HUT76354A

HUT76354A - Papillomavirus vaccines

Info

Publication number: HUT76354A
Application number: HU9603155A
Authority: HU
Inventors: James C Cook; Hugh A George; Kathryn J Hofmann; Kathrin U Jansen; Joseph G Joyce; Ernest Dale Lehman; Henry Z Markus; Mark Rosolowsky; Loren D Schultz
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1994-05-16
Filing date: 1995-05-15
Publication date: 1997-08-28
Also published as: DK0757717T3; PT757717E; WO1995031532A1; FI119815B; ES2264126T3; MXPA96005662A; ATE328068T1; NZ285941A; EP0757717A1; DE69535018T2; PL183781B1; EP0757717B1; CZ336696A3; SI0757717T1; NO322133B1; SK147696A3; CA2189882A1; PL317234A1; AU2549595A; JPH10500847A

Description

A találmány tárgyát papillomavírus Ll és L2 proteinjeit kódoló rekombináns expressziós vektorok, a rekombináns proteinek előállítására szolgáló eljárások, valamint a fenti rekombináns proteinek alkalmazása képezik.

Papillomavírus fertőzések különböző élőlényekben fordulnak elő, például emberben, birkákban, kutyákban, macskákban, nyulakban, majmokban, kígyókban és szarvasmarhákban. A papillomavírusok epitheliális sejteket fertőznek, és a fertőzés helyén általában jóindulatú epitheliális vagy fibroepitheliális tumorok keletkezését váltják ki. A papillomavírusok faj specifikus fertőző ágensek; egy humán papillomavírus nem képes egy nem-humán szervezet fertőzésére.

A papillomavírusok az általuk fertőzött szervezet alapján különböző csoportokra oszthatók. A humán papillomavírusokat (HPV) DNS-szekvencia homológiájuk alapján további 60 típusra osztjuk, [az ide vonatkozó összefoglalót lásd: Papillomaviruses and Humán Cancer, H. Pfister (szerk.), CRC Press Inc., (1990)]. Úgy tűnik, hogy a papillomavírus-típusok típusspecifikus immunogén hatással rendelkeznek, amennyiben egy adott papillomavírus-típussal történő fertőzéssel szemben létrejött neutralizáló immunitás nem hoz létre immunitást más papillomavírus-típusokkal szemben.

Emberben a különböző HPV-típusok különböző betegségeket okoznak. Az 1., 2., 3., 4., 7., 10. és 26-29. típusok mind normális, mind immunszupresszált egyénekben benignus (jóindulatú) szemölcsöket okoznak. Az 5., 8., 9., 12., 14., 15., 17., 19-25., 36., valamint 46-50. típusok immunszupresszált egyénekben lapos léziók létrejöttét váltják ki.

• · · · • ·

A 6., 11., 34., 39., 41-44., valamint 51-55. típusok a genitális és légúti nyálkahártyák nem-malignus kondilomatózus elváltozását eredményezik. A 16. és 18. típusok a genitális nyálkahártyák epitheliális diszpláziáját hozzák létre, és a méhnyak, a hüvely, a vulva és a végbélnyílás in situ és invazív karcinomás elváltozásainak nagy részével kapcsolatba hozhatók. Valamennyi kondilóma (genitális szemölcs) és gége papilloma több, mint 90 %-át a HPV6 és HPV11 típus okozza. A 6. típusú HPV legelterjedtebb altípusa a

HPV6a.

Állatokon végzett immunológiai vizsgálatok alapján megállapítható, hogy a papillomavírus-antigénekkel szemben termelődött neutralizáló ellenanyagok megakadályozzák a homológ vírussal történő fertőződést. Hatékony papillomavírus vakcinák kifejlesztését hátráltatták a vírus in vitro tenyésztésével kapcsolatos nehézségek. A hatékony HPV-vakcinák kifejlesztését különösen lelassította, hogy nem áll rendelkezésre megfelelő állat-modell.

A papillomavírusok neutralizációja típusspecifikusnak bizonyult, és a vírus felszínén található epitópok konformációjától függ.

A papillomavírusok kis méretű (50-60 nm) , burok nélküli, ikozahedriális DNS-vírusok, amelyek legfeljebb nyolc korai és két késői gént kódolnak. A vírusgenomok nyitott leolvasási keretei (ORF-jei) az E1-E7, valamint LI és L2 elnevezéseket kapták, ahol E korai, L késői géntermékeket jelölnek. Az LI és L2 gének vírus kapszidproteineket kódolnak. A korai (E) gének olyan funkciókkal kapcsolatosak, mint a vírusreplikáció és a sejttranszformáció.

Az LI protein a fő kapszidprotein, és 55-60 kDa molekulatömeggel rendelkezik. Az L2 protein egy kisebb arányban előforduló kapszidprotein, amely 55-60 kDa elméletileg számított molekulatömeggel, poliakrilamid-gélelektroforézis szerinti meghatározás alapján pedig 75-100 kDa molekulatömeggel rendelkezik. Immunológiai adatok szerint, a legtöbb L2 protein az LI proteinekhez képest beljebb található. Az L2 proteinek a különböző papillomavírusok között nagymértékben konzerváltak, ez különösen a C-terminális végen található 10 bázikus aminosavra vonatkozik. Az Ll-ORF a különböző papillomavírusok között nagy mértékben konzervált.

Az LI és L2 géneket papillomavírus fertőzések megelőzésére és kezelésére felhasználható vakcinák előállítására alkalmazták. Zhou és munkatársai (1991; 1992) a HPV16 típus eredetű LI és L2 géneket vacciniavírus vektorba klónozták, és a rekombináns vektorral CV-1 emlőssejteket fertőztek, vírusszerű részecskék (virus-like particles, VLP) előállítása céljából.

Előállítottak baktériumokban rekombináns, szarvasmarha papillomavírus LI és L2 proteineket. A rekombináns bakteriális proteinekkel szemben termelődő neutralizáló szérum kis mértékben adott keresztreakciót a natív vírusokkal, feltehetően a natív és bakteriális eredetű proteinek közti konformációs eltérések következtében.

A HPV6 Ll, HPV11 Ll, HPV16 Ll, HPV18 Ll, HPV31 Ll, vagy HPV16 L2 ORF-eket SF9 sejtek fertőzésére, valamint Ll és L2 proteinek előállítására használták. Western-blotanalízis szerint a baculovírus eredetű L1 és L2 proteinek reakciót adtak a HPV16-tal szemben termelődött ellenanyaggal. A baculovírus eredetű L1 proteinek VLP-ket képeznek.

Carter és munkatársai (1991) a HPV16 L1 és HPV16 L2 proteinek rekombináns Saccharomyces cerevisiae törzsekben történő előállítását mutatták ki. Carter és munkatársai

HPV6b L1 és L2 proteinek termelődését is szemléltették. A HPVőb L1 protein nem volt teljes hosszúságú L1 protein. A rekombináns proteinek intracellulárisan termelődtek, és szekretálódott termékekként is kimutathatóak voltak. A rekombináns L1 és L2 proteinek molekulatömege hasonló volt a natív proteinekéhez. Amennyiben a proteinek intracellulárisan expresszálódtak, a sejtek denaturáló reagensek jelenléte nélkül végzett lízise esetén a proteinek nagy része oldhatatlan maradt. Bár ez az oldhatatlanság megkönnyítheti a protein tisztítását, a protein natív epitópjainak analízisét gátolhatja.

Élesztőből szekretálódott rekombináns proteinekről kimutatták, hogy azok élesztő eredetű szénhidrátokat tartalmaznak. Ezeknek az N-kötésű oligoszacharidoknak a jelenléte elfedheti a natív epitópokat. A szekretálódott rekombináns polipeptidek tartalmazhatnak továbbá egyéb módosításokat, például visszamaradott szekretoros vezető szekvenciát.

Előnyös lenne olyan eljárások kifejlesztése, amelyek alkalmazásával, rekombináns élesztők tenyésztésén keresztül, valamely kívánt fajhoz vagy típushoz tartozó papillomavírus proteinek nagy mennyiségben előállíthatok lennének. Előnyös lenne továbbá a natív proteinek immunogén sajátságaival, például a natív protein konformációjával rendelkező, nagy mennyiségű papillomavírus protein előállítása.

A találmány tárgyát képezik tehát a natív proteinek immunogén sajátságaival rendelkező rekombináns papillomavírus proteinek, ezek előállítására szolgáló eljárások, valamint az említett proteinek alkalmazása. A találmány tárgya továbbá eljárás papillomavírus fertőzések megelőzésére és esetleges terápiájára alkalmazható vakcinák előállítására. A találmány szerinti rekombináns proteinek képesek vírusszerű részecskéket (VLP-ket) képezni. Ezek a VLP-k immunogén hatásúak, és állat-modellben megelőzik szemölcsök képződését. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint modellrendszerként a gyapjasfarkú nyúl papillomavírust (CRPV) és a HPV6 típust (6a altípust) alkalmaztuk.

A találmány tárgyát képezik tehát papillomavírus Ll és L2 proteineket kódoló rekombináns expressziós vektorok, a rekombináns proteinek előállítására szolgáló eljárások, valamint a rekombináns proteinek alkalmazása.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábra a papillomavírus Ll és/vagy L2 kapszidproteinek expresszálására felhasznált kétirányú élesztő expressziós vektort ábrázolja.

A 2. ábra HPV6a Ll expresszióját ábrázolja élesztőben (immunobiot).

A 3. ábra HPV6a L2 expresszióját ábrázolja élesztőben (immunobiot). Élesztőben expresszálódott HPV6a L2 immunoblot analízise: 1. csík: molekulatömeg-markerek; 2. csík: E.

coliban expresszált trpE-L2 fúziós protein, amely pozitív kontrollként szolgált; 4. csík: élesztőben expresszálódott HPVőa Ll, amely negatív kontrollként szolgált; 5. csík: élesztőben expresszálódott HPVőa L2 (a kísérlet részleteit lásd a leírásban).

A 4. ábra élesztőben expresszálódott HPVőa Ll VLP-k elektronmikroszkópos képét mutatja.

Az 5. ábra élesztőben expresszálódott HPVőa L1/L2 VLP-k elektronmikroszkópos képét mutatja.

A 6. ábra élesztőben expresszálódott CRPV Ll, L2 és (L1+L2) proteinek immunobiot analízisét ábrázolja. (A) ábra: CRPV Ll expressziója anti-CRPV-Ll-antiszérummal adott reakció alapján történő meghatározás szerint. (B) ábra: CRPV L2 expressziója anti-CRPV-L2-antiszérummal adott reakció alapján történő meghatározás szerint. 1. csík: molekulatömeg-markerek kDa-ban (Amersham Rainbow™ Markers, 14 300 200 000 Daiton); 2. csík: a CRPV Ll expressziós vektort tartalmazó BJ5462 törzs; 3. csík: a CRPV L2 expressziós vektort tartamazó 1569 törzs; 4. és 5. csík: az 1569 törzs két olyan izolátumát tartalmazzák, amelyeket a CRPV Ll és CRPV L2 proteinek expresszálása céljából két plazmiddal transzformáltunk; 6-8. csík: az 1569 törzs három olyan izolátumát ábrázolják, amelyek egyetlen vektort tartalmaznak a CRPV Ll és CRPV L2 proteinek együttes expresszálására; 9. és 10. csík: a BJ5462 törzs két izolátumát ábrázolják, amelyek egyetlen vektort tartalmaznak a CRPV Ll és CRPV L2 proteinek együttes expresszálására. Az Ll és L2 proteinek vándorlásának pozícióját a 6. ábra jobboldali tengelye mentén

jelöltük.

A 7. ábra az 1558 jelű S. cerevisiae törzs előállításának vázlatos ismertetése.

A 8. ábra az 1569 jelű S. cerevisiae törzs előállításának vázlatos leírása.

A 9. ábra a tisztítási eljárás főbb lépéseit mutatja.

A 10. ábra a felhasznált törzsek listáját tartalmazza.

A 11. ábra élesztőből tisztított HPV16 típusú (L1+L2) proteinek SDS-PAGE-analíziséről készített sorozatot ábrázol. A végső tisztított VLP-ken felül, a tisztítási eljárás közbülső lépéseinek termékeit is ábrázoltuk. Az egyes csíkokon található minták a táblázat alapján azonosíthatók. Az ábrán kolloidális Comassie-blue-festékkel festett gélt, valamint Ll és L2 proteinekkel szemben termelt antiszérummal érintkeztetett Western-blotokat mutatunk be.

A 12. ábra egy, gyapjasfarkú nyúl papillomavírus Ll protein tisztítására szolgáló alternatív eljárás vázlatos leírását mutatja.

A 13. és 14. ábra a tisztított VPL SDS/PAGE-analízisét mutatj ák.

A találmány tárgyát képezik tehát papillomavírus (PV) fertőzés megelőzésére, jellemzésére, kimutatására és kezelésére szolgáló módszerek, készítmények és eljárások. Az eljárások rekombináns Ll vagy rekombináns L2 vagy rekombináns (L1+L2) proteinek élesztőben történő előállításán alapulnak. A rekombináns proteinek képesek utánozni a natív PV neutralizáló epitópjainak konformációját. A rekombináns Ll vagy Ll és L2 proteinek képesek vírusszerű részecskék

(VLP-k) képzésére is. A találmány szerinti készítmények anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - tartalmazhatják az L1 vagy L2 vagy (L1+L2) proteineket kódoló rekombináns DNS-molekulákat, a rekombináns proteineket egymagukban vagy más rekombináns proteinekkel kombinálva, a rekombináns proteinek legalább egyikéből felépülő VLP-ket, a rekombináns proteinek fragmentumait, a rekombináns proteineket tartalmazó gyógyászati készítményeket, a rekombináns proteineket tartalamazó vakcinakészítményeket, a rekombináns proteinekkel vagy VLP-kkel szemben előállított ellenanyagokat, a rekombináns proteinek legalább egyikét tartalmazó immunogén készítményeket, valamint a rekombináns DNS-molekulákat vagy rekombináns proteineket tartalmazó diagnosztikus reagenskészleteket. Anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti rekombináns proteinek előállítására szolgáló eljárások, amelyek szerint megfelelő élesztő gazdasejteket rekombináns DNS molekulával transzformálunk, a transzformált élesztősejteket olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik a rekombináns proteineket kódoló DNS expresszálódását, majd a rekombináns proteineket tisztítjuk. Ezenfelül, a találmány tárgyához tartoznak a rekombináns proteinek, rekombináns proteinkészítmények vagy VLP-k állatnak - és anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - embernek történő beadására szolgáló eljárások. Alkalmas gazdasejtek - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - a Saccharomyces, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces és Hansenula nemzetségekhez tartozó élesztő10 sejtek.

Papillomavírus fertőzések különböző élőlényekben fordulnak elő, például emberben, birkákban, kutyákban, macskákban, nyulakban, majmokban, kígyókban és szarvasmarhákban. A papillomavírusok epitheliális sejteket fertőznek, és a fertőzés helyén általában jóindulatú epitheliális vagy fibroepitheliális tumorok keletkezéséhez vezetnek.

A papillomavírusok az általuk fertőzött gazdaszervezet alapján különböző csoportokra oszthatók. A humán papillomavírusokat (HPV) DNS-szekvencia homológiájuk alapján további 60 típusra oszthatjuk [az ide vonatkozó összefoglalót lásd: Papillomaviruses and Humán Cancer, H. Pfister (szerk.), CRC Press Inc., (1990)]. A papillomavírus-típusok típusspecifikus immunogéneknek tűnnek, amennyiben egy adott papillomavírus típussal történő fertőzéssel szemben létrejött neutralizáló immunitás más papillomavírus típusokkal szemben nem hoz létre immunitást.

Emberben a különböző HPV-típusok különböző betegségeket okoznak. Az 1., 2., 3., 4., 7., 10. és 26-29. típusok mind normális, mind immunszupresszált egyénekben benignus (jóindulatú) szemölcsöket hoznak létre. Az 5., 8., 9., 12., 14., 15., 17., 19-25., 36., valamint 46-50. típusok immunszupresszált egyénekben lapos léziók létrejöttét váltják ki. A 6., 11., 34., 39., 41-44., valamint 51-55. típusok a genitális és légúti nyálkahártyák nem-malignus, kondilomatózus elváltozását okozzák. A 16. és 18. típusok a genitális nyálkahártyák epitheliális diszpláziáját hozzák létre, és a méhnyak, a hüvely, a vulva és a végbélnyílás in situ és invazív karcimómás elváltozásainak nagy részével kapcsolatba hozhatók. Valamennyi kondilóma (genitális szemölcs) és gége papilloma több, mint 90 %-át a HPV6 és HPV11 típusok okozzák.

Állatokban végzett immunológiai vizsgálatok azt mutatják, hogy a papillomavírus kapszidproteinekkel szemben termelődött neutralizáló ellenanyagok megakadályozzák a homológ vírussal történő fertőződést. Hatékony papillomavírus vakcinák kifejlesztését hátráltatták a vírus in vitro tenyésztésével kapcsolatos nehézségek. A hatékony HPV-vakcinák kifejlesztését különösen lelassította, hogy nem áll rendelkezésre megfelelő állat-modell.

A papillomavírusok neutralizációja típusspecifikusnak, és a vírus felszínén található epitópok konformációjától függőnek bizonyult.

A papillomavírusok kis méretű (50-60 nm), burok nélküli, ikozahedriális DNS-vírusok, amelyek legfeljebb nyolc korai és két késői gént kódolnak. A vírusgenomok nyitott leolvasási keretei (ORF-jei) az E1-E7, valamint Ll és L2 elnevezéseket kapták, ahol E korai, L késői géntermékeket jelölnek. Az Ll és L2 gének vírus kapszidproteineket kódolnak. A korai (E) gének olyan funkciókkal kapcsolatosak, mint a vírusreplikáció és transzformáció.

Az Ll protein a fő kapszidprotein, és 55-60 kDa molekulatömeggel rendelkezik. Az L2 protein egy kisebb arányban előforduló kapszidprotein, amely 55-60 kDa elméletileg számított molekulatömeggel, poliakrilamid-gélelektroforézissel történő meghatározás alapján pedig 75-100 kDa molekula12

tömeggel rendelkezik.

Leírták a HPV16 L1 és HPV16 L2, és HPV6 típusú L1 proteinek rekombináns Saccharomyces cerevisiae törzsekben történő termelését. Előnyös lenne olyan eljárások kifejlesztése, amelyek alkalmazásával, rekombináns élesztők tenyésztésén keresztül valamely kívánt fajhoz vagy típushoz tartozó papillomavírus proteinek nagy mennyiségben előállíthatók lennének. Előnyös lenne továbbá a natív proteinek immunogén sajátságaival, például a natív protein konformációjával rendelkező nagymennyiségű papillomavírus proteinek előállítása.

A találmány tárgyát képezik tehát a natív proteinek immunogén sajátságaival rendelkező rekombináns papillomavírus proteinek, azok előállítására szolgáló eljárások, valamint az említett proteinek alkalmazása. A találmány tárgyához tartozik továbbá, papillomavírus fertőzések megelőzésére alkalmazható vakcinák előállítása. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint modellrendszerként a gyapjasfarkú nyúl papillomavírust (CRPV) és a 6. típusú humán papillomavírust (HPV6 vagy HPVőa altípust) alkalmaztuk. A példákat anélkül közöljük, hogy igényünket azokra korlátoznánk, találmány vonatkozik egyéb papillomavírus (PV) típusokra és altpusokra, így — anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk — a HPV11, HPV16 és HPV18 típusokra, valamint a HPV6a és HPV6b altípusokra.

A találmány szerinti proteineket vagy VLP-ket tartalmazó gyógyászati készítmények ismert eljárások szerint formulázhatók, például egy gyógyászatilag elfogadható hordozó-

anyaggal elegyítve. Ilyen hordozóanyagok és eljárások leírása megtalálható például az alábbi szakirodalmi helyen: Remington's Pharmaceutical Sciences. Hatékonyan adagolható gyógyászati készítmények előállításához a készítménynek hatékony mennyiségű, találmány szerinti proteint vagy találmány szerinti VLP-t kell tartalmaznia. Az ilyen készítmények tartalmazhatnak egy vagy több HPV-típusból származó proteint vagy VLP-t.

