CN101851281A

CN101851281A - 新蛋白质,编码该蛋白质的基因和它们的使用方法

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Publication number: CN101851281A
Application number: CN201010167264A
Authority: CN
Inventors: 高仓由光
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 2001-03-12
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2010-10-06
Anticipated expiration: 2022-03-12
Also published as: EP1369476A1; JP4758448B2; WO2002072817A1; ATE474919T1; JP4257119B2; CA2440424A1; KR20030087640A; HK1147504A1; PT1369476E; CN1505681A; US20090187006A1; DK1865059T3; US20100251429A1; US20050089983A1; ES2346405T3; US20110107469A1; EP1369476A4; CN1721434A; AU2002236300B2; DE60237073D1

Abstract

本发明的目的是筛选和鉴定新的抗微生物蛋白，浓度甚至相对较低的该蛋白质也能抑制植物病原菌的生长，所述病原菌包括Magnaporthe grisea和茄属丝核菌，它们能导致损害水稻作物的两种主要疾病。本发明的另一目的是克隆该蛋白质的基因。根据本发明，提供了抗微生物蛋白，可通过硫酸铵沉淀法使用自白黄侧耳水提取物沉淀的级分来获得该蛋白质，其中所述蛋白质具有至少稻瘟病的抗微生物活性，其在SDS-PAGE法中，显示出分子量约为15kDa的组分的存在。本发明还提供了编码该蛋白质的基因和使用它们的方法。

Description

新蛋白质，编码该蛋白质的基因和它们的使用方法

此案是中国申请200510089749.9的分案申请，该母案的申请日是2002年3月12日，本分案采用了与该母案一致的发明名称。

发明领域

本发明涉及一种具有抗菌活性(antifungal activity)的新的蛋白质和制备它的方法，编码该蛋白质的基因，和利用该蛋白质和基因的方法。具体地，本发明涉及一种源自于至少对稻瘟病(Magnaporthe grisea)具有抗菌活性的白黄侧耳(Pleurotus cornucopiae)的蛋白质，编码该蛋白质的基因，及利用该蛋白质和基因的方法。

本申请的要求基于2001年3月12日提交的日本专利申请2001-68894的优先权，其全部内容并入以作参考。

背景技术

诸如壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的分解酶已知是具有抗植物病原微生物的抗菌活性的植物蛋白。体外实验已经表明这些酶如果单独使用可以发挥作用(Schlumbaum et al.(1986)，Nature 324，pp.365-367)，而如果使用两种或更多种这样的酶组合一般可以增强效果(Mauch et al.(1988)，Plant Physiol.88，pp 936-942)。已知这些分解酶抗丝状真菌的生长抑制浓度在单独使用时一般地约为几十到几百μg/ml，或者在组合使用时分别约为几μg/ml。然而这些分解酶中没有一个被报道具有抗稻瘟病(Magnaporthe grisea)的抗真菌效果，稻瘟病对水稻作物可造成严重损害。

低分子量的抗菌肽(AFP)例如防卫素也具有抗微生物活性。其中，Ca-AMP1(Japanese Domestic Announcement No.505048/96)，CB-1(Oita et al.(1996)，Biosci.Biotech.Biochem.60，pp.481-483)，Rs-AFP1和Rs-AFP2(Terras et al.1992，J.Biol.Chem.267，pp.15301-15309)，和Ace-AMP1(Japanese Domestic Announcement No.501424/97)已经被报道具有抗稻瘟病的抗菌效果。这些低分子量的肽抑制包括上面提到的浓度为几μg/ml左右的各种植物病原微生物50％的生长。

通过分离分解酶或低分子量的抗菌肽基因并转染植物已尝试制备抗病植物(Broglie et al.(1991)，Science 254，pp.1194-1197；Terras et al.(1995)，ThePlant Cell 7，pp.573-588)。最近稻的研究表明通过过表达源于稻的壳多糖酶获得的转化体稻增加稻瘟病抗性(Nishizawa et al.(1999)Theor.Appl.Genet.99：383-390)。

其它通过基因导入制备的抗病原微生物的植物已经被报道例如PR蛋白(Alexander et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：pp.7327-7331)，葡糖氧化酶(Wu et al.(1995)Plant Cell 7：PP.1357-1368)，芪合成酶(stilbenesynthase)(Hain et al.(1993)Nature 361：pp.153-156)，等。

然而，现有的许多实例并没有获得实际上具有实用性水平的抗性的转基因植物。这是归因于转基因的低水平表达，更本质上是目前报道的抗菌蛋白本身具有很低的抗菌活性。因此，希望能够鉴定并在实践上应用比常规更有强大的抗菌的蛋白。

发明内容

本发明的目的是寻找并鉴定一种新的以较低浓度能抑制各种病原微生物，包括导致水稻作物严重损害的稻瘟病(Magnaporthe grisea)的微生物生长的抗菌蛋白质。

本发明另一目的是克隆编码所述新蛋白质的基因，并测定它的核苷酸序列。

本发明另一目的是将本发明的基因导入宿主生物体(微生物，动物，植物等)以制备转化体，并由此实际应用本发明的基因。

本发明另一目的是提供一种含有本发明抗菌蛋白的抗菌试剂。

更具体地，本发明涉及：

1.显示生物素结合活性的蛋白，其中所述蛋白具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或在所述序列中有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列，或与所述序列具有52％或更高同源性的氨基酸序列。

2.项1的蛋白，具有与SEQ ID NO：4的氨基酸序列有60％或更高同源性的氨基酸序列。

3.项1的蛋白，具有与SEQ ID NO：4的氨基酸序列有66％或更高同源性的氨基酸序列。

4.项1的蛋白，具有与SEQ ID NO：4的氨基酸序列有70％或更高同源性的氨基酸序列。

5.项1的蛋白，具有与SEQ ID NO：4的氨基酸序列有80％或更高同源性的氨基酸序列。

6.项1的蛋白，具有与SEQ ID NO：4的氨基酸序列有90％或更高同源性的氨基酸序列。

7.项1的蛋白，具有与SEQ ID NO：4的氨基酸序列有95％或更高同源性的氨基酸序列。

8.由单独的多肽或其组合组成的蛋白，其中所述多肽选自：

由SEQ ID NO：4的8-141的部分氨基酸序列组成的多肽，和

在任一所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸修饰的多肽，和

与任一所述氨基酸序列具有52％或更高的同源性的氨基酸序列的多肽；

其中所述多肽显示生物素结合活性。

9.项1-8中任一项所述的蛋白，该蛋白在水溶液中是可溶的。

10.制备项1-9中任一项所述的显示生物素结合活性的蛋白的方法，其中包括：

回收通过硫酸铵沉淀法，用75％饱和的硫酸铵沉淀的白黄侧耳含水提取物的级分；和

对所述级分进行离子交换柱层析以回收用浓度50mM-600mM的NaCl洗脱的级分。

11.编码项1-9中任一项所述的蛋白的基因。

12.项11的基因，其中所述基因具有SEQ ID NO：3碱基226-651的碱基序列，或具有在此碱基序列中取代，缺失，插入和/或添加一个或多个碱基的碱基序列，或能在严谨条件下与上述任一碱基序列杂交的碱基序列。

13.项11或12的基因，具有与SEQ ID NO：3碱基226-651的碱基序列有60％或更高的同源性的碱基序列。

14.项11或12的基因，具有与SEQ ID NO：3碱基226-651的碱基序列有70％或更高的同源性的碱基序列。

15.项11或12的基因，具有与SEQ ID NO：3碱基226-651的碱基序列有73％或更高的同源性的碱基序列。

16.项11或12的基因，具有与SEQ ID NO：3碱基226-651的碱基序列有80％或更高的同源性的碱基序列。

17.项11或12的基因，具有与SEQ ID NO：3碱基226-651的碱基序列有90％或更高的同源性的碱基序列。

18.项11或12的基因，具有与SEQ ID NO：3碱基226-651的碱基序列有95％或更高的同源性的碱基序列。

19.通过以下方法产生的用于得到编码源自白黄侧耳的生物素结合蛋白的基因的寡核苷酸，所述方法包括：

根据以下要求，从SEQ ID NO：3的编码所述蛋白的基因的碱基序列中选择两个区域：

1)每个区域长15-30个碱基；

2)每个区域碱基序列中G+C的含量的比例为40-60％；

制备单链DNA，该DNA具有与所述区域的碱基序列相同或互补的碱基序列，或者制备单链DNA的混合物，该单链DNA基于遗传密码简并性不改变所述单链DNA编码的氨基酸序列；和

任选制备修饰的所述单链DNA，所述修饰不改变所述单链DNA与编码所述生物素结合蛋白的基因的碱基序列的结合特异性。

20.项19的寡核苷酸，其具有SEQ ID Nos：16-19任一所述的核苷酸序列。

21.分离项11-18中任一项的基因的方法，其中所述方法包括：

使用项19或20的两种寡核苷酸作为引物对和白黄侧耳子实体的cDNA文库为模板进行核酸扩增反应，从而扩增项1-9中任一项所述的蛋白的编码基因的一部分，和

使用如此获得的扩增产物作为探针筛选该cDNA文库，从而分离全长cDNA克隆。

22.含有项11-18中任一项基因的重组载体。

23.项22的重组载体，其为表达载体。

24.转化的宿主细胞，其通过将项22或23的重组载体导入宿主生物体而获得。

25.由项24的转化的宿主细胞产生的重组蛋白。

26.制备生物素结合蛋白的方法，其包括用项11-18任一项的基因来转化宿主细胞，并从得自被破碎的宿主细胞的可溶性级分回收生物素结合蛋白。

27.项26的制备生物素结合蛋白的方法，其特征在于包含通过使用生物素类似物来进行亲和纯化的步骤。

28.抗项1-9中任一项的蛋白的抗体。

附图说明

图1显示通过本发明抗菌蛋白质抑制M.grisea的生长的外观(在80℃加热10分钟蛋白质组分的存在下，培养48小时)。

图2显示由Q-Sepharose FF柱分离的与抗菌活性有关的白黄侧耳蛋白质级分电泳图。M代表分子量标记，FT代表已经通过柱的组分。泳道下面的符号(-，+，++)表示抗菌活性的强度。括号中显示的抗菌活性是显示与本发明所述的纯化物不同的抗菌活性的级分。

图3显示的是与抗菌活性有关的由MonoQ柱分离白黄侧耳抗菌蛋白质表。显示抗菌活性洗脱的位置用+表示。

图4由Mono Q柱分离的与抗菌活性有关的白黄侧耳蛋白质电泳图。泳道上的数字对应于图3中的级分号，M代表分子量标记，Ori表示上样于Mono Q上的Q-Sepharose级分。泳道下面的符号(-，+，++)表示抗菌活性的强度。箭头表示抗菌蛋白质(15kDa)。

图5显示与抗菌活性有关的由Superose 6的白黄侧耳抗菌蛋白的纯化表。箭头表示Gel过滤标准的(BIO-RAD)的洗脱位置。显示抗菌活性级分的位置用+表示。

图6显示与抗菌活性有关的Superose 6纯化的白黄侧耳蛋白的电泳图。泳道上的数字对应于图5中的级分号，Ori表示上样于Superose 6上的MonoQ级分。泳道下面的符号(-，+，++)表示抗菌活性的强度。箭头表示抗菌蛋白质(15kDa)。

图7显示tamavidin 1和tamavidin 2，链霉抗生物素蛋白和其同系物，和抗生物素蛋白的氨基酸序列(成熟蛋白质区)的分子分类树。

图8显示通过添加生物素消除抗菌活性实验结果。将悬浮于1/2PD培养基的M.grisea孢子置于微量滴定板上。制备含有1000ng/ml纯化的tamavidin 1，链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的孔，进一步含有除了这些相同浓度的蛋白外又添加了100ng/ml的生物素，再进一步制备不含蛋白的孔并在28℃温育48小时。同时含有50ng/ml纯化tamavidin 1的孔也显示出来。

图9显示在亚氨基生物素柱上纯化在大肠杆菌中表达的重组tamavidin2。C表示总的可溶的没有IPTG诱导的大肠杆菌蛋白质级分，T代表由1mMIPTG诱导的总的大肠杆菌可溶性蛋白质级分，F代表在由1mM IPTG诱导的总的大肠杆菌可溶性蛋白质级分中，没有和亚氨基生物素柱结合已经通过的蛋白质级分，W代表通过相同柱经过洗涤处理洗脱的级分，E代表用酸性缓冲液洗脱的级分。箭头表示tamavidin 2蛋白质(约15kDa)，M表示分子量标记(LMW标记试剂盒：Pharmacia LKB)。

