CN116426396B - 一株耐硫酸铵酿酒酵母及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐硫酸铵酿酒酵母及其筛选方法，涉及生物技术领域，命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Z‑1，并于2023年03月03日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63227，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。本发明提供的耐硫酸铵酿酒酵母Z‑1可在1.0 mol/L NH4 +（6.6%硫酸铵）的环境下生长繁殖，且蛋白含量能够达到51.97%，以其作为蛋白饲料发酵菌株，不仅可以适应高耐受环境，还可以增加蛋白饲料的蛋白含量，是用于固态发酵的优良菌株。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一株耐硫酸铵酿酒酵母及其筛选方法。
背景技术
酿酒酵母具有很多优点，如生长周期短，发酵能力强、容易进行大规模培养，含有多种蛋白质、氨基酸、维生素、生物活性物质等丰富的营养成分等，在食品、医药等领域被广泛应用。同时，酿酒酵母也常被当做蛋白饲料的主要发酵菌株，在蛋白饲料中添加酿酒酵母，可以有效地提高饲料的营养价值，改善动物的生长发育状况；还可以改善饲料的风味和适口性，增加饲料的香味，从而提高动物对饲料的食欲和摄食量。此外，酿酒酵母中还含有丰富的有机酸和抗生素，可以替代一部分抗生素的使用，从而降低了养殖成本。在发酵过程中酿酒酵母的蛋白含量和耐受性一直是目前研究的热点。在蛋白饲料的生产中，硫酸铵为菌株的生长提供氮源，但高浓度的硫酸铵会抑制酵母菌的生长。利用耐盐酿酒酵母发酵蛋白饲料，可以增强其抗逆能力，使其在高渗透压的环境下仍能正常生长和发酵，从而提高产品的稳定性和质量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株耐硫酸铵酿酒酵母及其筛选方法，该耐硫酸铵酿酒酵母可以在较高浓度的硫酸铵环境下生长繁殖，是用于蛋白饲料固态发酵的优良菌株。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一株耐硫酸铵酿酒酵母，命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Z-1，并于2023年03月03日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63227，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
进一步地，所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Z-1能在1.0 mol/L NH4 +浓度环境下生长繁殖。
本发明还提供一种耐硫酸铵酿酒酵母的筛选方法，包括以下步骤：
S1：从葡萄自然发酵液中分离出多株酿酒酵母，并得到种子液，对多株酿酒酵母的种子液进行编号；
S2：初步筛选耐盐酿酒酵母：将S1中编号的酿酒酵母种子液分别接种于不同NH4 +浓度的硫酸铵琼脂培养基上进行培养，筛选出菌落大且饱满的3-5株酿酒酵母：
S3：测定生长曲线：将S1中编号的酿酒酵母种子液分别接种于YPD液体培养基中进行培养，绘制生长曲线并确定生长稳定期，筛选出生长稳定期内生长情况优良的3-5株酿酒酵母；
S4：测定蛋白含量：将S1中编号的酿酒酵母种子液接种于YPD液体培养基中进行培养得菌悬液，培养后测量菌悬液中蛋白含量，筛选出蛋白含量较多的3-5株酿酒酵母；
S5：综合分析比较S2、S3、S4中筛选出的酿酒酵母，从而筛选出高耐盐、生长情况优良的高蛋白酿酒酵母菌株。
进一步地，所述步骤S1中从葡萄自然发酵液中分离出15株酿酒酵母，并分别编号为：Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6、1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9。
进一步地，所述步骤S2中测定生长曲线的具体操作步骤为：将分离得到的15株酿酒酵母种子液分别取4 μL整齐的点在含有0 mol/L、0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8mol/L、1.0 mol/L、1.2 mol/L NH4 +的硫酸铵琼脂培养基上，30℃恒温培养箱倒置培养48 h；每个水平做3个重复，经48h培养后筛选菌落大且饱满的酿酒酵母。
