KR100477928B1 - 벼 유래의 재조합 ｇｓｔ 단백질 및 상기 단백질을 대량생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 유래의 재조합 GST(glutatione S-transferase) 단백질 및 상기 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 분자량 28kDa; (b) 최적 pH 9; (c) 최적 온도 45℃; 및 (d) CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene), ETA(ethacrynic acid), EPNP(1,2-epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy)propane) 및 CP(cumene hydroperoxide)에 대한 기질 특이성의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 벼 유래의 재조합 GST 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 이용하여 상기 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 대장균 내에서 대량 생산된 벼 유래의 재조합 GST 단백질은 제초제, 농약 또는 약물 등에 의한 식물 세포 내 해독 대사 과정 분석에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 표적분자 또는 종양 마커(cancer marker)로서 화학요법 분야의 진단 및 이를 필요로 하는 다양한 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

벼 유래의 재조합 ＧＳＴ 단백질 및 상기 단백질을 대량 생산하는 방법{Recombinant glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same}

본 발명은 벼 유래의 재조합 GST(glutatione S-transferase) 단백질 및 상기 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 GST 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 이용하여 상기 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

농작물에 대한 제초제(herbicide)의 처리는 농업학적으로 수확량의 증대를 가져왔다. 제초제는 식물종마다 다른 종류를 사용하며, 각 종마다 다른 해독작용(detoxification)을 거치게 된다(Lamoureux et al., J. Agric . Food. Chem . 28: 1057-1070, 1980). GST(Glutathione S -transferase, EC 2.5.1.18)는 식물 세포의 해독 작용 에 관여하는 효소이다(Rushmore and Pickett J. Biol . Chem . 268: 11475-11478, 1993; Mannervik and Danielson CRC Crit . Rev. Biochem . 23: 283-337, 1988). 이 효소는 다양한 소수성 화합물에 글루타치온(Glutathione; GSH, γ-Glu-Cys-Gly)과의 친전자성 반응을 촉매하며, 척추동물, 곤충, 선충류, 효모, 호기성균 등에서 발견된다. 또한, GST는 다른 유기체에서도 발암물질(carcinogens), 약물(Haye et al., Carcinogenesis. 9(7):1283-1287, 1988), 농약(Tsuchida and Sato J Biol Chem . 265(13): 7150-7157, 1990)에 대한 세포 내 해독작용에 있어 중요한 역할을 하고 있다. 식물 GSTs는 결합(conjugation)에 의해 독성 물질을 불활성화시키며, 병원균, 산화적 스트레스(oxidative stress), 식물 호르몬(phytohormone) 처리에 따른 스트레스 반응을 완화시킨다. 식물 GSTs의 다른 효소학적인 기능으로는 약물, 호르몬 등과 같은 소수성 비결합 화합물(non-substrate compounds)의 세포 내 이동과 저장을 촉진시킨다. 또한, GSTs는 세포 내 옥신 반응에 중요한 역할을 한다(Takahashi et al., Planta . 196(1): 111-117, 1995).

최근에는 드루그 등의 분류법에 의해 GSTs를 아미노산 서열 동일성과 인트론 대 엑손의 보존 관계(intron:exon conservation)에 따라 분류하고 있다(Droog et al ., Plant. Mol . Biol . 29: 413-429, 1995). Ⅰ형 GSTs는 제초제 해독작용을 담당하며, 식물의 이소효소(isozyme)가 이에 해당한다. 이들은 세 개의 엑손과 두 개의 인트론으로 구성된다. 또한, Ⅰ형의 GSTs는 방어 유전자(defense genes)(Bartling et al., Eur . J. Biochem . 216: 579-586, 1993)와 세포 내 예방 보호 유전자(cellular protectant genes)로서 기능을 하며, 병원균 공격 및 상처에 대응하는 단백질을 생산한다. 실렌(Silene)(Grove et al., Nucleic. Acids. Res. 16: 425-438, 1988), 사탕수수(Gronwaid and Plaisance Plant Physiol . 117(3): 877-892, 1988), 브로콜리(broccoli)(Irzyk and Fuerst Plant. physiol . 102: 803-810, 1993) 및 애기장대(Arabidopsis)(Friling et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 89(2): 668-672, 1992)의 GSTs가 이에 포함된다. Ⅱ형 GSTs는 10개의 엑손과 9개의 인트론으로 구성되는데, 이에 대해서는 오직 카네이션에서만 연구되어졌다(Dudler et al., Mol Plant Microbe Interact. 4(1): 14-18, 1991). Ⅱ형의 GSTs는 식물 기관에서 에틸렌(ethylene)과 노화 관련 유전자(senescence-related genes)로 발현된다. 마지막으로 Ⅲ형 GSTs는 2개의 엑손과 1개의 인트론으로 구성되며, 옥신 조절 유전자(auxin-regulated genes)(Droog et al., Plant Mol Biol . 21(6): 965-72, 1992)로서 기능을 한다.

또한, 수용성 세포질 GSTs는 이들의 서열 유사성과 면역적 교차반응(immunological cross-reactivity)에 따라 알파(Alpha, α)-, 무(Mu, μ)-, 파이(Pi, φ)-, 시그마(Sigma, σ- 및 세타(Theta, θ)- 클래스(class)로 분류된다(Mannervik et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 82: 7202-7206, 1985). 상기 다섯 종류의 GSTs는 X-선 구조분석을 통해 유사한 이량체(dimeric) 구조를 가지는 것으로 보고되었다(Sinning et al., J. Mol . Biol . 232(1): 192-212, 1993). 각 클래스는 촉매 중심(catalytic centre)과 C-말단(terminus)에 특이성을 가지나, 전체적인 위치에 있어서는 유사성을 보인다(Reinemer et al., J. Mol . Biol . 255: 289-309, 1996). 애기장대(Arabidopsis thaliana Heynh)의 GST(araGST)의 구조가 최초로 규명되었는데(Reinemer et al., J. Mol . Biol. 255: 289-309, 1996), 상기 araGST는 동종 이량체(homodimer)로서 각 부분(sub-unit)은 다른 길이의 연결 단편(segment)으로 연결된 두 개의 영역(domain)으로 구성되어 있다. 최근에는 옥수수(maize) GST의 구조에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Neuefeind et al., J. Mol. Biol . 274(4): 446-453, 1997). GST 활성부위는 두 개의 결합부위(G-site/H-site)를 포함하고 있다. G-부분(site)은 글루타치온 결합(glutathione binding)이 일어나는 부위로서 친수성이며 매우 높은 특이성을 가진다. 반면에 H-부분은 소수성이고, 구조학적으로 낮은 특이성을 가진 다른 기질들의 결합(binding)을 활성화시킨다.

