KR100824107B1 - 신규의 단백질, 이를 암호화하는 유전자 및 이들을이용하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은 상대적으로 낮은 농도로 벼 작물에 해를 입히는 두 가지 주요한 질병을 야기시키는 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)와 같은 식물 병원성 미생물의 성장을 저해할 수 있는 신규한 항미생물 단백질을 탐색하고 확인하는 것이고, 또한 이 단백질의 유전자를 클론하는 것이다. 본 발명에 따르면, 암모늄 설페이트법에 의하여 침전된 료필럼 쉬메지의 수성 추출물의 분획으로부터 얻어질 수 있는 항미생물 단백질은 적어도 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대하여 항미생물 활성을 나타내고, SDS-PAGE법에서 분자량 약 70kDa 및/또는 65kDa의 구성성분이 존재한다. 이 단백질을 암호화하는 유전자 및 그를 이용하는 방법이 제공된다.

Description

신규의 단백질, 이를 암호화하는 유전자 및 이들을 이용하는 방법{NOVEL PROTEIN, GENE ENCODING THE SAME AND METHOD OF UTILIZATION THEREOF}

본 발명은 항미생물 활성을 가진 신규한 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 단백질 및 유전자를 이용하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 료필럼 쉬메지(Lyopyllum shimeji)로부터 유래하고, 적어도 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia Oryzae)에 대하여 항미생물 활성을 가진 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 단백질 및 유전자를 이용하는 방법에 관한 것이다.

본 출원은 1999년 9월 21일에 출원된 일본 특허 출원번호 제267238/1999에 기초하여 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 참조로서 본 명세서에 포함되어진다.

키티나제(chitinase) 및 베타-1,3-글루카나제(β-1,3-glucanase)와 같은 파열 효소(lytic enzyme)는 식물 병원성 미생물에 대한 항균(antifungal) 또는 항미생물(antimicrobial) 활성을 가진 식물 단백질로서 알려져 왔다. 인 비트로 실험에 의하면, 이런 형태의 효소들은 단독으로 적용되었을 때에도 그들의 효과를 발휘할 것이나(Schlumbaum 등(1986), Nature 324, pp. 365∼367; Broglie 등(1991), Science 254, pp. 1194∼1197), 둘 이상의 그러한 효소가 조합되어 적용된다면 증 진된 효과가 일반적으로 얻어질 수 있다(Mauch 등(1988), Plant Physiol. 88, pp. 936∼942; Sela-Buurlage 등(1993), Plant Physiol. 101, pp. 857∼863). 곰팡이 성장을 저해하기 위하여 사용된다면, 단독으로 사용될 때에는 이들 파열 효소들은 약 수 십에서 수 백 ㎍/ml, 또는 조합하여 사용될 때에는 효소 당 약 수 ㎍/ml의 농도로 사용될 것이 요구된다고 알려졌다. 그러나, 본 발명의 발명자들이 아는 한, 이들 파열 효소들 중 어느 것도 벼 작물에 광범위한 해를 야기시키는 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae)에 대해 어떠한 항미생물 작용을 나타내는 지에 대하여 입증되지 않았다.

디펜신(defensin)과 같은 저분자량의 항곰팡이 펩티드(Antifungal peptides: AFP)도 또한 항미생물 활성을 가지고 있고, 이들 중 Ca-AMP1(일본 국내 공개 번호 505048/96) 및 CB-1(Oita 등(1996), Biosci. Biotech. Biochem. 60, pp. 481∼483)은 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 모두에 대한 항미생물 활성을 가진다고 보고되었다. 반면에 Rs-AFP1과 Ar-AFP2(Terras 등(1992), J. Biol. Chem. 267, pp 15301∼15309) 및 Ace-AMP1(일본 국내 공개 번호 501424/97)는 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae)에 대한 항미생물 활성을 가진다. 이들 저분자량 펩티드는 수 ㎍/ml의 농도로 상기한 미생물을 포함한 식물 병원성 미생물의 성장을 50% 저해한다.

또한, 파열효소 유전자 또는 저분자량 항미생물 펩티드 유전자를 분리하고, 이들 유전자들을 식물에 도입함으로써 질병으로 인한 상처(injury)에 대하여 저항성을 가진 식물체를 만들려는 시도가 있었다(Broglie 등(1991), Science 254, pp. 1194∼1197; Zhu 등(1994), Bio/Technology 12, pp. 807∼812; Lin 등(1995), Bio/Technology 13, pp. 686∼691; Terras 등(1995), The Plant Cell 7, pp. 573∼588). 그러나 어떠한 식물에 대하여도 실제적으로 허용가능한 수준으로 저항성이 주어지는 경우는 지금까지 얻어지지 않았다. 이에 대한 한 가지 이유는 도입된 유전자들이 아주 낮은 수준으로만 발현되기 때문인 것으로 여겨진다. 그러나, 좀더 근본적인 이유는 지금까지 보고된 항미생물 단백질 그 자체가 낮은 항미생물 활성을 가지고 있기 때문인 것으로 여겨진다. 결과적으로, 종래의 것에 비하여 항미생물 활성이 뛰어난 항미생물 단백질을 확인하고 이용하는 것이 요망되었다.

본 발명의 목적은, 심지어 상대적으로 낮은 농도에서도 벼에 영향을 미치는 두가지 주요한 질병을 야기시키는 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)를 포함하는, 다양한 식물 병원성 미생물의 성장을 저해할 수 있는 신규한 항미생물 단백질을 선별(screen)하고 확인하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 신규한 단백질을 암호화하는 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 결정하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 상기 유전자를 숙주 개체(미생물, 동물, 식물 등)에 도입하여 형질전환체를 만들고, 그럼으로써 본 발명의 유전자를 이용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 항미생물 단백질을 포함하는 항미생물제를 제공하는 것이다.

도 1은 MonoQ 칼럼을 이용한 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji) 단백질의 분리 차트 및 그의 항미생물 활성간의 관계를 나타내는 도면이고,

도 2는 MonoQ 칼럼에 의하여 분리된 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji) 단백질의 전기영동 양상 및 그의 항미생물 활성간의 관계를 나타내는 도면이다. 레인 상에 주어진 번호는 각각 도 1의 분획 번호에 해당하는 반면, M은 분자량 마커를 나타낸다. 레인 하단에 주어진 기호(-, +, ++, +++)는 항미생물 활성 강도를 나타낸다. 화살표는 항미생물 단백질(70kDa 및 65kDa)을 나타낸다.

상기 문제들에 대한 집중적인 연구의 결과, 본 발명자들은 인 비트로(in vitro)에서의 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 항미생물 활성 결정용 검정 시스템(assay system)을 확립하였다. 이를 확립한 후, 식용가능한 버섯 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji)로부터 단백질을 추출하였다. 상기 추출된 단백질은 이온교환칼럼 크로마토그래피 및 HPLC의 조합과정을 거치고, 그 결과 얻어진 각 분획은 상기 검정 시스템을 이용하여 조사되었다. 위와 같이, 상기 발명자들은 항미생물 단백질을 성공적으로 확인하고, 분리 및 정제하였다. 더욱이, 정제된 단백질의 부분적 아미노산 서열을 결정하였다. 프라이머로서 이들 아미노산 서열에 근거하여 합성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 RT-PCR을 행하였으며, 그 결과 상기 단백질을 암호화하는 부분적 길이의 cDNA를 얻었다. 뒤이어, 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji)로부터 유래한 cDNA 라이브러리를 탐침으로서 이들 부분적 길이의 cDNA를 사용하여 탐색하였다. 결과적으로, 상기 단백질을 암호화하는 전장 cDNA가 분리되었고, 그의 전체 염기 서열이 결정되었다. 위와 같이, 본 발명자들은 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji)로부터 유래한 신규한 항미생물 단백질을 성공적으로 분리하였고, 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 클로닝하였다. 더욱이, 상기 단백질의 아미노산 서열과 DNA의 염기서열을 결정하였고, 그럼으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

그러므로, 상기 첫 번째 양상에 따르면, 본 발명은 암모늄 설페이트 침전법에 의하여 침전된 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji)의 수성 추출물의 분획으로부터 얻을 수 있는 항미생물 단백질을 제공하고, 상기 단백질은 적어도 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 항미생물 활성을 가진 것으로 입증되었고, SDS-PAGE법을 이용하여 확인된 바에 의하면, 전구체 형태로는 약 70kDa의 분자량 및 성숙한 형태로서 약 65kDa의 분자량을 가진다.

일반적으로, 본 발명에 따른 항미생물 단백질은 서열목록의 서열번호2의 아미노산서열을 갖는다. 약 65kDa의 상기 성숙한 형태는 서열번호1의 아미노산 잔기 76에서 618로 이루어지나, 본 발명은 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 항미생물 단백질은 서열번호2의 아미노산 서열을 가진 항미생물 단백질뿐만 아니라 그 내부에 하나이상의 아미노산 돌연변이를 가진 아미노산을 가진 항미생물 단백질 또는 이 서열과 50%이상의 상동성을 가지고 피리쿨라 리아 오리자(Pyricularia oryzae) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 항미생물 활성을 보이는 아미노산 서열과 관련된다.

바람직하기로는, 본 발명에 따른 항미생물 단백질은 서열목록의 서열번호2의 아미노산 서열과 60%이상, 더욱 바람직하기로는 70%이상, 더욱 바람직하기로는 80%이상, 특히 바람직하기로는 90%이상 및 가장 바람직하기로는 95%이상의 상동성을 갖는 것이다.

상기 두 번째 양상에 따르면, 본 발명은 부분적 아미노산 서열 예를 들면, 서열목록의 서열번호2의 아미노산 서열에 있어서 아미노산 잔기 76에서 618의 서열을 갖는 폴리펩티드; 그 내부에 하나이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 이 서열과 50%이상의 상동성을 갖고 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 항미생물 활성을 보이는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중에서 선택된 단일 폴리펩티드 또는 이들 폴리펩티드의 조합으로 구성되는 항미생물 단백질을 제공한다.

본 발명의 두 번째 양상에 따른 상기한 항미생물 단백질에 관하여, 각각의 특정 아미노산 서열과 "50%이상의 상동성을 갖는 단백질"의 정의는 적어도 50%의 상동성을 갖는 한 허용가능하다는 것을 의미한다. 그러나, 이 단백질은 바람직하기로는 60%이상, 더욱 바람직하기로는 70%이상, 더욱 바람직하기로는 80%이상, 특히 바람직하기로는 90%이상 및 가장 바람직하기로는 95%이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 의도한 것이다.

상기 세 번째 양상에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하여 이루어지는 본 발명의 항미생물 단백질을 생산하는 공정을 제공하는 것이다:

암모늄 설페이트 침전법에 의하여, 75% 포화 암모늄 설페이트로 침전된 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji)의 수성 추출물의 분획을 회수하는 단계; 및

상기 분획을 이온교환 크로마토그래피를 거치게 하고 0.05M에서 1M의 NaCl 농도로 용출된 분획을 회수하는 단계.

상기 네 번째 양상에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항미생물 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

일반적으로, 본 발명에 따른 유전자는 서열목록의 서열번호1의 염기서열, 하나이상의 염기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의하여 이 염기서열로부터 파생된 염기서열 또는 엄격한 조건하에서 상기 염기서열에 혼성화할 수 있는 염기서열을 갖는다.

본 발명에 따른 상기 유전자는 서열목록의 서열번호1의 염기서열과 일반적으로 50%이상, 바람직하기로는 60%이상, 더욱 바람직하기로는 70%이상, 더욱 바람직하기로는 80%이상, 특히 바람직하기로는 90%이상 및 가장 바람직하기로는 95%이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 갖는다.

상기 다섯 번째 양상에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하여 이루어지는 공정에 의하여 만들어진 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji)로부터 유래된 항미생물 단백질을 암호화하는 유전자를 얻기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다:

서열목록의 서열번호1의 항미생물 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 염기 서열로부터 다음의 요건을 충족시키는 두 도메인을 선택하는 단계:

1) 15에서 30염기로 구성되는 각 도메인; 및

2) 40%에서 60%의 G+C 함량을 갖는 각 도메인;

상기 도메인의 염기서열과 동일하거나 그들에 상보적인 염기서열을 갖는 단일 가닥 DNA 준비하는 단계, 또는 단일 가닥 DNA들에 의하여 암호화되는 아미노산 잔기들이 변화되지 않도록 하는 유전적 코드에 있어서 다의성(degeneracy)을 갖는 단일가닥 DNA 혼합물을 준비하는 단계; 및 상기 항미생물 단백질을 암호화하는 유전자의 염기서열에의 결합 특이성에 해를 입히지 않으면서 단일 가닥 DNA를 선택적으로 변형시키는 단계.