具体实施方式

为了解决上述的问题，本发明人首先建立了体外评估抗稻瘟病的抗真菌活性的鉴定系统。

然后，从食用蘑菇白黄侧耳中提取蛋白质级分，并通过组合的离子交换层析和凝胶过滤层析进行抗菌试验以鉴定分离和纯化抗菌蛋白级分。测定了所纯化蛋白质的部分氨基酸序列，以此为模板合成寡DNA，然后通过RT-PCR获得编码该蛋白质的部分长度的cDNA。随后，使用该部分长度的cDNA为探针，筛选白黄侧耳子实体的cDNA文库以鉴定编码该蛋白质的全长cDNA，并测定其全部核苷酸序列。因此，鉴定白黄侧耳抗菌蛋白的全部氨基酸序列和编码它的基因的核苷酸序列，从而完成了本发明。

因此，根据第一方面，本发明提供了抗菌蛋白，可使用自白黄侧耳含水提取物通过硫酸铵沉淀法沉淀级分来获得该蛋白质，其中该蛋白质具有至少抗稻瘟病的抗菌活性，并通过SDS-PAGE方法显示有分子量约为15kDa组分的存在。

通常，本发明抗菌蛋白具有所附序列表中SEQ ID NO：2所示的143氨基酸序列。该蛋白质包括由SDS-PAGE估测的分子量约为15kDa、由一个单元组成的多肽(对应于由序列表中SEQ ID NO：2所示8-143氨基酸组成的多肽)。该蛋白质还被鉴定为具有通过凝胶过滤柱测定为约30kDa分子量特征的蛋白质。

本发明的抗菌蛋白还包括具有序列表中SEQ ID NO：4所示的141氨基酸的蛋白质。具有序列表中SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的蛋白质还包括由SDS-PAGE估测的分子量约为15kDa由一个单元组成的多肽和通过凝胶过滤柱测定分子量约为30kDa的多肽单元，类似于具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质。

本发明的抗菌蛋白包括不仅具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列，还包括与该氨基酸序列相比包含一个或多个氨基酸修饰的氨基酸，或与该氨基酸序列有52％或更高同源性的氨基酸，并且显示抗稻瘟病的抗菌活性的蛋白质。

本发明的抗菌蛋白优选的是与序列表中SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列具有52％或更高，更优选为60％或更高，还优选为70％或更高，还优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高的同源性。

关于本发明抗菌蛋白的与每个特定的氨基酸序列“具有52％或更高同源性的蛋白质”的定义是指其至少具有52％同源性，优选具有60％或更高，更优选为70％或更高，还更优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高的同源性。

本发明第二方面提供一种抗菌蛋白，其包括或者是一种或者是序列表中SEQ ID NO：2或4的部分氨基酸序列组成的多肽组合，例如由序列表中由SEQ ID NO：2所示部分氨基酸序列8-143或由SEQ ID NO：4所示部分氨基酸序列8-141组成的多肽；和具有的氨基酸序列在其中所述的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸改变的多肽，以及与所述的氨基酸序列有52％或更高同源性的氨基酸，并且显示抗稻瘟病的抗菌活性的多肽。

本发明第三方面提供一种制备抗菌蛋白质的方法，其包括：

回收通过硫酸铵沉淀法，用75％-饱和硫酸铵沉淀的白黄侧耳的含水提取物的级分；和

对所述级分进行离子交换柱层析以回收用50mM-600mM的NaCl洗脱的级分。

本发明第四方面提供了编码本发明抗菌蛋白的基因。

本发明的基因通常由序列表中SEQ ID NO：1的碱基71-502的核苷酸序列，或SEQ ID NO：3碱基226-651核苷酸序列(此后有时简单地表示“SEQ IDNO：1或3的核苷酸序列”)，或包含在所述碱基序列中取代，缺失，插入和/或添加一个或多个碱基的核苷酸序列，或在严谨条件下与所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列组成。

本发明的基因具有的碱基序列通常与SEQ ID NO：1的碱基71-502的核苷酸序列或SEQ ID NO：3碱基226-651的核苷酸序列具有60％或更高，更优选为70％或更高，还更优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高的同源性。

本发明第五方面提供了通过以下方法产生的寡核苷酸，所述寡核苷酸可用于得到编码源自白黄侧耳的抗菌蛋白，所述方法包括：

从SEQ ID NO：1或3编码抗菌蛋白之基因的碱基序列中选择满足以下需求的两个区域：

1)每个区域长为15至30个碱基；和

2)每个区域碱基序列中的G+C百分含量为40至60％；

制备单链DNA，该DNA具有与所述区域的碱基序列相同或互补的碱基序列，或者制备单链DNA混合物，基于遗传密码简并性而不会改变所述单链DNA所编码的氨基酸残基的序列；

并任选制备修饰的单链DNA，所述修饰没有改变单链DNA与编码所述抗菌蛋白之基因的碱基序列结合的特异性。

本发明的寡核苷酸优选具有序列表中SEQ ID NO：10至17任一个的核苷酸序列。

本发明第六方面提供了分离本发明基因的方法，其中所述方法包括：使用白黄侧耳子实体cDNA文库为模板，一对上述两种寡核苷酸为引物进行核酸扩增反应，籍此扩增编码本发明抗菌蛋白的基因的一部分，并使用如此获得的扩增产物为探针筛选cDNA文库，从而分离全长cDNA克隆。

本发明第七方面提供了含有本发明基因的重组载体。

关于本发明的重组载体，优选载体是表达载体。

本发明第八方面提供了通过将本发明的重组载体导入宿主生物而得到的转化体。

本发明第九方面提供了抗菌剂，其含有本发明的抗菌蛋白作为活性成分。

本发明优选的实施方案

优选的实施方案在下面详细描述以解释本发明。

源自白黄侧耳的抗菌蛋白

根据本发明的第一方面，提供了源自白黄侧耳的蛋白质，该蛋白质对植物病原微生物具有抗菌效果。本发明并不局限于该蛋白质任何特定的来源，生产方法等，只要它具有本说明书中所述的特征即可。即本发明的抗菌蛋白可以是天然存在蛋白质，或利用基因工程技术由重组DNA表达的蛋白质，或化学合成的蛋白质。

本发明抗菌蛋白通常具有所附序列表中SEQ ID NO：2所示的143个氨基酸序列或序列表中SEQ ID NO：4所示的141个氨基酸序列。然而，众所周知天然蛋白质常包括具有一个或多个氨基酸修饰的蛋白质变体，所述氨基酸修饰是由以下因素引起的：即产生蛋白质的生物体种类差异，或取决于生态型差异的基因突变或存在非常类似的同工酶所致的基因突变。本文所用术语“氨基酸修饰”指的是取代，缺失，插入和/或添加一个或多个氨基酸。本发明包括具有由克隆基因的核苷酸序列推定的，SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列的蛋白，但它并不局限于此。即本发明欲包括具有本文所定义特征的所有同源蛋白质。同源性至少为52％或更高，更优选为60％或更高，还优选为70％或更高，进一步优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高。

通常，当引入具有类似特性的氨基酸残基取代(所述取代如用一个疏水氨基酸取代另一个疏水氨基酸，用一个亲水氨基酸取代另一个亲水氨基酸，用一个酸性氨基酸取代另一个酸性氨基酸，或用一个碱性氨基酸取代另一个碱性氨基酸)时，所得到的修饰蛋白经常与那些原来蛋白质具有类似特性。通过使用基因工程技术制备具有所需突变的重组蛋白质的方法是本领域技术人员众所周知的，因此，这些修饰蛋白质也包含在本发明的范围中。例如，可以应用分子克隆，第二版(Sambrook et al.，(1989))中描述的位点专一性诱变。

如本文中所用，同源性百分比可以通过例如使用Altschul et al.(Nucl.Acids.Res.25，pp.3389-3402，1997)描述的BLAST程序通过比较序列信息测定。例如该程序可以通过互联网上National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)站点或DNA Data Bank of Japan(DDBJ)站点得到。用BLAST程序同源性捡索的各种条件(参数)在该站点中详细描述，尽管可以改变一些设置，通常用默认值实施检索。可选择地，同源性百分比可以通过使用诸如GENETYX(Software Development Co.，Ltd.)或DNASIS(HitachiSoftware Engineering)的遗传序列信息分析软件的序列信息比较而得以测定。

对于本发明源自白黄侧耳的抗菌蛋白，其基因以及它们的同源物和具有由此编码的氨基酸序列的蛋白质，使用BLAST通过GenBank数据库进行同源性检索。对于本发明第一个源自白黄侧耳抗菌蛋白的氨基酸序列(SEQID NO：2的全部氨基酸序列)进行数据库搜寻显示与Streptomyces violaceus的链霉抗生物素蛋白v2(登录号：Q53533，Bayer et al.(1995)Biochim BiophysActa 1263：pp.60-66)，链霉抗生物素蛋白v1(保藏号：Q53532)，阿维丁氏链霉菌(Streptmyces avidin ii)的链霉抗生物素蛋白(保藏号：P22629，Argarana etal.(1986)Nucleic Acids Res 14：pp.1871-1882)，等匹配。这三种序列的同源性扩展到超过128氨基酸，并且分别为50％，49％和49％。与核心链霉抗生物素蛋白突变体w79f(B链(Chain B))51.7％的同源性(Freitag et al.(1997)Protein Sci.6：pp.1157-1166)也显示超过了120个氨基酸。

卵清抗生物素蛋白(Gope et al.(1987)Nucleic Acids Res 15：pp.3595-3606)和一些与抗生物素蛋白相关的蛋白(Keinanen et al.(1994)Eur JBiochem 220：pp.615-621)也以较低同源性程度匹配。这些事实显示该蛋白是新的蛋白。

对于本发明第二个源自白黄侧耳的抗菌蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：4的全部氨基酸序列)进行数据库搜寻显示与链霉抗生物素蛋白v2，v1，链霉抗生物素蛋白，分别有50％，48％和48％的同源性。

本发明的抗菌蛋白命名为″tamavidin″是因为从可食用的蘑菇白黄侧耳(Tamogitake)纯化的新的链霉抗生物素类蛋白。本文中来自该纯化蛋白的基因称为tam1，具有由其编码的氨基酸序列的蛋白质称为tamavidin 1，tam1同源物称为tam 2，具有由其编码的氨基酸序列的蛋白质称为tamavidin 2。

SEQ ID NOs：2和4的氨基酸序列残基1-7被认为相当于抗菌蛋白的前体的前导肽。因此，SEQ ID NO：2氨基酸残基的8-143和SEQ ID NO：4的8-141为抗菌蛋白的成熟形式。因此，本发明还提供一种抗菌蛋白，其包括或者是一种多肽或者多肽组合，该多肽组合包含SEQ ID NO：2部分氨基酸序列，即氨基酸8-143或SEQ ID NO：4部分氨基酸序列，即氨基酸8-141；和具有在任一个所述的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的多肽，或与任一个所述的氨基酸序列有高于51％同源性，并且显示抗稻瘟病的抗真菌活性的多肽。

本发明蛋白质的纯化和分离可以通过用于纯化和分离蛋白质的常规方法例如硫酸铵沉淀，离子交换层析(Mono Q，Q Sepharose or DEAE)，凝胶过滤(Superose 6，Superose 12)适当组合而得以完成。

例如，将白黄侧耳磨碎用缓冲液提取，然后过滤，并如下面实施例所述在上清里添加合适浓度的硫酸铵，例如使之达到75％饱和通过静置以沉淀。将沉淀透析，然后使用浓度梯度(例如50mM-600mM NaCl)的盐通过离子交换层析洗脱，再根据抗菌活性指标回收包含所需蛋白的级分。具有分子量约30kDa的级分可通过凝胶过滤回收，但并不限于此，本发明的抗菌蛋白通过SDS-PAGE测定的分子量约为15kDa。

或者，所述的蛋白质可以通过已知的导入技术使用能在各宿主中扩增并表达它的表达载体将DNA序列导入大肠杆菌，酵母或昆虫或某种动物细胞，可获得大量的本发明蛋白质，所述DNA序列或者是由SEQ ID NO：1的71(或92)至502的DNA序列，或者是SEQ ID NO：3的226(或247)至651的DNA序列。

