PT1369476E - Nova proteína, gene que a codifica e método de utilização da mesma - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"NOVA PROTEÍNA, GENE QUE A CODIFICA E MÉTODO DE UTILIZAÇÃO DA MESMA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma nova proteína tendo uma actividade antifúngica e um método para a sua produção, um gene codificando a proteína e um método de utilização da proteína e gene. Especificamente, refere-se a uma proteína originada de Pleurotus cornucopiae tendo uma actividade antifúngica contra, pelo menos, a piriculariose do arroz (Magnaporthe grisea), um gene codificando a proteína e um método de utilização da proteína e gene. 0 presente pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Japonesa N° 2001-68894, apresentado em 12 de Março de 2001.

ESTADO DA TÉCNICA ANTERIOR

As enzimas líticas, tais como quitinase e β-l,3-glucanase, são conhecidas como proteínas vegetais tendo uma actividade antifúngica contra microrganismos patogénicos de plantas. Experiências in vitro mostraram que estas enzimas podem exercer o efeito, se empregues isoladamente (Schlumbaum et al. (1986), Nature 324, p. 365-367), porém um efeito melhorado pode ser, em 1 geral, obtido se for utilizada uma combinação de duas ou mais dessas enzimas (Mauch et al. (1988), Plant Physiol. 88, p. 936-942). Sabe-se que a concentração de inibição de crescimento destas enzimas liticas contra fungos filamentosos deverá ser, de um modo típico, cerca de várias dezenas a várias centenas de pg/mL, quando utilizadas isoladamente, ou cerca de vários pg/mL por enzima, quando utilizadas em combinação. Contudo, nenhuma destas enzimas liticas foi referida como tendo um efeito antifúngico contra a piriculariose do arroz (Magnaporthe grisea) que causa danos extensos às colheitas de arroz.

Os péptidos antifúngicos (AFP) de baixo peso molecular, tal como defensina, também têm uma actividade antimicrobiana. Entre estes, Ca-AMPl (Pedido de Patente Japonesa N° 505048/96), CB-1 (Oita et al. (1996), Biosci. Biotech. Biochem. 60, p. 481-483), Rs-AFPl e Rs-AFP2 (Terras et al. 1992, J. Biol. Chem. 267, p. 15301-15309) e Ace-AMPl (Pedido de Patente Japonesa N° 501424/97) foram referidos como tendo um efeito antifúngico contra a piriculariose do arroz. Estes péptidos de baixo peso molecular inibem 50% do crescimento de diversos microrganismos patogénicos de plantas, incluindo aquele anteriormente mencionado, a uma concentração na ordem de vários pg/mL.

Também foram feitas tentativas para criar uma planta resistente às doenças, através do isolamento do gene para uma enzima lítica ou um péptido antifúngico de baixo peso molecular e transfecção do mesmo para uma planta (Broglie et al. (1991), Science 254, p. 1194-1197; Terras et al. (1995), The Plant Cell 7, p. 573-588) . Um estudo recente do arroz referiu que arroz transformante, obtido por sobreexpressão de quitinase derivada 2 de arroz, exerceu resistência aumentada à piriculariose do arroz (Nishizawa et ai. (1999) Theor. Appl. Genet. 99: 383-390).

Também foram referidas outras plantas resistentes a microrganismos patogénicos criadas por introdução génica, tais como para a proteína PR (Alexander et ai. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: p. 7327-7331), glucose oxidase (Wu et ai. (1995) Plant Cell 7: p. 1357-1368), estilbeno sintase (Hain et ai. (1993) Nature 361: p. 153-156), etc.

Contudo, muitos casos existentes não obtêm plantas transgénicas tendo resistência, sob um aspecto prático, aceitável. Isto pode ser atribuído ao baixo nível de expressão dos transgenes e, mais essencialmente, à baixa actividade antifúngica das proteínas antifúngicas referidas até à data. Por conseguinte, seria desejável identificar e aplicar, sob um aspecto prático, uma proteína antifúngica mais potente do que as convencionais.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO É um objectivo da presente invenção pesquisar e identificar uma nova proteína antifúngica, capaz de inibir o crescimento de diversos microrganismos patogénicos de plantas, incluindo a piriculariose do arroz (Magnaporthe grisea) que causa extensos danos às culturas de arroz. É outro objectivo da presente invenção clonar um gene codificando a referida nova proteína e determinar a sua sequência nucleotídica. 3 É ainda outro objectivo da presente invenção introduzir o gene da presente invenção num organismo hospedeiro (microrganismo, animal, planta, etc.), de modo a criar um transformante e, desse modo, colocar em utilização prática o gene da presente invenção. É ainda outro objectivo da presente invenção proporcionar um agente antifúngico contendo a proteína antifúngica da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 mostra a aparência da inibição de crescimento de M. grisea pela proteína antifúngica da presente invenção (culturas de 48 horas, na presença de uma fracção de proteína aquecida a 80 °C, durante 10 minutos). A FIG. 2 mostra padrões electroforéticos de fracções de proteína de Pleurotus cornucopiae, separadas por uma coluna FF Q-Sepharose, em relação a uma actividade antifúngica. M representa um marcador de peso molecular e FT representa a fracção tendo passado através da coluna. Os símbolos (-, +, ++) por baixo dos corredores indicam a potência da actividade antifúngica. As actividades antifúngicas mostradas entre parênteses pertencem a fracções que não aquelas purificadas, descritas na presente invenção. A FIG. 3 mostra um gráfico de separação da proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae, por coluna MonoQ, em relação a uma actividade antifúngica. As posições de eluição mostrando a actividade antifúngica são indicadas por +. 4 A FIG. 4 mostra padrões electroforéticos de proteína de

Pleurotus cornucopiae, separada por uma coluna Mono Q, em relação a uma actividade antifúngica. Os números por cima dos corredores correspondem aos números de fracção na Fig. 3, M representa um marcador de peso molecular e Ori representa a fracção Q-Sepharose aplicada em Mono Q. Os símbolos (-, + , + + , +++) por baixo dos corredores indicam a potência de uma actividade antifúngica. As setas indicam a proteína antifúngica (15 kDa) . A FIG. 5 mostra um gráfico de separação da proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae, por Superose 6, em relação a uma actividade antifúngica. As setas indicam as posições de eluição do Padrão de filtração em gel (BIO-RAD). As posições de fracções mostrando a actividade antifúngica são indicadas por +. A FIG. 6 mostra padrões electroforéticos de proteína de

Pleurotus cornucopiae, purificada por Superose 6, em relação a uma actividade antifúngica. Os números por cima dos corredores correspondem aos números de fracção na Fig. 5, Ori representa a fracção MonoQ aplicada em Superose 6 e M representa um marcador de peso molecular. Os símbolos (-, +, ++,) por baixo dos corredores indicam a potência de uma actividade antifúngica. A seta indica a proteína antifúngica (15 kDa). A FIG. 7 mostra uma árvore taxonómica molecular das sequências de aminoácidos (regiões de proteínas maduras) de tamavidina 1 e tamavidina 2, estreptavidina e o seu homologo, e avidina. A FIG. 8 mostra os resultados de experiências de abolição de uma actividade antifúngica por adição de biotina. Esporos de 5 M. grisea suspensos em 1/2 PD foram colocados em placas de microtitulação. Poços contendo 1000 ng/mL de tamavidina 1 purificada, estreptavidina e avidina, ou poços contendo biotina a 100 ng/mL, adicionalmente a estas proteinas às mesmas concentrações, ou poços não contendo proteína, foram preparados e incubados, a 28 °C, durante 48 horas. Também são mostrados os poços contendo 50 ng/mL de tamavidina 1 purificada. A FIG. 9 mostra a purificação de tamavidina 2 recombinante expressa em E. coli numa coluna de iminobiotina. C representa a fracção de proteína solúvel total de E. coli que não foi induzida por IPTG e T representa a fracção de proteína solúvel

total de E. coli induzida por IPTG a 1 mM. F representa a fracção de proteína tendo passado através da coluna de iminobiotina, sem ligação à coluna, obtida da fracção de proteína solúvel total de E. coli induzida por IPTG a 1 mM, W representa a fracção eluída através de lavagem da coluna e E representa a fracção eluída com um tampão acídico. As setas indicam a proteína tamavidina 2 (cerca de 15 kDa) e M representa um marcador de peso molecular (kit marcador LMW: Pharmacia LKB).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, apenas, a proteínas antifúngicas de acordo com as sequências referidas nas reivindicações, genes codificando estas proteínas antifúngicas, métodos de produção destas proteínas, métodos para o isolamento destes genes, vectores recombinantes compreendendo estes genes, assim como transformantes obtidos através da introdução destes vectores recombinantes num organismo hospedeiro. A referida proteína antifúngica da presente invenção é designada 6 tamavidina 1. A proteína muito estreitamente relacionada, tamavidina 2, também foi isolada no decurso da presente invenção mas não é reivindicada e não está dentro do âmbito de protecção da presente invenção. Contudo, para reforçar e para uma melhor compreensão, a descrição também se refere, parcialmente, ao isolamento de tamavidina 2. As proteínas e sequências referindo-se a estas proteínas, são apenas incluídas para efeitos de referência mas não estão abrangidas pelo âmbito da presente invenção.

Com o objectivo de resolver os problemas anteriormente descritos, a presente requerente primeiro estabeleceu um sistema de ensaio para avaliação de uma actividade antifúngica in vitro contra a piriculariose do arroz.

Depois, as fracções de proteína foram extraídas de um cogumelo comestível, Pleurotus cornucopiae, e submetidas ao ensaio antifúngico, de modo a identificar fracções de proteínas antifúngicas e isolar e purificar uma proteína antifúngica, através de combinação de cromatografia de permuta iónica e filtração em gel. As sequências de aminoácidos parciais da proteína purificada foram determinadas, com base nas quais foram sintetizadas as sequências de oligo ADN e, depois, um ADNc de comprimento parcial codificando a proteína foi obtido por RT-PCR. Depois, uma biblioteca de ADNc de carpóforo de Pleurotus cornucopiae foi rastreada através da utilização do ADNc de comprimento parcial como uma sonda, de modo a identificar um ADNc de comprimento completo codificando a proteína e a sua sequência nucleotídica total foi determinada. Deste modo, a sequência de aminoácidos total da proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae e a sequência nucleotídica 7 de um gene que a codifica foram identificadas, completando, desse modo, a presente invenção.

Consequentemente, um primeiro aspecto da presente invenção proporciona uma proteína antifúngica que pode ser obtida de fracção (fracções) precipitada(s) pelo método de precipitação de sulfato de amónio, utilizando um extracto aquoso de Pleurotus cornucopiae, em que a referida proteína tem uma actividade antifúngica contra, pelo menos, a piriculariose do arroz, e apresenta um componente tendo um peso molecular de cerca de 15 kDa, como determinado pelo método de SDS-PAGE. A proteína antifúngica da presente invenção é, de um modo típico, caracterizada pela sequência de 143 aminoácidos mostrada na SEQ ID N° 2 na Listagem de sequências incluída em anexo. Esta proteína compreende uma unidade de um polipéptido tendo um peso molecular de cerca de 15 kDa, como estimado por SDS-PAGE (correspondendo a um polipéptido consistindo nos aminoácidos 8-143 na sequência da SEQ ID N° 2 na Listagem de sequências). Esta proteína também foi identificada como uma proteína caracterizada por um peso molecular de cerca de 30 kDa, como determinado por coluna de filtração em gel. A presente descrição também descreve uma proteína tendo 141 aminoácidos mostrados na SEQ ID N° 4 na Listagem de sequências. A proteína tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 4 também compreende uma unidade de um polipéptido tendo um peso molecular de cerca de 15 kDa, como estimado por SDS-PAGE, e tem um peso molecular de cerca de 30 kDa, como determinado por coluna de filtração em gel, semelhante à proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2. A proteína antifúngica da presente invenção inclui proteínas antifúngicas tendo, não apenas a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2, mas também uma sequência de aminoácidos contendo uma ou mais modificações de aminoácidos, em comparação com a sequência original ou uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de 90% ou mais, com a sequência original e mostrando uma actividade antifúngica contra a piriculariose do arroz. A proteína antifúngica da presente invenção tem, de um modo preferido, uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de, de um modo preferido, 95% ou mais com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2 na Listagem de sequências. A definição da "proteína tendo uma homologia de 90% ou mais" com cade sequência de aminoácidos específica, como referido em relação à proteína antifúngica da presente invenção, significa que pode ter uma homologia de 90% ou mais, de um modo muito preferido, 95% ou mais.

Um segundo aspecto da presente invenção proporciona uma proteína antifúngica, compreendendo um polipéptido consistindo numa sequência de aminoácidos parcial da SEQ ID N° 2 na Listagem de sequências, e. g. , um polipéptido consistindo numa sequência de aminoácidos parcial 8-143 da SEQ ID N° 2. A descrição também se refere a uma sequência de aminoácidos parcial 8-141 da SEQ ID N° 4; e um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos contendo uma ou mais alterações de aminoácidos, em qualquer uma das referidas sequências de aminoácidos ou um polipéptido tendo uma homologia de 90% ou mais com qualquer uma das referidas sequências de aminoácidos e mostrando uma actividade antifúngica contra a piriculariose do arroz. 9

Um terceiro aspecto da presente invenção proporciona um método para a produção da proteina antifúngica da presente invenção que compreende: a recolha de fracção (fracções) de extracto aquoso de Pleurotus cornucopiae, precipitado pelo método de precipitação de sulfato de amónio, utilizando sulfato de amónio saturado a 75%; e a aplicação da(s) referida(s) fracção (fracções) a uma coluna de cromatografia de permuta iónica, de modo a recolher a(s) fracção (fracções) eluida(s) por NaCl, a uma concentração entre 50 mM-600 mM de NaCl.

Um quarto aspecto da presente invenção proporciona um gene codificando a proteina antifúngica da presente invenção. O gene da presente invenção tem, de um modo típico, uma sequência nucleotídica consistindo nas bases 71-502 da SEQ ID N° 1 (também é aqui descrita uma sequência nucleotídica das bases 226-651 da SEQ ID N° 3) a seguir, por vezes, simplesmente referida como "a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 1 ou 3") , ou uma sequência nucleotídica hibridando-se à referide sequência nucleotídica em condições restringentes. O gene da presente invenção tem, em geral, uma sequência nucleotídica tendo, de um modo preferido, uma homologia de 90% ou mais, de um modo muito preferido, 95% ou mais com a sequência nucleotídica das bases 71-502 da SEQ ID N° 1 ou a sequência nucleotídica das bases 226-651 da SEQ ID N° 3, a última não fazendo parte da presente invenção. 10

Um quinto aspecto da presente invenção proporciona um oligonucleótido para a obtenção de uma proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae, produzida por um método que compreende: a selecção de duas regiões a partir de uma sequência de bases de um gene codificando a proteína antifúngica da SEQ ID N° 1, com base nos seguintes requisitos; 1) o comprimento de cada das regiões é de 15-30 bases; 2) a proporção do teor de G+C na sequência de bases de cada região é 40-60%; a preparação de um ADN de cadeia simples, tendo uma sequência de bases que é idêntica à referida região ou complementar à referida região, ou a preparação de uma mistura de ADN de cadeia simples, com base na degenerescência do código genético, sem alterar uma sequência de resíduos aminoácidos codificada pelos referidos ADN de cadeia simples; e opcionalmente, a preparação de uma versão modificada dos referidos ADN de cadeia simples, a referida modificação não alterando uma especificidade de ligação dos ADN de cadeia simples à sequência de bases do gene codificando a referida proteína antifúngica. O oligonucleótido da presente invenção tem, de um modo preferido, a sequência nucleotídica de qualquer uma da SEQ ID Nos 10 a 15 na Listagem de sequências.