바람직하기로는, 본 발명에 따른 상기 올리고뉴클레오티드는 서열목록의 서열번호7에서 12의 어느 뉴클레오티드 서열을 가진다.

여섯번째 양상에 따르면, 본 발명은 주형으로서 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji) cDNA 라이브러리 및 프라이머로서 상기한 한쌍의 두 올리고뉴클레오티드를 사용하여 핵산 증폭 반응을 일으켜 본 발명의 상기 항미생물 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 일부분을 증폭하는 단계 및 프로브로서 위와 같이 얻어진 상기 증폭 산물을 사용하여 cDNA 라이브러리를 선별하여 전장 cDNA 클론을 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 본 발명에 따른 상기 유전자의 분리 방법을 제공한다.

일곱번째 양상에 따르면, 본 발명은 본 발명의 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터에 관하여, 상기 벡터는 발현 벡터인 것이 바람직하 다.

여덟번째 양상에 따르면, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터를 숙주 개체로 도입함으로써 얻어지는 형질전환체를 제공한다.

아홉번째 양상에 따르면, 본 발명은 활성 성분으로서 본 발명에 따른 항미생물 단백질을 포함하여 이루어지는 항미생물제를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위하여 바람직한 구체예들이 개시될 것이다.

본 발명의 첫번째 양상에 따르면, 식물 병원성 미생물에 대한 항미생물 활성을 가진 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji)로부터 유래한 단백질이 제공된다. 상기 본 발명의 단백질은 본 명세서에서 기술된 특징을 갖는 한 기원, 생산방법 등에 의하여 제한받지 않는다. 즉, 본 발명의 항미생물 단백질은 자연의 단백질, 유전공학기술을 이용하여 재조합 DNA로부터 발현된 단백질 또는 화학적으로 합성된 단백질일 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 상기 단백질은 서열목록의 서열번호2의 것으로서 618개 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, 자연의 단백질은 그 단백질을 생산하는 다양한 개체에 있어서의 차이, 에코타입(ecotype)의 차이에 따른 유전자 돌연변이 또는 아주 비슷한 동위효소(isozyme)의 존재에 의하여 야기된 하나이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 돌연변이 단백질을 수반한다는 것은 잘 알려져 있다. 본 명세서에 사용된 "아미노산 돌연변이"란 용어는 하나이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가 등을 의미한다. 본 발명에 따른 상기 단백 질은 클론된 유전자의 염기서열로부터 추론된 서열번호2의 아미노산 서열을 가지지만, 이 서열을 가지는 단백질에만 한정되는 것은 아니다. 즉, 본 명세서에 언급된 특징들을 가지는 한 상동 단백질도 본 발명에 포함된다는 것을 의도한 것이다. 상기 상동성은 적어도 50%이상, 바람직하기로는 60%이상, 더욱 바람직하기로는 70%이상, 더욱 바람직하기로는 80%이상, 특히 바람직하기로는 90%이상 및 가장 바람직하기로는 95%이상이다.

본 명세서에서, 상기 상동성 백분율은 예를 들면, Altschul등(Nucl. Acids. Res. 25. pp. 3389∼3402, 1997)에 의하여 보고된 BLAST 프로그램을 이용하여 서열 데이터를 비교함으로써 결정될 수 있다. 이 프로그램은 국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)(NCBI) 또는 일본 DNA 데이터은행(DNA Data Bank of Japan)(DDBJ)의 인터넷 웹사이트로부터 인터넷 상에서 구입할 수 있다. 상기 BLAST 프로그램에 의하여 상동성 검색을 위한 다양한 조건(인자)들이 이 사이트에 상세하게 설명되어 있다. 비록 그 체제는 다소 변할 수 있을 지라도, 초기설치(default)를 이용하여 일반적으로 검색을 수행할 수 있다.

일반적으로, 하나이상의 아미노산 잔기를 다른 하나이상의 비슷한 성질을 가진 아미노산 잔기로 치환함으로써 얻어지는 돌연변이(예를 들면, 소수성 아미노산을 또 다른 소수성 아미노산으로 치환, 친수성 아미노산을 또 다른 친수성 아미노산으로 치환, 산성 아미노산을 또 다른 산성 아미노산으로 친환 또는 염기성 아미노산을 또 다른 염기성 아미노산으로 치환)는 온전한 단백질과 비슷한 성질을 갖는 다. 유전 공학 기술을 이용하여 그러한 바람직한 돌연변이를 갖는 재조합 단백질을 제조하는 과정은 당업자에게 잘 알려져 있으므로, 이들 단백질 또한 본 발명의 범위내에 속한다.

본 발명의 상기 단백질은 SDS-PAGE법에 의하여 측정된 것으로서, 서열목록의 서열번호2의 1에서 618의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 해당하는 전구체 형태로서 약 70kDa의 분자량을 가지고, 서열목록의 서열번호2의 76에서 618의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 해당하는 성숙한 형태로서 약 65kDa의 분자량을 가진다. 일반적으로, 본 발명에 따른 상기 항미생물 단백질은 서열목록의 서열번호2의 아미노산 서열을 가지나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명은 서열목록의 서열번호2의 아미노산 서열에 있어서 1에서 618의 부분적 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및 76에서 618의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중에서 선발된 단일 폴리펩티드 또는 이들의 조합을 포함하여 이루어지는 항미생물 단백질을 제공한다. 상기 폴리펩티드는 명세서에서 상기한 바와 같은 돌연변이를 갖는 상동성 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명에 따른 단백질은 다음의 실시예에서 기술하는 바와 같은 암모늄 설페이트 침전법, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 등을 이용하여 료필럼 쉬메지 과실체로부터 정제할 수 있다. 다른 방법으로서, 해당 단백질은 본 발명에 따른 서열목록의 서열번호1에 있어서 8에서 1861의 DNA 서열 또는 233에서 1861의 DNA 서열을 E.coli, 효모, 곤충 또는 특정 동물세포에, 숙주에서 증폭할 수 있고 상기 단백질을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 이용하여 도입함으로써 다량으로 얻어질 수 있 다.

DDBJ의 BLAST 프로그램을 사용하여 본 발명에 따른 료필럼 쉬메지-유래 단백질의 상동성 검색의 결과로서, 가장 높은 경우에도 전장 아미노산 서열과의 사이에 45% 상동성만이 관찰되었고, 그외의 상동성 서열은 발견되지 않는 것으로 밝혀졌다. 이들 사실에 근거하여 보면, 이 단백질은 신규한 단백질이라고 결론지을 수 있다. 본 발명에 있어서, 이 단백질의 아미노산 서열 및 그를 암호화하는 DNA 서열의 개시의 결과로서, 비슷한 생리적 활성을 가진 단백질을 암호화하는 유전자는 이들 서열 또는 그 일부분을 사용한 유전 공학적 기법(혼성화, PCR 등의 핵산 증폭)을 이용하여 다른 개체 종으로부터 쉽게 분리할 수 있다. 그러한 경우에 있어서, 이러한 유전자에 의하여 코드되는 신규한 단백질 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에 따른 DNA 서열상의 상동성 검색의 결과로서, 극히 짧은 길이(32염기) 내의 단 하나의 서열만이 93% 상동성에 해당하였다.

코리올러스 베르시콜러(Coriolus versicolor)의 피라노즈 옥시다제(pyranose oxidase)가 본 발명의 료필럼 쉬메지-유래 항미생물 단백질과 가장 높은 상동성(전장 아미노산 서열과 45%)을 보인다. 피라노즈 옥시다제는 포도당과 같은 피라노즈를 산화시켜 2-케토(2-keto) 산물 및 과산화수소(hydrogen peroxide)를 만드는 효소이다. 이 효소는 다른 피라노즈의 검정(assay)에도 적용할 수 있다고 보고되어 있다(본 명세서에 참조로서 포함된 일본 특허 공개 번호 205861/96을 참조). 본 발명의 료필럼 쉬메지-유래 항미생물 단백질은 실제 피라노즈 옥시다제 활성을 갖고, 포도당 등에 대한 Km 값은 낮으면서 그 비활성은 극히 높다는 것이 밝혀졌다. 이온 교환칼럼 분획에 있어서의 항미생물 활성의 강도는 상기 피라노즈 옥시다제 활성의 강도로부터 예상된 바 대로이다. 그러므로, 본 발명에서 발견된 료필럼 쉬메지-유래 항미생물 단백질의 항미생물 활성은 피라노즈 옥시다제와 관련된다고 추정된다. 본 발명의 항미생물 활성의 기능적 기작의 관점에 있어서, 하나의 이론은 검정 배지(assay medium)에 포함된 포도당의 산화 과정에서 이 효소에 의하여 형성된 과산화수소는 병원성 미생물에 해로운 영향을 미친다는 것이나, 반드시 이 이론에 한정하고자 하는 의도는 아니다.

본 발명에 따른 상기 단백질은 암모늄 설페이트 침전, 이온 교환 크로마토그래피(MonoQ, A Sepharose, DEAE 등) 등과 같은 단백질 정제 및 분리에 사용되는 일반적인 과정을 적절히 조합함으로써 정제 및 분리될 수 있다.

하기한 실시예에서와 같이, 예를 드면, 료필럼 쉬메지는 갈아서 버퍼로 추출될 수 있다. 상기 추출물을 여과한 후, 암모늄 설페이트를 상징액에 첨가하여 적절한 농도(예를 들면, 75% 포화)로 맞추고, 상기 혼합물은 방치하여 둔다. 위와 같이 본 발명에 따른 단백질을 포함하는 침전물이 얻어질 수 있다. 상기 침전물은 투석되고 이온교환 크로마토그래피를 거치고 염농도 구배(예를 들면, 50mM에서 1M의 소듐 클로라이드)로 용출하여, 상기 원하는 단백질을 포함하는 분획을 회수한다.

본 발명은 본 발명의 상기 항미생물 단백질을 암호화하는 유전자를 추가로 제공한다. 유전자의 형태는 제한이 없다. 즉, 자연 유래의 DNA, 재조합 DNA, 화학적으로 합성된 DNA 어느 것이나 될 수 있다. 상기 유전자는 게놈 DNA 또는 cDNA 클론일 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 상기 유전자는 서열목록의 서열번호1의 염기 서열을 갖는다. 그러나, 서열번호1은 본 발명의 단지 하나의 실시예인 하기의 실시예에서 얻어진 한 클론의 염기서열이다. 천연 유전자는 그것을 생산하는 개체의 다양성에 있어서의 차이 또는 에코타입(ecotype)에 있어서의 차이에 의하여 야기되는 적은 수의 돌연변이 또는 아주 비슷한 동위효소(isozyme)의 존재에 의하여 야기되는 소수의 돌연변이를 수반한다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 상기 유전자는 서열목록의 서열번호1의 염기서열을 갖는 상기 유전자에 한정되는 것만은 아니고 본 발명의 상기 항미생물 단백질을 암호화하는 어떠한 유전자도 포함될 수 있다.