进一步地，所述步骤S3中测定生长曲线的具体方法为：将步骤S1分离得到的15株酿酒酵母种子液分别以1％的接种量分别接种到300 mL YPD液体培养基中，同时做一组未接种酿酒酵母种子液的空白对照，于30℃、180 rpm条件下振荡培养，并于接种后0 h、2 h、4h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h分别取样3mL，以空白对照调零，测定酿酒酵母在600 nm处的吸光值，然后以酿酒酵母吸光值作为纵坐标，生长时间作为横坐标，绘制生长曲线，筛选出生长稳定期内生长情况优良的3-5株酿酒酵母。
进一步地，所述步骤S4中测定蛋白含量的具体方法为：将步骤S1分离得到的15株酿酒酵母种子液以1％的接种量分别接种至300 mL YPD液体培养基，于30℃、180 rpm的条件下振荡培养48 h，得菌悬液；对每一瓶菌悬液中的蛋白质含量进行测定；筛选出蛋白含量较多的3-5株酿酒酵母。
进一步地，所述步骤S2、S3、S4中酿酒酵母种子液的OD600均一致。
进一步地，步骤S4中对每一瓶菌悬液中的蛋白质含量进行测定时，每一组重复三次，且具体操作方法为：
将发酵培养48 h后的菌悬液，4500 rpm离心10 min，弃上清，用蒸馏水洗涤，洗涤重复3次后，放入 105℃烘箱内烘至恒重或冷冻干燥至恒重，冷却后利用 GB/T5009.5-2003规定测定蛋白含量方法对酵母菌体测定粗蛋白含量，如下：
式中：V2—滴定样品消耗的标准盐酸溶液体积mL；
V1—空白对照所需的标准盐酸溶液体积mL；
C—标准盐酸溶液的浓度；
m—试样的质量g；
V—试样消解液总体积mL；
V＇—蒸馏用消解液体积mL；
0.0140—每毫克当量氮的克数；
6.25—氮换算成蛋白质的平均系数。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的耐硫酸铵酿酒酵母Z-1可在1.0 mol/L NH4 +（6.6%硫酸铵（W/V））的环境下生长繁殖，不仅可以适应固态发酵的高渗环境，同时还可利用相对廉价的硫酸铵无机盐转化为蛋白质。相对于现有菌株，本发明菌株蛋白含量能够达到51.97%，以其作为蛋白饲料发酵菌株，不仅可以适应高耐受环境，还可以增加蛋白饲料的蛋白含量，是用于固态发酵的优良菌株。
附图说明
图1为本发明中的初步筛选耐盐酿酒酵母生长情况；
图2为本发明中的生长曲线测定结果图；
图3为酿酒酵母Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6在生长稳定期（14~20 h）的生长曲线图；
图4为酿酒酵母1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9在生长稳定期（14~20 h）的生长曲线图；
图5为本发明中蛋白含量检测结果条形图；
图6为本发明中酿酒酵母Z-1在不同盐浓度平板下的生长情况；
图7为本发明中酿酒酵母Z-1在不同盐浓度下生长曲线测定结果。
具体实施方式
下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
本实施例提供一株耐硫酸铵酿酒酵母，命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Z-1，并于2023年03月03日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC NO：63227，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例还提供一种耐硫酸铵酿酒酵母的筛选方法，该耐硫酸铵酵母是葡萄自然发酵液中分离出的一株酿酒酵母，经以步骤筛选得到的：
（1）从葡萄自然发酵液中分离出15酿酒酵母，并得到种子液，对这15株酿酒酵母种子液编号为：Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6、1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9。
（2）初步筛选耐盐酿酒酵母：
将（1）中分离得到的15株酿酒酵母种子液分别取4 μL整齐的点在含有0 mol/L、0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、1.2 mol/L NH4 +的硫酸铵琼脂培养基上，30℃恒温培养箱倒置培养48 h；每个水平做3个重复（每一个培养基中接种三次，得到三个菌落，如图1所示），经48h培养后筛选菌落大且饱满的酿酒酵母。