本文所公开的该蛋白质的氨基酸序列和编码它的DNA序列可以使用包括杂交和PCR基因工程的基本方法而全部或部分地容易地用于分离基因，该基因编码的蛋白质与其它种类具有相似的生理活性，优选的是真菌，更优选包括蘑菇，霉菌(molds)和酵母的真菌门(Eumycota)，和包括多种蘑菇的担子菌亚门(Basidiomycotina)，更优选白黄侧耳所属的伞菌目(Agaricales)蘑菇例如糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)，香菇(Lentinus edodes)，假蜜环菌(Armillariella mellea)，松口蘑(Tricholoma matsutake)，shimeji mushrooms，绒状火菇(Flammulina velutipes)，多叶奇果菌(Grifola frondosa)，鸡油菌(Cantharellus cibarius)，Pleurotus eryngii。在这种情况下，这些新的蛋白质也包括在本发明的范围之内。

抗菌蛋白的基因

本发明还提供了编码本发明的抗菌蛋白的基因。基因类型不受限制。即它可以是任何天然来源的DNA，重组DNA，化学合成的DNA和任何基因组DNA或cDNA克隆。

本发明的基因通常具有序列表中SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列。然而，下面显示的实施例中得到的克隆的核苷酸序列仅是一实施例。本领域技术人员众所周知：天然基因伴随有少量变体，所述变体是由产生该基因的生物种的品种差异，或生态型差异引起的小突变，或者是由非常相似的同工酶的存在引起的小突变。因此，本发明的基因并不局限于具有序列表中SEQ ID NO：1或3的碱基序列的基因，可包括编码本发明的抗菌蛋白的任何基因。

特别是，本发明公开了该蛋白质的氨基酸序列和编码它的DNA序列，结果，通过使用基因工程技术(包括杂交，核酸扩增)，利用这些序列或其部分，可以容易地从其它物种中分离出编码具有类似生理学活性的蛋白质的基因。在这种情况下，所得的基因也属于本发明的范围之内。

通过GenBank数据库使用编码源自于白黄侧耳抗菌蛋白的基因的DNA序列(SEQ ID NO：1的DNA序列71-502)和编码第二个源自于白黄侧耳抗菌蛋白的基因的DNA序列(SEQ ID NO：3的DNA序列226-651)进行BLAST搜寻，发现在很短的范围内(23bp)仅有一些序列显示同源性但不是链霉抗生物素蛋白的DNA序列。这表明编码本发明该新蛋白的DNA序列与链霉抗生物素蛋白在DNA水平上没有高度同源性。

更具体的是，遗传序列分析软件程序GENETYX-WIN ver 3.2(SoftwareDevelopment Co.，Ltd.)用于分析本发明的白黄侧耳抗菌蛋白的全部氨基酸序列(tamavidins 1和2)与链霉抗生物素蛋白的同源性(分别与链霉抗生物素蛋白v2和v1仅有9氨基酸和1个氨基酸不同)。结果由本发明tam1编码的tamavidin 1的氨基酸序列显示同源性(氨基酸同一性)为46.7％，并且由tam2编码的tamavidin 2的氨基酸序列显示为48.1％。全部DNA序列(序列表中SEQ ID NOs：1和3)与链霉抗生物素蛋白的同源性对于tam1为53.8％及对于tam2为51.0％。tam1编码的白黄侧耳抗菌蛋白与卵清抗生物素蛋白的在氨基酸序列中同源性为31.2％，在DNA序列中为42.4％，tam2编码的白黄侧耳抗菌蛋白与卵清抗生物素蛋白的在氨基酸序列中同源性为36.2％，在DNA序列中为41.8％。tamavidin 1和tamavidin 2间氨基酸序列的同一性，和编码它们的基因tam1与tam 2DNA序列的同源性分别为65.5％和64.5％。

与链霉抗生物素蛋白相比，本发明的tamavidin 1和tamavidin 2其N末端的33个氨基酸截短，但可能涉及与生物素结合的所有的色氨酸(W)残基(Gitlin et al.(1988)Biochem.J 256：pp.279-282)和酪氨酸(Y)残基(Gitlin et al.(1990)Biochem.J 269：pp.527-530)都是保守的，(在SEQ ID NO：2氨基酸序列的Y 34和45和W 82，98和110，在SEQ ID NO：4氨基酸序列中的Y 34和45和W 80，96和108)。

推定为成熟蛋白区域的该区域平均分子量(SEQ ID NO：2的氨基酸序列8-143，SEQ ID NO：4的氨基酸序列8-141)分别为15158.4和14732.2，接近于链霉抗生物素蛋白和成熟抗生物素蛋白的平均分子量(分别为16490.6和14342.9)。

链霉抗生物素蛋白源自于放线菌(Actinomyces)阿维丁氏链霉菌，抗生物素蛋白源自于鸟(Gallus gallus)卵清。目前分离的与链霉抗生物素蛋白非常类似的蛋白包括自紫色链霉菌(Streptomyces violaceus)的链霉抗生物素蛋白v1和v2(Bayer et al.(1995)Biochim Biophys Acta 1263：pp.60-66)，又分离了抗生物素蛋白基因同源物包括与源自鸟类的抗生物素蛋白相关的基因(avr1-avr5，Keinanen et al.(1994)Eur J Biochem 220：pp.615-621)。链霉抗生物素蛋白v1和v2与链霉抗生物素蛋白在氨基酸序列上分别有1个氨基酸和9个氨基酸不同，并且与抗生物素蛋白相关的蛋白与抗生物素蛋白在氨基酸序列上有68-78％的同源性，在DNA序列上有88-92％的同源性。链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白在氨基酸序列上的同源性为29.2％在DNA序列上的同源性为46.8％。

本发明抗菌蛋白优选的实例，tamavidins 1和2源于担子菌纲(Basidiomycetes)的白黄侧耳种，并如上所述分别与链霉抗生物素蛋白在氨基酸序列上具有46.7％和48.1％的同源性，分别与抗生物素蛋白在氨基酸序列上具有31.2％和36.2％的同源性。因此，tamavidins 1，2形成不同于放线菌的链霉抗生物素蛋白组和鸟类的抗生物素蛋白组，其为第三组。除了放线菌和鸟类，该抗生物素样蛋白首次被分离。Tamavidins 1，2是存在于蘑菇中的抗生物样蛋白，并且其它的种类的蘑菇可能包含类似的蛋白。tamavidins1，2的氨基酸序列和tam1，tam2的DNA序列可进一步用于搜寻和分离该蛋白质和其基因。

用于筛选同源基因杂交条件并不具体限制。通常，优选利用如分子生物学第一卷(John Wiley and sons，Inc.)或分子克隆第二版(Sambrook等(1989))的目前方案(Current Protocols)中所述的严谨条件例如在5×SSC，5×Denhardt’s溶液，1％SDS，25℃至68℃几小时到过夜。优选杂交温度范围为45℃至68℃(无甲酰胺)或30℃至42℃(50％甲酰胺)。洗涤条件涉及如在45℃至68℃，0.2×SSC。本领域技术人员众所周知：可以通过适当地选择杂交条件例如甲酰胺浓度，盐浓度，温度等可以克隆所含核苷酸序列具有同源性高于预先确定水平的DNA。如此克隆的同源基因都包括在本发明的范围之内。

核酸扩增反应的例子包括：利用温度循环进行的反应，如聚合酶链式反应(PCR)(Saiki等，1985，科学230，pp1350-1354)，连接酶链反应(LCR)(Wu等，1989，基因组学4，pp560-569；Barringer等，1990，基因89，pp 117-122和Barany等，1991，美国国家科学院院刊88，pp189-193)和基于转录的扩增(Kwoh等，1989，美国国家科学院院刊86，pp1173-1177)和等温反应，如链置换扩增(SDA)(Walker等，1992，美国国家科学院院刊89，pp392-396；和Walker等，1992，核酸研究，20，pp1691-1696)，自我维持的序列复制(3SR)(Guatelli等，1990，美国国家科学院院刊87，pp1874-1878)和Qβ复制酶系统(Lizardi等，1988，生物技术6，pp1197-1202)。另外，还可以利用欧洲专利0525882等所公开的靶核酸和突变序列的竞争性扩增使用基于核酸序列的扩增(NASBA)反应。优选使用PCR法进行扩增。

通过上述杂交或核酸扩增反应克隆的同源基因与序列表中SEQ IDNO：1的碱基序列具有优选为60％或更高，更优选为70％或更高，还优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高的同源性。

寡核苷酸

根据本发明，还提供用于得到源于白黄侧耳的抗菌蛋白的寡核苷酸，其通过包括下述的方法得到：

从SEQ ID NO：1或3的编码抗菌蛋白之基因的碱基序列中选择满足以下需求的两个区域：

1)每个区域长15至30个碱基；和

2)每个区域碱基序列中具有40至60％比例G+C含量；

制备单链DNA，该DNA具有与所述区域的碱基序列相同或互补的碱基序列，或者制备单链DNA混合物，基于遗传密码简并性而不会改变所述单链DNA所编码的氨基酸残基的序列；和根据需要，

任选制备修饰的所述单链DNA，所述修饰没有改变该单链DNA与编码所述抗菌蛋白之基因的碱基序列结合的特异性。本发明的寡核苷酸可用于，例如杂交或扩增反应所述杂交用于检测本发明的基因或分离基因，所述扩增反应如PCR利用合适的所述寡核苷酸的两种作为引物对。

本发明的寡核苷酸优选具有序列表中SEQ ID NO：10至19任一个的核苷酸序列。根据SEQ ID NO：9的氨基酸序列作为PCR引物设计SEQ ID NOs：10-13核苷酸序列用以克隆编码部分蛋白质的基因片段，包括所有能编码该氨基酸的碱基。SEQ ID NO：14-17的核苷酸是合成用于以引物步移法(primerwalking)解码tam1和tam2基因的全部核苷酸序列的引物。SEQ ID NO：18-19的核苷酸是PCR引物，其是根据SEQ ID NO：3制备的用于扩增全部ORF以构建表达具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重组tamavidin 2蛋白的表达载体。

通过使用白黄侧耳子实体cDNA文库为模板，和上述合适的寡核苷酸对进行的核酸扩增反应诸如PCR来扩增和分离本发明基因的部分片段。使用所得扩增产物为探针，通过例如噬斑杂交进一步筛选cDNA文库，即可分离全长cDNA克隆。核酸扩增反应的方法和条件，噬斑杂交条件是本领域技术人员众所周知的。

例如，可以使用相当低严谨度的杂交条件，诸如，但并不限于，室温并在较高盐浓度下洗涤，例如2x SSC在37℃，如在Molecular Biology Vol.1(John Wiley and Sons，Inc.)或Molecular Cloning(Sambrook et al.，supra.)目前方案中所描述的。

重组抗菌蛋白的制备

本发明的蛋白质具有很强的抗菌活性。例如，其可在50ng/ml低浓度下完全抑制稻瘟病(M.grisea)孢子的萌发(见下面实施例4)。在该浓度下甚至延长培养后孢子没有萌发，表明本发明蛋白质抗稻瘟病的效果可能是杀真菌的效果而不是部分抑制生长。就我们所知而言，目前还没有报道有在这种低浓度(纳克)下可完全抑制病原微生物的生长。在下面的实施例中，一种主要的稻病原体，稻瘟病用作抗菌试验的植物病原体以纯化抗菌蛋白。非常可能的是本文鉴定的白黄侧耳抗菌蛋白对除此以外的抗其它植物病原体诸如植物病原体茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)具有极大可能的抗菌效果。

因此，本发明源于白黄侧耳的抗菌蛋白具有很强的抗菌活性，使得其可以用于诸如包含活性形式抗菌蛋白的抗菌剂和农药的配置中。在这种情况下，自白黄侧耳通过使用例如下面描述的离子交换柱，或凝胶过滤柱纯化该蛋白。然而，本发明的白黄侧耳抗菌蛋白可以更方便地大量制备，其是使用能在各宿主中扩增的表达载体通过导入并于大肠杆菌，酵母，昆虫或动物细胞中表达编码该蛋白质的具有SEQ ID NO：1的71-502或SEQ IDNO：3的226-651核苷酸序列DNA(实施例5)。

