JP6018922B2 - 改変型タマビジン - Google Patents
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Description
本発明は好ましくは以下の態様を含む。
[態様1]
配列番号2に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中において1から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号2の115番目のアスパラギン残基がシステインに置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
[態様2]
99.9℃で30分間加熱処理した後も、該処理前と比較して75%以上のビオチン結合活性を維持する、態様1に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
[態様3]
60%の非プロトン性極性有機溶媒中で30分間処理した後も、該処理前と比較して50%以上のビオチン結合活性を維持する、態様1又は態様2に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
[態様4]
前記非プロトン性極性有機溶媒がジメチルスルホキシドである、態様3に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
[態様5]
配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様1ないし4のいずれか1に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
[態様6]
配列番号2の115番目のアスパラギン残基がシステインに置換されている(TM2 N115C)、改変型ビオチン結合タンパク質。
[態様7]
態様1ないし6のいずれか1に記載のタンパク質を固定化した担体。
[態様8]
態様1ないし6のいずれか1に記載のタンパク質をコードする核酸。
[態様9]
態様8に記載の核酸を含むベクター。
[態様10]
態様1ないし6のいずれか1に記載のタンパク質の分離、濃縮、捕捉、精製、および/または検出方法であって、以下の工程:
1)当該タンパク質を含む試料を少なくとも90℃の温度で少なくとも10分間加熱処理を行い、
2)上記1)の工程で熱変性をしなかったタンパク質を回収することにより当該タンパク質を分離、濃縮、捕捉もしくは精製し、および/または、当該タンパク質を検出する;
を含んでなる、前記方法。
[態様11]
ビオチンと連結した物質の分離、濃縮、捕捉、精製、および/または検出方法であって、以下の工程:
1)態様7に記載の担体とビオチンと連結した物質を接触させて、当該担体と連結した物質を結合させ;
2)非プロトン性極性有機溶媒を60%ないし80%含む溶液で、当該担体に結合しなかった夾雑物を洗浄し;
3)当該担体に結合したビオチンと連結した物質を回収することにより当該物質を分離、濃縮、捕捉もしくは精製し、および/または、当該物質を検出する;
を含んでなる、前記方法。
[態様12]
前記非プロトン性極性有機溶媒がジメチルスルホキシドである、態様11に記載の方法。
タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ(Pleurotus conucopiae)から発見された新規ビオチン結合タンパク質である(WO02/072817)。当該文献には、
−タマビジン1とタマビジン2の相互のアミノ酸相同性は65.5%で、ビオチンと強く結合する;
−タマビジン2は、大腸菌で可溶性画分に高発現する;そして
−タマビジン2を大腸菌で発現させた場合、4.5時間の培養で、50mlの培養当たり約1mgの純度の高い精製組換えタンパク質が得られた。これはビオチン結合タンパク質として知られているアビジンやストレプトアビジンと比較しても、非常に高い値である;
ことが記載されている。
1)配列番号2の104番目のアルギニン残基;
2)配列番号2の141番目のリジン残基;
3)配列番号2の26番目のリジン残基;及び
4)配列番号2の73番目のリジン残基
から選択される1又は複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、ビオチン結合タンパク質であってよい。
配列番号2において、40番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、104番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、ビオチン結合タンパク質(D40N−R104E);
配列番号2において、40番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、141番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、ビオチン結合タンパク質(D40N−K141E);並びに、
配列番号2において、40番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、104番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、141番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、ビオチン結合タンパク質(D40N−R104E−K141E)、
からなるグループから選択される、ビオチン結合タンパク質であってよい。
本発明の改変型TM2は、配列番号2に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中において1から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、タンパク質としての構造を維持する、好ましくはビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号2の115番目のアスパラギン残基がシステインに置換されていることを特徴とする。