한편, 지금까지 동물, 식물, 박테리아 등을 포함하는 다양한 유기생물체로부터 여러 유전자들이 규명되었다. 현재 유전자의 규명은 대부분 생물체로부터 클로닝한 미지의 유전자의 염기서열을 분석한 후, 이를 다시 서열 상동성 검색 프로그램으로 분석하여 높은 상동성을 나타내는 공지의 유전자를 탐색함으로써 미지의 유전자가 상기 공지의 유전자와 동일한 기능을 하는 유전자일 것이라고 추정한다. 이는 염기서열의 상동성이 높을수록 동일한 단백질을 암호화할 확률이 크기 때문이다. 이렇게 기능이 추정된 유전자의 염기서열은 "추정되는(putative)..."라는 유전자 산물(product) 명으로 NCBI 진뱅크 상에 등록된다. 그러나, 서열 상동성 검색으로 클로닝한 유전자의 기능을 추정하였다고 해서, 반드시 그 유전자가 동일한 유전자 산물을 100% 암호화하는 것은 아니다. 실제로 본 발명자가 진뱅크 상에 등록된 4개의 추정되는 GST 유전자(표 1 참조)를 단백질로 발현시킨 결과, 그 중에서 2개의 유전자로부터 발현된 단백질만이 GST 활성이 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

	진뱅크 등록번호	진뱅크에 등록된 유전자 산물 명	실제 유전자 산물
1	AF309384	추정되는 GST	GST
2	AF309382	추정되는 GST	GST
3	AF309380	추정되는 GST	GST-CDNB 활성이 없음
4	AF309377	추정되는 GST	GST-CDNB 활성이 없음

따라서, 클로닝한 유전자의 정확한 기능을 알기 위해서는, 유전자의 염기서열을 규명하여 이로부터 기능(유전자 산물)이 추정된다 할지라도, 상기 유전자를 직접 단백질로 발현시켜서 발현된 단백질이 염기서열로부터 추정된 기능과 동일한 기능을 하는지에 대해 확인해 보아야 할 필요성이 있다.

이에, 본 발명자들은 진뱅크 AF309382에 개시된 벼의 '추정되는 글루타치온 S-전이효소 OsGSTF5'의 염기서열을 참고로 하여, 벼로부터 GST 유전자를 클로닝하였으며, 상기 유전자를 발현시키기 위한 대장균 대량 발현계를 구축하였다. 또한, 상기 대장균 대량 발현계를 통하여 재조합 GST 단백질을 대장균에서 대량 발현시키고, 이를 분리·정제한 후, 재조합 GST 단백질의 특성을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 벼 유래의 재조합 GST 단백질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 GST 단백질을 대량 발현시키기 위한 대량 발현계를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 GST 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 (a) 내지 (d)의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 벼 유래의 재조합 GST 단백질을 제공한다.

(a) 분자량 28kDa;

(b) 최적 pH 9;

(c) 최적 온도 45℃; 및

(d) CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene), ETA(ethacrynic acid), EPNP(1,2-epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy)propane) 및 CP(cumene hydroperoxide)에 대한 기질 특이성

본 발명에 따른 벼 유래의 재조합 GST 단백질은 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 GST 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 GST를 암호화하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 GST 유전자를 증폭시키는 단계;

(b) 상기 증폭된 GST 유전자를 pET-26b(+)에 클로닝하여 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 제조하는 단계;