A találmány szerinti terápiás vagy diagnosztikus készítményeket olyan mennyiségben alkalmazzuk, amely elegendő PV-fertőzés diagnosztizálására vagy kezelésére. A hatékony mennyiség számos faktortól függ, például az egyén általános állapotától, testtömegétől, nemétől és korától. További faktor az adagolás módja. A készítményt általában 1-250 pg dózisokban adjuk be.

A gyógyászati készítményt az adott egyénnek különböző módokon adhatjuk be, például bőr alá, lokálisan, szájon át, nyálkahártyán át és izomba.

A találmány szerinti vakcinák olyan rekombináns proteineket vagy VLP-ket tartalmaznak, amelyek a gazdasejtben neutralizáló ellenanyagok termelődéséhez vezető antigéndeterminánsokat hordoznak. Az ilyen vakcináknak elég biztonságosaknak kell lenniük ahhoz, hogy klinikai fertőzés előidézésének veszélye nélkül beadhatók legyenek; nem rendelkezhetnek toxikus mellékhatásokkal; hatékony eljárással adagolhatok, stabilak; és egyéb vakcina hordozóanyagokkal kompatibilisek.

A vakcinák különböző módokon adhatók be, például szájon át, parenterálisan, bőr alá, nyálkahártyán át vagy izomba. Az adagolandó dózis függ például az egyén általános állapotától, nemétől, testtömegétől és korától; valamint a vakcina PV-típusától. A vakcina adagolható kapszula, szuszpenzió, elixír vagy folyékony oldat formájában. A vakcina formulázható egy immunológiailag elfogadható hordozóanyaggal együtt.

A vakcinát terápiásán hatékony mennyiségben adagoljuk, azaz védettséget előidéző immunválasz kiváltásához elegendő mennyiségben. A terápiásán hatékony mennyiség a PV típusa szerint változhat. A vakcinát adagolhatjuk egyetlen dózisban vagy több dózisban.

A találmány szerinti eljárások lehetővé teszik vírusnál kisebb részecskéket tartalmazó vakcinák (szubvírus-vakcinák) előállítását, PV-fertőzés megelőzésére. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával előállíthatunk monovalens vagy multivalens PV-vakcinákat. Monovalens HPV16 típusú vakcinát előállíthatunk például rekombináns HPV16 Ll protein vagy L2 protein vagy L1+L2 proteinek alkalmazásával. Más eljárás szerint multivalens HPV-vakcinát előállíthatunk különböző HPV-típusokból származó Ll vagy L2 proteinek vagy L1+L2 proteinek vagy VLP-k elegyítésével.

A találmány szerinti rekombináns proteinek és VLP-k alkalmazhatók immunogén készítmények előállítására. A fenti készítmények - megfelelő gazdaszervezetnek beadva - képesek a gazdaszervzetben immunológiai válaszreakció kiváltására.

A rekombináns proteinek és VLP-k felhasználhatók ellenanyagok termelésére. A leírásban ellenanyagon poliklonális és monoklonális ellenanyagokat, valamint azok fragmentumait, például Fv, Fab és F(ab)2 fragmentumokat értünk, amelyek képesek antigénhez vagy hapténhez kötődni.

A találmány szerinti rekombináns proteinek, VLP-k, valamint ellenanyagok alkalmazhatók HPV-fertőzés szerotipizálására és HPV-szűrésre. A rekombináns proteinekből, VLP-kből, valamint ellenanyagokból HPV kimutatására és szerotipizálására alkalmas reagenskészletek formulázhatók. Az ilyen reagenskészletek tartalmaznak egy rekeszekre osztott hordozót, amely alkalmas legalább egy tartály tárolására. A hordozó tartalmaz további reagenseket, például rekombináns HPV proteint vagy VLP-t vagy anti-HPV-ellenanyagokat, amelyek különböző HPV-típusok kimutatására alkalmazhatók. A hordozó tartalmazhat további a kimutatást szolgáló anyagokat, például jelölt antigént vagy enzim-szubsztrátot vagy hasonlókat.

A találmány szerinti rekombináns proteinek és VLP-k molekulatömeg- és molekulaméret-markerekként is felhasználhatók.

A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség céljából a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

1. példa

Az U9 élesztőtörzs előállítása

A 2150-2-3-jélű Saccharomyces cerevisiae törzset (MATa, leu2-04, adel, cir°) Dr. Leland Hartwelltől kaptuk (University of Washington, Seattle, WA) . A 2150-2-3-törzs sejtjeit egy éjszakán át, 30 °C-on, 5 ml YEHD-tápfolyadékban tenyésztettük [Carty és mtsai.: J. Ind. Micro. 2, 117. (1987)]. A sejteket steril desztillált vízben háromszor mostuk, 2 ml steril desztillált vízben szuszpendáltuk, majd ura3-mutánsok szelektálása céljából, hat darab 5-fluor-orotiksavat tartalmazó (FOA) lemezre (Cold Spring Harbor Laboratory Manual fór Yeast Genetics) 0,1-0,1 ml sejtszuszpenziót oltottunk. A lemezeket 30 °C-on inkubáltuk. A táptalaj összetétele a következő volt: 250 ml desztillált vízben 3,5 g, aminosav- és ammónium-szulfát-mentes Difco Yeast Nitrogén Base; 0,5 g 5-fluor-orotiksav; 25 mg uracil; és 10,0 g dextróz.

A táptalajt 0,2 pg áteresztőképességű szűrőkön történő szűréssel sterilizáltuk, majd 250 ml térfogatú, 50 °C-on tartott, 4 %-os Bacto-Agar-ral (Difco), 10 ml 1,2 mg/ml-es adeninoldattal, és 5 ml L-leucin-oldattal (180 mg/50 ml) elegyítettük. Az így kapott táptalajt 20 ml térfogatú Petri-csészékbe osztottuk szét.

Ötnapos inkubálást követően számos telep jelent meg. Különálló telepeket izoláltunk úgy, hogy az eredeti FAOlemezekről lekapart telepeket friss FAO-lemezekre oltottuk, majd azokat 30 °C-on inkubáltuk. A második sorozat FAO-lemezről számos telepet teszteltünk uraű-mutáció jelenlétére, YEHD-táptalajt tartalmazó és uracil-mentes táptalajt tartalmazó replikalemezekre történő egyidejű átoltással. A kívánt eredmény szerint, a telep jól növekedett YEHD-táptalajon és nem növekdett uracil-mentes táptalajon. Egy olyan izolátumot találtunk (U9), amely a fenti sajátságokkal rendelkezett.

Ezt későbbi felhasználásig -70 °C-on, glicerinben lefagyasztott törzstenyészetként tároltuk (325 számú törzs).

2. példa

Vektor előállítása az MNN9 jelű élesztőgén megszakítására

Abból a célból, hogy olyan vektort állítsunk elő, amelyben az MNN9 jelű élesztőgén megszakított, az MNN9 gént S. cerevisiae genomi DNS-ből először klónoznunk kellett. Ezt szokásos polimeráz-láncreakciós (PCR) technikával végeztük. A teljes hosszúságú MNN9 gén kódoló szekvenciájának klónozásához a PCR-reakcióban alkalmazott 5'-végi szensz láncindító oligonukleotidot és 3'-végi antiszensz láncindító oligonukleotidot az MNN9 gén közölt szekvenciája alapján terveztük [Zymogenetics: EP-88117834.7 sz. európai szabadalmi bejelentés, közzétételi szám: EP-0-314-096-A2] . Az alábbi, határoló NlndlII-helyeket tartalmazó láncindító oligodezoxi-nukleotidokat alkalmaztuk (a tfindlll-helyeket aláhúzással jelöltük):

szensz láncindító oligonukleotid: 5'-CTT AAA GCT TAT GTC

ACT TTC TCT TGT ATC G-3' (1. szekvencia);

antiszensz láncindító oligonukleotid: 5'-TGA TAA GCT TGC

TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3' (2. szekvencia).

Az MNN9 gén kezdő metionin kodonját vastag betűvel jelöltük. A PCR-reakciót a JRY188 jelű S. cerevisiea törzsből származó genomi DNS templátként történő felhasználásával, Taq-DNS-polimeráz enzimmel (Perkin Elmer), 25 amplifikációs ciklus (94 °C-on 1 perc; 37 °C-on 2 perc; 72 °C-on 3 perc) alkalmazásával végeztük. A kapott 1,2 kbp

(kilobázispár) nagyságú PCR-fragmentumot HindiII-enzimmel emésztettük, gélen tisztítottuk, majd HindlII-enzimmel emésztett és alkalikus foszfatázzal kezelt pUCl3 plazmiddal (Pharmacia) ligáltuk. A kapott plazmidot pll83 plazmidnak neveztük.

Abból a célból, hogy az MNN9-qént az élesztő URA3génnel megszakítsuk, a pBR322-URA3 plazmidot, (amely a pBR322-plazmid HindiII-helyére szubklónozva tartalmazta a S. cerevisiae URAS-génjét kódoló 1,1 kbp HindlII-fragmentumot), HindlII-enzimmel emésztettük, a funkcionális HRA3-gént kódoló 1,1 kbp DNS-fragmentumot gélen tisztítottuk, T4-DNS-polimerázzal tompa végűvé alakítottuk, majd a Pmil-enzimmel emésztett pll83 plazmiddal ligáltuk (a PmlI az MNN9 kódoló szekvenciáján belül hasít). A kapott pll99 plazmidban az MNN9 gén folytonosságát a funkcionális URA3 gén megszakítja.

3. példa

A megszakított MNN9 gént tartalmazó, U9-eredetű 1372 törzs előállítása

Abból a célból, hogy az U9 (325 számú) törzsben az MNN9 gént megszakítsuk, 30 pg pll99 plazmidot Hindin enzimmel emésztettünk, hogy lineáris, mnn9:: URA3 megszakítást tartalmazó kazettát nyerjünk. A 325 számú törzs sejtjeit a Hindin enzimmel emésztett pll99-DNS-sel transzformáltuk a spheroplaszt eljárás alkalmazásával [Hinnen és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5, 1929. (1978)], majd uracilmentes és

1,0 mól/1 szorbitot tartalmazó szintetikus agar-táptalajon transzformánsokat szelektáltunk. A szintetikus táptalaj összetétele a következő volt: 1 liter desztillált vízben * · • · · g agar; 6,7 g, aminosavakat nem tartalmazó Yeast Nitrogén Base; 0,04 g adenin; 0,05 g L-tirozin; 182 g szorbit; 20 g glükóz; és 10 ml Leucin Minus Solution #2. A

Leucin Minus Solution #2 összetétele a következő volt (1 liter desztillált vízben): 2 g L-arginin; 1 g L-hisztidin; 6 g L-leucin; 6 g L-izoleucin; 4 g L-lizin; 1 g L-metionin; 6 g L-fenilalanin; 6 g L-treonin; 4 g L-triptofán.

A lemezeket öt napig, 30 °C-on inkubáltuk, ezalatt számos telep jelent meg. Tíz telepből kromoszomális DNS-t állítottunk elő, és azt BcoRI, valamint HindlII enzimmel emésztettük. Az emésztett DNS-t Southern-blot eljárással vizsgáltuk [J. Sambrook és és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], próbaként az MNN9 gént hordozó, (pll99 plazmidból izolált), 1,2 kbp HindlII-fragmentum felasználásával. Egy olyan izolátumot azonosítottunk, amely Southern-blot szerint a várakozásnak megfelelő DNS-csík vándorlást mutatta, valamint az MNN9 mutánsokra tipikusan jellemző nagymértékű összetapadási tulajdonsággal rendelkezett .

4. példa

Vektor előállítása az élesztő HIS3 gén megszakítására

Olyan génmegszakítást tartalmazó kazetta előállítása céljából, amelyben a S. cerevisiae HIS3 gént az URA3 génnel megszakítottuk, az YEp6 plazmidot [K. Struhl és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035. (1979)] BamHI enzimmel emésztettünk. A HIS3 gént hordozó 1,7 kbp BamHI-fragmentumot gélen tisztítottuk, T4-DNS-polimerázzal tompavégűvé alaki20 tottuk, majd előzőleg BamHI enzimmel emésztett és T4-DNSpolimerázzal kezelt pUC18 plazmiddal ligáltuk. Az igy kapott plazmidot (amelyet pl501 plazmidnak vagy pUC18-HIS3 plazmidnak neveztünk) Nhel enzimmel emésztettük (amely a HIS3 gén kódoló szekvenciáján belül hasit), a vektor-fragmentumot gélen tisztítottuk, T4-DNS-polimerázzal tompavégűvé alakítottuk, majd borjú bélből izolált alkalikus foszfatázzal kezeltük. Az URA3 gént a pBR322-URA3 plazmidból HundlII enzimmel történő emésztéssel izoláltuk, az URA3 gént hordozó 1,1 kbp fragmentumot gélen tisztítottuk, T4-DNS-polimerázzal tompavégűvé alakítottuk, és a fenti, pUC18-HIS3 plazmid eredetű Nhel-fragmentummal ligáltuk. Az így kapott plazmid (amelyet pUC18-his3::URA3 plazmidnak vagy pl505 plazmidnak neveztünk) tartalmazta a génmegszakítást tartalmazó kazettát, amelyben az élesztő eredetű HIS3 gént a funkcionális URA3 gén szakítja meg.

5. példa

Vektor előállítása az élesztő PRB1 génnek HIS3 génnel történő megszakítására

A S. cerevisiae PRB1 gént hordozó FP8AH plazmidot Dr. E. Jones-től kaptuk (Carnegie-Mellon Univ.) [C.M. Moehle és mtsai.: Genetics 115, 255. (1987)]. Ezt Hindin és Xhol enzimekkel emésztettük, és a PRB1 gént tartalmazó, 3,2 kbp nagyságú DNS-fragmentumot gélen tisztítottuk, majd T4-DNSpolimerázzal tompavégűvé alakítottuk. A pUC18 plazmidot BamHI enzimmel emésztettük, gélen tisztítottuk, majd T4-DNSpolimerázzal tompavégűvé alakítottuk. Az így kapott vektorfragmentumot a fenti PRB1 génfragmentummal ligáltuk, így

nyertük a pUC18-PRBl plazmidot. A HIS3 gént hordozó Yep6 plazmidot BamHI enzimmel emésztettük. A funkcionális HIS3 gént hordozó 1,7 kbp BamHI-fragmentumot gélen tisztítottuk, majd T4-DNS-polimerázzal végzett kezeléssel tompavégűvé alakítottuk. A pUC18-PRBl plazmidot BcoRV és Ncol enzimmel emésztettük, amelyek a PRB1 gén kódoló szekvenciáján belül hasítanak, és eltávolítják a proteáz-B aktív helyet, valamint az azt határoló szekvenciákat. A PRB1 gén kódoló szekvenciájának 5'- és 3'-végi részét pUC18 plazmidban tartalmazó, megmaradt 5,7 kbp nagyságú BcoRV-Ncol-fragmentumot gélen tisztítottuk, T4-DNS-polimerázzal tompavégűvé alakítottuk, borjúbélből izolált alkalikus foszfatázzal kezeltük, majd a fent ismertetett, tompavégűvé alakított HIS3-£ragmentummal ligáltuk. Az így előállított plazmid (amelyet PUC18-prbl::HIS3 plazmidnak neveztünk, 1245 számú törzstenyészet) a PRB1 gén fenti módon deletált részének helyén tartalmazta a funkcionális HIS3 gént.

6. példa

Megszakított MNN9 gént, valamint megszakított PRB1 gént tartalmazó, U9-eredetű élesztőtörzs előállítása

A megszakított MNN9 gént tartalamazó, U9-eredetű 1372 számú törzset a 3. példában ismertettük. Az 1372 számú törzs klonális izolátumait ura3 mutánsok szelektálása céljából FOA-lemezeken passzáltuk. Számos, 1372 törzs eredetű ura3izolátumot kaptunk, egy izolátumot (az 12930-190-S1-1 törzset) választottuk a HIS3 gén megszakítására. A pUC18his3::URA3 jelű, génmegszakítást tartalmazó vektort (pl501 plazmidot) Xbal és BcoRI enzimmel emésztettük, hogy lineá♦ «··· · · ·· ·· ··· ··· · • · · · · · · ris, his3::URA3 génmegaszakítást tartalmazó kazettát nyerjünk, ezzel pedig a lítium-acetátos módszer alkalmazásával [Methods in Enzymology 194, 290. (1991)] az 12930-190-S1-1 törzset transzformáltuk. Uracil-mentes szintetikus agartáptalajon Ura3⁺-transzformánsokat szelektáltunk, izolált kiónokat az előbbivel megegyező összetételű táptalajra átoltottunk, majd uracil-mentes vagy hisztidin-mentes táptalajokon replika-lemezeket készítettünk olyan izolátumok kiszűrése céljából, amelyek mind Ura⁺, mind His’ tulajdonsággal rendelkeznek. Egy izolátumot (a 12930-230-1 törzset) választottunk a PRB1 gén ezt követően történő megszakítására. A PRB1 gén megszakítását tartalmazó vektort (pUC18-prbl::HIS3 plazmidot; 1245 számű törzstenyészet) SacI és Xba enzimmel emésztettük, hogy lineáris, prbl::HIS3 génmegaszakítást tartalmazó kazettát nyerjünk, ezzel pedig a lítium-acetátos módszer alkalmazásával az 12930-230-1 törzset transzformáltuk. Hisztidin-mentes agartáptalajon His⁺ transzformánsokat szelektáltunk, és az izolált kiónokat az előbbivel megegyező összetételű táptalajra átoltottuk. Több, így kapott His⁺izolátumból genomi DNS-t állítottunk elő, EcoRI enzimmel emésztettük, majd 0,8 %-os agarózgéleken elektroforetizáltuk. Southern-blot-analíziseket végeztünk a PRB1 génre specifikus, radioaktívan jelölt, 617 bp nagyságú próba alkalmazásával, amelyet PCR eljárással állítottunk elő, az alábbi láncindító oligonukleotidok felhasználásával:

5'-TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA-3' (3. szekvencia);

5'-CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA-3' (4. szekvencia). Tizenegy olyan izolátumot kaptunk, amelyek esetében a

próba a várakozásnak megfelelően egy 2,44 kbp prbl::HIS3 DNS-fragmentummal hibridizálódott. Ezzel szemben, a vadtípusú PRB1 gén esetében a próba egy 1,59 kbp fragmentummal hibridizálódott. További felhasználás céljára kiválasztottunk egy, a kívánt prbl::HIS3 génmegszakítást tartalmazó izolátumot; ezt az izolátumot 1558 számú törzsnek neveztük.

7. példa

Vektor előállítása az élesztő PEP4 gén megszakítására

A S. cerevisiae PEP4 gént élesztő eredetű genomi génkönyvtárból klónoztuk, a következő módon. A pLSIOl jelű élesztő génkönyvtárat [Schultz és Friesen: J. Bacteriol. 155, 8. (1983)] tartalmazó E. coli sejteket egy éjszakán át, ml, 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-táptalajban tenyésztettünk. Ebből a tenyészetből 10^-4 és 10^{* 5} hígításokat oltottunk ki ampicillinnel kiegészített LB-lemezekre. Nitrocellulóz szűrőkkel a lemezekről a telepeket felemeltük. Az élesztő PEP4 génre specifikus, 600 bp nagyságú próbát állítottunk elő PCR eljárással, Taq-DNS-polimeráz enzim, a pLSIOl jelű élesztő génkönyvtárból nyert teljes plazmid-DNS, valamint a PEP4 gén közölt DNS-szekvenciája [C. A. Woolford és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 6, 2500. (1986)] alapján tervezett, alábbi láncindító oligonukleotidok alkalmazásával :

szensz láncindító oligonukleotid: 5'-GAG GCT ACC AGC GAG

CCG GGC-3' (5. szekvencia);

antiszensz láncindító oligonukleotid: 5'-GGC CAG TGG GCC

AAC AGG TTC-3' (6. szekvencia).