培养48h后，对上述15株酿酒酵母进行观察，其生长情况如图1所示。由图可知，在0-0.6 mol/L NH4 +存在的条件下，所有菌株都可以生长，所有菌株的生长无明显差异，且菌落大小随着盐浓度的增加而变小。在0.8 mol/L NH4 +存在的条件下，酿酒酵母Z-1、Z-2、Z-3、Z-5、1-1、1-2、1-3、1-5、1-7、1-9可以生长，但大部分菌落直径较小，且菌落不紧密，只有酿酒酵母Z-1和酿酒酵母Z-3的菌落更大更饱满。在1.0 mol/L NH4 +存在的条件下，只有酿酒酵母Z-1和酿酒酵母Z-3可以生长，酿酒酵母Z-3的菌落较小，酿酒酵母Z-1的菌落更大。在1.2mol/L NH4 +存在的条件下，所有菌株均不生长。说明酿酒酵母Z-1和酿酒酵母Z-3具有较强的耐盐性，且酿酒酵母Z-1的耐盐性要强于酿酒酵母Z-3。
（3）测定生长曲线：
将（1）中分离得到的15株酿酒酵母种子液以1％（OD600=0.8）的接种量分别接种到300 mL YPD液体培养基中，同时做一组未接种酿酒酵母种子液的空白对照。于30℃、180rpm条件下振荡培养，并于接种后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20h、22 h、24 h分别取样3 mL，以空白对照调零，测定酿酒酵母在600 nm处的吸光值，然后以酿酒酵母吸光值作为纵坐标，生长时间作为横坐标，绘制生长曲线，从生长稳定期的生长情况来选择最优的菌株。
对上述15株酿酒酵母绘制生长曲线，如图2所示，可知15株酿酒酵母的生长趋势基本一致。即培养后 0~6 h为菌株生长延滞期，6~12 h细胞数以几何级数增长，此阶段菌株生长进入对数生长期，菌株培养时间至14~20h 后菌体的产量达到了最高点，此阶段为菌株生长稳定期。处于对数生长期内的菌体，其营养条件充足，生长速度较快，代谢能力较强，并且处此生长阶段的细胞性质较稳定统一，并对理化因素的变化较为敏感，对盐胁迫较为敏感，所以一般选用处于该生长时期的细胞进行实验研究。图3和图4为图2的局部放大图，其中图3为酿酒酵母Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6在生长稳定期（14~20 h）时候的生长曲线图，从图中可知酿酒酵母Z-1在生长稳定期的生长情况优于其他菌株，且酿酒酵母Z-1的OD600＞2.0；图4为酿酒酵母1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9在生长稳定期（14~20 h）时候的生长曲线图，通过对比，酿酒酵母1-2、1-5在生长稳定期的生长情况优于本图中的其他，但酿酒酵母1-2、1-5的OD600＜2.0。通过综合分析酿酒酵母Z-1酿酒酵母Z-1生长情况优于其他14株菌。
（3）测定蛋白含量：
将（1）中编号的15株酿酒酵母种子液以1％（OD600=0.8）的接种量分别接种至300mL YPD液体培养基，于30℃、180 rpm的条件下振荡培养48 h，得菌悬液。对每一瓶菌悬液中的蛋白质含量进行测定，重复三次。筛选出蛋白含量最高的菌株。
将发酵培养48 h后的菌悬液，4500 rpm离心10 min，弃上清，用蒸馏水洗涤，洗涤重复3次后，放入 105℃烘箱内烘至恒重或冷冻干燥至恒重，冷却后利用 GB/T 5009.5-2003 规定测定蛋白含量方法对酵母菌体测定粗蛋白含量，如下：
式中：V2—滴定样品消耗的标准盐酸溶液体积mL；
V1—空白对照所需的标准盐酸溶液体积mL；
C—标准盐酸溶液的浓度；
m—试样的质量g；
V—试样消解液总体积mL；
V＇—蒸馏用消解液体积mL；
0.0140—每毫克当量氮的克数；
6.25—氮换算成蛋白质的平均系数。
将上述25株酿酒酵母进行蛋白含量的检测，检测结果如下表，将其转化成更直观的条形图，如图5所示。
注：小写字母不同表示差异显著（P<0.05），大写字母不同表示差异极显著（P<0.01）。
由上表和图5可知，15株酿酒酵母的单细胞蛋白含量在30%~55%之间，酿酒酵母Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-6、1-3、1-4、1-5的蛋白含量均在40%以上。其中酿酒酵母Z-1蛋白含量为51.97%，酿酒酵母Z-2蛋白含量为42.7%，酿酒酵母Z-3蛋白含量为45.7%，酿酒酵母Z-4蛋白含量为50.13%，酿酒酵母Z-6蛋白含量为41.93%，酿酒酵母1-3蛋白含量为43.77%，酿酒酵母1-4蛋白含量为48.3%，酿酒酵母1-5蛋白含量为46.77%。酿酒酵母Z-1和酿酒酵母Z-4单细胞蛋白含量相对于其他酿酒酵母较高，分别达到了51.97%和50.13%。所以根据蛋白含量筛选出酿酒酵母Z-1和Z-4。