本发明还提供了含有本发明基因的重组载体。根据例如Sambrook，J等(分子克隆，实验室手册(第2版)，冷泉港实验室，1.53(1989))所报道的方法，将本发明基因的DNA片段插入至诸如质粒等载体中。更加方便的方法是使用商购连接试剂盒(例如宝酒造有限公司(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)的产品)。将所得重组载体(例如重组质粒)导入宿主细胞(例如大肠杆菌TB1，LE392或XL-1Blue)。

据Sambrook，J等，分子克隆，实验室手册(第2版)，冷泉港实验室，1.74(1989)所述，将质粒转移至宿主细胞的合适方法包括例如磷酸钙法，氯化钙/氯化铷法，电穿孔法，电注射法，用PEG等进行化学处理，和使用基因枪的方法。

通过常规方法将所需基因连接至本领域可得到的重组载体(例如质粒DNA)中，可以方便地制备载体。本文可以使用的合适载体的具体例子包括，但并不局限于，源自大肠杆菌的质粒，如pBluescript、pUC18、pUC19、pBR322、Ptrc99A。

表达载体对产生所需蛋白质特别有用。对表达载体的类型没有特别的限制，只要它具有以下功能即可，即能在原核和/或真核多种宿主细胞中表达所需基因，从而产生所需蛋白质。优选载体的例子包括大肠杆菌表达载体，如pQE-30，pQE-60，pMAL-C2，pMAL-p2，pSE420等；酵母表达载体，如pYES2(糖酵母属(Saccharomyces))和pPIC3.5K，pPIC9K和pAO815(均为毕赤酵母属(Pichia))和用于昆虫中的表达载体，诸如pBacPAK8/9，pBK283，pVL1392，pBlueBac4.5。

通过将所需表达载体转移至宿主细胞可制备转化体。对所用合适的宿主细胞没有特别的限制，只要它能与本发明的表达载体相容因而能被转化即可，包括可以利用本领域常用的多种细胞，包括天然细胞和人工建立的重组细胞。其例子包括细菌(埃希氏菌属(Escherichia)和芽胞杆菌属(Bacillus))，酵母(糖酵母属，毕赤酵母属)，动物细胞，昆虫细胞和植物细胞等。

至于宿主细胞，优选使用大肠杆菌，酵母、植物细胞或昆虫细胞，具体地是，大肠杆菌菌株诸如M15，JM109，BL21；酵母诸如INVSc1(糖酵母属)，GS115和KM71(全为毕赤氏酵母)等)和昆虫细胞诸如BmN4，蚕幼虫。动物细胞的例子包括源自小鼠，非洲爪蟾，大鼠，仓鼠，猴，人的细胞，和由上述细胞建立的培养细胞系。对植物细胞没有特别的限制，只要它能被培养即可，所述植物细胞包括源自例如烟草，拟南芥，水稻，玉米和小麦等的细胞。

当使用细菌，具体为大肠杆菌作为宿主细胞时，表达载体一般至少包含启动子/操纵子域，起始密码子，编码所需抗菌蛋白的基因，终止密码子，终止子以及可复制单位。

当使用酵母，植物细胞，动物细胞或昆虫细胞作为宿主细胞时，表达载体优选包括至少启动子，起始密码子，编码所需抗菌蛋白的基因，终止密码子，终止子。如果需要其还可包含编码信号肽的DNA，增强子序列，所需基因5’和3’侧的非翻译区，选择标记区，可复制单位等。

本发明载体中优选的起始密码子是甲硫氨酸密码子(ATG)。终止密码子的例子可以是常用的终止密码子，例如TAG，TGA和TAA。

“可复制单位”指的是能在宿主细胞中复制其完整DNA序列的DNA。其包括天然质粒，人工修饰的质粒(即由天然质粒制备的质粒)和合成质粒等。优选的质粒是pQE30，pET或pCAL或其人工修饰(如用合适的限制性内切核酸酶处理pQE30，pET或pCAL得到的DNA片段)(对大肠杆菌而言)；质粒pYES2或pPIC9K(对酵母而言)；和质粒pBacPAK8/9等(对昆虫细胞而言)。

关于增强子序列和终止序列，可以使用本领域技术人员常用的那些，例如源自SV40的序列。

关于选择标记，可以利用本领域通过常规方法常用的选择标记。其例子包括提供抗生素抗性的基因，所述抗生素诸如四环素，氨苄青霉素，卡那霉素，新霉素，潮霉素，壮观霉素。

通过将至少上述启动子，起始密码子，编码所需抗菌蛋白的基因，终止密码子和终止子域顺序地和环形地连接至适当的可复制单位即可制备表达载体。在此方法中，必要时也可以通过常规方法，如用限制性酶消化或使用T4DNA连接酶连接，来应用适当的DNA片段(例如接头或其它限制性酶位点等)。

可使用公知方法将本发明的表达载体导入(即转化(转导))至宿主细胞。

例如对细菌(诸如大肠杆菌，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis))而言的Cohen等(美国国家科学院院刊，69，2110(1972))报道的方法，原生质体法(Mol.Gen.Genet.，168，111(1979))或感受态法(分子生物学杂志，56，209(1971))；对酿酒酵母而言的Hinnens等(美国国家科学院院刊，75，1927(1978))报道的方法和锂法(细菌学杂志，153，163(1988))；对植物细胞而言的叶片法(leaf disc)(科学，227，129(1985))和电穿孔法(自然，319，791(1986))；对动物细胞而言的Graham(病毒学，52，456(1973))报道的方法；和对昆虫细胞而言的Summers等(分子细胞生物学，3，pp2156-2165(1983))报道的方法。

通过使用本发明的DNA片段，植物转化的载体可特别用于构建抗病植物。对植物载体类型没有特别的限制，只要它能在植物细胞中表达目的基因并因而产生所需的蛋白质即可。所述载体的优选的是pBI221和pBI121(Clontech)和由它们衍生的载体。具体的转化单子叶植物实例，可使用例如pIG121Hm和pTOK233(Hiei等，植物杂志，6，pp271-282(1994))，pSB424(Komari等，植物杂志，10，pp165-174(1996))。

通过用本发明的DNA片段取代上述载体中的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因以制备转化植物所用的载体，然后将该载体导入植物，即可制备转基因植物。植物转化载体优选的是至少含有启动子，起始密码子，目的基因(本发明的DNA序列或其部分)，终止密码子和终止子。另外，所述载体如果需要还含有编码信号肽的DNA，增强子序列，所需基因5’和3’非翻译域，选择标记域等。

对启动子和终止子没有特别的限制，只要它能在植物细胞中发挥作用即可。组成型表达启动子的例子包括：已被插入至上述载体中的35S启动子，以及肌动蛋白和遍在蛋白基因的启动子。然而，更优选插入诱导型启动子。其可允许仅在转基因植物与害虫接触之后才能产生所需蛋白质，因此植物获得了抗性。合适的诱导型启动子包括：苯丙氨酸氨裂合酶(phenylalanine ammonia-lyase)，壳多糖酶，葡聚糖酶，硫堇和消炎痛控释剂(osmosin)基因的启动子，和其它可应答害虫或胁迫的基因的启动子。

通过使用下列方法将基因转移至植物，所述方法包括：农杆菌法(Horsch等，科学，227，129(1985)；Hiei等，植物杂志，6，pp271-282(1994))，电穿孔法(Fromm等，自然，319，791(1986))，PEG法(Paszkowski等，EMBO J.，3，2717(1984))，显微注射法(Crossway等，Mol.Gen.Genet.，202，179(1986))，粒子轰击法(McCabe等，Bio/Technology，6，923(1988))等，但不具体的限制地使用任何方法，只要它适合将基因转染至所需植物即可。类似地，宿主植物并不局限于特定的物种，只要它能与本发明转化植物的载体相容，并能被其转化即可。具体地可利用本领域常用的植物，例如双子叶植物(例如烟草，拟南芥，番茄，黄瓜，胡萝卜，大豆，马铃薯，甜菜，芜菁(turnip)，白菜(Chinese cabbage)，油菜，棉花，矮牵牛花等)和单子叶植物(例如水稻，玉米，小麦等)。

本发明的蛋白质可以通过在营养培养基培养包含如上所述制备的表达载体的转化细胞而得以表达(制备)。营养培养基优选包含宿主细胞(转化体)生长必需的碳源，无机氮源或有机氮源。碳源的例子包括例如葡萄糖，葡聚糖，可溶性淀粉，蔗糖，甲醇。无机氮源或有机氮源的例子包括铵盐，硝酸盐，氨基酸，玉米浆，蛋白胨，酪蛋白，牛肉膏(beefextract)，豆饼(soybeanmeal)，马铃薯提取物等。必要时，还可进一步含有其它营养成分(例如无机盐诸如氯化钠，氯化钙，磷酸二氢钠，氯化镁，维生素和抗生素诸如四环素，新霉素，氨苄青霉素，卡那霉素)。

通过本领域已知的方法进行培养。可适当选择培养条件(例如温度，培养基的pH，培养时间)以大量产生本发明的蛋白质。对于在大肠杆菌中表达时，表达重组蛋白质的培养条件包括但并不局限于此，在4℃至40℃下进行保温，通过0.01mM至5.0mM IPTG诱导。

可按下列方法从上述培养物中回收本发明的蛋白质。当本发明的蛋白质在宿主细胞中积累时，通过例如离心或过滤等收集宿主细胞，然后悬浮于适当缓冲液(例如浓度约为10M至100mM的如Tris缓冲液，磷酸缓冲液，HEPES缓冲液或MES缓冲液，其pH值范围随缓冲液的不同而变化，但希望pH范围为5.0至9.0)。然后，通过适于所用宿主细胞的方法破碎细胞，离心得到宿主细胞的内容物。当本发明的蛋白质从宿主细胞中被分泌出来时，通过例如离心或过滤等从培养基中分离宿主细胞和培养物。宿主细胞的裂解物或培养物滤过物可直接或用硫酸铵沉淀和透析后用于分离/纯化本发明的蛋白质。

使用下列方法进行分离/纯化。当用6×组氨酸，GST，麦芽糖-结合蛋白质等标记所述蛋白质时，可使用基于适于每个所用标记物的亲和层析法。在下文所述的实施例4中，表达了N-末端被6×组氨酸标记的重组抗菌蛋白，但本发明并不局限于此。通过使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)纯化该重组蛋白质，所述琼脂糖对6×组氨酸具有亲和性。当产生不具有任何上述标记的本发明的蛋白质时，可以使用例如下文实施例所详述的基于离子交换层析法的方法。也可以将这些方法与凝胶过滤，疏水层析，等电层析等联合。也可使用如Hofmann等所述在亚氨基生物素亲和柱上的纯化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：pp.4666-4668(1980))。下面实施例5中，重组tamavidin 2蛋白从50ml大肠杆菌培养物中获得1mg的产量。

如上所述由遗传工程技术或自天然来源获得的纯化抗菌蛋白具有抗菌活性。抗菌活性可以通过，但并不限于，在存在预先确定浓度例如10ng/ml-1000ng/ml，优选50ng/ml的本发明的抗菌蛋白下，在微量滴定板28℃培养悬浮于培养基(例如1/2PD，蔗糖-蛋白胨)中的孢子48小时得以测定，并与不含抗菌蛋白的对照(实施例4)相比，评估是否稻瘟病的生长/增殖(例如菌丝的延伸)受到抑制。

或者，可以进行下面的试验，将稻瘟病的集落置于培养皿中琼脂培养基中心，并且将预先确定量的本发明抗菌蛋白水溶液滴在集落周围，将培养皿在28℃培养约48小时至一周。然后，通过与未处理区相比较评估在抗菌蛋白处理过的区域菌丝的延伸是否被抑制从而来鉴定抗菌活性。

抗菌剂

本发明的蛋白质具有很强的抗菌活性。例如，在我们的试验中其可以在低浓度诸如50ng/ml抑制稻瘟病菌菌的生长。在下面的实施例中，使用了作为水稻最重要的病虫害菌即稻瘟病菌和被用作抗菌试验的植物病原体。本文鉴定的白黄侧耳抗菌蛋白显示抗它们的抗菌效果。本发明的蛋白质除了对M.grisea以外，也对其它的植物病原体微生物最有可能具有抗菌效果。

因此，本发明源于白黄侧耳抗菌蛋白具有很强的抗菌活性，使得其可以用于诸如包含活性形式抗菌蛋白的抗菌剂和农药的配置中。在这种情况下，本发明的蛋白质可以通过将编码本发明蛋白质的DNA序列插入在例如如上所述的大肠杆菌或酵母有功能的表达载体中从而大量制备蛋白质。