Um sexto aspecto da presente invenção proporciona um método para o isolamento do gene da presente invenção, que compreende a realização de uma reacção de amplificação de ácido nucleico, 11 utilizando dois tipos de oligonucleótidos anteriormente descritos, como um par de iniciadores e biblioteca de ADNc de carpóforo de Pleurotus cornucopiae como um molde para amplificar uma porção do gene codificando a proteína antifúngica da presente invenção e o rastreio da referida biblioteca de ADNc através da utilização do produto de amplificação obtido deste modo como uma sonda para isolar o clone de ADNc de comprimento completo.

Um sétimo aspecto da presente invenção proporciona um vector recombinante compreendendo o gene da presente invenção.

Quanto ao vector recombinante da presente invenção, o vector é, de um modo preferido, um vector de expressão.

Um oitavo aspecto da presente invenção proporciona um transformante, obtido pela introdução do vector recombinante da presente invenção num organismo hospedeiro.

Um nono aspecto da presente invenção proporciona um agente antifúngico, compreendendo a proteína antifúngica da presente invenção como um ingrediente activo.

FORMAS DE REALIZAÇAO PREFERIDAS DA INVENÇÃO

As formas de realização preferidas são descritas em detalhe abaixo, de modo a explicar a presente invenção. 12

Proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma proteína derivada de Pleurotus cornucopiae, tendo um efeito antifúngico contra um microrganismo patogénico de plantas. A proteína da presente invenção não está limitada a qualquer origem específica ou processo de preparação, desde que tenha características aqui definidas, isto é, a proteína antifúngica da presente invenção pode ser de ocorrência natural ou expressa a partir de ADN recombinante, por técnicas de engenharia genética ou quimicamente sintetizada. A proteína da presente invenção tem, de um modo típico, a sequência de 143 aminoácidos mostrada na SEQ ID N° 2 na Listagem de sequências. Contudo, é sabido que as proteínas naturais incluem proteínas variantes, tendo um ou mais modificações de aminoácidos resultando de diferenças em variedades dos organismos produzindo a proteína ou a mutação génica dependendo de diferenças em ecotipos ou a presença de isozimas estreitamente semelhantes. Como aqui utilizado, o termo "modificação de aminoácido" significa substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos. A presente invenção inclui a proteína tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N° 2, presumida das sequências nucleotídicas dos genes clonados, mas não está restringida a esta. Nomeadamente, pretende-se que abranja todas as proteínas homólogas tendo características aqui definidas. A homologia é 90% ou mais, de um modo muito preferido, 95% ou mais.

De um modo geral, uma proteína modificada contendo um substituto de um aminoácido para outro tendo propriedades semelhantes (tais como um substituto de um aminoácido hidrófobo 13 para outro aminoácido hidrófobo, um substituto de um aminoácido hidrófilo para outro aminoácido hidrófilo, um substituto de um aminoácido acidico para outro aminoácido acidico ou um substituinte de um aminoácido básico para outro aminoácido básico) tem, frequentemente, propriedades semelhantes àquelas da proteína original. Os métodos para a preparação de uma tal proteína recombinante tendo uma modificação desejada, utilizando técnicas de engenharia genética, são bem conhecidos dos especialistas na técnica e tais proteínas modificadas também estão incluídas no âmbito da presente invenção. Por exemplo, pode ser utilizada a mutagénese específica pontual, descrita em Molecular Cloning, 2a edição (Sambrook et al., (1989)).

Como aqui utilizada, a percentagem de homologia pode ser determinada por comparação com informação de sequência, utilizando o programa BLAST, descrito por Altschul et al. (Nucl. Acids. Res. 25, p. 3389-3402, 1997), por exemplo. Este programa está disponível a partir do sítio da Internet do National Center for Biotechnology Information (NCBI) ou a Base de Dados de ADN do Japão (DDBJ) na Internet. Diversas condições (parâmetros) para pesquisas de homologia com o programa BLAST são descritas em detalhe no sítio e as pesquisas são, normalmente, realizadas com valores predefinidos, embora algumas regulações possam ser um pouco alteradas. Alternativamente, pode ser determinada por comparação com informação de sequência, utilizando um programa de software análise de sequência genética, tais como GENETYX (Software Development Co., Ltd.) ou DNASIS (Hitachi Software Engineering).

As pesquisas de homologia foram realizadas através de bases de dados do GenBank, utilizando o BLAST para a proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae da presente 14 invenção e o seu gene, assim como os seus homólogos e proteínas tendo uma sequência de aminoácidos codificada desse modo. As pesquisas das bases de dados para a sequência de aminoácidos da primeira proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae da presente invenção (sequência de aminoácidos total da SEQ ID N° 2) revelaram correspondências para a estreptavidina v2 de Streptomyces violaceus (Acesso N° Q53533, Bayer et al. (1995) Biochim Biophys Acta 1263: p. 60-66), estreptavidina vl (Acesso N° Q53532), estreptavidina de Streptomyces avidinii (Acesso N° P22629, Argarana et al. (1986) Nucleic Acids Res 14: p. 1871-1882), etc. A homologia destas três sequências estende-se por mais de 128 aminoácidos e foi 50%, 49% e 49%, respectivamente. Também se mostrou uma homologia de 51,7% para um mutante de estreptavidina nuclear w79f (Cadeia B) (Freitag et al. (1997) Protein Sei. 6: p. 1157-1166) por mais de 120 aminoácidos. A avidina da clara de ovo (Gope et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: p. 3595-3606) e várias proteínas relacionadas com a avidina (Keinanen et al. (1994) Eur J Biochem 220: p. 615-621) também tiveram correspondência a graus de homologia inferiores. Estes factos indicam que a presente proteína é uma nova proteína.

As pesquisas das bases de dados de sequência de aminoácidos da segunda proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae da presente invenção (sequência de aminoácidos total da SEQ ID N° 4) mostraram homologia de 50%, 48% e 48% para estreptavidina v2, vl e estreptavidina, respectivamente. A presente proteína antifúngica foi denominada "tamavidina", em virtude de ser uma nova proteína semelhante a 15 estreptavidina purificada de um cogumelo comestível Pleurotus cornucopiae (Tamogitake). Aqui, o gene derivado da proteína purificada é denominado tam 1, a proteína tendo uma sequência de aminoácidos codificada desse modo é denominada tamavidina 1, um homólogo de tam 1 é denominado tam 2 e a proteína tendo uma sequência de aminoácidos, codificada desse modo, é denominada tamavidina 2.

Pensa-se que os resíduos de aminoácidos 1-7 da SEQ ID Nos 2 e 4 correspondam ao péptido condutor de um precursor da proteína antifúngica. Deste modo, os resíduos de aminoácidos 8-143 da SEQ ID N° 2 e 8-141 da SEQ ID N° 4 são formas maturadas da proteína antifúngica. Consequentemente, a presente invenção também proporciona uma proteína antifúngica compreendendo um ou uma combinação, de um polipéptido consistindo numa sequência de aminoácidos parcial da SEQ ID N° 2, isto é, aminoácidos 8-143, ou uma sequência de aminoácidos parcial da SEQ ID N° 4, isto é, aminoácidos 8-141; e um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos contendo uma ou mais modificações de aminoácidos em qualquer uma das referidas sequências de aminoácidos ou um polipéptido tendo uma homologia superior a 51% com qualquer uma das referidas sequências de aminoácidos e mostrando uma actividade antifúngica contra a piriculariose do arroz. A purificação e isolamento da proteína da presente invenção podem ser realizados combinando, de forma apropriada, métodos convencionais para purificação e isolamento de proteínas, tais como precipitação de sulfato de amónio, cromatografia de permuta iónica (Mono Q, Q sepharose ou DEAE), filtração em gel (Superose 6, Superose 12) . 16

Por exemplo, pó triturado de Pleurotus cornucopiae é extraído com um tampão e, depois, filtrado e o sobrenadante é deixado a repousar com sulfato de amónio, a uma concentração adequada, e. g., saturação de 75%, de modo a proporcionar precipitados, como descrito nos exemplos abaixo. Os precipitados são dialisados e, depois, eluídos por cromatografia de permuta iónica, utilizando um gradiente de concentração salina (e. g., NaCl a 50 mM - 600 mM) e, depois, as fracções contendo uma proteína desejada são recuperadas com base numa actividade antifúngica. As fracções tendo um peso molecular cerca de 30 kDa podem ser recuperadas por filtração em gel. A proteína antifúngica da presente invenção tem um peso molecular, mas não está limitado, a cerca de 15 kDa, como determinado por SDS-PAGE.

Alternativamente, a referida proteína pode ser obtida em quantidade de massa, através da introdução de uma sequência de ADN consistindo em 71 (ou 92) a 502 de sequência de ADN da SEQ ID N° 1 ou uma sequência de ADN consistindo em 226 (ou 247) a 651 de sequência de ADN da SEQ ID N° 3 em E. coli, leveduras ou insectos ou determinadas células animais, por técnicas de introdução conhecidas, utilizando um vector de expressão capaz de amplificação em cada hospedeiro e expressando-a. A sequência de aminoácidos desta proteína e a sequência de ADN que a codifica, aqui divulgadas, podem ser totalmente ou parcialmente utilizadas, de modo a isolar facilmente um gene codificando uma proteína tendo uma actividade fisiológica semelhante a outras espécies, de um modo preferido, fungos, de um modo mais preferido, Eumycota, incluindo cogumelos, bolores e leveduras e Basidiomycotina, incluindo muitos cogumelos, de um modo mais preferido, cogumelos de Agaricales, aos quais pertence Pleurotus cornucopiae, e. g., Pleurotus ostreatus, Lentinus 17 eclodes, Armillariella mellea, Tricholoma matsutake, cogumelos shimeji, Flammulina velutipes, Grifola frondosa, Cantharellus cibarius, Pleurotus eryngii, utilizando técnicas básicas de engenharia genética, incluindo hibridação e PCR. Em tais casos, estas novas proteínas também estão incluídas no âmbito da presente invenção.

Gene para a proteína antifúngica A presente invenção também proporciona um gene codificando a proteína antifúngica da presente invenção. 0 tipo do gene da presente invenção não está especificamente limitado, mas pode ser qualquer de ADN nativo, ADN recombinante ou ADN quimicamente sintetizado e qualquer clone de ADN genómico ou clone de ADNc. 0 gene da presente invenção tem, de um modo típico, a sequência nucleotídica mostrada na SEQ ID N° 1. Contudo, a sequência nucleotídica de um clone obtido nos exemplos mostrados abaixo é apenas um exemplo. É bem conhecido dos especialistas na técnica que os genes naturais incluem variações, resultando de diferenças em variedades dos organismos produzindo o gene, ou de menor mutação, dependendo de diferenças em ecotipos ou de menor mutação, dependendo da presença de isozimas muito semelhantes. Consequentemente, o gene da presente invenção não está limitado, apenas, àquele tendo a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 1 ou 3 na Listagem de sequências e pretende-se que abranja todos os genes codificando a proteína antifúngica da presente invenção.

Especialmente, a sequência de aminoácidos das proteínas e a sequência de ADN que a codifica aqui divulgadas, podem ser totalmente ou parcialmente utilizadas, de modo a isolar 18 facilmente a partir de outras espécies um gene codificando uma proteína tendo uma actividade fisiológica semelhante, utilizando técnicas de engenharia genética, incluindo hibridação e reacções de amplificação de ácido nucleico. Nesses casos, estes genes também estão incluídos no âmbito da presente invenção.

Pesquisas BLAST através de bases de dados do GenBank, utilizando a sequência de ADN de um gene codificando a proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae (sequência de ADN de 71-502 da SEQ ID N° 1) e a sequência de ADN de um gene codificando a segunda proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae (sequência de ADN 226-651 da SEQ ID N° 3), verificaram apenas várias sequências mostrando homologia numa gama muito curta (23 pb) mas não a sequência de ADN de estreptavidina. Isto significa que, ao nível do ADN, a sequência de ADN codificando a nova proteína da presente invenção não é altamente homóloga com a sequência de ADN de estreptavidina.

Mais especificamente, foi utilizado um programa de software de análise de sequência genética GENETYX-WIN, versão 3.2 (Software Development Co., Ltd.), de modo a analisar a homologia das sequências de aminoácidos totais das proteínas antifúngicas de Pleurotus cornucopiae do presente pedido (tamavidinas 1 e 2) com a estreptavidina (que difere das estreptavidinas v2 e vl em apenas 9 aminoácidos e 1 aminoácido, respectivamente). Como resultado, a sequência de aminoácidos de tamavidina 1, codificada por tam 1 da presente invenção, mostrou uma homologia (identidade de aminoácido) de 46,7% e a sequência de aminoácidos de tamavidina 2, codificada por tam 2, mostrou 48,1%. A homologia de sequência de ADN total (SEQ ID N° 1 e 3 na Listagem de sequências) com estreptavidina foi 53,8% para tam 1 e 51,0% para tam 2. A homologia da proteína antifúngica de 19

Pleurotus cornucopiae, codificada por tam 1 com avidina de clara de ovo, foi 31,2% na sequência de aminoácidos e 42,4% na sequência de ADN e a homologia da proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae, codificada por tam 2, com avidina de clara de ovo foi 36,2% na sequência de aminoácidos e 41,8% na sequência de ADN. A homologia entre as sequências de aminoácidos de tamavidina 1 e tamavidina 2 e a homologia entre as sequências de ADN dos genes tam 1 e tam 2 codificando-as foi 65,5% e 64,5%, respectivamente.

Em comparação com a estreptavidina, a tamavidina 1 da presente invenção e tamavidina 2 estão truncadas até aos 33 aminoácidos da extremidade N, mas todos os resíduos de triptofano (W) (Gitlin et al. (1988) Biochem. J 256: p. 279-282) e resíduos de tirosina (Y) (Gitlin et al. (1990) Biochem. J 269: p. 527-530) possivelmente envolvidos na ligação a biotina são conservados (Y 34 e 45 e W 82, 98 e 110 na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2, Y 34 e 45 e W 80, 96 e 108 na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 4).