(c) 상기 재조합 발현 벡터 pET-rGST로 대장균을 형질전환하는 단계; 및

(d) 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 GST 단백질을 발현시킨 후, 이를 수집 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 GST 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 진뱅크 등록번호 AF309382에 개시된 '추정되는 글루타치온 S-전이효소 OsGSTF5'의 염기서열을 참고로 하여 벼로부터 GST 유전자를 클로닝하였으며, 본 발명은 클로닝된 GST 유전자가 대장균에서 GST 활성을 나타내는 효소의 기능을 갖는 단백질로 발현됨을 실험을 통해 직접 확인하였다는 점에 특징이 있다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 발현을 위한 대장균 대량 발현계를 구축하였다는 점에 특징이 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 벼로부터 GST 유전자를 클로닝하기 위하여, 진뱅크 등록번호 AF309382에 개시된 염기서열을 참고로 하여 GST 유전자 증폭용 프라이머쌍을 합성하였다. 상기 GST 유전자 증폭용 프라이머쌍은 각 염기서열 내에 적절한 서열의 클로닝을 위해 제한 효소의 부위를 포함하도록 제작되는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명자들은 프라이머의 각 서열 내에 NdeⅠ과 BamHⅠ의 제한효소 인식 부위가 존재하도록 제작하였다(표 3 참조). 본 발명자가 제작한 GST 유전자 증폭용 프라이머쌍의 염기서열을 서열번호 1과 서열번호 2로 각각 기재하였다. 이후, 제작된 프라이머쌍을 이용하여 벼로부터 GST 유전자를 증폭시켰다(도 2 참조). 본 발명자들은 증폭된 GST 유전자를 벼(rice)로부터 분리되었다는 의미로 'rGST 유전자'라 명명하였다. 벼로부터 클로닝된 rGST 유전자의 염기서열을 서열번호 5로 기재하였으며, 이로부터 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 6으로 기재하였다. 상기 rGST 유전자의 염기서열을 다른 종의 GST와 비교한 결과, 세타(theta, θ) 클래스의 GSTs와 54 내지 71%의 상동성을 보임을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 벼로부터 증폭된 rGST 유전자를 발현시키기 위한 대량발현계를 구축하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 상기 증폭된 rGST 유전자를 대장균용 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하였다. 상기 대장균용 발현 벡터로는 외래 유전자를 대장균 내에서 발현시킬 수 있는 벡터라면 제한없이 이용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 재조합 유전자의 클로닝 및 대장균 내 발현에 매우 효율적인 것으로 알려진 pET-26b(+)를 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명자들은 rGST 유전자를 상기 pET-26b(+)에 삽입하여 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 제조하였다(도 1 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 이용하여 대장균을 형질전환시킨 후, 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 GST 단백질을 발현시켰다. 이 때 배양은 배양액의 OD₆₀₀값이 0.3-0.4가 되었을 때, IPTG를 최종농도 0.4mM로 첨가한 후, 11시간 정도 더 배양하는 것이 바람직하다. 상기 조건에서 배양할 때 GST 활성이 가장 높은 것으로 조사되었다(결과 미도시). 이후, 발현된 재조합 GST 단백질을 대장균 배양액으로부터 분리·정제하였다. 이 때 사용될 수 있는 분리·정제 방법으로는 GST와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 이용한 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 GSH-세파로즈 친화 크로마토그래피(GSH-sepharose affinity chromatography)를 이용하였다(도 6 참조). 정제된 재조합 GST 단백질의 비활성을 조사한 결과, 조추출물(crude extract)에 비해 6배 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다(표 4 참조).

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 이화학적 특성 및 효소학적 특성은 다음과 같다.

1) 분자량

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 분자량은 SDS-PAGE를 통해 28kDa로, 겔 크로마토그래피를 통해 55kDa인 것으로 규명되었다(도 6 및 도 7 참조). 이 결과로부터 본 발명에 따라 벼로부터 클로닝된 GST 단백질의 활성형은 2개의 서브유닛(subunit)으로 이루어진 동형 이량체(homo-dimer)의 구조인 것으로 추정된다.

2) 기질 특이성

하기 표 2에 기재된, 여러 특성을 갖는 7종류의 기질을 대상으로 하여 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 기질 특이성을 조사한 결과, CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene), ETA(ethacrynic acid), EPNP(1,2-epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy)propane) 및 CP(cumene hydroperoxide)에 대해서만 활성을 나타내었으며, 그 중에서 EPNP에 대한 비활성이 0.852±0.012μmol/min/mg으로 가장 높은 수치를 나타내었다(표 6 참조).

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 기질 특이성 조사에 이용된 기질 및 이들의 특성

기질	기질의 특성
CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene)	대부분의 GST의 공통적인 기질
DCNB(1,2-dichloro-4-nitrobenzene)	포합 반응에 대한 초기속도 측정에 이용되는 기질이며, 뮤(Mu, μ) 클래스의 GST에 높은 활성을 보임
ETA(ethacrynic acid)	파이(Pi, φ) 클래스의 GST 규명에 이용됨
EPNP(1,2-epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy)propane)	에폭사이드 고리 열림(epoxide ring opening) 반응 측정에 이용되며, 세타(theta, θ) 클래스의 GST에 높은 활성을 보임
스테로이드(Δ5-androstene-3,17-dione)	스테로이드 이성질화 효소(steroid isomerase) 활성 측정에 이용됨
4-NPB(4-nitrophenethyl bromide)	세타 클래스의 식물 GST 규명에 이용됨
CP(cumene hydroperoxide)	글루타치온 퍼옥시데이즈(glutathione peroxidase) 활성 측정에 이용되며, 알파(alpha, α) 클래스의 GST에 높은 활성을 보임

3) 각 기질에 대한 Km 값 및 Vmax 값

상기 표 2에 기재된 7종류의 기질 중에서 EPNP에 대한 Km값이 0.05mM로 가장 작은 수치를 나타내었으며, 이 때 Vmax 값은 0.22U/mg이었다(표 7 참조).

4) 저해효과

표 8에 기재된 다양한 저해제를 이용하여 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 GSH-CDNB 결합에 대한 저해 효과를 조사한 결과, S-헥실-GSH(S-hexyl-GSH)의 IC ₅₀ 값(효소의 활성을 50%로 감소시키는 저해제의 농도)이 1.25±0.03μM로 가장 낮은 수치를 나타내었다(표 8 참조).

5) 최적 pH

pH 8.5 ~ 9.5에서 80% 이상의 활성을 나타내었으며, 최적 pH는 9.0인 것으로 나타났다(도 11 참조).

6) 최적 온도

30 ~ 50℃에서 80% 이상의 활성을 나타내었으며, 최적 온도는 45℃인 것으로 나타났다(도 12 참조).

7) 열안정성

GSH-CDNB에 대한 활성이 50%로 감소하는 온도(Tm)는 52℃인 것으로 나타났으며, 80℃에서는 15% 미만의 잔존 활성이 존재하였다(도 13 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

벼로부터 rGST 유전자의 증폭 및 분리

1-1) 주형 DNA의 제조

벼의 뿌리와 배양세포로부터 poly(A) RNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 제조하였다. 이후, 상기 cDNA를 EcoRⅠ과 XhoⅠ으로 절단한 후, 동일한 효소로 절단된 λZAPⅡ 벡터(Stratagene, CA, USA)에 삽입시켰다. 클로닝한 cDNA의 염기서열을 이중가닥 DNA 주형과 pBluescript 시쿼네이즈 킷트(sequenase kit)(Stratagene, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 이후, 벼의 cDNA가 클로닝된 λZAPⅡ 벡터를 M13 파지(phage)에 도입시킨 후, 이로부터 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 95℃에서 10분간 가열하여 PCR 용으로 변성시켰다. 변성된 DNA를 사용 전까지 4℃에서 보관하였다.