本发明的抗菌蛋白是新的链霉抗生物素样蛋白，表明其可以结合一种维生素即生物素(vitamin H)。已知稻瘟病菌的生长需要生物素。这些事实表明本发明抗菌蛋白与试验培养基中游离的生物素结合以在培养基中诱导生物素缺陷，结果抑制了稻瘟病菌的生长。事实上，如下面实施例4所述在生物素过量加入到试验培养基时，消除了本发明tamavidin 1的抗菌活性。我们进一步发现商购获得的链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白也具有类似于tamavidin 1抗稻瘟病的抗菌效果，并证实该效果也被生物素所消除。

本发明表明抗病虫害尤其是抗稻瘟病的可能性通过控制一种维生素，生物素的量而可以赋予植物。通过控制维生素赋予抗病的可能性到目前还是未知。这是全新的观念。该观念也包括在本发明中。例如包含本发明抗菌蛋白作为活性成分的制品可以用作农药。在这种情况中，除了本发明抗菌蛋白，生物素结合蛋白(例如阿维丁氏链霉菌的链霉抗生物素蛋白和卵清抗生物素蛋白，和其同源物)也包括在本发明的观念之中。

因此，本发明提供一种包含本发明抗菌蛋白作为活性成分的抗菌试剂。通常，本发明抗菌试剂可全部地或局部地喷洒于植物。

抗菌试剂的喷洒剂量取决于植物的类型，生长时间，症状，喷洒的方法，处理的时间，所使用的蛋白质的类型(例如全长的蛋白质或通过先前蛋白的取代，缺失，插入和/或添加而得到的部分蛋白)，植物生长环境的气候和土壤情况以及其它因素而不同，抗菌剂可以一天一次，每天几次或者是间隔几天散布。喷洒量因各种条件而变化。如果需要，本发明的抗菌剂还可与增溶剂，悬浮剂，乳化剂等混合散布。将水的或非水的增容剂、悬浮剂混合成有一种或多种活性物质至少有一种惰性稀释液。包括含水的稀释液的例子包括蒸馏水和盐水。不含水的稀释液的例子包括丙烯乙二醇，聚乙烯乙二醇，和诸如橄榄油的植物油以及诸如乙醇的醇类。

这种抗菌组合物可以进一步包含诸如防腐剂，湿润剂，乳化剂，分散剂或稳定剂(例如精氨酸，天冬氨酸等)的辅助剂。

如果需要，这些组合物通过不让细菌通过的过滤器过滤或添加杀菌剂或放射而灭菌。它们还可通过例如冻干制备为灭菌的固体组合物，然后在使用前溶解于无菌的蒸馏水中或其它溶剂中。

由此获得的抗菌剂的剂量形式可以合适地根据所需目的来确定，即其可以片剂，丸剂，粉末，颗粒，溶液，乳状液等形式在有上述添加剂的混合物中使用。

通过将本发明编码抗菌蛋白基因插入植物来制备抗病植物。因此，抗病植物可通过例如用构建体导入植物而得以制备，所述构建体其中在植物中有功能的启动子与编码本发明抗菌蛋白的基因相连并且在植物中有功能的终止子进一步被添加到下游。在这种情况中，编码在植物中有胞外分泌功能的信号肽的DNA序列被添加到本发明基因的5’侧以启动植物细胞外tamavidin的分泌。或者，该基因密码子的用途可适合于单子叶或双子叶植物而不改变氨基酸以促进植物细胞内外抗菌蛋白的蓄积。使用这些手段的组合制备抗病植物的方法也包括在本发明的范围之内。

tamavidin，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白或它们非常类似的蛋白用于制备抗病植物以及除了水稻以外的植物也包括在本发明中。尽管本文分析的病原体真菌是稻瘟病菌，其它需要生物素用于生长的植物病原体真菌和病原体细菌非常合理地也在本发明的范围之内。

此外，一般认为不仅抗植物病原体微生物而且本质上需要生物素用于生长的动物病原体真菌，尤其是针对人和家畜的病原体微生物，都会产生相似的效果，因此本发明包括本发明抗菌蛋白，抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白和它们非常类似的蛋白在该种情形中用作治疗试剂。

链霉抗生物素蛋白DNA序列已经被公开(Garwin et al.，WO/8602077)，但在普通数据库搜寻期间，如前所述，本发明tam1和tam2与链霉抗生物素蛋白的DNA不匹配，并且在使用如上所述核酸序列/氨基酸序列分析软件程序硬性比较时，实际上显示与链霉抗生物素蛋白DNA同源性仅为51.0-53.8％。

链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白在分子生物学，生物化学等情况中已被广泛地用作实验试剂，是由于它们与生物素及其衍生物有强的结合能力。例如根据表达为融合蛋白的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的生物素结合亲和力它们可以用于核酸和蛋白质的检测系统中(Liang.WO/9707244)或纯化方法中(Skerra et al.EP835934，Kopetzki.WO/9711186)。本发明的Tamavidin1和tamavidin 2也可用于当前广泛公知或报道的这些应用中。

目前报道的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白与植物相关的应用包括使用抗生物素蛋白制备雄性不育植物(Howard and Albertsen.WO/9640949)，链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白用作杀虫蛋白(Czapla et al.WO/9400992)，和在植物中制备抗生物素蛋白(Baszczynski et al.US Pat.No.5767379)。这些文献中描述的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的用途也可适用于本发明源于白黄侧耳的抗菌蛋白。

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7.Broglie et al.(1991)Science 254：pp.1194-1197

8.Terras et al.(1995)The Plant Cell 7：pp.573-588

9.Nishizawa et al.(1999)Theor Appl Genet 99：383-390

10.Alexander et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：pp.7327-7331

11.Wu et al.(1995)Plant Cell 7：pp.1357-1368

12.Hain et al.(1993)Nature 361：pp.153-156

13.Bayer et al.(1995)Biochim Biophys Acta 1263：pp.60-66

14.Argarana et al.(1986)Nucleic Acids Res 14：pp.1871-1882

15.Freitag et al.(1997)Protein Sci.6：pp.1157-1166

16.Gope et al.(1987)Nucleic Acids Res 15：pp.3595-3606

17.Keinanen et al.(1994)Eur J Biochem 220：pp.615-621

18.Gitlin et al.(1988)Biochem.J 256：pp.279-282

19.Gitlin et al.(1990)Biochem J 269：pp.527-530

20.Hofmann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：pp.4666-4668(1980)

21.Garwin et al.WO/8602077

22.Liang.WO/9707244

23.Skerra et al.EP835934

24.Kopetzki.WO/9711186

25.Howard and Albertsen.WO/9640949

26.Czapla et al.WO/9400992

27.Baszczynski et al.US Pat.No.5767379.

下面的实施例进一步解释本发明，而本发明并不限于此。

实施例

实施例1：构建检测系统

1)建立鉴定系统

培养病原菌：在燕麦粉培养基(Difco有限公司，添加有1％蔗糖)上培养Magnaporthe grisea(稻瘟病)(TUS-1菌株，品种337，由农林水产省东北农业试验场提供)以产生分生孢子用作接种物。根据需要加入10％甘油，将孢子悬浮液储存于-80℃。

在1/2马铃薯汤(PD，Difco)中将茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)(JT872菌株)培养2天。使用Teflon匀浆器轻轻在1/2PD中研磨3块菌丝体(约5mm)以得到菌丝片段用作接种物。

将上述接种物分别加入96孔微滴板(Corning)。以约1000/孔的密度加入M.grisea分生孢子，或以约300/孔的密度加入茄属丝核菌菌丝片段于100μl 1/2PD中。然后，在28℃恒温箱中保温48小时。通过用微滴板读数仪(Benchmark，Bio-Rad)测定595nm的光吸收来监测真菌的生长。

2)自白黄侧耳提取蛋白

预先用剪刀将商购的100g白黄侧耳子实体切碎后，使用液氮冷冻，在研钵中研磨以得到精细的粉末。然后用300ml 100mM Hepes-KOH缓冲液(pH7.5)4℃提取30分钟并缓慢搅拌。将提取物用Miracloth滤过，然后以10,000×g离心20分钟。然后在上清液中加入硫酸铵以达到75％饱和，于4℃静置过夜。再次以15,000×g离心20分钟之后，将沉淀物溶解于3ml 10mMHepes-KOH缓冲液(PH7.5)中，并使用透析管(Spectra/Porl MWCO 6-8000，Spectrum Medical Industries)，对着20mM Hepes-KOH缓冲液(pH7.5)进行透析。离心除去不可溶的物质之后，得到白黄侧耳蛋白质样品。通过Bradford法，以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质，测定白黄侧耳蛋白质样品的蛋白质水平。

实施例2：抗菌蛋白的纯化

1)粗白黄侧耳蛋白样品的抗真菌活性

将给定量的粗白黄侧耳蛋白样品添加到M.grisea和茄属丝核菌培养系统中，该样品在培养开始后马上加入，培养2天(46-48小时)，然后通过测定吸光度对抗真菌活性进行评估。结果显示白黄侧耳的提取物包含具有高度抗Magnaporthe grisea和茄属丝核菌的抗真菌(antifungal)活性的物质。对于M.grisea观察到完全抑制萌发和抑制菌丝生长而茄属丝核菌观察到抑制菌丝生长。对于M.grisea的细胞，细胞质与细胞壁分离并看起来象质壁分离。

为了进一步分析所检测的抗真菌活性的性质，加热后检测残留的活性。抗真菌试验在60和80℃加热10分钟后进行，通过稀释蛋白质样品评估抗真菌的活性强度。结果，将抗M.grisea和茄属丝核菌的抗真菌活性在60℃加热前和加热后是可以比较的。然而，抗茄属丝核菌的抗真菌活性在80℃加热后消失。相对比的是，尽管诱导质壁分离的活性丢失，通过在80℃加热后菌丝的前端膨胀已停止生长显示了新的抗M.grisea活性(图1)。

为了获知调控这些活性的包含于粗白黄侧耳蛋白样品加热级分中的该核心物质的近似分子量，将样品通过超滤膜分级以研究抗真菌活性，使用超滤膜的Ultrafree MC 10,000NMWL过滤单位(截留(cut-off)分子量10000，Millipore)进行分析，把样品级分分为通过膜级分和未通过膜级分的。结果，仅未通过膜的级分都有活性。因此，活性核心的分子量估测至少为10000或更高。

2)通过离子交换层析纯化

然后纯化抗菌蛋白。起初，将150mg/20ml的粗蛋白样品上样于备有离子交换单体Q Sepharose FF(Pharmacia)的自制柱(内直径1.5cm×高10cm，柱体积10ml)以部分纯化抗菌蛋白。应用50mM Tris pH8.0，50mM NaCl，至50mM Tris pH8.0，600mM NaCl，梯度为50mM到600mM NaCl的缓冲液，流速为2ml/min，洗脱超过100分钟。将一部分各级分(12.5ml)进行抗M.grisea的抗真菌试验并进行SDS-PAGE电泳。各级分的蛋白质溶液与等量的2×SDS电泳缓冲液(running buffer)在95℃反应(Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring Harbor)5分钟，然后根据Laemmli(Laemmli(1970)Nature 227：pp.680-685.)的方法进行SDS-PAGE电泳。所用凝胶为15％PAGEL(ATTO)，并且该蛋白质用Silver Stain II kit Wako(Wako Pure Chemical Industries)检测。为了估测近似的分子量和蛋白的量，分子量标记(LMW marker kit：Pharmacia LKB，依分子量大小分别为94kDa，67kDa，43kDa，30kDa，20.1kDa，14.4kDa)也进行电泳。通过银染的蛋白质电泳图在与抗真菌活性强度相关的图2中显示。

在NaCl浓度为160mM和240mM-280mM的两峰显示抗真菌活性。在160mM的峰中包含的蛋白质通过菌丝前端膨胀以终止生长而发挥作用，而在70℃加热10分钟活性并没有消失。然而，包含于240mM-280mM峰中的蛋白质在M.grisea中诱导质壁分离，并在相同温度下加热后活性消失。因此，进行尝试以纯化在160mM峰中包含的抗菌蛋白。