Os pesos moleculares médios das regiões presumidas como sendo regiões de proteínas maduras (segmentos 8-143 de sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2 e 8-141 de sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 4) foram calculados em 15158,4 e 14732,2, respectivamente, próximos dos pesos moleculares médios de estreptavidina madura e avidina madura (16490,6 e 14342,9, respectivamente). A estreptavidina é derivada de Actinomyces Streptomyces avidinii e a avidina é derivada de clara de ovo de aves (Gallus gallus). As proteínas estreitamente semelhantes a estreptavidina isoladas até agora incluem as estreptavidinas vl e v2 de 20

Streptomyces violaceus (Bayer et al. (1995) Biochim Biophys Acta 1263: p. 60-66) e homólogos do gene de avidina isolados até à data incluem um gene relacionado com a avidina aviária (avrl-avr5, Keinanen et al. (1994) Eur J Biochem 220: p. 615-621) . As estreptavidinas vl e v2 diferem de estreptavidina na sequência de aminoácidos num 1 aminoácido e 9 aminoácidos, respectivamente e a proteína relacionada com avidina tem uma homologia com avidina de 68-78% na sequência de aminoácidos e 88-92% na sequência de ADN. A homologia entre estreptavidina e avidina é 29,2% na sequência de aminoácidos e 46,8% na sequência de ADN. O exemplo preferido, da proteína antifúngica da presente invenção, tamavidina 1, mas também tamavidina não fazendo parte da invenção, 2, é derivado de uma espécie das Basidiomicetas, Pleurotus cornucopiae, e tem uma homologia de 46,7% e 48,1%, respectivamente, com estreptavidina na sequência de aminoácidos e uma homologia de 31,2% e 36,2%, respectivamente, com avidina na sequência de aminoácidos, como anteriormente descrito. Deste modo, as tamavidinas 1, 2 formam um terceiro grupo distinto do grupo de estreptavidina de Actinomicetos e do grupo de avidina aviária. Tal proteína semelhante a avidina foi primeiro isolada de fontes que não actinomicetos e aves. As tamavidinas 1, 2 são proteínas semelhantes a avidina presentes em cogumelos e é provável que outras variedades de cogumelos contenham proteínas semelhantes. A sequência de aminoácidos das tamavidinas 1, 2 e as sequências de ADN de tam 1, tam 2 podem ser utilizadas para pesquisar e isolar, adicionalmente, tais proteínas e os seus genes.

As condições de hibridação utilizadas para o rastreio de genes homólogos não estão especificamente limitadas, mas são, em geral, preferidas condições restringentes, tal como várias horas 21 até, de um dia para o outro, em 5 x SSC, 5 x de solução de Denhardt, SDS a 1%, a 25-68 °C, como descrito em Current Protocols In Molecular Biology Vol. 1 (John Wiley and Sons, Inc.) ou Molecular Cloning, 2a edição (Sambrook et al. (1989)).

Aqui, a temperatura de hibridação é, de um modo mais preferido, 45-68 °C (sem formamida) ou 30-42 °C (formamida a 50%) . As condições de lavagem envolvem, e. g., 0,2 x SSC, a 45-68 °C. É bem conhecido dos especialistas na técnica que um ADN, contendo uma sequência nucleotídica tendo homologia superior a um nível predeterminado, pode ser clonado através da selecção apropriada de condições de hibridação, tais como nível de formamida, nível salino e temperatura, e a totalidade dos genes homólogos clonados deste modo, está incluída no âmbito da presente invenção.

As reacções de amplificação de ácido nucleico incluem, aqui, reacções envolvendo ciclos de temperatura, tais como a reacção de polimerização em cadeia (PCR) (Saiki et ai., 1985, Science, 230, p. 1350-1354), reacção em cadeia da ligase (LCR) (Wu et al., 1989, Genomics, 4, p. 560-569; Barringer et al., 1990, Gene, 89, p. 117-122; Barany et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 189-193) e amplificação baseada em transcrição (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86, p. 1173-1177), assim como reacções isotérmicas, tais como amplificação de deslocamento de cadeia (SDA) (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, p. 392-396; Walker et al., 1992, Nuc. Acids Res., 20, p. 1691-1696), replicação de sequência auto-sustentada (3SR) (Guatelli et al., 1990, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 87, p. 1874-1878) e sistema de replicase ζ)β (Lizardi et al., 1988, BioTechnology, 6, p. 1197-1202).

Também podem ser utilizadas outras reacções, tal como a amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (NASBA), 22 utilizando amplificação competitiva de um ácido nucleico alvo e uma sequência mutante divulgada na Patente Europeia N° 0525882. É preferido, um PCR.

Os genes homólogos clonados por hibridação ou reacções de amplificação de ácido nucleico, como anteriormente, têm, de um modo preferido, uma homologia de 60% ou mais, de um modo mais preferido, 70% ou mais, de um modo ainda mais preferido, 80% ou mais, especialmente 90% ou mais, de um modo muito preferido, 95% ou mais com a sequência nucleotidica mostrada na SEQ ID N° 1 na Listagem de sequências.

Oligonucleótido

Também é descrito um oligonucleótido para obtenção de uma proteína antifúngica, derivada de Pleurotus cornucopiae que é produzida por um método compreendendo (mas não reivindicado na presente invenção) a selecção de duas regiões a partir de uma sequência de bases de um gene codificando a proteína antifúngica da SEQ ID N°l, com base nos seguintes requisitos; 1) o comprimento de cada região é de 15-30 bases; 2) a proporção do teor de G+C na sequência de bases de cada região é 40-60%; a preparação de um ADN de cadeia simples, tendo uma sequência de bases que é idêntica à referida região ou complementar à referida região, ou a preparação de uma mistura de ADN de cadeia simples, com base na degenerescência do código genético, sem 23 alterar uma sequência de resíduos aminoácidos codificada pelos referidos ADN de cadeia simples; e opcionalmente, a preparação de uma versão modificada dos referidos ADN de cadeia simples, a referida modificação não alterando uma especificidade de ligação dos ADN de cadeia simples à sequência de bases do gene codificando a referida proteína antifúngica. 0 oligonucleótido da presente invenção pode ser utilizado para, e. g., hibridação ou reacções de amplificação, tal como PCR, utilizando adequadamente dois dos oligonucleótidos como um par iniciador para detecção ou isolamento do gene da presente invenção. 0 oligonucleótido da presente invenção tem, de um modo preferido, a sequência nucleotídica mostrada em qualquer uma da SEQ ID N° 10-19 na Listagem de sequências. As sequências nucleotídicas da SEQ ID N° 10-13 foram concebidas com base na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 9, como iniciadores de PCR para clonagem de um fragmento génico codificando uma parte da proteína e compreendem todas as bases capazes de codificarem o aminoácido. Os nucleótidos da SEQ ID Nos 14-17 são iniciadores sintetizados para progressão de iniciador, para a descodificação das sequências nucleotídicas totais dos genes tam 1 e tam 2. Os nucleótidos da SEQ ID N° 18-19 são iniciadores de PCR, preparados com base na SEQ ID N° 3 para amplificação da ORF total, de modo a construir um vector de expressão para expressão da proteína tamavidina 2 recombinante, tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 4.

Um fragmento parcial do gene da presente invenção pode ser isolado por reacções de amplificação de ácido nucleico, tal como PCR, utilizando uma biblioteca de ADNc de carpóforo Pleurotus cornucopiae como um molde, com um par apropriado dos oligonucleótidos anteriores. Um clone de ADNc de comprimento completo pode ser isolado através do rastreio da biblioteca de ADNc com um produto de amplificação obtido deste modo, como uma sonda por, e. g., hibridação de placa. Os processos e condições para as reacções de amplificação de ácido nucleico e as condições de hibridação de placa são bem conhecidos dos especialistas na técnica.

Por exemplo, podem ser utilizadas condições de hibridação de restringência bastante baixa, tais como mas não limitadas a temperatura ambiente e lavagem a concentrações salinas superiores, tal como 2 x SSC, a 37 °C, como descrito em Current Protocols in Molecular Biology Vol. 1 (John Wiley and Sons, Inc.) ou Molecular Cloning (Sambrook et al., supra).

Preparação de proteínas antifúngicas recombinantes A proteína da presente invenção tem uma actividade antifúngica muito forte. Por exemplo, inibe completamente a germinação de esporos de piriculariose do arroz (M. grisea) , a uma concentração tão baixa quanto 50 ng/mL (ver o Exemplo 4 abaixo). A esta concentração, não surge a germinação de esporos, mesmo após incubação prolongada, sugerindo que o efeito da proteína da presente invenção contra a piriculariose do arroz pode ser um efeito de morte de fungo, em vez de inibição parcial do crescimento. Do que se sabe, até à data, não foram referidas proteínas antifúngicas que consigam inibir completamente o crescimento de microrganismo patogénico a uma concentração tão baixa (na ordem de nanogramas). Nos exemplos abaixo, um patógeno do arroz muito importante, piriculariose do arroz, foi utilizado 25 como um patógeno de plantas para o ensaio antifúngico para purificação de uma proteína antifúngica, mas é altamente possível que as proteínas antifúngicas de Pleurotus cornucopiae, aqui identificadas, tenham efeitos antifúngicos comparáveis contra outro dano patogénico de plantas, tal como Rhizoctonia solani.

Deste modo, a proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae da presente invenção tem uma actividade antifúngica potente, de modo que pode ser utilizada em formulações, tais como agentes antifúngicos e pesticidas que podem conter a proteína antifúngica numa forma activa. Neste caso, a presente proteína é purificada de Pleurotus cornucopiae através da utilização de, e. g., uma coluna de permuta iónica ou uma coluna de filtração em gel, como descrito nos exemplos abaixo. Contudo, a proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae da presente invenção pode ser preparada, de um modo mais conveniente, em quantidade de massa, através da introdução e expressão de um ADN tendo a sequência nucleotídica de 71-502 da SEQ ID N° 1 ou 226-651 da SEQ ID N° 3, codificando a proteína em E. coli, leveduras, insectos ou células animais, utilizando um vector de expressão capaz de amplificação em cada hospedeiro (Exemplo 5). A presente invenção também proporciona um vector recombinante contendo o gene da presente invenção. Os métodos para inserção de um fragmento de ADN do gene da presente invenção num vector, tal como um plasmídeo, são descritos em, e. g., Sambrook, J. et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53 (1989).

Kits de ligação comercialmente disponíveis (e. g., disponíveis a partir de TAKARA SHUZO CO., LTD.) podem ser convenientemente utilizados. Os vectores recombinantes obtidos deste modo (e. g., 26 plasmídeos recombinantes) sao introduzidos em células hospedeiras (e. g., E. coli TB1, LE392 ou XL-IBlue). Métodos adequados para introdução de um plasmideo numa célula hospedeira incluem a utilização de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio/cloreto de rubidio, electroporação, electroinjecção, tratamento químico com PEG, ou semelhantes, a utilização de uma pistola de genes descrita em Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74 (1989).

Os vectores podem ser convenientemente preparados através da ligação de um gene desejado por um método padrão a um vector de recombinação disponível na técnica (e. g., ADN plasmídico) . Exemplos específicos de vectores adequados, incluem mas não estão limitados a plasmídeos derivados de E. coli, tais como pBluescript, pUC18, pUC19, pBR322, pTrc99A.

Os vectores de expressão são especialmente úteis para efeitos de produção de uma proteína desejada. Os tipos de vectores de expressão não estão especificamente limitados, desde que possam expressar um gene desejado em diversas células hospedeiras procarióticas e/ou eucarióticas, de modo a produzir uma proteína desejada mas incluem, de um modo preferido, vectores de expressão para E. coli, tais como pQE-30, pQE-60, pMAL-C2, pMAL-p2, pSE420; vectores de expressão para leveduras, tais como pYES2 (género Saccharomyces) , pPIC3.5K, pPIC9K, pA0815 (todos do género Pichia); e vectores de expressão para insectos, tais como pBacPAK8/9, pBK283, pVL1392, pBlueBac4.5.

Os transformantes podem ser preparados através da introdução de um vector de expressão desejado numa célula 27 hospedeira. As células hospedeiras adequadas não estão especificamente limitadas, desde que sejam compatíveis com vectores de expressão e transformáveis, e incluem diversas células, tais como células naturais ou células recombinantes, artificialmente estabelecidas, geralmente utilizadas no campo da presente invenção. São exemplos bactérias (Escherichia, Bacillus) , leveduras {Saccharomyces, Pichia), células animais, células de insecto, células vegetais, etc.

As células hospedeiras são, de um modo preferido, E. coli, leveduras ou células de insecto, especificamente E. coli, tais como M15, JM109, BL21; leveduras, tais como INVScl (género Saccharomyces), GS115, KM71 (todas do género Pichia); células de insecto, tais como BmN4, larvas de bicho-da-seda. Os exemplos de células animais são aqueles derivados de murganho, Xenopus, rato, hámster, linhas celulares simias ou humanas ou culturas estabelecidas a partir destas células. As células vegetais incluem aquelas derivadas de tabaco, Arabidopsis, arroz, milho, trigo, etc., mas não estão especificamente limitadas, desde que possam ser cultivadas.

Quando uma bactéria, especialmente E. coli, é utilizada como uma célula hospedeira, o vector de expressão, em geral, consiste, pelo menos, numa região promotora/operadora, um codão de iniciação, um gene codificando uma proteína antifúngica desejada, um codão de terminação, um terminador e uma unidade replicável.

Quando uma levedura, célula vegetal, célula animal ou célula de insecto é utilizada como uma célula hospedeira, o vector de expressão contém, em geral, de um modo preferido, pelo menos, um promotor, um codão de iniciação, um gene codificando 28 uma proteína antifúngica desejada, um codão de terminação e um terminador. Também pode conter um ADN codificando um péptido sinal, uma sequência estimuladora, regiões 5' e 3' não traduzidas do gene desejado, um marcador seleccionável ou uma unidade replicável, etc., se desejado.

Um codão de iniciação preferido, em vectores da presente invenção é um codão de metionina (ATG). Os codões de terminação podem ser codões de terminação convencionais (por exemplo, TAG, TGA, TAA). A unidade replicável significa um ADN capaz de replicar toda a sequência de ADN numa célula hospedeira e inclui plasmídeos naturais, plasmídeos artificialmente modificados (plasmídeos preparados a partir de plasmídeos naturais) e plasmídeos sintéticos, etc. São plasmídeos preferidos pQE30, pET ou pCAL ou suas modificações artificiais (fragmentos de ADN obtidos através de tratamento de pQE30, pET ou pCAL com endonucleases de restrição adequadas) para E. coli; pYES2 ou pPIC9K para leveduras; e pBacPAK8/9 para células de insecto.

As sequências estimuladoras e sequências terminadoras podem ser aquelas geralmente utilizadas pelos especialistas na técnica, tal como aquelas derivadas de SV40.