1-2) rGST 유전자의 증폭을 위한 프라이머 제작

진뱅크 등록번호 AF309382에 개시된 오리자 사티바(Oryza sativa) 유래 추정되는 GST의 염기서열을 참고로 하여 GST 유전자 증폭용 프라이머쌍을 제작하였다. 용이한 클로닝을 위하여, 하기 표 3에 기재된 바와 같이, 프라이머의 서열 내에 NdeⅠ과 BamHⅠ의 제한효소 자리가 존재하도록 제작하였다. 제작된 2개의 프라이머의 염기서열을 서열번호 1과 서열번호 2로 각각 기재하였다. 이 때 각 프라이머는 다카라(TaKaRa)에 의뢰하여 합성하였다.

rGST 유전자의 증폭에 사용된 프라이머

	염기 서열
프라이머-N(서열번호 1)	5'-GGAATTC CATATG AAAGTGTACGGGTGGGTGGTA-3' NdeⅠ
프라이머-C(서열번호 2)	5'-CGC GGATCC GCTACTATGGTATGTTCCCACTTCCGAA-3' BamHⅠ

1-3) rGST 유전자의 증폭 및 분리·정제

상기 실시예 1-1)에서 제조한 DNA를 주형으로 하고, 상기 실시예 1-2)에서 제작한 2개의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응용액은 파지 DNA 20㎕, 프라이머-N 0.5㎕, 프라이머-C 0.5㎕, 25mM MgCl₂ 3㎕, 2mM dNTP 5㎕, 10×PCR 완충용액 5㎕, KOD 중합효소(polymerase) 1㎕ 및 물(H₂O) 15㎕를 혼합하여 제조하였다. PCR 반응은 94℃에서 1분; 50℃에서 2분; 및 72℃에서 3분을 한 사이클로 하여 35회 반복 수행하였다. 이후, 1% 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 분자량 마커 Mb의 770bp와 612bp 사이에서 단일 밴드의 DNA가 나타남을 확인할 수 있다. 이후, 진 클린 킷트(geneclean kit; BIO 101 사)를 이용하여 겔로부터 DNA를 추출하였다.

<실시예 2>

재조합 발현 벡터 pET - rGST 의 제조

상기 실시예 1에서 분리·정제된 rGST 유전자를 NdeⅠ와 BamHⅠ로 37℃에서 24시간 동안 절단한 후, 동일한 제한효소로 절단된 pET-26b(+) 벡터(Novagen 사)에 삽입하였다. 제조된 재조합 발현 벡터를 'pET-rGST'라 명명하였다. 이후, 열충격(42℃) 방법으로 상기 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 대장균 BL21(DE3)에 도입하였다. 이후, 25㎍/㎖ 카나마이신(kanamycin)이 포함된 평판 L-브로쓰(Broth) 배지 상에서 배양하여 형질전환된 대장균을 선별하였다. 배양된 콜로니 중에서 하나를 선택하여 다시 액체 L-브로쓰 배지에서 배양한 후, 이로부터 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 NdeⅠ와 BamHⅠ로 절단한 후, 1% 아가로그 겔 전기영동을 수행하여 rGST 유전자의 도입 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 절단된 pET-rGST에서 pET-26b(+) 벡터(5360bp) 및 rGST 유전자(669bp)의 크기에 해당하는 2개의 밴드가 나타남을 확인할 수 있었다.

<실시예 3>

재조합 rGST 유전자의 염기서열 분석

상기 실시예 2에서 대장균에 도입된 것으로 확인된 rGST 유전자의 염기서열 분석은 코아바이오시스템(주) 부설 생명과학연구소의 ADD377(USA)를 이용하여 수행하였다. 이 때 서열 분석용 프라이머로는 pET-26b(+) 벡터 내에 존재하는 T7 프로모터 프라이머(#69348-1, 코아바이오시스템(주))와 T7 터미네이터 프라이머(#69337-1, 코아바이오시스템(주))을 사용하였으며, 각 프라이머의 서열은 서열번호 3과 서열번호 4로 각각 기재하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 재조합 rGST 유전자는 총 669bp의 염기로 구성되었으며, 이의 염기서열을 서열번호 5로 기재하였다. 또한, 서열번호 5의 염기서열로부터 암호화되는 단백질의 염기서열을 서열번호 6으로 기재하였다. 본 발명에 따른 재조합 rGST 유전자의 염기서열을 진뱅크 등록번호 AF309382에 개시된 '추정되는 글루타치온 S-전이효소 OsGSTF5'의 CDS 염기서열과 비교한 결과, 99%의 상동성을 나타냄을 확인하였다. 이로부터 본 발명에 따른 재조합 rGST 유전자의 클로닝이 정확하게 이행되었음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에 따른 재조합 rGST 유전자의 염기서열을 다른 종의 GST 유전자의 염기서열들과 비교한 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 옥수수(Zea mays)의 GST(진뱅크 등록번호: AF244673)와는 71%, 다른 옥수수(maize)의 GST(진뱅크 등록번호: P46420)와는 60%, 그리고 밀(Triticum aestivum)의 GST(진뱅크 등록번호: CAD11966)와는 54%의 서열 상동성을 나타내었다.