A PCR-reakciót 25 amplifikációs ciklus alkalmazásával végeztük (94 °C-on 1 perc; 37 °C-on 2 perc; és 72 °C-on 3 perc) . A PCR-próbát gélen tisztítottuk, radioaktívan jelöltük, és a telepek lenyomatát tartalmazó fenti szűrőkkel hibridizáltattuk. Több.telep hibridizálódott a P£P4-próbával, ezeket a telepeket egyenként, ampicillinnel kiegészített LBlemezekre oltottuk át. Több izolátumból plazmid-DNS-t állítottunk elő az alkalikus-SDS-lízis eljárással (Sambrook és mtsai.: lásd fent), és azokat BamHI-enzimmel emésztettük. A várakozásnak megfelelő 14 kbp vektorcsík és a PEP4 gént tartalmazó 6,9 kbp inszertcsík volt megfigyelhető. EcoPI és Xhol enzimmel végzett kettős emésztést követően kimutatható volt a PEP4 génnek megfelelő 1,5 kbp csík. Egy a várakozásnak megfelelő eredményt mutató izolátumot (860 számút) választottunk további felhasználásra. A 860 számú törzsből előállított plazmid-DNS-t BamHI enzimmel emésztettük, és a kromoszomális PEP4 gént tartalmazó 6,9 kbp BamHI-DNS-fragmentumot pUC13 plazmid BamHI-helyére szubklónoztuk, így nyertük a p890 plazmidot. A p890 plazmidot ezután Ncol enzimmel emésztettük (amely a PEP4 gén kódoló szekvenciáján belül hasít), gélen tisztítottuk, T4-DNS-polimerázzal tompavégűvé alakítottuk, majd a (2. példában leírtak szerint előállított) funkcionális URA3 gént hordozó, tompavégűvé alakított 1,1 kbp méretű fragmentummal ligáltuk. Az így kapott plazmidot, amely az URA3 génnel megszakított a PEP4 gént tartalmazta, pUC13-pep4::URA3 plazmidnak neveztük (906 számú törzs).

8. példa

Az 1569 számú élesztőtörzs előállítása, amely az U9 törzs prbl és pep4 mutációkat tartalmazó származéka

Az U9 törzsben a HIS3 gén megszakítása céljából a pUC18-his3::URA3 jelű, génmegszakítást tartalmazó vektort Xbal és EcoRI enzimmel emésztettük, ezzel a lítium-acetátos módszer alkalmazásával az U9 törzset transzformáltuk.

Uracil-mentes agartáptalajon Ura3⁺ transzformánsokat szelektáltunk, az izolált kiónokat az előbbivel megegyező összetételű táptalajra átoltottunk. Több, így kapott URA⁺izolátumból uracil-mentes vagy hisztidin-mentes táptalajokon replika-lemezeket készítettünk, és olyan izolátumokat szűrtünk ki, amelyek mind Ura⁺, mind His* tulajdonsággal rendelkeztek. Egy izolátumot (az 1524 számú törzset) választottuk a PRB1 gén folytonosságának ezt követően végzendő megszakítására. A PRB1 génmegszakítást tartalmazó pUC18prbl::HIS3 vektort SacI és Xbal enzimmel emésztettük, majd a lítium-acetátos módszer alkalmazásával az 1524 számú törzset transzformáltuk. Hisztidin-mentes agartáptalajon His⁺transzformánsokat szelektáltunk, és az izolált kiónokat az előbbivel megegyező összetételű táptalajra átoltottunk. Több His⁺ izolátumból genomi DNS-t állítottunk elő, és azt Southern-blot-hibridizációval értékeltük a PRB1 génre specifikus, radioaktívan jelölt próba alkalmazásával. Egy izolátumot (az 1537 számú törzset), amely tartalmazta a PRB1 gén HIS3 génnel történő kívánt megszakítását (azaz a prbl::HIS3 megszakítást), választottunk a PEP4 gén ezt követően végzendő megszakítására. Az 1537 számú törzset •« · urad-izolátumok izolálása céljából FOA-lemezeken passzáltuk; egy izolátumot (az 1541 számú törzset) választottunk további felhasználásra.

Az 1541 számú törzsben a PEP4 gén megszakítása céljából a megszakított PEP4 gént tartalmazó pUC13pep4::URA3 vektort Xhol enzimmel emésztettük, hogy lineáris, pep4::URA3-génmegaszakítást tartalmazó kazettát nyerjünk, ezzel pedig a lítium-acetátos módszer alkalmazásával az 1541 számú törzset transzformáltuk. Uracil-mentes agartáptalajon Ura3⁺ transzformánsokat szelektáltunk, és az izolált kiónokat az előbbivel megegyező összetételű táptalajra átoltottunk. Több Ura3⁺ transzformánsból genomi DNS-t izoláltunk, és azokat a PEP4 génre specifikus radioaktívan jelölt próba alkalmazásával, Southern-blot eljárással értékeltük. Egy, URA3 génnel kívánt módon megszakított PEP4 gént tartalmazó izolátumot (az 1569 számú törzset) választottunk további felhasználás céljára.

9. példa

A CRPV Ll expressziós vektor előállítása

A CRPV Ll gént PCR eljárással amplifikáltuk a teljes CRPV vírusgenomot tartalmazó pLAII plazmid alapján (Dr. Peter Howley, NCI), Vent-polimeráz (New England Biolabs, Inc.), 35 amplifikációs ciklus (94 °C-on 1 perc; 50 °C-on 1 perc; 72 °C-on 2 perc) és az alábbi, határoló BgrlII-helyeket tartalmazó (aláhúzással jelölt) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával:

szensz láncindító oligonukleotid: 5'-GAA GAT CTT CAA AAC

AAA ATG GCA GTG TGG CTG TCT AC-3' (7. szekvencia);

antiszensz láncindító oligonukleotid: 5'-GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG CGT TTA G-3' (8. szekvencia).

A szensz láncindító oligonukleotid egy élesztő eredetű, nem-transzlálódó vezető szekvenciát iktat be a CRPV L1 kezdő metionin kodonjától közvetlenül 5'-irányban (mely kodont vastag betűvel jelöltünk). Az 1,6 kb L1 PCR-terméket Bglll enzimmel emésztettük, gélen tisztítottuk, és a pSP72 vektor (Promega) SglII-helyére szubklónoztuk, így kaptuk a PSP72-CRPV-L1 plazmidot (pl2930-314-4-l) .

Egy szubklónt teljes egészében szekvenáltunk, és azt találtuk, hogy az négy nukleotid vonatkozásában eltér a CRPV L1 közölt szekvenciájától. Az eltérések nem nyilvánulnak meg aminosav-eltérésekben. Az L1 gént egy BglII-fragmentumként a pSP72-CRPV-Ll plazmidból kivágtuk, és a pCl/l-GAL10p-ADHlt élesztő expressziós vektorban az élesztő GAL10 promóter és ADH1 transzkripciós terminációs szekvencia között található egyedi BamHI-helyre szubklónoztuk, amely vektor egy pCl/1vektorvázban tartalmazza az YEp52-ből származó GAL10 promótert [Broach és mtsai.: Exp. Manipulation of Gene Expression 83, 81 . (1983)], valamint az ADH1 transzkripciós terminációs szekvenciát. Az így kapott plazmidot pl2930-3236-1 plazmidnak neveztük.

10. példa

A CRPV L2 expressziós vektor előállítása

A CRPV L2 gént PCR eljárással, Vent-polimeráz alkalmazásával (New England Biolabs, Inc.) amplifikáltuk, a pLAII plazmid alapján, miután a plazmidot előzőleg Sáli enzimmel emésztettük, a 7,9 kb fragmentumot gélen tisztítottuk, és önmagával ligáltuk. A PCR eljárást 35 amplifikációs ciklus (90 °C-on 1 perc; 50 °C-on 1 perc; 72 °C-on 2 perc) és a következő (aláhúzással jelölt) határoló EcoRI-helyeket tartalmazó láncindító oligonukleotidok alkalmazásával végeztük:

szensz láncindító oligonukleotid: 5'-GGA ATT CAC AAA ACA

AAA TGG TTG CAC GGT CAC GAA AAC-3' (9. szekvencia;

antiszensz láncindító oligonukleotid: 5'-GGA ATT CTT ATT

CTG CGT AGA CAG CCA CAC TG-3' (10. szekvencia).

A szensz láncindító oligonukleotid egy élesztő eredetű, nem-transzlálódó vezető szekvenciát iktat be a CRPV Ll kezdő metionin kodonjától közvetlenül 5'-irányban, (mely kodont vastag betűvel jelöltük). Az 1,5 kb PCR-terméket EcoRI enzimmel emésztettük, gélen tisztítottuk, és a divergens, élesztő GALlp/GALlOp promótereket tartalmazó, pUC18GALlp-GALlOp jelű kétirányú promótervektor EcoRI-helyére szubklónoztuk. Ez a vektor egyedi BamHI-helyet tartalmaz a GÁLI promóter és az ADH1 transzkripciós terminátor szekvencia első példánya között, és egyedi EcoRI- és Smal-helyeket tartalmaz a GAL10 promóter és az ADH1 transzkripciós terminátor szekvencia második példánya között. Az így kapott expressziós kazetta egy 1,4 kb Sphl-fragmentumon található. Egy, a kívánt L2-inszertet a GAL10 promóterhez kötve tartalmazó kiónt (pl2930-295-2-2) teljes egészében szekvenáltunk, azt találtuk, hogy az hat nukleotid vonatkozásában eltér a közölt szekvenciától, és ezek közül négy aminosav-eltérést eredményez. Az eredeti templát-DNS szekvencia-analízise szerint az eltérések jelen voltak a pLAII plazmidban is, és azokat nem a PCR eljárással hoztuk létre. Az L2 gént tartalmazó pUC18-GALlp-GAL10p-vektort Sphl enzimmel emésztettük, és az ADH1t-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt expressziós kazettát hordozó 2,9 kb fragmentumot a pCl/1 j eű élesztő ingázó vektor nagyobb SphI-fragmentumával ligáltuk. Az így kapott plazmidot pl2930-323-2-3 plazmidnak neveztük (pCl/l-GALlpGAL10p-CRPV-L2).

11. példa

A CRPV L1 és CRPV L2 kapszidproteinek expressziója élesztőben

A pl2930-323-6-l és pl2930-323-2-3 plazmiddal (pCl/1GALlp-GALlOp-CRPV/Ll és pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV/L2) S. cerevisiae 1569, BJ5462 [E.W. Jones: Methods in Enzymology 194, 428. (1991)] és BJ1995 jelű [Jones, lásd fent] törzseket transzformáltunk. Az izolált kiónokat 48-72 órán át, 30 °Con, 2 % galaktózt tartalmazó YEHD táptalajban tenyésztettük. Miután a sejteket összegyűjtötttük, a sejtüledéket üveggyöngyökkel roncsoltuk, ehhez 0,5 % végkoncentrációig Triton-X-100-t adtunk, és a kapott sejtlizátumot CRPV L1 és L2 expresszálódására nézve immunobiot analízissel vizsgáltuk. 40 pg teljes sejtproteint tartalmazó mintát 12 %-os TrisGlicin-géleken (Novex), redukáló és denaturáló körülmények között elektroforetizáltunk, és elektroblot-eljárással PVDF-szűrőkre (Novex) vittünk át. A CRPV L1 és L2 proteineket első ellenanyagként nyúlban termelt poliklonális antiLl- vagy anti-L2-antiszérumok alkalmazásával (amelyeket Dr. Jones Kreider bocsátott rendelkezésünre; Hershey Medical Center), majd második ellenanyagként torma-peroxidázzal konjugált protein-A (Amersham, Inc.) alkalmazásával mutattuk

ki. A szűrőket kemilumineszcens ECL™ Detection Kit (Amersham, Inc.) alkalmazásával értékeltük. Valamennyi, az

L1 expressziós plazmidot hordozó mintában egy 55-61 kDa L1 proteincsíkot tudtunk kimutatni, és valamennyi, L2 expreszsziós plazmidot hordozó élesztőklónból származó mintában egy körülbelül 90 kDa L2-proteincsíkot tudtunk kimutatni.

Az L1 expressziós plazmidot hordozó élesztőkiónokból származó mintákban anti-L2-antiszérum alkalmazásával, illetve fordított esetben, nem kaptunk jelet.

12. példa

A. Rekombináns CRPV L1 kapszidprotein tisztítása Valamennyi lépést 4 °C-on végeztük, hacsak másképp nem adjuk meg. A -70 °C-on tárolt sejteket felolvasztottuk, és a mintával megegyező térfogatú Ll-pufferben (20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCl; 1,7 mmól/1 EDTA) szuszpendáltuk. Az elegyhez PMSF és Pepstatin-A proteázinhibitorokat adtunk 2 mmól/1, illetve 1,7 pmól/l végkoncentrációig. A sejteket microfluidizer-készülékben 10 passzálással lizáltuk. A lizátumot 5000 x g-n 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk. A felülúszót Llpufferben 45 %-os (tömeg/térfogat) szacharózpárnára rétegeztük, és az L1 proteint 100 000 x g-n 4 órán át végzett centrifugálással ülepítettük. Az üledéket 1/10 térfogatú Llpufferben szuszpendáltuk, és 5000 x g-n 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk. A felülúszóhoz 0,01 % (térfogat/térfogat) végkoncentrációban Tween-80-at adtunk, majd a felülúszót szobahőmérsékleten, egy 1700 ml térfogatú (5 cm átmérőjű), Sephacryl-S-1000 töltetet tartamazó oszlo31 pon (Pharmacia) molekulaszűrő-kromatográfiával frakcionáltuk. Az oszlopon futtató pufferként az alábbi összetételű puffért alkalmaztuk: 10 mmól/1 nátrium-foszfát (pH=7,2), 150 mmól/1 NaCI, 0,01 % (térfogat/térfogat) Tween-80. Az immunodot-blot-eljárás szerint immunreaktiv anyagot tartalmazó frakciókat elegyítettük, és ultraszűréssel, keverős Amicon-cellákban, 76 mm átmérőjű lapos YM-100 szűrővel (100 000 MWCO) 1/6 térfogatra koncentráltuk. A terméket 0,22 pm Millex-GV membránon (Millipore) sterilre szűrtük. A tisztított CRPV Ll kapszidproteint 100 pg/ml koncentrációnál alumínium-hidroxidra adszorbeáltattuk.

B. A rekombináns CRPV Ll kapszidprotein jellemzése

A végső termék azonosítását Western-blot-eljárással és N-terminális szekvencia-analízissel végeztük. A tisztaságot SDS/PAGE-vizsgálattal, Coomassie- és ezüst-festéssel, valamint Solution Sieving Capillary Electrophoresis (folyadékszűrős kapilláris elektroforézis, SSCE) eljárással, 215 nm-es hullámhosszon történő méréssel határoztuk meg. A készítmény SSCE eljárás szerint Ll proteinre nézve 75 %-os tisztaságúnak bizonyult.

13. példa

Rekombináns CRPV L2 kapszidprotein tisztítása

Valamennyi lépést 4 °C-on végeztük, hacsak másképp nem adjuk meg. A -70 °C-on tárolt sejteket felolvasztottuk, és a mintával megegyező térfogatú Ll-pufferben (20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCI; 1,7 mmól/1 EDTA) szuszpendáltunk. Az elegyhez PMSF és Pepstatin-A proteáz32 inhibitorokat adtunk 2 mmól/1, illetve 1,7 pmól/l végkoncentrációig. A sejteket microfluidizer-készülékben végzett 10 passzálásal lizáltuk. A lizátumot 5000 x g-n 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk. A felülúszót Llpufferben 45 %-os (tömeg/térfogat) szacharózpárnára rétegeztük, és az L2 proteint 100 000 x g-n 4 órán át végzett centrifugálással ülepítettük. Az üledéket 1/10 térfogat Llpufferben szuszpendáltuk és 5000 x g-n 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk. A felülúszóhoz 0,01 % (térfogat/térfogat) végkoncentrációban Tween-80-at adtunk, majd a felülúszót szobahőmérsékleten, egy 1700 ml térfogatú (5 cm átmérőjű), Sephacryl-S-1000 töltetet tartamazó oszlopon (Pharmacia) molekulaszűrő-kromatográfiával frakcionáltuk. Az oszlopon futtató pufferként az alábbi összetételű puffért alkalmaztuk: 10 mmól/1 nátrium-foszfát (pH=7,2), 150 mmól/1 NaCl, 0,01 % (térfogat/térfogat) Tween-80. Az immunodot-blot-eljárás szerint immunreaktív anyagot tartalmazó frakciókat elegyítettük. Az összegyűjtött frakciókat SDS/PAGE (ezüst-festéses) eljárással és Western-blot-eljárással analizáltuk.

14. példa

A. Rekombináns CRPV Ll kapszidprotein tisztítása (1. eljárás)

A -70 °C-on tárolt sejteket felolvasztottuk, és a mintával megegyező térfogatú roncsoló-pufferben (20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCl; 1,7 mmól/1 EDTA) szuszpendáltunk. Az elegyhez PMSF és Pepstatin-A proteázinhibitorokat adtunk 2 mmól/1, illetve 1,7 pmól/l végkoncent33

rációig. A sejteket microfluidizer-készülékben végzett 10 passzálásal lizáltuk. A lizátumot 5000 x g-n 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk. A felülúszót Llpufferben, 5 cm-es, 45 %-os (tömeg/térfogat) szacharózpárnára rétegeztük, és az L1 proteint 100 000 x g-n 4 órán át végzett centrifugálással ülepítettük. Az üledéket 1/10 térfogatú Ll-pufferben szuszpendáltuk. A szuszpendált üledéket 5000 x g-n 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk. A felülúszóhoz 0,01 % végkoncentrációban Tween-80-at adtunk, majd a felülúszót szobahőmérsékleten, egy 1700 ml térfogatú (5 cm átmérőjű), Sephacryl-S-1000 töltetet tartamazó oszlopon (Pharmacia) molekulaszűrő-kromatográfiával frakcionáltuk. Az oszlopon futtatópufférként az alábbi összetételű puffért alkalmaztuk: 10 mmól/l nátrium-foszfát (pH=7,2), 150 mmól/l NaCl, 0,01 % Tween-80. Az immunodotblot-eljárás szerint immunreaktív anyagot tartalmazó frakciókat elegyítettük, és ultraszűréssel, keverés Amicon-cellákban, 76 mm átmérőjű lapos YM-100 szűrővel (100 000 MWCO) 1/6 térfogatra koncentráltuk. A terméket 0,22 pm áteresztőképességű Millex-GV-membránon (Millipore) sterilre szűrtük.

B. A rekombináns CRPV L1 kapszidprotein jellemzése

A végső termék azonosítását Western-blot-eljárással és N-terminális szekvencia-analízissel végeztük. A tisztaságot SDS/PAGE-vizsgálattal, Coomassie- és ezüst-festéssel, valamint Solution Sieving Capillary Electrophoresis (folyadékszűrős kapilláris-elektroforézis, SSCE) eljárással, 215 nm-es hullámhosszon történő méréssel határoztuk meg. A készítmény SSCE eljárás szerint L1 proteinre nézve 75 %-os tisztaságúnak bizonyult. Elektronmikroszkópos vizsgálattal a mintában 50-55 nm átmérőjű VLP-k voltak kimutathatóak.

