KR20030087640A

KR20030087640A - 신규 단백질, 이를 코드하는 유전자 및 이들의 이용방법

Info

Publication number: KR20030087640A
Application number: KR10-2003-7011944A
Authority: KR
Inventors: 타카쿠라요시미츠
Original assignee: 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤; 신젠타 리미티드
Priority date: 2001-03-12
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2003-11-14
Also published as: EP1369476A1; JP4758448B2; WO2002072817A1; ATE474919T1; JP4257119B2; CA2440424A1; HK1147504A1; PT1369476E; CN1505681A; US20090187006A1; DK1865059T3; US20100251429A1; US20050089983A1; ES2346405T3; US20110107469A1; EP1369476A4; CN1721434A; AU2002236300B2; DE60237073D1; EP1865059A1

Abstract

본 발명은, 비교적 저농도로 벼의 2대 병해인 도열병균이나 라이족토니아병균 등의 식물병원균의 생장을 억제할 수 있는 신규한 항균단백질을 검색, 동정하고, 더욱이 당해 단백질의 유전자를 클로닝하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 의하면, 노랑느타리의 수성추출액으로부터 황산암모늄침전법으로 침전하는 분획으로부터 얻어질 수 있고, 적어도 도열병균에 대한 항균활성을 가지며, SDS-PAGE법에서 분자량이 약 15kDa인 성분의 존재를 나타내고, 항균단백질 및 당해 단백질을 코드하는 유전자 및 이들의 이용방법이 제공된다.

Description

신규 단백질, 이를 코드하는 유전자 및 이들의 이용방법{NOVEL PROTEIN, GENE ENCODING THE SAME AND METHOD OF USING THE SAME}

종래, 식물병원균에 대해서 항균활성(antifungal activity)을 갖는 식물의 단백질로서, 키티나아제(chitinase), β-1,3-글루카나아제(glucanase) 등의 용균효소가 알려져 있다. 시험관 내(in vitro) 실험에서는, 이들의 효소는 단독으로도 효과가 있지만(Schlumbaum 등.(1986) Nature 324: p.365∼367), 일반적으로 2종류 이상의 효소를 조합시키므로써, 보다 높은 효과가 얻어진다는 것이 알려져 있다(Mauch 등.(1998) Plant Physiol.88: p.936∼942). 이들 용균효소가 사상균(絲狀菌)의 생육을 억제하는 농도는 일반적으로는, 단독사용의 경우 수십∼수백㎍/㎖ 정도, 조합시켜 사용한 경우에도 각각 수㎍/㎖ 정도를 필요로 한다는 것이 알려져 있다. 그러나, 이들 용균효소 중에서, 벼의 중요병해인 도열병균(Magnaporthe grisea)에 대해서 항균적으로 작용한다는 것이 증명된 것은 아직 보고되어 있지 않다.

한편, 디펜신(defensin)을 비롯한 저분자량의 AFP(Anti-fungal peptide)도 항미생물 활성을 갖는다, 이 중에서 벼의 도열병균에 항균적으로 작용하는 것으로서, Ca-AMP1(일본 특표평 8-505048), CB-1(Oita 등.(1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60: p.481∼483), Rs-AFP1과 Rs-AFP2(Terras 등.(1992) J. Biol. Chem. 267: p.15301∼15309) 및 Ace-AMP1(일본 특표평 9-501424)가 보고되어 있다. 이들 저분자량의 펩티드는 수㎍/㎖ 정도에서 상기 병원균을 포함하는 각종 식물병원균의 생육을 50% 저해한다.

용균효소 또는 저분자량 항균펩티드의 유전자를 단리, 식물에 도입(transfection)하므로써, 병해저항성 식물을 작출하기 위한 시도가 있어왔다(Broglie 등.(1991) Science 254: p.1194∼1197; Terras 등.(1995) The Plant Cell 7: p.573∼588). 벼에 있어서의 연구에서는, 최근 벼유래 키티나아제를 과잉 발현한 형질전환벼의 도열병 저항성이 증강된 것이 보고되었다(Nishizawa 등.(1999) Theor Appl Genet 99:383∼390).

이들 외에 유전자도입에 의한 병원균 저항성 식물의 작출예로서, PR단백질(Alexander 등.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: p.7327∼7331), 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase)(Wu 등.(1995) Plant Cell 7: p.1357∼1368), 스틸벤 신타아제(stilbene synthase)(Hain 등. (1993) Nature 361: p.153∼156) 등이 보고되어 있다.

그러나, 현재 상태에서는, 반드시 실용화 레벨의 저항성을 부여한 식물체가 얻어지지 않는 경우가 많다. 그 이유로는, 도입한 유전자의 발현레벨이 낮은 것을 들 수 있지만, 보다 본질적으로는, 이제까지 보고되어 있는 항균단백질 자체의 항균력이 낮기 때문이라고 여겨진다. 따라서, 종래의 항균단백질보다 더 강력한 항균단백질을 동정하여 이용을 도모하는 것이 요망되고 있다.

본 발명은, 항균활성을 갖는 신규한 단백질과 그 제조방법, 그것을 코드하는 유전자 및 상기 단백질 및 유전자의 이용방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 적어도 벼도열병균에 대한 항균활성을 갖는 노랑느타리(Pleurotus cornucopiae)유래 단백질, 상기 단백질을 코드하는 유전자 및 상기 단백질 및 상기 유전자의 이용방법에 관한 것이다.

본 출원은, 2001년 3월 12일에 제출된 일본특허출원 특원 2001-68894호를 기초로 하는 우선권주장출원이다. 당해 일본특허출원의 내용은 전부 본 명세서에서 채용된다.

도 1은, 본 발명의 항균단백질에 의한 도열병균의 생육저해의 양상을 나타낸다(80℃에서 10분간 처리한 단백질 분획을 첨가하였다. 배양개시 48시간후의 결과).

도 2는, Q-Sepharose FF 컬럼에 의해 분리된 노랑느타리 단백질의 각 분획의 전기영동상과 항균성과의 관계를 나타낸다. M은 분자량마커를, FT는 컬럼통과 분획을 나타낸다. 또한 레인(lane) 아래의 기호(-, +, ++)는 항균활성의 강도를 나타낸다. 괄호 안의 항균활성은 본 발명에서 정제한 것과는 별개의 항균활성을 나타낸다.

도 3은, MonoQ컬럼에 의한 노랑느타리 항균단백질의 분리 챠트와 항균활성과의 관계를 나타낸다. 항균활성을 나타낸 용출위치를 +로 나타내었다.

도 4는, MonoQ컬럼에 의한 노랑느타리 항균단백질 분리의 전기영동상과 항균활성과의 관계를 나타낸다. 레인 위의 번호는 도 3의 분획번호와 일치하고, M은 분자량마커를, Ori는 MonoQ에 건 Q-sepharose분획을 각각 나타낸다. 또한 레인 아래의 기호(-, +, ++, +++)는 항균활성의 강도를 나타낸다. 항균단백질(15kDa)을 화살표로 나타내었다.

도 5는, Superose6에 의한 노랑느타리 항균단백질의 정제챠트와 항균활성과의 관계를 나타낸다. 화살표는 Gel filtration standard(BIO-RAD사제)의 용출위치를 나타낸다. 항균활성을 나타낸 분획의 위치를 +로 나타내었다.

도 6은, Superose6에 의한 노랑느타리 항균단백질 정제의 전기영동상과 항균활성과의 관계를 나타낸다. 레인 위의 번호는 도 5의 분획번호와 일치하고, Ori는Superose6에 건 MonoQ분획을, M은 분자량마커를 나타낸다. 또한, 레인 아래의 기호(-, +, ++)는 항균활성의 강도를 나타낸다. 항균단백질(15kDa)를 화살표로 나타내었다.

도 7은, tamavidin1과 tamavidin2, 스트렙트아비딘(streptavidin)과 그 동족체, 아비딘(avidin)의 아미노산서열(성숙 단백질 영역)의 분자계통수를 나타낸다.

도 8은, 비오틴(biotin) 첨가에 의한 항균활성의 소실실험의 결과를 나타낸다. 마이크로타이터 플레이트(microtiter plates)에 1/2 PD배지에 현탁한 도열병균의 포자를 넣고, 거기에 1000ng/㎖ 농도의 정제 tamavidin1, 스트렙트아비딘, 아비딘을 첨가한 웰(well), 같은 농도의 이들 단백질 이외에 100ng/ml 농도의 비오틴을 더 가한 웰, 또한 단백질을 첨가하지 않은 웰을 준비하여, 28℃에서 48시간 배양하였다. 50ng/ml의 농도의 정제 tamavidin을 첨가한 웰도 동시에 나타내었다.

도 9는, 대장균에서 발현재조합된 tamavidin2의 이미노비오틴컬럼에 의한 정제를 나타낸다. C는 IPTG유도를 하지 않은 대장균의 총 가용성 단백질 분획을, T는 1mM의 IPTG에 의해 단백질 발현유도를 한 대장균의 총 가용성 단백질 분획을 나타낸다. F는 1mM의 IPTG에 의해서, 단백질 발현유도를 한 대장균의 총 가용성 단백질 중 이미노피오틴컬럼에 결합하지 않고, 통과한 단백질의 분획을, W는 같은 컬럼의 세정처리에 의해서 용출된 분획을, E는 산성완충액에 의해 용출된 분획을 각각 나타낸다. Tamavidin2 단백질(약 15kDa)을 화살표로 나타내고, 분자량마커(LMW마커키트 : Pharmacia LKB사제)를 M으로 나타내었다.

발명의 상세한 설명

상기 과제를 해결하는 것을 목적으로 하여, 본 발명자들은, 우선, 도열병균에 대한 시험관 내에서의 항균활성을 검정하기 위한 분석계(assay system)를 확립하였다.

더욱이, 식용버섯의 하나인 노랑느타리로부터 단백질을 추출하고, 이온교환컬럼, 겔투과컬럼을 조합시키고, 각 분획을 상기 항균분석에 제공하는 것에 의해, 항균단백질 분획을 동정, 항균단백질을 분리ㆍ정제하였다. 더욱이 정제단백질의 부분아미노산서열을 결정하고, 이것을 기초로 올리고DNA를 합성하고, RT-PCR에 의해 당해 단백질을 코드하는 부분길이cDNA를 얻었다. 다음으로, 이 부분길이cDNA를 프로브로서 노랑느타리 자실체(字實體) cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 당해 단백질을 코드하는 전장(full length) cDNA를 동정하여, 전체 염기서열을 결정하였다. 이와 같이 하여 노랑느타리 항균단백질의 전체 아미노산 서열과, 이를 코드하는 유전자의 DNA서열을 동정하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 제 1의 측면에 의하면, 노랑느타리의 수성추출액(aqueous extract)으로부터 황산암모늄침전법에 의해 침전된 분획으로부터 얻어질 수 있고, 적어도 도열 병균에 대한 항균활성을 갖고, SDS-PAGE법으로 분자량이 약 15kDa인, 항균단백질이 제공된다.

본 발명의 항균단백질은 전형적으로는, 본 명세서중의 서열목록의 서열번호2로 표시되는 143개의 아미노산서열로 특징지워진다. 본 단백질은, SDS-PAGE에서 분자량이 약 15kDa(본 명세서에 있어서 후술하는 서열목록의 서열번호2의 서열중 제 8번째부터 제 143번째의 아미노산서열로 이루어진 폴리펩티드에 상당)으로 견적되는 폴리펩티드가 하나의 유니트로 되어 있다. 또한 본 단백질은, 겔투과컬럼에서 분자량이 약 30kDa인 것을 특징으로 하는 단백질로서 동정된다.

본 발명의 항균단백질은 또한 서열목록의 서열번호4로 표시되는 141개의 아미노산을 갖는 단백질을 포함한다. 서열번호4의 아미노산서열을 갖는 단백질도, 상기 서열번호2의 아미노산서열을 갖는 단백질과 동일하게 SDS-PAGE에서 분자량이 약 15kDa로 견적되는 폴리펩티드가 하나의 유니트로 되어 있고, 겔투과컬럼에서 분자량이 약 30kDa이다.

본 발명의 항균단백질은, 서열번호2 또는 4에 기재된 아미노산서열 뿐만 아니라, 당해 서열에 있어서 1개에서 복수개의 아미노산변이를 갖는 아미노산서열 또는 이 서열과 52% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖고, 벼도열병균에 대한 항균활성을 나타내는 항균단백질도 포함한다.

본 발명의 항균단백질은, 바람직하게는 서열목록의 서열번호2 또는 4에 기재된 아미노산서열과 52% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖는다.

본 발명의 항균단백질에 관해서, 각각의 구체적인 아미노산서열과 「52% 이상의 상동성을 갖는 단백질」이라는 정의는, 적어도 52%의 상동성을 갖고 있으면 좋다는 것을 의미하지만, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖는 단백질을 의미한다.

본 발명의 제 2의 측면에 의하면, 서열목록의 서열번호2 또는 4의 부분아미노산서열로 이루어진 폴리펩티드, 예컨대 서열번호2의 부분아미노산서열8∼143 또는 서열번호4의 부분아미노산서열 8∼141로 이루어진 폴리펩티드; 및 상기 아미노산서열 중 어느 하나에 1∼복수개의 아미노산변이를 갖는 폴리펩티드 및 상기 아미노산서열의 어느 하나와 52% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드에 있어서, 벼도열병균에 대한 항균활성을 나타내는 당해 폴리펩티드;의 단독 또는 어느 하나의 폴리펩티드의 조합으로 이루어진 항균단백질이 제공된다.

본 발명의 제 3의 측면에 의하면, 노랑느타리의 수성추출액으로부터 75% 포화된 황산암모늄을 사용하여 황산암모늄침전법으로 침전된 분획을 회수하는 공정; 및

상기 분획을 이온교환크로마토그래피에 걸어서 50mM∼600mM의 농도의 NaCl로 용출된 분획을 회수하는 공정;

을 포함하는, 본 발명의 항균단백질의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 제 4의 측면에 의하면, 본 발명의 항균단백질을 코드하는 유전자가 제공된다.