<실시예 4>

대장균에서의 재조합 GST 단백질의 대량 발현

먼저, 상기 실시예 3에서 얻은 형질전환체(pET-rGST가 도입된 대장균)를 카나마이신 25㎍/㎖가 첨가된 10㎖의 액체 L-브로쓰 배지에서 37℃, 200rpm으로 종배양하였다. 이후, 카나마이신이 첨가된 1ℓ의 L-브로쓰에 상기 종배양액을 1%가 되도록 접종하였다. 37℃에서 배양하면서 일정 시간마다 OD₆₀₀(optical density) 값을 측정하였다. OD₆₀₀ 값이 0.3 내지 0.4 정도가 되었을 때 발현유도제인 IPTG를 최종농도가 0.4mM이 되도록 첨가하였다. IPTG 첨가 후, 11시간 정도 더 배양하여 재조합 GST 단백질의 대량 발현을 유도하였다. 배양이 끝난 후, 배양액을 냉동원심분리기를 이용하여 4℃, 10,000g, 10분간 집균하여 -20℃에서 냉동보관하였다.

<실시예 5>

재조합 GST 단백질의 정제

냉동 보관된 균체를 용해 완충용액(lysis buffer; 20mM potassium phosphate buffer, pH 7.0) 10㎖로 균질화시켰다. 이후, 소니케이터(sonicator)를 이용하여 4℃, 30~40 watts, 앰플리튜드(amplitude) 8%의 조건으로 10분간 세포막을 파괴하였다. 그리고 나서, 20,000rpm, 4℃로 20분간 원심분리하여 다른 세포 불순물들이 제거된 조추출물(crude extract)을 수득하였다. GSH-세파로즈 비드(sepharose bead)를 2M NaCl로 충분히 세척한 다음, 컬럼에 충진시켰다. 이후, 상기 용해 완충용액을 이용하여 컬럼을 평형화(equilibrium)시킨 후, 원심분리한 상층액을 2-3회 흘려주었다. 그리고 나서, 컬럼 내의 불필요한 단백질을 제거하기 위해 50mM 염화칼륨을 함유하는 용해 완충용액으로 세척하였다. 이 때 세척은 세척된 액의 OD₂₈₀ 값을 측정하여 OD₂₈₀ =0이 될 때까지 세척하였다. 이후, 10mM GSH를 함유하는 50mM 트리스-염산(Tris-Cl) 완충용액(pH 8.0)을 이용해 컬럼에 붙어있는 재조합 GST 단백질을 용출시켰다. 이 때 2㎖씩 10개의 분획(fraction)을 수득하였다. 이후, GST 활성 측정을 위해, 200mM 인산 칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer, pH 6.5)에 1mM GSH, 1mM CDNB, 그리고 용출된 각 분획의 효소 용액을 첨가하여 반응시킨 후, 자외선/가시광선 분광광도계(UV/VIS spectrophotometer)를 이용하여 340nm에서 1분 동안의 흡광도 변화를 측정하였다. 효소 활성 단위는 1분당 1μmol의 반응 생성물의 형성을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다. 또한, Bio-Rad 사의 단백질 정량 시약을 이용하여 단백질 정량을 수행하였다(595nm에서 흡광 측정). 그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 4번 분획에서 GST 활성 및 단백질 양이 가장 높은 것으로 확인되었다. 또한, 12.5% SDS-PAGE를 실시하여 정제된 재조합 GST 단백질의 순수도를 확인하였다. 그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 약 28kDa에서 단일 밴드가 나타남을 확인할 수 있었다.

하기 표 4는 조추출물과 정제된 재조합 GST 단백질의 총 활성, 총 단백질 양, 비활성, 수율 및 정제도를 비교하여 나타낸 것이다.

조추출물과 정제된 재조합 GST 단백질의 비교

	총활성(unit)	총 단백질 양(mg)	비활성(unit/mg)	수율(%)	정제도(fold)
조추출물	16.80	24.0	0.07	100	1
정제된 재조합 GST 단백질	8.84	5.4	0.41	52	6

상기 표 4에 기재된 바와 같이, 조추출물의 비활성은 0.07unit/mg이었으나, GSH-세파로즈를 통해 정제한 결과, 0.41unit/mg으로 약 6배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 정제된 재조합 GST 단백질의 수율은 52%로 계산되었다.

<실시예 6>

정제된 재조합 GST 단백질의 분자량 측정

상기 실시예 5에서 정제된 재조합 GST 단백질을 200mM 인산 칼륨 완충용액(pH 6.5)으로 평형화시킨 겔 크로마토그래피 컬럼(Superdex 200 HR fast protein liquid Chromatography column, 1.0×30cm; Pharmacia Biotech(Upsala, Sweden))에 흡착시켰다. 이후, 상기 완충용액을 0.5㎖/min의 속도로 흘려주어 용출시켰다. 이 때 분자량 표준 마커로는 블루 덱스트란(blue dextran; 2,000 kDa), 효모 알코올 탈수소효소(yeast alcohol dehydrogenase; 150 kDa), BSA(bovine serum albumin; 66 kDa), 트립신 저해제(trypsin inhibitor; 29.8 kDa) 및 싸이토크롬 C(Cytochrome c; 12.4 kDa)를 사용하였다. 그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, 수퍼덱스 200 컬럼으로 정제된 재조합 GST 단백질의 분자량은 55kDa로 나타났다. 상기 실시예 5의 12.5% SDS-PAGE를 통해서는 재조합 GST 단백질의 분자량이 28kDa로 나타난 것을 고려할 때에, 본 발명에 따른 벼 유래의 재조합 GST 단백질의 활성형(active form)이 28kDa의 두 폴리펩타이드로 이루어진 동형 이량체(homo-dimer)인 것으로 사료된다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 분자량은 감자 GST의 분자량(26kDa)(Karoline and Gunter Eur . J. Biochem . 226: 619-626, 1993)과 브로콜리 GST의 분자량(27kDa)(Mary et al ., Biochem . Biophys . Acta . 1205: 29-38, 1994)과 유사하였다.