Em relação a marcadores seleccionáveis, os geralmente utilizados podem ser utilizados por métodos padrão. São exemplos os genes que proporcionam resistência a antibióticos, tais como tetraciclina, ampicilina, canamicina, neomicina, higromicina ou espectinomicina. 29

Os vectores de expressão podem ser preparados através de ligação consecutiva e cíclica de, pelo menos, os anteriormente descritos promotor, codão de iniciação, gene codificando uma proteína antifúngica desejada, codão de terminação e região terminadora para uma unidade replicável adequada. Neste processo, um fragmento de ADN adequado (tais como um adaptador ou outro sítio de restrição enzimática) pode ser utilizado por métodos padrão, tais como digestão com uma enzima de restrição ou ligação com T4 ADN ligase, se desejado. A introdução [transformação (transdução)] de vectores de expressão da presente invenção em células hospedeiras pode ser conduzida através da utilização de técnicas conhecidas.

Por exemplo, as bactérias (tais como E. coli, Bacillus subtilis) podem ser transformadas pelo método de Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)], o método de protoplasto [Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)] ou o método competente [J. Mol. Biol., 56, 209 (1971)]; A Saccharomyces cerevisiae pode ser transformada pelo método de Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 1927 (1978)] ou o método de lítio [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)]; as células vegetais podem ser transformadas pelo método de disco de folha [Science, 227, 129 (1985)] ou electroporação [IVature, 319, 791 (1986)]; as células animais podem ser transformadas pelo método de Graham [Virology, 52, 456 (1973)]; e as células de insecto podem ser transformadas pelo método de Summers et al. [Mol. Cell. Biol., 3, 2156-2165 (1983)] .

Os vectores de transformação de plantas são especialmente úteis para efeitos de criação de uma planta resistente às doenças, utilizando um fragmento de ADN da presente invenção. Os 30 tipos de vectores para plantas não estão especificamente limitados, desde que possam expressar o gene de interesse em células vegetais, de modo a produzir a proteína mas incluem, de um modo preferido, pBl221, pBI121 (Clontech) e vectores derivados a partir destes. De modo especial, os exemplos de vectores para a transformação de monocotiledóneas incluem pIG121Hm e pTOK233 (Hiei et al., Plant J., 6, 271-282 (1994)) e pSB424 (Komari et al., Plant J., 10, 165-174 (1996)).

As plantas transgénicas podem ser preparadas através da substituição do gene da β-glucoronidase (GUS) nos vectores anteriores com um fragmento de ADN da presente invenção, de modo a construir um vector de transformação de plantas e introduzi-lo numa planta. O vector de transformação de plantas contém, de um modo preferido, pelo menos, um promotor, um codão de iniciação, um gene desejado (uma sequência de ADN da presente invenção ou uma sua parte), um codão de terminação e um terminador. Também pode conter um ADN codificando um péptido sinal, uma sequência estimuladora, regiões 5' e 3' não traduzidas do gene desejado, uma região marcadora seleccionável etc., se desejado.

Os promotores e terminadores não estão especificamente limitados, desde que sejam funcionais em células vegetais, promotores de expressão constitutiva, entre os quais se incluem o promotor 35S, sendo inicialmente inserido nos vectores anteriores, assim como promotores para genes de actina e ubiquitina. Contudo, de um modo mais preferido, pode ser inserido um promotor indutível. Isto permite que as plantas transgénicas sejam resistentes a uma praga, através da produção da proteína apenas quando entram em contacto com a mesma. Promotores indutíveis adequados incluem promotores de genes de fenilalanina amónia-liase, quitinase, glucanase, tionina e 31 osmosina e outros promotores de genes respondendo a pragas ou stresses. Métodos para a transdução génica numa planta incluem a utilização do Agrobacterium (Horsch et al., Science, 227, 129 (1985); Hiei et al. , Plant J., 6, p. 271-282 (1994)), electroporação (Fromm et al., Nature, 319, 791 (1986)), PEG (Paszkowski et al. , EMBO J., 3, 2717 (1984) ) , micro-injecção (Crossway et al., Mol. Gen. Genet. 202, 179 (1986)), bombardeamento de partículas (McCabe et al., Bio/Technology, 6, 923 (1988)) mas não estão especificamente limitados, desde que sejam adequados para transfecção de um gene numa planta desejada. As espécies de plantas hospedeiras também não estão especificamente limitadas, desde que sejam compatíveis com os vectores de transformação de plantas da presente invenção e transformáveis, especificamente plantas geralmente utilizadas no campo da presente invenção, e. g., dicotiledóneas, tais como tabaco, Arabidopsis, tomate, pepino, cenoura, soja, batata, beterraba, nabo, couve Chinesa, colza, algodão e petúnia; e monocotiledóneas, tais como arroz, milho e trigo. A proteína da presente invenção pode ser expressa (produzida) através do cultivo de células transformadas contendo um vector expressão, preparado como anteriormente descrito, num meio nutriente. 0 meio nutriente contém, de um modo preferido, uma fonte de carbono, azoto inorgânico ou azoto orgânico, necessária para o crescimento das células hospedeiras (transformantes) . Exemplos de fontes de carbono incluem, e. g. , glucose, dextrano, amido solúvel, sacarose e metanol. Exemplos de fontes de azoto inorgânico ou orgânico incluem sais de amónio, nitratos, aminoácidos, água de maceração de milho, peptona, caseína, extracto de carne, farinha de soja e extracto 32 de batata. Se desejado, podem estar contidos outros nutrientes (e. g., sais inorgânicos, tais como cloreto de sódio, cloreto de cálcio, di-hidrogenofosfato de sódio e cloreto de magnésio; vitaminas; antibióticos, tais como tetraciclina, neomicina, ampicilina e canamicina). A incubação ocorre por técnicas conhecidas na técnica. As condições de incubação, tais como temperatura, o pH do meio e o período de incubação são seleccionadas, de forma apropriada, de modo a produzir a proteína da presente invenção em quantidade de massa. Para expressão em E. coli, as condições de incubação para expressão de uma proteína recombinante incluem mas não estão limitadas a incubação a uma temperatura de 4-40 °C e indução com IPTG a 0,01-5,0 mM. A proteína da presente invenção pode ser obtida das culturas como se segue. Quando a proteína da presente invenção se acumula em células hospedeiras, as células hospedeiras são recolhidas por centrifugação ou filtração, ou semelhantes, e suspensas num tampão adequado (e. g., um tampão, tais como cerca de 10 M - 100 mM de tampão Tris, tampão de fosfatos, tampão HEPES ou tampão MES, a um pH dependendo do tampão utilizado mas, de um modo desejado, na gama de pH 5,0 - 9,0), depois, as células são dissociadas por um método adequado para as células hospedeiras utilizadas e centrifugadas, de modo a recolher o conteúdo das células hospedeiras. Quando a proteína da presente invenção é segregada no exterior das células hospedeiras, as células hospedeiras e o meio de cultura são separados por centrifugação ou filtração, ou semelhantes, de modo a proporcionar um filtrado de cultura. Os lisados de célula hospedeira ou os filtrados de cultura podem ser utilizados para 33 isolar/purificar a proteína da presente invenção, directamente ou após precipitação de sulfato de amónio e diálise.

Um método de isolamento/purificação é como se segue. Quando a proteína de interesse é marcada com 6 x histidina, GST, proteína de ligação a maltose, ou semelhantes, podem ser utilizados métodos convencionais baseados em cromatografia de afinidade adequados para cada marcador. Como um exemplo não limitativo, uma proteína antifúngica recombinante marcada com 6 x histidina na extremidade N foi expressa no Exemplo 4 abaixo. Esta proteína recombinante foi purificada utilizando Ni-NTA agarose (Qiagen), tendo afinidade para 6 x histidina. Quando a proteína da presente invenção é produzida sem a utilização destes marcadores, pode ser utilizado, por exemplo, o método descrito em detalhe nos exemplos abaixo, baseado em cromatografia de permuta iónica. Estes métodos podem ser combinados com cromatografia de filtração em gel ou hidrófoba, cromatografia isoeléctrica ou semelhantes. Também pode ser aplicada a purificação numa coluna de afinidade de iminobiotina, como descrito por Hofmann et al., (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: p. 4666-4668 (1980)). No Exemplo 5 abaixo, a proteína recombinante, tamavidina 2, foi obtida a um rendimento de 1 mg a partir de 50 mL de culturas de E. coli.

As proteínas antifúngicas da presente invenção, obtidas por técnicas de engenharia genética ou purificadas de fontes naturais, como anteriormente descritas, têm actividade antifúngica. A actividade antifúngica pode ser determinada, mas não limitada, através da incubação de placas de microtitulação contendo esporos de piriculariose do arroz, suspensos num meio de cultura (e. g., 1/2 PD, sacarose-peptona) na presença da proteína antifúngica da presente invenção, a uma concentração 34 predeterminada, e. g., 10 ng/mL-1000 ng/mL, de um modo preferido, 50 ng/mL, a 28 °C, durante 48 horas, e avaliação se o crescimento/proliferação de piriculariose do arroz (e. g., extensão de hifas) é ou não inibido, em comparação com um controlo não contendo a proteína antifúngica (Exemplo 4).

Alternativamente, também pode ser aplicado o ensaio seguinte. Uma colónia de piriculariose do arroz é colocada no centro de um meio de agar, preparado numa placa de Petri, e uma quantidade predeterminada de uma solução aquosa da proteína antifúngica da presente invenção é deixada cair em torno da colónia e a placa de Petri é incubada, a 28 °C, durante cerca de 48 horas a uma semana. Depois, a actividade antifúngica pode ser ensaiada avaliando se a extensão das hifas de piriculariose do arroz em regiões tratadas com a proteína antifúngica é ou não inibida, em comparação com regiões não tratadas.

Agentes antifúngicos

As proteínas da presente invenção têm uma potente actividade antifúngica. Por exemplo, inibem o crescimento de hifas de piriculariose do arroz a uma baixa concentração, tal como 50 ng/mL, no presente ensaio antifúngico. Nos exemplos abaixo, M. grisea e Rhizoctonia solani que causam extensos danos nas colheitas de arroz, foram utilizados como patógenos de plantas para o ensaio antifúngico. A proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae, aqui identificada, mostrou um efeito antifúngico contra estes. É muito provável que a proteína da presente invenção tenha um efeito antifúngico contra microrganismos patogénicos de plantas que não M. grisea. 35

Deste modo, a proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae, da presente invenção, tem uma potente actividade antifúngica, de modo que pode ser utilizada em formulações, tais como agentes antifúngicos e pesticidas que podem conter a proteína antifúngica numa forma activa. Neste caso, a proteína da presente invenção pode ser preparada em quantidade de massa, através da inserção de uma sequência de ADN codificando a proteína da presente invenção num vector de expressão funcional em, e. g., E. coli ou leveduras, como anteriormente descrito. A proteína antifúngica da presente invenção é uma nova proteína semelhante a estreptavidina, sugerindo que se liga a uma das vitaminas, biotina (vitamina H) . Sabe-se que a piriculariose do arroz requer biotina para o seu crescimento. Estes factos sugerem que a presente proteína antifúngica se liga a biotina livre presente em meios de ensaio, de modo a induzir deficiência de biotina nos meios, com o resultado de que o crescimento de piriculariose do arroz era inibido. De facto, a actividade antifúngica de tamavidina 1 da presente invenção era abolida quando a biotina era adicionada em excesso ao meio de ensaio, como descrito no Exemplo 4 abaixo. Verificou-se, adicionalmente, que a estreptavidina e a avidina, comercialmente disponíveis, também têm um efeito antifúngico contra a piriculariose do arroz semelhante à tamavidina 1 e demonstrou-se que este efeito também é abolido pela biotina. A presente invenção sugeriu a possibilidade de que a resistência às doenças, especialmente à piriculariose do arroz, pode ser conferida em plantas através do controlo da quantidade de uma das vitaminas, biotina. A possibilidade de que a resistência à doença podia ser conferida através do controlo de uma vitamina não era, até agora, conhecida. Trata-se de um novo 36 conceito.

Este conceito também está incluído na presente invenção. Por exemplo, uma formulação contendo a proteína antifúngica da presente invenção como um ingrediente activo pode ser utilizada como um pesticida. Neste caso, as proteínas de ligação a biotina que não a proteína antifúngica da presente invenção (e. g., estreptavidina de Streptomyces avidinii e avidina de clara de ovo e os seus homólogos), também estão incluídas no mesmo conceito.

Deste modo, a presente invenção proporciona um agente antifúngico, contendo a proteína antifúngica da presente invenção como um ingrediente activo. Normalmente, o agente antifúngico da presente invenção pode ser sistemicamente ou localmente aplicado a plantas. A dose de dispersão do agente antifúngico depende do tipo de planta, estádio de crescimento, estado, método de dispersão, tempo de tratamento, do tipo da proteína aplicada (e. g., uma proteína de comprimento completo ou uma proteína obtida por substituição, deleção, inserção e/ou adição de uma parte da proteína anterior), das condições meteorológicas e do solo do local onde a planta cresce, e outros factores, e o agente antifúngico pode ser disperso uma vez ou mais, diariamente, ou a intervalos de vários dias. 0 agente antifúngico da presente invenção também pode ser disperso em mistura com solubilizantes, agentes de suspensão, emulsionantes, etc., se necessário. São misturados agentes solubilizantes e de suspensão, aquosos ou não aquosos, como, pelo menos, um diluente inerte com uma ou mais substâncias activas. Exemplos de diluentes aquosos, incluem água destilada e solução salina. Exemplos de diluentes não aquosos incluem propilenoglicol, polietilenoglicol e óleos vegetais, tal como azeite e álcoois, tal como etanol. 37

Tais composições antifúngicas podem, adicionalmente, conter agentes auxiliares, tais como conservantes, humectantes, emulsionantes, dispersantes ou estabilizantes (e. g. , arginina, ácido aspártico, etc.).

Estas composições são esterilizadas por filtração através de um filtro bacteriostático ou da adição de um bactericida ou irradiação, se necessário. Também podem ser preparadas como composições sólidas estéreis através de, por exemplo, liofilização e, depois, dissolvidas em água destilada ou outros solventes, antes de utilização. A forma de dosagem do agente antifúngico obtido deste modo pode ser determinada de forma apropriada, dependendo da finalidade, i. e., pode ser aplicada na forma de comprimidos, pilulas, pós, grânulos, soluções, emulsões, etc., em mistura com os aditivos anteriormente mencionados.

As plantas resistentes às doenças também podem ser criadas através da inserção numa planta de um gene codificando a proteína antifúngica da presente invenção. Deste modo, uma planta resistente às doenças pode ser criada através, e. g., da introdução numa planta de uma construção, na qual um promotor funcional na planta é ligado a um gene codificando a proteína antifúngica da presente invenção e um terminador funcional na planta é, adicionalmente, adicionado a jusante. Neste caso, uma sequência de ADN codificando um péptido sinal para secreção extracelular funcional na planta pode ser adicionada ao lado 5' do gene codificando a proteína antifúngica da presente invenção, para promover a secreção de tamavidina para o exterior das células vegetais. Alternativamente, a utilização de codão do gene pode ser adaptada para monocotiledóneas ou dicotiledóneas, 38 sem afectar os aminoácidos, de modo a promover a acumulação da proteína antifúngica no interior ou no exterior das células vegetais. Também estão incluídos na presente invenção os métodos para criação de plantas resistentes às doenças utilizando combinações destes meios.