본 발명의 유전자는, 전형적으로는 서열번호1의 염기 71∼502의 염기서열 또는 서열번호3의 염기 226∼651의 염기서열(이하, 본 명세서중, 간단하게 「서열번호1 또는 3의 염기서열」이라고 하는 경우도 있다), 상기 염기서열중에 1∼복수개의 염기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 갖는 염기서열, 또는 상기 염기서열과 스트린전트(stringent)한 조건하에서 혼성화(hybridization)하는 염기서열을 갖는다.

본 발명의 유전자는 일반적으로는, 서열번호1의 염기 71∼502의 염기서열 또는 서열번호3의 염기 226∼651의 염기서열과 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 갖는다.

본 발명의 제 5의 측면에 의하면, 노랑느타리유래의 항균단백질을 얻기 위한 올리고뉴클레오티드에 있어서,

서열목록의 서열번호1 또는 3에 나타난 항균단백질을 코드하는 유전자의 염기서열로부터 이하의 조건을 만족하도록 2개의 영역을 선택하고:

1) 각 영역의 길이가 15∼30염기인 것;

2) 각 영역중의 G+C의 비율이 40∼60%인 것;

상기 영역과 동일한 염기서열 또는 상기 영역에 상보적인 염기서열을 갖는 단일사슬 DNA를 제조하고, 또는 상기 단일사슬 DNA에 의해 코드되는 아미노산 잔기를 변화시키지 않도록 유전자 암호의 축중(縮重)(degeneracy)을 고려한 단일사슬 DNA의 혼합물을 제조하고, 더욱 필요하면 상기 항균단백질을 코드하는 유전자의 염기서열에 대한 결합특이성을 소실하지 않도록 수식(修飾)(modified)한 상기 단일사슬 DNA를 제조하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 당해 올리고뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 바람직하게는 서열목록의 서열번호10 내지 17 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드서열을 갖는다.

본 발명의 제 6의 측면에 의하면, 상기 올리고뉴클레오티드의 2종의 조를 프라이머로서 사용하여, 노랑느타리 자실체 cDNA라이브러리를 주형(鑄型)으로 하는 증폭반응을 행하여 본 발명의 항균단백질을 코드하는 유전자의 일부를 증폭하고, 얻어진 증폭산물을 프로브로서 사용하여 상기 cDNA라이브러리를 스크리닝하여 전장 cDNA클론을 단리하는 것을 포함하는, 본 발명의 유전자의 단리방법이 제공된다.

본 발명의 제 7의 측면에 의하면, 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.

본 발명의 재조합 벡터에 있어서 바람직하게는, 벡터는 발현벡터이다.

본 발명의 제 8의 측면에 의하면, 숙주생물에 본 발명의 재조합 벡터를 도입하여 얻어지는 형질전환체가 제공된다.

본 발명의 제 9의 측면에 의하면, 본 발명의 항균단백질을 유효성분으로서 포함하는 항균제가 제공된다.

발명의 실시의 형태

이하, 본 발명의 설명을 위해서, 바람직한 실시형태에 관해서 상술한다.

노랑느타리유래 항균단백질

본 발명의 제 1의 측면에 의하면, 식물병원균에 대해서 항균효과가 있는 노랑느타리유래의 단백질이 제공된다. 본 발명의 단백질은 본 명세서에 기재된 특징을 갖는 한, 그 기원, 제법 등은 한정되지 않는다. 즉, 본 발명의 항균단백질은, 천연산의 단백질, 유전공학적 수법에 의한 재조합DNA로부터 발현시킨 단백질, 또는 화학합성 단백질중 어느 하나이어도 바람직하다.

본 발명의 단백질은 전형적으로는, 서열목록의 서열번호2에 기재된 143개의 아미노산서열 또는 서열번호4에 기재된 141개의 아미노산서열을 갖는다. 그러나, 천연의 단백질중에는 그것을 생산하는 생물종의 품종의 차이나, 생태형(ecotype)의 차이에 따른 유전자의 변이, 또는 매우 유사한 아이소자임(isozyme)의 존재 등에 기인하여 1∼복수개의 아미노산변이를 갖는 변이단백질이 존재한다는 것은 주지이다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 「아미노산변이」는 1 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가 등을 의미한다. 본 발명의 단백질은, 클로닝된 유전자의 염기서열로부터의 추측에 근거하여, 서열번호2 또는 4에 기재된 아미노산서열을 갖지만, 그 서열을 갖는 단백질만에 한정되는 것은 아니고, 본 명세서중에 기재된 특성을 갖는 한, 전체의 상동단백질을 포함하는 것이 의도된다. 상동성은 적어도 52% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다.

또한, 일반적으로, 동일한 성질을 갖는 아미노산끼리의 치환(예컨대, 어느 소수성 아미노산으로부터 다른 소수성 아미노산으로의 치환, 어느 친수성 아미노산으로부터 다른 친수성 아미노산으로의 치환, 어느 산성 아미노산으로부터 다른 산성 아미노산으로의 치환, 또는 어느 염기성 아미노산으로부터 다른 염기성 아미노산으로의 치환)을 도입한 경우, 얻어지는 변이단백질은 원래의 단백질과 동일한 성질을 갖는 경우가 많다. 유전자 재조합 기술을 사용하여, 이와 같은 원하는 변이를 갖는 재조합단백질을 제조하는 방법은 당업자에게 주지이고, 이와 같은 변이단백질도 본 발명의 범위에 포함된다. 예컨대, Molecular Cloning 2판(Sambrook 등.(1989))에 기재된 부위특이적 돌연변이유발법(site-specific mutagenesis) 등이 사용가능하다.

본 명세서에 있어서, 상동성의 퍼센트는 예컨대 Altschul 등(Nucl. Acids. Res. 25., p.3389∼3402,1997)에 기재되어 있는 BLAST프로그램을 사용하여 서열정보와 비교하여 결정하는 것이 가능하다. 당해 프로그램은 인터넷상에서 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 또는 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹사이트로부터 이용하는 것이 가능하다. BLAST프로그램에 의한 상동성 검색의 각종 조건(파라미터)은 같은 사이트에 상세하게 기재되어 있고, 일부의 설정을 적절하게 변경하는 것이 가능하지만, 검색은 통상 디폴트값(default value)을 사용하여 행한다. 또는, GENETYX(Software Development Co.,Ltd)나 DNASIS(히타치소프트웨어엔지니어링사)와 같은 유전자서열해석 소프트웨어를 사용하여, 서열정보를 비교하여, 결정하는 것이 가능하다.

본 발명의 노랑느타리유래 항균단백질 및 그 유전자, 더욱이 그 동족체와 그것에 의해 코드되는 아미노산서열을 갖는 단백질에 관해서, GeneBank데이터베이스의 BLAST에 의한 상동성 검색을 행하였다. 본 발명의 제1의 노랑느타리유래 단백질의 아미노산서열(서열번호2의 전체 아미노산서열)의 데이터베이스검색 결과, 방선균streptmyces violaceus의 스트렙트아비딘 v2(기탁번호: Q53533, Bayer 등.(1995) Biochim Biophys Acta 1263:p.60∼66), 스트렙트아비딘 v1(기탁번호: Q53532), 방선균streptmyces avidin ii의 스트렙트아비딘(기탁번호: P22629,Argarana 등.(1986) Nucleic Acids Res 14: p.1871∼1882) 등이 상동성을 갖는 것으로서 나타났다. 상동성은 3개 모두 128아미노산에 달하고, 각각 50%, 49%, 49%이었다. 또한, 코어스트렙트아비딘 돌연변이 w79f(ChainB)(Freitag 등.(1997) Protein Sci. 6: p.1157∼1166)과 120아미노산에 달하고, 51.7%의 상동성을 나타내었다.

이들보다 낮은 상동성으로 난백아비딘(egg white avidin)(Gope 등.(1987) Nucleic Acids Res 15: p.3595∼3606)이나 몇몇의 아비딘관련 단백질(Keinanen 등.(1994) Eur J Biochem 220: p.615∼621)도 나타났다. 이외의 것으로부터, 본 단백질은 신규한 단백질이라고 여겨진다.

본 발명의 제 2의 노랑느타리유래 항균단백질의 아미노산서열(서열번호4의 전체 아미노산서열)의 데이터베이스검색 결과에서는, 스트렙트아비딘 v2, v1, 스트렙트아비딘과 각각 50%, 48%, 48%의 상동성을 나타내었다.

본 항균단백질은 식용 버섯인 노랑느타리로부터 정제된 신규한 스트렙트아비딘모양 단백질이므로 「tamavidin」이라 명명하였다. 본 명세서에 있어서, 정제한 단백질유래의 유전자를 tam1, 그것이 코드하는 아미노산서열을 갖는 단백질을 tamavidin1, tam1의 동족체를 tam2, 그것이 코드하는 아미노산서열을 갖는 단백질을 tamavidin2라 부르기로 한다.

또한, 서열번호2 및 4의 아미노산서열1∼7은 항균단백질의 전구체의 리더펩티드(leader peptide)에 상당한다고 여겨진다. 따라서, 서열번호2의 아미노산염기8∼143 및 서열번호4의 8∼141은 항균단백질의 성숙형이다. 따라서, 본 발명에 의하면, 서열번호2의 부분아미노산서열8∼143 또는 서열번호4의 부분아미노산서열8∼141로 이루어진 폴리펩티드, 및 상기 아미노산서열 중 어느 하나에 1∼복수개의 아미노산변이를 갖는 폴리펩티드 및 상기 아미노산서열의 어느 하나와 51%보다 높은 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드에서, 벼도열병균에 대한 항균활성을 나타내는 당해 폴리펩티드의 단독 또는 어느 하나의 폴리펩티드와의 조합으로 이루어지는 항균단백질도 제공된다.

본 발명의 단백질의 정제 및 단리는, 황산암모늄침전법, 이온교환크로마토그래피(MonoQ, Q Sepharose 또는 DEAE 등), 겔여과(Superose 6, Superose 12 등) 등의 단백질의 정제 및 단리를 위해 관용되는 방법을 적절하게 조합시켜 행할 수 있다.

예컨대, 하기의 실시예에 있어서 기재한 바와 같이, 분말화한 노랑느타리를 완충액으로 추출한 후, 여과하고, 그 상청(supernatant)에 황산암모늄을 적절한 농도, 예컨대 75% 포화될때까지 첨가하여 정치(靜置)하는 것에 의해 본 발명의 단백질을 포함하는 침전물이 얻어진다. 이 침전물을 더 투석한 후, 이온교환크로마토그래피에 걸고, 염농도의 구배(예컨대, 50mM∼600mM 염화나트륨)으로 용출하고, 원하는 단백질을 포함하는 분획을 항균활성을 지표로 하여 회수한다. 더욱이, 겔여과를 행하고, 분자량 30kDa 부근의 분획을 회수하는 것이 바람직하다. 한정되지는 않지만, 본 발명의 항균단백질은 SDS-PAGE에서 분자량이 약 15kDa이다.

또는, 본 발명에 의한 서열번호1의 DNA서열의 71(또는 92)에서 502의 서열로 이루어진 DNA서열 또는 서열번호3의 226(또는 247)에서 651의 서열로 이루어진 DNA서열을 대장균이나 효모 또는 곤충이나 어느 종류의 동물세포에, 각각의 숙주에서 증폭가능한 발현벡터를 사용하여 공지의 도입방법을 사용하여 도입, 발현시키는 것에 의해, 당해 단백질을 대량으로 얻을 수 있다.

본 발명에 의해서 이 단백질의 아미노산서열 및 이를 코드하는 DNA서열이 개시되면, 이 서열 또는 그 일부를 이용하여 혼성화나, PCR이라는 유전공학의 기본적 수법을 사용하여, 다른 생물종, 바람직하게는 균류, 보다 바람직하게는 버섯, 곰팡이, 효모 등이 포함되는 진균류(Eumycota), 많은 버섯이 속하는 담자균류(Basidiomycotina), 더욱 바람직하게는 노랑느타리에 속하는 주름버섯목(Agaricales)의 버섯 예컨대 느타리버섯, 표고버섯, 뽕나무버섯, 송이버섯, 땅만가닥버섯, 팽이버섯, 잎새버섯, 꾀꼬리버섯, 새송이버섯 등으로부터 동일한 생리활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자가 단리되어 획득될 수 있다고 여겨진다. 이와 같은 경우, 이들의 신규단백질도 본 발명의 범위에 포함되는 것이다.

항균단백질 유전자

본 발명은 또한, 본 발명의 항균단백질을 코드하는 유전자도 제공한다. 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않고, 천연유래의 DNA, 재조합 DNA, 화학합성 DNA의 어느 것이어도 바람직하고, 또한 게놈DNA클론, cDNA클론의 어느 것이어도 좋다.

본 발명의 유전자는 전형적으로는, 서열번호1 또는 3에 기재된 염기서열을 갖지만, 이것은 본 발명의 일예를 나타내는데 불과한 하기의 실시예에서 얻어진 클론의 염기서열이다. 천연의 유전자중에는 그것을 생산하는 생물종의 품종의 차이나, 생태형(ecotype)의 차이에 기인하는 소수의 변이나 매우 유사한 아이소자임의존재에 기인하는 소수의 변이가 존재하는 것은 당업자에게 주지이다. 따라서, 본 발명의 유전자는 서열목록의 서열번호1 또는 3에 기재된 염기서열을 갖는 유전자만으로 한정되지 않을 뿐만 아니라, 본 발명의 항균단백질을 코드하는 전체 유전자를 포함한다.

특히, 본 발명에 따라서 이 단백질의 아미노산서열 및 그것을 코드하는 DNA서열이 개시된다면, 이 서열 또는 그 일부를 이용하여 혼성화나 핵산증폭반응 등의 유전공학의 기본적 수법을 사용하여, 다른 생물종으로부터 동일한 생리활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 용이하게 단리할 수 있다. 이와 같은 경우, 그와 같은 유전자도 본 발명의 범위에 포함된다.