<실시예 7>

재조합 GST 단백질의 특성 분석

7-1) 기질 특이성

하기 표 5에 기재된 7종류의 기질을 사용하여 GST 활성을 측정하였다. 측정방법은 하기 표 5에 기재된 기질, 용매, GSH 및 상기 실시예 5에서 정제된 재조합 GST 단백질 20㎕를 잘 혼합한 후, 각 기질에 따른 적정 파장에서 자외선/가시광선 분광광도계를 이용하여 1분 동안의 흡광도의 변화값을 측정하였다. 이 때 총 반응 용액은 1㎖로 하였다. 효소 활성 단위는 1분당 생성물 1μmol의 형성을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다. 총 5회 측정하여 표준 편차(standard deviation)를 계산하였다.

GST 활성 측정에 사용된 기질과 이에 따른 반응 조건

기질	용매	pH	GSH(mM)	파장(nm)	흡광 계수(absorbancecoefficient; mM-1cm-1)
1mM CDNB	200mM KPB*	6.5	1	340	9.6
1mM DCNB	200mM KPB	7.5	5	345	8.5
0.2mM ETA	200mM KPB	6.5	0.25	270	5
0.5mM EPNP	200mM KPB	6.5	5	360	0.5
0.1mM 스테로이드	100mM KPB	6.5	6	248	16.3
0.1mM 4-NPB	200mM KPB	6.5	5	310	1.2
1.5mM CP	200mM 인산 나트륨완충용액	7.0	1	340	6.6

* KPB: 인산 칼륨 완충용액

그 결과, 하기 표 6에 기재된 바와 같이, EPNP의 비활성이 0.852μmol/min/mg로 가장 큰 값을 나타내었으며, CDNB, CP, ETA의 순으로 높은 값을 나타내었다. 그러나, 나머지 기질 DCNB와 스테로이드에 대해서는 활성을 보이지 않았다. 이로부터, 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질은 다른 기질에 비해 CDNB와 EPNP에 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다.

재조합 GST 단백질의 각 기질에 대한 비활성

기질	비활성(μmol/min/mg)
CDNB(1-Chloro-2,4-dinitrobenzene)	0.410 ±0.007
DCNB(1,2-Dichloro-4-nitrobenzene)	NDa
ETA(Ethacrynic acid)	0.013 ±0.003
EPNP(1,2-Epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy)propane)	0.852 ±0.012
스테로이드(Δ5-androstene-3,17-dione)	NDa
4-NPB(4-Nitrophenethyl bromide)	NDa
CP(Cumene hydroperoxide)	0.148 ±0.006

ND^a: 활성이 측정되지 않음

7-2) Km 값과 Vmax 값 측정

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 GSH와 CDNB에 대한 카이네틱 파라미터(kinetic parameter)를 구하기 위하여, 한 기질의 농도는 1mM로 고정시키고, 다른 한 기질의 농도를 0.2 내지 2mM의 범위(range)로 변화시키면서 기질의 농도에 따른 GST 활성도를 측정하였다. GST 활성 측정은 상기 실시예 7-1)와 동일한 방법에 따라 수행하였다. Km(Michaelis-Menten constant) 값과 Vmax(최대속도) 값은 라인위버-버크 플롯(Lineweaver-Burk plot)에 의하여 결정되었다(도 8 참조). 또한, GSH와 EPNP에 대한 카이네틱 파라미터는 각 기질의 농도를 0.2 내지 2mM과 0.01 내지 0.25mM의 범위로 하여 측정하였으며, GSH와 CP에 대한 카이네틱 파라미터는 각 기질의 농도를 0.2 내지 2mM과 0.1 내지 1mM의 범위로 변화시키면서 측정하였다(도 9 및 도 10 참조). 각 기질에 대한 Km 값과 Vmax 값을 하기 표 7에 기재하였다.

각 기질에 따른 Km 값과 Vmax 값

	기질	Km(mM)	Vmax(U/mg)
GSH-CDNB	CDNB	0.55	0.2
	GSH	0.35	0.18
GSH-EPNP	EPNP	0.05	0.22
	GSH	0.84	0.26
GSH-CP	CP	0.16	0.20
	GSH	0.34	0.19

7-3) 저해 효과 측정

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 GSH-CDNB 결합(conjugation)에 대한 저해제의 저해 효과를 알아보기 위하여, IC ₅₀ 값을 측정하였다. 이를 위해, 200mM 인산 칼륨 완충용액(pH 6.5)에 1mM GSH와 CDNB를 넣은 후, 저해제의 농도를 변화시키면서 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질을 넣어 30℃에서 2분간 반응을 시켰다. 저해제로는 GSH의 경쟁적 저해제인 S-헥실-GSH(S-hexyl-GSH)와 CDNB에 대한 경쟁적 저해제인 베나스타틴 A(Benastatin A)를 사용하였다. 또한, 반응 생성물에 대한 저해제로는 DNP-SG(S-(2,4-dinitrophenyl)glutathione)을 사용하였다. 또한, 비기질 리간드(non-substrate ligand)로 작용하는 헤마틴(hematin)과 IAA(indole-3-acetic acid)도 저해제로 사용하였다. 총 5회 측정하여, 각 결과에 대한 표준편차를 계산하였다. 계산된 IC ₅₀ 값을 하기 표 8에 기재하였다.

각 저해제의IC ₅₀ 값

저해제	I 50 (μM)
S-헥실-GSH(S-hexyl-GSH)	1.25 ±0.03
베나스타틴 A(Benastatin A)	1.36 ±0.05
DNP-SG(S-(2,4-dinitrophenyl)glutathione)	18.92 ±0.02
헤마틴(hematin)	3.49 ±0.03
IAA(indole-3-acetic acid)	1.25 ×103 ±2.30

그 결과, 상기 표 8에 기재된 바와 같이, S-헥실-GSH의 IC ₅₀ 값이 가장 낮은 것으로 확인되었다. 반면, IAA는 별 다른 저해 효과를 미치지 못하는 것으로 나타났다.