结合酿酒酵母耐盐筛选、生长曲线测定、蛋白量的测定结果，最终确定酿酒酵母Z-1为耐盐菌株，并于2023年03月03日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC NO：63227，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
对上述酿酒酵母Z-1分别进行如下测试：
（1）测定酿酒酵母Z-1在不同盐浓度平板下的生长情况：
取酿酒酵母Z-1种子液（OD600=0.8）按照100、10-1、10-2、10-3、10-4进行梯度稀释，各取4 μL分别整齐的点在含有0 mol/L，0.2 mol/L，0.4 mol/L，0.6 mol/L，0.8 mol/L和1.0mol/L NH4 +硫酸铵琼脂培养基上， 30℃恒温培养箱倒置培养48 h，通过观察培养基上菌落大小、疏密程度等判断菌株的耐盐能力。
酿酒酵母Z-1在不同盐浓度平板下的生长情况如图6所示，可知，在不添加NH4 +的情况下，酿酒酵母Z-1的生长无明显差异，培养48 h后可以在10-4稀释倍数下观察到清晰的菌落生长。当培养基中NH4 +浓度达到0.2 mol/L时，酿酒酵母Z-1在100~10-2稀释倍数下相较于对照组（NH4 +浓度0 mol/L）菌落无太大差异，形成的菌落范围变小。酿酒酵母Z-1在10-3~10-4稀释倍数下形成的菌落相对于对照组（NH4 +浓度0 mol/L）较大较饱满。当培养基中NH4 +浓度达到0.4 mol/L时，酿酒酵母Z-1在100~10-4稀释倍数下能观察到清晰的菌落生长。当培养基中NH4 +浓度达到0.6 mol/L时，酿酒酵母Z-1在10-4稀释倍数下受到轻微抑制。当培养基中NH4 +浓度达到0.8 mol/L时，酿酒酵母Z-1在10-4稀释倍数下受到轻微抑制，菌落变小。当培养基中NH4 +浓度达到1.0 mol/L时，酿酒酵母Z-1在10-4稀释倍数下受到抑制，菌落范围变小，酿酒酵母Z-1能在1.0 mol/L的NH4 +浓度下生长。
（2）测定不同盐浓度下酿酒酵母Z-1的生长曲线：
将酿酒酵母Z-1种子液以1％（OD600=0.8）的接种量分别接种至含有0 mol/L、0.2mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L和1.0mol/L NH4 +的YPD液体培养基中，同时做一组空白对照（未接种酿酒酵母Z-1的培养基）。于30℃、180rpm条件下振荡培养48h，间隔4h取一次样，分别取样3mL，以空白对照调零，测定酿酒酵母在600 nm处的吸光值，然后以酿酒酵母Z-1的吸光值作为纵坐标，生长时间作为横坐标，绘制生长曲线。
绘制的生长曲线如图7所示，由图可知，在NH4 +浓度达到0.2 mol/L时，酿酒酵母Z-1的生长能力与对照组相比无显著差异。当NH4 +浓度达到0.4 mol/L时，酿酒酵母Z-1的生长能力均有所下降。当NH4 +浓度达到0.6 mol/L时，酿酒酵母Z-1的生长能力均有所下降，有一定时间的迟滞期。当NH4 +浓度达到0.8 mol/L时，酿酒酵母Z-1的生长能力下降较为明显。当NH4 +浓度达到1.0 mol/L时，酿酒酵母Z-1的生长能力下降尤为明显，在16h后缓慢增长达到稳定期。
本发明提供的耐硫酸铵酿酒酵母Z-1可在1.0 mol/L NH4 +（6.6%硫酸铵）的环境下生长繁殖，不仅可以适应固态发酵的高渗环境，同时还可利用相对廉价的硫酸铵无机盐转化为蛋白质，相对于现有菌株，本发明菌株蛋白含量能够达到51.97%，以其作为蛋白饲料发酵菌株，不仅可以适应高耐受环境，还可以增加蛋白饲料的蛋白含量，是用于固态发酵的优良菌株。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1. 一株耐硫酸铵酿酒酵母，其特征在于，命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Z-1，并于2023年03月03日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63227，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2. 权利要求1所述的耐硫酸铵酿酒酵母的应用，其特征在于，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Z-1能在1.0 mol/L NH4 +浓度环境下作为蛋白饲料的发酵菌株。
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