노랑느타리유래 단백질을 코드하는 유전자의 DNA서열(서열번호1의 71∼502의 DNA서열) 및 제 2의 노랑느타리유래 단백질을 코드하는 유전자의 DNA서열(서열번호3의 226∼651의 DNA서열)을 사용한 GeneBank 데이터베이스의 BLAST검색에서는, 상당히 짧은 범위(23bp)에서 상동성이 나타나는 서열이 몇개 검출된 것에 불과하고, 스트렙트아비딘의 DNA서열 등은 검출되지 않았다. 이것은 본 발명의 신규 단백질을 코드하는 DNA서열은 DNA레벨에서는 스트렙트아비딘의 DNA서열 등과 상동성이 그다지 높지 않다는 것을 의미한다.

보다 상세하게는, 유전자 서열해석 소프트웨어 GENETYX-WIN ver3.2(Software Development Co., Ltd)를 사용하여, 본 발명의 노랑느타리 항균단백질(tamavidin1 및 2)과 스트렙트아비딘(스트렙트아비딘은 스트렙트아비딘v2, v1과 각각 9개의 아미노산, 1개의 아미노산이 다를 뿐이다)의 아미노산서열 전체의 상동성을 해석하였다. 그 결과, 본 발명의 tam1이 코드하는 tamavidin1의 아미노산서열에서 46.7%, tam2가 코드하는 tamavidin2의 아미노산서열에서 48.1%의 상동성(아미노산 동일성)을 나타내었다. 한편, DNA서열(서열목록의 서열번호1 및 3) 전체에서는 스트렙트아비딘과의 상동성은 tam1에서 53.8%, tam2에서는 51.0%이었다. 또한 tam1에 의해 코드되는 노랑느타리 항균단백질과 난백아비딘과의 상동성은 아미노산서열에서 31.2%, DNA서열에서 42.4%이고, tam2에 의해 코드되는 노랑느타리 항균단백질과 난백아비딘과의 상동성은 아미노산서열에서 36.2%, DNA서열에서 41.8%이었다. 또한, tamavidin1과 tamavidin2의 아미노산서열간 및 이들을 코드하는 유전자 tam1과 tam2의 DNA서열간의 상동성은 각각 65.5%, 64.5%이었다.

스트렙트아비딘과 비교한 경우, 본 발명의 tamavidin1, tamavidin2는 N말단측이 33아미노산으로 짧게 되어 있지만, 비오틴(biotin)과의 결합에 관여하고 있다고 여겨지고 있는 트립토판(W)잔기(Gitlin 등.(1988) Biochem. J 256: p.279∼282), 티로신(Y)잔기(Gitlin 등(1990) Biochem J 269: p. 527∼530)은 전부 보존되어 있다(서열번호2의 아미노산서열중 제34, 제45번째의 Y, 제82, 제98, 제110번째의 W, 서열번호4의 아미노산서열중, 제34, 제45번째의 Y, 제80, 제96, 제108번째의 W).

또한 성숙단백질 영역이라 여겨지는 부분(서열번호2의 아미노산서열 중 제8번째로부터 제143번째의 아미노산서열, 서열번호4의 아미노산서열중 제8번째로부터 제141번째의 아미노산서열)의 평균분자량은 각각 15158.4, 14732.2로 산출되고, 성숙스트렙트아비딘이나 성숙아비딘의 평균분자량(각각 16490.6, 14342.9)과 유사하다.

스트렙트아비딘은 방선균Streptmyces avidin ii유래, 아비딘은 조류(Gallus gallus)의 난백유래이다. 이제까지 스트렙트아비딘과 매우 유사한 단백질로서, 방선균Streptmyces violaceus로부터 전술한 스트렙트아비딘 v1 및 v2(Bayer 등.(1995) Biochim Biophys Acta 1263: p.60∼66)가, 또한 아비딘유전자의 동족체로서 조류로부터 아비딘 관련유전자(avr1∼avr5, Keinanen 등. (1994) Eur J Biochem 220: p. 615∼621)가 단리되어 있다. 스트렙트아비딘과 스트렙트아비딘 v1 및 v2와의 아미노산서열의 차이는 각각 1개의 아미노산, 9개의 아미노산이고, 아비딘과 아비딘관련 단백질과의 아미노산서열의 상동성은 68∼78%, DNA서열의 상동성은 88∼92%이다. 스트렙트아비딘과 아비딘의 상동성은 아미노산서열에서 29.2%, DNA서열에서 46.8%이다.

한편, 본 발명의 항균단백질의 바람직한 1태양인 tamavidin1 및 2는 담자균노랑느타리(Pleurotus cornucopiae) 유래이고, 전술한 바와 같이 스트렙트아비딘과의 아미노산서열 상동성은 각각 46.7%, 48.1%이고, 또한 아비딘과의 아미노산서열 상동성은 각각 31.2%, 36.2%이다. 이와 같이 tamavidin1, 2는 방선균의 스트렙트아비딘의 그룹, 조류의 아비딘의 그룹과는 다른 제 3의 그룹을 형성하고 있다. 방선균, 조류 이외에서 이와 같은 아비딘같은 단백질이 단리된 것은 이것이 처음이다. tamavidin1, 2는 버섯류의 아비딘과 같은 단백질이지만, 다른 버섯류에도 동일한 단백질이 포함되어 있을 가능성은 높다고 예측된다. tamavidin1, 2의 아미노산서열, tam1, tam2의 DNA서열은, 이와 같은 단백질 및 그 유전자를 더 검색, 단리하는것에 이용할 수 있다.

상동유전자의 스크리닝을 위해 사용하는 혼성화 조건은 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로는 엄격한 조건이 바람직하고, 예컨대 Current Protocols in Molecular Biology Vol.1(John Wiley and Sons, Inc.)이나 Molecular Cloning 2판(Sambrook 등.(1989))에 기재되어 있는 바와 같이, 5×SSC, 5×Denhardt's solution, 1% SDS, 25℃∼68℃에서, 수시간∼하룻밤 등의 혼성화 조건을 사용하는 것을 생각할 수 있다. 이 경우, 혼성화의 온도로서는, 보다 바람직하게는 45℃∼68℃(포름아미드(formamide) 없음) 또는 30℃∼42℃(50% 포름아미드)를 들 수 있다. 세정의 조건으로서는, 예컨대 0.2×SSC로 45℃∼68℃를 들 수 있다. 포름아미드 농도, 염 농도 및 온도 등의 혼성화 조건을 적절하게 설정하는 것에 의해 어느 일정한 상동성 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는 DNA를 클로닝할 수 있다는 것은 당업자에 주지이고, 이와 같이 하여 클로닝된 상동유전자는 전부 본 발명의 범위중에 포함된다.

핵산증폭반응은 예컨대, 복제연쇄반응(PCR)(사이키 등, 1985, Science 230, p.1350∼1354), 라이게이즈연쇄반응(LCR)(우 등, 1989, Genomics 4, p.560∼569; 배링거 등, 1990, Gene 89, p.117∼122; 발라니등, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, p.189∼193) 및 전사에 따른 증폭(코 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, p.1173∼1177 등의 온도순환을 필요로 하는 반응, 및 사슬치환반응(SDA)(워커 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, p.392∼396; 워커 등, 1992, Nuc. Acids. Res. 20, p.1691∼1696), 자기유지서열복제(3SR)(구아테리 등, 1990, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87, p.1874∼1878) 및 Qβ레플리카제시스템(리자디 등, 1998, BioTechnology 6, p.1197∼1202) 등의 항온반응을 포함한다. 또한, 유럽특허 제0525882호에 기재되어 있는 표적핵산과 변이서열의 경합증폭에 의한 핵산서열에 근거한 증폭(Nucleic Acid Sequence Based Amplification: NASABA) 반응 등도 이용가능하다. 바람직하게는 PCR법이다.

상기와 같은 혼성화, 핵산증폭반응 등을 사용하여 클로닝되는 상동유전자는, 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기서열에 대해서 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는다.

올리고뉴클레오티드

본 발명에 의하면 또한, 노랑느타리유래의 항균단백질을 얻기 위한 올리고뉴클레오티드에 있어서,

서열목록의 서열번호1 또는 3에 나타난 항균단백질을 코드하는 유전자의 염기서열로부터 이하의 조건을 만족시키도록 2개의 영역을 선택하고:

1) 각 영역의 길이가 15∼30염기인 것;

2) 각 영역중의 G+C의 비율이 40∼60%인 것;

상기 영역과 같은 염기서열 또는 상기 영역에 상보적인 염기서열을 갖는 단일사슬 DNA를 제조하고, 또한 상기 단일사슬 DNA에 의해 코드되는 아미노산염기를 변화시키지 않도록 유전자암호의 축중을 고려한 단일사슬 DNA의 혼합물을 제조하고, 더욱 필요하다면 상기 항균단백질을 코드하는 유전자의 염기서열에 대한 결합특이성을손실하지 않도록 수식한 상기 단일사슬 DNA를 제조하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 당해 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 예컨대 본 발명의 유전자를 검출 또는 단리하기 위한 혼성화 또는 적당한 2종을 프라이머쌍으로서 사용한 PCR 등의 증폭반응에 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 바람직하게는 서열목록의 서열번호10∼19 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드서열을 갖는다. 서열목록10∼13의 뉴클레오티드서열은, 서열번호9의 아미노산서열에 근거하여, 그 단백질의 일부를 코드하는 유전자 단편의 클로닝을 위한 PCR용 프라이머로서 설계된 것으로, 당해 아미노산을 코드하는 것이 가능한 전체 염기를 믹스한 프라이머이다. 서열번호14∼17의 뉴클레오티드는 tam1과 tam2 유전자의 전체 염기서열을 해독하기 위하여 프라이머워크용으로서 합성된 프라이머이다. 서열번호18∼19의 뉴클레오티드는, 서열번호4의 아미노산서열을 갖는 재조합 tamavidin2 단백질을 발현하기 위한 발현벡터를 구축하기 위해서, 전체 ORF를 증폭하기 위해 서열번호3에 근거하여 작성된 PCR용 프라이머이다.

본 발명의 유전자의 부분단편은, 상기 올리고뉴클레오티드의 적절한 조합을 사용하여 노랑느타리 자실체 cDNA라이브러리를 주형으로 하여 PCR등의 핵산증폭반응을 행하는 것에 의해 증폭시켜 단리할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 증폭산물을 프로브로서 사용하여 더욱이 cDNA라이브러리를 플라크혼성화(plaque hybridization) 등으로 스크리닝하는 것에 의해 완전길이의 cDNA클론을 단리하는 것이 가능하다. 핵산증폭반응의 순서 및 조건, 플라크혼성화의 조건 등은 당업자에게 주지이다.

예컨대, 한정되지는 않지만, 혼성화의 조건으로서는 Current Protocols in Molecular Biology Vol.1(John Wiley and Sons, Inc.)이나 Molecular Cloning(Sambrook 등. 상기)에 기재되어 있는 바와 같이, 온도조건이 경우에 따라서는 실온 정도, 세정도 예컨대 2×SSC 등 통상보다도 높은 염 농도이고, 온도도 37℃ 정도가 되도록 상당히 스트린전시(stringency)를 낮게 하는 것을 생각할 수 있다.

재조합 항균단백질의 제조

본 발명의 단백질은 극히 강력한 항균활성을 가진다. 예컨대 벼의 도열병균에 대해서는 50ng/ml라는 상당히 낮은 농도에서 포자의 발아를 완전히 억제한다(후술하는 실시예 4를 참조). 이 농도에 있어서는 장시간의 인큐베이션 후에도 포자의 발아는 보이지 않기 때문에, 본 발명의 단백질의 도열병균에 대한 효과는, 생장의 부분적 저해라기 보다는 오히려 살균효과라 여겨진다. 이와 같은 낮은 농도(나노그램수준)에서, 병원균의 생육을 완전히 억제할 수 있는 항균단백질은 본 발명자가 알고 있는 범위에서는 현재까지 보고되어 있지 않다. 후술하는 실시예에 있어서는, 항균단백질의 정제를 위한 항균분석을 위한 식물병원균으로서 벼의 가장 중요병해인 도열병균을 사용하였지만, 동정한 노랑느타리 항균단백질이, 이것 이외의 라이족토니아(Rhizoctonia)병균 등의 식물병해에도 커다란 차이가 없는 레벨에서 항균효과를 갖고 있을 가능성은 매우 높다.

이와 같이 본 발명의 노랑느타리유래의 항균단백질은 강한 항균활성을 갖고있으므로, 본 발명의 단백질은 항균제나 농약 등의 약제로서 그것이 활성이 있는 형태로 포함되도록 한 제제로서 이용할 수 있다. 이 경우, 본 단백질은 예컨대 후술하는 실시예에 따라서 노랑느타리로부터 이온교환컬럼, 겔투과컬럼을 사용하여 정제될 수 있다. 그러나, 본 발명의 노랑느타리 항균단백질을 코드하는 서열목록1의 71∼502 또는 서열번호3의 226∼651의 염기서열을 갖는 DNA를, 대장균이나 효모 또는 곤충이나 어느 종의 동물세포에, 각각의 숙주에서 증폭가능한 발현벡터를 사용하여 도입, 발현시키므로써 당해 단백질을 보다 간편하고 또한 대량으로 제조할 수 있다(실시예 5).

본 발명에 의하면 또한, 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합벡터가 제공된다. 플라스미드 등의 벡터에 본 발명의 유전자의 DNA단편을 삽입하는 방법으로서는 예컨대, Sambrook, J. 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53(1989)에 기재된 방법 등을 들 수 있다. 간편하게는, 시판되는 라이게이션키트(예컨대, TAKARA제 등) 을 사용할 수도 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 재조합벡터(예컨대, 재조합플라스미드)는 숙주세포(예컨대, E-coli TB1, LE392 또는 XL-1Blue 등)에 도입된다.

플라스미드를 숙주세포에 도입하는 방법으로서는 Sambrook, J. 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74(1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화칼슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적인 처리에 의한 방법, 유전자총(銃)(gene gun) 등을 사용하는 방법 등을 들수 있다.