C. Analitikai molekulaszűrő HPLC

A VLP-k kimutatása céljából mintákat méretük szerint, molekulaszűrő-kromatográfiával frakcionáltunk. A kromatográfiát egy Perkin-Elmer Series 410 Biopump HPLC készülékkel, 200 mikroliteres injekciós hurokkal felszerelt ISS-100 autoinjektorral végeztük. A vizsgálathoz egy 7,5x600 nm méretű TSK-gel G5000PW oszlopot használtunk (TOSOHAAS, Montgomeryville, PA) . A protein oszlopról történő el’uálódását egy Perkin-Elmer LC-235 típusú diódasoros dekektorral, a 280 nm-es hullámhosszon történő fényelnyelés meghatározásával követtük. A mozgófázis összetétele a következő volt: 0,5 mól/1 NaCl; 10 mmól/1 nátrium-foszfát-puffer (pH=7,2). Az átfolyási sebesség 0,5 ml/perc volt, és 1 ml térfogatú frakciókat gyűjtöttünk. Az oszlopot a Sigma cég által forgalmazott protein-standardokkal, valamint rekombináns hepatitis-B felületi antigénnel (Recombivax, Merck & Co., West Point, PA) kalibráltuk. Az elúció során összegyűjtött frakciókban az antigéneket immunodot-blot-eljárással mutattuk ki.

D, Immunodot-blot-eljárás

A frakciókból 10-10 mikroliter térfogatú mintát előzőleg megnedvesített és nedves itatóspapírra helyezett PVDF-mebráncslkokra vittünk fel (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA). A mintákat hagytuk beszívódni a membránba, majd a membránokat Blocking Solution oldatba [blokkoló oldatba: 0,15 mól/1 NaCl, 02 % (tömeg/térfogat) nátrium-azid, és 0,01 mól/1 nátrium-foszfát (pH=7,2) összetételű pufferben feloldott 5 % (tömeg/térfogat) zsírtalan szárított tejpor] helyeztük, majd szobahőmérsékleten, óvatos mozgatás mellett, legalább három órán át inkubáltuk. Ekkor a blokkoló oldatot leöntöttük, és első ellenanyagot tartalmazó oldatra cseréltük.

Az alkalmazott első ellenanyag a kimutatandó antigéntől függően változott:

A CRPV Ll-t nyúlban termelt, késői válasz anti-CRPVszérummal (Biodesign International, Kennebunk, ME) történő érintkeztetéssel mutattuk ki. A CRPV L2-t nyúlban termelt, anti-CRPV-L2-szérummal mutattuk ki. A HPV6a Ll-t MAB-837 monoklonális ellenanyaggal (Chemical International, Inc. Temecula, CA) mutattuk ki. A HPV6a L2-t egérben, HPV6a L2trpE fúziós peptiddel szemben termelt szérummal határoztuk meg.

Az immunkomplexeket szokásos módszerekkel tettük láthatóvá, alkalikus foszfatázzal konjugált második ellenanyag és NBT/BCIP kromogén szubsztrát alkalmazásával.

E. Solution Sieving Capillary Electrophoresis (folyadékszűrős kapilláris-elektroforézis, SSCE)

CRPV VLP-ket tartalmazó mintákat (körülbelül

0,2 mg/ml) 15 percig 100 °C-ra hevítettünk, 1 % 2-merkaptoetanolt és 1 % (tömeg/térfogat) SDS-t tartalmazó oldatban. A mintákat elektrokinetikus úton, mellitsav referenciamarkerrel együtt 42 cm (a detektorig 22 cm) hosszú, 0,05 mm átmérőjű szilika-fúzionált kapillárisra vittük fel, amelyet

előzőleg 10-szeres beltérfogatnak megfelelő 0,1 n NaOH-val, vízzel és ProSort szűrő reagenssel (Applied Biosystems, Foster City, CA) ekvilibráltunk. Az elválasztáshoz 300 volt/cm feszültséget alkalmaztunk, egy Applied Biosystems Model 270A-HT-CE készülékben. A minta elúcióját 215 nm-en mért fényelnyelés alapján határoztuk meg, és az adatokat Nelson Turbochrom 3 programcsomag felhasználásával gyűjtöttük össze.

F. Vakcina előállítása rekombináns CRPV L1 kapszidproteinbői

A tisztított CRPV L1 kapszidproteint 100 μ/ml koncentráció mellett Al(OH)₃-ra adszorbeáltattunk.

15. példa

Védettség létrehozása CRPV által kiváltott papillóma kialakulásával szemben, élesztő eredetű CRPV L1

VLP-kkel végzett vakcinázással

Öt New Zeeland White nyulat immunizáltunk izomba adva, 135 mg alumínium-hidroxidra adszorbeált L1 VLP-vel (75 %-ban tiszta, lásd a 17. példát) vagy negatív kontrollként 100 mg, alumínium-hidroxidra adszorbeált rekombináns hepatitisz-B felületi antigénnel (99 %-ban tiszta). Az állatok nyolc hét alatt még két emlékeztető oltásban részesültek, majd 10 nappal az utolsó emlékeztető oltást követően CRPV-vel kísérletesen fertőztük őket. Az immunizálást megelőzően, valamennyi emlékeztető oltás alkalmával és a kísérletes fertőzést megelőzően vett szérumokat L1 VLPspecifikus ELISA-eljárással analizáltuk. Az élesztőben expresszált CRPV L1 VLP-kkel szemben létrejött szérum-ellen37 anyagválasz meghatározására indirekt ELISA-eljárást alkalmaztunk. Az ELISA-eljárásban antigénként rekombináns baculovírus felhasználásával rovarsejtekben expresszált CRPV Ll

VLP-ket alkalmaztunk, lényegében Christensen és munkatársai által leírtak szerint [J. Virol. 64, 3151. (1990); J. Gén.

Virol. 75, 2271. (1994)]. Második ellenanyagként kecskében termelt, alkalikus foszfatázzal konjugált anti-nyúl IgG-t, szubsztrátként p-nitrofenil-foszfátot alkalmaztunk (Kirkegaard and Perry Labs, Inc.). A fényelnyelést 405 nm-en mértük. A titert határhígításos módszerrel határoztuk meg (1:100 hígításból kiindulva, háromszoros léptékű szérumhígítások alkalmazásával); pozitívnak tekintettük a mintát, ha az Ll-specifikus fényelnyelés meghaladta a nyúl preimmunszérum-nak (az immunizálás előtt levett szérumnak) a standard eltérés kétszeresével növelt átlagos fényelnyelését. A pontos titereket a fenti adatok alapján számítottuk, a SOFTmax 2.3-programváltozat alkalmazásával (Molecular Devices Inc., Menlo Park, CA).

Anti-Ll-VLP-ellenanyagtiterek az első immunizálást követően négy héttel kimutathatóak voltak, és mindegyik további emlékeztető oltással emelkedtek. A kontroll állatok negatívnak bizonyultak. A CRPV-vel (1:2 arányban vagy 1:12 arányban hígított vírustenyészettel) végzett kísérletes fertőzést követően hat héttel a vakcinázott állatok 15 helyből 15 helyen szemölcs-mentesek voltak, míg a kontroll állatok esetében 15 helyből 12 helyen (1:2 arányban hígított vírus alkalmazása esetén) vagy 15 helyből 9 helyen (1:12 arányban hígított vírus alkalmazása esetén) szemölcsképződés

volt megfigyelhető. 15 hét elteltével, a vakcinázott állatok még mindig szemölcs-mentesek voltak.

Vírusneutralizációs vizsgálatokat végeztünk [lényegében Christensen és munkatársai eljárása szerint: Virology 181, 572. (1991)] oly módon, hogy nyúlszérumokat elegyítettünk CRPV-vel, majd a kezelt CRPV-vel nyulakat kísérletesen fertőztünk. Neutralizáló ellenanyagok jelenlétét abban az esetben állapítottuk meg, ha teljes vírusneutralizáció történt (azaz 3 helyből 3 negatív volt szemölcsképződésre nézve). Öt vakcinázott állatból és öt kontroll állatból származó szérumot analizáltunk. Egyetlen CRPV Ll VLP dózist követően gyűjtött szérumok a nyulak 80 %-ában (4/5) a hígítatlan vírus teljes neutralizációját eredményező ellenanyagokat tartalmaztak. Két-három CRPV Ll VLP dózist követően a nyulak 100 %-a (5/5) rendelkezett vírusneutralizáló ellenanyagokkal. A kontroll szérumok egyáltalán nem rendelkeztek vírusneutralizáló aktivitással. A végső titertől függően, kiválasztott vakcinázott állatok szérumai 10-1000-szeres hígítás mellett még 100 %-ban neutralizáló hatással rendelkeztek.

Annak vizsgálata céljából, hogy a neutralizáló ellenanyag válasz natív CRPV Ll VLP-re specifikus volt-e, egy immunszérumot kiválasztottunk, és azt natív vagy denaturált, élesztő eredetű CRPV Ll VLP-vel fedett nitrocellulóz négyzetekkel inkubáltuk. Nitrocellulóz négyzeteket (1 cm²) natív vagy denaturált (redukált és 8 mól/1 karbamidban oldott jódecetsavban alkilált), élesztőben expresszált CRPV Ll VLP-vel fedtünk. Kontrollként natív vagy denaturált élesztő-extrák39

tumokat alkalmaztunk. A nitrocellulóz négyzetekkel 8-14 órán át, 4 °C-on nyúl immunszérumot inkubáltunk sorozatban négy alkalommal, mielőtt azt a fentiek szerint, vírusneutralizációs vizsgálatban teszteltük. Csak a natív CRPV L1 VLP-k voltak képesek a CRPV-neutralizációért felelős ellenanyagok abszorbeálására, míg a denaturált vagy kontroll élesztőproteinek nem abszorbeálták ezeket az ellenanyagokat. Ezenfelül, a natív CRPV L1 VLP-k eltávolították a rovarsejtekben expresszált CRPV L1 VLP-kkel szemben kimutatható ELISAreaktivitást is (az adatokat nem tüntettük fel).

16. példa

Vektor előállítása CRPV L1/L2 proteinek egyetlen plazmidról történő együttes expresszálására A pSP72-CRPV-Ll-plazmidot (pl2930-314-4-l) Bglll enzimmel emésztettük, és a CRPV L1 ORF-t (open reading frame: ORF, nyitott leolvasási keret), valamint egy élesztő eredetű, 5'-végi nem-transzlálódó vezetőszekvenciát hordozó 1,5 kbp SglII-fragmentumot gélen tisztítottunk. A pl2930323-2-3 plazmidot (pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV-L2) BamHI-enzimmel emésztettük, amely a GÁLI promoter és az ADH1 transzkripciós terminátor szekvencia között hasít. A lineáris vektorfragmentumot gélen tisztítottuk, majd az előzőekben ismertetett CRPV L1 BglII-fragmentummal ligáltuk, így kaptuk a pl2930-366-l-2 plazmidot (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2). Az így nyert plazmid tartalmazta a CRPV L1 ORF-t a GÁLI promoter szabályozása alatt, valamint a CRPV L2 ORF-t a GAL10 promoter szabályozása alatt.

17. példa

Vektor előállítása CRPV L1/L2 proteinek két plazmádról történő együttes expresszálására

Az L2 gént tartalmazó pUC18-GALlp-GAL10p vektort Sphl enzimmel emésztettük, és az ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt expressziós kazettát hordozó 2,9 kbp fragmentumot gélen tisztítottuk, majd T4-DNS-polimerázzal tompavégűvé alakítottuk. Az YEp24 élesztő ingázóvektort [Botstein és mtsai.: Gene 8_, 17. (1979)] BamHI enzimmel emésztettük, T4-DNS-polimerázzal tompavégűvé alakítottuk, borjú bélből izolált alkalikus foszfatázzal kezeltük, majd a fenti, tompavégűvé alakított L2 expressziós kazettával ligáltuk, így kaptuk a pl594 plazmidot.

18. példa

A CRPV Ll és L2 expresszálása élesztőben

A pl2930-366-1-2 plazmáddal (pCl/l-GALl/10pCRPV/L1+L2) S. cerevisiae 1569 és BJ5462 törzset transzformáltunk (egy plazmidos rendszer), a kapott transzformánsokat leucin-mentes szintetikus agartáptalajon szelektáltuk. Egy párhuzamos kísérletben, az 1569 törzset a pCl/l-GAL10pCRPV-L1 expressziós vektorral (pl2930-323-6-l), valamint az YEp24-GAL10p-L2 expressziós vektorral (pl594) transzformáltuk (két plazmidos rendszer) , majd az így kapott, mindkét vektort tartalmazó transzformánsokat leucin-mentes és uracil-mentes szintetikus agartáptalajon szelektáltuk. Mind az egy plazmidos rendszerből, mind a két plazmidos rendszerből származó izolált kiónokat 48-72 órán át, 30 °C-on, 2 % galaktózt tartalmazó komplex YEHD táptalajban tenyésztettük.

Miután a sejteket összegyűjtöttük, a sejtüledéket üveggyöngyökkel roncsoltuk. Az elegyhez 0,5 % végkoncentrációig Triton-X-100-at adtunk, és a kapott sejtlizátumokat CRPV Ll és L2 expresszálódására nézve, immunoblot-analízissel vizsgáltuk. 50 pg teljes sejtproteint tartalmazó mintákat 8-16 %-os Tris-Glicin gradiensgéleken (Novex), redukáló és denaturáló körülmények mellett elektroforetizáltunk, és elektroblot-eljárással PVDF-szűrőkre (Novex) vittünk át. A CRPV Ll és L2 proteineket első ellenanyagként nyúlban termelt poliklonális anti-Ll- vagy anti-L2-antiszérumok alkalmazásával (amelyeket Dr. Jones Kreider bocsátott rendelkezésünre; Hershey Medical Center), majd második ellenanyagként tormaperoxidázzal konjugált protein-A (Amersham, Inc.) alkalmazásával mutattuk ki. A szűrőket kemilumineszcens ECL™ Detection Kit (Amersham, Inc.) alkalmazásával értékeltük. Valamennyi, az L1+L2 expressziós plazmidot hordozó élesztőklónból származó mintában egy 5561 kDa Ll proteincsikot, valamint egy körülbelül 90 kDa L2 proteincsíkot tudtunk kimutatni. Az Ll-t kódoló expressziós plazmidot hordozó élesztőkiónokból származó mintákban L2 proteinnek megfelelő jelet nem kaptunk. A csak L2 expreszsziós plazmidot hordozó sejtekből származó mintákban Ll proteinnek megfelelő jelet nem sikerült kimutatnunk.

19. példa

CRPV Ll és CRPV (L1+L2) VLP-k tisztítása EM-vizsgálat (elektromikroszkópos vizsgálat) céljára Az élesztőben expresszált CRPV Ll, valamint és CRPV Ll és L2 proteineket részlegesen tisztítottuk és koncentráltuk elektronmikroszkópos (EM) vizsgálat céljára. 1-1,5 liter, 2 % galaktózt tartalmazó YEHD táptalajt oltottunk be a pl2930-366-l-2-jélű (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2) , (L1 + L2) proteineket kódoló koexpressziós vektorral transzformált S. cerevisiae 1569, illetve BJ5462 törzsekkel, és azokat 48-72 órán át, 30 °C-on tenyésztettük. Egy párhuzamos kísérletben, GALlOp-CRPV-Ll jelű expressziós vektorral (pl2930-323-6-1), valamint YEp24-GAL10p-L2 plazmiddal (pl594) kotranszformált 1569 jelű sejteket hasonló módon tenyésztettünk. A sejteket összegyűjtöttük, és a sejtüledéket -70 °C-on fagyasztva tároltuk. Valamennyi ezt követő lépést 4 °C-on végeztünk. A sejtüledékeket felolvasztottuk, és a mintával megegyező térfogatú Ll-pufferben (20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCl; 1,7 mmól/1 EDTA) szuszpendáltuk. Az elegyhez PMSF és Pepstatin-A proteázinhibitorokat adtunk 2 mmól/1, illetve 1,7 pmól/l végkoncentrációig. A sejteket microfluidizer-készülékben, 3-5 passzálással lizáltuk. A lizátumot 5000 x g-n, 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk. A felülúszót Ll-pufferben 5 cm-es, 45 %-os (térfogat/térfogat) szacharózpárnára rétegeztük, és az Ll, L2, illetve Ll és L2 proteineket 100 000 x g-n, 4 órán át végzett centrifugálással ülepítettük. Az üledéket 1/10 térfogatú Ll-pufferben szuszpendáltuk. A szuszpendált üledéket 5000 x g-nél, 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk.

Az EM-analízishez (Structure Probe, West Chester, PA) valamennyi mintából egy adott térfogatot 0,07 mm nyílásméretű, szénnel fedett rézrácsra vittünk fel. A rácsra másodpercre, egy csepp 2 %-os foszfor-wolframsavat (PTA) (pH=7,0) cseppentettünk. A rácsokat levegőn hagytuk megszáradni, mielőtt azokat TEM-vizsgálatnak vetettük alá. Valamennyi mikroszkópos vizsgálatot JEOL-lOOCX-típusú transzmissziós elektronmikroszkóp (JEOL USA, Inc.) alkalmazásával végeztünk, 100 kV gyorsító feszültség mellett. A mikroszkópos vizsgálat 100 000-szeres nagyítást eredményezett.

Valamennyi, a CRPV-L1 expressziós plazmidot, illetve CRPV-(L1+L2) koexpressziós plazmidot tartalmazó élesztőmintában 50-55 nm-es mérettartományba eső VLP-k voltak megfigyelhetőek. Az élesztő kontroll mintákban és csak az L2 expressziós plazmidot tartalmazó élesztőmintákban VLP-k nem voltak kimutathatóak (7., 8. és 9. ábrák).

20. példa

Rekombináns CRPV Ll kapszidprotein tisztítása (2. eljárás)

Valamennyi lépést 4 °C-on végeztük, hacsak másképp nem adjuk meg. A -70 °C-on tárolt sejteket felolvasztottuk, és a mintával megegyező térfogatú roncsoló-pufferben (Breaking buffer; 20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCl;

1,7 mmól/1 EDTA) szuszpendáltuk. Az elegyhez PMSF és Pepstatin-A proteázinhibitorokat adtunk 2 mmól/1, illetve

1,7 pmól/l végkoncentrációig. A sejteket BioNeb Cell Disruptor rendszerrel (Glas-Col Apparátus Co., Terra Haute, IN) lizáltuk. A lizátumot 5000 x g-n, 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk.

A felülúszót Ll-pufferben, 5 cm-es, 45 %-os (tömeg/térfogat) szacharózpárnára rétegeztük, és az Ll pro44 teint 100 000 χ g-n, 4 órán át végzett centrifugálással ülepítettük. Az üledéket 1/10 térfogatú Ll-pufferben szuszpendáltuk. A szuszpendált üledéket 5000 x g-n, 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk.

A felülúszót 1:5 arányban PBS-sel hígítottuk, majd Sorvall-SA-600 rotorban, 6500 ford/perc mellett, 10 percig, 4 °C-on végzett centrifugálással feltisztítottuk. A felülúszót 0,22 mikrométeres fecskendőszűrőn átszűrtük, és anioncserélő kromatográfiával frakcionáltuk.

Az anioncserélő kromatográfiát Perkin-Elmer Series410 Biopump HPLC készülékkel végeztük, 5 ml-es injekciós hurok alkalmazásával. Kromatográfiás közegként Fractogel EMF TMAE-650 (S) típusú 25-40 mikrométeres töltetet alkalmaztunk (EM Separations, Gibbstown, NJ) , egy 150 mm x 10 mm méretű üvegoszlopban. A protein oszlopról történő eluálódását egy Perkin-Elmer LC-235 típusú, diódasoros dekektorral, a 280 nm-es hullámhosszon történő fényelnyelés meghatározásával követtük. Az oszlopot előzetesen az alábbi összetételű pufferrel ekvilibráltuk: 0,15 mól/1 NaCI; 0,01 mól/1 nátrium-foszfát-puffér (pH=7,2) (A-puffer). Az oszlopot 0,75 ml/perc áfolyási sebesség mellett futtattuk. A mintát felvittük az oszlopra, majd a nem-kötődött anyag kimosása céljából az oszlopot A-pufferrel mostuk. A kötődött anyagot az alábbi lineáris nátrium-klorid koncentráció-gradienssel eluáltuk: 5 percen át 0,15-0,65 mól/1, majd 30 percen át 0,65-1,15 mól/1 lineáris gradiens. Az elúció során összegyűjtött frakciókban az antigént immunodot-blot-eljárással mutattuk ki. Az immunoreaktív anyagot tartalmazó frakciókat (azaz, a 0,81-1,05 mól/1 NaCl között eluálódó frakciókat) elegyítettük.