As aplicações de tamavidina, avidina, estreptavidina ou proteínas estreitamente semelhantes a estas, para criação de plantas resistentes às doenças e para plantas que não de arroz, também estão incluídas na presente invenção. Aapesar do fungo patogénico aqui analisado ser a piriculariose do arroz, é muito possível que outros fungos patogénicos de plantas e bactérias patogénicas, requerendo biotina para o seu crescimento, também estejam abrangidos.

Além do mais, efeitos semelhantes podem ser produzidos, de modo natural, não apenas contra microrganismos patogénicos de plantas mas também fungos patogénicos de animais requerendo, essencialmente, biotina para o seu crescimento, especialmente microrganismos patogénicos para os humanos e animais domésticos e, por conseguinte, a presente invenção abrange as utilizações da proteína antifúngica da presente invenção, avidina ou estreptavidina, e proteínas estreitamente semelhantes a estas, como agentes terapêuticos em tais cenários. A sequência de ADN de estreptavidina já foi divulgada (Garwin et al., documento WO/8602077), mas as sequências de ADN de tam 1 da presente invenção (mas também de tam 2) não correspondiam ao ADN de estreptavidina durante pesquisas de base de dados comuns e, na realidade, mostraram homologia com o ADN de estreptavidina em apenas 51,0-53,8%, durante comparação forçada, utilizando um programa de software de análise de 39 sequência de ácido nucleico/aminoácido, como anteriormente descrito. A estreptavidina e avidina já foram largamente utilizadas como reagentes experimentais em diversos cenários em biologia molecular, bioquímica ou semelhantes, em virtude de terem uma afinidade de ligação muito forte para a biotina e seus derivados. São, por exemplo, utilizadas em sistemas de detecção de ácidos nucleicos e proteínas (Liang. Documento WO/9707244) ou métodos de purificação baseados na afinidade de ligação a biotina de estreptavidina ou avidina, expressa como uma proteína de fusão (Skerra et al. Documento EP835934, Kopetzki. Documento WO/9711186). A tamavidina 1 da presente invenção (mas também tamavidina 2, não fazendo parte da invenção) também pode ser utilizada nestas aplicações, actualmente largamente conhecidas ou referidas.

As aplicações relacionadas com plantas de estreptavidina ou avidina até agora referidas incluem a criação de plantas masculinas estéreis utilizando avidina (Howard e Albertsen. Documento WO/9640949), a aplicação de estreptavidina ou avidina como proteína insecticida (Czapla et al. Documento WO/9400992) e a produção de avidina em plantas (Baszczynski et al. Pat. US N° 5767379). As utilizações de estreptavidina ou avidina descritas nestes documentos também se aplicam à proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae da presente invenção.

Referências 1. Schlumbaum et al. (1986) Nature 324: p. 365-367 40 2. Mauch et al. (1988) Plant Physiol. 88: p. 936-942 3. Pedido de Patente Japonesa N° 505048/96 4. Oita et al. (1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60 p. 481-483 5. Terras et ai. (1992) J. Biol. Chem. 267: p. 15301-15309 6. Pedido de Patente Japonesa N° 501424/97 7. Broglie et al. (1991) Science 254: p. 1194-1197 8. Terras et ai. (1995) The Plant Cell 7: p. 573-588 9. Nishizawa et al. (1999) Theor Appl Genet 99:383-390 10. Alexander et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 p. 7327-7331 11. Wu et al. (1995) Plant Cell 1: p. 1357-1368 12. Hain et al. (1993) Nature 361: p. 153-156 13. Bayer et al. (1995) Biochim Biophys Acta 1263: p. 60-66 14. Argarana et al. (1986) Nucleic Acids Res 14 p. 1871-1882 15. Freitag et al. (1997) Protein Sei. 6: p. 1157-1166 16. Gope et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: p. 3595-3606 17. Keinanen et al. (1994) Eur J Biochem 220: p. 615-621 18. Gitlin et al. (1988) Biochem J 256: p. 279-282 19. Gitlin et al. (1990) Biochem J 269: p. 527-530 20. Hofmann et al., Proc.Natl .Acad. Sei. USA, 77 p. 4666—4668(1980) 21. Garwin et al. Documento WO/8602077 22. Liang. Documento WO/9707244 23. Skerra et al. Documento EP835934 24. Kopetzki. Documento WO/9711186 25. Howard and Albertsen. Documento WO/9640949 26. Czapla et al. Documento WO/9400992 27. Baszczynski et al. Pat. US N° 5767379. 41

Os exemplos seguintes ilustram, adicionalmente, a presente invenção sem, contudo, limitarem a invenção aos mesmos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construção de um sistema de ensaio 1) Estabelecimento de um sistema de ensaio

Cultivo de fungos patogénicos: Magnaporthe grisea (piriculariose do arroz) (linhagem 337, estirpe TUS-1 obtida do National Agricultural Research Center para a Região de Tohoku do Ministério da Agricultura, Floresta e Pescas do Japão) foi cultivado num meio de farinha de aveia (Difco, suplementado com sacarose a 1%) , de modo a proporcionar conidios para utilização como um inoculo. Os esporos foram armazenados a -80 °C, em glicerol a 10%, se necessário.

Rhizoctonia solani (estirpe JT872) foi cultivado em caldo de dextrose de 1/2 de batata (PD, Difco), durante 2 dias, e três micélios de cerca de 5 mm foram suavemente triturados em 1/2 PD num homogeneizador Teflon, de modo a proporcionar fragmentos de hifas para utilização como um inoculo.

Estes inóculos foram adicionados a placas de microtitulação de 96 poços (Corning), a uma densidade de cerca de 1000 conidios de M. grisea por poço ou cerca de 300 fragmentos de hifas de R. solani por poço, em 100 pL de 1/2 PD e incubados numa incubadora, a 28 °C, durante 48 horas. O crescimento dos fungos foi monitorizado através da medição da absorvência a 595 nm com um leitor de microplacas (Benchmark, Bio-Rad). 42 2) Extracção de proteína de Pleurotus cornucopiae

Depois de 100 g de carpóforos comercialmente disponíveis de Pleurotus cornucopiae serem finamente cortados com tesoura antecipadamente, foram congelados em azoto líquido e triturados num almofariz em pó fino e, depois, extraídos com 300 mL de tampão HEPES-KOH a 100 mM, pH 7,5, a 4 °C, durante 30 minutos, com agitação suave. O extracto foi filtrado através de Miracloth e, depois, centrifugado a 10000 x g, durante 20 minutos. Depois, o sobrenadante foi deixado a repousar, a 4 °C, de um dia para o outro, com 75% de saturação de sulfato de amónio. Depois, os precipitados foram obtidos por centrifugação a 15000 x g, durante 20 minutos e dissolvidos em 3 mL de tampão HEPES-KOH a 10 mM, pH 7,5 e dialisados contra tampão HEPES-KOH a 20 mM, pH 7,5, utilizando um tubo de diálise (Spectra/Porl MWCO 6-8000, Spectrum Medicai Industries). Os insolúveis foram removidos por centrifugação, de modo a proporcionar uma amostra de proteína de Pleurotus cornucopia. O nível de proteína da amostra de proteína de Pleurotus cornucopia foi determinado pelo método de Bradford, utilizando albumina de soro bovino (BSA) como uma proteína padrão.

Exemplo 2: Purificação de proteína antifúngica 1) Actividade antifúngica da amostra de proteína de

Pleurotus cornucopiae em bruto

Os sistemas de cultura de M. grisea e R. solani foram adicionados com uma determinada quantidade de amostra de proteína de P. cornucopiae em bruto, adicionada imediatamente após o início da cultura, incubados durante 2 dias (46-48 horas) 43 e, depois, avaliados para uma actividade antifúngica através da medição da absorvência. Os resultados mostraram que o extracto de Pleurotus cornucopiae continha uma substância tendo uma elevada actividade antifúngica contra Magnaporthe grisea e Rhizoctonia solani. A completa inibição de germinação e inibição do crescimento de hifas foi observada contra M. grisea e a inibição do crescimento de hifas foi observada contra R. solani. Quanto a células de M. grisea, o citoplasma estava separado da parede celular e parecia plasmólise.

De modo a analisar, adicionalmente, a actividade antifúngica detectada, a actividade residual foi testada após aquecimento. 0 ensaio antifúngico foi realizado após aquecimento, a 60 e 80 °C, durante 10 minutos. A potência de actividade foi estimada através da diluição da amostra de proteína. Como resultado, a actividade antifúngica tanto contra M. grisea como R. solani era comparável, antes e após aquecimento a 60 °C. Contudo, a actividade antifúngica contra R. solani desapareceu após aquecimento a 80 °C. Em contraste, foi demonstrada uma nova actividade contra M. grisea através de dilatação de ápices de hifas, de modo a interromper o crescimento após aquecimento a 80 °C, embora se tenha perdido a actividade de indução de plasmólise (FIG. 1).

De modo a conhecer-se o peso molecular aproximado da substância nuclear que controlam estas actividades, contidas em fracções aquecidas da amostra de proteína de Pleurotus cornucopiae em bruto, a amostra foi fraccionada através de uma membrana de ultrafiltração, de modo a estudar uma actividade antifúngica através da separação da amostra em fracções que passaram, ou não, através de uma unidade de filtro Ultrafree MC10000 NMWL (peso molecular de exclusão de 10000, Millipore), 44 utilizada como uma membrana de ultrafiltração. Como resultado, todas as actividades existiram apenas em fracções retidas na membrana. Deste modo, o peso molecular do núcleo activo foi estimado como sendo, pelo menos, 10000 ou superior. 2) Purificação por cromatografia de permuta iónica

Depois, a proteína antifúngica foi purificada. Inicialmente, 150 mg/20 mL da amostra de proteína em bruto foram carregados numa coluna de construção própria (1,5 cm de diâmetro interno x 10 cm de altura, 10 mL de volume de coluna) empacotada com um permutador iónico Q sepharose FF (Pharmacia), de modo a purificar parcialmente a proteína antifúngica. Um tampão de Tris a 50 mM, pH 8,0, NaCl a 50 mM para Tris a 50 mM, pH 8,0, NaCl a 600 mM como tampão de eluição, com um gradiente (NaCl a 50 mM a 600 mM) foi utilizado a um caudal de 2 mL/min, ao longo de 100 minutos. Uma parte de cada fracção (12,5 mL) foi submetida ao ensaio antifúngico contra M. grisea e electroforese de SDS-PAGE. A solução de proteína de cada fracção foi colocada em reacção com uma quantidade equivalente de tampão de corrida 2 x SDS (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2a edição, Cold Spring Harbor), a 95 °C, durante 5 minutos e, depois, corrida por electroforese de SDS-PAGE de acordo com o método de Laemmli (Laemmli (1970) Nature 227: p. 680-685.). O gel utilizado é PAGEL a 15% (ATTO) e a proteína foi detectada com um kit Sllver Stain II Wako (Wako Pure Chemical Industries). De modo a estimar o peso molecular aproximado e a quantidade da proteína, foi corrido um marcador de peso molecular (kit de marcador LMW: Pharmacia LKB, tamanhos 94 kDa, 67 kDa, 43 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa, 14,4 kDa). Os padrões electroforéticos de 45 proteína por coloraçao de prata sao mostrados na FIG. 2, em relação à potência de uma actividade antifúngica.

Surgiram dois picos como actividades antifúngicas a concentrações de NaCl de 160 mM e 240 mM-280 mM. A proteína contida no pico a 160 mM actuou através de dilatação de ápices de hifas, de modo a interromper o crescimento,e não desapareceu após aquecimento a 70 °C, durante 10 minutos. Contudo, a proteína contida no pico a 240 mM-280 mM induziu plasmólise em M. grisea e desapareceu após aquecimento à mesma temperatura. Consequentemente, foi realizada uma tentativa para purificar a proteína antifúngica contida no pico a 160 mM.

As fracções correspondendo à concentração de NaCl de 120 mM-240 mM foram transferidas para um tubo de diálise (Spectra/Por1 MWCO 6-8000, Spectrum Medicai Industries) e dialisadas contra Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0, NaCl a 50 mM, a 4 °C, de um dia para o outro. A concentração em Centriprep-10 (peso molecular de exclusão de 10000, Amicon) foi seguida de aquecimento a 70 °C, durante 30 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm. Esta amostra de proteína (cerca de 10 mL) foi carregada em MonoQ HR 5/5 (Pharmacia) de modo a separar/purificar proteína antifúngica. Um tampão de Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0, NaCl a 50 mM para Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0, NaCl a 500 mM foi utilizado como tampão de eluição, com um gradiente (NaCl a 50 mM a 500 mM) , a um caudal de 1 mL/min., ao longo de 40 minutos, com início 20 minutos após carregamento da amostra. Uma parte de cada fracção (1 mL) foi submetida ao ensaio antifúngico contra M. grisea e electroforese de SDS-PAGE. 46 0 gráfico de HPLC é mostrado na FIG. 3, em relação à potência de uma actividade antifúngica. Os resultados mostram gue surgiu um pico de eluição da proteína antifúngica em torno de uma força iónica (concentração de NaCl) de 200 mM-260 mM. O padrão electroforético é mostrado na FIG. 4, em relação à potência de uma actividade antifúngica. O número no topo de cada corredor corresponde ao número de fracção na FIG. 3. Uma examinação cuidada das bandas de proteína possivelmente relacionadas com uma actividade antifúngica verificou duas bandas de cerca de 15 kD como candidatos prováveis (setas na FIG. 4) . A intensidade das bandas e o nível de uma actividade antifúngica estão positivamente correlacionadas, sugerindo a possibilidade de que as bandas possam ser a proteína antifúngica nuclear. 3) Purificação por filtraçao em gel e estimativa do peso molecular

De modo a purificar a proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae e estimar o peso molecular nativo, fracções Mono Q N° 41-46, obtidas como anteriormente, foram concentradas numa unidade de filtro Ultrafree MC10000 NMWL (Millipore) e carregadas numa coluna de filtração em gel Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia). 0 tampão utilizado é MES-NaOH a 50 mM, pH 6,0, NaCl a 50 mM, a um caudal de 0,5 mL/min. Os pesos moleculares e os tempos de eluição aproximados da proteína foram previstos por Padrão de filtração em gel (BIO-RAD) e, depois, foram carregadas as fracções MonoQ tendo uma actividade antifúngica. 47

Como resultado, surgiu um pico estreito a 30 kDa, quando a proteína foi monitorizada a A280 (FIG. 5). A actividade antifúngica estava concentrada no pico e próximo de 30 kDa. Isto mostra que a actividade antifúngica de Pleurotus cornucopiae é derivada de uma única proteína, tendo um peso molecular de cerca de 30 kDa, como determinado por filtração em gel. Quando cada fracção (0,25 mL) era corada com prata, após SDS-PAGE, uma banda de 15 kDa, mostrada na FIG. 4, foi detectada apenas em torno de 30 kDa (FIG. 6) . Não surgiu nenhuma banda que não a de 15 kDa, sugerindo fortemente que a proteína de 15 kDa contribui para uma actividade antifúngica. A quantidade da proteína antifúngica foi estimada a partir de um marcador de peso molecular (inibidor de tripsina a 20,1 kDa) por um densitómetro e a concentração de inibição de crescimento de 50% contra M. grisea foi calculada em cerca de 50 ng/mL. A quantidade da proteína antifúngica que podia ser purificada a partir de um peso em bruto de 100 g de carpóforos de Pleurotus cornucopiae pelo método anterior foi cerca de 0,2 mg.