벡터는, 간편하게는 당업계에 있어서 입수가능한 재조합용 벡터(예컨대, 플라스미드 DNA 등)에 원하는 유전자를 통상의 방법에 의해 연결하는 것에 의해 제조할 수 있다. 사용되는 벡터의 구체예로서는, 대장균유래의 플라스미드로서 예컨대, pBluescript, pUC18, pUC19, pBR322, pTrc99A 등이 예시되지만 이들에 한정되지 않는다.

원하는 단백질을 생산하는 목적에 있어서는, 특히 발현벡터가 유용하다. 발현벡터의 종류는 원핵세포 및/또는 진핵세포의 각종 숙주세포 내에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 대장균용 발현벡터로서 pQE-30, pQE-60, pMAL-C2, pMAL-p2, pSE420 등이 바람직하고, 효모용 발현벡터로서 pYES32(사카로마이세스(Saccharomyces)속), pPIC3.5K, pPIC9K, pAO815(이상 피키아(pichia)속), 곤충용 발현벡터로서 pBacPAK8/9, pBK283, pVL1392, pBlueBac4.5 등이 바람직하다.

형질전환체는, 원하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 것에 의해 제조할 수 있다. 사용되는 숙주세포로서는, 본 발명의 발현벡터에 적합하고, 형질전환될 수 있는 것이면 특별한 제한은 없으며, 본 발명의 기술분야에 있어서 통상 사용되는 천연세포, 또는 인공적으로 수립된 재조합세포 등 여러가지의 세포를 사용하는 것이 가능하다. 예컨대, 세균(에시케리키아속균, 바실러스속균), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등), 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등을 들 수 있다.

숙주세포는, 대장균, 효모, 식물세포 또는 곤충세포가 바람직하고, 구체적으로는 대장균(M15, JM109, BL21 등), 효모(INVSc1(사카로마이세스속), GS115, KM71(이상 피키아속) 등), 곤충세포(BmN4, 누에유충 등) 등을 들 수 있다. 또한, 동물세포로서는 마우스(mouse)유래, 아프리카산 발톱개구리(Xenopus)유래, 래트(rat)유래, 햄스터(hamster)유래, 시미안(Simian)유래 또는 인간유래의 세포 또는 그들의 세포로부터 수립된 배양세포주 등이 예시된다. 더욱이, 식물세포에 관해서는, 세포배양이 가능하다면, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 담배, 아라비아돕시스(Arabidopsis), 벼, 옥수수, 밀유래의 세포 등이 예시된다.

숙주세포로서 세균, 특히 대장균을 사용하는 경우, 일반적으로 발현벡터는 적어도 프로모터(promoter)/오퍼레이터(operator) 영역, 개시코돈, 원하는 항균단백질을 코드하는 유전자, 종결코돈, 터미네이터(terminator) 및 복제 가능단위로 구성된다.

숙주세포로서 효모, 식물세포, 동물세포 또는 곤충세포를 사용하는 경우에는, 일반적으로 발현벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 원하는 항균단백질을 코드하는 유전자, 종결코돈, 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 또한 시그널펩티드를 코드하는 DNA, 인핸서(enhancer)서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역영역, 선택마커(selectable marker)영역 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함하여도 좋다.

본 발명의 벡터에 있어서, 적절한 개시코돈으로서는, 메티오닌코돈(ATG)이 예시된다. 또한, 종결코돈으로서는, 상용되는 종결코돈(예컨대, TAG, TGA, TAA 등)이 예시된다.

복제가능단위란, 숙주세포중에서 그 전체 DNA서열을 복제할 수 있는 능력을 갖는 DNA를 의미하고, 천연의 플라스미드, 인공적으로 수식된(modified) 플라스미드(천연의 플라스미드로부터 제조된 플라스미드) 및 합성플라스미드 등이 포함된다. 적절한 플라스미드로서는, E.coli에서는 플라스미드 pQE30, pET 또는 pCAL 또는 그들의 인공적 수식물(modification)(pQE30, pET 또는 pCAL을 적당한 제한효소로 처리하여 얻어지는 DNA단편)을, 효모에서는 플라스미드 pYES2 또는 pPIC9K를, 또는 곤충세포에서는 플라스미드 pBacPAK8/9 등을 들 수 있다.

인핸서서열, 터미네이터서열에 관해서는 예컨대, 각각 SV40에 유래하는 것 등, 당업자에게 있어서 통상 사용되는 것을 사용할 수 있다.

선택마커로서는, 통상 사용되는 것을 통상의 방법에 의해 사용할 수 있다. 예컨대, 테트라사이클린(tetracycline), 암피실린(ampicillin), 또는 카나마이신(kanamycin) 또는 네오마이신(neomycin), 하이그로마이신(hygromycin) 또는 스펙티노마이신(spectinomycin) 등의 항생물질 내성유전자 등이 예시된다.

발현벡터는 적어도 상술한 프로모터, 개시코돈, 원하는 항균단백질을 코드하는 유전자, 종결코돈, 및 터미네이터영역을 연속적으로 또한 환상으로 적당한 복제가능단위로 연결하는 것에 의해 제조할 수 있다. 또한 이 경우, 소망에 따라 제한효소에 의한 절단이나 T4 DNA리가아제를 사용하는 라이게이션 등의 통상의 방법에 의해 적당한 DNA단편(예컨대, 링커(linker), 다른 제한효소부위 등)을 사용할 수 있다.

본 발명의 발현벡터의 숙주세포로의도입[형질전환(형질이입(transduction))]은 종래 공지의 방법을 사용하여 행할 수 있다.

예컨대, 세균(대장균, 간상균(Bacillus subtilis) 등)의 경우는 예컨대 Cohen 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)], 프로토플라스트법(protoplast method)[Mol. Gen. Genet., 168, 111(1979)]나 컨피턴트법(competent method)[J. Mol. Biol., 56, 209(1971)]에 의해, Saccharomyces cerevisiae의 경우는, 예컨대 Hinnen 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1927(1978)]이나 리튬법[J. Bacteriol.,153,163(1983)]에 의해, 식물세포의 경우는, 예컨대 리프디스크법(leaf disc method)[Science, 227, 129(1985)], 일렉트로포레이션법[Nature, 319, 791(1986)]에 의해, 동물세포의 경우는, 예컨대 Graham의 방법[Virology, 52, 456(1973)], 곤충세포의 경우는, 예컨대 Summers 등의 방법[Mol. Cell. Biol., 3, 2156∼2165(1983)]에 의해 각각 형질전환할 수 있다.

본원발명의 DNA단편을 사용하여 병해저항성 식물을 작출하는 목적에 있어서는, 식물형질전환용 벡터가 유용하다. 식물용 벡터로서는, 식물세포중에서 당해 유전자를 발현하고, 당해 단백질을 생산하는 능력을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 pBI221, pBI121(이상, Clontech사제) 및 이들로부터 파생된 벡터를 들 수 있다. 또한, 특히 단자엽 식물의 형질전환에는, pIG121Hm, pTOK233(이상, Hiei 등, Plant J., 6, 271∼282(1994)), pSB424(Komari 등, Plant J., 10, 165∼174(1996)) 등이 예시된다.

형질전환 식물은, 상술한 벡터의 β-글루클로니다아제(β-glucuronidase)(GUS)유전자의 부위에 본원발명의 DNA단편을 삽입하여 식물형질전환용 벡터를 구축하고, 이것을 식물에 도입하므로써 조정할 수 있다. 식물형질전환용 벡터는 적어도 프로모터, 번역개시코돈, 원하는 유전자(본원발명의 DNA서열 또는 그 일부), 번역종결코돈 및 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 시그널펩티드를 코드하는 DNA, 인핸서서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역영역, 선택마커영역 등을 적당하게 포함하고 있어도 좋다.

프로모터, 터미네이터는 식물세포에서 기능하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 구성적(constitutive) 발현을 하는 프로모터로서는, 상기 벡터에 이미 삽입되어 있는 35S프로모터 이외에, 액틴(actin), 유비키틴(ubiquitin)유전자의 프로모터 등이 예시된다. 그러나, 보다 적당하게는 유도성의 프로모터를 삽입하여 사용하여도 좋다. 이와 같이 하므로써 병해충이 형질전환식물에 접촉한 때에만, 당해 단백질이 생산되고, 저항성으로 된다. 사용되는 적당한 유도성 프로모터로서는 페닐알라닌암모니아리아제(phenylalanine ammonia-lyase), 키티나아제(chitinase), 글루카나아제(glucanase), 티오닌(thionine), 오즈모신(osmosin) 또는 병해충이나 스트레스에 반응하는 그 밖의 유전자의 프로모터가 고려된다.

식물로의 유전자도입법으로서는, 아가로박테리움을(Agaro bacterium) 사용하는 방법(Horsch 등., Science, 227, 129(1985), Hiei 등., Plant J., 6, p.271∼282(1994)), 일렉트로포레이션법(Fromm 등., Nature, 319, 791(1986)), PEG법(Paszkowski 등., EMBO J., 3, 2717(1984)), 마이크로인젝션(microinjection)법(Crossway 등., Mol. Gen. Genet., 202,179(1986)), 미소물충돌(particle bombardment)법(McCabe 등., Bio/Technology, 6, 923(1988)) 등을 들 수 있지만, 원하는 식물에 유전자를 도입하는 방법이면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 숙주로 되는 식물종도 본 발명의 식물형질전환용 벡터에 적합하고, 형질전환되는 것이면 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 기술분야에 있어서 통상 사용되는 식물, 예컨대 쌍자엽식물에서는 담배, 아라비돕시스, 토마토, 오이, 당근, 콩, 감자, 사탕무, 순무, 중국양배추, 포도찌꺼기, 면, 페츄니아 등을 들 수 있고, 단자엽식물에서는 벼, 옥수수, 밀 등을 들 수 있다.

본 발명의 단백질은, 상기와 같이 제조된 발현벡터를 포함하는 형질전환세포를 영양배지에서 배양하는 것에 의해 발현(생산)할 수 있다. 영양배지는 숙주세포(형질전환체)의 생육에 필요한 탄소원, 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예컨대 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 슈크로오스, 메탄올 등이 예시된다. 무기질소원 또는 유기질소원으로서는, 예컨대 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘스팁ㆍ리쿼(corn steep liquor) , 펩톤, 카제인, 소 추출물, 대두백, 감자 추출액 등이 예시된다. 또한, 원하다면 다른 영양소(예컨대 무기염(예컨대, 염화나트륨, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류, 항생물질(예컨대, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등)등)을 포함하고 있어도 좋다.

배양은, 당업계에 있어서 알려져 있는 방법에 의해 행해진다. 배양조건, 예컨대 온도, 배지의 pH 및 배양시간은, 본 발명의 단백질이 대량으로 생산되도록 적절하게 선택된다. 한정되지는 않지만, 예컨대 대장균에서의 발현의 경우, 재조합단백질 발현을 위한 배양조건으로서, 바람직하게는 4℃∼40℃의 온도에서 배양하고, 0.01mM∼5.0mM의 IPTG에 의한 유도를 행한다.

본 발명의 단백질은, 상기 배양에 의해 얻어지는 배양물보다 이하와 같이 하여 취득할 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질이 숙주세포내에 축적하는 경우에는, 원심분리나 여과 등의 조작에 의해 숙주세포를 모으고, 이것을 적당한 완충액(예컨대 농도가 10M∼100mM 정도의 트리스완충액, 인산완충액, HEPES완충액, MES완충액 등의 완충액, pH는 사용되는 완충액에 따라서 다르지만, pH5.0∼9.0의 범위가 바람직하다)에 현탁한 후, 사용하는 숙주세포에 적합한 방법으로 세포를 파괴하고, 원심분리에 의해 숙주세포의 내용물을 얻는다. 한편, 본 발명의 단백질이 숙주세포 밖으로 분비되는 경우에는, 원심분리나 여과 등의 조작에 의해 숙주세포와 배지를 분리하여, 배양여과액을 얻는다. 숙주세포 파괴액 또는 배양여과액은 그대로, 또는 황산암모늄침전과 투석을 행한 후에, 본 발명의 단백질의 정제, 단리에 제공될 수 있다.

정제ㆍ단리의 방법으로서는, 이하의 방법을 들 수 있다. 즉, 당해 단백질에 6×히스티딘이나 GST, 말토오스 결합단백과 같은 태그(tag)를 부착하고 있는 경우에는, 일반적으로 사용되는 각각의 태그에 적합한 친화(affinity)크로마토그래피에 의한 방법을 들 수 있다. 예컨대, 한정되는 것은 아니지만, 본 명세서에서 후술하는 실시예 4에서는, N-말단에 6×히스티딘의 태그를 갖는 재조합 항균단백질을 발현시켰다. 당해 재조합 단백질은 6×히스티딘에 친화성을 갖는 Ni-NTA아가로스(Qiagen사)를 사용하여 정제하였다. 한편, 그와 같은 태그를 부착하지 않은 본 발명의 단백질을 생산한 경우에는, 예컨대 후술하는 실시예에 상세하게 서술하고 있는 방법, 즉 이온교환크로마토그래피에 의한 방법을 들 수 있다. 또한, 이것에 더하여 겔여과나 소수성크로마토그래피, 등전점크로마토그래피 등을 조합시키는 방법도 들 수 있다. 또한, Hofmann 등의 문헌(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: p.4666∼4668(1980))에 기재되어 있는 바와 같이, 이미노비오틴(iminobiotin) 친화컬럼을 사용하여 정제하는 방법도 적용할 수 있을 것이다. 후술하는 실시예 5에서는, 50mL의 대장균 배양액으로부터 재조합 tamavidin2 단백질을 1mg의 수율로 얻었다.