Az összegyűjtött frakciókat Macrosep centrifugális koncentráló eszközökkel (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) 1/5 térfogatúra koncentráltuk.

A koncentrátumot Sephacryl-S-1000-SF töltetet tartamazó, 87 cm x 27 mm méretű oszlopon (Pharmacia, Piscataway, NJ) molekulaszűrő kromatográfiával frakcionáltuk. Az oszlopot 2,5 ml/perc áfolyási sebesség mellett futtattuk. A protein oszlopról történő eluálódását a 280 nm-es hullámhosszon történő fényelnyelés meghatározásával követtük. Az antigént immunoblot-eljárással mutattuk ki.

Az immunreaktív anyagot tartalmazó frakciókat összesítettük, és ultraszűréssel, keverés Amicon-cellákban (Amicon, Inc., Beverly, MA), 43 mm átmérőjű lapos YM-100 szűrővel (Amicon, Inc., Beverly, MA), nitrogén alatt, 70 kPa nyomás mellett koncentráltuk.

A végső termék azonosítását SDS/PAGE eljárással, Coomassie-festéssel, valamint Solution Sieving Capillary Electrophoresis (folyadékszűrős kapilláris-elektroforézis, SSCE) eljárással jellemeztük. A 2. eljárásból származó végső termék SSCE eljárás szerint 88 %-os tisztaságúnak bizonyult.

21. példa

Rekombináns CRPV LI kapszidprotein tisztítása (3. eljárás)

Valamennyi lépést 4 °C-on végeztük, hacsak másképp nem adjuk meg.

A -70 °C-on tárolt sejteket felolvasztottuk, és a min46 tával megegyező térfogatú roncsoló-pufferben (Breaking buffer; 20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCI;

A felülúszót Ll-pufferben, 5 cm-es, 45 %-os (tömeg/térfogat) szacharózpárnára rétegeztük, és az Ll proteint 100 000 x g-n, 4 órán át végzett centrifugálással ülepítettük. Az üledéket 1/10 térfogatú Ll-pufferben szuszpendáltuk. A szuszpendált üledéket 5000 x g-n, 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk.

A felülúszót 1/2 térfogatú kloroformmal extraháltuk. A vizes réteget eltávolítottuk, és 12 000 ford/perc mellett, Beckman mikrocentrifugában, 5 perc alatt, szobahőmérsékleten feltisztítottuk.

A felülúszót 1:5 arányban PBS-ben hígítottuk, és Sorvall-SA-600 rotorban, 6500 ford/perc mellett, 10 percig, 4 °C-on végzett centrifugálással újból feltisztítottuk. A felülúszót 0,22 mikrométeres fecskendőszűrőn átszűrtük, és anioncserélő kromatográfiával frakcionáltuk.

Az anioncserélő kromatográfiát Perkin-Elmer Series410 Biopump HPLC készülékkel végeztük, 5 ml térfogatú injekciós hurok alkalmazásával. Kromatográfiás közegként Fractogel EMF TMAE-650 (S) típusú 25-40 mikrométeres töltetet alkalmaztunk (EM Separations, Gibbstown, NJ) , egy

150 mm χ 10 mm méretű üvegoszlopban. A protein oszlopról történő eluálódását egy Perkin-Elmer LC-235 típusú diódasoros dekektorral, a 280 nm-es hullámhosszon történő fényelnyelés meghatározásávalal követtük. Az oszlopot előzetesen az alábbi összetételű pufferrel ekvilibráltuk: 0,15 mól/1 NaCl; 0,01 mól/1 nátrium-foszfát-puffér (pH=7,2) (A-puffer). Az oszlopot 0,75 ml/perc áfolyási sebesség mellett futtattuk. A mintát felvittük az oszlopra, majd a nem-kötődött anyag kimosása céljából az oszlopot A-pufferrel mostuk. A kötődött anyagot az alábbi lineáris nátrium-klorid koncentráció-gradienssel eluáltuk: 5 percen át 0,15-0,65 mól/1, majd 30 percen át 0,65-1,15 mól/1 lineáris gradiens. Az elúció során összegyűjtött frakciókban az antigént immunodotblot-eljárással mutattuk ki. Az immunreaktív anyagot tartalmazó frakciókat (azaz a 0,81-1,05 mól/1 NaCl között eluálódott frakciókat) elegyítettük.

Az immunreaktív anyagot tartalmazó frakciókat elegyítettük, és keverős cellában (Amicon, Inc., Beverly, MA),

mm átmérőjű lapos YM-100 szűrővel (Amicon, Inc., Beverly, MA) , nitrogén alatt, 70 kPa nyomás mellett ultraszűréssel koncentráltuk.

A végtermék azonosítását SDS/PAGE eljárással, Coomassie-festéssel, valamint Solution Sieving Capillary Electrophoresis (folyadékszűrős kapilláris-elektroforézis, SSCE) eljárással jellemeztük. A 3. eljárásból származó végső termék SSCE eljárás szerint 95 %-os tisztaságúnak bizonyult.

22. példa

CRPV LI és HPV6a LI (1644 számú törzs) expresszálása dúsított közegben és kémiailag meghatározott táptalajban

A fenti törzsekből származó inokulumot a fentiek szerint, leucin-mentes szintetikus táptalajban állítottuk elő, majd rázatott palackos tenyészetekbe oltottuk. Az alkalmazott rázópalackokat magas levegőztetési kapacitásra állítottuk be (70 ml folyadék 300 ml térfogatú palack esetében, Tunair Labware), és a tápfolyadékot 0,5 ml/1 habzásgátlóval (UCON LB-625, Union Carbide) egészítettük ki. A dúsított komplex tápfolyadék összetétele (egy literre számítva) a következő volt: 40 g Difco élesztőkivonat; 20 g Sheffield HySoy pepton; 30 g glükóz; 50 g galaktóz; a táptalajt pH-ját a sterilizációt megelőzően 5,3-ra állítottuk be. A vegyileg meghatározott tápfolyadék összetétele hasonló volt az Oura által leírt táptalajéhoz [Biotechnoi. Bioengineer. 16, 1197. (1974)], azzal az eltéréssel, hogy (literenként) az alábbiakkal egészítettük ki: 0,1 g kolin-Cl; 0,4 g adenin; nitrogénforrásként 30 g mononátrium-glutamát; 0,2 g uracil;

g glükóz; 40 g galaktóz. A palackokat 3 ml inokulummal oltottuk be, majd 66 órán át, 28 °C-on, 250 ford/perc mellett, körkörös rázókészüléken inkubáltuk. A palackokból időközcinként mintákat vettünk, az expresszió anti-CRPV-Ll- és anti-HPV-6a-Ll-antiszérumok alkalmazásával, immunobiotanalízíssel történő igazolása céljából.

23. példa

A HPV6a genom klónozása

Súlyos condyloma acuminatum (hegelyes függöly) diagnózissal kezelt betegből származó szövetet, (amelyet Dr. Darron Brown-tól kaptunk, Indiana University School of Medicine), restrikciós enzimekkel végzett emésztésekkel és polimeráz-láncreakciós (PCR) eljárással tipizáltunk, és kimutattuk, hogy az HPV6a típust tartalmaz. A szövetmintából DNS-t extraháltunk, és ífíndlll enzimmel emésztettük. Alacsony olvadáspontú, 0,8 %-os preparatív agarózgélen végzett, méret alapján történő frakcionálást követően, a 8 kb méretnek megfelelő régiót a gélből kivágtuk, és az agarózt Gelase^-enzimmel emésztettük (Epicentre Technologies, Inc.).

A mintát Hindin enzimmel emésztett és defoszforliezett pUC18 vektorral ligáltuk (Pharmacia, Inc.). Kompetens E. coli DH5 sejtek (BRL) transzformálását követően, a plazmid génkönyvtárat a HPV6a L1 génnel komplementer, ³²P-jelölt oligonukleotid alkalmazásával HPV6a-pozitív kiónokra nézve szűrtük. A 8 kb HPV6a genomot tartalmazó pUC18 vektort izoláltuk, majd restrikciós enzimekkel, valamint Southern-blotanalízissel jellemeztük. A teljes, 8 kb méretű HPV6a genomot ABI típusú automatizált szekvenátorral (#373A) szekvenáltuk, a gyártó utasításai szerint eljárva.

Egy 25 éves, szült női betegről nagy méretű, vulváris condyloma acuminatum elváltozást távolítottunk el. Az elváltozás egy részét folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd egy Braun mikrodismembrator II típusú készülékkel (B.

Braun Instruments, Melsungen, Németország) feldolgoztuk. Az így kapott anyagot 0,6 % (tömeg/térfogat) nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS-sel) szolubilizáltuk, proteináz-K-val (50 pg/ml) kezeltük, és fenol/kloroform/izoamil-alkohol eleggyel extraháltuk. A DNS-t etanollal kicsaptuk, és UVspektrofotométeres eljárással annak mennyiségét meghatároztuk. A nagy molekulatömegű DNS jelenlétét agarózgél-elektroforézissel, majd etidium-bromiddal végzett festéssel igazoltuk .

A HPV DNS típusát a ViraType Plus néven forgalmazott (Digene Diagnostics, Beltsville, MD) hibridizációs vizsgálati készlettel határoztuk meg. A felhasznált HPV próbákat két csoportra osztottuk, amelyek összetétele az egyes típusoknak a genitális traktus malignus elváltozásaival történő kapcsolatán alapult. Az A-csoportba tartozó próbák az alacsony kockázatú, HPV6a, 11, 42, 43 és 44 típusokat tartalmazta, a B-próba a magas kockázatú, 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 és 56 típusokat tartalmazta. Össz-DNS-t PstI, BamHI és Hindin enzimekkel emésztettünk, majd a HPV-altípus meghatározása céljából, nagy mértékben sztringens (a hibridizáció szempontjából igen szigorú) feltételek mellett (Tm-15 °C) Southern-blot vizsgálatot végeztünk.

A teljes HPV6a-szekvencia meghatározása céljából, a

HPV6a közölt szekvenciája alapján szekvenáló láncindító oligonukleotidokat állítottunk elő. A 8,1 kbp méretű HPV6a genom mindkét szálát szekvenáltuk a didezoxi-láncterminációs eljárással, a PRISM™-reagenskészet és Applied Biosystems (ABI) automatizált szekvenátor (#373A) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint eljárva (ABI, Inc., Foster City, CA) . Azokban az esetekben, ahol a szensz és antiszensz szekvenciák nem feleltek meg egymásnak, további HPV6a-specifikus láncindító oligonukleotidokat szintetizáltunk, hogy a kérdéses régióban a szekvenálást mindkét irányban megismételjük, és egyértelmű eredményt kapjunk.

A HPV6a és HPV6b DNS-szekvenciája 97 %-os egyezést mutatott, 8010 bázispárból 229 bázipár eltérést találtunk. A HPVőb-szekvenciához képest a legjelentősebb eltéréseket a hosszú szabályozó régión (long control region LCR; 7205. nukleotidtól a 106. nukleotidig terjedő régión) belül találtuk. A HPV6a LCR-en belül néhány egyedi nukleotid eltéréstől eltekintve, a 7350. nukleotidnál egy 94 bázispárból álló inszertálódott szekvenciát, valamint a 7804. nukleotidnál egy másik, 19 bázispárból álló inszertálódott szekvenciát találtunk. A 7615. nukleotidnál hat bázispár deletálódott a HPV6a-genomjából.

24. példa

HPV6a L1 élesztő expressziós vektor előállítása

A HPV6a típusú DNS-t használtuk PCR-templátként. A

HPV6a L1 gént PCR eljárással amplifikáltuk, Vent-polimeráz (New England Biolabs, Inc.), 35 amplifikációs ciklus (94 °C-on 1 perc; 48 °C-on 1 perc; 72 °C-on 1 perc, 45 másod52 perc), és határoló BglII-helyekét tartalmazó (aláhúzással jelölt) alábbi láncindító oligonukleotidok alkalmazásával: szensz láncindító oligonukleotid: 5'-CTG AGA TCT CAC AAA

ACA AAA TGT GGC GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3' (11.

szekvencia);

antiszensz láncindító oligonukleotid: 5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3' (12. szekvencia).

A szensz láncindító oligonukleotid egy élesztő eredetű, nem-transzlálódó vezető szekvenciát iktat be a HPV6a Ll kezdő metionin kodonjától közvetlenül 5'-irányban, (mely kodont vastag betűvel jelöltük). Az 1,5 kb Ll PCRterméket BglII enzimmel emésztettük, és gélen tisztítottuk. A pCl/l-GAL expressziós vektort úgy állítottuk elő, hogy a kétirányú pUC18-GALlp-GALl0p promótervektorból izoláltuk az 1,4 kbp Sphl-fragmentumot, amely tartalmazta a pBM272 plazmidból származó divergens GAL1/GAL10 promótert (Dr. Mark Johnston jóvoltából, Washington University, St Louis), amelyet mindkét oldalon az élesztő ADH1 transzkripciós terminációs szekvencia egy-egy példánya határolt [Bennetzen J. L. és Hall B.D.: J. Bioi. Chem. 257, 3018. (1982)].

Az így kapott expressziós kazettában egy BamHI-hely található a GÁL2-promótér és az ADH1 transzkripciós terminátor szekvencia első példánya között, és egy Smal klónozó hely található a divergens GAL10 promóter és az ADH1 transzkripciós terminátor szekvencia második példánya között. A pCl/1 jelű élesztő ingázóvektort [Rosenberg és mtsai.: Natúré 312, 77. (1984)] Sphl enzimmel emésztettük, és a GÁL promótert tartalmazó 1,4 kbp Sphl-fragmentummal ligáltuk. Az • · · így kapott pCl/l-GAL vektort BamHI enzimmel linearizáltuk, amely a GÁLI promóter és az ADH1 transzkripciós terminátor szekvencia között hasít. A BamHI enzimmel emésztett pCl/1GAL vektort és a BglII enzimmel emésztett HPV6a Ll PCR-fragmentumot ligáltuk, és azzal E. coli DH5 sejteket (BRL) transzformáltunk. Olyan pCl/l-GAL plazmidot izoláltunk, amely tartalmazta a HPVöa Ll gént, és azt pl3173-357-6 plazmidnak neveztük. Az pl3173-357-6 plazmidban található Ll gént szekvenáltuk (ABI Sequencer, #373A), és arról kimutattuk, hogy azonos a pUC18-HPV6a-klónban található Ll génnel.

25. példa

A HPV6a Ll és-L2 élesztő expressziós vektor előállítása

A pl3173-357-6 plazmidot (pCl/l-GAL + HPV6a-Ll) Smal enzimmel emésztettük, amely a GAL10 promóter és az ADH1 transzkripciós terminátor szekvencia között hasít. Az 1,4 kbp HPV6a L2 gént PCR eljárással amplifikáltuk, templátként a pUC18-HPV6a DNS, Vent-polimeráz (New England Biolabs, Inc.), 10 PCR amplifikációs ciklus (94 °C-on 1 perc; 48 °Con 1 perc; 72 °C-on 1 perc, 45 másodperc) , és az alábbi, határoló Smal helyeket tartalmazó (aláhúzással jelölt) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával:

szensz láncindító oligonukleotid: 5'-TCC CCC GGG CAC AAA

ACA AAA TGG CAC ATA GTA GGG CCC GAC GAC-3' (13.

szekvencia);

antiszensz láncindító oligonukleotid: 5'-TCC CCC GGG CTA

GGC CGC CAC ATC TGA AAA AAA TAA GG-3 (14.

szekvencia).

A szensz láncindító oligonukleotid egy élesztő eredetű, nem-transzlálódó vezető szekvenciát iktat be a HPV6a

L2 kezdő metionin kodonjától közvetlenül 5'-irányban, (mely kodont vastag betűvel jelöltünk). A PCR-fragmentumot Smal enzimmel emésztettük, gélen tisztítottuk, és a Smal enzimmel emésztett pl3173-357-6 plazmiddal ligáltuk. A mind HPV6a Ll, mind HPV6a L2 gént tartalmazó pCl/l-GAL plazmidot izoláltuk, és pl4049-7-2 plazmidnak neveztük. Az L2 gént szekvenáltuk (ABI Sequencer, #373A), és kimutattuk, hogy azonos a pUC18HPV6a kiónban található L2 génnel.

26. példa

A HPV6a Ll expressziója, valamint a HPV6a Ll és HPV6a

L2 együttes expressziója élesztőben

A pl3173-357-6 plazmiddal (pCl/l-GAL + HPV6a-Ll) és a pl4049-7-2 plazmiddal (pCl/l-GAL + HPV6a Ll és L2) S. cerevisiae 1567 számú törzset (MATa, leu2-04, prbl, adel, pep4, cir°) és 1558 számú törzset (MATa, leu2-04, prbl, mnn9, adel, cir°) transzformáltunk. A 1558 számú gazdatörzzsel kapott rekombináns törzseket 1644 (HPVőaLl) és 1670 (HPV6a L1+L2) jelű törzseknek neveztük, amint azt a táblázat mutatja. Izolált kiónokat 68-72 órán át, 30 °C-on, 2 % galaktózt tartalmazó YEHD táptalajban tenyésztettünk. Miután a sejteket összegyűjtötttük, a sejtüledéket üveggyöngyökkel roncsoltuk, és a sejtlizátumokat HPV6a Ll vagy HPV6a L2 proteinek expresszálódására nézve, immunoblot-analízissel vizsgáltuk. 40 pg teljes sejtproteint tartalmazó mintát 10 %-os Tris-Glicin-géleken, redukáló és denaturáló körül55 mények mellett elektroforetizáltunk, és elektroblot-eljárással nitrocellulóz-szűrőkre vittünk át. Az Ll proteint első ellenanyagként trpE-HPVll fúziós proteinnel szemben nyúlban termelt antiszérum (Brown D.R. és mtsai.: Virology 201, 46.), majd második ellenanyagként szamárban termelt, torma-peroxidázzal (HRP) konjugált teljes anti-nyúl-IgG ellenanyag (Amersham, Inc.) alkalmazásával mutattuk ki. A szűrőket kemilumineszcens ECL™ Detection Kit (Amersham, Inc.) alkalmazásával értékeltük. A negatív kontrollt kivéve (Ll vagy L2 gént nem tartalmazó pCl/1) valamennyi mintában egy 50-55 kDa Ll proteincsíkot tudtunk kimutatni.

Az L2 proteint egy 70 kDa proteincsíkként mutattuk ki Western-analízissel, első ellenanyagként lényegében Carter és munkatársai eljárása szerint előállított trpE-HPV6a-L2 fúziós proteinnel három alkalommal immunizált egérből származó, 1:250 arányban hígított szérum, majd második ellenanyagként HRP-vel konjugált, birkában termelt anti-egér-IgG (Amersham, Inc.) (1:1000 hígítás) alkalmazásával.

Az EM-analízishez (Structure Probe, West Chester, PA) valamennyi mintából egy adott térfogatot 0,074 mm nyílásméretű, szénnel fedett rézrácsra vittünk fel. A rácsra 20 másodpercre, egy csepp 2 %-os foszfor-wolframsavat (PTA) (pH=7,0) cseppentettünk. A rácsokat levegőn hagytuk megszáradni, mielőtt azokat TEM-vizsgálatnak vetettük alá. Valamennyi mikroszkópos vizsgálatot JEOL-100CX típusú transzmissziós elektronmikroszkóp (JEOL USA, Inc.) alkalmazásával végeztünk, 100 kV gyorsító feszültség mellett. A mikroszkópos vizsgálat 100 000-szeres nagyítást eredményezett.

