核细胞表达类病毒颗粒的纯化方法 |
| RU2546243C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантная вакцина для профилактики папилломавирусной инфекции человека и способ ее получения |
| RU2546242C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 18 |
| RU2546241C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 16 |
| RU2546240C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 56 |
| EA201790944A1 (ru) * | 2014-12-26 | 2017-11-30 | Айджин, Инк. | Способ получения вирусоподобных частиц папилломавируса человека |
| US10758606B2 (en) * | 2015-09-04 | 2020-09-01 | Inventprise, Llc | VLP stabilized vaccine compositions |
| RU2676160C1 (ru) * | 2018-02-14 | 2018-12-26 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент главного капсидного белка L1 вируса папилломы человека типа 11 |
| RU2681174C1 (ru) * | 2018-07-12 | 2019-03-04 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Способ получения рекомбинантной вакцины для профилактики папилломавирусной инфекции человека, рекомбинантная вакцина |
| CN116426396B (zh) * | 2023-06-09 | 2023-09-01 | 内蒙古工业大学 | 一株耐硫酸铵酿酒酵母及其筛选方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2586428B1 (fr) * | 1985-08-26 | 1988-11-25 | Pasteur Institut | Polypeptides et anticorps, caracteristiques du papillomavirus et leurs applications au diagnostic in vitro, a la prevention et/ou la lutte contre des infections a papillomavirus |
| DE3625257A1 (de) * | 1986-07-23 | 1988-02-04 | Behringwerke Ag | Expressionsprodukte der menschlichen papillomviren typ 16 und 18, fuer diese proteine spezifische antikoerper und diese antikoerper bzw. entsprechende dna enthaltende diagnostika |
| DE122007000023I1 (de) * | 1991-07-19 | 2007-08-09 | Univ Queensland St Lucia | Impfsstoff gegen Humanes Papillomavirus (typ 18) |
| DE122007000096I1 (de) * | 1992-06-25 | 2008-03-27 | Papillomavirus vakzine | |
| US5437951A (en) * | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
| DE4332596A1 (de) * | 1993-09-24 | 1995-03-30 | Martin Josef Dr Sapp | Monoklonale Antikörper |
| AUPM566794A0 (en) * | 1994-05-17 | 1994-06-09 | University Of Queensland, The | Process and product |
-
1995
- 1995-05-15 AT AT95919820T patent/ATE328068T1/de active
- 1995-05-15 RU RU96123707/13A patent/RU2206608C2/ru active
- 1995-05-15 CN CN95194158A patent/CN1152935A/zh active Pending
- 1995-05-15 DK DK95919820T patent/DK0757717T3/da active
- 1995-05-15 AU AU25495/95A patent/AU693203B2/en not_active Expired
- 1995-05-15 DE DE69535018T patent/DE69535018T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 PT PT95919820T patent/PT757717E/pt unknown
- 1995-05-15 EP EP95919820A patent/EP0757717B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 RO RO96-02165A patent/RO117541B1/ro unknown
- 1995-05-15 WO PCT/US1995/006006 patent/WO1995031532A1/en active IP Right Grant
- 1995-05-15 PL PL95317234A patent/PL183781B1/pl unknown
- 1995-05-15 MX MXPA96005662A patent/MXPA96005662A/es active IP Right Grant
- 1995-05-15 SI SI9530726T patent/SI0757717T1/sl unknown
- 1995-05-15 JP JP52980895A patent/JP3863559B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 ES ES95919820T patent/ES2264126T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 CA CA002189882A patent/CA2189882C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 BR BR9507657A patent/BR9507657A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-05-15 HU HU9603155A patent/HUT76354A/hu unknown
- 1995-05-15 CZ CZ963366A patent/CZ336696A3/cs unknown
- 1995-05-15 SK SK1476-96A patent/SK147696A3/sk unknown
- 1995-06-02 NZ NZ285941A patent/NZ285941A/en not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-11-12 BG BG100974A patent/BG100974A/xx unknown
- 1996-11-15 NO NO19964862A patent/NO322133B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-11-15 FI FI964592A patent/FI119815B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2189882A1 (en) | 1995-11-23 |
| AU693203B2 (en) | 1998-06-25 |
| RO117541B1 (ro) | 2002-04-30 |
| NZ285941A (en) | 1998-05-27 |
| MXPA96005662A (es) | 2004-08-19 |
| CN1152935A (zh) | 1997-06-25 |
| HUT76354A (en) | 1997-08-28 |
| NO322133B1 (no) | 2006-08-21 |
| JP3863559B2 (ja) | 2006-12-27 |
| JPH10500847A (ja) | 1998-01-27 |
| CA2189882C (en) | 2005-09-20 |
| ES2264126T3 (es) | 2006-12-16 |
| RU2206608C2 (ru) | 2003-06-20 |
| CZ336696A3 (en) | 1997-07-16 |
| PL317234A1 (en) | 1997-03-17 |
| ATE328068T1 (de) | 2006-06-15 |
| DK0757717T3 (da) | 2006-09-25 |
| DE69535018T2 (de) | 2007-02-15 |
| WO1995031532A1 (en) | 1995-11-23 |
| BR9507657A (pt) | 1997-09-09 |
| AU2549595A (en) | 1995-12-05 |
| NO964862D0 (no) | 1996-11-15 |
| EP0757717A1 (en) | 1997-02-12 |
| BG100974A (en) | 1998-04-30 |
| SK147696A3 (en) | 1997-08-06 |
| HU9603155D0 (en) | 1997-01-28 |
| FI964592A (fi) | 1996-11-15 |
| EP0757717B1 (en) | 2006-05-31 |
| FI964592A0 (fi) | 1996-11-15 |
| EP0757717A4 (en) | 1998-04-15 |
| SI0757717T1 (sl) | 2006-08-31 |
| PT757717E (pt) | 2006-09-29 |
| PL183781B1 (pl) | 2002-07-31 |
| DE69535018D1 (de) | 2006-07-06 |
| NO964862L (no) | 1997-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI119815B (fi) | Papilloomavirusproteiinin valmistusmenetelmä | |
| Hofmann et al. | Sequence determination of human papillomavirus type 6a and assembly of virus-like particles in Saccharomyces cerevisiae | |
| US6159729A (en) | Synthetic HPV6/11 hybrid L1 DNA encoding human papillomavirus type 11 L1 protein | |
| EP0789767B1 (en) | A method for producing purified papillomavirus proteins | |
| US9034340B2 (en) | Genes encoding major capsid protein L1 of human papilloma virus | |
| US5888516A (en) | Recombinant papillomavirus vaccines | |
| EP0817851B9 (en) | Dna encoding human papilloma virus type 18 | |
| WO1996015247A9 (en) | Purified papillomavirus proteins | |
| MXPA97003570A (en) | Proteins of purify papiloma viruses | |
| CA2204266C (en) | Purified papillomavirus proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 119815 Country of ref document: FI |
|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: MERCK SHARP & DOHME CORP. Free format text: MERCK SHARP & DOHME CORP. |
|
| MA | Patent expired |