상기와 같이 유전공학수법에 의해 얻어진, 또는 천연원으로부터 정제된 본 발명의 항균단백질은, 항균활성을 갖는다. 항균활성은 한정되지는 않지만, 예컨대 마이크로타이터플레이트에 배지(예컨대, 1/2 PD배지, 슈크로오스펩톤배지 등)에 현탁한 도열병균의 포자를 넣고, 거기에 본 발명의 항균단백질을 소정의 농도, 예컨대 10ng/ml∼1000ng/ml, 바람직하게는 50ng/ml의 농도로 첨가하고, 28℃에서 48시간 배양한다. 그리고, 도열병균의 성장ㆍ증식(예컨대, 균사의 신장)이 항균단백질을 가하지 않은 경우와 비교하여 억제되는지 여부를 판단하는 것에 의해, 항균활성을 측정하는 것이 가능하다(실시예 4).

또는, 하기의 방법도 사용가능하다. 샬레에 준비한 한천배지의 중심에 도열병균 콜로니를 배치하고, 그 주위에 상술한 농도의 본 발명의 항균단백질의 수용액의 일정량을 적하하고, 28℃에서 48시간∼1주간 정도 배양한다. 그리고, 항균단백질을 적하한 부분에 있어서 도열병균의 균사의 신장이, 적하하지 않은 부분에 비교하여 억제되는지 여부를 판단하는 것에 의해, 항균활성을 측정하는 것이 가능하다.

항균제

본 발명의 단백질은 강한 항균활성을 갖는다. 예컨대 우리가 사용한 항균분석에서는 벼의 도열병균에 대해서 50ng/ml라는 낮은 농도에서 균사의 성장을 억제한다. 후술하는 실시예에 있어서는, 항균분석용의 식물병원균으로서 벼의 가장 중요병해인 도열병균과 라이족토니아병균을 사용하고, 본 발명에서 동정한 노랑느타리 항균단백질은 이들에 대해서 항균작용을 나타내었다. 본 발명의 단백질이 도열병균 이외의 다른 식물병원균에 대해서도 항균효과를 갖고 있을 가능성이 높다.

이와 같이 본 발명의 노랑느타리유래의 항균단백질은 강한 항균활성을 갖고 있으므로, 항균제나 농약 등의 약제로서 그것이 활성이 있는 형으로 포함되도록 한 제제로서 이용할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA서열을 사용하면, 전술한 바와 같이 예컨대, 대장균이나 효모 등에서 기능하는 발현벡터에 그 DNA를 삽입시켜 대량으로 제조할 수 있다.

본 발명의 항균단백질은 신규한 스트렙트아비딘모양 단백질인 것에서부터, 비타민의 일종인 비오틴(비타민H)과 결합하는 것이 예시된다. 한편 도열병균은 그 생육에 비오틴이 필요한 경우가 알려져 있다. 이들로부터, 본 항균단백질은 분석배지에 존재하는 유리비오틴과 결합하고, 이것이 배지중의 비오틴결실을 일으키고, 그 결과 도열병균의 생육이 억제된 것이 시사되었다. 실제, 후술하는 실시예 4에 기재된 바와 같이, 분석배지중에 비오틴을 과잉으로 첨가하면 본 발명의 tamavidin1의 항균활성은 소실되었다. 더욱이 본 발명자는 시판되는 스트렙트아비딘 및 아비딘에도 tamavidin1과 동일하게 벼도열병균에 대한 항균작용이 있는 것을 발견하여, 이 작용은 결국 비오틴에 의해 파괴된다는 것을 명확하게 하였다.

본 발명에 의해서 비타민의 일종인 비오틴의 양을 제어하는 것에 의해, 병해저항성 특히 벼도열병균 저항성을 식물에 부여할 수 있는 가능성이 시사되었다. 이와 같이 비타민을 제어하는 것에 의해 병해저항성을 부여할 수 있는 가능성이 있는 것은 이제까지 알려져 있지 않았다. 이것은 전부 새로운 개념이다. 이 개념도 본 발명에 포함된다. 예컨대, 본 발명의 항균단백질을 유효성분으로서 포함하는 제제의 농약으로서의 이용을 들 수 있다. 이 경우, 본 발명의 항균단백질 이외의 비오틴결합성 단백질(예컨대 streptmyces avidin ii의 스트렙트아비딘이나 단백질아비딘 및 그들의 동족체 등)도 같은 개념으로 포함된다.

따라서, 본 발명에 의하면, 본 발명의 항균단백질을 유효성분으로서 포함하는 항균제가 제공된다. 본 발명의 항균제는 통상, 식물의 전신 또는 국소적으로 산포할 수 있다.

산포량은 식물의 종류, 생육단계, 증상, 산포방법, 처리시간, 산포하는 단백질의 종류(전체 길이의 단백질, 상기 단백질의 일부를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 단백질 등), 생육하고 있는 장소의 기후, 생육하고 있는 장소의 토양 등에 따라 다르지만, 일일 일회로부터 복수회 매일 내지 수일 두고 산포할 수 있다. 산포량은 여러가지 조건에 따라 변동한다. 본 발명의 항균제의 산포의 경우에는, 필요에 따라서, 용액제(solubiliter), 현탁제, 유탁제(emulsifier) 등을 혼합하여 산포하는 것도 가능하다. 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제로서는, 하나 또는 그이상의 활성물질이 적어도 1개의 불활성인 희석제로서 혼합된다. 수성의 희석제로서는, 예컨대 증류수, 식염수 등을 들 수 있다. 비수성의 희석제로서는, 예컨대 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물오일, 에탄올과 같은 알코올류 등을 들 수 있다.

이와 같은 항균 조성물은, 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제(dispersant) 또는 안정화제(예컨대 아르기닌, 아스파라긴산 등) 등의 보조제를 더 포함하고 있어도 좋다.

이들은 필요에 따라서 박테리아보류필터(bacteriostatic filter)를 통한 여과, 살균제의 배합 또는 조사(照射)에 의해 무균화된다. 이들은 또한 예컨대 동결건조법 등에 의해 무균의 고체조성물의 형태로 제조하고, 사용전에 무균의 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수도 있다.

이와 같이 하여 얻어지는 항균제의 제형으로서는, 사용하는 용도에 따라서 결정하면 좋고, 상기와 같은 첨가물과 혼합하여, 정제, 환제, 산제, 과립제, 액제, 유제 등의 형태에 의해 산포할 수 있다.

또한 본 발명의 항균단백질을 코드하는 유전자를 식물에 도입하므로써 병해저항성 식물을 작성하는 것도 가능하다. 즉, 예컨대 식물에서 기능하는 프로모터와 본 발명의 항균단백질을 코드하는 유전자를 연결하고, 더욱이 그 하부(down stream)에 식물에서 기능하는 터미네이터를 부가한 컨스트럭트(construct)를 식물에 도입하므로써 병해저항성 식물의 작성이 가능하다. 이 경우, tamavidin의 식물세포 밖으로의 분비를 만족시키기 위하여, 본 발명의 항균단백질을 코드하는 유전자의 5'측에 식물에서 기능하는 세포 외분비 시그널펩티드를 코드하는 DNA서열을 부가하는 것도 가능하다. 또한 식물세포 또는 세포외에서의 항균단백질의 축적을 촉진하기 위해서 유전자의 사용코돈(codon usage)을 그 아미노산은 변화시키지 않도록 단자엽 또는 쌍자엽 식물용으로 변화시키는 것도 가능하다. 이와 같은 조합을 사용한 병해저항성 식물의 작출방법도 본 발명에 포함되는 것이다.

tamavidin, 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 이들과 매우 유사한 단백질의 병해저항성 식물의 작출로의 적용 및 벼 이외의 식물로의 적용도 본 발명에 포함되는 것이다. 본 발명에 있어서 해석된 병원균은 벼도열병균이지만, 이 병원균 이외에도 비오틴을 그 생육에 필요로 하는 그 밖의 식물병원균, 병원세균에 효과를 발휘할 가능성은 충분하다고 여겨진다.

더욱이 식물병원균 뿐만 아니라, 비오틴이 그 생육에 필수인 동물 특히 사람이나 가축의 병원균에도 동일한 효과를 발휘하는 것은 당연하다고 여겨지므로, 본 발명의 항균단백질, 아비딘 또는 스트렙트아비딘 및 이들과 매우 유사한 단백질을 그와 같은 면에 치료약으로서 사용하는 경우, 이것은 본 발명의 범주에 속하는 것이다.

스트렙트아비딘에 관해서는 이미 그것의 DNA서열이 개시되어 있지만(Garwin 등. WO/8602077), 전술한 바와 같이 본 발명의 tam1 및 tam2의 DNA서열은, 통상의 데이터베이스검색을 행하여도 스트렙트아비딘의 DNA를 추출하는 것은 아니고, 핵산ㆍ아미노산 서열해석 소프트웨어를 사용하여 스트렙트아비딘과의 DNA의 상동성을 강제적으로 비교하여도 실제로 51.0∼53.8%로 높은 값은 나타나지 않았다.

스트렙트아비딘이나 아비딘은, 비오틴 및 그 유도체와 상당히 강한 결합능력을 가지기 때문에, 분자생물학, 생화학 등의 여러가지 면에 있어서 실험시약으로서 이미 널리 이용되고 있다. 예컨대 핵산이나 단백질검출계로의 이용(Liang. WO/9707244)이나 스트렙트아비딘이나 아비딘을 융합단백질로서 발현하여 비오틴과의 결합능을 사용하여 정제하는 방법(Skerra 등. EP835934, Kopetzki. WO/9711186)등을 들 수 있다. 본 발명의 tamavidin1, tamavidin2도 현재 널리 알려져 있다. 또한 보고되어 있는 사용방법으로 사용할 수 있다.

식물에 관련되는 스트렙트아비딘 또는 아비딘에 관해서는 이제까지 아비딘을 이용한 우성불임식물의 작출(Howard and Albertsen. WO/9640949), 스트렙트아비딘 또는 아비딘의 살충단백질로서의 응용(Czapla 등. WO/9400992), 식물에 있어서 아비딘의 생산(Baszczynski 등. 미국특허. 제5767379호) 등이 보고되어 있다. 또 이들 문헌에 기재되어 있는 스트렙트아비딘 또는 아비딘의 이용법이 본 발명의 노랑느타리유래의 항균단백질에도 적용된다.

선행기술문헌

이하의 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 목적중의 하나는, 비교적 저농도에서 벼의 중요병해인 도열병균을 비롯한 다양한 식물병원균의 생장을 억제할 수 있는 신규한 항균단백질을 검색, 동정하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기한 신규 단백질을 코드하는 유전자를 클로닝하고, 그 염기서열을 특정하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명의 유전자를 숙주생물(미생물, 동물 또는 식물 등)에 도입하여 형질전환체를 작출하여, 본 발명의 유전자의 이용을 도모하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명의 항균단백질을 포함하는 항균제를 제공하는 것이다.

실시예 1 분석계의 구축

1) 검정계의 확립

병원균의 배양 : 벼도열병균(균주 TUS-1, 레이스337; 농림수산성동북농업시험장으로부터 분양)은 오트밀배지(Difco사제, 1% 슈크로오스 첨가)상에서 배양하여 분생포자를 얻어서, 접종원으로 하였다. 포자액은 필요에 따라서 10% 글리세롤을 가하여 -80℃에서 보존하였다.

라이족토니아병균(균주 JT872)는 1/2 감자 덱스트로스 배지(PD배지: Difco사제)에서 2일간 배양하고, 5mm 정도의 균사덩어리 3개를 테프론 호모지나이저(Teflon homogenizer)로 1/2PD배지와 함께 부드럽게 분쇄하여 얻어진단편화 균사(hyphal fragment)를 접종원으로 하였다.

상기의 접종원을 96웰 마이크로타이터 플레이트(코닝사제)에 1웰당 도열병균 분생포자는 약 1,000개, 라이족토니아병균은 단편화 균사가 약 300개로 되도록 100㎕의 1/2PD배지와 함께 가하고, 28℃의 항온기에서 48시간 배양하였다. 균의 증식은 마이크로플레이트리더(Bio-Rad사제, Benchmark)로 595nm에서 흡광도를 측정하였다.

2)노랑느타리로부터의 단백질 추출

시판되는 노랑느타리(Pleurotus cornucopiae)자실체 100g을 미리 가위로 미세하게 절단후, 액체질소를 사용하여 동결하여 유발(乳鉢)에서 세분될때까지 분쇄하고, 300ml의 100mM HEPES-KOH완충액 pH7.5를 가하여 완만하게 교반하면서 4℃에서 30분간 추출을 행하였다. 추출액은 미라크로스(Miracloth)에서 여과후, 10,000×g에서, 20분간 원심분리를 행하였다. 상청에 황산암모늄을 75% 포화되도록 가하여, 하룻밤 4℃에서 정치하였다. 다음에 15,000×g에서, 20분간 원심분리로 침전시켜, 침전물을 3ml의 10mM HEPES-KOH완충액, pH7.5로 용해하고, 투석튜브(Spectra/Por1 MWCO 6-8000, Spectrum Medical Industries사제)를 사용하여 20mM HEPES-KOH완충액, pH7.5에 대해서 투석을 행하였다. 불용물을 원심분리에 의해 제거하여 노랑느타리 단백질 시료로 하였다. 노랑느타리 단백질의 단백질 농도는 소혈청 알부민(BSA)을 표준단백질로서 사용하여 Bradford법으로 측정하였다.

실시예 2 항균단백질의 정제

1) 노랑느타리 조단백질시료의 항균활성

상기의 도열병균, 라이족토니아병균의 배양계에 배양개시 직후에 노랑느타리 단백질 시료를 일정량 가하여 배양 2일후(46∼48시간후)의 흡광도를 측정하여 항균성의 유무에 관해서 판정하였다. 그 결과, 노랑느타리의 추출물 중에는 도열병균, 라이족토니아병균 양 균에 대해서 높은 항균활성을 갖는 물질이 포함되어 있다는 것이 명확하게 되었다. 저해의 양상은, 도열병균의 경우, 발아의 완전억제나 균사의 생장저해가 관찰되고, 라이족토니아병균의 경우는 균사의 생장저해가 관찰되었다. 도열병균의 세포의 경우, 그 세포질이 세포벽으로부터 분리되어 원형질분리(plasmolysis)모양의 양상을 나타내고 있었다.