Valamennyi, a HPV6a Ll expressziós plazmidot, illetve HPVőa L1+L2 koexpressziós plazmidot tartalmazó élesztőmintában 50-55 nm-es átmérőjű VLP-k voltak megfigyelhetőek.

Az élesztő kontroll mintákban VLP-k nem voltak kimutathatók.

27. példa

A HPV6a (L1+L2) (1670 számú törzs) fermentoros tenyésztése

Az 1670 számú törzs lemeztenyészetének felszínéről kapott tenyészetet aszeptikus körülmények mellett leucinmentes folyékony tápfolyadékba oltottunk, amelynek összetétele a következő volt (1 literre számítva): 8,5 g Difco élesztő nitrogénbázis, aminosavak és ammónium-szulfát nélkül; 0,2 g adenin; 0,2 g uracil; 10 g borostyánkősav; 5 g ammónium-szulfát; és 0,25 g L-tirozin; sterilizálás előtt a táptalaj pH-ját NaOH-val 5,0-5,3-ra állítottuk be. Miután a tenyésztést 25 órán át, 28 °C-on, körkörös mozgást végző rázókészüléken 250 ford/perc mellett folytattuk, fagyasztott ampullákat (1 ml/fagyasztóampulla) állítottunk elő úgy, hogy a -70 °C-on történő tárolást megelőzően a tenyészethez 17 % (tömeg/térfogat) végkoncentrációig steril glicerint adtunk. Az 1670 számú törzs fermentoros tenyésztéséhez felhasznált inokulumot a fentivel megegyező összetételű táptalajban állítottuk elő (500 ml egy 2 literes palackban), a tenyésztést úgy indítottuk meg, hogy két fagyasztott ampulla felolvasztott tartalmát a 2 literes palackba oltottuk, majd azt 25 órán át, 28 °C-on, körkörös mozgást végző rázókészüléken 250 ford/perc mellett inkubáltuk. Az 1670 számú törzs fermentoros tenyésztését a beoltást követően egy New • ·

Brunswick SF-116 típusú, 10 liter hasznos térfogatú fermentorban végeztük. Az alkalmazott fermentációs tápfolyadék összetétele a következő volt (1 literre számítva): 20 g Difco élesztőkivonat; 10 g Sheffield HySoy pepton; 20 g glükóz; 20 g galaktóz; a sterilizálást megelőzően a táptalaj pH-ját 5,3-ra állítottuk be. A 2 literes beoltópalack teljes tartalmát (500 ml) a fermentorba vittük át, amelyet ezután 28 °C-on, 5 1 levegő/perc, 400 ford/perc, és 24 kPa nyomás mellett inkubáltunk. A rázatást szükség szerint fokoztuk, hogy az oldott oxigén telítettségi szintjét 40 % felett tartsuk. A fermentáció folyamatát a glükózszintnek a központi egységtől független (offline) készülékkel történő meghatározásával (Beckman Glucose 2 Analyzer) , valamint az azzal összekapcsolt (online) tömeg-spektrofotométerrel (Perkin-Elmer 1200) követtük. 69 óráig tartó inkubálást követően, literenként 9,9 g száraz sejttömeg denzitást értünk el. A tenyészetet üreges rostos szűréssel (Amicon, H5MP01-43 típusú cserélhető betéttel ellátott Amicon-DC-10 szűrőrendszerrel) 2 literre koncentráltuk, 2 liter foszfát-pufferes fiziológiás sóoldatba átszűrtük, és tovább (körülbelül 1 literre) koncentráltuk, majd 500 ml-es centrifugacsövekbe szétosztottuk. A sejtüledéket 8 000 ford/perc mellett, 20 percig, 4 °C-on (Sorvall-GS3-rotorban) végzett centrifugálással összegyűjtöttük. Miután a felülúszót leöntöttük, az üledéket (összesen 225 g nedves sejttömeg) felhasználásig -70 °C-on tároltuk.

28. példa

A rekombináns HPV6a (L1+L2) kapszidproteinek tisztítása

Valamennyi lépest 4 °C-on végeztük, hacsak másképp nem adjuk meg. Az 1670 számú törzs sejtjeit -70 °C-on fagyasztva tároltuk. A fagyasztott sejtjeket (nedves tömeg = 38,0 g) 20-23 °C-on felolvasztottuk, és 50 ml Ll-pufferben (20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCI;

1,7 pmól/l végkoncentrációig. A sejtelegyet körülbelül 56 MPa nyomás mellett, M110 Microfluidizerkészülékben (Microfluidics Corp., Newton, MA), 3 passzálással roncsoltuk. A roncsolt sejtelegyet a sejttörmelék eltávolítása céljából 5000 x g-n, 10 percig centrifugáltuk. Az L1+L2 antigéneket tartalmazó felülúszó folyadékot kinyertük.

A felülúszó folyadékot A-puffer (20 mmól/1 MOPS, pH=7,0) hozzáadásával 1:5 arányban hígítottuk, majd A-pufferrel ekvilibrált, Fractogel® EMD TMAE-650 (S) töltetet (EM Separations, Gibbstown, NJ) tartalmazó anioncserélő oszlopra (5,0 cm 4,0 cm) vittük fel. A-pufferrel történő mosást követően az antigént A-pufferben készített 0,01,0 mól/1 NaCl-gradienssel eluáltuk. Immuno-dot-blot-vizsgálatot végeztünk annak megállapítására, hogy az oszlopról lejövő mely frakciók tartalmaztak Ll proteint.

Az immuno-dot-blot-vizsgálat alapján Ll proteint tartalmazó frakciókban Bradford-féle eljárással meghatároztuk az össz-protein mennyiséget, majd SDS-PAGE-vizsgálatot végeztünk ezüst-festéssel és Western-blot vizsgálattal.

Az Ll proteinre nézve megfelelő tisztaságú és proteintartalmú TMAE frakciókat elegyítettük. Az antigént ammónium-szulfátos frakcionálással koncentráltuk. Az oldatot szilárd reagens hozzáadásával, 30 perc alatt, óvatos keverés mellett ammónium-szulfáttal 63 %-ra telítettük. A mintát jégre állítottuk, és 30 percig hagytuk kicsapódni. A mintát 12 000 g-n centrifugáltuk. Az üledéket 20,0 ml PBS-ben (6,25 mmól/1 Nafoszfát, pH=7,2; 150 mmól/1 NaCl) szuszpendáltuk.

A szuszpendált üldéket Sephacryl-500-HR töltetet (Pharmacia, Piscataway, NJ) tartalmazó molekulaszűrő oszlopon (2,6 cm átmérő x 89 cm) kromatografáltuk. Futtató pufferként PBS-t alkalmaztunk. A kromatográfiát 20-23 °C-on végeztük. A frakciókat SDS-PAGE eljárással, ezüst-festéssel és Western-blot vizsgálattal analizáltuk. A legtisztább frakciókat elegyítettük. A kapott összegyűjtött elegyet koncentráltuk.

A végterméket SDS-PAGE eljárással, kolloidális Coomassie-blue festéssel analizáltuk. Az Ll és L2 proteinek 85 %-ban homogénnek bizonyultak. Az Ll és L2 proteinek azonosságát Western-blot eljárással, a megfelelő antiszérumok alkalmazásával igazoltuk. A végterméket mintákra osztottuk, és -70 °C-on tároltuk. A fenti eljárás összesen 3,0 mg proteint eredményezett.

Elektronmikroszkópos vizsgálatot végeztünk Structure

Probe (West Chester, PA) alkalmazásával. Valamennyi mintából egy adott térfogatot 0,074 mm nyílásméretű, szénnel fedett rézrácsra vittünk fel. A rácsra 20 másodpercre, egy csepp 2 %-os foszfor-wolframsavat (pH=7,0) cseppentettünk. A rácsokat levegőn hagytuk megszáradni, mielőtt azokat TEMvizsgálatnak vetettük alá. Valamennyi mikroszkópos vizsgálatot JEOL-lOOCX típusú transzmissziós elektronmikroszkóp (JEOL USA, Inc.) alkalmazásával végeztünk, 100 kV gyorsító feszültség mellett. A mikroszkópos vizsgálat 100 000-szeres nagyítást eredményezett. A mintákban 50-55 nm-es mérettartományba eső vírusszerű részecskék jelenléte volt megfigyelhető.

29. példa

HPV6a LI és L1/L2 VLP-k tisztítása EM-vizsgálat célj ára

Az élesztőben expresszált HPV6a LI és HPV6a (L1+L2) proteineket részlegesen tisztítottuk és koncentráltuk elektronmikroszkópos (EM) vizsgálat vizsgálat céljára. Egy-1,5 liter, 2 % galaktózt és 0,1 mól/1 szorbitolt tartalmazó YEHD táptalajt oltottunk be a pl3173-357-6 plazmidot (LI expreszsziós vektort), illetve a pl4049-7-2 plazmidot (L1+L2 koexpressziós vektort) hordozó S. cerevisiae 1558 számú törzzsel, és azokat 68-78 órán át, 30 °C-on tenyésztettük. A sejteket 4 000 g-n, 10 percig végzett centrifugálással összegyűjtöttük, és a sejtüledéket -70 °C-ra lefagyasztottuk. Valamennyi ezt követő lépést 4 °C-on végeztünk. A sejtüledékeket felolvasztottuk, és a mintával megegyező térfogatú Ll-pufferben (20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCl;

1,7 μιηόΐ/l végkoncentrációig. A sejteket microfluidizer-

készülékben, 3-5 passzálással lizáltuk. A lizátumot 5000 x g-n, 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk. A felülúszót Ll-pufferben 5 cm-es, 45 %-os (tömeg/térfogat) szacharózpárnára rétegeztük, és az Ll, illetve Ll és L2 proteineket 100 000 x g-n, 4 órán át végzett centrifugálással ülepítettük. Az üledéket 1/10 térfogatú Ll-pufferben szuszpendáltuk, és 5000 x g-n, 10 percig végzett centrifugálással feltisztítottuk. A mintákat EM eljárással vizsgáltuk, és kimutattuk, hogy vírusszerű részecskéket tartalmaznak.

30. példa

A HPV6a Ll és L2 gének klónozása

Caski-sejtekből (ATCC CRL 1550) ismert technikákkal (Sambrook és munkatársai, lásd fent) összes genomi DNS-t vontunk ki. A DNS-t BstI-1701 és Sphl endonukleázokkal emésztettük, és 0,8 %-os, alacsony olvadáspontú preparatív agarózgélen elektroforetizáltuk. A körülbelül 3,5 kbp méretnek megfelelő régiót a gélből kivágtuk, és az agarózt Gelase™ enzimmel emésztettük (Epicentre Technologies, Inc.). A gélen tisztított DNS-t T4-DNS-polimerázzal tompavégűvé alakítottuk, és tompavégűvé alakított, foszforliezett, beépített HindlII-helyet tartalmazó kapcsoló oligonukleotid szekvenciákkal (linkerekkel) ligáltuk. A ligációs elegyet Hindin enzimmel teljesen emésztettük, és a körülbelül 3,5 kbp DNS-t a fent leírtak szerint, agarózgélen méret alapján frakcionáltuk. A gélen tisztított DNS-t HindlII enzimmel emésztett és defoszforilezett pUC18-plazmid-DNS-sel ligáltuk. Kompetens E. coli DH5 sejtek (BRL) transzformálását követően, a plazmid-génkönyvtárat a HPV16 Ll gén 3'-végével komplementer, ³²P-jelölt, antiszensz oligodezoxinukleotid (5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3' ) alkalmazásával, telephibridizációs eljárással HPV16-pozitív kiónokra nézve szűrtük. A 3,3 kbp nagyságú HPV16 genomi fragmentumot tartalmazó pUC18 plazmidot izoláltuk, majd restrikciós enzimekkel, valamint Southern-blot-analízissel jellemeztük. Ez a plazmid, amelyet pUC18-HPl6-L1/L2 plazmádnak neveztük, tartalmazta a teljes Ll- és L2-kódoló DNSszekvenciákat. Plazmid DNS-t a Qiagen™ Plasmid Maxi (Qiagen, Inc.) reagenskészlet alkalmazásával állítottunk elő.

31. példa

A HPV16 Ll élesztő expressziós vektor előállítása

A PCR eljárás során a pUC18-HPV16-Ll/L2 kiónt alkalmaztuk temlátként. A HPV16 Ll gént PCR eljárással amplifikáltuk, Vent-polimeráz (New England Biolabs, Inc.), 10 amplifikációs ciklus (94 °C-on 1 perc; 48 °C-on 1 perc; 72 °C-on 1 perc, 45 másodperc) és az alábbi, határoló Bglllhelyeket tartalmazó (aláhúzással jelölt) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával:

szensz láncindító oligonukleotid: 5'-CTG AGA TCT CAC AAA

ACA AAA TGT CTC TTT GGC TGC CTA TGT AGG CC-3' (15.

szekvencia);

antiszensz láncindító oligonukleotid: 5'-GAG AGA TCT TAC

AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3' (16.

szekvencia).

A szensz láncindító oligonukleotid egy élesztő ere-

detű, nem-transzlálódó vezető szekvenciát iktat be a HPV16 L1 kezdő metionin kodonjától közvetlenül 5'-irányban, (mely kodont vastag betűvel jelöltünk). Az 1,5 kbp L1 PCR-terméket Bglll enzimmel emésztettük, gélen tisztítottuk, és a BamHI enzimmel emésztett pCl/l-GAL vektorral ligáltuk. A HPV16 L1 gént tartalmazó pCl/l-GAL plazmidot izoláltuk, és pl4049-371 plazmidnak neveztük. A pl4049-37-l plazmidban található L1 gént a PRISNP⁴ reagenskészet (ABI, Inc.) és ABI szekvenátor (ABI Sequencer Model #373A) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint eljárva (ABI, Inc., Foster City, CA) szekvenáltuk. A fenti izolátumban található L1 génről kimutattuk, hogy az 3 nukleotid vonatkozásában eltér a helyesbített, közölt eredeti szekvenciától [Kirnbauer R és mtsai.:

J. Virol. 67, 6929. (1993)], amely két aminosav eltérést eredményez: a His-202 aminosav helyett Asp található, a Thr266 aminosav helyett pedig Alá található. Az eredeti templát-DNS szekvencia-analízise szerint, az eltérések jelen voltak a pUC18-HPV16-Ll/L2 jelű genomi kiónban is, és azok nem a PCR eljárás során keletkeztek.

32. példa

A HPV16 L1 és L2 élesztő expressziós vektor előállítása

A pl4049-37-l plazmidot (pCl/1-GAL+HPV16-L1) Smal enzimmel emésztettük, amely a GAL10 promóter és az ADH1 transzkripciós terminátor szekvencia között hasít. Az 1,4 kbp HPV16 L2 gént a pUC18-HPV16-Ll/L2 DNS-templát felhasználásával PCR eljárással amplifikáltuk, Vent-polimeráz (New England Biolabs, Inc.), 10 amplifikációs ciklus

(94 °C-on 1 perc; 48 °C-on 1 perc; 72 °C-on 1 perc, 45 másodperc) és az alábbi, határoló Smal helyeket tartalmazó (aláhúzással jelölt) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával :

szensz láncindító oligonukleotid: 5'-TCC CCC GGG CAC AAA

ACA AAA TGC GAC ACA AAC GTT CTG CAA AAC-3' (17.

szekvencia);

antiszensz láncindító oligonukleotid: 5'-TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TGA-3' (18. szekvencia).

A szensz láncindító oligonukleotid egy élesztő eredetű, nem-transzlálódó vezető szekvenciát iktat be a HPV16

L2 kezdő metionin kodonjától közvetlenül 5'-irányban, (mely kodont vastag betűvel jelöltünk). Az 1,4 kbp L2 PCR-terméket Smal enzimmel emésztettük, gélen tisztítottuk, és a Smal enzimmel emésztett pl4049-37-l vektorral ligáltuk. A HPV16 Ll és L2 géneket tartalmazó pCl/l-GAL plazmidot izoláltuk, és pl4049-42-2 plazmidnak neveztük. A p!4049-42-2 plazmidban található L2 gént a PRISM™ reagenskészet (ABI, Inc.) és ABI szekvenátor (ABI Sequencer Model #373A) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint eljárva (ABI, Inc., Foster City, CA) szekvenáltuk. A fenti izolátumban található két génről kimutattuk, hogy 5 nukleotid vonatkozásában eltér a helyesbített, közölt eredeti szekvenciától [Kirnbauer R és mtsai.: lásd fent, (1993)], amely egy aminosav eltérést eredményez: a Ser-269 aminosav helyett Pro található. A pUC18-HPV16L1/L2 jelű genomi klón szekvencia-analízise szerint, az eltérések jelen voltak a eredeti templát-DNS-ben is, és azok nem a PCR eljárás során keletkeztek.

····

33. példa

A. HPV16 Ll expressziója és a HPV16 Ll, valamint

HPV16 L2 együttes expressziója élesztőben A pl4049-37-l plazmiddal (pCl/l-GAL + HPV16-L1) és a pl4049-42-2 plazmiddal (pCl/l-GAL + HPV16 Ll és L2) S. cerevisiae 1558 számú törzset transzformáltunk. A kapott rekombináns törzseket 1678 (HPV16 Ll) és 1679 (HPV16 L1+L2) törzseknek neveztük, amint azt a táblázat mutatja. Az izolált kiónokat 68-78 órán át, 30 °C-on, 2 % galaktózt tartalmazó YEHD táptalajban tenyésztettünk. Miután a sejteket összegyűjtöttük, a sejtüledéket üveggyöngyökkel roncsoltuk, és a sejtlizátumokat HPV16 Ll vagy HPV16 L2 proteinek expresszálódására nézve, immunoblot-analízissel vizsgáltuk. 40 pg teljes sejtproteint tartalmazó mintákat 10 %-os TrisGlicin-géleken, redukáló és denaturáló körülmények mellett elektroforetizáltunk, és elektroblot-eljárással nitro-cellulóz-szűrókre vittünk át. A HPV16 Ll proteint első ellenanyagként trpE-HPVll-Ll fúziós proteinnel szemben nyúlban termelt antiszérum (Brown D.R. és mtsai.: Virology 201, 46.), majd második ellenanyagként szamárban termelt, torma-peroxidázzal (HRP) konjugált teljes anti-nyúl-IgGellenanyag (Amersham, Inc.) alkalmazásával mutattuk ki. A szűrőket kemilumineszcens ECL™ Detection Kit (Amersham,

Inc.) alkalmazásával értékeltük. A negatív kontrollt kivéve (Ll vagy L2 gént nem tartalmazó pCl/1) valamennyi mintában egy 50-55 kDa Ll proteincsíkot tudtunk kimutatni. Az L2 proteint immunoblot-analízissel egy 70 kDa proteincsíkként mutattuk ki, első ellenanyagként E. coliban expresszált trpE-L2 fúziós proteinnel szemben egérben termelt antiHPV16-L2-szérum alkalmazásával. Második ellenanyagként kecskében termelt, HRP-konjugált anti-egér-IgG-t (Amersham, Inc.) alkalmaztunk, majd a szűrőket a fent ismertetettek szerint kezeltük.

. B, Rekombináns HPV16 (L1+L2) kapszidproteinek tisztítása

Valamennyi lépést 4 °C-on végeztük, hacsak másképp nem adjuk meg.

A sejteket -70 °C-on fagyasztva tároltuk. A fagyasztott sejtjeket (nedves tömeg = 27,6 g) 20-23 °C-on felolvasztottuk, és 40 ml Ll-pufferben (20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCl; 1,7 mmól/1 EDTA) szuszpendáltuk. Az elegyhez PMSF és Pepstatin-A proteázinhibitorokat adtunk 2 mmól/1, illetve 1,7 pmól/l végkoncentrációig. A sejtelegyet körülbelül 56 MPa nyomás mellett, M110 Microfluidizer készülékben (Microfluidics Corp., Newton, MA), 3 passzálással roncsoltuk. A roncsolt sejtelegyet a sejttörmelék eltávolítása céljából 5000 x g-n, 10 percig centrifugáltuk. Az L1+L2 antigéneket tartalmazó felülúszó folyadékot kinyertük.