将相当于120mM-240mM NaCl浓度的级分转移至透析管(Spectra/Por1MWCO 6-8000，Spectrum Medical Industries)，对50mM Tris-HCl pH8.0，50mM NaCl在4℃过夜透析。在Centriprep-10(截留分子量10,000，Amicon)的浓缩后在70℃加热30分钟。离心后，将上清通过0.22μm滤膜过滤。将该蛋白样品(约10ml)上样于MonoQ HR 5/5(Pharmacia)以分离/纯化抗菌蛋白。50mM Tris-HCl，pH8.0，50mM NaCl至50mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，梯度为50mM到500mM NaCl的缓冲液用作洗脱缓冲液，流速为1ml/min，在上样后20分钟开始洗脱40分钟。将部分各级分(1ml)进行抗M.grisea的抗真菌试验并进行SDS-PAGE电泳。

图3显示了HPLC图表与抗真菌活性强度关系。结果显示抗菌蛋白的洗脱峰出现在200mM-260mM离子强度(NaCl浓度)附近。

图4显示了电泳图与抗真菌活性强度关系。各泳道上部的数字对应于图3中的级分号。可能与抗真菌活性相关的蛋白质带的精细检测发现可能的候选物的两条带(约15KDa)(图4箭头)。带的强度和抗真菌的活性的水平存在正相关性，表明该带可能是核心的抗菌蛋白。

3)通过凝胶过滤的纯化和分子量的估测

为了纯化白黄侧耳抗菌蛋白并估计天然分子量，如上获得的Mono Q级分#41-46在Ultrafree MC 10,000NMWL过滤单元(Millipore)浓缩并在凝胶过滤柱上Superose 6HR 10/30(Pharmacia)上样。所用的缓冲液为50mMMES-NaOH pH6.0，50mM NaCl，流速为0.5ml/min。蛋白质分子量和近似的洗脱时间通过凝胶过滤标准(BIO-RAD)预测，然后上样具有抗真菌活性的MonoQ级分。

结果，当该蛋白在A280监测时尖峰显示在30kDa(图5).抗真菌活性集中于峰并且接近30kDa。这表明白黄侧耳的抗真菌活性源于具有凝胶过滤确定的约30kDa分子量的单一蛋白质。当各级分(0.25ml)在SDS-PAGE后银染，显示于图4中的15kDa条带仅在约30kDa处检测出来(图6)。除了15kDa的带没有显示出其它的带。这强有力的再次表明15kDa蛋白对抗真菌活性发挥了作用。抗菌蛋白的量通过光密度计由分子量标记(20.1kDa胰岛素抑制物)估测，并且抗M.grisea的50％生长抑制浓度计算为约50ng/ml。自粗重100g白黄侧耳子实体通过上述方法纯化的抗菌蛋白的量约0.2mg。

实施例3：cDNA的分离

1)白黄侧耳抗菌蛋白的氨基酸序列的测定

如上获得的Superose 6级分在Ultrafree MC 10,000NMWL(Millipore)上浓缩并进行SDS-PAGE电泳。在既不包含Tris又不含甘氨酸(glycine)的缓冲系统中将级分转移到PVDF膜(Millipore)上，用考马斯亮蓝R-250轻染色然后脱色。接着将可能具有抗真菌活性的15kDa蛋白带切下。15kDa蛋白带用赖氨酰内肽酶(Wako Pure Chemical Industries)或V8蛋白酶(Wako PureChemical Industries)部分消化。

结果，14kDa的级分通过赖胺酰内肽酶消化获得，并且14kDa和12kDa级分通过V8蛋白酶消化获得。迁移后将这些带转移。然后N-末端氨基酸序列通过Edman降解法使用气相蛋白质测序仪(HPG1005A ProteinSequencing System)得以确定。

结果，下面的44氨基酸自15kDa蛋白确定：

N′-Leu Xaa Gly Xaa Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Xaa Xaa Met Asn Leu ThrAla Asn Lys Asp Gly Ser Leu Xaa Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val ProXaa Xaa Tyr His Leu Ala Gly Arg Tyr-C′(SEQ ID NO：5)

其中及下文中Xaa是未知的。下面的50氨基酸自赖氨酰内肽酶消化14kDa蛋白确定：

N′-Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro ProThr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val ThrLeu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val-C′(SEQ ID NO：6).

下面的21氨基酸自V8蛋白酶消化14kDa蛋白确定：

N′-Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr AlaAsn Lys Asp Gly-C′(SEQ ID NO：7).

下面的23氨基酸自12kDa蛋白确定：

N′-Leu Thr Gly Thr Xaa Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Xaa Asn Leu Thr AlaAsn Xaa Asp Gly Xaa Leu-C′(SEQ ID NO：8).

最后确定69氨基酸：

N′-Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr AlaAsn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro ProThr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val ThrLeu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val-C′(SEQ ID NO：9).

2)设计简并引物

基于1)中确定的氨基酸序列，合成四种包含所有可能碱基的引物。括号中的数字表明简并程度。

TMR1：5′-acnggnacntggtayaayg-3’(256)

(对应于SEQ ID NO：9的第2位氨基酸残基Thr至第8位Glu)(SEQ IDNO：10)

TMR2：5′-garytiggiwsnacnatgaa-3’(256)

(对应于SEQ ID NO：9的第8位氨基酸残基Glu至第14位Asn)(SEQ IDNO：11)

TMF1：5′-gtrttytcraaiswiacn-3’(128)

(对应于SEQ ID NO：9的第59位氨基酸残基Ala至第65位Thr)(SEQ IDNO：12)

TMF2：5′-cciarigtnacnccytgncc-3’(256)

(对应于SEQ ID NO：9的第51位氨基酸残基Gly至第57位Gly)(SEQ IDNO：13)

其中分别是″i″表示肌苷，″r″表示″g或a″，″y″表示″c或t″，″w″表示″a或t″，″s″表示″g或c″，″n″表示″a或g或c或t″。

3)构建白黄侧耳子实体cDNA文库

通过SDS苯酚的方法自白黄侧耳子实体提取全部的核酸并通过氯化锂沉淀回收全部的RNA。然后，自全部的RNA使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)制备白黄侧耳mRNA。自约5g的子实体，获得10μg mRNA，其中5μg使用ZAP cDNA合成试剂盒(Stratagene)合成cDNA。通过凝胶过滤级分化约0.5-5kb cDNA并与Uni-ZAP XR载体(Stratagene)连接利用Gigapack III(Stratagene)包装。根据试剂盒的指示实施所有的方法。由此构建的白黄侧耳子实体cDNA文库的效价估测约为3,000,000pfu。

4)通过RT-PCR制备探针

使用2)中合成的引物和3)中合成的cDNA为模板进行PCR以试图扩增适合用于筛选文库探针的白黄侧耳抗菌蛋白的部分长cDNA。反应条件如下：50μl反应溶液包含10ng cDNA，5μl 10×Ex taq缓冲液，4μl 2.5mM各dNTP，5pmoles/各引物序列和1μl Ex taq(Takara)+Taq START抗体(Clontech)，将该反应溶液使用程序化温度控制系统PC-700(ASTEK)在94℃，3min运行1个循环；94℃，1min；50℃，1min，72℃，1min进行35个循环，接着在72℃，6min运行1个循环。结果，约150-190bp的产物被扩增，其是使用下面的引物对TMR1-TMRF1，TMR1-TMRF2，TMR2-TMRF 1和TMR2-TMRF2。

将这些PCR产物进行凝胶纯化并克隆入载体pCRII(Invitrogen)中。对这些克隆进行测序以揭示它们包含两种cDNAs，即1)中所确定的相同氨基酸序列严格编码的cDNA(将源于TMR2-TMRF1和TMR2-TMRF2对；特别是将源于TMR2-TMRF2对的cDNA命名为TM100)，和编码具有与1)中所确定的氨基酸序列约75％同源性的氨基酸序列的cDNA(源于TMR1-TMRF1，TMR1-TMRF2对；特别是，将源于TMR1-TMRF1对的cDNA命名为TM75)。

5)筛选全长的cDNA

将得自4)的cDNA克隆TM100和TM75自载体中切割并用作探针以筛选白黄侧耳子实体的cDNA文库。根据ZAP cDNA合成试剂盒(Stratagene)的说明在方形培养皿(14×10cm)，将约20,000pfu的噬菌体用宿主XL1-blue MRF’涂布培养皿。将噬菌粒与Hybond-N+尼龙滤膜(Amersham)接触以按照该膜的说明通过碱变性DNA，并固定于膜上。该探针使用rediprime IITM DNA标记系统(Amersham)进行³²P-标记。在0.5M NaHPO₄(pH7.2)，7％SDS，1mM EDTA于65℃杂交过夜，在40mM NaHPO₄(pH7.2)，1％SDS，1mM EDTA于65℃20分钟洗涤两次。自约160,000pfu噬菌体用TM100探针初级筛选出600阳性克隆和用TM75探针初步筛选出30阳性克隆。其中，由TM100探针得到的24克隆和由TM75探针得到的12克隆进一步进行次级筛选，而三级筛选也针对纯化噬斑，所有选出的克隆按照ZAPcDNA合成试剂盒的(Stratagene)指示进行体内切割。结果，由TM100探针得到的18克隆和由TM75探针得到的12克隆作为整合入噬菌粒载体pBluescript SK的cDNA被回收。这些克隆的插入长度通过限制性内切酶分析得以鉴定。

6)确定碱基序列

每一上述cDNA克隆中最长的克隆的全部核苷酸序列都得以确定。起初，该克隆的5’和3’的核苷酸序列使用M13引物(takara)在ABI PRISM荧光测序仪得以确定(Model 310Genetic Analyzer，Perkin Elmer)。

然后，合成下面的引物：

TM100inRV：gTC AAg gCg TTA CTC Tgg(SEQ ID NO：14)，其是基于由TM100得到的最长克隆的5’核苷酸序列数据；

TM100inFW：CTg ggT gAg gAT CAC CTC(SEQ ID NO：15)，其是基于自相同克隆的3’核苷酸序列数据；

TM75inRV：gAT gTC TAC gTg CCC TAC(SEQ ID NO：16)，其是基于由TM75得到的最长克隆的5’核苷酸序列数据；和

TM75inFW：ACg ACT CAg AgA AgA ACT g(SEQ ID NO：17)，其是基于相同克隆的3’核苷酸序列数据；

并用于测序。因此，由TM100和TM75得到的最长克隆的DNA序列得以确定，使得确定全部的核苷酸序列。

结果显示编码白黄侧耳抗菌蛋白的cDNA(由TM100探针得到)编码143个氨基酸(SEQ ID NO：2)由全长671碱基(SEQ ID NO：1)组成。自纯化的蛋白质确定的N-末端氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2氨基酸残基8-76。SEQ IDNO：2氨基酸序列和直接自该纯化蛋白质确定的67氨基酸除了两未知的氨基酸(在SEQ ID NO：2氨基酸序列中的W65和S73)其它全部相同。由此得出结论克隆的cDNA源于编码白黄侧耳抗菌蛋白的基因。

自cDNA序列确定的蛋白质的N-末端序列与实际上纯化的蛋白的N-末端序列不相同，即在起始密码子蛋氨酸后面7个氨基酸之后的L(亮氨酸)位于纯化蛋白质的N-末端。这表明白黄侧耳抗菌蛋白首先被翻译为前体然后，将N-末端前导序列(7氨基酸)截短。推定成熟蛋白氨基酸(SEQ ID NO：2的第8-第143位的136个氨基酸序列)序列的平均分子量使用基因序列分析软件程序GENETYX-WIN ver 3.2(Software Development Co.，Ltd.)确定为15158.4，等电点计算为6.22。这个分子量与通过SDS-PAGE所估的纯化蛋白(15kDa)非常相符。此外，存在两个推定的糖基化位点(SEQ ID NO：2的氨基酸残基21和71位的N)。

另一方面，编码自白黄侧耳抗菌蛋白同源物的cDNA(由TM75得到)编码141个氨基酸(SEQ ID NO：4)，由全长840碱基(SEQ ID NO：3)组成。该cDNA在5’末端包含三个ATG密码子，但当翻译从第一和第二ATG密码子起始时，终止密码子紧接其后并且仅有12和31氨基酸可以被编码。只有翻译起始于第三个ATG密码子，可以编码141个氨基酸。终止密码子TGA在相同的读框内位于该ATG 102bp上游。因此，几乎可以确定的是第三个ATG是起始密码子。