本発明の改変型TM2におけるアミノ酸残基の改変については、ビオチン結合能に影響を及ぼさないことが求められる。このことを考慮すると、非限定的に、タマビジン2の変異体は、配列番号2のアミノ酸配列において、4つのトリプトファン残基(W69、W80、W96、W108)が改変されないことが好ましい。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸、例えばフェニルアラニン(F)への改変が好ましい。また、ビオチンと直接相互作用すると考えられるアミノ酸残基(N14、S18、Y34、S36、S76、T78、D116)についても改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましく、例えばアスパラギン(N14)の場合は、グルタミン(Q)やアスパラギン酸(D)へ、好ましくはアスパラギン酸へ、アスパラギン酸(D40)の場合は、アスパラギン(N)へ、セリン(S18、S36、S76)の場合は、スレオニン(T)あるいはチロシン(Y)へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン(Y34)の場合は、セリン(S)やスレオニン(T)あるいはフェニルアラニン(F)へ、好ましくはフェニルアラニンへ、スレオニン(T78)の場合は、セリン(S)やチロシン(Y)へ、好ましくはセリンへ、アスパラギン酸(D116)の場合は、グルタミン酸(E)やアスパラギン(N)へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞれ改変することが好ましい。
TM2のアミノ酸を改変して、本発明の改変型TM2を得るための方法は、公知のアミノ酸配列に変異を施す方法を使用でき、特に限定されない。好ましくは本発明の改変タンパク質をコードする核酸の塩基配列に修飾を施し改変する。
本発明は、本発明の改変型TM2タンパク質をコードする核酸を提供する。このような核酸の塩基配列は、野生型TM2タンパク質をコードする塩基配列(配列番号1)を、改変型TM2タンパク質の改変アミノ酸をコードする塩基配列に改変したものである。改変される塩基配列は、改変後のアミノ酸をコードする塩基配列であれば限定されない。例えば、配列番号1の塩基配列からなる核酸(以下、「TM2遺伝子」)、またはそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ビオチンとの結合を可能とする、適切なビオチン結合活性を有するタンパク質をコードする核酸であって、本発明の改変を施すために塩基配列を改変させたものを含む。
また、本発明は、改変型TM2タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、改変型TM2タンパク質を発現するための発現ベクターである。
本発明は、本発明の改変型TM2タンパク質を固定化した担体を提供する。
また本発明は、本発明の改変型TM2タンパク質を熱精製する方法を提供する。本発明の改変型TM2タンパク質は顕著な耐熱性を有するために、殆どのタンパク質が変性してしまう厳しい条件下で加熱処理を行っても変性せずに元の構造を維持する。そこで本発明の改変型TM2タンパク質を含む試料を少なくとも90℃の温度で少なくとも10分間加熱処理を行い、変性をしなかったタンパク質を回収することにより、当該タンパク質を精製することができる。加熱処理を含む該方法は本発明の改変型TM2タンパク質の精製のみならず、分離、濃縮、捕捉、および検出の目的にも使用することができる。
また本発明は、有機溶媒耐性を有する本発明の改変型TM2を利用して、ビオチンと連結した物質を、有機溶媒を含む系で精製する方法を提供する。本発明の方法は、1)改変型TM2が結合した担体とビオチンと連結した物質を接触させて、当該担体と連結した物質を結合させ;2)非プロトン性極性溶媒を60%ないし80%含む溶液で、当該担体に結合しなかった夾雑物を洗浄し;3)当該担体に結合したビオチンと連結した物質を回収することを含んでなる。非プロトン性極性溶媒を用いた洗浄工程を含む該方法は、ビオチンと連結した物質の精製のみならず、分離、濃縮、捕捉、および検出の目的にも使用することができる。
タマビジン2のN115をシステイン(Cys)に変えた変異体TM2 N115Cを設計した。
2−1.遺伝子構築
タマビジン2遺伝子が大腸菌用発現ベクターpTrc99Aに組み込まれたプラスミドTM2/pTrc99A(WO02/072817)を鋳型としてPCRを行った。使用したプライマーの配列(配列番号5乃至配列番号8)を表1に示す。
TM2を含むプラスミドTM2/pTrc99Aを鋳型にして、Tm2NtermPciとTM2N115C RV、Tm2CtermBamとTM2N115C FWのプライマー組合せで別々にPCRを行った。得られた産物を、低融点アガロースを用いてアガロールゲル電気泳動を行った後、ゲルから精製した。精製した2種のPCR産物を鋳型にして、Tm2NtermPciとTm2CtermBamの組合せで2回目のPCR(オーバーラッピングPCR)を行った。なお、PCRは、50μl反応液中、プラスミド、10×PyroBestバッファー(TaKaRa社)5μl、2.5mMのdNTPs4μl、プライマー各25pmoles、PyroBestDNAポリメラーゼ(TaKaRa社)0.5μlをそれぞれ含み、96℃3分を1回、96℃1分、55℃1分、72℃1分を15回、72℃6分を1回行った。