A felülúszó folyadékot A-puffer (20 mmól/1 MOPS, pH=7,0) hozzáadásával 1:5 arányban hígítottuk, majd A-pufferrel ekvilibrált, Fractogel® EMD TMAE-650 (S) töltetet (EM Separations, Gibbstown, NJ) tartalmazó anioncserélő oszlopra (5,0 cm átmérő x 4,8 cm) vittük fel. A-pufferrel történő mosást követően az antigént A-pufferben készített 0,0-1,0 mól/1 NaCl-gradienssel eluáltuk. Immuno-dot-blot67 vizsgálatot végeztünk annak megállapítására, hogy az oszlopról lejövő mely frakciók tartalmaztak L1 proteint.

Az immuno-dot-blot-vizsgálat alapján L1 proteint tartalmazó frakciókban Bradford-féle eljárással meghatároztuk az össz-protein mennyiséget, majd SDS-PAGE-vizsgálatot végeztünk ezüst-festéssel és Western-blot-vizsgálattal.

Az L1 proteinre nézve megfelelő tisztaságú és proteintartalmú TMAE frakciókat elegyítettük. Az antigént ammónium-szulfátos frakcionálással koncentráltuk. Az oldatot szilárd reagens hozzáadásával, 30 perc alatt, óvatos keverés mellett ammónium-szulfáttal 48 %-ra telítettük. A mintát jégre állítottuk, és egy éjszakán át hagytuk kicsapódni. A mintát 12 000 g-n centrifugáltuk. Az üledéket 20,0 ml PBS-ben (6,25 mmól/l Na-foszfát, pH=7,2; 150 mmól/l NaCI) szuszpendáltuk .

A szuszpendált üldékeket külön-külön, Sephacryl-500HR töltetet (Pharmacia, Piscataway, NJ) tartalmazó molekulaszűrő oszlopon (2,6 cm átmérő x 89 cm), 20-23 °C-on kromatografáltuk. Futtató pufferként PBS-t alkalmaztunk. A frakciókat SDS-PAGE eljárással, ezüst-festéssel és Western-blot-vizsgálattal analizáltuk. A legtisztább frakciókat elegyítettük. A kapott összegyűjtött elegyet 50 ml-es keverős cellákban, 43 mm átmérőjű lapos YM-100 szűrővel (Amicon, Inc., Beverly, MA), N₂ atmoszféra alatt, 27,5-41 kPa nyomás alatt koncentráltuk.

A végterméket SDS-PAGE-eljárással, kolloidális

Coomassie-festéssel analizáltuk. Az L1 és L2 proteinek 70 %bán homogénnek bizonyultak. Az L1 és L2 proteinek azonos68 ságát Western-blot-eljárással, a megfelelő antiszérumok alkalmazásával igazoltuk. A végterméket mintákra osztottuk, és -70 °C-on tároltuk. A fenti eljárás összesen 0,53 mg proteint eredményezett.

Elektronmikroszkópos vizsgálatot végeztünk Structure Probe (West Chester, PA) alkalmazásával. Valamennyi mintából egy adott térfogatot 0,074 mm nyílásméretű, szénnel fedett rézrácsra vittünk fel. A rácsra 20 másodpercre, egy csepp 2 %-os foszfor-wolframsavat (pH=7,0) cseppentettünk. A rácsokat levegőn hagytuk megszáradni, mielőtt azokat TEMvizsgálatnak vetettük alá. Valamennyi mikroszkópos vizsgálatot JEOL-100CX típusú transzmissziós elektronmikroszkóp (JEOL USA, Inc.) alkalmazásával végeztünk, 100 kV gyorsító feszültség mellett. A mikroszkópos vizsgálat 100 000-szeres nagyítást eredményezett. A mintákban 50-55 nm-es mérettartományba eső vírusszerű részecskék jelenléte volt megfigyelhető .

C. Rekombináns HPV16 (L1+L2) kapszidproteinek tisztítása

Valamennyi lépést 4 °C-on végeztük, hacsak másképp nem adjuk meg.

A sejteket -70 °C-on fagyasztva tároltuk. A fagyasztott sejteket (nedves tömeg = 92,8 g) 20-23 °C-on felolvasztottuk, és 105 ml Ll-pufferben (20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCl; 1,7 mmól/1 EDTA) szuszpendáltuk. Az elegyhez PMSF és Pepstatin-A proteázinhibitorokat adtunk 2 mmól/1, illetve 1,7 pmól/l végkoncentrációig. A sejtelegyet körülbelül 110 MPa nyomás mellett, • · ·

Μ110 Y Microfluidizer készülékben (Microfluidics Corp.,

Newton, MA) három passzálással roncsoltuk. A roncsolt sejtelegyet a sejttörmelék eltávolítása céljából 6100 x g-n, percig centrifugáltuk. Az L1+L2 antigéneket tartalmazó felülúszó folyadékot kinyertük.

A felülúszó folyadékot A-puffer (20 mmól/1 MOPS, pH=7,0) hozzáadásával 1:5 arányban hígítottuk, majd Apufferrel ekvilibrált, Fractogel® EMD TMAE-650 (S) töltetet (EM Separations, Gibbstown, NJ) tartalmazó anioncserélő oszlopra (5,0 cm átmérő x 4,2 cm) vittük fel. A-pufferrel történő mosást követően az antigént A-pufferben készített 0,0-1,0 mól/1 NaCl-gradienssel eluáltuk. Immuno-dot-blot vizsgálatot végeztünk annak megállapítására, hogy az oszlopról lejövő mely frakciók tartalmaztak L1 proteint.

Az immuno-dot-blot-vizsgálat alapján L1 proteint tartalmazó frakciókban Bradford-féle eljárással meghatároztuk az össz-protein mennyiséget, majd SDS-PAGE vizsgálatot végeztünk ezüst-festéssel és Western-blot vizsgálattal.

Az L1 proteinre nézve megfelelő tisztaságú és proteintartalmú TMAE frakciókat elegyítettük. Az antigént ammónium-szulfátos frakcionálással koncentráltuk. Az oldatot szilárd reagens hozzáadásával, 10 perc alatt, óvatos keverés mellett ammónium-szulfáttal 35 %-ra telítettük. A mintát jégre állítottuk, és 4 órán át hagytuk kicsapódni. A mintát 12 000 g-n centrifugáltuk. Az üledéket 20,0 ml, 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó PBS-ben (6,25 mmól/1 Na-foszfát, pH=7,2; 150 mmól/1

NaCl) szuszpendáltuk.

A szuszpendált üldéket külön-külön, Sephacryl-500-HR

ΊΟ töltetet (Pharmacia, Piscataway, NJ) tartalmazó molekulaszűrő oszlopon (2,6 cm átmérő x 89 cm) kromatografáltuk. Futtató pufferként 1 mmól/l EDTA-t tartalmazó PBS-t alkalmaztunk. A frakciókat SDS-PAGE eljárással, ezüst-festéssel és Western-blot vizsgálattal analizáltuk. A legtisztább frakciókat elegyítettük. A kapott összegyűjtött elegyet 43 mm átmérőjű, lapos YM-100 szűrővel (Amicon, Inc., Beverly, MA) ellátott 50 ml-es keverős cellákban, N₂atmoszféra alatt, 27,5-41 kPa nyomáson koncentráltuk.

A végterméket SDS-PAGE eljárással, kolloidális Coomassie-festéssel analizáltuk. Az L1 és L2 proteinek 70 %bán homogénnek bizonyultak. Az L1 és L2 proteinek azonosságát Western-blot eljárással, a megfelelő antiszérumok alkalmazásával igazoltuk. A végterméket mintákra osztottuk, és -70 °C-on tároltuk. A fenti eljárás összesen 3,8 mg proteint eredményezett.

34. példa

A. Az 1679 törzs [HPV16 (L1+L2)] fermentoros tenyésztése

A fagyasztott törzstenyészetek előállításánál, az inokulum előállításánál, a fermentációnál és az 1679 törzshöz tartozó sejtek kinyerésénél alkalmazott eljárások lényegében megegyeztek a fent ismertetettekkel.

órás inkubálást követően literenként 4,2 g száraz sejttömeg sejtdenzitást értünk el, és a kinyerést követően összesen 93 g nedves sejttömegnek megfelelő sejtüledéket kaptunk.

B. Az 1678 törzs (HPV16-L1) fermentoros tenyésztése

A fagyasztott törzstenyészetek: előállításánál, az inokulum előállításánál, a fermentációnál és az 1678 törzshöz tartozó sejtek kinyerésénél alkalmazott eljárások lényegében megegyeztek a fent ismertetettekkel. 70,5 órás inkubálást követően két, egyenként 10 literes fermentor tartalmát elegyítettük, (literenként 8,7 g száraz sejttömeg sejtdenzitást értünk el), amely a kinyerést követően összesen 258 g nedves sejttömegnek megfelelő sejtüledéket eredményezett .

C. Rekombináns HPV16 L1 kapszidproteinek tisztítása

Valamennyi lépést 4 °C-on végeztük, hacsak másképp nem kötöttük kádjuk megi.

Az 1678 törzshöz tartozó sejteket -70 °C-on fagyasztva tároltuk. A fagyasztott sejtjeket (nedves tömeg = 128 g) 2023 °C-on felolvasztottuk, és 140 ml módosított Ll-pufferben (20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCl) szuszpendáltuk. Az elegyhez PMSF és Pepstatin-A proteázinhibitorokat adtunk 2 mmól/1, illetve 1,7 pmól/l végkoncentrációig. A sejtelegyet körülbelül 110 MPa nyomáson M110-Y Microfluidizer készülékben (Microfluidics Corp., Newton, MA) három passzálással roncsoltuk. A roncsolt sejtelegyet a sejttörmelék eltávolítása céljából 11 000 x g-n, 40 percig centrifugáltuk. Az L1 antigént tartalmazó felülúszó folyadékot kinyertük.

A felülúszó folyadékot A-puffer (20 mmól/1 MOPS, pH=7,0) hozzáadásával 1:5 arányban hígítottuk, majd A-pufferrel ekvilibrált, Fractogel® EMD TMAE-650 (S)^/z töltetet • · · (EM Separations, Gibbstown, NJ) tartalmazó anioncserélő oszlopra (5,0 cm átmérő x 6,4 cm) vittük fel. A-pufferrel történő mosást követően az antigént A-pufferben készített 0,0-1,0 mól/1 NaCl-gradienssel eluáltuk. Immuno-dot-blot vizsgálatot végeztünk annak megállapítására, hogy az oszlopról lejövő mely frakciók tartalmaztak Ll proteint.

Az immuno-dot-blot vizsgálat alapján Ll proteint tartalmazó frakciókban Bradford-féle eljárással meghatároztuk az össz-protein mennyiséget, majd SDS-PAGE vizsgálatot végeztünk ezüst-festéssel és Western-blot vizsgálattal.

Az Ll proteinre nézve megfelelő tisztaságú és proteintartalmú TMAE frakciókat elegyítettük. Az antigént ammónium-szulfátos frakcionálással koncentráltuk. Az oldatot szilárd reagens hozzáadásával, 10 perc alatt, óvatos keverés mellett ammónium-szulfáttal 35 %-ra telítettük. A mintát jégre állítottuk, és 5 órán át hagytuk kicsapódni. A mintát 12 000 g-n centrifugáltuk. Az üledéket 20,0 ml PBS-ben (6,25 mmól/1 Nafoszfát, pH=7,2; 150 mmól/1 NaCl) szuszpendáltuk.

A szuszpendált üldéket külön-külön, Sephacryl-500-HR töltetet (Pharmacia, Piscataway, NJ) tartalmazó molekulaszűrő oszlopon (2,6 cm átmérő x 89 cm) kromatografáltuk. Futtató pufférként tartalmazó PBS-t alkalmaztunk. A frakciókat SDS-PAGE eljárással, ezüst-festéssel és Western-blot vizsgálattal analizáltuk. A legtisztább frakciókat elegyítettük. A kapott összegyűjtött elegyet 43 mm átmérőjű, lapos YM-100 szűrővel (Amicon, Inc., Beverly, MA) ellátott 50 mles keverős cellákban, N₂ atmoszféra alatt, 27,5-41 kPa nyomáson koncentráltuk.

A végterméket SDS-PAGE eljárással, kolloidális Coomassie-festéssel analizáltuk. Az L1 protein 70 %-ban homogénnek bizonyult. Az L1 protein azonosságát Western-blot eljárással, a megfelelő antiszérum alkalmazásával igazoltuk. A végterméket mintákra osztottuk, és -70 °C-on tároltuk. A fenti eljárás összesen 7,4 mg proteint eredményezett.

D. Analitikai eljárások

Immuno-dot-blot eljárás

A mintákat (szükség szerint) 1:10 arányban, Milli-QH₂O-ban hígítottuk, és 10 μΐ mintát PolyScreen™ PVDF szűrőkre (NEN Research Products, Boston, MA) cseppentettünk.

Miután a cseppek megszáradtak, a szűrőket vízben mostuk, és megszárítottuk. Első ellenanyag oldatot állítottunk elő a megfelelő antiszérum blot-pufferrel [6,25 mmól/l Nafoszfát puffer (pH=7,2); 150 mmól/l NaCI; 0,02 % NaNO₃; 5 % zsírtalan tejpor] történő hígításával. Az inkubálást 2023 °C-on, legalább egy órán át végeztük. A biottot a puffer háromszori cseréjével, egyenként 1-1 percig PBS-ben mostuk (6,25 mmól/l Na-foszfát, pH=7,2; 150 mmól/l NaCI). Második ellenanyag oldatot úgy állítottunk elő, hogy a megfelelő, alkalikus-foszfátázzál konjugált antiszérumot blot-pufferrel hígítottuk. Az inkubálást a fentivel megegyező körülmények mellet, legalább egy órán át végeztük. A biotokat a fent ismertetettek szerint mostuk, és egy lépésben, NBT/BCIP-szubsztrát (Pierce, Rockford, IL) alkalmazásával előhívtuk.

A kimutatásra a következő ellenanyagokat alkalmaztuk:

A HPV6a L1 proteint MAB-837-ellenanyaggal (Chemicon

International, Inc. Temecula, CA) mutattuk ki. A HPVőa L2 proteint HPV6a-L2-trpE fúziós proteinnel szemben egérben termelt, elegyített 641 és 647 szérumok alkalmazásával mutattuk ki. A HPV16 Ll proteint MAB-885 ellenanyaggal (Chemicon International, Inc. Temecula, CA) mutattuk ki. A

HPV6a L2 proteint HPV16-L2-trpE fúziós proteinnel szemben egérben termelt 611 szérum alkalmazásával mutattuk ki.

Bradford-féle vizsgálati eljárás az össz-protein meghatározására

Az össz-proteint a kereskedelemben hozzáférhető Coomassie Plus® reagenskészlet (Pierce, Rockford, IL) alkalmazásával határoztuk meg. A mintákat Milli-Q-H₂O-ban megfelelő szintre hígítottuk. A standard eljáráshoz és a mikrovizsgálati eljáráshoz 1,0 ml, illetve 0,1 ml térfogatú mintára volt szükség. Mindkét eljárásban BSA-t (Pierce, Rockford, IL) alkalmaztunk a standard görbe meghatározására. A vizsgálati eljárást a gyártó utasításai szerint végeztük. A standard görbéket CricketGraph® programcsomag felhasználásával, Macintosh Ilci komputeren vettük fel.

35. példa

Rekombináns HPV11 Ll kapszidprotein tisztítása

Valamennyi lépést 4 °C-on végeztük, hacsak másképp nem adjuk meg.

A sejteket -70 °C-on fagyasztva tároltuk. A fagyasztott sejtjeket (nedves tömeg = 180 g) 20-23 °C-on felolvasztottuk, és 900 ml roncsoló-pufferben (Breaking buffer: 50 mmól/1 MOPS, pH=7,2; 500 mmól/1 NaCl; 1,0 mmól/1 CaCl₂) szuszpendáltuk. Az elegyhez AEBSF és Pepstatin-A proteáz75 inhibitorokat adtunk 1 mmól/1, illetve 1,7 pmól/l végkoncentrációig. A sejtelegyet körülbelül 110 MPa nyomáson M110-Y Microfluidizer készülékben (Microfluidics Corp., Newton, MA) négy passzálással roncsoltuk. A roncsolt sejtelegyhez elegendő térfogatú 10 %-os Triton-X-100®-detergenst (Pierce, Rockford, IL) adtunk ahhoz, hogy a Triton-X-100® koncentrációját 0,5 %-ra állítsuk be. Az elegyet 20 órán át kevertük. A Triton-X-100©-detergenssel kezelt lizátumot a sejttörmelék eltávolítása céljából 12 000 x g-n, 40 percig centrifugáltuk. Az Ll proteint tartalmazó felülúszó folyadékot kinyertük.

A felülúszó folyadékot ötszörös térfogatú, 0,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó, 20 mmól/1 nátrium-foszfát pufferrel (pH=7,2) szemben diafiltráltuk egy 300K tangenciális áramlásos membrán-kazetta (Filtron, Northborough, MA) alkalmazásával. A membrán felhasználásával nyert anyagban radioimmun vizsgálati eljárással és Western-blottal kimutattuk, hogy az tartalmazza az Ll proteint.

A visszamaradó anyagot 0,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó, 20 mmól/1 nátrium-foszfát pufferrel (pH=7,2) ekvilibrált, SP-Spherodex (M)® töltetet (IBF, Villenevue-la-Garenne, Franciaország) tartalmazó nagy feloldású affinitásos oszlopra (11,0 cm x 5,3 cm) vittük fel. Miután az oszlopot ekvilibráló pufferrel, majd 1,0 mól/1 NaCl-t tartalmazó, 20 mmól/1 nátrium-foszfát pufferrel (pH=7,2) mostuk, az Ll proteint 2,5 mól/1· NaCl-t tartalmazó, 20 mmól/1 nátrium-foszfát pufferrel (pH=7,2) eluáltuk. A mosások és az elúció során frakciókat gyűjtöttünk. Az oszlopról lejövő frakciók

Ί6 össz-protein tartalmát Bradford-féle eljárással határoztuk meg. Ezt követően, a frakciókat Western-blot eljárással és SDS-PAGE vizsgálattal, kolloidális Coomassie-festéssel történő kimutatással analizáltuk. Ezen felül, a frakciókat radioimmun vizsgálattal is analizáltuk.

Az Ll proteinre nézve megfelelő tisztaságú és proteintartalmú SP-Spherodex frakciókat elegyítettük.

A végterméket Western-blot eljárással és SDS-PAGE vizsgálattal, kolloidális Coomassie-festéssel történő kimutatással analizáltuk. Az Ll protein A Coomassie-festett gélek denzitométeres analízise szerint több, mint 90 %-ban homogénnek bizonyult. Az Ll protein azonosságát Western-blot eljárással igazoltuk. A végterméket aszeptikus körülmények között, 0,22 pm-es membránon átszűrtük, és 4 °C-on tároltuk. A fenti eljárás összesen 202 mg proteint eredményezett.

Elektronmikroszkópos vizsgálatot végeztünk Structure Probe (West Chester, PA) alkalmazásával. A mintából 0,074 mm nyílásméretű, szénnel fedett rézrácsra alikvotot vittünk fel. A rácsra 20 másodpercre, egy csepp 2 %-os foszfor-wolframsavat (pH=7,0) cseppentettünk. A rácsokat levegőn hagytuk megszáradni, mielőtt azokat TEM-vizsgálatnak vetettük alá. Valamennyi mikroszkópos vizsgálatot JEOL-100CX típusú transzmissziós elektronmikroszkóp (JEOL USA, Inc.) alkalmazásával végeztünk, 100 kV gyorsító feszültség mellett. A mikroszkópos vizsgálat 100 000-szeres nagyítást eredményezett.