검출된 항균활성의 성질을 더 상세하게 해석하기 위해서, 열처리를 행하여 잔존활성을 조사하였다. 열처리는 60℃, 80℃에서 10분간 행하여 항균분석을 행하였다. 활성의 강도는 단백질 시료를 희석하므로써 추정하였다. 그 결과 60℃ 처리에서는 도열병균, 라이족토니아병균 양쪽에 대한 항균활성은 무처리와 동등한 활성이 유지되고 있었다. 한편 80℃처리에서는 라이족토니아병균에 대한 항균활성은 소실되었다. 그런데 도열병균에 대한 항균활성은, 80℃처리에 의해서 원형질분리를 일으키는 활성은 소실하였지만, 균사의 선단(hyphal apices)을 팽창시켜 생장을 정지시키는 신규한 활성이 존재한다는 것이 명확하게 되었다(도 1).

또한 노랑느타리 조단백질시료 열처리 분획에 포함되는 이들의 활성을 담당하는 본체의 대략의 분자량을 파악하기 위해서, 한외여과막(ultrafiltration membrane)에 의해 샘플을 분획하고, 항균활성을 조사하였다. 한외여과막은 울트라프리 MC10,000 NMWL 필터유니트(컷오프분자량 10000, Millipore제)를 사용하고, 막을 통과한 분획과 막을 통과하지 않은 분획을 나누어 분석을 행하였다. 그 결과 전체의 활성은 막을 통과하지 않은 분획에만 존재하고 있었다. 따라서 활성 본체(active core)의 분자량은 적어도 10000 이상인 것이 예상되었다.

2) 이온교환컬럼에 의한 정제

다음에 항균단백질의 정제를 행하였다. 조단백질시료 150mg/20ml를 우선, 이온교환단체(ion exchanger) Q Sepharose FF(Pharmacia사제)를 충진한 자체 제작한 컬럼(내경 1.5cm×길이 10cm, 단체용량(column volume) 10ml)에 걸어서, 항균단백질을 부분정제하였다. 유속은 2ml/분으로 하고, 기본완충액은 50mM Tris pH8.0, 50mM NaCl, 용출완충액은 50mM Tris pH8.0, 600mM NaCl을, 구배(NaCl에서 50mM∼600mM)는 100분간 걸었다. 각 분획(12.5ml)의 일부를 도열병균에 대한 항균분석과, SDS-PAGE전기영동에 공시하였다. 각 분획의 단백질 용액에 등량의 2×SDS 영동용 완충액(running buffer)(Sambrook 등.(1989) Molecular Cloning 2판, Cold Spring Harbor)을 가하여, 95℃에서 5분간 처리한 후, Laemmli(Laemmli(1970) Nature 227: p.680∼685)의 방법에 따라서, SDS-PAGE 전기영동을 행하였다. 겔은 15%의 PAGEL(ATTO사제)를 사용하고, 은염색II키트 와코(화광순약사제)에 의해 단백질을 검출하였다. 단백질의 대략의 분자량과 양을 견적하기 위해서, 분자량마커(LMW 마커키트: Pharmacia LKB사제, 분자량이 큰 순서로 94kDa, 67kDa, 43kDa, 30kDa, 20.1kDa, 14.4kDa)를 영동하였다. 단백질의 은염색에 의한 전기영동상과 항균성의 강도와의 관계를 도 2에 나타내었다.

항균활성으로서 NaCl농도가 160mM에서의 피크와, 240mM∼280mM에서의 피크두개가 나타났다. 160mM에서의 피크에 포함되는 단백질은, 균사의 선단을 팽창시켜 생장을 정지시키고, 70℃, 10분의 처리에서도 그 활성은 상실하지 않았다. 한편 240mM∼280mM에서의 피크에 포함되는 단백질은 도열균 세포에 원형질 분리를 생기게 하고, 동 열처리에 의해 실활하였다. 따라서 전자의 160mM에서의 피크에 포함되는 항균단백질의 정제를 시도하였다.

NaCl농도가 120mM∼240mM에 상당하는 분획을 투석튜브(Spectra/Por1 MWCO 6-8000, Spectrum Medical Industries사제)로 옮기고, 50mM Tris-HCl pH8.0, 50mM NaCl에 대해서 4℃에서 하룻밤 투석을 행하였다. Centriprep-10(컷오프분자량 10,000, Amicon사제)을 사용하여 농축한 후, 70℃에서 30분간 열처리를 행하였다. 원심분리후 상청을 0.22㎛의 필터로 여과하였다. 이 단백질샘플(약 10ml)을 MonoQ HR 5/5(Pharmacia사제)에 의한 항균단백질의 분리정제에 공시하였다. 유속은 1ml/min으로 하고, 기본완충액은 50mM Tris-HCl, pH8.0, 50mM NaCl, 용출완충액은 50mM Tris-HCl, pH8.0, 500mM NaCl을 사용하고, 구배(NaCl에서 50mM로부터 500mM)는 시료를 넣고 20분 후로부터 40분간 걸었다. 각 분획(1ml)의 일부를 도열병균에 대한 항균분석과, SDS-PAGE전기영동에 공시하였다.

우선, HPLC의 챠트와 항균성의 강도와의 관계를 도 3에 나타내었다. 그 결과, 이온강도(NaCl 농도)가 200mM∼260mM 부근에서 항균단백질의 용출피크가 나타났다.

전기영동상과 항균성의 강도와의 관계를 도 4에 나타내었다. 각 레인 위에 표시한 숫자는 도 3의 분획의 번호에 준하여 표시하였다. 항균성과 관련된다고 여겨지는 단백질의 밴드를 정밀하게 검사하면, 약 15kD의 2개의 밴드를 유력후보로 들 수 있었다(도 4 화살표). 이 밴드의 농도와 항균활성의 정도는 플러스의 상관관계에 있으므로, 이 밴드가 항균 단백질 본체일 가능성이 시사되었다.

3) 겔여과컬럼에 의한 정제와 분자량의 추정

노랑느타리 항균단백질의 정제, 그리고 native한 상태의 분자량을 추정하기 위하여, 상기의 MonoQ분획의 #41∼46을 울트라프리 MC 10,000 NMWL 필터유니트(Millipore사제)로 농축하고, 겔투과컬럼 Superose6 HR 10/30(Pharmacia사제)에 공시하였다. 유속은 0.5ml/분으로 하고, 완충액은 50mM MES-NaOH pH6.0, 50mM NaCl을 사용하였다. 우선 Gel filtration standard(BIO-RAD사제)에 의해 단백질의 분자량 및 대략의 용출시간을 파악한 후, 항균활성이 있는 MonoQ 분획을 넣었다.

그 결과, A280에서 단백질을 모니터하면 30kDa을 정점으로 하는 날카로운 피크가 나타났다(도 5). 항균활성은 30kDa의 피크와 근접한 그 전후에 집중하였다. 이것으로부터, 노랑느타리가 갖는 항균성은 겔여과에 의해 대략 30kDa의 분자량을 갖는 단일한 단백질에서 유래하는 것을 알았다. 또한, 각 프랙션(0.25ml)을 SDS-PAGE후 은염색하면, 30kDa 부근에만 도 4에 나타난 15kDa의 밴드가 검출되었다(도 6). 15kDa 이외의 밴드는 발견되지 않았으므로, 항균성에 기여하고 있는 것은 15kDa의 단백질인 것이 다시 한번 강하게 시사되었다. 분자량마커(20.1kDa의 트립신 인히비터)로부터 덴시토미터(densitometer)에 의한 항균단백질의 양을 추정하고, 벼도열병균에 대한 50% 생장저해농도를 산출하면, 대략 50ng/ml로 계산되었다.생중량 100g의 노랑느타리 자실체로부터 상기의 방법으로 정제되어 얻어지는 당해 항균단백질의 양은 대략 0.2mg이었다.

실시예 3 cDNA의 단리

1) 노랑느타리 항균단백질의 아미노산서열의 해독

상기의 Superose6 분획을 울트라프리 MC 10,000 NMWL(Millipore사제)로 농축하고, SDS-PAGE 전기영동하였다. Tris를 제거하고, 글리신을 포함하지 않은 완충액계에서 PVDF막(Millipore사제)으로 전사(transfer)하고, 쿠마시 브릴리언트 블루-R-250로 가볍게 염색한 후, 탈색하였다. 그 후, 항균성에 관여한다고 여겨진 15kDa의 단백질밴드를 절출하였다. 또한 15kDa의 단백질을 리실 엔도펩티다아제(lysyl endopeptidase)(화광순약공업사제) 또는 V8프로테아제(화광순약공업사제)에서 부분소화하였다.

그 결과, 리실 엔도펩티다아제 소화로부터는 14kDa가, 또는 V8프로테아제 소화로부터는 14kDa와 12kDa가 얻어졌다. 이들의 밴드를 동일하게 영동후 막에 전사하였다. 다음으로, 기체상 프로틴 시퀀서(HPG1005A Protein Sequencing System)을 사용하여, N말단 아미노산서열을 에드맨 분해법(Edman degradation)에 의해 결정하였다.

그 결과, 15kDa 단백질로부터는 다음과 같은 44아미노산:

N말단-Leu Xaa Gly Xaa Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Xaa Xaa Met Asn Leu

Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Xaa Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu

Val Pro Xaa Xaa Tyr His Leu Ala Gly Arg Tyr-C말단 (서열번호5)

이 결정되었다(상기 아미노산서열에 있어서, Xaa는 미정, 이하 동일). 또한, 14kDa 단백의 리실 엔도펩티다아제 소화물로부터는 다음과 같은 50아미노산:

N말단-Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val

Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln

Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val-C말단 (서열번호6)

또한, 14kD 단백질의 V8프로테아제 소화물로부터는 다음과 같은 21아미노산:

N말단-Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu

Thr Ala Asn Lys Asp Gly-C말단 (서열번호7)

또한, 12kDa 단백질로부터는 다음과 같은 23아미노산

N말단-Leu Thr Gly Thr Xaa Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Xaa Asn Leu

Thr Ala Asn Xaa Asp Gly Xaa Leu-C말단 (서열번호8)

이 결정되었다.

최종적으로 다음과 같은 69아미노산이 결정되었다.

N말단-Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Met Asn Leu

Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu

Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly

Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val

-C말단 (염기서열9)

2) 축중(degenerate)프라이머의 설계

1)에서 결정된 아미노산서열에 근거하여, 가능한 모든 염기가 믹스된 4개의 프라이머를 합성하였다. 괄호내의 숫자는 축중도를 나타낸다.

TMR1 : 5'-acnggnacntggtayaayg-3' (256)

(서열번호9의 2번째의 아미노산 잔기 Thr 내지 8번째의 Glu에 대응)

(서열번호10)

TMR2 : 5'-garytiggiwsnacnatgaa-3' (256)

(서열번호9의 8번째의 아미노산 잔기 Glu 내지 14번째의 Asn에 대응)

(서열번호11)

TMF1 : 5'-gtrttytcraaiswiacn-3' (128)

(서열번호9의 59번째의 아미노산 잔기 Ala 내지 65번째의 Thr에 대응)

(서열번호12)

TMF2 : 5'-cciarigtnacnccytgncc-3' (256)

(서열번호9의 51번째의 아미노산 잔기 Gly 내지 57번째의 Gly에 대응)

(서열번호13)

다만, 상기에 있어서 「i」는 「이노신」을, 「r」은 「g 또는 a」를, 「y」는 「c 또는 t」를, 「w」는 「a 또는 t」를, 「s」는 「g 또는 c」를, 그리고 「n」은 「a 또는 g 또는 c 또는 t」를 각각 나타낸다.

3) 노랑느타리 자실체 cDNA라이브러리의 구축

노랑느타리 자실체로부터 SDS페놀법으로 전체 핵산을 추출하고, 염화리튬 침전에 의해 전체 RNA를 회수하였다. 여기에서 mRNA 정제 키트(Pharmacia사제)에 의해 노랑느타리 mRNA를 제조하였다. 자실체 약 5g으로부터 10㎍의 mRNA가 얻어졌다. 이중 5㎍은 ZAP cDNA 합성 키트(Stratagene사제)에 공시하여, cDNA를 합성하였다. 겔여과 컬럼에 의해 대략 0.5∼5kb의 cDNA를 분획하고, Uni-ZAP XR 벡터(Stratagene사제)에 라이게이션하고, GigapackIII(Stratagene사제)에 의해 패키징을 행하였다. 전체 순서는 키트에 첨부한 설명서에 따랐다. 구축한 노랑느타리 자실체 cDNA라이브러리의 타이터(titer)는 대략 300만pfu로 산출되었다.

4) RT-PCR에 의한 프로브의 취득

2)에서 합성한 프라이머를 사용하여 3)에서 합성한 cDNA를 주형으로 PCR을 행하고, 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브로 적합한 노랑느타리 항균단백질의 부분길이 cDNA의 증폭을 시험하였다. 반응조건은 이하와 같이 행하였다. 50㎕의 반응액중에 cDNA 10ng, 10×Ex taq buffer 5㎕, 2.5mM의 각 dNTPs 4㎕, 프라이머 5피코몰/각 서열, Ex taq(Takara사제)+Taq START 항체(Clontech사제) 1㎕를 각각 포함하고, 프로그램 온도조절 시스템 PC-700(ASTEK사)를 사용하여, 94℃ 3분을 1회, 94℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 1분을 35회, 72℃ 6분을 1회 행하였다. 그 결과, TMR1-TMRF1, TMR1-TMRF2, TMR2-TMRF1, TMR2-TMRF2의 전체의 프라이머 조합에 있어서, 각각 대략 150∼190bp의 산물이 증폭되었다.