7-4) pH의 영향

pH의 변화가 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 하기 표 9에 기재된 각 pH에 해당하는 완충용액을 사용하여 GST 활성을 측정하였다. 이때 GST 활성은 CDNB을 기질로 하여 측정하였으며, 각 pH의 완충용액에 효소가 들어가지 않은 상태를 측정하여 이를 대조구(control)로 잡았다. 또한, pH를 0.5씩 증가시켜 측정하였다.

pH에 따른 완충용액

pH 범위	완충용액
pH 4.0-6.0	200mM 구연산-나트륨 인산 완충용액(citrate-sodium phosphate buffer)
pH 6.0-8.5	200mM 인산 칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer)
pH 8.5-9.5	200mM Tris-Cl 완충용액
pH 9.5-10.5	200mM 글리신-수산화나트륨 완충용액(Glycine-NaOH buffer)

그 결과, 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 벼 유래의 재조합 GST 단백질의 최적 활성은 pH 9.0에서 나타났으며, 그 이후의 pH에서는 활성이 급격히 감소함을 확인할 수 있었다.

7-5) 온도의 영향

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 활성에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해, 표준 활성 반응 조건에서 온도를 30℃에서 80℃까지 5℃ 간격으로 증가시키면서 GST의 잔존 활성(remaining activity)을 측정하였다. 활성 측정은 200mM 인산 칼륨 완충용액(pH 6.5)을 10분간 각 온도에 놓아둔 후, 재조합 GST 단백질과 1mM의 기질(GSH와 CDNB)를 첨가하여 340nm에서 측정하였다. 그 결과, 최적 활성은 45℃에서 나타났으며, 이 때의 활성을 100으로 하고 다른 온도에서의 활성을 상대적으로 계산하여 도 12에 도시하였다.

7-6) 열에 대한 안정성

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여, 20nM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.0)에 효소액(재조합 GST 단백질)을 첨가한 후, 상기 혼합액을 각 온도(30℃에서 80℃까지 5℃ 간격을 증가시킴)에서 10분간 정치하였다. 이후, 100mM 인산 칼륨 완충용액(pH 6.5)에 1mM GSH와 CDNB, 상기 가열한 효소액, 그리고 열에 의한 산화를 방지하기 위한 3mM DTT와 EDTA를 첨가하여 GST의 잔존 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 13에 도시된 바와 같이, 52℃에서 50%의 잔존 활성을 나타내었으며, 80℃에서는 15% 미만의 잔존 활성을 보였다. 이집트콩(chickpea)의 GST의 경우 80℃에서 활성을 거의 잃고 60℃에서 50%의 잔존 활성을 나타내었다는 연구 결과(Abdelrahim and Bassam, Phytochemistry, 29: 2431-2435, 1990)를 고려할 때에 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질은 비교적 높은 열 안정성을 가지는 것을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 벼로부터 GST 유전자를 클로닝하여 상기 유전자를 대량 발현시키기 위한 재조합 발현 벡터를 제조하였다. 또한, 상기 벡터로 형질전환시킨 대장균에서 재조합 GST 단백질이 발현됨을 확인하고, 상기 단백질을 분리·정제하여 이의 특성을 규명하였다. 본 발명에 따른 방법에 따라 대장균 내에서 대량 생산된 벼 유래의 재조합 GST 단백질은 제초제, 농약 또는 약물 등에 의한 식물 세포 내 해독 대사 과정 분석에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 표적분자 또는 종양 마커(cancer marker)로서 화학요법 분야의 진단 및 이를 필요로 하는 다양한 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질을 발현시키기 위한, 재조합 발현 벡터 pET-rGST의 제조과정을 나타낸 모식도이다.

rGST: 벼의 GST 유전자

도 2는 PCR에 의해 증폭된 rGST 유전자의 단편을 확인하기 위해 1% 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과를 나타내는 겔 사진이다.

레인 M_a: λ-DNA/HindⅢ 분자량 마커

레인 1: 증폭된 rGST 유전자

레인 M_b: φX174/HincⅡ 분자량 마커(1057bp, 770bp, 612bp, 459bp...)

도 3은 pET-rGST 벡터 내에 삽입된 rGST 유전자를 확인하기 위하여, 상기 벡터에 NdeⅠ 및 BamHⅠ을 처리하여 1% 전기영동을 수행한 결과를 나타내는 겔 사진이다.

레인 M: λ-DNA/HindⅢ 분자량 마커

레인 1: 제한효소를 처리하지 않은 pET-rGST

레인 2: 제한효소를 처리한 pET-rGST

도 4는 본 발명에 따라 벼로부터 클로닝된 rGST 유전자의 염기서열을 다른 종의 GST 유전자의 염기서열과 비교하여 도시한 것으로서, 염기서열이 일치하는 부분은 검정색 음영으로 표시하였다.

A: 본 발명의 rGST 유전자

B: 옥수수(Zea mays)의 GST 유전자(진뱅크 등록번호: AF244673)

C: 옥수수(Maize)의 GST 유전자(진뱅크 등록번호: P46420)

D: 밀(Triticum aestivum)의 GST 유전자(진뱅크 등록번호: CAD11966)

도 5는 GSH-세파로즈 친화 크로마토그래피에 의해 수득된 각 분획의 GST 활성 및 단백질 양을 나타낸 그래프이다.

-●-: GST 활성

-■-: 단백질 양

도 6은 조추출물로부터 정제된 재조합 GST 단백질을 확인하기 위하여, 12.5% SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타내는 겔 사진이다.

레인 M: 분자량 마커

레인 1: 조추출물

레인 2: GSH-세파로즈 친화 크로마토그래피로 정제된 재조합 GST 단백질

도 7은 수퍼덱스 200 컬럼(superdex 200 column)에 의해 정제된 재조합 GST 단백질의 분자량을 나타내는 그래프이다.

A: 블루 덱스트란(2,000kDa)

B: 효모 알코올 탈수소효소(150kDa)

C: BSA(66kDa)

D: 트립신 저해제(29.8kDa)

E: 싸이토크롬 C(12.4kDa)

도 8은 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질에 의한 GSH-CDNB의 라인위버-버크 플롯(Lineweaver-Burk plot)이다.