SDS-PAGE és Western-blot analízis

Valamennyi gél, puffer és elektroforetikus készülék a

Novex-től származott (San Diego, CA) , és azokat a gyártó utasításai szerint használtuk. Röviden, a mintákat Milli-QH₂O-ban azonos protein koncentrációra hígítottuk, és 1:1 arányban 200 mmól/1 DTT-t tartalmazó minta inkubációs pufferrel elegyítettük. A mintákat 15 percig, 100 °C-on inkubáltuk, majd előregyártott 12 %-os Tis-glicin gélekre vittük fel. A géleket 125 V mellett, 1 óra 45 percen át elektroforetizáltuk. A géleket kolloidális Coomassie-festéssel előhívtuk, a kereskedelemben hozzáférhető reagenskészlet (Integrated Separation Systems, Natick, MA) alkalmazásával.

Western-blot céljára a proteineket 25 V mellett, 40 perc alatt PVDF membránokra vittük át. A membránokat Milli-Q-H₂O-ban mostuk, és levegőn szárítottuk. Első ellenanyagként TrpE-HPVll-Ll fúziós proteinnel szemben nyálban termelt poliklonális antiszérumot alkalmaztunk (Dr. D. Brown ajándéka). Az ellenanyag oldatot az antiszérum blotpufferben [6,25 mmól/1 Na-foszfát puffer (pH=7,2); 150 mmól/1 NaCl; 0,02 % NaN0₃; 5 % zsírtalan tejpor] történő hígításával állítottuk elő. Az inkubálást 20-23 °C-on, legalább egy órán át végeztük. A biottot a puffer háromszori cseréjével, egyenként 1-1 percig, PBS-ben mostuk (6,25 mmól/1 Na-foszfát, pH=7,2; 150 mmól/1 NaCl). Második ellenanyag oldatot úgy állítottunk elő, hogy kecskében nyúlIgG-vel szemben termelt, alkalikus-foszfátázzál konjugált antiszérumot (Pierce, Rockford, IL) blot-pufferben hígítottunk. Az inkubálást a fentivel megegyező körülmények között, legalább egy órán át végeztük. A biotokat a fent ismertetettek szerint mostuk, és 1 lépésben, NBT/BCIP»·«» szubsztrát (Pierce, Rockford, IL) alkalmazásával előhívtuk.

36. példa

HPV18 Ll és L2 expresszálása élesztőben A pl91-6 plazmiddal (pGALl-10+HPV18-Ll) és a pl95-ll plazmiddal [pGALl-10+HPV18-(L1+L2)] S. cerevisiae 1558 törzset (MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°) transzformáltunk. Izolált kiónokat 88 órán át, 30 °C-on, 2 % galaktózt tartalmazó YEHD táptalajban tenyésztettünk. Miután a sejteket összegyűjtöttük, a sejtüledéket üveggyöngyökkel roncsoltuk, és a sejtlizátumokat HPV18 Ll és/vagy HPV18 L2 proteinek expresszálódására nézve, immunoblot-analízissel vizsgáltuk. 25 pg teljes sejtproteint tartalmazó mintát 10 %-os Tris-glicin-géleken, redukáló és denaturáló körülmények között elektroforetizáltunk, és elektroblot eljárással nitrocellulóz-szűrőkre vittünk át. Az Ll proteint első ellenanyagként trpE-HPVll fúziós proteinnel szemben nyúlban termelt antiszérum [Brown D.R. és mtsai.: Virology

201, 46. (1994)], majd második ellenanyagként szamárban termelt, torma-peroxidázzal (HRP) konjugált anti-nyúl-IgGellenanyag (Amersham, Inc.) alkalmazásával mutattuk ki. A szűrőket kemilumineszcens ECL™ Detection Kit (Amersham,

Inc.) alkalmazásával értékeltük. Mind az Ll proteint, mind az (L1+L2) proteineket kódoló koexpressziós élesztő kiónokban (1725 és 1727 törzsekben) egy 50-55 kDa Ll proteincsíkot tudtunk kimutatni, míg a negatív kontroliban (Ll vagy L2 géneket nem tartalmazó pGALl-10) a fenti csík nem volt kimutatható.

A HPvl8 L2 proteint Western-blot analízissel, első

ΊΟ ellenanyagként trp£-HPV18-L2 fúziós proteinnel szemben kecskében termelt poliklonális antiszérum, majd kecskével szemben nyúlban termelt, HRP-konjugált IgG (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithesburg, MD) alkalmazásával mutattuk ki. A szűrőket a fent leírtak szerint kezeltük. Az L2 proteint az (L1+L2) proteineket kódoló koexpressziós élesztőkiónban (1727 törzsben) 75 kDa proteincsíkként mutattuk ki, míg az sem a negatív kontroliban, sem az L1 expressziós kiónban nem volt kimutatható.

37. példa

A HPV18 L1 törzs (1725 törzs) és a HPV18 (L1+AL2) törzs (1727 törzs) fermentoros tenyésztése

Az 1725 és 1727 törzsek lemeztenyészetének felszínéről gyűjtött tenyészetet aszeptikus körülmények között leucinmentes tápfolyadékba oltottunk, amelynek összetétele a következő volt (1 literre számítva): 8,5 g Difco élesztő nitrogénbázis, aminosavak és ammónium-szulfát nélkül; 0,2 g adenin; 0,2 g uracil; 10 g borostyánkősav; 5 g ammónium-szulfát; 40 g glükóz; 0,25 g L-tirozin; 0,1 g L-arginin; 0,3 g L-izoleucin; 0,05 L-metionin; 0,2 g L-triptofán; 0,05 g L-hisztidin; 0,2 g L-lizin; 0,3 g L-fenilalanin. A táptalaj pH-ját a sterilizálást megelőzően NaOH-val 5,0-5,3 értékre állítottuk be. Miután a tenyésztést 28 °C-on, körkörös mozgást végző rázókészüléken 250 ford/perc mellett folytattuk, fagyasztott ampullákat (1 ml/ fagyasztóampulla) készítettünk úgy, hogy a -70 °C-on történő tárolást megelőzően a tenyészethez 17 % (tömeg/térfogat) végkoncentrációig steril glicerint adtunk. Az inokulumokat a fentivel ·· · · megegyező összetételű táptalajban állítottuk elő (500-500 ml egy-egy 2 literes palackban); a tenyésztést úgy indítottuk meg, hogy egy fagyasztott ampulla felolvasztott tartalmát a palackba oltottuk, majd azt 29 órán át, 28 ^öC-on, 250 ford/perc mellett, körkörös mozgást végző rázókészüléken inkubáltuk. A beoltást követően valamennyi törzs fermentoros tenyésztését egy New Brunswick SF-116 típusú, 10 liter hasznos térfogatú fermentorban végeztük. Az alkalmazott fermentációs tápfolyadék összetétele a következő volt (1 literre számítva) : 20 g Difco élesztőkivonat,· 10 g Sheffield HySoy pepton; 20 g glükóz; 20 g galaktóz; 0,3 ml Union Carbide UCON LB-625 habzásgátló. A sterilizálást megelőzően a táptalaj pH-ját 5,3-ra állítottuk be. A 2 literes beoltópalack teljes tartalmát (500 ml) a fermentorba vittük át, amelyet ezután 28 °C-on, 5 1 levegő/perc, 400 ford/perc, és 24 kPa nyomás mellett inkubáltunk. A rázatást szükség szerint fokoztuk, hogy az oldott oxigén telítettségi szintjét 40 % felett tartsuk. A fermentáció folyamatát a glükózszintnek a központi egységtől független (offline) készülékkel történő meghatározásával (Beckman Glucose 2 Analyzer), valamint az azzal összekapcsolt (online) tömegspektrofotométerrel (Perkin-Elmer 1200) követtük. 66 óráig tartó inkubálást követően, literenként 9,5-9,7 g száraz sejttömeg denzitást értünk el. A tenyészeteket üreges rostos szűréssel (Amicon, H5MP01-43 típusú cserélhető betéttel ellátott Amicon-DC-10 szűrőrendszerrel) körülbelül literre koncentráltuk, 2 liter foszfát pufferes fiziológiás sóoldatba átfiltráltuk, és tovább (körülbelül 1 liter81 re) koncentráltuk, majd 500 ml-es centrifugacsövekbe szétosztottuk. A sejtüledéket 8 000 ford/perc mellett, 20 percig, 4 °C-on (Sorvall-GS3-rotorban) végzett centrifugálással összegyűjtöttük. Miután a felülúszót leöntöttük, az üledékeket (összesen 191-208 g nedves sejttömeg) felhasználásig

-70 °C-on tároltuk.

38. példa

Rekombináns HPV18 LI kapszidproteinek tisztítása

Valamennyi lépést 4 °C-on végeztük, hacsak másképp nem adjuk meg.

A sejteket -70 °C-on fagyasztva tároltuk. A fagyasztott sejtjeket (nedves tömeg = 126 g) 20-23 °C-on felolvasztottuk, és 70 ml roncsoló-pufferben (Breaking buffer: 20 mmól/1 nátrium-foszfát, pH=7,2; 100 mmól/1 NaCl) szuszpendáltuk. Az elegyhez PMSF és Pepstatin-A proteázinhibitorokat adtunk 2 mmól/1, illetve 1,7 pmól/l végkoncentrációig. A sejtelegyet körülbelül 110 MPa nyomáson M110-Y Microfluidizer készülékben (Microfluidics Corp., Newton, MA), négy passzálással roncsoltuk. A roncsolt sejtelegyet a sejttörmelék eltávolítása céljából 12 000 x g-n, 40 percig centrifugáltuk. Az LI proteint tartalmazó felülúszó folyadékot kinyertük.

A felülúszó folyadékot A-puffer (20 mmól/1 MOPS, pH=7,0) hozzáadásával 1:5 arányban hígítottuk, majd A-pufferrel ekvilibrált, Fractogel® EMD TMAE-650 (M) töltetet (EM Separations, Gibbstown, NJ) tartalmazó anioncserélő oszlopra (9,0 cm átmérő x 3,9 cm) vittük fel. A-pufferrel történő mosást követően az antigént A-pufferben készített • · · ·

0,0-1,0 mól/1 NaCl-gradienssel eluáltuk. Az oszlopról lejövő frakciókban Bradford-féle eljárással meghatároztuk az összprotein mennyiséget. Ezt követően a frakciókat egyenlő összprotein tartalom mellett Western-blot vizsgálattal és SDSPAGE-t követően végzett ezüst-festéssel analizáltuk.

Az Ll proteinre nézve megfelelő tisztaságú és proteintartalmú TMAE-frakciókat elegyítettük. Az antigént ammónium-szulfátos frakcionálással koncentráltuk. Az oldatot szilárd reagens hozzáadásával, 10 perc alatt, óvatos keverés mellett ammónium-szulfáttal 35 %-ra telítettük. A mintát jégre állítottuk, és 4 órán át hagytuk kicsapódni. A mintát 16 000 g-n 45 percig centrifugáltuk. Az üledéket 20,0 ml PBS-ben (6,25 mmól/1 Na-foszfát, pH=7,2; 150 mmól/1 NaCl) szuszpendáltuk .

A szuszpendált üldéket Sephacryl-500-HR töltetet (Pharmacia, Piscataway, NJ) tartalmazó molekulaszűrő oszlopon (2,6 cm átmérő x 89 cm) kromatografáltuk. Futtató pufferként PBS-t alkalmaztunk. A kromatográfiát 20-23 °C-on végeztük. A frakciókat Western-blot vizsgálattal és SDSPAGE-t követően végzett ezüst-festéssel analizáltuk. A legtisztább frakciókat elegyítettük. A kapott összegyűjtött elegyet 43 mm átmérőjű lapos ΥΜ-100-szűrővel (Amicon, Inc., Beverly, MA) ellátott 50 ml-es keverős cellában, N₂ atmoszféra alatt, 24,5-41 kPa nyomáson koncentráltuk.

A végterméket Western-blot-eljárással, SDS-PAGE-t követően végzett kolloidális Coomassie-blue festéssel analizáltuk. Az Ll protein 50-60 %-ban homogénnek bizonyult. Az

Ll protein azonosságát Western-blot eljárással igazoltuk. A végterméket mintákra osztottuk, és -70 °C-on tároltuk. A fenti eljárás összesen 12,5 mg proteint eredményezett.

39. példa

Immunogén készítmény előállítása

A tisztított VLP-ket ismert módszerekkel formulázhatjuk, például gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokkal, stabilizátorokkal vagy vakcina adjuvánsokkal történő elegyítéssel. A találmány szerinti immunogén VLP-k vakcinákká alakíthatók oly módon, hogy azokat fiziológiásán elfogadható készítményekkel, például PBS-sel, fiziológiás sóoldattal vagy desztillált vízzel elegyítjük. Az immunogén VLP-ket a kívánt immunogén hatás eléréséhez 0,1-100 pg dózisban, előnyösen körülbelül 1-20 pg dózisban adagoljuk. A készítményben található VLP-k mennyisége különböző faktoroktól függhet, így - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - az egyén állapotától, testtömegétől, korától és nemétől. A VLP-készítmény beadható különböző módokon, például - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - szájon át, bőr alá, lokálisan, nyálkahártyán keresztül és izomba. A fenti VLP-készítmények tartalmazhatnak egyetlen VLP-típust (azaz a HPVőa típusból származó VLP-t) vagy VLP-k elegyét (azaz a HPV6a, HPV11, HPV16 és HPV18 típusokból származó VLP-ket).

A készítményhez adott esetben antimikrobiális tartósítószereket, például thiomerosalt is adhatunk. A találmány szerinti immunogén antigének kívánt esetben vakcina stabilizálószerekkel és vakcina adjuvánsokkal együtt is alkalmazhatók. Tipikus stabilizálószerek lehetnek specifikus vegyü84 letek, például polianionok, ezen belül heparin, inozitol-hexaszulfát, szulfátéit béta-ciklodextrin; lehetnek kevésbé specifikus kötőanyagok, például aminosavak, szorbit, mannit, xilit, glicerin, szacharóz, dextróz és trehalóz; valamint a stabilizálást elérhetjük az oldat jellemzőinek változtatásával, például semleges pH, magas ionerősség (körülbelül 0,52,0 mól/1 sók), valamint kétértékű kationok (Ca²⁺, Mg^2>) alkalmazásával. Alkalmazható adjuvánsok például az A1(OH)₃, és az Al(PCL). A találmány szerinti vakcina tárolható hűtőszekrényben vagy liofilizált formában.

40. példa

Ellenanyagok előállítása VLP-vel szemben Ellenanyagok előállítására tisztított VLP-ket alkalmaztunk. A leírásban ellenanyag alatt mind poliklonális, mind monoklonális ellenanyagokat, valamint azok fragmentumait, például Fv, Fab és F(ab)2 fragmentumokat értünk, amelyek képesek antigénhez vagy hapténhez kötődni. Az ellenanyagokat különböző célokra alkalmazhatjuk, például - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - rekombináns VLP-k tisztítására, natív Ll vagy L2 proteinek tisztítására és reagenskészletekben. Ilyen reagenskészletek tartalmaznak egy rekeszekre osztott hordozót, amely alkalmas legalább egy tartály szilárd tárolására. A hordozó tartalmaz továbbá reagenseket, például anti-VLP-ellenanyagokat vagy HPV kimutatására alkalmas VLP-ket vagy HPV-fragmentumokat vagy anti-HPV ellenanyagokat. A hordozó tartalmazhat továbbá a kimutatást szolgáló anyagokat, például jelölt antigént vagy enzim-szubsztrátot vagy hasonlókat. Az ellenanyagok

vagy VLP-k vagy reagenskészletek különböző célokra alkalmazhatók, így például - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - törvényszéki analízisekre, valamint epidemiológiai vizsgálatokra.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Izolált és tisztított papillomavírus Ll, L2 és L1+L2 protein vagy azok funkcionális származéka, amely legalább 60 %-ban tiszta.
2. Az 1. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a papillomavírus humán papillomavírus vagy gyapjasfarkú nyúl papillomavírus.
3. A 2. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a papillomavírus a HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18,

HPV31, HPV33, HPV35, HPV41, HPV45 és HPV58 típusú valamelyike .
4. Az 1. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a protein szintetizáló rendszerben lett előállítva, és a szintetizáló rendszer rekombináns gazdasejtet tartalmaz.
5. Az 1. igénypont szerinti proteint tartalmazó kapszidok.
6. Az 1. igénypont szerinti proteint tartalmazó vírusszerű részecskék.
7. Eljárás az 1. igénypont szerinti tisztított protein előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) gazdasejteket rekombináns DNS-molekulával transzformálunk, ahol a rekombináns DNS molekula papillomavírus Ll proteint, papillomavírus L2 proteint, papillomavírus (L1+L2) proteint vagy ezek funkcionális származékát kódolja, (ii) a transzformált gazdasejteket a rekombináns DNS molekula expresszálódását lehetővé tevő feltételek mellett tenyésztjük; és (iii) a kapott nyers, rekombináns papillomavírus proteint tisztítjuk.
8. Rekombináns papillomavírus protein, amely a 7. igénypont szerinti eljárással lett előállítva.
9. Kapszidok, amelyek a 7. igénypont szerinti proteineket tartalmaznak.
10. Vírusszerű részecskék, amelyek a 7. igénypont szerinti proteineket tartalmaznak.
11. Vakcina, amely valamely az 1. igénypont szerinti proteineket tartalmaz.
12. Gyógyászati készítmény, amely valamely az 1. igénypont szerinti proteineket tartalmaz.
13. Eljárás papillomavírus fertőzés kezelésére vagy megelőzésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdaszervezetnek egy a 11. igénypont szerinti vakcinát adagolunk.
14. Reagenskészlet papillomavírus vagy papillomavírussal szemben termelődött ellenanyagok kimutatására, azzal jellemezve, hogy reagensként valamely az 1. igénypont szerinti papillomavírus proteint kódoló DNS-molekulát, valamely az 1. igénypont szerinti proteint, valamely az 1. igénypont szerinti proteint tartalmazó vírusszerű részecskét, valamely az 1. igénypont szerinti proteinnel szemben termelődött ellenanyagot vagy valamely az 1. igénypont szerinti proteint tartalmazó vírusszerű részecskékkel szemben termelődő ellenanyagot tartalmaz.
15. Eljárás kapsziddá vagy vírusszerű részecskévé összeépült rekombináns papillomavírus kapszidprotein előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) legalább egy papillomavírus kapszidproteint kódoló papillomavírus gént vektorba klónozunk;

(ii) a vektort gazdasejtbe juttatjuk;

(iii) a kapott rekombináns gazdasejtet a papillomavírus kapszidprotein termelődését lehetővé tevő feltételek mellett tenyésztjük; és (iv) a papillomavírus kapszidproteint tisztítjuk.
16. Kapszidok, amelyek a 15. igénypont szerinti eljárással készültek.
17. Vírusszerű részecskék, amelyek a 15. igénypont szerinti eljárással készültek.
18. Eljárás gerincesben immunválasz létrehozására, azzal jellemezve, hogy egy gerincesnek valamely a 15. igénypont szerinti tisztított proteint vagy valamely a 15. igénypont szerinti kapszidot vagy valamely a 15. igénypont szerinti vírusszerű részecskéket adagolunk.
19. Eljárás állatban immunválasz létrehozására, azzal jellemezve, hogy az állatnak valamely az 1. igénypont szerinti proteint adagolunk.
20. A 4. igénypont szerinti szintetizáló rendszer, amely transzformált rovarsejtek, transzformált élesztősejtek, transzformált baktériumsejtek, transzformált gombasejtek, transzformált növénysejtek és transzformált állati sejtek valamelyike.
21. A 20. igénypont szerinti rendszer, ahol az élesztő Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis és Schizosaccharomyces pombe valamelyike.

I
22. A 21. igénypont szerinti rendszer, ahol a Saccharomyces cerevisiae törzs a 2150-2-3, U9, 1372, 1372ura3, 1372-his3, 1558, 1524, 1537, 1541, 1582, és 1569 jelű törzsek valamelyike.