Exemplo 3: Isolamento de ADNc 1) Determinação de sequência de aminoácidos de proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae A fracção de Superose 6, obtida como anteriormente, foi concentrada num Ultrafree MC 10000 NMWL (Millipore) e submetida a electroforese de SDS-PAGE. A fracção foi transferida para uma membrana de PVDF (Millipore), num sistema tampão não contendo Tris nem glicina e ligeiramente corada com Azul Brilhante de Coomassie R-250 e, depois, descorada. Depois, a banda de proteína de 15 kDa possivelmente contribuindo para uma 48 actividade antifúngica foi excisada. A proteína de 15 kDa foi parcialmente digerida com lisil endopeptidase (Wako Pure Chemical Industries) ou protease V8 (Wako Pure Chemical Industries).

Como resultado, foi obtida uma fracção de 14 kDa por digestão com lisil endopeptidase e as fracções de 14 kDa e 12 kDa foram obtidas por digestão com protease V8. Estas bandas também foram transferidas após migração. Depois, a sequência de aminoácidos N-terminal foi determinada por degradação de Edman, utilizando um Sequenciador de proteína de fase gasosa (HPG1005A Protein Sequencing System).

Como resultado, os 44 aminoácidos seguintes foram determinados a partir da proteína de 15 kDa: Ν'-Leu Xaa Gly Xaa Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Xaa Xaa Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Xaa Gly Thr Tyr His Ser

Asn Vai Gly Glu Vai Pro Xaa Xaa Tyr His Leu Ala Gly Arg

Tyr-C' (SEQ ID NO: 5) em que e, a seguir Xaa, é desconhecido. Os 50 aminoácidos seguintes foram determinados a partir da digestão de lisil endopeptidase da proteína de 14 kDa: Ν'-Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Vai Gly Glu Vai Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gin Pro

Pro Ser Gly Gin Gly Vai Thr Leu Gly Xaa Ala Vai Ser Phe Glu

Asn Thr Xaa Ala Asn Val-C' (SEQ ID 6). 49

Os 21 aminoácidos seguintes foram determinados a partir da digestão de protease V8 da proteína de 14 kDa: Ν'-Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly-C (SEQ ID N2 7).

Os 23 aminoácidos seguintes foram determinados a partir da proteína de 12 kDa: Ν'-Leu Thr Gly Thr Xaa Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Xaa Asn Leu Thr Ala Asn Xaa Asp Gly Xaa Leu-C (SEQ ID N2 8).

Finalmente, foram determinados os 69 aminoácidos seguintes: Ν'-Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser

Asn Vai Gly Glu Vai Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr

Asn Leu Gin Pro Pro Ser Gly Gin Gly Vai Thr Leu Gly Xaa Ala

Vai Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val-C (SEQ ID N2 9). 2) Concepção de iniciadores degenerados

Com base na sequência de aminoácidos determinada em 1), foram sintetizados quatro iniciadores contendo todas as bases possíveis. Os números entre parênteses mostram o grau de degenerescência. TMR1: 5'-acnggnacntggtayaayg-3' (256) 50 (correspondendo aos resíduos de aminoácidos Thr2 a Glu8 da SEQ ID N° 9) (SEQ ID N° 10) TMR2: 5'-garytiggiwsnacnatgaa-3' (256) (correspondendo aos resíduos de aminoácidos Glu8 a Asnl4 da SEQ ID N° 9) (SEQ ID N° 11) TMF1: 5'-gtrttytcraaiswiacn-3 ' (128) (correspondendo aos resíduos de aminoácidos Ala59 a Thr65 da SEQ ID N° 9) (SEQ ID N° 12) TMF2: 5'-cciarigtnacnccytgncc-3’ (256) (correspondendo aos resíduos de aminoácidos Gly51 a Gly57 da SEQ ID N° 9) (SEQ ID N° 13) em que "i" significa "inosina", "r" significa "g ou a", "y" significa “c ou t", "w" significa "a ou t", "s" significa "g ou c" e "n" significa “a ou g ou c ou t", respectivamente. 3) Construção de uma biblioteca de ADNc de carpóforo de Pleurotus cornucopiae O ácido nucleico total foi extraído do carpóforo de Pleurotus cornucopiae pelo método de SDS fenol e o ARN total foi recuperado por precipitação de cloreto de lítio. Depois, o ARNm

de Pleurotus cornucopiae foi preparado a partir do ARN total utilizando um kit de purificação de ARNm (Pharmacia) . De cerca de 5 g de carpóforos, foram obtidos 10 pg de ARNm, dos quais 5 pg foram utilizados num kit de síntese de ADNc ZAP (Stratagene), de modo a sintetizar ADNc. Cerca de 0,5-5 kb de ADNc foram fraccionados por filtração em gel e ligados a um vector Uni-ZAP XR (Stratagene) e empacotados com Gigapack III (Stratagene). Todos os processos foram efectuados de acordo com as instruções no kit. O título da biblioteca de ADNc de 51 carpóforo de Pleurotus cornucopiae, construída deste modo, foi estimado em cerca de 3000000 pfu.

4) Preparação de sondas por RT-PCR O PCR foi realizado utilizando os iniciadores sintetizados em 2) e o ADNc sintetizado em 3) como um molde para tentar amplificar um ADNc de comprimento parcial de proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae, adequado como uma sonda para rastreio de bibliotecas. As condições de reacção foram como se segue: 50 pL de uma solução de reacção contendo 10 ng de ADNc, 5 pL de tampão 10 * Ex taq, 4 pL de 2,5 mM de cada dNTP, 5 pmoles/sequência de cada iniciador e 1 pL de Ex taq (Takara) + anticorpo Taq START (Clontech) foram corridos num 1 ciclo, a 94 °C, durante 3 min., 35 ciclos a 94 °C, durante 1 min., 50 °C durante 1 min. e 72 °C, durante 1 min. e, depois, 1 ciclo a 72 °C, durante 6 min., utilizando um sistema de controlo de temperatura programado PC-700 (ASTEK). Como resultado, foi amplificado um produto de cerca de 150-190 pb com cada um dos pares de iniciadores TMR1-TMRF1, TMR1-TMRF2, TMR2-TMRF1 e TMR2-TMRF2.

Estes produtos de PCR foram purificados em gel e clonados num vector pCRII (Invitrogen). Estes clones foram sequenciados para revelar que continham dois ADNc, i. e., um ADNc codificando estritamente a mesma sequência de aminoácidos, como determinada em 1) (derivada dos pares TMR2-TMRF1 e TMR2-TMRF2; de modo especial, o ADNc derivado do par TMR2-TMRF2 é designado como TM100) e um ADNc codificando uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de cerca de 75% com a sequência de aminoácidos determinada em 1) (derivada dos pares TMR1-TMRF1, TMR1-TMRF2; de 52 modo especial, o ADNc derivado do par TMR1-TMRF1 é designado como TM75). 5) Rastreio do ADNc de comprimento completo

Os clones de ADNc TM100 e TM75 obtidos em 4) foram excisados do vector e utilizados como sondas para rastrear a biblioteca de ADNc de carpóforo de Pleurotus cornucopiae. Numa placa de Petri quadrada (14 x 10 cm), cerca de 20000 pfu de fago foram plaqueados com um hospedeiro XLl-blue MRF', de acordo com as instruções proporcionadas para um kit de síntese de ADNc ZAP (Stratagene) . A placa foi colocada em contacto com o filtro de membrana de nylon Hybond-N+ (Amersham) , de modo a desnaturar o ADN por álcali, como instruído para a membrana e imobilizada na membrana. As sondas foram marcadas com 32P, utilizando um sistema de marcação de ADN rediprime II™ (Amersham) . A hibridação foi realizada em NaHPCh a 0,5 M (pH 7,2), SDS a 7%, EDTA a 1 mM, a 65 °C, de um dia para o outro, seguida de lavagem de duas vezes em NaHP04 a 40 mM (pH 7,2), SDS a 1%, EDTA a 1 mM, a 65 °C, durante 20 minutos. O rastreio primário de cerca de 160000 pfu de fago proporcionou 600 clones positivos com a sonda TM100 e 30 clones positivos com a sonda TM75. Entre estes, 24 clones da sonda TM100 e 12 clones da sonda TM75 foram, adicionalmente, submetidos a rastreio secundário e um terceiro rastreio também visou a purificação da placa e todos os clones seleccionados foram excisados in vivo, como instruído para o kit de síntese de ADNc ZAP (Stratagene) . Como resultado, 18 clones da sonda TM100 e 12 clones da sonda TM75 foram recuperados como ADNc integrado no vector fagemídico pBluescript SK. O comprimento de inserto destes clones foi identificado por análise de endonuclease de restrição. 53 6) Determinação das sequências de bases

Foi determinada a sequência nucleotidica total do clone mais comprido de cada um dos clones de ADNc anteriores. Inicialmente, as sequências nucleotidicas 5' e 3' do clone foram determinadas utilizando iniciadores de M13 (takara) no

Sequenciador de Fluorescência ABI PRISM (Modelo 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer).

Depois, foram sintetizados os seguintes iniciadores: TMlOOinRV: gTC AAg gCg TTA CTC Tgg (SEQ ID N° 14) com base nos dados de sequência nucleotidica 5' do clone mais comprido de TM100; TMlOOinFW: CTg ggT gAg gAT CAC CTC (SEQ ID N° 15) com base nos dados de sequência nucleotidica 3' do mesmo clone; TM75inRV: gAT gTC TAC gTg CCC TAC (SEQ ID N° 16) com base nos dados de sequência nucleotidica 5' do clone mais comprido de TM75; e TM75inFW: ACg ACT CAg AgA AgA ACT g (SEQ ID N° 17) com base nos dados de sequência nucleotidica 3' do mesmo clone; e utilizados para sequenciação. Deste modo, foram determinadas ambas as sequências de ADN dos clones mais compridos de TM100 e TM75, de modo que foi determinada a sequência nucleotidica total.

Os resultados mostraram que o ADNc codificando a proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae (a partir da sonda TM100) consiste num total de 671 bases (SEQ ID N° 1), codificando 143 aminoácidos (SEQ ID N° 2) . A sequência de aminoácidos N-terminal, determinada a partir da proteína purificada, correspondeu aos resíduos de aminoácidos 8-76 de sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2. A sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2 e 67 aminoácidos directamente determinados a partir da proteína purificada eram totalmente 54 idênticos, à excepção de dois aminoácidos desconhecidos (correspondendo a W 65 e S 73 na the sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2). Isto conduziu à conclusão de que o ADNc clonado é derivado de um gene codificando a proteina antifúngica de Pleurotus cornucopiae. A sequência N-terminal da proteina determinada a partir de sequência de ADNc não era idêntica à sequência N-terminal da proteina efectivamente purificada, i. e., a L (leucina) depois de 7 aminoácidos a seguir ao codão de iniciação metionina estava localizada na extremidade N da proteina purificada. Isto indicou que a proteina antifúngica de Pleurotus cornucopiae era, ao principio, traduzida como um precursor e, depois, a sequência condutora N-terminal (7 aminoácidos) era truncada. 0 peso molecular médio de sequência de aminoácidos da putativa proteina madura (uma sequência de 136 aminoácidos 8-143 da SEQ ID N° 2) era 15158,4, como determinado utilizando um programa de software de análise de sequência génica GENETYX-WIN, ver. 3.2 (Software Development Co., Ltd.), e o ponto isoeléctrico foi calculado em 6,22. Este peso molecular estava de acordo com a estimativa (15 kDa) da proteina purificada por SDS-PAGE. Adicionalmente, existiam dois putativos sítios de glicosilação (N 21 e 71 da SEQ ID N° 2).

Por outro lado, o ADNc codificando um homólogo da proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae (de TM75) consiste num total de 840 bases (SEQ ID N° 3) codificando 141 aminoácidos (SEQ ID N° 4) . O ADNc contém três codões ATG na extremidade 5' mas, quando se inicia a tradução a partir do primeiro e de acordo com codões ATG, surge um codão de terminação mesmo atrás dos mesmos e apenas podem ser codificados 12 e 31 aminoácidos. Só quando a tradução se inicia a partir do terceiro codão ATG, 55 podem ser codificados 141 aminoácidos. Um codão de terminação TGA estava localizado 102 pb a montante deste ATG, na mesma fase de leitura. Deste modo, é quase certo que o terceiro ATG é um codão de iniciação. O peso molecular da putativa sequência de aminoácidos madura (uma sequência de 134 aminoácidos, consistindo nos resíduos 8-141 de sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 4) foi estimado em 14732,2 e o ponto isoeléctrico foi calculado em 8,62. Existia um putativo sítio de glicosilação (N 115 da SEQ ID N° 4). A homologia entre a proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae da presente invenção e o homólogo era 65,5% em aminoácidos e 64,5% em ADN (ORF 12,2%), como analisado utilizando o GENETYX-WIN.

As pesquisas de homologia foram realizadas através de bases de dados do GenBank, utilizando o BLAST para a proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae da presente invenção e o seu gene, assim como os seus homólogos e proteínas tendo uma sequência de aminoácidos codificada desse modo. As pesquisas das bases de dados de sequência de aminoácidos da proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae da presente invenção (sequência de aminoácidos total da SEQ ID N° 2) verificaram sequências homólogas, tais como estreptavidina v2 de Streptomyces violaceus (Acesso N° Q53533, Bayer et al. (1995) Biochim Biophys Acta 1263: p. 60-66), e vl (Acesso N° Q53532), estreptavidina de Streptomyces avidinii (Acesso N° P22629, Argarana et al. (1986) Nucleic Acids Res 14: p. 1871-1882), etc. As homologias destas três sequências estendem-se por mais de 128 aminoácidos e eram 50%, 49% e 49%, respectivamente. A avidina da clara de ovo (Gope et al. (1987)

Nucleic Acids Res 15: p. 3595-3606) e várias proteínas 56 relacionadas com a avidina (Keinanen et al. (1994) Eur J Biochem 220: p. 615-621) também tiveram correspondência a graus de homologia inferiores. Um mutante de estreptavidina nuclear w79f ChainB (Freitag et al. (1997) Protein Sei. 6: p. 1157-1166) também teve correspondência, que difere de estreptavidina em apenas um aminoácido e no qual 36 aminoácidos N-terminais e 20 aminoácidos C-terminais de estreptavidina estão truncados. A homologia foi 51,7%.