推定的成熟的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸残基中由8-141残基组成的134氨基酸的序列)的分子量估测为14732.2，并且等电点计算为8.62。还存在一个推定的糖基化位点(SEQ ID NO：4中的N 115)。本发明白黄侧耳抗菌蛋白和其同源物的同源性使用GENETYX-WIN分析在氨基酸水平上为65.5％在DNA水平上为64.5％(开放读码框(ORF)为72.2％)。

通过GenBank数据库利用BLAST对本发明的源于白黄侧耳抗菌蛋白和其基因以及它们的同源物和具有其编码的氨基酸序列的蛋白质实施同源性搜寻。数据库搜寻本发明的源于白黄侧耳抗菌蛋白的氨基酸序列(SEQID NO：2的全部氨基酸序列)发现同源性序列诸如紫色链霉菌的链霉抗生物素蛋白v2(保藏号：Q53533，Bayer et al.(1995)Biochim Biophys Acta 1263：pp.60-66.)和v1(保藏号Q53532)，阿维丁氏链霉菌ii(Streptmyces avidin ii)的链霉抗生物素蛋白(保藏号：P22629，Argarana et al.(1986)Nucleic AcidsRes 14：pp.1871-1882)，等。这三种氨基酸同源性扩展到超过128个氨基酸，并分别是50％，49％和49％。卵清抗生物素蛋白(Gope et al.(1987)NucleicAcids Res 15：pp.3595-3606)和一些与抗生物素蛋白相关的蛋白(Keinanen etal.(1994)Eur J Biochem 220：pp.615-621)也以较低同源性程度匹配。核心链霉抗生物素蛋白突变体w79f ChainB(Freitag et al.(1997)Protein Sci.6：pp.1157-1166)也匹配，其与链霉抗生物素蛋白仅一个氨基酸不同，并且其中链霉抗生物素蛋白的36个N-末端氨基酸和20个C-末端氨基酸被截短，同源性为51.7％。

这些事实表明该蛋白是新的蛋白。数据库搜寻本发明第二个源于白黄侧耳抗菌蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的全部氨基酸序列)显示分别与链霉抗生物素蛋白v2，v1和链霉抗生物素蛋白有50％，48％和48％的同源性程度。

然而，使用编码源于第一白黄侧耳抗菌蛋白基因的DNA序列(SEQ IDNO：1的71-502)和编码源于第二白黄侧耳抗菌蛋白的DNA序列(SEQ ID NO：3的226-651)进行相似的数据库搜索，发现仅有几个序列(但不是链霉抗生物素蛋白的DNA序列)在很短的范围(23bp)内显示同源性。这表明编码本发明新蛋白的DNA序列与链霉抗生物素蛋白的DNA序列在DNA水平上没有高度同源性。

本发明的抗菌蛋白命名为″tamavidin″是由于从食用的蘑菇白黄侧耳(Tamogitake)纯化的新的链霉抗生物素蛋白样蛋白。本文中衍生于该纯化蛋白的基因称为tam1，具有由其编码的氨基酸序列的蛋白质称为tamavidin 1，tam1同源物称为tam 2，具有由其编码的氨基酸序列的蛋白质称为tamavidin2。当遗传序列分析软件程序GENETYX-WIN ver 3.2用于分析本发明白黄侧耳抗菌蛋白和链霉抗生物素蛋白的全部氨基酸序列(链霉抗生物素蛋白分别与链霉抗生物素蛋白v2和v1仅有9氨基酸和1个氨基酸不同)的同源性。结果由本发明tam1编码的tamavidin 1的氨基酸序列显示同源性(氨基酸同一性)为46.7％，并且由tam2编码的tamavidin 2的氨基酸序列显示为48.1％。全部DNA序列(序列表中SEQ ID NOs：1和3)与链霉抗生物素蛋白的同源性对于tam1为53.8％(ORF56.8％)及对于tam2为51.0％(ORF57.3％)。tam1编码的白黄侧耳抗菌蛋白与卵清抗生物素蛋白的在氨基酸序列中同源性为31.2％，在DNA序列中为42.4％，tam2编码的白黄侧耳抗菌蛋白与卵清抗生物素蛋白的在氨基酸序列中同源性为36.2％，在DNA序列中为41.8％。

通过UPGMA方法使用GENETYX-WIN制作tamavidin 1，tamavidin 2，链霉抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白V1，链霉抗生物素蛋白V2and抗生物素蛋白的成熟蛋白区域的氨基酸序列的分子系统树。结果如图7所示tamavidin 1和tamavidin 2形成不同于链霉抗生物素蛋白组和抗生物素蛋白组的第三组。

与链霉抗生物素蛋白相比，本发明tamavidin 1和tamavidin 2在N-末端33氨基酸截短，但可能涉及与生物素结合的所有的色氨酸(W)残基(Gitlin etal.(1988)Biochem.J 256：pp.279-282)和酪氨酸(Y)残基(Gitlin et al.(1990)Biochem.J 269：pp.527-530)都是保守的(在SEQ ID NO：2氨基酸序列的Y 34和45和W 82，98和110，在SEQ ID NO：4氨基酸序列中的Y 34和45和W 80，96和108)。

推定为成熟蛋白区域的该区域(SEQ ID NO：2的氨基酸序列8-143，SEQ ID NO：4的氨基酸序列8-141)平均分子量分别计算为15158.4和14732.2，接近于成熟链霉抗生物素蛋白和成熟抗生物素蛋白的平均分子量(分别为16490.6和14342.9)。这些事实强有力表明不仅tam1编码的tamavidin 1而且tam2编码的tamavidin 2是具有生物素结合亲和力的蛋白。

实施例4：通过添加生物素消除抗真菌活性的实验

本发明抗菌蛋白是新的链霉抗生物素蛋白样蛋白，表明其结合一种维生素，D-生物素(维生素H，Katayama Chemical)。稻瘟病菌的生长已知需要生物素。这些事实表明本发明的抗菌蛋白与试验培养基存在的游离的生物素结合，以诱导生物素缺陷的培养基，结果抑制了稻瘟病菌(M.grisea)的生长

图8显示通过添加生物素消除抗真菌活性的实验结果。具体地是，将悬浮于1/2PD的M.grisea孢子置于微量滴定板上。制备含有50ng/ml或1000ng/ml纯化的tamavidin 1的孔，含有1000ng/ml的tamavidin 1和100ng/ml生物素的孔，以及不含蛋白的对照孔，并在28℃温育48小时。

结果，如图8中所示，在含tamavidin 1甚至浓度为50ng/ml的孔中，M.Grisea菌丝的延伸被较大程度地抑制。然而，在既含有tamavidin 1(1000ng/ml)又有生物素的孔和对照孔中，菌丝正常延伸。因此，本发明抗菌蛋白的抗真菌活性通过过量添加生物素到试验培养基中而实际上得以消除，这可能是由于过量添加的一部分生物素与大部分的用于测试活性的tamavidin1结合而灭活其抗真菌活性。

类似的试验在商业购得的在浓度1000ng/ml的卵清抗生物素蛋白(Sigma)和阿维丁氏链霉菌ii的链霉抗生物素蛋白(Sigma)中实施。结果显示两种蛋白质都具有抗M.Grisea的抗真菌活性并且该活性都被生物素消除(图8)。

实施例5：重组tamavidin 2蛋白的生物素结合活性

1)构建表达载体

tam2基因分离为本发明tam1基因的同源物，对由tam2基因编码的tamavidin 2进行了评估以发现它实际上是否显示了与生物素结合的活性。具体地是，将tam2基因插入大肠杆菌以表达重组tamavidin 2，并且进行检测该蛋白是否在亚氨基生物素柱上被纯化。

起初，合成用于通过PCR扩增全部实施例3中获得的tam2基因的ORF(序列表中SEQ ID NO：3的226-651)引物对。

TM75Bsp5：5’-ACCAACATgTCAgACgTTCAA-3’(SEQ ID NO：18)

TM75Hin3：5’-ATgAAAgCTTTTACTTCAACCTCgg-3’(SEQ ID NO：19).

TM75Bsp5包含限制性内切酶BspLU 11I的识别位点(下划线)并且TM75Hin3包含限制性内切酶HindIII的识别位点(下划线)。这些引物用于在以包含tam2基因的质粒(pBluescript，实施例3(6))作为模板实施PCR。利用程序性温度控制系统PC-700(ASTEK)，50μl反应溶液包含500ng模板质粒DNA，5μl 10×Pyrobest缓冲液，4μl 2.5mM各dNTP，10pmoles各引物，0.5μl Pyrobest DNA聚合酶(Takara)在94℃，3min运行1个循环；94℃，1min；50℃，1min，72℃，1min进行15个循环，接着在72℃，6min 1个循环。

所得的PCR产物用限制性内切酶BspLU 11I(Roche)和HindIII(Takara)双消化并进行凝胶纯化。所用的大肠杆菌表达载体为pTrc99A(PharmaciaLKB)。该载体为用NcoI(Takara)和HindIII双消化并凝胶纯化，和用上述限制性内切酶消化的PCR产物连接，然后插入到大肠杆菌TB1。所插入的tam2基因的核苷酸序列得以证实。

2)重组蛋白的表达和在生物素柱上的纯化

将具有包含tam2表达载体pTrc99A的大肠杆菌TB1的单集落接种至包含抗生素氨苄青霉素的LB培养基上进行前培养至约OD₆₀₀＝0.5。然后添加IPTG的终浓度为1mM以诱导蛋白表达，并且通过在37℃振荡再培养4.5小时。培养基的体积为50mL，不含IPTG(异丙基-β-D(-)-硫代半乳糖苷，Wako Pure Chemical Industries)的对照也进行检测。通过离心收集培养细胞并直至蛋白质纯化储存于-80℃

参考Hofmann等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4666-4668(1980))的方法将Tamavidin 2在亚氨基生物素上纯化。将细胞悬浮于1.5mL缓冲液A(50mM CAPS(3-[环己氨基]-1-丙烷磺酸，SIGMA)，pH 11，50mM NaCl)并超声破碎。离心之后，将上清收集为全部可溶的蛋白。用0.5mL 2-亚氨基生物素-琼脂糖(SIGMA)在具有直径0.5cm高5cm的柱填充装柱并用缓冲液A预平衡。将全部可溶的蛋白在该亚氨基生物素琼脂糖柱上上柱。在该柱用5mL50mM CAPS pH11，500mM NaCl洗涤之后，tamavidin 2被用1.5mL50mM NH₄OAC，pH4.0进行洗脱。全部可溶的蛋白和已通过该柱的级分，洗涤级分和洗脱级分在15％PAGEL(ATTO)进行SDS-PAGE电泳。

迁移之后，将该蛋白用考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)R-250(Wako Pure Chemical Industries)染色。结果显示于图9。如图9所示，1mMIPTG(T)诱导的大肠杆菌全部可溶性级分(T)显示约15kDa的条带，而在未诱导的级分(C)中未发现该条带。该分子量与tam2基因编码的141氨基酸所推导的15467的分子量极为符合。

此外，该15kDa蛋白在用50mM NH₄OAC，pH4.0洗脱的级分(E)中出现，但未在通过生物亚氨基素柱的级分(F)和柱的洗涤级分(W)中显现。该15kDa蛋白形成洗脱级分的主要成分。这种结果显示tam2编码的tamavidin2结合生物素，该结果还显示其可方便地通过上述方法纯化。得自50mL培养体积的大肠杆菌中表达的重组tamavidin 2产量约1mg。

效果

对包含下述蛋白成分作为活性成分的制剂预计可用作抗真菌剂，该蛋白成分的特征在于其根据本发明包含由SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列组成的多肽或由其部分序列组成并且能与生物素或其衍生物结合的多肽。

抗病植物也可通过将本发明具有SEQ ID NO：1的71-502或92-502序列的DNA或具有SEQ ID NO：3的226-651或247-651序列的DNA整合入包含在植物细胞中有功能的合适的组成型启动子，器官/时间特异性启动子或对胁迫或害虫作出反应的诱导型启动子序列，和在植物细胞中有功能的终止子序列的表达盒中，然后将该盒导入植物细胞以得到再生个体。这种情况下，编码用于运输到细胞内的细胞器的信号肽的DNA序列或用于胞外分泌信号序列也可与编码本发明抗菌蛋白DNA序列连接。