본 발명에서의 이 단백질의 아미노산 서열 및 그를 암호화하는 DNA 서열의 개시의 결과로서, 비슷한 생리적 활성을 가진 단백질을 암호화하는 유전자는, 이들 서열 또는 그 일부분을 사용한 유전 공학적 기법(혼성화, 핵산 증폭 등)을 이용하여 다른 개체 종으로부터 쉽게 분리할 수 있다. 그러한 경우에 있어서, 그 결과 얻어진 유전자는 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

상동성 유전자의 탐색은 어떠한 제한 없이 임의의 조건하에서 실행될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건(예를 들면, 6xSSC, 5x Denhardt's, 0.1% SDS, 25℃에서 68℃)을 채용하는 것이 바람직하다. 상기 혼성화 온도는 바람직하기로는 45℃에서 68℃(포름아미드가 없는 경우) 또는 25℃에서 50℃(50% 포름아미드를 포함하는 경우)의 범위이다. 특정 수준이상의 상동성을 가진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA는 혼성화 조건(포름아미드 농도, 염 농도, 온도 등)을 적절히 설정함으로써 클 론될 수 있다는 것은 당업자에게 잘 알려진 사실이다. 위와 같이 클론된 상동성 유전자는 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 핵산 증폭 반응의 예들에는 중합효소 연쇄 반응(PCR)(Saiki 등, 1985, Science 230, pp. 1350∼1354), 리가제 연쇄 반응(LCR)(Woh 등, 1989, Genomics 4, pp. 560∼569; Baringer 등, 1990, Gene 89, pp. 117∼122; 및 Baranny 등, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, pp. 189∼193) 및 전사에 근거한 증폭(Kwoh 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, pp. 1173∼1177)과 같은 온도 순환과 가닥 치환 증폭(strand displacement amplication)(SDA)(Walker 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, pp. 392∼396; 및 Walker 등, 1992, Nuc. Acids. Res. 20. pp. 1691∼1696), 자발 유지 서열 복제(self-sustained sequence replication)(3SR)(Guatelli 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, pp. 1874∼1878) 및 Qβ복제효소 시스템(Qβreplicase system)(Lizardi 등, 1988, BioTechnology 6, pp. 1197∼1202)과 같은 등온 반응을 이용하여 수행되는 반응이 포함된다. 더욱이, 유럽 특허 번호 0525882등에 보고된 바와 같은 목표 핵산과 돌연변이 서열의 경쟁적 증폭에 근거한 핵산 서열에 근거한 증폭(nucleic acid sequence based amplication(NASBA)의 용도로 사용될 수도 있다. 그를 위하여 PCR 법을 사용하는 것이 바람직하다.

상기한 혼성화, 핵산 증폭 등을 사용하여 클론된 그러한 상동성 유전자는 서열목록의 서열번호1의 염기서열과 적어도 50%이상, 바람직하기로는 60%이상, 더욱 바람직하기로는 70%이상, 더욱 바람직하기로는 80%이상, 특히 바람직하기로는 90% 이상 및 가장 바람직하기로는 95%이상의 상동성을 갖는다.

본 발명은 다음 단계를 포함하여 이루어지는 공정에 의하여 만들어진 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji)로부터 유래된 항미생물 단백질을 얻기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다:

서열목록의 서열번호1의 항미생물 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 염기서열로부터 다음의 요건을 충족시키는 두 도메인을 선택하는 단계:

1) 15에서 30염기로 구성되는 각 도메인; 및

2) 40%에서 60%의 G+C 함량을 갖는 각 도메인;

이들 도메인의 염기서열과 동일하거나 그들에 상보적인 염기서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 준비하는 단계, 또는 단일 가닥 DNA들에 의하여 암호화되는 아미노산 잔기들이 변화되지 않도록 하는 유전적 코드에 있어서 다의성(degeneracy)을 갖는 단일가닥 DNA 혼합물을 준비하는 단계; 및 상기 항미생물 단백질을 암호화하는 유전자의 염기서열에의 결합 특이성에 해를 입히지 않으면서 단일 가닥 DNA를 선택적으로 변형시키는 단계. 본 발명에 따른 상기 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 상기 유전자를 검출하거나 분리하기 위한 혼성화에 사용될 수 있다. PCR과 같은 증폭 반응에 프라이머로서 이들 올리고뉴클레오티드의 적절한 쌍을 사용하는 것도 또한 가능하다.

본 발명에 따른 상기 올리고뉴클레오티드는 서열목록의 서열번호8에서 12의 어느 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열은 각 단백질을 암호화하는 유전자 단편을 클로닝하기 위하여 PCR 프라이머로서 설계된다. 이들 프 라이머들은 함께 혼합된 해당 아미노산을 암호화하는 모든 잠재적 염기들을 포함한다.

본 발명에 따른 상기 유전자의 단편은 주형으로서 료필럼 쉬메지 과실체 cDNA 라이브러리 및 상기의 적절한 조합을 사용하여 핵산 증폭 반응(PCR 등)을 수행함으로써 증폭되거나 분리될 수 있다. 전장 cDNA 클론은 예를 들면, 플라크 혼성화(plaque hybridization)에 의한 프로브로서 위와 같이 얻어진 증폭 산물을 사용하여 cDNA 라이브러리를 추가로 탐색함으로써 분리될 수 있다. 핵산 증폭 과정 및 조건, 플라크 혼성화 조건등은 당업자에게 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 상기 유전자의 단편은 예를 들면, Sambrook 등(Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53(1989))이 보고한 방법에 따라서 플라스미드와 같은 벡터내에 도입될 수 있다. 더욱 간편하게는, 상업적으로 구입가능한 라이게이션 키트(ligation kit)(예를 들면, Takara Shuzo co., Ltd. 제품)를 사용할 수도 있다. 위와 같이 얻어진 재조합 벡터(예를 들면, 재조합 플라스미드)는 숙주세포(예를 들면, E-coli TB1, LE392 또는 XL-1Blue) 내로 도입시킨다.

플라스미드를 상기 숙주세포내로 도입시키는 방법의 예들에는 Sambrook J.등(Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74(1989))에 보고된 바와 같은, 칼슘 포스페이트법, 칼슘 클로라이드/루비듐 클로라이드법, 전기천공법, 전기주입법, PEG 등의 화학물질로의 처리 및 유전자 총(gene shotgun)을 사용하는 방법이 포함된다.

편리하게는, 상기 벡터는 원하는 유전자를 당업계에서 구입할 수 있는 재조합 벡터(예를 들면, 플라스미드 DNA)에 연결하여 제조될 수 있다. 본 명세서에 사용될 수 있는 벡터의 구체적인 예들에는 pBluescript, pUC18, pUC19 및 pBR322와 같이, E,coli로부터 유래한 플라스미드가 포함되나, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.

발현 벡터는 상기 원하는 단백질을 생산하는 데에 특히 유용하다. 상기 발현 벡터는 다양한 원핵 및/또는 진핵 숙주세포에서 상기 원하는 유전자를 발현하여 상기 원하는 단백질을 생산하는 기능을 갖는 한, 특별한 형태에 한정되는 것은 아니다. 상기 벡터의 바람직한 예들에는 pQE-30, pQE-60, pMAL-C2, pMAL-p2, pSE420 등과 같은, E.coli용 발현 벡터가 포함된다. 효모용 발현 벡터로서는, pYES2(사카로마이세스(Saccharomyces)속) 및 pPIC3.5K, pPIC9K 및 pAO815(피치아(Pichia)속)가 바람직하다. 곤충용 발현 벡터로서는, pBacPAK8/9, pBK283, pVL1392, pBlueBac4.5 등이 바람직하다.

형질전환체는 원하는 발현 벡터를 숙주세포 내로 도입시킴으로써 제조될 수 있다. 사용되어질 상기 숙주세포는, 본 발명에 따른 발현 벡터와 양립(compatible)할 수 있어 형질전환될 수 있는 한 특별하게 한정되는 것은 아니다. 즉, 자연의 세포 및 인공적으로 확립한 재조합 세포를 포함하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 세포들이 사용될 수 있다. 그 예들에는 박테리아(Escherichia 및 Bacillus 속 등에 속하는 것들), 효모(Saccharomyces 및 Pichia 속 등에 속하는 것들), 동물 세포, 곤충세포 및 식물세포가 포함된다.

상기 숙주세포로서는, E.coli, 효모 또는 곤충세포를 사용하는 것이 바람직하다. 그 구체적인 예들에는 E.coli 스트레인(M15, JM109, BL21 등), 효모(INVSc1(사카로마이세스), GS115 및 KM71(각각 피치아) 등) 및 곤충세포(BmN4, 누에 유충 등)가 포함된다. 동물세포의 예들에는 쥐, 아프리카산 발톱개구리(Xenopus), 래트, 햄스터, 원숭이, 인간으로부터 유래한 세포 및 상기 세포로부터 확립된 배양된 세포주가 포함된다. 상기 식물 세포에는, 배양될 수 있는 한 특별하게 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 담배, 애기장대(Arabidopsis), 벼, 옥수수 및 밀로부터 유래한 세포가 포함된다.

상기 숙주세포로서 박테리아(예를 들면, E.coli)를 사용하는 경우, 발현 벡터는 일반적으로 적어도 프로모터/작동자(operator) 도메인, 개시 코돈, 원하는 항미생물 단백질을 암호화하는 유전자, 종결 코돈, 터미네이터 및 복제단위(replicable unit)를 포함하여 구성된다.

상기 숙주세포로서 효모, 식물세포, 동물세포 또는 곤충세포를 사용하는 경우, 발현 벡터는 일반적으로 적어도 프로모터, 개시 코돈, 원하는 항미생물 단백질을 암호화하는 유전자, 종결 코돈 및 터미네이터를 포함하는 것이 바람직하다. 더욱이, 신호 펩티드를 암호화하는 DNA, 인핸서 서열, 원하는 유전자의 5′ 및 3 ′쪽의 비번역 도메인, 선발 마커 도메인, 복제단위 등을 선택적으로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 벡터에 있어서 상기 개시 코돈의 적절한 예는 메티오닌 코돈(ATG)이다. 종결 코돈의 예들에는 TAG, TGA 및 TAA와 같은 통상적으로 채용되는 것들이 포함된다.

본 명세서에 사용된 "복제 단위"라는 용어는 숙주세포에서 그 전체 DNA를 복제할 수 있는 DNA를 의미한다. 그 예들에는 자연의 플라스미드, 인공적으로 변형된 플라스미드(즉, 자연의 플라스미드로부터 제조된 플라스미드) 및 합성 플라스미드가 포함된다. 상기 플라스미드의 적절한 예들에는, E.coli의 경우 플라스미드 pQE30, pET, pCAL 또는 그들의 인공적으로 변형된 것들(예를 들면, pQE30, pET 또는 pCAL를 적절한 제한효소로 처리하여 얻어지는 DNA 단편); 효모의 경우 플라스미드 pYES2 및 pPIC9K; 및 곤충 세포의 경우 플라스미드 pBacPAK8/9 등이 포함된다.

상기 인핸서 서열 및 상기 터미네이터 서열로서, 당업자들에 의하여 통상적으로 사용되는 것들, 예를 들면 SV40으로부터 유래된 서열이 사용될 수 있다.

상기 선발 마커로서, 통상적인 방법을 사용하여 당업계에서 통상적으로 채용되는 것들을 사용할 수 있다. 그 예들에는 항생제 저항성 유전자(테트라사이클린, 앰피실린, 카나마이신, 네오마이신, 하이그로마이신, 스펙티노마이신 등)가 포함된다.

상기 발현 벡터는 적어도 상기한 프로모터, 개시 코돈, 상기 원하는 항미생물 단백질을 암호화하는 상기 유전자, 종결 코돈 및 터미네이터 도메인을, 연속적이고 반복적으로(cyclically) 적절한 반복단위에 연결시킴으로써 제조될 수 있다. 이 공정에 있어서, 제한 효소에 의한 절단 또는 바람직하다면, T4DNA 리가제를 사용한 연결과 같은 통상적인 방법에 의하여 적절한 DNA 단편(예를 들면, 링커, 다른 제한 효소 사이트 등)을 사용하는 것도 또한 가능하다.

본 발명에 따른 상기 발현 벡터는 공개적으로 알려진 방법에 의하여 숙주세포로 도입(즉, 형질전환(transformation)(형질도입(transduction))될 수 있다.

즉, 상기 형질전환은 예를 들면, 박테리아(E.coli, Bacillus subtilis 등)의 경우 Cohen 등(Proc. Natl. Acad. Sci USA, 69, 2110(1972))에 의하여 보고된 방법, 프로토플라스트법(Mol. Gen. Genet., 168, 111(1979)) 또는 competent 법(J. Mol. Biol., 56, 209(1971)); 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우 Hinnens 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1927(1978)) 및 리튬 법(J. Bacteriol., 153, 163(1988)); 식물세포의 경우 잎 디스크 법(leaf disc method)(Science, 227, 129(1985)) 및 전기 천공법(Nature, 319, 791(1986)); 동물세포의 경우 Graham에 의하여 보고된 방법(Virology, 52, 456(1973)); 곤충 세포의 경우 Summers 등에 의하여 보고된 방법(Mol. Cell. Biol., 3, pp. 2156∼2165(1983))에 의하여 수행될 수 있다.