タマビジン2および上記のように作製したタマビジン2変異体が組み込まれた大腸菌の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン(最終濃度100μg/ml)を含むLB培地に接種し、37℃で一晩振とう培養した。これを、アンピシリンを含むLB培地に接種して、37℃で2時間培養した後、イソプロピル−β−D(−)−チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度で1mMとなるように加え、発現誘導してさらに5〜6時間培養した。
3−1.蛍光ビオチンアッセイ
精製したTM2ならびにTM2−N115Cの耐熱性を、蛍光ビオチンへの結合活性を用いて分析した。即ち蛍光ビオチンがビオチン結合タンパク質のビオチン結合サイトに結合すると、蛍光ビオチンの蛍光強度が消失する性質を利用して、TM2−N115Cの高温度条件下におけるビオチン結合能を、TM2と比較した。
TM2−N115C、TM2、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンを、99.9℃で1、2、4、10、20分間、または32分間処理した後、疎水結合用マイクロプレート(住友ベークライト社、タイプH)に固定化し、さらにビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)(VECTOR社)を反応させて、HRP活性を測定した。99.9℃で1、2、4、10、20分間処理した結果を図1に示す。99.9℃で32分間処理した結果を図2と表2に示す。図2において、白いカラムは熱処理を行っていないサンプルの結果を、黒いカラムは熱処理を行ったサンプルの結果を、それぞれ示す。
4−1. DMSO耐性試験
Dynabeads M270−Amine(Dynal社製)にNHS−PEG12−ビオチン(PIERCE社製)を反応させることによりビオチン化磁性ビーズを調製した。
Biotin−Lc−BSAに対するアフィニティー解析
TM2 N115Cについて、BIAcore3000を用いて、ビオチンとの相互作用を解析した。Biotin−Lc−BSAの相互作用を解析した結果を表3に示す。TM2の結合速度定数kaは(1.0 ± 0.3)×106 (M−1・S−1)、解離速度定数kdはビアコア3000の検出限界以下(<5×10−6 S−1)(Takakura et al. 2009 FEBS J 276: 1383−1397)ゆえ、TM2 N115CはTM2とほぼ同レベルのビオチン結合活性を有することが分かった。
蛍光ビオチン試験より、90℃で20分加熱すると、TM2では蛍光ビオチン結合活性が低下するが、TM2N115Cでは蛍光ビオチン結合活性が低下しないことが示唆された。そこで、加熱後のタンパク質のBiotin−Lc−BSAに対するアフィニティーの測定を行った。TM2溶液とTM2N115C溶液を0.6mg/mL程度に希釈した(20mM KPi(pH7)。90℃ 20分加熱後、15000rpmで10分間(4℃)遠心分離を行い、上清を回収し、A280で濃度測定を行った後、上記と同様にBIAcoreによるBiotin−Lc−BSAとのアフィニティーの解析を行った。
Claims (11)
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号2に記載のアミノ酸配列中において1から10個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号2の115番目のアスパラギン残基がシステインに置換されていることを特徴とし、99.9℃で30分間加熱処理した後も、該処理前と比較して75%以上のビオチン結合活性を維持する、改変型ビオチン結合タンパク質。
- 60%の非プロトン性極性有機溶媒中で30分間処理した後も、該処理前と比較して50%以上のビオチン結合活性を維持する、請求項1に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
- 前記非プロトン性極性有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項2に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号2の115番目のアスパラギン残基がシステインに置換されており(TM2 N115C)、99.9℃で30分間加熱処理した後も、該処理前と比較して75%以上のビオチン結合活性を維持する、改変型ビオチン結合タンパク質。
- 請求項1ないし5のいずれか1項に記載のタンパク質を固定化した担体。
- 請求項1ないし5のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸。
- 請求項7に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項1ないし5のいずれか1項に記載のタンパク質の分離、濃縮、捕捉、精製、および/または検出方法であって、以下の工程:
1)当該タンパク質を含む試料を少なくとも90℃の温度で少なくとも10分間加熱処理を行い、
2)上記1)の工程で熱変性をしなかったタンパク質を回収することにより当該タンパク質を分離、濃縮、捕捉もしくは精製し、および/または、当該タンパク質を検出する;
を含んでなる、前記方法。 - ビオチンと連結した物質の分離、濃縮、捕捉、精製、および/または検出方法であって、以下の工程:
1)請求項6に記載の担体とビオチンと連結した物質を接触させて、当該担体と連結した物質を結合させ;
2)非プロトン性極性有機溶媒を60%ないし80%含む溶液で、当該担体に結合しなかった夾雑物を洗浄し;
3)当該担体に結合したビオチンと連結した物質を回収することにより当該物質を分離、濃縮、捕捉もしくは精製し、および/または、当該物質を検出する;
を含んでなる、前記方法。 - 前記非プロトン性極性有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項10に記載の方法。
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