Estes factos indicam que a presente proteína é uma nova proteína. As pesquisas das bases de dados de sequência de aminoácidos da segunda proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae da presente invenção (sequência de aminoácidos total da SEQ ID N° 4) mostraram graus de homologia de 50%, 48% e 48% para estreptavidina v2, vl e estreptavidina, respectivamente.

Contudo, pesquisas de base de dados semelhantes, utilizando a sequência de ADN de um gene codificando a primeira proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae (71-502 da SEQ ID N° 1) e a sequência de ADN de um gene codificando a segunda proteína antifúngica derivada de Pleurotus cornucopiae (226-651 da SEQ ID N° 3) verificaram apenas várias sequências mostrando homologia numa gama muito curta (23 pb) mas não a sequência de ADN de estreptavidina. Isto significa que, ao nível do ADN, as sequências de ADN codificando as novas proteínas da presente invenção não são altamente homólogas com a sequência de ADN de estreptavidina. A presente proteína antifúngica foi denominada "tamavidina", em virtude de ser uma nova proteína semelhante a estreptavidina purificada de um cogumelo comestível Pleurotus 57 cornucopiae (Tamogitake). 0 gene derivado da proteína purificada é denominado tam 1, a proteína tendo uma seguência de aminoácidos codificada desse modo é denominada tamavidina 1, um homólogo de tam 1 é denominado tam 2 e a proteína tendo uma seguência de aminoácidos codificada desse modo é denominada tamavidina 2. Quando foi utilizado um programa de software de análise de seguência genética GENETYX-WIN, ver. 3.2, para analisar a homologia das seguências de aminoácidos totais das proteínas antifúngicas de Pleurotus cornucopiae da presente invenção com estreptavidina (gue difere das estreptavidinas v2 e vl em apenas 9 aminoácidos e 1 aminoácido, respectivamente), a sequência de aminoácidos de tamavidina 1 codificada por tam 1 mostrou uma homologia (identidade de aminoácido) de 46,7% e a sequência de aminoácidos de tamavidina 2 codificada por tam 2 mostrou 48,1%. A homologia de sequência de ADN total (SEQ ID N° 1 e 3) com estreptavidina foi 53,8% (ORF 56,8%) para tam 1 e 51,0% (ORF 57,3%) para tam 2. A homologia da proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae codificada por tam 1 com avidina de clara de ovo foi 31,2% na sequência de aminoácidos e 42,4% na sequência de ADN, e a homologia da proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae codificada por tam 2 com avidina de clara de ovo foi 36,2% na sequência de aminoácidos e 41,8% na sequência de ADN.

Uma árvore taxonómica molecular das sequências de aminoácidos das regiões de proteínas maduras de tamavidina 1, tamavidina 2, estreptavidina, estreptavidina VI, estreptavidina V2 e avidina foi preparada pelo método UPGMA, utilizando o GENETYX-WIN. Os resultados mostraram que tamavidina 1 e tamavidina 2 formam um terceiro grupo, distinto do grupo de estreptavidina e grupo de avidina, como mostrado na FIG. 7. 58

Em comparação com a estreptavidina, a tamavidina 1 da presente invenção e tamavidina 2 estão truncadas até aos 33 aminoácidos N-terminais, mas todos os resíduos de triptofano (W) (Gitlin et ai. (1988) Biochem. J 256: p. 279-282) e resíduos de tirosina (Y) (Gitlin et al. (1990) Biochem. J 269: p. 527-530) possivelmente envolvidos na ligação a biotina são conservados (Y 34 e 45 e W 82, 98 e 110 na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2, e Y 34 e 45 e W 80, 96 e 108 na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 4) .

Os pesos moleculares médios das regiões supostas como sendo regiões de proteínas maduras (segmentos 8-143 de sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2 e 8-141 de sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 4) foram calculados em 15158,4 e 14732,2, respectivamente, próximos dos pesos moleculares médios de estreptavidina madura e avidina madura (16490,6 e 14342,9, respectivamente). Estes factos sugerem fortemente que não apenas a tamavidina 1 codificada por tam 1 mas também a tamavidina 2 codificada por tam 2 é uma proteína tendo afinidade de ligação a biotina.

Exemplo 4: Experiências de aboliçao de uma actividade antifúngica por biotinilação

As proteínas antifúngicas da presente invenção são novas proteínas semelhantes a estreptavidina, sugerindo que se ligam a uma das vitaminas, D-biotina (vitamina H, Katayama Chemical). Sabe-se que a piriculariose do arroz requer biotina para o seu crescimento. Estes factos sugerem que a presente proteína antifúngica se liga a biotina livre presente em meios de ensaio, de modo a induzir deficiência de biotina nos meios, com o 59 resultado de que o crescimento de piriculariose do arroz (M. grisea) é inibido. A FIG. 8 mostra os resultados de experiências de abolição de uma actividade antifúngica por adição de biotina. Especificamente, esporos de M. grisea suspensos em 1/2 PD foram colocados em placas de microtitulação. Poços contendo 50 ng/mL ou 1000 ng/mL de tamavidina 1 purificada, ou poços contendo 1000 ng/mL de tamavidina 1 e 100 ng/mL de biotina, ou poços de controlo não contendo proteína foram preparados e incubados, a 28 °C, durante 48 horas.

Como resultado, a extensão de hifas de M. grisea foi razoavelmente inibida em poços contendo tamavidina 1, mesmo a uma concentração de 50 ng/mL, como mostrado na FIG. 8. Contudo, as hifas alongaram-se normalmente em poços contendo tamavidina 1 (1000 ng/mL) e biotina como poços de controlo. Deste modo, uma actividade antifúngica da presente proteína antifúngica foi, na realidade, abolida através de adição excessiva de biotina aos meios de ensaio. Provavelmente, isto ocorre em virtude de uma determinada parte de biotina excessivamente adicionada se ligar à maior parte de tamavidina 1 utilizada para o ensaio, de modo a inactivar a sua actividade antifúngica.

Foram realizados testes semelhantes em avidina de clara de ovo (Sigma) e estreptavidina de Streptomyces avidinii (Sigma) comercialmente disponíveis, a uma concentração de 1000 ng/mL. Os resultados mostraram que ambas as proteínas tinham a actividade antifúngica contra M. grisea e a actividade foi abolida pela biotina (FIG. 8) . 60

Exemplo 5: Actividade de liqaçao de biotina de proteína de tamavidina 2 recombinante 1) Construção de um vector de expressão

As avaliações foram realizadas de modo a descobrir se a tamavidina 2 codificava ou não o gene tam 2, que é um gene isolado como um homólogo do gene tam 1 da presente invenção, praticamente mostra actividade de ligação de biotina. Especif icamente, o gene tam 2 foi inserido em E. coli para expressar tamavidina 2 recombinante e foi examinado de modo a verificar se esta proteína é ou não purificada numa coluna de iminobiotina.

Inicialmente, foi sintetizado um par iniciador para amplificação da ORF total do gene tam 2, obtido no Exemplo 3 (bases 226-651 da SEQ ID N° 3 na Listagem de sequências), por PCR. TM7 5Bsp5: 5'-ACCAACATgTCAgACgTTCAA-3' (SEQ ID N° 18) TM75Hin3: 5'-ATgAAAgCTTTTACTTCAACCTCqq-3' (SEQ ID N° 19).

TM75Bsp5 contém um sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição BspLU 111 (sublinhado) e TM75Hin3 contém um sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição HindIII (sublinhado), respectivamente. Estes iniciadores foram utilizados para realizar o PCR num plasmídeo contendo o gene tam 2 (pBluescript, Exemplo 3(6)) como um molde. Utilizando um sistema de controlo de temperatura programado PC-700 (ASTEK) , 50 pL de uma solução de reacção contendo 500 ng de ADN plasmídico molde, 5 pL de tampão 10 x Pyrobest, 4 pL de 2,5 mM de cada dNTP, 10 pmoles de cada iniciador e 0,5 pL de ADN polimerase Pyrobest (Takara) foram corridos em 1 ciclo a 94 °C, durante 3 min., 15 ciclos a 94 °C, durante 1 min., 50 °C durante 61 1 min. e 72 °C durante 1 min. e, depois, 1 ciclo, a 72 °C, durante 6 min. 0 produto de PCR resultante foi duplamente digerido com as endonucleases de restrição BspLU 111 (Roche) e HindIII (Takara) e submetido a purificação em gel. 0 vector de expressão de E. coli utilizado foi pTrc99A (Pharmacia LKB) . Este vector foi duplamente digerido com Ncol (Takara) e HindIII e purificado em gel e ligado com o produto de PCR tratado com as endonucleases de restrição, como anteriormente, e, depois, inserido em E. coli TB1. A sequência nucleotídica do gene tam 2 inserido foi confirmada. 2) Expressão da proteína recombinante e purificação numa coluna de biotina

Uma única colónia de E. coli, transportando o vector de expressão pTrc99A contendo tam 2 de TB1, foi inoculada em meio LB contendo um antibiótico de ampicilina e pré-cultivada até atingir cerca de OD60o = 0,5. Depois, foi adicionado IPTG, a uma concentração final de 1 mM, de modo a induzir expressão de proteína e as células foram cultivadas por agitação, a 37 °C, durante 4,5 horas adicionais. O volume de cultura foi 50 mL e um controlo sem IPTG (Isopropil-β-Ο (-)-tiogalactopiranósido, Wako Pure Chemical Industries) também foi testado. As células cultivadas foram recolhidas por centrifugação e armazenadas, a -80 °C, até à purificação de proteína.

A tamavidina 2 foi purificada em iminobiotina fazendo-se referência ao método de Hofmann et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4666-4668(1980)). As células foram suspendidas em 1,5 mL 62 de tampão A (CAPS a 50 mM (ácido 3-[Ciclo-hexilamino]-1-propanossulf ónico, SIGMA), pH 11, NaCl a 50 mM) e dissociadas por sonicação. Após centrifugação, o sobrenadante foi recolhido como proteina solúvel total. Uma coluna tendo um diâmetro de 0,5 cm e uma altura de 5 cm foi carregada com 0,5 mL de 2-Iminobiotina-Agarose (SIGMA) e equilibrada com tampão A. A proteina solúvel total foi carregada nesta coluna de iminobiotina agarose. Após a lavagem da coluna com 5 mL de CAPS a 50 mM, pH 11, NaCl a 500 mM, a tamavidina 2 foi eluida com 1,5 mL de NH4OAC a 50 mM, pH 4,0. Tendo a proteina solúvel total e a fracção passado através da coluna, a fracção de lavagem e fracção de eluição foram submetidas a electroforese de SDS-PAGE em PAGEL a 15% (ATTO).

Após migração, a proteina foi corada com Azul Brilhante de Coomassie R-250 (Wako Pure Chemical Industries). Os resultados são mostrados na Fig. 9. Como mostrado na FIG. 9, a fracção de proteina solúvel total induzida por IPTG a 1 mM (T) mostrou uma banda em torno de 15 kDa que não se verificou na fracção não induzida (C) . Este peso molecular concordava bem com o peso molecular de 15467 deduzido a partir de 141 aminoácidos codificados pelo gene tam 2.

Adicionalmente, esta proteina de 15 kDa surgiu na fracção eluida com NH4OAC a 50 mM, pH 4,0 (E) , mas não na fracção tendo passado através da coluna de biotina (F) e da fracção de lavagem de coluna (W) . A proteina de 15 kDa formava um elemento muito importante na fracção de eluição. Este resultado mostra que a tamavidina 2 codificada por tam 2 se liga a biotina. O resultado também mostra que a mesma pode ser convenientemente purificada pelo método mostrado anteriormente. O rendimento de tamavidina 2 63 recombinante, expressa em E. coli obtida a partir de um volume de cultura de 50 mL, foi cerca de 1 mg.

EFEITOS

As formulações contendo, como um ingrediente activo, um elemento de proteína, caracterizado por compreender um polipéptido consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2 ou 4, ou um polipéptido consistindo numa sua sequência parcial, e capaz de ligação a biotina ou um seu derivado, de acordo com a presente invenção, podem ser esperadas para utilização como agentes antifúngicos.

Plantas resistentes às doenças também podem ser criadas através da integração de um ADN tendo a sequência de 71-502 ou 92-502 da SEQ ID N° 1 da presente invenção ou um ADN tendo a sequência de 226-651 ou 247-651 da SEQ ID N° 3 numa cassete de expressão, contendo um promotor constitutivo adequado, funcional numa célula vegetal, um promotor específico de órgão/tempo ou uma sequência promotora indutível respondendo a stress ou pragas e uma sequência terminadora, funcional na célula vegetal, e, depois, introdução da cassete na célula vegetal, de modo a proporcionar um indivíduo regenerado. Neste caso, uma sequência de ADN codificando uma sequência sinal para transportar pequenos órgãos celulares ou uma sequência sinal para secreção extracelular também pode ser ligada à sequência de ADN codificando a proteína antifúngica da presente invenção.