식물 형질전환용 벡터는 본 발명에 따른 DNA 단편을 사용하여 질병에 대한 저항성을 갖는 식물을 제조하는 데에 유용하다. 식물용 벡터는 해당 유전자를 발현하여 상기 원하는 단백질을 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 그들의 예들에는, pBI1221 및 pBI121(Clontech, Co., Ltd) 및 그들로부터 파생된 벡터들이 포함된다. 더욱이, 특별히 단자옆식물(monocotyledons)을 형질전환시키기 위하여는 예를 들면, pIG121Hm, pTOK233(Hiei 등, Plant J., 6, pp. 271∼282(1994)), pSB424(Komari 등, Plant J., 10, pp. 165∼174(1996)) 등이 사용될 수 있다.

형질전환 식물은 상기 벡터에 있는 β-글루쿠로니다제(GUS) 유전자 부위를 본 발명에 따른 DNA 단편으로 치환하여 형질전환 식물용 벡터를 제조하고, 그 후 상기 벡터를 식물에 도입함으로써 제조될 수 있다. 바람직하기로는, 형질전환 식물용 상기 벡터는 적어도 프로모터, 개시 코돈, 원하는 유전자(본 발명의 DNA 서열 또는 그 일부분), 종결 코돈 및 터미네이터를 포함한다. 더욱이, 신호 펩티드를 암호화하는 DNA, 인핸서 서열, 상기 원하는 유전자의 5′및 3′쪽의 비번역 도메인, 선발 마커 도메인 등을 선택적으로 포함할 수 있다.

상기 프로모터 및 상기 터미네이터는 식물세포에서 기능을 발휘할 수 있는 한, 특별히 제한되는 것은 아니다. 체제적 발현(constitutive expression)을 할 수 있게 하는 프로모터의 예들에는, 액틴 유비퀴틴 유전자 프로모터뿐만 아니라 상기한 벡터에 도입된 35S 프로모터도 포함된다. 그러나, 더욱 바람직하게는, 유도성 프로모터가 도입되는 것이다. 유도성 유전자를 사용함으로써, 상기 원하는 단백질은 형질전환 식물이 해충(pests)과 접촉하고, 그후 식물체가 면역성을 취득한 후에만 생산된다. 그를 위하여 사용될 수 있는 유도성 프로모터의 예들에는, 페닐알라닌 암모니아-리아제(lyase), 키티나제(chitinase), 글루카나제, 티오닌(thionine) 및 오스모신(osmosin) 유전자의 프로모터 및 다른 해충 또는 스트레스에 반응하는 유전자의 프로모터들이 포함된다.

식물세포로 도입되는 상기 유전자는 아그로박테리움을 사용하는 방법(Horsch 등, Science, 227, 129(1985)); Hiei 등, Plant J., 6, pp. 271∼282(1994)); 전기 천공법(Fromm 등, Nature, 319, 791(1986)), PEG 법(Paszkowski 등, EMBO J., 3, 2717(1984)), 미세주입법(microinjection method)(Crossway 등, Mol. Gen. Genet., 202, 179(1986)), 미세충돌법(microcollision method)(McCabe 등, Bio/Technology, 6, 923(1988)) 등에 의하여 수행될 수 있다. 원하는 식물 내에 상기 유전자를 도입할 수 있는 한, 임의의 방법이 그를 위하여 제한 없이 사용될 수 있다. 비슷하게, 상기 숙주식물은 본 발명에 따른 형질전환 식물용 벡터와 양립할 수 있고(compatible), 따라서 형질전환될 수 있는 한, 특정한 종에 제한되지 않는다. 즉, 당업계에서 통상적으로 사용되는 식물들 예를 들면, 양자엽식물(dicotyledons)(예를 들면, 담배, 애기장대, 토마토, 오이, 당근, 콩, 감자, 무우, 순무(turnip), 배추(chinese cabbage), 평지(rape plant), 면, 페튜니아 등) 및 단자옆식물(monocotyledons(예를 들면, 벼, 옥수수, 밀 등)이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 항미생물 단백질은 아주 강력한 항미생물 활성을 나타낸다. 예를 들면, 5ng/ml의 아주 낮은 농도에서도 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae)의 발아를 완전히 억제한다(하기 실시예2 참조). 이 농도에서의 장기간의 배양 후에는 어떠한 포자의 발아도 관찰되지 않았으며, 이는 본 발명의 상기 단백질은 피리쿨라리아 오리자의 성장을 부분적으로 저해하는 것이 아니라, 그에 대하여 항미생물 활성을 발휘하는 것을 의미한다. 본 발명자들이 아는 한, 지금까지 그러한 낮은 농도에서(예를 들면, 나노그램 단위) 병원성 미생물의 성장을 완전히 저해할 수 있는 항미생물 단백질은 보고된 바가 없었다. 하기의 실시예에 있어서, 벼의 두가지 주요한 병해를 야기하는 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)가 상기 항미생물 단백질을 정제하기 위한 항미생물 검정(antimicrobial assay)에 사용되었다. 그러나, 본 발명에 의하여 확인된 료필럼 쉬메지 항미생물 단백질은 또한 다른 식물 병에 대하여도 비교될 수 있는 수준으로 항미생물 효과를 발휘할 수 있을 것이라는 것은 극히 가능성이 높다. 상기한 그의 강력한 항미생물 효과에 근거하여, 료필럼 쉬메지로부터 유래한 본 발명의 상기 항미생물 단백질은 항미생물제 및 살충제(pesticides)를 포함한 약제(pharmaceuticals)와 같이, 활성 상태로 그것을 포함하는 제제용으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 사용되는 경우, 상기 단백질은 상기 DNA를 상기한 바 대로, E.coli, 효모 등에서 기능할 수 있는 발현 벡터에 도입함으로써 다량으로 생산될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 단백질은 영양 배지에서 상기한 바와 같이 제조된 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환세포를 배양함으로써 발현(생산)될 수 있다. 상기 영양 배지는 숙주세포(형질전환체)의 성장에 필요한 탄소원, 무기 질소원 또는 유기 질소원을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 탄소원의 예들에는 포도당, 덱스트란, 가용성 녹말, 설탕, 메탄올 등이 포함된다. 상기 무기 질소원 또는 유기 질소원의 예들에는 암모늄 염, 질산(nitric acid) 염, 아미노산, 콘스팁리쿼(corn steep liquor), 펩톤, 카제인(casein), 미트 추출물(meat extract), 콩 케이크(soybean cake), 감자 추출물(potato extract)등이 포함된다. 바람직하다면, 무기염(소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소듐 디하이드라이드포스페이트, 마그네슘 클로라이드 등), 비타민 및 항생제(테트라사이클린, 네오마이신, 앰피실린, 카나마이신 등)와 같은 다른 영양분을 더 포함할 수 있다. 배양은 당업계에서 알려진 방법에 의하여 수행된다. 상기 배양 조건(예를 들면, 온도, 배지의 pH, 배양시간)은 본 발명에 따른 상기 단백질을 대량으로 생산하기 위하여 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 실시예4에 있어서, 예를 들면 본 발명의 재조합 항미생물 단백질은 상기 숙주세포로서 E.coli(M15)를 사용하여 발현될 수 있다. E.coli에서 발현하는 경우, 배양은 4℃에서 40℃에서 수행되고, 상기 재조합 단백질의 발현은 0.01mM에서 5.0mM의 IPTG에 의하여 유도되는 것이 바람직하나, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 단백질은 다음과 같은 방법으로 상기 배양으로부터의 배양액으로부터 회수될 수 있다. 본 발명의 상기 단백질이 상기 숙주세포에 축적되는 경우, 상기 숙주세포는 예를 들면, 원심 또는 여과 및 그 후 적절한 버퍼(예를 들면, 약 100mM에서 10M의 농도로 버퍼마다 다르나, 바람직하기로는 5.0에서 9.0범위인 pH 값을 가진 트리스 버퍼, 포스페이트 버퍼, HEPES 버퍼 또는 MES 버퍼)에 부유하여 수집된다. 그 후 상기 세포는 채용된 숙주세포에 적절한 방법에 의하여 파괴되고, 숙주세포의 내용물은 원심에 의하여 얻어진다. 본 발명의 단백질이 숙주세포로부터 분비되는 경우, 상기 숙주세포는 예들 들면, 원심 또는 여과에 의하여 배양액 여과액을 만드는 것에 의하여 배지로부터 분리된다. 상기 파괴된 세포의 부유액 또는 배양액 여과액은 선택적으로 암모늄 설페이트 침전을 거쳐 투석되고, 그 후 본 발명의 상기 단백질의 정제 및 분리를 거치게 된다.

정제 및 분리는 다음 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 단백질이 6x 히 스티딘, GST, 말토스 결합 단백질 등으로 꼬리표가 붙어 있는 경우, 채용된 각 꼬리표(tag)에 적절한 친화성 크로마토그래피법을 사용할 수 있다. 하기한 실시예4에서, N 말단에 6x히스티딘으로 꼬리표가 붙여진 재조합 항미생물 단백질이 발현되었으나, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 이 재조합 단백질은 6x히스티딘에 대하여 친화성을 가진 Ni-NTA 아가로즈(Qiagen에 의하여 제조됨)를 사용하여 정제되었다. 한편, 어떤 꼬리표 없이 본 발명의 상기 단백질을 생산하는 경우, 하기 실시예들에 기술되는 바와 같은 이온교환 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 이들 방법들을 또한 겔여과, 소수성 크로마토그래피, 등전(isoelectric) 크로마토그래피 등과 조합할 수도 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 상기 항미생물 단백질은 예를 들면, 곰팡이 또는 박테리아가 인자인 식물 질병을 예방 또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 활성 인자로서 본 발명의 상기 항미생물 단백질을 포함하는 항미생물제(antimicrobial agent)를 제공한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 상기 항미생물제는 전체 식물 또는 그 일부분에 적용될 수 있다.

상기 적용량(application dose)은 식물의 형태, 성장 단계, 조건, 적용 방법, 치료시간, 적용된 단백질의 형태(예를 들면, 전장 단백질 또는 그것으로부터 그 일부분의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의하여 파생된 단백질 중 하나), 성장 위치에서의 기후, 성장 위치에서의 토양 등에 따라 변한다. 하루에 한 번이상 적용될 수 있다. 상기 적용량은 다양한 인자에 의존하여 변한다. 필요하다면, 본 발명에 따른 상기 항미생물제를 용액, 서스펜션(suspension), 에멀션 등과의 혼합 물로서 적용하는 것도 또한 가능하다. 수성 또는 비수성 용액 또는 서스펜션은 적어도 하나의 불활성 희석제(diluent)와 함께 하나 이상의 활성 물질을 포함한다. 수성 희석제의 예들에는 증류수 및 염수(saline)가 포함된다. 비수성 희석제의 예들에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유 및 에탄올과 같은 알콜류가 포함된다.

이들 항미생물 조성에는 보존제, 습윤제(humectant), 에멀션화제(emulsifier), 분산제(dispersant) 또는 안정화제(stabilizer)(아르기닌, 아스파틱산 등)를 더 포함할 수 있다.

이들 조성물들은 필요하다면, 예를 들면 상기 조성물들을 박테리아방지 필러(bacteriostatic filer)를 통한 여과, 살균제(bactericide)를 첨가하거나 조사에 의하여 멸균될 수 있다. 예를 들면, 냉동건조에 의하여 멸균된 고체 조성물을 준비하고, 그 후 사용 전에 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용하는 것이 또한 가능하다.

위와 같이 얻어진 항미생물제의 투약 형태는 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 즉, 상기한 첨가제들과 혼합될 수 있으며, 그 후 정제(tablet), 알약(pill), 분말(dust), 과립(granule), 용액, 에멀션 등의 형태로 적용될 수 있다.

본 발명을 이하의 실시예들을 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들에 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예1 : 검정 시스템의 구축

1) 시험 시스템의 확립

병원성 곰팡이의 배양 : 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae)(TUS-1 스트레인, race 337, Tohoku National Agricultural Experiment Station, 농림수산부로부터 분양받음)를 코니디아를 발생시키기 위하여 귀리(oatmeal) 배지(Difco Co. Ltd., 1% 설탕으로 보충됨)에서 배양하였다. 10%의 글리세롤을 첨가한 후, 상기 코니디움(conidium) 현탁액은 -80℃에 보관하였다.

리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)(JT872 스트레인)는 2일 동안 1/2 감자-덱스트로즈 브로스(PD broth, Difco Co. Ltd.)에서 배양되었다. 3개 균사(hypha) 덩어리(약 5x5mm)를 Teflon 호모게나이저를 이용하여 1/2 PD 배지와 함께 살짝 가라앉히고, 위와 같이 얻어진 상기 분획된 균사는 접종원으로 채택되었다.