A: CDNB B:GSH

도 9는 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질에 의한 GSH-EPNP의 라인위버-버크 플롯이다.

A: EPNP B:GSH

도 10은 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질에 의한 GSH-CP의 라인위버-버크 플롯이다.

A: CP B:GSH

도 11은 pH 변화에 따른 재조합 GST 단백질의 활성 변화를 나타내는 그래프이다.

-●-: 구연산-나트륨 인산 완충용액(pH 4.0 ~ 6.0)

-■-: 인산 칼륨 완충용액(pH 6.0 ~ 8.5)

-▲-: 트리스-염산 완충용액(pH 8.5 ~ 9.5)

-◆-: 글리신-수산화나트륨 완충용액(pH 9.5 ~ 10.5)

도 12는 온도 변화에 따른 재조합 GST 단백질의 활성 변화를 나타내는 그래프이다.

도 13은 재조합 GST 단백질의 열에 대한 안정성을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.

<110> KONG, Kwang Hoon <120> Recombinant glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same <130> 02DMP0005 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer N for PCR <400> 1 ggaattccat atgaaagtgt acgggtgggt ggta 34 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer C for PCR <400> 2 cgcggatccg ctactatggt atgttcccac ttccgaa 37 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 promoter primer <400> 3 taatacgact cactata 17 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 terminator primer <400> 4 gctagttatt gctcagcgg 19 <210> 5 <211> 669 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 5 atgaaagtgt acgggtgggt ggtatcgcca tggatggcgc gggtgctggt ggccctggag 60 gaggccggcg ccgagtacga ggtcgttccg atgagcaggt ccggcggcga ccaccgccgg 120 ccggagcacc tcgccagaaa cccgttcggt gagattccag tactggagga tggcgacctg 180 acgctctatc aatcgcgagc aatcgctagg tacatctttc gcaagtacaa accagagttc 240 ctgggactcg gagaaggtgg aagcctggag gagtcggcaa tggtggacgt gtggctggac 300 gtggaagccc accagcacga ggccgccgtg aggcccatcc tgtggcactg catcatcaac 360 aagttcgagg gccgcgaccg cgaccagggc gtcgtggacg agagcgtccg gaagctggag 420 aaggtgctcg gggtgtacga ggcgaggctg tcgggctcca ggtacctcgc cggcgaccgc 480 atcagcctcg cggacctcag ccacttctcc aacatgcgct acttcatggc gacggagtac 540 gccggcgtgg tcgacgcgta cccgcacgtg aaggcgtggt gggaggcgct gctggccagg 600 ccgacggtgc agaaggtgat ggccggcatg ccaccggatt tcggcttcgg aagtgggaac 660 ataccatag 669 <210> 6 <211> 222 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 6 Met Lys Val Tyr Gly Trp Val Val Ser Pro Trp Met Ala Arg Val Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Glu Glu Ala Gly Ala Glu Tyr Glu Val Val Pro Met Ser 20 25 30 Arg Ser Gly Gly Asp His Arg Arg Pro Glu His Leu Ala Arg Asn Pro 35 40 45 Phe Gly Glu Ile Pro Val Leu Glu Asp Gly Asp Leu Thr Leu Tyr Gln 50 55 60 Ser Arg Ala Ile Ala Arg Tyr Ile Phe Arg Lys Tyr Lys Pro Glu Phe 65 70 75 80 Leu Gly Leu Gly Glu Gly Gly Ser Leu Glu Glu Ser Ala Met Val Asp 85 90 95 Val Trp Leu Asp Val Glu Ala His Gln His Glu Ala Ala Val Arg Pro 100 105 110 Ile Leu Trp His Cys Ile Ile Asn Lys Phe Glu Gly Arg Asp Arg Asp 115 120 125 Gln Gly Val Val Asp Glu Ser Val Arg Lys Leu Glu Lys Val Leu Gly 130 135 140 Val Tyr Glu Ala Arg Leu Ser Gly Ser Arg Tyr Leu Ala Gly Asp Arg 145 150 155 160 Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ser His Phe Ser Asn Met Arg Tyr Phe Met 165 170 175 Ala Thr Glu Tyr Ala Gly Val Val Asp Ala Tyr Pro His Val Lys Ala 180 185 190 Trp Trp Glu Ala Leu Leu Ala Arg Pro Thr Val Gln Lys Val Met Ala 195 200 205 Gly Met Pro Pro Asp Phe Gly Phe Gly Ser Gly Asn Ile Pro 210 215 220

Claims (6)

1. 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, 하기 (a) 내지 (d)의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 GST(glutathione S-transferase) 단백질.

   (a) 분자량 28kDa;

   (b) 최적 pH 9;

   (c) 최적 온도 45℃; 및

   (d) CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene), ETA(ethacrynic acid), EPNP(1,2-epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy)propane) 및 CP(cumene hydroperoxide)에 대한 기질 특이성
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 벼(Oryza sativa)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 재조합 GST 단백질.
4. 제 1항의 재조합 GST 단백질을 암호화하는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자를 포함하는, 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 발현 벡터 pET-rGST.
5. (a) 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 GST를 암호화하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 GST 유전자를 증폭시키는 단계;

   (b) 상기 증폭된 GST 유전자를 도 1의 개열지도를 갖는 pET-26b(+)에 클로닝하여 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 제조하는 단계;

   (c) 상기 재조합 발현 벡터 pET-rGST로 대장균을 형질전환하는 단계; 및

   (d) 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 GST 단백질을 발현시킨 후, 이를 수집 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1항의 재조합 GST 단백질을 대량 생산하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 (d) 단계의 수집 및 정제는 글루타치온-세파로즈 친화 크로마토그래피(glutathione-sepharose affinity chromatography)를 이용하여 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.