이들 PCR산물을 겔정제하고, 벡터 pCRII(Invitrogen사제)에 클로닝하였다. 이들의 클론의 염기서열을 결정한 결과, 1)에서 결정된 아미노산서열과 전부 동일한 아미노산서열을 코드하는 cDNA(TMR2-TMRF1, TMR2-TMRF2의 조합유래. 특히 TMR2-TMRF2의 조합유래의 cDNA를 TM100이라 명명)와, 1)에서 결정된 아미노산서열과 약75%의 상동성을 갖는 아미노산서열을 코드하는 cDNA(TMR1-TMRF1, TMR1-TMRF2를 조합시킨 것에서 유래. 특히 TMR1-TMRF1을 조합시킨 것에서 유래한 cDNA를 TM75라 명명)의 2종류가 포함되어 있었다.

5) 전장 cDNA의 스크리닝

4)에서 얻어진 cDNA클론 TM100, TM75를 벡터로부터 절제하고, 이것을 프로브로 사용하여 노랑느타리 자실체 cDNA라이브러리를 스크리닝하였다. 14×10cm의 각형(square) 샬레에 ZAP cDNA 합성 키트(Stratagene사제)의 설명서에 따라서, 약 20,000pfu의 파지(phage)를 숙주균 XL1-blue MRF'와 함께 플레이팅하였다. 플라크(plaque)를 Hybond-N+나일론멤브레인필터(Amersham사제)에 접촉시키고, 멤브레인 첨부의 설명서에 따라서 알칼리처리를 행하여 DNA를 변성시키고, 멤브레인상에 고정시켰다. 프로브는 rediprime II^TMDNA labelling system(Amersham사제)을 사용하여³²P라벨하였다. 혼성화는 0.5M NaHPO₄(pH7.2), 7% SDS, 1mM EDTA중에서 65℃에서 하루밤, 세정의 조건은 40mM NaHPO₄(pH7.2), 1% SDS, 1mM EDTA중에서 65℃, 20분을 2회 행하였다. 1차 스크리닝에서 약 160,000pfu의 파지로부터 TM100프로브로 600개, TM75프로브로 30개의 포지티브클론이 얻어졌다. 그 중 TM100프로브로 24개, TM75프로브로 12개의 클론에 대해서, 2차 스크리닝 및 플라크의 정제를 겸한 3차 스크리닝을 행하여, 선택된 클론 전부에 관해서 ZAP cDNA 합성 키트(Stratagene사제)의 설명서에 따라서, 생체내(in vivo) 절제를 행하였다. 그 결과, TM100프로브로 18개, TM75프로브로 12개의 클론이, 파지미드(phagemid)벡터 pBluescript SK에삽입된 cDNA로서 회수되었다. 이들의 클론에 관해서 제한효소분석에 의해 인서트길이를 동정하였다.

6) 염기서열의 결정

상기의 각 cDNA클론에 관해서, 최장의 클론의 전체 염기서열을 양쪽 사슬 모두 결정하였다. 우선, M13프라이머(takara)를 사용하여, ABI PRISM 형광시퀀서(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer사제)로 클론의 5',3' 양 부분의 염기서열을 결정하였다.

다음에, TM100유래의 최장클론의 5'부분의 염기서열정보에 근거하여, 프라이머

TM100inRV: gTC AAg gCg TTA CTC Tgg

(서열번호14)

를, 동 3'부분의 염기서열정보에 근거하여 프라이머

TM100inFW: CTg ggT gAg gAT CAC CTC

(서열번호15)

를, 더욱이 TM75유래의 최장클론의 5'부분의 염기서열정보에 근거하여 프라이머

TM75inRV: gAT gTC TAC gTg CCC TAC

(서열번호16)

을, 동 3'부분의 염기서열정보에 근거하여 프라이머

TM75inFW: ACg ACT CAg AgA AgA ACT g

(서열번호17)

을 각각 합성하고, 서열결정에 이용하였다. 이상과 같이 하여 TM100 및 TM75유래의 최장클론에 관해서 DNA의 양 사슬의 서열을 해독하고, 전체 염기서열을 결정하였다.

그 결과, 노랑느타리 항균단백질을 코드하는 cDNA(TM100프로브유래)는 전체 길이 671염기로 이루어지고(서열번호1), 143개의 아미노산을 코드하고 있었다(서열번호2). 정제단백질로부터 결정된 N말단의 아미노산은 서열번호2의 아미노산서열의 8∼76의 아미노산 잔기에 상당하였다. 서열번호2의 아미노산서열과 정제단백질로부터 직접 결정된 67개의 아미노산의 상동성은, 결정되지 않은 2개의 아미노산(서열번호2의 아미노산서열에서는 제65번째의 W 및 제73번째의 S에 상당) 이외의 전체의 아미노산이 동일하였다. 이것으로부터, 클로닝한 cDNA는 노랑느타리 항균단백질을 코드하는 유전자로부터 유래한다고 결론지었다.

cDNA서열로부터 결정되는 단백질의 N말단과, 실제의 정제단백질의 N말단은 일치하지 않고, 번역개시 메티오닌의 7아미노산 다음의 L(루이신)이 정제단백질의 N말단이었다. 이것으로부터, 노랑느타리 항균단백질은 이미 전구체형으로서 번역된 후, N말단의 리더서열(7아미노산)이 절제되어 분리된다고 추정되었다. 추정성숙단백질의 아미노산서열(서열번호2 중 8∼143의 136개의 아미노산서열)로부터 유전자서열해석 소프트웨어 GENETYX-WIN ver3.2(Software Development Co.,Ltd.)를 사용하여 평균분자량을 구하면 15158.4로 되고, 등전점은 6.22로 산출되었다. 이 분자량은 정제단백질의 SDS-PAGE에 의한 견적(15kDa)과 잘 일치하였다. 또한 추정 글리코실화 반응 부가부위가 2개소(서열번호2의 아미노산 잔기21, 동71의 N) 존재하고 있었다.

한편, 노랑느타리 항균단백질의 동족체를 코드하는 cDNA(TM75유래)는 전체길이 840염기로 이루어지고(서열번호3), 141개의 아미노산을 코드하고 있었다(서열번호4). 이 cDNA의 5'측에는 3개의 ATG가 존재하지만, 1번째와 2번째의 ATG로부터 번역을 개시하면 그들 바로 뒤에 종결코돈이 나타나고, 각각 12개, 31개의 아미노산만이 코드될 수 있다. 141개의 아미노산을 코드할 수 있는 것은 3번째의 ATG로부터 번역이 개시된 때만이다. 또한 이 ATG의 102bp 상류(upstream)에는 동일한 해독구조에 종결코돈 TGA가 위치하고 있었다. 따라서 3번째의 ATG가 번역개시코돈인 것은 거의 확실하다.

추정 성숙아미노산서열(서열번호4의 아미노산서열 중 8∼141의 잔기로 이루어진 134개의 아미노산서열)로부터 추정되는 분자량은 14732.2, 등전점은 8.62로 산출되었다. 또한 추정 글리코실화 반응 부가부위가 1개소(서열번호4의 아미노산번호115의 N) 존재하고 있었다. GENETYX-WIN을 사용하여 본 발명의 노랑느타리 항균단백질과 그 동족체의 상동성을 해석한 결과, 아미노산에서 65.5%, DNA에서 64.5%(ORF부분은 72.2%)이었다.

본 발명의 노랑느타리유래 항균단백질 및 그 유전자, 더욱이 그 동족체와 그것에 의해 코드되는 아미노산서열을 갖는 단백질에 관해서, GeneBank 데이터베이스의 BLAST에 의한 상동성 검색을 행하였다. 본 발명의 노랑느타리유래 항균단백질의 아미노산서열(서열번호2의 전체 아미노산서열)의 데이터베이스 검색의 결과streptmyces violaceus의 스트렙트아비딘 v2(기탁번호: Q53533, Bayer 등.(1995) Biochim Biophys Acta 1263: p.60∼66), v1(기탁번호: Q53532),streptmyces avidin ii의 스트렙트아비딘(기탁번호: P22629, Argarana 등.(1986) Nucleic Acids Res 14: p.1871∼1882) 등이 상동성을 갖는 것으로 나타났다. 상동성은 3개 모두 128아미노산에 달하고, 각각 50%, 49%, 49%이었다. 이들보다 낮은 상동성으로 난백아비딘(Gope 등.(1987) Nucleic Acids Res 15: p.3595∼3606)이나 어느 하나의 아비딘 관련 단백질(Keinanen 등.(1994) Eur J Biochem 220: p.615∼621)도 나타났다. 또한, 스트렙트아비딘과 1아미노산만 다르고, N말단측, C말단측이 각각 36아미노산분, 20아미노산분 스트렙트아비딘보다도 짧게 되어 있는(truncated) 코어스트렙트아비딘 뮤턴트w79f ChainB(Freitag 등.(1997) Protein Sci. 6: p.1157∼1166)도 나타났다. 상동성은 51.7%이었다.

이상으로부터, 본 단백질은 신규한 단백질이라고 여겨졌다. 본 발명의 제 2의 노랑느타리유래 항균단백질의 아미노산서열(서열번호4의 전체 아미노산서열)의 데이터베이스검색의 결과에서는 스트렙트아비딘 v2, v1, 스트렙트아비딘과 각각 50%, 48%, 48%의 상동성을 나타내었다.

한편, 제 1의 노랑느타리유래 항균단백질을 코드하는 유전자의 DNA서열(서열번호1의 71∼502) 및 제2의 노랑느타리유래 항균단백질을 코드하는 유전자의 DNA서열(서열번호3의 226∼651)을 사용한 동 데이터베이스 검색에서는, 상당히 짧은 범위(23bp)에서 상동성을 나타내는 서열이 몇개 검출된 것에 불과하고, 스트렙트아비딘의 DNA서열 등은 검출되지 않았다. 이것은 본 발명의 신규단백질을 코드하는 DNA서열은 DNA레벨에서는 스트렙트아비딘의 DNA서열 등과 상동성이 그다지 높지 않은 것을 의미한다.

본 항균단백질은 식용버섯 노랑느타리로부터 정제된 신규한 스트렙트아비딘모양 단백질이므로, 'tamavidin'이라 명명하였다. 정제한 단백질유래의 유전자를 tam1, 이것이 코드하는 아미노산서열을 갖는 단백질을 tamavidin1, tam1의 동족체를 tam2, 이것이 코드하는 아미노산서열을 갖는 단백질을 tamavidin2라 부르기로 한다. 유전자 서열해석 소프트웨어 GENETYX-WIN ver3.2를 사용하여 본 발명의 노랑느타리 항균단백질과 스트렙트아비딘(스트렙트아비딘은 스트렙트아비딘 v2, v1과 각각 9아미노산, 1아미노산 다를 뿐이다)의 아미노산서열 전체의 상동성을 해석한 결과, tam1이 코드하는 tamavidin1의 아미노산서열에서 46.7%, tam2이 코드하는 tamavidin2의 아미노산서열에서 48.1%의 상동성(아미노산 동일성)을 나타내었다. 한편, DNA서열(서열번호1 및 3) 전체에서는 스트렙트아비딘과의 상동성은 tam1에서 53.8%(ORF부분에서는 56.8%), tam2에서는 51.0%(ORF부분에서는 57.3%)이었다. 또한 tam1에 의해 코드되는 노랑느타리 항균단백질과 단백질아비딘과의 상동성은 아미노산서열에서 31.2%, DNA서열에서 42.4%이고, tam2에 의해 코드되는 노랑느타리 항균단백질과 단백질아비딘과의 상동성은 아미노산서열에서 36.2%, DNA서열에서 41.8%이었다.

Tamavidin1, tamavidin2, 스트렙트아비딘, 스트렙트아비딘 V1, 스트렙트아비딘 V2 및 아비딘의 성숙 단백질영역의 아미노산서열의 분자계통수를, GENETYX-WIN을 사용하여 UPGMA법에 의해 작성하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이,tamavidin1 및 tamavidin2는, 스트렙트아비딘의 그룹 및 아비딘과는 다른 제 3의 그룹을 형성하고 있다는 것이 분명하게 되었다.

스트렙트아비딘과 비교한 경우, 본 발명의 tamavidin1, tamavidin2는 N말단측이 33아미노산 짧게 되어 있지만, 비오틴과의 결합에 관여하고 있다고 여겨지고 있는 트립토판(W)잔기(Gitlin 등.(1988) Biochem J 256: p.279∼282), 티로신(Y)잔기(Gitlin 등.(1990) Biochem J 269: p.527∼530)는 전부 보존되어 있다(서열번호2의 아미노산서열중 제34, 제45번째의 Y, 제82, 제98, 제110번째의 W, 서열목록의 서열번호4의 아미노산서열중, 제34, 제45번째의 Y, 제80, 제96, 제108번째의 W).

또한 성숙단백질영역이라 여겨지는 부분(서열번호2의 아미노산서열중 8∼143의 서열, 서열번호4의 아미노산서열중 8∼141의 서열)의 평균분자량은 각각 15158.4, 14732.2로 산출되고, 성숙스트렙트아비딘이나 성숙아비딘의 평균분자량(각각 16490.6, 14342.9)과 유사하였다. 이들은, tam1에 코드되어 있는 tamavidin1은 물론, tam2에 코드되어 있는 tamavidin2에 관해서도 비오틴 결합능을 갖는 단백질인 것을 강하게 시사하는 것이다.

실시예 4 비오틴 첨가에 의한 항균활성 소실실험

본 발명의 항균단백질은 신규한 스트렙트아비딘모양 단백질인 것으로부터, 비타민의 일종인 D-비오틴(비타민H, 편출화학공업사제)와 결합하는 것이 시사된다. 한편 도열병균은 그 생육에 비오틴이 필요하다는 것이 알려져 있다. 이들로부터, 본 항균단백질은 분석배지에 존재하는 유리비오틴과 결합하고, 이것이 배지중의 비오틴 결실을 일으키고, 결과적으로 도열병균의 생육이 억제된다고 예측된다.