상기한 접종원은 각각 96웰 마이크로타이터 플레이트(Corning Co. Ltd.)에 첨가되었다. 상기 피리쿨라리아 오리자 코니디아는 웰 당 약 1,000의 밀도로 첨가되었고, 반면에 리조크토니아 솔라니 균사는 약 1/2 PD 배지 100㎕와 함께 웰 당 약 300의 밀도로 첨가되었다. 그 후 이들 접종원은 28℃로 항온기(thermostat)에서 배양되었다. 상기 곰팡이의 성장은 마이크로플레이트 판독기(Benchmark, Bio-Rad Co. Ltd.)를 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정함으로써 모니터되었다.

염과 버퍼의 영향 : 곰팡이의 성장에 미치는 염과 버퍼의 영향은 일정한 양 의 NaCl, 포스페이트 버퍼, 트리스 버퍼, Hepes 버퍼, 우혈청 알부민(bovine serum albumin), 디티오트레이톨(dithiothreitol) 등을 배지에 첨가함으로써 결정되었다.

2) 료필럼 쉬메지 유래의 단백질의 추출물

10g의 료필럼 쉬메지(일본에서 제조되고, Shiga Forest Research Center로부터 얻음)는 가위로 예비적으로 작은 조각으로 자르고, 액체 질소를 사용하여 냉동하고 모타르에서 갈아 작은 낱알모양으로 만들었다. 그 후 상기 낱알들은 30ml의 50mM Hepes 버퍼로 30분 동안 추출되었다. 상기 추출물은 Miracloth를 통하여 여과되었고, 그 후 10,000xg로 20분 동안 원심되었다. 그 후 암모늄 설페이트를 상기 상징액에 첨가하여 75% 포화되게 하였고, 상기 혼합물은 4℃에서 밤새 동안 방치하였다. 15,000xg에서 20분 동안 다시 원심한 후, 상기 침전물은 3ml의 10mM Hepes 버퍼(pH 7.5)에 용해시키고 투석 튜브(Spectra/Por1 MWC06-8000, Spectrum Medical Industries Co. Ltd.) 또는 벤조일레이티드 튜석 튜브(SIGMA Co. Ltd.)를 사용하여 10mM Hepes 버퍼(pH 7.5)에 대하여 투석하였다. 원심으로 상기 불용성 물질을 제거한 후, 료필럼 쉬메지 단백질 시료가 얻어졌다. 상기 료필럼 쉬메지 단백질 시료의 단백질 농도는 표준 단백질로서 우혈청 알부민(BSA)을 사용한 브래드포드 법(Bradford method)에 의하여 측정되었다.

실시예2 : 항미생물 단백질의 정제

조(crude)료필럼 쉬메지 단백질 시료의 항미생물 활성

피리쿨라리아 오리자 및 리조크토니아 솔라니의 배양을 시작한 직후, 일정량의 조료필럼 쉬메지 단백질 시료를 배양시스템에 첨가하였다. 그 후 2일의 시간 경과에 대한 흡광도 변화를 모니터한 후, 상기 항미생물 활성의 존부를 결정하였다. 상기 단백질 시료는 상기 항미생물 활성에 관한 희석 한계를 결정하기 위하여 연속희석되었다. 그 결과, 높은 항미생물 활성이 피리쿨라리아 오리자 및 리조크토니아 솔라니 모두에서 발견되었다(표 1).

표1 : 조 료필럼 쉬메지 추출물의 항미생물 활성

버섯	추출시의 pH	완전한 성장 저해 농도(ug/ml)
L. shimeji	7.5	P.oryzae	R.solani
		30	30

피리쿨라리아 오리자에 대한 완전한 성장 저해에 필요한 료필럼 쉬메지 유래의 상기 단백질 추출물의 농도는 대략 30㎍이하의 총 추출된 단백질/ml로서 추정된다. 따라서, 상기 료필럼 쉬메지 추출물은 높은 항미생물 활성을 가진 물질을 포함하고 있다는 것은 명확하게 되었다. 이 단백질 추출물의 상기 곰팡이에 대한 성장 저해 방식에 관하여, 발아의 완전한 저해는 높은 농도에서 관찰되었고, 균사 성장의 저해는 낮은 농도에서 관찰되었다. 균사 신장의 저해 수준은 분명하게 사용된 농도에 의존하였다. 피리쿨라리아 오리자 세포에 있어서, 세포질은 세포벽으로 부터 분리되어 원형질분리(plasmolysis)와 유사한 상태를 보였다.

2) 이온교환 크로마토그래피에 의한 정제

다음으로, 상기 항미생물 단백질은 정제되었다. 70g의 료필럼 쉬메지를 액체질소 중에서 갈아서, 200ml의 버퍼(50mM MES, 50mM NaCl, pH6.0)로 30분 동안 단백질을 추출하였다. 두번 접은 Miracloth를 통하여 여과한 후, 상기 여과액은 15,000xg로 20분 동안 원심하여 분순물을 침전시켰다. 상징액은 여과지를 통하여 더 여과하여 단백질 시료를 얻었다. 200ml의 상기 단백질 시료를 이온교환기 Q- Sepharose FF(Pharmacia Co. Ltd.)로 채워진 칼럼(내경 1.1cm, 높이 20cm)에 부었다. 유속을 2.5ml/min로 맞추고, 기본 버퍼로 50mM Mes(pH 6.0), 50 mM NaCl 및 용출 버퍼로서 50mM Mes(pH 6.0), 1M NaCl을 사용하였다. 시료를 로딩한 후 100분에서 120분 사이에 50mM에서 1M의 NaCl 구배를 적용하였다. 뒤이어, 상기 용출 버퍼를 40분 동안 더 통과시켰다. 분획은 구배 적용 후 4번 수집되었다(100ml/분획). 이들 4개 분획들(I, II, III, VI)은 연속 희석되었고, 그 후 피리쿨라리아 오리자에 대한 항미생물 검정이 행하여졌다. 그 결과, 상기 분획 II에서 IV가 항미생물 활성을 보였다. 이들 분획들은 병원성 곰팡이 세포의 원형질 분리를 야기시켰다. 가장 강한 활성을 보인 상기 분획II(0에서 333mM NaCl에 해당)는 Centriprep(Amicon Co. Ldt., MWCO 10,000)으로 농축되었고, 이온교환 칼럼 Mono QHR 5/5(Pharmacia Co. Ltd.)에 부어 상기 항미생물 단백질을 부분적으로 정제하였다. 유속을 1ml/min으로 맞추고, 기본 버퍼로 50mM Mes(pH 6.0) 및 50mM NaCl을, 용출 버퍼로 50mM Mes(pH 6.0), 1M NaCl을 사용하였다. 시료를 로딩한 후 20분에서 40분에 50mM에서 1M까지의 NaCl 구배를 적용하였다. 각 분획의 일부분(1ml)은 피리쿨라리아 오리자에 대한 항미생물 검정 및 SDS-PAGE 전기영동을 행하였다. 도 1은 HPLC 차트와 상기 항미생물 활성의 강도의 관계를 나타낸다. 각각의 MonoQ 분획으로부터 5, 1 및 0.2㎕ 분액을 수집하고 피리쿨라리아 오리자에 대한 항미생물 검정을 행함으로써 측정되는, 상기 항미생물 활성은 4단계, 즉 +++(0.2㎕에서 저해), ++(1㎕에서 저해), +(5㎕에서 저해) 및 -(5㎕에서도 저해하지 않음)로 나타내었다. 상기 단백질이 A₂₈₀ 및 피리쿨라리아 오리자에 대한 항미생물 활성의 강도에 근거하여 모니터될 때, 상기 항미생물 단백질의 용출 피크는 pH 6.0에서 250mM의 이온강도(NaCl 농도) 주위에서 나타났다. 뒤이어, 단위 용출액 당 상기 단백질의 항미생물 활성은 이온 강도가 높아짐에 따라 점차로 낮아졌다.

다음으로, 각 분획으로부터 10㎕의 분액(aliquot)에 동량의 2xSDS 전기영동 버퍼(Sambrook 등, 1989)를 첨가하였다. 95℃에서 5분 동안 처리 한 후, SDS-PAGE 전기영동은 Laemmli의 방법(1970)에 따라 행하였다. 겔로서, 15% PAGEL(ATTO Co. Ltd.)가 사용되었고 상기 단백질은 은 염색 II 키트 와코(silver-staining II Kit Wako)(Wako Pure Chmeical Industries, Ltd.)를 사용하여 검출하였다. 분자량과 단백질의 양을 대략적으로 추정하기 위하여, 분자량 마커(LMW, Pharmacia LKB Co. Ltd.에 의해 제조됨, 94kDa, 67kDa, 43kDa, 30kDa, 20.1kDa 및 14.4kDa, 큰 크기 부터 작은 크기로 내려가는 순서임)는 단일 밴드가 20ng을 나타내도록 전기영동되었다. 도 2는 전기영동 양상과 항미생물 활성의 강도의 관계를 나타낸다. 상기 레인의 상단에 주어진 번호는 각각 도 1의 분획 번호에 해당한다. 항미생물 활성의 강도는 도 1에서 보인 바와 같다. 집중적인 연구에 의하면 약 70kDa 및 약 65kDa의 두개의 밴드가 항미생물 활성에 관계되는 상기 단백질의 후보인 것으로 생각된다(도 2에서의 화살표). 이 두밴드의 농도는 항미생물 활성 수준과 양성적으로 상관되기 때문에, 이들 두개의 밴드는 그 자체가 상기 항미생물 단백질에 해당하는 것이 확실한 것으로 제안되었다. 이들 밴드 중, 65kDa 밴드는 Q-Sepharose 분획 및 MonoQ 분획에 있어서 모두 단백질 밴드 밀도 및 항미생물 활성과 분명한 연관(link)을 보였다. 분자량 마커(67kDa의 알부민)와 비교하여, 상기 항미생물 단백질의 양은 덴시토미터(densitometer)로 추정하였고, 그 후 피리쿨라리아 오리자에 대한 완전한 성장 저해에 필요한 농도는 약 5ng/ml로 계산되었다.

3) 상기 항미생물 단백질의 N 말단 아미노산의 결정

상기 MonoQ 분획 번호 36에서 44는 Centrifut V-20(Kurabo Industries, Ltd.)로 농축되었고 SDS-PAGE 전기영동을 행하였다. 트리스(Tris)를 제거한 후, 상기 분리된 단백질은 글리신이 없는 버퍼 시스템 내의 PVDF 막(Millipore Co. Ltd.) 상으로 전이되고, 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 약하게 염색되고 탈색되었다. 다음으로, 상기 항미생물 단백질로 여겨지는 70kDa 및 65kDa의 단백질 밴드는 상기 막으로부터 절제되었다. N 말단 아미노산 서열은 기체상 단백질 시퀀서(HPG1005A Protein Sequencing System)를 사용한 에드만법(Edman method)에 의하여 결정되었다.

결과적으로, 65kDa 단백질의 다음과 같은 30 아미노산이 결정되었다.

N′-NAEEGTAVPYVPGYHKKNEIEFQKDIDRFV-C′(서열번호3)

한편, 상기 70kDa 단백질은 서열을 결정할 수 없었다. 그 이유는 상기 단백질은 N′말단이 방해(blocked) 받고 있기 때문인 것으로 여겨진다. 그러므로, 상기 70kDa 단백질은 라이실엔도펩티다제(lysylendopeptidase) 및 V8 프로테아제(protease)를 사용하여 부분적으로 소화시켜 43kDa의 라이실엔도펩티다제 소화 산물과 45kDa의 V8 프로테아제 소화 산물을 만들었다. 이들 부분적으로 소 화된 단백질의 아미노산 서열을 재분석함으로써, 다음의 24잔기 및 29잔기가 각각 전자 및 후자의 단백질로부터 결정되었다.

N′-EFDESIRHTLVLRSLQDAYKDRQR-C′(서열번호4) 및,

N′-AERLIGTSTKEFDESIRHTLVLRSLQDAY-C′(서열번호5).