As proteínas da presente invenção podem ser produzidas e preparadas em massa em células de E. coli, leveduras, plantas, insectos ou animais, tal como Xenopus, através da integração de 64 uma sequência de ADN codificando a proteína da presente invenção num vector de expressão, capaz de expressar proteínas estranhas nas células. Neste caso, uma sequência de ADN codificando uma sequência sinal para transportar pequenos órgãos celulares ou uma sequência sinal para secreção extracelular também pode ser ligada à sequência de ADN codificando a proteína antifúngica da presente invenção. A forte interacção entre as proteínas da presente invenção e biotina pode ser aplicada a diversas técnicas analíticas que sejam, actualmente, largamente utilizadas com estreptavidina e avidina.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> JAPAN TOBACCO INC. e Syngenta Limited <120> Nova proteína, gene que a codifica e método de utilização da mesma <13 0> YCT697 <16 0> 19 <210> 1 <211> 671 <212> ADN <213> Pleurotus cornucopiae 65 <22 0>

<221> CDS <222> (71)... (502) <400> 1 gcccagagag accalctata acctctgcgt ccaaaccttc attgaaagct tcaaccccca gtcccccatc atg aaa gac glc caa tct ctc ctc acc gga acc tgg tac Met Lys Asp Vai Gin Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr 1 aat gaa ctc ggc tca aca Asn Glu Leu Gly Ser Thr 15 ctc acc gga acg tac cac Leu Thr Gly Thr Tyr His 30 35 cac ctt tct ggc cgg tac His Leu Ser Gly Arg Tyr 50 act ctg gga tgg gcg gtg Thr Leu Gly Trp Ala Vai 65 5 atg aat ttg act gca aat MET Asn Leu Thr Ala Asn 20 25 tcc aac gtc ggc gag gtt Ser Asn Vai Gly Glu Vai 40 aac ctc cag ccc ccc tcg Asn Leu Gin Pro Pro Ser 55 tct ttc gaa aac act agt Ser Phe Glu Asn Thr Ser 70 10 aaa gac ggt tcg 157

Lys Asp Gly Ser ccc cca act tat 205

Pro Pro Thr Tyr 45 ggt caa ggc gtt 253

Gly Gin Gly Vai 60 gcg aat gtt cat 301

Ala Asn Vai His 75 66 349 tct gtc tea aca tgg age ggg cag tac t tc tct gaa ccc gee gag gtg Ser Vai Ser Thr Trp Ser G ly Gin Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Vai 80 85 90 ate ctc acc cag tgg ctg ttg tea agg age tct gag ege gaa gat ttg 11 e Leu Thr Gin Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu 95 100 105 tgg cag tcc acc cat gtg ggg cat gat gag ttc age aag aca aag cca Trp Gin Ser Thr His Vai Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro 110 115 120 125 acc aag gag aag at t gee cag gct caa ctc ctt cgt ege ggg ttg aag Thr Lys Glu Lys Ile Ala Gin Ala Gin Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys 130 135 140 ttc gag tga acctgattca cgaaaaatlc cgtctatcca acgttggaga tgactccac 551 Phe Glu 143 ctcaagttgt gaatgtttgc tcatttgtac cgaatctgta cgacaagttt gtctgccacc 611 atgtacatcg caaagaatta tcaagaaact ccatgacctg ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa 671

<210> 2 <211> 143 <212> PRT <213> Pleurotus cornucopiae 67 <400> 2

Met Lys Asp Vai Gin Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr 1 5 10 Asn Glu Leu Gly Ser Thr MET Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser 15 20 25 Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Vai Gly Glu Vai Pro Pro Thr Tyr 30 35 40 45 His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gin Pro Pro Ser Gly Gin Gly Vai 50 55 60 Thr Leu Gly Trp Ala Vai Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Vai His 65 70 75 Ser Vai Ser Thr Trp Ser Gly Gin Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Vai 80 85 90 Ile Leu Thr Gin Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu 95 100 105 Trp Gin Ser Thr His Vai Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro 110 115 120 125 Thr Lys Glu Lys Ile Ala Gin Ala Gin Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys 130 135 140

Phe Glu 143

<210> 3 <211> 840 <212> ADN <213> Pleurotus cornucopiae 68 <220>

<221> CDS <222> (226) .. . (651) <400> 3 gtggactctt gcgcgggcag gtacattcac aggtcgtgca ggttgtggga gtattcagtg 60 gctcagactc ttgtgctgac gggtatagat tcacaagccg tgcaggttgt gggagtactc 120 agagggtgag tgattgaatg gaagcacatc ggcgctggtt tcaagccgag aattgaggaa 180 gtaatactcc aagccgatga gaggttacag agatcctcta ccacc atg tca gac gtt 237

Met Ser Asp Vai 1 caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac Gin Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr 5 10 gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr 25 aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac Lys Vai Gly Asp Vai Tyr Vai Pro Tyr 40 45 ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc Leu Gin Pro Pro Ala Gly Gin Gly Vai 55 60 tgg gag aac agt aaa at t cat tcc gct Trp Glu Asn Ser Lys lie His Ser Ala 70 75 aat gaa ctc aac tcc aag atg 285 Asn Glu Leu Asn Ser Lys Met 15 20 ctc act gga aag tac ctc tcc 333 Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Ser 30 35 cca ctc tct ggt ege tat aac 381 Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Asn 50 gct ct t ggg tgg gcg gta tcc 429 Ala Leu Gly Trp Ala Vai Ser 65 acg aca tgg age gga cag ttc 477 Thr Thr Trp Ser Gly Gin Phe 80 69 ttc tet gag teg tet cca Phe Ser Glu Ser Ser Pro 85 90 age act gcg cgt ggg gac Ser Thr Ala Arg Gly Asp 105 teg m aca aag acg gcg Ser Phe Thr Lys Thr Ala 120 ctc cat tgt ege gea ccg Leu His Cys Arg Ala Pro 135 gtg at t ctt act cag tgg Vai Ile Leu Thr Gin Trp 95 gta tgg gaa tcc aca ctt Vai Trp Glu Ser Thr Leu 110 ccg act gag cag cag ate Pro Thr Glu Gin Gin Ile 125 agg ttg aag taa cgagggti Arg Leu Lys 140 141 525 ttg ttg tca leg

Leu Leu Ser Ser 100 gtg ggg aat gat 573

Vai Gly Asn Asp 115 gel cat gct caa 621

Ala His Ala Gin 130 at cgcaaacaaa ccc 674 catcggtctt gaccggtgat ccaaccccaa ggtctaatca atgccggatg actccatttg 734 aggatgtgaa ttagttgcca tttgtatgac ttgatttgtc tgítgtgtag tatcggatta 794 agaatcacat ctcgttaacc ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 840

<210> 4 <211> 141 <212> PRT <213> Pleurotus cornucopiae <400> 4

Met Ser Asp Vai 1

Gin Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Asn Ser Lys Met 5 10 15 20 70

Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Ser 25 30 35 Lys Vai Gly Asp Vai Tyr Vai Pro Tyr Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Asn 40 45 50 Leu Gin Pro Pro Ala Gly Gin Gly Vai Ala Leu Gly Trp Ala Vai Ser 55 60 65 Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gin Phe 70 75 80 Phe Ser Glu Ser Ser Pro Vai Ile Leu Thr Gin Trp Leu Leu Ser Ser 85 90 95 100 Ser Thr Ala Arg Gly Asp Vai Trp Glu Ser Thr Leu Vai Gly Asn Asp 105 110 115 Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gin Gin Ile Ala His Ala Gin 120 125 130 Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 135 140 141

<210> 5 <211> 44 <212> PRT <213> Pleurotus cornucopiae <220> <223> Xaa representa resíduo de aminoácido desconhecido <400> 5

Leu Xaa Gly Xaa Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Xaa Xaa Met Asn Leu Thr 15 10 15 71

Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Xaa Gly Thr Tyr His Ser Asn Vai Gly 20 25 30

Glu Vai Pro Xaa Xaa Tyr His Leu Ala Gly Arg Tyr 35 40 44

<210> 6 <211> 50 <212> PRT <213> Pleurotus cornucopiae <220> <223> Xaa representa resíduo de aminoácido desconhecido <400> 6

Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Vai Gly Glu Vai Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gin Pro Pro Ser Gly 20 25 30 Gin Gly Vai Thr Leu Gly Xaa Ala Vai Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala 35 40 45

Asn Vai 50 72 <210> 7

<211> 21 <212> PRT <213> Pleurotus cornucopiae <220> <223> Xaa representa resíduo de aminoácido desconhecido <400> 7

Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr 15 10 15

Ala Asn Lys Asp Gly 20 21

<210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Pleurotus cornucopiae <220> <223> Xaa representa resíduo de aminoácido desconhecido <400> 8

Leu Thr Gly Thr Xaa Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Xaa Asn Leu Thr 15 10 15

Ala Asn Xaa Asp Gly Xaa Leu 20 23 73 <210> 9

<211> 69 <212> PRT <213> Pleurotus cornucopiae <220> <223> Xaa representa resíduo de aminoácido desconhecido <400> 9

Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu 1 5 Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr 20 Glu Vai Pro Pro Thr Tyr His Leu 35 40 Pro Ser Gly Gin Gly Vai Thr Leu 50 55 Thr Xaa Ala Asn Vai

Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr 10 15 Gly Thr Tyr His Ser Asn Vai Gly 25 30 Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gin Pro 45 Gly Xaa Ala Vai Ser Phe Glu Asn 60 65

<210> 10 <211> 19 <212> ADN <213> sequência Artificial <400> 10 acnggnacnt ggtayaayg 74 <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> <22 0> sequência Artificial <222> 6 e 9 <223> i representa inosina <40 0> 11 garytiggiw snacnatgaa <210> 12 <211> 18 <212> ADN <213> sequência Artificial <22 0> <222> 12 e 15 <223> i representa inosina <40 0> 12 gtrttytcra aiswiacn <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> sequência Artificial <22 0> <222> 3 e 6 <223> i representa inosina 75 <40 0> 13 cciar: igtna cnccytgncc <210> 14 <211> 18 <212> ADN <213> sequência Artificial <40 0> 14 gtcaaggcgt tactctgg <210> 15 <211> 18 <212> ADN <213> sequência Artificial <40 0> 15 ctgggtgagg atcacctc <210> 16 <211> 18 <212> ADN <213> sequência Artificial <40 0> 16 gatgtctacg tgccctac <210> 17 <211> 19 <212> ADN <213> sequência Artificial 76 <40 0> 17 acgactcaga gaagaactg

Lisboa, 18 de Agosto de 2010 <210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> sequência Artificial <40 0> 18 accaacatgt cagacgttca a <210> 19 <211> 25 <212> ADN <213> sequência Artificial <40 0> 19 atgaaagctt ttacttcaac ctcgg 77

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Proteína antifúngica que pode ser obtida de fracção (fracções) precipitada(s) pelo método de precipitação de sulfato de amónio utilizando extracto aquoso de Pleurotus cornucopiae, em que a referida proteína tem uma actividade antifúngica contra, pelo menos, a piriculariose do arroz, e apresenta um componente tendo um peso molecular de cerca de 15 kDa pelo método de SDS-PAGE, em que a extremidade N da proteína tem a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID N° 9: Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Vai Gly Glu Vai Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gin Pro Pro Ser Gly Gin Gly Vai Thr Leu Gly Xaa Ala Vai Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Vai em que Xaa é desconhecido.
2. 2. Proteína antifúngica exibindo uma actividade antifúngica contra a piriculariose do arroz, em que a referida proteína tem uma sequência de aminoácidos de sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2 ou uma sequêcias de aminoácido com 90% ou mais de homologia com a referide sequência. 1
3. 3. Proteínas antifúngicas de acordo com a Reivindicação 2, tendo uma sequência de aminoácidos com 95% ou mais de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2.
4. 4. Proteína antifúngica consistindo num polipéptido, em que o referido polipéptido é seleccionado de um polipéptido consistindo na sequência de aminoácidos parcial 8-143 da SEQ ID N° 2 e um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos com 90% ou mais de homologia com a sequência de aminoácidos parcial 8-143 da SEQ ID N° 2 em que os referidos polipéptidos exibem uma actividade antifúngica contra a piriculariose do arroz.
5. 5. Método para a produção da proteína antifúngica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-4 que compreende: a recolha de fracção (fracções) de extracto aquoso de Pleurotus cornucopiae, precipitado pelo método de precipitação de sulfato de amónio, utilizando sulfato de amónio saturado a 75%; e a aplicação da(s) referida(s) fracção (fracções) a uma coluna de cromatografia de permuta iónica, de modo a recolher a(s) fracção (fracções) eluída(s) por NaCl, a uma concentração entre 50 mM-600 mM de NaCl.
6. 6. Gene codificando a proteína antifúngica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-4. 2
7. 7. Gene de acordo com a Reivindicação 6, em que o referido gene tem uma sequência de bases das bases 71-502 da SEQ ID N° 1, ou uma sequência de bases que se pode hibridiza à sequência de bases anterior sob condições restringentes (NaHP04 a 0,5 M (pH 7,2), SDS a 7%, EDTA a 1 mM, a 65 °C)
8. 8. Gene codificando uma proteína antifúngica exibindo uma actividade antifúngica contra a piriculariose do arroz, em que o referido gene tem uma sequência de bases das bases 71-502 da SEQ ID N° 1 ou uma sequência de bases que se pode hibridar à sequência de bases anterior sob condições restringentes (NaHP04 a 0,5 M (pH 7,2), SDS a 7%, EDTA a 1 mM, a 65 °C).
9. 9. Gene de qualquer uma das Reivindicações 6 a 8, tendo uma sequência de bases com 90% ou mais de homologia com a sequência de bases das bases 71-502 da SEQ ID N° 1.
10. 10. Gene de qualquer uma das Reivindicações 6 a 8, tendo uma sequência de bases com 95% ou mais de homologia com a sequência de bases das bases 71-502 da SEQ ID N° 1.
11. 11. Oligonucleótido para a obtenção de um gene codificando uma proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae, tendo uma sequência nucleotídica descrita em qualquer das SEQ ID N° 10-15.
12. 12. Método para o isolamento do gene de acordo com qualquer uma das Reivindicações 6-10 que compreende: 3 a realização de uma reacção de amplificação de ácido nucleico utilizando dois tipos de oligonucleótidos, descritos na Reivindicação 10, como um par de iniciadores e biblioteca de ADNc de carpóforo de Pleurotus cornucopiae como um molde para amplificar uma porção do gene codificando a proteína antifúngica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-4; e o rastreio da referida biblioteca de ADNc, através da utilização do produto de amplificação obtido deste modo como uma sonda para isolar o clone de ADNc de comprimento completo.
13. 13. Vector recombinante compreendendo o gene de acordo com qualquer uma das Reivindicações 6-10.
14. 14. Vector recombinante de acordo com a Reivindicação 13, o qual é um vector de expressão.
15. 15. Transformante obtido através da introdução do vector recombinante da Reivindicação 13 ou 14 num organismo hospedeiro não humano.
16. 16. Transformante da Reivindicação 15 que é uma planta clendúsica.
17. 17. Agente antifúngico compreendendo a proteína antifúngica de qualquer uma das Reivindicações 1-4 como um ingrediente activo. 4 das da
18. 18. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma Reivindicações 1-4 produzida pelo transformante Reivindicação 15. Lisboa, 18 de Julho de 2010 5 1/9 Fig. 1

    2/9Fig. 2 M FT 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 mM(NaCI)

    3/9 Absorvência (A280) Fig. 3 Actividade antifúngica

    Cone. de NaCl (iTtM) Número de fracção 4/9 Fig. 4 4/9ji&U M Ori FT 30 32 34 36 37 38 39 40 M 94-

    (kDa) +++......·+ + +++ M 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 ZZ £

    +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ + 5/9 Fig. 5 Absorvência (A28O

    Número de fracção 6/9 Fig. 6

    M Ori 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Μ

    7/9 Fig. 7 Tamavidina 1 Tamavidina 2 - Estreptavidina VI L Estreptavidina Estreptavidina V2 Avidina Avidina (1000 ng/mL) Estreptavidina (1000 ng/mL) Tamavidina (1000 ng/mL)

    Λ [/) Ω Φ n (5' « 00 co \ ID Tamavidina (50 ng/mL)

    H3 O ty 0 + H W 0 3 H· ft 0 ID Sft h 3 H· 3 F<3 (D ^ (D §3 rtm H H 0 0 H ft 0 ID ~ H' 3 D) 9/9 Fig. 9 M C T F W EM