本发明的蛋白可以在大肠杆菌，酵母，植物，昆虫或动物，诸如非洲瓜蟾中，通过将编码本发明蛋白的DNA整合入能在上述细胞中表达外源蛋白的表达载体大量产生或制备。这种情况下，编码用于运输到小细胞器的信号肽的DNA序列或用于胞外分泌的信号序列也可与编码本发明抗菌蛋白DNA序列连接。

本发明蛋白和生物素间强的相互作用可应用于链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白当前广泛应用的各种分析技术中。

序列表

<110>日本烟草产业株式会社和欣根塔有限公司

(JAPAN TOBACCO INC.and Syngenta Limited)

<120>新蛋白质，编码该蛋白质的基因和它们的使用方法

<130>YCT697

<160>19

<210>1

<211>671

<212>DNA

<213>白黄侧耳(Pleurotus cornucopiae)

<220>

<221>CDS

<222>(71)...(502)

<400>1

gcccagagag accatctata acctctgcgt ccaaaccttc attgaaagct tcaaccccca 60

gtcccccatc atg aaa gac gtc caa tct ctc ctc acc gga acc tgg tac 109

Met Lys Asp Val Gln Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr

1 5 10

aat gaa ctc ggc tca aca atg aat ttg act gca aat aaa gac ggt tcg 157

Asn Glu Leu Gly Ser Thr MET Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser

15 20 25

ctc acc gga acg tac cac tcc aac gtc ggc gag gtt ccc cca act tat 205

Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr

30 35 40 45

cac ctt tct ggc cgg tac aac ctc cag ccc ccc tcg ggt caa ggc gtt 253

His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val

50 55 60

act ctg gga tgg gcg gtg tct ttc gaa aac act agt gcg aat gtt cat 301

Thr Leu Gly Trp Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Val His

65 70 75

tct gtc tca aca tgg agc ggg cag tac ttc tct gaa ccc gcc gag gtg 349

Ser Val Ser Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Val

80 85 90

atc ctc acc cag tgg ctg ttg tca agg agc tct gag cgc gaa gat ttg 397

Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu

95 100 105

tgg cag tcc acc cat gtg ggg cat gat gag ttc agc aag aca aag cca 445

Trp Gln Ser Thr His Val Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro

110 115 120 125

acc aag gag aag att gcc cag gct caa ctc ctt cgt cgc ggg ttg aag 493

Thr Lys Glu Lys Ile Ala Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys

130 135 140

ttc gag tga acctgattca cgaaaaattc cgtctatcca acgttggaga tgactccac 551

Phe Glu

143

ctcaagttgt gaatgtttgc tcatttgtac cgaatctgta cgacaagttt gtctgccacc 611

atgtacatcg caaagaatta tcaagaaact ccatgacctg ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa 671

<210>2

<211>143

<212>PRT

<213>白黄侧耳(Pleurotus cornucopiae)

<400>2

Met Lys Asp Val Gln Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr

1 5 10

Asn Glu Leu Gly Ser Thr MET Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser

15 20 25

Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr

30 35 40 45

His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val

50 55 60

Thr Leu Gly Trp Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Val His

65 70 75

Ser Val Ser Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Val

80 85 90

Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu

95 100 105

Trp Gln Ser Thr His Val Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro

110 115 120 125

Thr Lys Glu Lys Ile Ala Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys

130 135 140

Phe Glu

143

<210>3

<211>840

<212>DNA

<213>白黄侧耳(Pleurotus cornucopiae)

<220>

<221>CDS

<222>(226)...(651)

<400>3

gtggactctt gcgcgggcag gtacattcac aggtcgtgca ggttgtggga gtattcagtg 60

gctcagactc ttgtgctgac gggtatagat tcacaagccg tgcaggttgt gggagtactc 120

agagggtgag tgattgaatg gaagcacatc ggcgctggtt tcaagccgag aattgaggaa 180

gtaatactcc aagccgatga gaggttacag agatcctcta ccacc atg tca gac gtt 237

Met Ser Asp Val

1

caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc aac tcc aag atg 285

Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Asn Ser Lys Met

5 10 15 20

gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga aag tac ctc tcc 333

Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Ser

25 30 35

aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct ggt cgc tat aac 381

Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Asn

40 45 50

ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg tgg gcg gta tcc 429

Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly Trp Ala Val Ser

55 60 65

tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg agc gga cag ttc 477

Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Phe

70 75 80

ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg ttg ttg tca tcg 525

Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Ser

85 90 95 100

agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt gtg ggg aat gat 573

Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu Val Gly Asn Asp

105 110 115

tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc gct cat gct caa 621

Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile Ala His Ala Gln

120 125 130

ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa cgagggtcat cgcaaacaaa ccc 674

Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys

135 140 141

catcggtctt gaccggtgat ccaaccccaa ggtctaatca atgccggatg actccatttg 734

aggatgtgaa ttagttgcca tttgtatgac ttgatttgtc tgttgtgtag tatcggatta 794

agaatcacat ctcgttaacc ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 840

<210>4

<211>141

<212>PRT

<213>白黄侧耳(Pleurotus cornucopiae)

<400>4

Met Ser Asp Val

1

Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Asn Ser Lys Met

5 10 15 20

Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Ser

25 30 35

Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Asn

40 45 50

Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly Trp Ala Val Ser

55 60 65

Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Phe

70 75 80

Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Ser

85 90 95 100

Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu Val Gly Asn Asp

105 110 115

Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile Ala His Ala Gln

120 125 130

Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys

135 140 141

<210>5

<211>44

<212>PRT

<213>白黄侧耳(Pleurotus cornucopiae)

<220>

<223>Xaa代表未知氨基酸残基

<400>5

Leu Xaa Gly Xaa Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Xaa Xaa Met Asn Leu Thr

1 5 10 15

Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Xaa Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly

20 25 30

Glu Val Pro Xaa Xaa Tyr His Leu Ala Gly Arg Tyr

35 40 44

<210>6

<211>50

<212>PRT

<213>白黄侧耳(Pleurotus cornucopiae)

<220>

<223>Xaa代表未知氨基酸残基

<400>6

Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro

1 5 10 15

Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly

20 25 30

Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala

35 40 45

Asn Val

50

<210>7

<211>21

<212>PRT

<213>白黄侧耳(Pleurotus cornucopiae)

<220>

<223>Xaa代表未知氨基酸残基

<400>7

Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr

1 5 10 15

Ala Asn Lys Asp Gly

20 21

<210>8

<211>23

<212>PRT

<213>白黄侧耳(Pleurotus cornucopiae)

<220>

<223>Xaa代表未知氨基酸残基

<400>8

Leu Thr Gly Thr Xaa Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Xaa Asn Leu Thr

1 5 10 15

Ala Asn Xaa Asp Gly Xaa Leu

20 23

<210>9

<211>69

<212>PRT

<213>白黄侧耳(Pleurotus cornucopiae)

<220>

<223>Xaa代表未知氨基酸残基

<400>9

Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr

1 5 10 15

Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly

20 25 30

Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro

35 40 45

Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn

50 55 60

Thr Xaa Ala Asn Val

65

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

acnggnacnt ggtayaayg

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>6和9

<223>i代表肌苷

<400>11

garytiggiw snacnatgaa

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>12 and 15

<223>i代表肌苷

<400>12

gtrttytcra aiswiacn

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>3 and 6

<223>i代表肌苷

<400>13

cciarigtna cnccytgncc

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gtcaaggcgt tactctgg

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ctgggtgagg atcacctc

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

gatgtctacg tgccctac

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

acgactcaga gaagaactg

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

accaacatgt cagacgttca a

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

atgaaagctt ttacttcaac ctcgg

Claims

1.一种抗菌蛋白，可通过使用硫酸铵沉淀法自白黄侧耳水提取物沉淀的级分来获得该蛋白质，其中所述蛋白质具有至少对稻瘟病的抗菌活性，其在SDS-PAGE法中，显示出分子量约为15kDa的组分的存在。

2.根据权利要求1的抗菌蛋白，其中N-末端具有SEQ ID NO：9所述的N-末端氨基酸序列，其中Xaa未知。

3.一种对稻瘟病显示抗菌活性的抗菌蛋白，其中所述蛋白具有SEQ IDNO：2或NO：4的氨基酸序列，或在所述序列中有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列，或与所述序列具有52％或更高同源性的氨基酸序列。

4.权利要求3的抗菌蛋白，具有与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列有60％或更高同源性氨基酸序列。

5.权利要求3的抗菌蛋白，具有与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列有70％或更高同源性氨基酸序列。

6.权利要求3的抗菌蛋白，具有与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列有80％或更高同源性氨基酸序列。

7.权利要求3的抗菌蛋白，具有与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列有90％或更高同源性氨基酸序列。

8.权利要求3的抗菌蛋白，具有与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列有95％或更高同源性氨基酸序列。

9.一种由单独的多肽或其组合组成的抗菌蛋白，其中所述多肽选自

由SEQ ID NO：2的8-143的部分氨基酸序列或SEQ ID NO：4的8-141的部分氨基酸序列组成的多肽，和

在所述任一项氨基酸序列中具有一个或更多个修饰氨基酸的多肽；和

与所述任一项氨基酸序列具有52％甚至更高的同源性的多肽。

其中所述多肽对稻瘟病显示抗菌活性。

10.一种制备权利要求1-9中任一项所述的抗菌蛋白的方法，其中包括：

回收通过硫酸铵沉淀法，用75％-饱和硫酸铵沉淀的自白黄侧耳含水提取物的级分；和

11.一种编码权利要求1-9中任一项所述的抗菌蛋白的基因。

12.权利要求11的基因，其中所述基因具有SEQ ID NO：1的碱基71-502碱基序列或具有SEQ ID NO：3碱基226-651碱基序列，或具有在此碱基序列中取代，缺失，插入和/或添加一个或多个碱基的碱基序列，或能在严谨条件下与上述任一碱基序列杂交的碱基序列。

13.权利要求11或12的基因，具有与SEQ ID NO：1的碱基71-502碱基序列或与具有SEQ ID NO：3碱基226-651碱基序列有至少60％的同源性的碱基序列。

14.权利要求11或12的基因，具有与SEQ ID NO：1的碱基71-502碱基序列或具有与SEQ ID NO：3碱基226-651碱基序列有至少70％的同源性的碱基序列。

15.权利要求11或12的基因，具有与SEQ ID NO：1的碱基71-502碱基序列或具有与SEQ ID NO：3碱基226-651碱基序列有至少80％的同源性的碱基序列。

16.权利要求11或12的基因，具有与SEQ ID NO：1的碱基71-502碱基序列或具有与SEQ ID NO：3碱基226-651碱基序列有至少90％的同源性的碱基序列。

17.权利要求11或12的基因，具有与SEQ ID NO：1的碱基71-502碱基序列或具有SEQ ID NO：3碱基226-651碱基序列有至少95％的同源性的碱基序列。

18.通过以下方法产生的用于得到编码源自白黄侧耳的抗菌蛋白的基因的寡核苷酸，所述方法包括：

根据以下需求，从编码SEQ ID NO：1或3抗菌蛋白之基因的碱基序列中选择两个区域：

1)每个区域长15-30个碱基；

2)每个区域碱基序列中G+C的含量的比例为40-60％；

制备单链DNA，该DNA具有与所述区域的碱基序列相同或互补的碱基序列，或者制备根据遗传密码简并性不改变所述单链DNA所编码的氨基酸残基的单链DNA混合物；并任选制备修饰的所述单链DNA，所述修饰不丧失与编码所述抗菌蛋白之基因的单链DNA碱基序列的结合特异性。

19.根据权利要求18的寡核苷酸，具有权利要求10-19任一项所述的核苷酸序列。

20.一种分离根据权利要求11-17中任一项的基因的方法，其中所述方法包括：使用权利要求18或19的两种寡核苷酸作为引物对和白黄侧耳子实体cDNA文库为模板进行核酸扩增反应，籍此扩增编码根据权利要求1-9所述的任一项抗菌蛋白之基因的一部分，和

使用如此获得的扩增产物为探针筛选该cDNA文库，从而分离全长cDNA克隆。

21.一种含有根据权利要求11-17中任一项基因的重组载体。

22.根据权利要求21的重组载体，其中所述载体是表达载体。

23.通过将根据权利要求21或22的重组载体导入宿主生物而得到的转化体。

24.权利要求23的转化体，其是抗病性植物。

25.一种包括权利要求1-9任一项抗菌蛋白作为活性成分的抗菌剂。

26.一种由权利要求23的转化体制备的重组蛋白。