위와 같이 결정된 상기 아미노산 서열은 데이터 베이스에서 검색되었다. 그 결과, 65kDa 단백질로부터의 30 아미노산 및 70kDa 단백질로부터의 34 아미노산 둘 모두코리올러스 베르시콜러(Coriolus versicolor)의 피라노즈 옥시다제와 상동성을 보였다. 따라서, 각 MonoQ 분획의 피라노즈 옥시다제 활성이 Nishimura 등(1996)의 방법에 따라 측정되었다. 그 결과, 피라노즈 옥시다제 활성은 항미생물 활성 강도로부터 예상될 수 있는 것과 일치하였다. 따라서, 상기 항미생물 활성은 이 효소에 의하여 배지 중의 포도당의 산화 동안 형성되는 과산화수소(hydrogen peroxide)로부터 파생될 수 있는 것으로 추정된다. 다음으로, 65kDa 및 70kDa 단백질 모두를 포함하는 분획들(도 2 번호 42∼44)은 배타적으로 농축되었고, 피라노즈 옥시다제 성질이 분석되었다. 그 결과, 이들 분획들은 아주 높은 피라노즈 옥시다제 활성 및 포도당 및 1,5-안하이드로글루시톨(1,5-anhydroglucitol)에 대하여 낮은 Km 값을 보였다(표 2).

표 2: L.shimeji의 항미생물 단백질의 피라노즈 옥시다제 활성 및 그의 다양한 특성

효소 단백질	Km(mM)		비활성(U/mg)*
	포도당	1,5-anhydroglucitol
L.shimeji	0.50	6.5	10.6

* : 1U = 1μmole H₂O₂/min, pH 7.0, 37℃.

효소 단백질(65kDa + 70kDa)의 양은 SDS-PAGE 은 염색(silver staining)에 의하여 결정되었다.

실시예3 : cDNA의 분리

1) 다의성(degenerate) 프라이머의 디자인

1)에서 결정된 아미노산 서열에 근거하여, 모든 잠재적 염기의 혼합물을 포함하는 프라이머가 합성되었다(Tm : 52℃에서 56℃, 괄호안의 번호는 각각 다의성(degeneracy)의 정도를 나타낸다). 더욱 특정적으로는, 다음의 세 프라이머가 65kDa 단백질로부터 유래한 아미노산 서열(30잔기)로부터 합성되었다:

65R1(5′-gargarggiacigcigticc-3′(4))(서열번호 7);

65R2(5′-garttycaraargayathgaymg-3′(384))(서열번호 8);

및

65R3(5′-ttygtiaaygtiathtgyggigc-3′(24))(서열번호 9).

한편, 다음의 세 프라이머가 70kDa 단백질의 부분적 소화 산물로부터 유래하는 아미노산 서열(34잔기)로부터 합성되었다:

70F1(5′-tgickdatiswytcrtcraaytc-3′(384))(서열번호 10);

70F2(5′-tgickrtcyttrtaigcrtcytg-3′(64))(서열번호 11);

및

70F3(5′-ggigcraadatickytgickrtc-3′(96))(서열번호 12).

상기한 프라이머들에 있어서, r은 a 또는 g를 의미한다; y는 c 또는 t를 의미한다; h는 a, c 또는 t를 의미한다; m은 a 또는 c를 의미한다: k는 g 또는 t를 의미한다; d는 a, g 또는 t를 의미한다; s는 g 또는 c를 의미한다; w는 a 또는 t를 의미한다; 그리고 i는 이노신(inosine)을 의미한다.

2) 료필럼 쉬메지 과실체로부터 cDNA 라이브러리의 구축

총 핵산은 SDS 페놀 법에 의하여 료필럼 쉬메지 과실체로부터 추출되었고, 총 RNA는 리튬 클로라이드 침전에 의하여 회수되었다. 그 후, 료필럼 쉬메지 mRNA는 mRNA 정제 키트(Pharmacia Co. Ltd.)를 사용하여 그로부터 준비되었다. 위와 같이 하여 20㎍의 mRNA가 약 10g의 과실체(fruit body)로부터 얻어졌다. 상기 mRNA의 5㎍을 ZAP cDNA 합성 키트(Stratagene Co. Ltd.)용으로 사용하여 cDNA를 합성하였다. 1kb에서 5kb cDNA 분획을 겔여과 칼럼을 사용하여 수집하고, Uni-ZAP XR 벡터(Stratagene Co. Ltd.)에 연결하고 그 후, Gigapack III(Stratagene Co. Ltd.)에 패키지되었다. 모든 과정은 키트에 첨부된 제작자의 설명서에 따라 수행하였다. 위와 같이 구축된 료필럼 쉬메지 cDNA 라이브러리의 타이터(titer)는 약 3,000,000pfu로 계산되었다.

3) RT-PCR에 의한 프로브의 준비

상기 라이브러리 탐색용 프로브로서 사용될 수 있는 료필럼 쉬메지 단백질의 상기 부분적 길이 cDNA를 증폭하기 위하여, 1)에서 합성된 프라이머들을 사용하고, 주형으로서 2)에서 합성된 cDNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 채용된 반응 조건은 다음과 같다. 50㎕의 상기 반응 혼합물 용액은 100ng의 cDNA, 5㎕의 10xEq taq 버 퍼, 4㎕의 dNTPs, 10pmoles/프라이머의 서열의 각 종류 및 1㎕의 Ex taq(Takara Shuzo Co. Ltd.) + Taq START 항체(Clontech Co. Ltd.)를 포함한다. Program Temp Control System PC-700(ASTEK Co. Ltd.)를 사용하여, 상기 PCR은 3분 94℃ 1회, 1분 94℃, 1분 50℃, 1분 72℃ 35회 및 그 후 6분 72℃ 1회로 구성되었다. 그 결과, 약 0.4에서 0,5kb의 산물이 65R1-70F1, 65R1-70F2, 65R2-70F1, 65R2-70F2, 65R2-70F3 및 65R3-70F1의 프라이머 조합으로 증폭되었다. 그들 중, 높은 증폭 효율을 보이는 약 0.4kb 단편이 겔-정제되고, pCRII 벡터(Invitrogen에 의하여 제조됨) 내로 클론됨으로써 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열에 근거하여 추론된 아미노산 서열은 실시예2-3)에서 결정된 아미노산 서열의 일부분과 동일한 서열을 포함하고 있었고, 상기 전체 서열은 코리올러스 베르시콜러 피라노즈 옥시다제와 약한 상동성을 보였다. 이 결과에 근거하여, 70kDa 및 65kDa의 정제된 항미생물 단백질은 단일 유전자에 의하여 암호화되고, 상기 RT-PCR에 의하여 얻어진 cDNA 클론은 료필럼 쉬메지 항미생물 단백질의 부분적 길이 cDNA인 것이 확인되었다.

4) 전장 cDNA의 탐색

3)에서 얻어진 상기 클론은 벡터로부터 절제되어 2)에서 구축된 료필럼 쉬메지 cDNA 라이브러리 탐색용 프로브로서 채용되었다. 사각 페트리 디쉬(14x10cm) 내에, 약 15,000pfu의 파아지가 ZAP cDNA 합성 키트(Stratagene Co. Ltd.)에 첨부된 제작자의 설명서에 따라 숙주 XL1-blue MRF'와 함께 도말되었다. 그 후 플라크는 나일론 막 필터 Hybond-N+(Amersham Co.Ltd.)와 접촉시켰고 상기 막에 첨부된 제작자의 설명서에 따라 알칼리 처리되었다. 위와 같이 하는 것은, DNA를 변성시키고 막 상에 그들을 고정하기 위한 것이다. 혼성화 및 세척은 상기 막에 첨부된 제작자의 설명서에 따라 아주 엄격한 조건하에서 행하였다. 일차 탐색에서, 20개의 양성 클론이 약 120,000pfu 파아지로부터 얻어졌다. 이들 클론에 대하여 이차 탐색을 하였고 그 후, 또한 플라크를 정제할 목적인 삼차 탐색을 하였다. 이들 20개 클론 모두는 ZAP cDNA 합성 키트(Stratagene Co. Ltd.)에 첨부된 제작자의 설명서에 따라 인 비보(in vivo) 절제를 하였다. 그 결과, 18개 클론이 파아지미드(phagemid) 벡터 pBluescript SK에 도입된 cDNA로서 수집되었다. 이들 클론은 길이가 1.7kb에서 2.1kb이었다. 제한 효소에 의한 분석 결과에 의하면, 이들 클론은 서로 아주 비슷한 유전자들로부터 유래하였음을 암시하고 있다.

5) 염기서열의 결정

상기한 18개의 cDNA 클론에 관하여, 5′과 3′쪽 염기 서열(각각 약 500bp)이 결정되었다. 위와 같이 얻어진 염기 서열 데이터는 analysis soft Genetyx 9.0판(Software Development Co. Ltd.)을 사용하여 분석되었다. 그 결과, 비록 poly A첨가 부위는 클론에 따라 다를지라도, 이들 클론 모두는 실시예2-3)에서 결정된 상기 65kDa 단백질의 30개 아미노산을 암호화하는 DNA 서열을 포함하고 있다. 가장 긴 cDNA 클론 번호 13(2.1kb)의 전염기 서열은 ABI PRIMS Fluorescence Sequencer(Model 1310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer Co. Ltd.)를 사용한 프라이머 워킹법(primer walking method)에 의하여 결정되었다. 그 결과, 료필럼 쉬메지 항미생물 단백질을 암호화하는 상기 cDNA는 전장이 2106 염기쌍으로 구성되었고, 618 아미노산을 암호화하는 1854bp의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포 함하고 있다(서열번호 1 및 2). 상기 아미노산 서열에 근거하여, 분자량은 약 68487로 추정되었고, 등전점은 6.12로 계산되었다. 상기 정제된 단백질로부터 결정된 아미노산 서열에 있어서, 65kDa 단백질로부터 유래하는 30 아미노산은 서열번호2의 아미노산 잔기 번호 76에서 105에 해당하고, 70kDa 단백질로부터 유래한 34 아미노산은 그의 아미노산 잔기 번호 211에서 244에 해당한다. 이들 사실은 65kDa 및 70kDa 단백질은 단일 유전자에 의하여 암호화된다는 것을 암시한다. 더욱이, 당쇄 첨가 부위로서 추정되는 7곳이 있다(서열번호2의 아미노산 잔기 번호 154, 319, 360, 412, 558, 573 및 583).

이들 결과에 근거하여, 상기 클론된 cDNA는 료필럼 쉬메지 항미생물 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래하는 것으로 판단되었다. 본 발명에 따른 료필럼 쉬메지-유래 항미생물 단백질의 아미노산 서열의 상동성은 데이터 베이스(DDBJ) 상에서 (BLAST) 탐색되었다. 그 결과, 전체적으로 코리올러스 베르시콜러(Coriolus versicolor) 피라노스 옥시다제의 아미노산과 45% 동일성을 보였다. 다른 상동성 서열이 없었으므로, 이 유전자는 신규한 피라노스 옥시다제-유사 단백질을 암호화하는 것으로 추정되었다.

실시예 4 : 재조합 단백질의 E.coli에서의 발현 및 정제

1) 발현 벡터의 구축

실시예 3-5)에서 분리된 cDNA 클론 번호 13은 종결 코돈의 약 0.06kb 하류에 독특한 EcoT22I 제한 부위 및 종결코돈의 약 0.25kb 상류에 독특한 BamHI 제한 부위를 가지고 있다. 또한, BamHI은 이 cDNA의 5′-쪽 벡터 상의 다중클로닝 부위(multicloning site)에 위치하고 있다. 먼저, 그(벡터: pBluescript) 안에 삽입된 이 cDNA를 갖는 플라스미드는 제한 효소 EcoT22I(Takara Shuzo, Co. Ltd.)로 완전히 소화되고, 그 후 BamHI(Takara사 제조)으로 부분적으로 소화되었다. 위와 같이 형성된 상기 약 2kb BamHI(벡터 상의 BamHI)-EcoT22I 단편은 제한 효소 BamHI 및 PstI으로 이중소화된 E.coli pQE30(Qiagen, Co. Ltd.)용 발현 벡터 내로 도입되었다(pQEHSPOfull로 명명함). 위와 같이 형성된 상기 구조체는 (서열목록의 서열번호2의 전체 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호1의 번호8에서 1864의 염기서열을 포함하는) 본 발명에 따른 료필럼 쉬메지 피라노스 옥시다제-유사 단백질을 암호화하는 전장 cDNA의 가장 긴 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)을 포함하고, 6 히스티딘 잔기가 꼬리표(tag)로서 발현된 단백질의 N′말단에 첨가되었다.