비오틴첨가에 의한 항균활성의 소실실험의 결과를 도 8에 나타낸다. 구체적으로는, 마이크로타이터 플레이트에 1/2 PD배지에 현탁된 도열병균의 포자를 넣고, 거기에 정제 tamavidin1을 50ng/ml 또는 1000ng/ml의 농도로 첨가한 웰, 또한 1000ng/ml의 tamavidin1에 더하여 100ng/ml의 농도의 비오틴을 가한 웰, 또한 단백질 무첨가의 대조군웰을 설치하고, 28℃에서 48시간 배양하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 tamavidin1 첨가웰에서는 50ng/ml의 농도에서도 도열병균의 균사의 신장은 상당히 억제되었다. 이에 반해서, tamavidin1(1000ng/ml)와 비오틴의 양쪽을 첨가한 웰, 및 대조군웰에서는 균사는 정상적으로 신장하였다. 이와 같이 실제로 분석배지중에 비오틴을 과잉으로 첨가하면 본 항균단백질의 항균활성은 소실되었다. 이것은 과잉으로 가한 비오틴의 어느 일정량이, 분석에 사용된 tamavidin1의 대부분과 결합하여 그 항균성을 불활화하였기 때문이라고 추론되었다.

더욱이, 시판되는 단백질아비딘(Sigma사제) 및 streptmyces 아비딘 ii의 스트렙트아비딘(Sigma사제)을 사용하고, 1000ng/ml의 농도에서 동일한 시험을 행하였다. 그 결과, 양 단백질 모두, 도열병균에 대해서 항균활성이 있어, 그 활성은 비오틴으로 파괴된다는 것이 명확하게 되었다(도 8).

실시예 5 재조합 tamavidin2 단백질의 비오틴결합활성

1) 발현벡터의 구축

tam2의 유전자는 본 발명의 tam1유전자의 동족체로서 단리된 유전자이지만, 이 tam2유전자에 의해서 코드되는 tamavidin2가 실제로 비오틴 결합활성을 나타내는지 여부를 조사하였다. 구체적으로는 tam2유전자를 대장균에 삽입하고, 재조합 tamavidin2를 발현시키고, 이 단백질이 이미노비오틴컬럼에서 정제되는지 여부를 조사하였다.

우선, 실시예 3에서 얻어진 tam2유전자의 전체 ORF(서열목록의 서열번호 3중, 제226번째로부터 제651번째의 염기)를 PCR에 의해 증폭시키기 위해서

1조의 프라이머

TM75Bsp5:5' -ACCAACATgTCAgACgTTCAA-3'

(서열번호18)

TM75Hin3:5' -ATgAAAgCTTTTACTTCAACCTCgg-3'

(서열번호19)

를 합성하였다. TM75Bsp5에는 제한효소 BspLU 11I의 인식부위(밑줄로 표시하였다)가, TM75Hin3에는 제한효소 HindIII의 인식부위(밑줄로 표시하였다)가 각각 삽입되어 있다. 이들 프라이머를 사용하여 tam2유전자가 삽입된 플라스미드(pBluescript, 실시예 3(6))를 주형으로 PCR을 행하였다. 50㎕의 반응액중에 주형 플라스미드 DNA 500ng, 10×Pyrobest buffer 5㎕, 2.5mM 각 dNTPs 4㎕, 각 프라이머 10pmoles, Pyrobest DNA 폴리머라제(Takara사제) 0.5㎕를 각각 포함하고, 프로그램 온도조절 시스템PC-700(ASTEK사제)을 사용하여, 94℃, 3분을 1회, 94℃, 1분, 50℃, 1분, 72℃, 1분을 15회, 72℃, 6분을 1회 행하였다.

얻어진 PCR산물을 제한효소 BspLU 11I(Roche사제), HindIII(Takara사제)로 2중 소화하고, 겔정제하였다. 대장균 발현용 벡터는 pTrc99A(Pharmacia LKB사제)를사용하였다. 이 벡터를 제한효소 NcoI(Takara사제), HindIII로 2중 소화하여 겔정제한 것을, 상술한 제한효소처리를 실시한 PCR산물과 라이게이션하고, 대장균TB1에 삽입하였다. 삽입된 tam2 유전자의 염기서열을 확인하였다.

2) 재조합 단백질의 발현과 비오틴컬럼에 의한 정제

tam2가 삽입된 발현벡터 pTrc99A를 갖는 대장균TB1의 단일콜로니를 항생물질 암피실린을 포함하는 LB배지에 접종하고, OD₆₀₀=0.5 정도로 될때까지 균을 전배양(preculture)하였다. 다음 IPTG를 최종농도 1mM 가하고, 단백질 발현을 유도하고, 37℃에서 4.5시간 더 진탕배양(shaking culture)하였다. 배양스케일은 50mL로 하고, IPTG(Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside, 화광순약사제)를 가하지 않은 것을 대조군으로 하였다. 균체를 원심분리에 의해 모으고, 단백질 정제를 할때까지 -80℃에서 보존하였다.

Tamavidin2의 정제는 호프만 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4666∼4668(1980))을 참조로, 이미노비오틴에 의한 정제를 행하였다. 균체를 1.5mL의 완충액 A(50mM CAPS (3-[시클로헥실아미노]-1-프로판설폰산, SIGMA사제), pH11, 50mM NaCl)중에 현탁하고, 음파처리에 의해 균체를 파괴하였다. 원심분리후 상청액을 총 가용성 단백질로 하였다. 2-Iminobiotin-Agarose(SIGMA사제) 0.5mL를 직경 0.5cm, 길이 5cm의 컬럼에 충진하고, 완충액 A로 평형화(equilibration)하였다. 이 이미노비오틴아가로스컬럼에, 총 가용성 단백질을 통과시켰다. 컬럼을 5mL의 50mM CAPS pH11, 500mM NaCl로 세정후, 1.5mL의 50mM NH₄OAC pH4.0에 의해tamavidin2를 용출하였다. 총 가용성 단백질, 컬럼통과분획, 세정분획, 용출분획을 15% PAGEL(ATTO사제)을 사용하여 SDS-PAGE 전기영동하였다.

영동후, 단백질을 Coomassie Brilliant Blue R-250(화광순약제)으로 염색하였다. 결과를 도 9에 나타낸다. 도 9에 나타난 바와 같이, 1mM의 IPTG에 의해 단백질 발현유도를 한 대장균의 총 가용성 단백질 분획(T)에 발현유도를 하지 않은 경우(C)에는 존재하지 않는 15kDa 부근의 밴드가 관찰되었다. 이 분자량은 tam2유전자가 코드하는 141개의 아미노산으로부터 추정되는 분자량 15467과 잘 일치하였다.

더욱이 이 15kDa단백질은, 이미노비오틴컬럼 통과분획(F), 동 세정분획(W)에는 나타나지 않고, 50mM NH₄OAC pH4.0에 의한 용출분획(E)에 나타났다. 용출분획에서는 이 15kDa 단백질이 주요요소로 되어 있었다. 이 결과로부터, tam2에 코드되는 tamavidin2는 비오틴에 결합하는 것이 명확하게 되었다. 더구나 상기에 나타난 방법으로 간편하게 정제될 수 있다는 것이 명확하게 되었다. 50mL의 배양에서 얻어지는 대장균발현 재조합tamavidin2의 수율은 대략 1mg이었다.

본 발명의 서열번호2 또는 4의 아미노산서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그 일부의 서열로 이루어지고, 또한 비오틴 또는 그 유도체와 결합하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 성분을 유효성분으로 하여 포함하는 정제를 작출하면, 항균제로서의 이용을 기대할 수 있다.

또한, 본 발명의 서열번호1의 71∼502 또는 92∼502의 서열을 갖는 DNA 또는 서열번호3의 226∼651 또는 247∼651의 서열을 갖는 DNA를 식물세포중에서 기능하도록 적당한 구성적 프로모터, 기관ㆍ시기특이적 프로모터, 또는 스트레스나 병해충에 반응하는 유도성의 프로모터서열과, 식물세포에서 기능하는 터미네이터서열의 발현카세트(expression cassette)로 삽입, 식물세포에 도입, 재생개체를 얻는 것에 의해, 병해저항성 식물을 작출할 수 있다. 이 경우 본 발명의 항균단백질을 코드하는 DNA서열에 세포내 소기관으로의 수송시그널 또는 세포외 분비를 위한 시그널서열을 코드하는 DNA서열을 연결하는 것도 가능하다.

본 발명의 단백질을 코드하는 DNA를 대장균, 효모, 식물 또는 곤충이나 예컨대, 아프리카산 발톱개구리 등의 동물세포에서 외래단백질을 발현시킬 수 있는 벡터로 삽입, 당해 세포내에서 본 발명의 단백질을 생산, 대량정제하는 것이 가능하게 된다. 이 경우 본 발명의 항균단백질을 코드하는 DNA서열에 세포내 소기관으로의 수송시그널 또는 세포외 분비를 위한 시그널서열을 코드하는 DNA서열을 연결하는 것도 가능하다.

본 발명의 단백질과 비오틴과의 강한 상호작용은, 현재 스트렙트아비딘이나 아비딘에 있어서 널리 이용되고 있는 것과 같이 다양한 분석기술에 응용하는 것이 가능하게 된다.

Claims

노랑느타리의 수성추출액으로부터 황산암모늄침전법으로 침전하는 분획으로부터 얻어질 수 있고, 적어도 벼도열병균에 대한 항균활성을 가지며, SDS-PAGE법에서 분자량이 약 15kDa인 성분의 존재를 나타내는 항균단백질.
제 1항에 있어서, N말단이 서열목록의 서열번호9 기재의 N말단 아미노산 서열:

(여기에서 Xaa는 미정)

을 갖는 항균단백질.
서열번호2 또는 4에 기재된 아미노산서열 또는 이 서열중에 1∼복수개의 아미노산변이를 갖는 아미노산서열 또는 이 서열과 52% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖는, 벼도열병균에 대한 항균활성을 나타내는 항균단백질.
제 3항에 있어서, 서열번호2 또는 4에 기재된 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖는 항균단백질.
제 3항에 있어서, 서열번호2 또는 4에 기재된 아미노산서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖는 항균단백질.
제 3항에 있어서, 서열번호2 또는 4에 기재된 아미노산서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖는 항균단백질.
제 3항에 있어서, 서열번호2 또는 4에 기재된 아미노산서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖는 항균단백질.
제 3항에 있어서, 서열번호2 또는 4에 기재된 아미노산서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖는 항균단백질.
서열번호2의 부분아미노산서열 8∼143 또는 서열번호4의 부분아미노산서열 8∼141로 이루어지는 폴리펩티드 및 상기 아미노산서열중 어느 하나에 1∼복수개의 아미노산변이를 갖는 폴리펩티드 및 상기 아미노산서열중의 어느 하나와 52% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드로서, 벼도열병균에 대한 항균활성을 나타내는 상기 폴리펩티드의 단독 또는 어느 하나의 폴리펩티드와의 조합으로 이루어지는 항균단백질.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 노랑느타리의 수성추출액으로부터 75% 포화 황산암모늄을 사용하는 황산암모늄침전법으로 침전하는 분획을 회수하는 공정; 및

상기 분획을 이온교환크로마토그래피에 걸어서 50mM∼600mM의 농도의 NaCl로 용출하는 분획을 회수하는 공정;

을 포함하는 항균단백질의 제조방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 항균단백질을 코드하는 유전자.
제 11항에 있어서, 서열번호1의 염기71∼502의 염기서열 또는 서열번호3의 염기226∼651의 염기서열, 상기 염기서열중에 1∼복수개의 염기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 갖는 염기서열 또는 상기 염기서열과 스트리전트한 조건하에서 혼성화하는 염기서열을 갖는 유전자.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 서열번호1의 염기71∼502의 염기서열 또는 서열번호3의 염기226∼651의 염기서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 갖는 유전자.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 서열번호1의 염기71∼502의 염기서열 또는서열번호3의 염기226∼651의 염기서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 갖는 유전자.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 서열번호1의 염기71∼502의 염기서열 또는 서열번호3의 염기226∼651의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 갖는 유전자.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 서열번호1의 염기71∼502의 염기서열 또는 서열번호3의 염기226∼651의 염기서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 갖는 유전자.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 서열번호1의 염기71∼502의 염기서열 또는 서열번호3의 염기226∼651의 염기서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 갖는 유전자.
노랑느타리유래의 항균단백질을 코드하는 유전자를 얻기 위한 올리고뉴클레오티드로서,

서열번호1 또는 3에 나타난 항균단백질을 코드하는 유전자의 염기서열로부터 이하의 조건을 만족시키도록 2개의 영역을 선택하고:

1) 각 영역의 길이가 15∼30염기인 것;

2) 각 영역중의 G+C의 비율이 40∼60%인 것;

상기 영역과 같은 염기서열 또는 상기 영역에 상보적인 염기서열을 갖는 단일사슬 DNA를 제조하고, 또는 상기 단일사슬 DNA에 의해 코드되는 아미노산 잔기를 변화시키지 않도록 유전자 암호의 축중을 고려한 단일사슬 DNA의 혼합물을 제조하고, 더욱이 필요하면 상기 항균단백질을 코드하는 유전자의 염기서열에 대한 결합특이성을 손상시키지 않도록 수식한 상기 단일사슬 DNA를 제조하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드.
제 18항에 있어서, 서열번호10 내지 19 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.
제 18항 또는 제 19항에 기재된 올리고뉴클레오티드의 2종을 프라이머쌍으로 사용하여, 노랑느타리 자실체 cDNA라이브러리를 주형으로 하여 핵산증폭반응을 행하여 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 항균단백질을 코드하는 유전자의 일부를 증폭하고, 얻어진 증폭산물을 프로브로서 사용하여 상기 cDNA라이브러리를 스크리닝하여 전장 cDNA클론을 단리하는 것을 포함하는, 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 기재된 유전자의 단리방법.
제 11항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 포함하는 재조합벡터.
제 21항에 있어서, 벡터가 발현벡터인 재조합벡터.
숙주생물에 제 21항 또는 제 22항에 기재된 재조합벡터를 도입하여 얻어지는 형질전환체.
제 23항에 있어서, 형질전환체는 병해저항성 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 항균단백질을 유효성분으로 포함하는 항균제.
제 23항의 형질전환체에 의해 발현되는 재조합 단백질.