2) E.coli에서의 발현

숙주로서 E.coli M15 스트레인을 사용하여 발현 실험을 행하였다. 상기 스트레인의 배양 및 IPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)에 의한 단백질 발현의 유도는 제작자의 설명서(Qiagen)에 따라 행하였다. 상기 스트레인은 OD₆₀₀이 약 0.5가 될 때까지 항생제 앰피시린 및 카나마이신을 포함하는 LB 배지에서 전배양되었다. 뒤이어, 다양한 온도 및 다양한 IPTG 농도에서 일정한 시간 동안 동일한 배지에서 배양되었고, 그러므로써 발현을 유도하였다. 가용성 단백질은 제작자의 설명서(Qiagen)에 따라 추출되었고, 그의 일정량은 Nishimura 등(1996)의 방법에 따른 상기 피라노스 옥시다제 활성의 측정에 사용되었다. 표 3은 재조합 단백질의 발 현 결과를 요약한 것이다.

표 3: E.coli에서 료필럼 쉬메지 피라노스 옥시다제의 발현

구조체	유도 조건		피라노스 옥시다제 활성(mU/mL 배양액)
	온도(℃)	IPTG(mM)	5시간 후	21시간 후
pQEHSPOful	37	2	0	0
	25	0.5	2.5	1
	16	0.1	15	34
pQE30(표준물질)	25	0.5	0	0
	16	0.1	0	0

비록 유도는 먼저, 통상의 조건(37℃, IPTG 농도 2mM)에서 시도되었으나, 가용성 분획에서는 어떠한 피라노스 옥시다제 활성도 관찰되지 않았고, 반면에 다량의 불용성 봉입체(inclusions)가 발현되었다. 그 후, 상기 발현은 다양한 조건에서 유도되었으며, 가용성 분획 내의 피라노스 옥시다제 활성을 측정하였다. 그 결과, 상기 피라노스 옥시다제 활성은 유도 조건이 온화해짐에 따라, 즉, 배양 온도를 낮추고 IPTG 농도를 감소시킴에 따라 증가하였다. 유도 조건이 온화해짐에 따라 상기 가용성 재조합 단백질은 증가하기 때문인 것으로 여겨진다. 대조적으로, 표준 벡터로 채용된 pQE30(벡터 그 자체)로부터는 어떠한 활성도 검출되지 않았다. 이들 결과는 상기 클론된 cDNA는 확실히 상기 활성 피라노스 옥시다제-유사 단백질을 암호화한다는 것을 분명하게 나타내고 있다. 25℃에서 0.5mM의 IPTG 농도로 배양한 경우, 상기 활성의 감소는 21시간 후에 관찰되었으며, 이는 유도 시작 5시간 후에 관찰되는 것과 비교된다. 상기 발현된 단백질은 분해되었기 때문인 것으로 여겨진다.

다음으로, 상기 발현된 단백질을 정제하려고 시도하였다. 16℃에서 0.1mM의 IPTG 농도에서의 발현 유도하의 세포로부터 유래하는 가용성 단백질 분획으로부터, 상기 재조합 피라노스 옥시다제-유사 단백질은 Ni-NTA 아가로즈(Qiagen, Co. Ltd.)를 사용하여 정제되었다. 그 결과, 상기 피라노스 옥시다제 활성은 용출된 분획에서만 발견되었다. 따라서 상기 재조합 단백질의 N′말단은 E.coli에서 소화되고, 히스티딘 잔기는 여전히 N′말단에 부착되어 있다는 것; 상기 재조합 단백질은 히스티딘 잔기를 이용하여 Ni-NTA 아가로즈에 의하여 쉽게 정제될 수 있다는 것; 및 클론된 전장 cDNA의 암호화 도메인(coding domain)은 그 자체로서(즉, 단백질의 N 말단 쪽에 해당하는 부분을 제거함이 없이) 활성 단백질을 암호화 한다는 것을 분명히 나타내고 있다. 상기 재조합 단백질의 수율은 E.coli 배양액 1리터 당 수 mg으로 추정된다.

활성 성분으로서, 본 발명에 따른 서열목록의 서열번호2의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 단백질 성분, 또는 번호 1에서 75의 서열을 제외한 그의 전장(full length)을 포함한 제제(formulation)는 강력한 항미생물제로서 사용될 수 있다. 더욱이, 활성 성분으로서 상기한 단백질 성분을 포함하는 시약(reagent)은 혈당 수준과 같은 당을 측정하는 데에 사용될 수 있다. 질병 및 해충에 저항성이 있는 식물은 서열목록의 서열번호1의 DNA 서열에서, 번호 8에서 1864의 서열 또는 번호 233에서 1864의 서열에 의하여 특징지워지는 DNA 서열을, 식물세포 내에서 기능할 수 있는 체제적(constitutive), 기관/시간-특이적(organ/time-specific) 또는 스트레스-유도성(stress-inducible) 또는 질병/곤충-유도성 프로모터 서열 및 식물세포에서 기능할 수 있는 터미네이터 서열을 포함하는 발현 카세트 내로 도입 하고, 상기 카세트를 식물세포 내로 도입하여 재생된(regenerated) 개체를 얻으므로써 구축될 수 있다. 더욱이, 상기 단백질은 상기한 DNA 서열을, 선택된 숙주 내에서 증폭할 수 있는 벡터를 사용하여 E.coli, 효모, 곤충 또는 일정한 동물세포 내로 도입하고 상기 단백질을 발현시킴으로써 대량으로 얻을 수 있다.

<110> NOVEL PROTEIN, GENE ENCODING THE SAME AND METHOD OF UTILIZATION THEREOF <120> JAPAN T0BACCO INC. and N0RlNSUlSAN-SENTANGIJYUTU SANGYOUSHINKOU CENTOR <130> PC/N(x)-61-17 <160> 12 <210> 1 <211> 2106 <212> DNA <213> Lyophyllum shimeji <220> <221> CDS <222> (8)..(1861) <400> 1 atcagcc atg tct ctc tca acc gag cag atg cta cgc gac tat cca cgg 49 Met Ser Leu Ser Thr Glu Gln Met Leu Arg Asp Tyr Pro Arg 1 5 10 tct atg caa atc aac gga cag att cct aag aac gca att cac gaa aca 97 Ser Met Gln Ile Asn Gly Gln Ile Pro Lys Asn Ala Ile His Glu Thr 15 20 25 30 tac gga aac gac gga gtt gat gta ttc att gca gga tct gga ccc att 145 Tyr Gly Asn Asp Gly Val Asp Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile 35 40 45 gga gcg acg tat gca aag ctc tgt gtt gaa gct ggt cta cgt gtt gtg 193 Gly Ala Thr Tyr Ala Lys Leu Cys Val Glu Ala Gly Leu Arg Val Val 50 55 60 atg gtc gag atc gga gct gct gat agc ttc tac gct gtt aat gcc gaa 241 Met Val Glu Ile Gly Ala Ala Asp Ser Phe Tyr Ala Val Asn Ala Glu 65 70 75 gaa gga act gca gtt ccc tac gtt cct ggc tac cac aag aag aat gaa 289 Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val Pro Gly Tyr His Lys Lys Asn Glu 80 85 90 atc gag ttc cag aaa gat att gac cgc ttc gtc aat gta atc aag gga 337 Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val Asn Val Ile Lys Gly 95 100 105 110 gcc tta caa caa gtc tct gtt cct gtc aga aac cag aac gtg cct aca 385 Ala Leu Gln Gln Val Ser Val Pro Val Arg Asn Gln Asn Val Pro Thr 115 120 125 ctt gat ccc gga gcc tgg agc gcg ccc cct gga agt tca gcc ata tcg 433 Leu Asp Pro Gly Ala Trp Ser Ala Pro Pro Gly Ser Ser Ala Ile Ser 130 135 140 aac ggt aaa aat cct cac cag cgg gaa ttc gag aac ttg tct gcg gag 481 Asn Gly Lys Asn Pro His Gln Arg Glu Phe Glu Asn Leu Ser Ala Glu 145 150 155 gcc gta acg cgt gga gtc ggc ggc atg agt acc cac tgg acg tgc tcc 529 Ala Val Thr Arg Gly Val Gly Gly Met Ser Thr His Trp Thr Cys Ser 160 165 170 acg cca cgg att cat cca ccc atg gaa agt ctc ccg ggc atc ggc cgt 577 Thr Pro Arg Ile His Pro Pro Met Glu Ser Leu Pro Gly Ile Gly Arg 175 180 185 190 ccg aag ctc agt aac gac ccg gca gag gac gac aaa gag tgg aac gag 625 Pro Lys Leu Ser Asn Asp Pro Ala Glu Asp Asp Lys Glu Trp Asn Glu 195 200 205 ctt tat tcc gag gcc gag cgt ctc atc ggg act tcc acc aag gaa ttc 673 Leu Tyr Ser Glu Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe 210 215 220 gac gag tca att cgg cac acc ctt gtt ctg cgc tct ttg caa gac gcg 721 Asp Glu Ser Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala 225 230 235 tac aag gat cgt caa cgt atc ttt cgc cct ctc ccg ttg gca tgc cac 769 Tyr Lys Asp Arg Gln Arg Ile Phe Arg Pro Leu Pro Leu Ala Cys His 240 245 250 cgg ttg aag aac gcg ccg gaa tac gtc gaa tgg cac tca gca gaa aat 817 Arg Leu Lys Asn Ala Pro Glu Tyr Val Glu Trp His Ser Ala Glu Asn 255 260 265 270 ctt ttc cac tct atc tac aac gat gac aag cag aag aag ctc ttt acc 865 Leu Phe His Ser Ile Tyr Asn Asp Asp Lys Gln Lys Lys Leu Phe Thr 275 280 285 ctg ctg acg aac cat cgc tgc aca cga ctg gcg ctt acg ggc ggg tat 913 Leu Leu Thr Asn His Arg Cys Thr Arg Leu Ala Leu Thr Gly Gly Tyr 290 295 300 gag aag aag att ggc gct gcc gag gtc agg aat cta ctg gcc acc agg 961 Glu Lys Lys Ile Gly Ala Ala Glu Val Arg Asn Leu Leu Ala Thr Arg 305 310 315 aat cct agt tcg cag ctg gac agc tat atc atg gcg aag gta tat gta 1009 Asn Pro Ser Ser Gln Leu Asp Ser Tyr Ile Met Ala Lys Val Tyr Val 320 325 330 ctg gcg tcg gga gcg atc ggc aac cca cag att ctc tat aac tcg ggc 1057 Leu Ala Ser Gly Ala Ile Gly Asn Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Ser Gly 335 340 345 350 ttc tct ggg cta cag gtc acg cca cgc aat gac tcg ttg atc ccc aac 1105 Phe Ser Gly Leu Gln Val Thr Pro Arg Asn Asp Ser Leu Ile Pro Asn 355 360 365 ctg ggg agg tac atc acg gag cag ccg atg gca ttt tgc cag ata gtc 1153 Leu Gly Arg Tyr Ile Thr Glu Gln Pro Met Ala Phe Cys Gln Ile Val 370 375 380 ttg agg cag gaa ttc gtc gac agc gtg cgc gac gat cct tat gga ctg 1201 Leu Arg Gln Glu Phe Val Asp Ser Val Arg Asp Asp Pro Tyr Gly Leu 385 390 395 cca tgg tgg aaa gaa gcc gtt gct caa cat att gcc aag aac ccg aca 1249 Pro Trp Trp Lys Glu Ala Val Ala Gln His Ile Ala Lys Asn Pro Thr 400 405 410 gat gca ctg ccc att ccg ttc cgc gat ccg gaa ccc cag gta aca acc 1297 Asp Ala Leu Pro Ile Pro Phe Arg Asp Pro Glu Pro Gln Val Thr Thr 415 420 425 430 cca ttt aca gaa gaa cac ccc tgg cac acg cag att cac cgc gat gct 1345 Pro Phe Thr Glu Glu His Pro Trp His Thr Gln Ile His Arg Asp Ala 435 440 445 ttt tcg tac ggt gcc gtc ggt cct gag gtg gac tct cgt gtc atc gtc 1393 Phe Ser Tyr Gly Ala Val Gly Pro Glu Val Asp Ser Arg Val Ile Val 450 455 460 gac ctg cgc tgg ttt ggc gca acc gac cct gaa gca aac aac ctt ttg 1441 Asp Leu Arg Trp Phe Gly Ala Thr Asp Pro Glu Ala Asn Asn Leu Leu 465 470 475 gtt ttc cag aac gat gtt caa gac ggg tac agt atg ccg cag ccg acg 1489 Val Phe Gln Asn Asp Val Gln Asp Gly Tyr Ser Met Pro Gln Pro Thr 480 485 490 ttc aga tat cga ccc agc act gcg tca aac gtg aga gca agg aaa atg 1537 Phe Arg Tyr Arg Pro Ser Thr Ala Ser Asn Val Arg Ala Arg Lys Met 495 500 505 510 atg gcc gat atg tgc gaa gtg gcg agc aac ttg gga ggt tat ttg ccc 1585 Met Ala Asp Met Cys Glu Val Ala Ser Asn Leu Gly Gly Tyr Leu Pro 515 520 525 acg tcc ccc ccg cag ttt atg gat cca ggc ctt gca ctt cat ctt gcg 1633 Thr Ser Pro Pro Gln Phe Met Asp Pro Gly Leu Ala Leu His Leu Ala 530 535 540 ggg act act cgc att ggc ttc gac aag gca act aca gtg gct gat aac 1681 Gly Thr Thr Arg Ile Gly Phe Asp Lys Ala Thr Thr Val Ala Asp Asn 545 550 555 aac tcg ctg gtc tgg gac ttt gcc aat ctt tat gtt gca ggc aat ggc 1729 Asn Ser Leu Val Trp Asp Phe Ala Asn Leu Tyr Val Ala Gly Asn Gly 560 565 570 acc atc agg acg ggc ttc ggc gag aac ccg aca ctt acg tcg atg tgc 1777 Thr Ile Arg Thr Gly Phe Gly Glu Asn Pro Thr Leu Thr Ser Met Cys 575 580 585 590 cac gct atc aag agc gcg agg agc atc atc aat aca ctc aag ggt ggg 1825 His Ala Ile Lys Ser Ala Arg Ser Ile Ile Asn Thr Leu Lys Gly Gly 595 600 605 act gac gga aaa aat aca ggc gag cat cgc aac ctt tga ggaaggagca 1874 Thr Asp Gly Lys Asn Thr Gly Glu His Arg Asn Leu 610 615 acagcagtgt aaacaaacgc gtcaagtggc tacttcaagt tgaatgcatt ctggtcccct 1934 accatgttga tgtgtacgat aggcgttgaa agattttgtg tattactgaa cctgtacttt 1994 gtctgaatag ttatggcact atgattcatg tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2054 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2106 <210> 2 <211> 618 <212> PRT <213> Lyophyllum shimeji <400> 2 Met Ser Leu Ser Thr Glu Gln Met Leu Arg Asp Tyr Pro Arg Ser Met 1 5 10 15 Gln Ile Asn Gly Gln Ile Pro Lys Asn Ala Ile His Glu Thr Tyr Gly 20 25 30 Asn Asp Gly Val Asp Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile Gly Ala 35 40 45 Thr Tyr Ala Lys Leu Cys Val Glu Ala Gly Leu Arg Val Val Met Val 50 55 60 Glu Ile Gly Ala Ala Asp Ser Phe Tyr Ala Val Asn Ala Glu Glu Gly 65 70 75 80 Thr Ala Val Pro Tyr Val Pro Gly Tyr His Lys Lys Asn Glu Ile Glu 85 90 95 Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val Asn Val Ile Lys Gly Ala Leu 100 105 110 Gln Gln Val Ser Val Pro Val Arg Asn Gln Asn Val Pro Thr Leu Asp 115 120 125 Pro Gly Ala Trp Ser Ala Pro Pro Gly Ser Ser Ala Ile Ser Asn Gly 130 135 140 Lys Asn Pro His Gln Arg Glu Phe Glu Asn Leu Ser Ala Glu Ala Val 145 150 155 160 Thr Arg Gly Val Gly Gly Met Ser Thr His Trp Thr Cys Ser Thr Pro 165 170 175 Arg Ile His Pro Pro Met Glu Ser Leu Pro Gly Ile Gly Arg Pro Lys 180 185 190 Leu Ser Asn Asp Pro Ala Glu Asp Asp Lys Glu Trp Asn Glu Leu Tyr 195 200 205 Ser Glu Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe Asp Glu 210 215 220 Ser Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala Tyr Lys 225 230 235 240 Asp Arg Gln Arg Ile Phe Arg Pro Leu Pro Leu Ala Cys His Arg Leu 245 250 255 Lys Asn Ala Pro Glu Tyr Val Glu Trp His Ser Ala Glu Asn Leu Phe 260 265 270 His Ser Ile Tyr Asn Asp Asp Lys Gln Lys Lys Leu Phe Thr Leu Leu 275 280 285 Thr Asn His Arg Cys Thr Arg Leu Ala Leu Thr Gly Gly Tyr Glu Lys 290 295 300 Lys Ile Gly Ala Ala Glu Val Arg Asn Leu Leu Ala Thr Arg Asn Pro 305 310 315 320 Ser Ser Gln Leu Asp Ser Tyr Ile Met Ala Lys Val Tyr Val Leu Ala 325 330 335 Ser Gly Ala Ile Gly Asn Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Ser Gly Phe Ser 340 345 350 Gly Leu Gln Val Thr Pro Arg Asn Asp Ser Leu Ile Pro Asn Leu Gly 355 360 365 Arg Tyr Ile Thr Glu Gln Pro Met Ala Phe Cys Gln Ile Val Leu Arg 370 375 380 Gln Glu Phe Val Asp Ser Val Arg Asp Asp Pro Tyr Gly Leu Pro Trp 385 390 395 400 Trp Lys Glu Ala Val Ala Gln His Ile Ala Lys Asn Pro Thr Asp Ala 405 410 415 Leu Pro Ile Pro Phe Arg Asp Pro Glu Pro Gln Val Thr Thr Pro Phe 420 425 430 Thr Glu Glu His Pro Trp His Thr Gln Ile His Arg Asp Ala Phe Ser 435 440 445 Tyr Gly Ala Val Gly Pro Glu Val Asp Ser Arg Val Ile Val Asp Leu 450 455 460 Arg Trp Phe Gly Ala Thr Asp Pro Glu Ala Asn Asn Leu Leu Val Phe 465 470 475 480 Gln Asn Asp Val Gln Asp Gly Tyr Ser Met Pro Gln Pro Thr Phe Arg 485 490 495 Tyr Arg Pro Ser Thr Ala Ser Asn Val Arg Ala Arg Lys Met Met Ala 500 505 510 Asp Met Cys Glu Val Ala Ser Asn Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Thr Ser 515 520 525 Pro Pro Gln Phe Met Asp Pro Gly Leu Ala Leu His Leu Ala Gly Thr 530 535 540 Thr Arg Ile Gly Phe Asp Lys Ala Thr Thr Val Ala Asp Asn Asn Ser 545 550 555 560 Leu Val Trp Asp Phe Ala Asn Leu Tyr Val Ala Gly Asn Gly Thr Ile 565 570 575 Arg Thr Gly Phe Gly Glu Asn Pro Thr Leu Thr Ser Met Cys His Ala 580 585 590 Ile Lys Ser Ala Arg Ser Ile Ile Asn Thr Leu Lys Gly Gly Thr Asp 595 600 605 Gly Lys Asn Thr Gly Glu His Arg Asn Leu 610 615 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Lyophyllum shimeji <400> 3 Asn Ala Glu Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val Pro Gly Tyr His Lys 1 5 10 15 Lys Asn Glu Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val 20 25 30 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Lyophyllum shimeji <400> 4 Glu Phe Asp Glu Ser Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln 1 5 10 15 Asp Ala Tyr Lys Asp Arg Glu Arg 20 <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Lyophyllum shimeji <400> 5 Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe Asp Glu Ser Ile 1 5 10 15 Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala Tyr 20 25 <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Lyophyllum shimeji <400> 6 Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe Asp Glu Ser Ile 1 5 10 15 Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala Tyr Lys Asp Arg 20 25 30 Gln Arg <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 9, 12, 15 and 18 <223> i represents inosine <400> 7 gargarggia cigcigticc 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 garttycara argayathga ymg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 6, 12 and 21 <223> i represents inosine <400> 9 ttygtiaayg tiathtgygg igc 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 3 and 9 <223> i represents inosine <400> 10 tgickdatis wytcrtcraa ytc 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 3 and 15 <223> i represents inosine <400> 11 tgickrtcyt trtaigcrtc ytg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 3, 12 and 18 <223> i represents inosine <400> 12 ggigcraada tickytgick rtc 23

Claims (27)

1. 적어도 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 또는 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia Oryzae)에 대하여 항미생물 활성을 가지고, SDS-PAGE법에 의한 분자량에 있어서 70kDa 또는 65kDa의 성분의 존재를 보이는, 암모늄 설페이트 침전법에 의하여 침전된 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji)의 수성 추출물의 분획으로부터 얻어질 수 있는 항미생물 단백질로서, 상기 단백질의 N 말단은 서열목록의 서열번호3의 N 말단 아미노산 서열: Asn Ala Glu Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val Pro Gly Tyr His Lys Lys Asn Glu Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val을 갖는 것을 특징으로 하는 항미생물 단백질.
2. 삭제
3. 서열목록의 서열번호2의 아미노산 서열을 갖고, 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 또는 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia Oryzae)에 대하여 항미생물 활성을 보이는 항미생물 단백질.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 서열목록의 서열번호2의 아미노산 서열에 있어서 76에서 618의 부분적 아미노산 서열을 갖고, 피리쿨라리아 오리자(Pyricularia oryzae) 또는 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 항미생물 활성을 보이는 단일 폴리펩티드 또는 이들 폴리펩티드의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 항미생물 단백질.
10. 다음 단계를 포함하여 이루어지는 제1항, 제3항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 항미생물 단백질을 생산하는 방법:

    암모늄 설페이트 침전법에 의하여 75% 포화 암모늄 설페이트로 침전된 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji)의 수성 추출물의 분획을 회수하는 단계; 및

    상기 분획을 이온교환 크로마토그래피를 거치게 하고 0.05M에서 1M의 NaCl 농도로 용출된 분획을 회수하는 단계.
11. 제1항, 제3항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 항미생물 단백질을 암호화하는 유전자.
12. 제11항에 있어서, 상기 유전자는 서열목록의 서열번호1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 다음 단계를 포함하여 이루어지는 공정에 의하여 만들어진 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji)로부터 유래된 항미생물 단백질을 암호화하는 유전자를 얻기 위한 올리고뉴클레오티드:

    서열목록의 서열번호1의 항미생물 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 염기서열로부터 다음의 요건을 충족시키는 두 도메인을 선택하는 단계:

    1) 15에서 30염기로 구성되는 각 도메인; 및

    2) 40%에서 60%의 G+C 함량을 갖는 각 도메인;

    상기 도메인의 염기서열과 동일하거나 그들에 상보적인 염기서열을 갖는 단일 가닥 DNA 준비하는 단계, 또는 단일 가닥 DNA들에 의하여 암호화되는 아미노산 잔기들이 변화되지 않도록 하는 유전적 코드에 있어서 다의성(degeneracy)을 갖는 단일가닥 DNA 혼합물을 준비하는 단계; 및 상기 항미생물 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 염기서열에의 결합 특이성에 해를 입히지 않으면서 단일 가닥 DNA를 선택적으로 변형시키는 단계.
20. 제19항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열목록의 서열번호 7 내지 12의 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레티드.
21. 주형으로서 료필럼 쉬메지(Lyophyllum shimeji) 과실체 cDNA 라이브러리 및 프라이머로서 제19항에 따른 한쌍의 두 올리고뉴클레오티드를 이용하여 핵산 증폭 반응을 일으켜 제1항에 따른 항미생물 단백질을 암호화하는 유전자의 일부를 증폭 하는 단계 및 프로브로서 상기와 같이 얻어진 증폭 산물을 이용하여 상기 cDNA 라이브러리를 탐색하여 전장 cDNA 클론을 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제11항에 따른 유전자를 분리하는 방법.
22. 제11항에 따른 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
23. 제22항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터(expression vector)인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
24. 제22항에 따른 재조합 벡터를 숙주 개체내로 도입함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
25. 항미생물 단백질의 발현을 촉진하는 조건하에서 제24항에 따른 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항미생물 단백질을 생산하는 방법.
26. 제25항에 따른 방법에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 재조합 항미생물 단백질.
27. 활성 성분으로서 제1항에 따른 항미생물 단백질을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 식물용 항미생물제.

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