JP6018922B2 - 改変型タマビジン - Google Patents

Description

本出願は、２０１０年１２月２８日に出願された日本国特許出願２０１０−２９３７７６に基づく優先権を主張する。

本発明は耐熱性が向上した改変型タマビジンに関する。

アビジンは卵白由来の塩基性糖タンパク質で、ビオチン（ビタミンＨ）と強く結合する。ストレプトアビジンは放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）由来のアビジン様タンパク質で、等電点は中性付近で糖鎖を含まない。両タンパク質とも、四量体を形成し、その分子量は６０ｋＤａ程度である。この四量体は、二量体同士の弱い結合で形成されているが、この二量体は単量体が強く結合したものである。アビジンおよびストレプトアビジンは、単量体当たり１分子のビオチンと結合する性質をもつ。アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの親和性は非常に高く（Ｋｄ＝１０^−１５〜^−１４ Ｍ）、生体二分子間の相互作用としては最も強い。そのため、アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている。

ビオチンの分子量は２４４と小さく、ｐＨ変化や熱にも安定であるため、物質の標識によく用いられている。ビオチン化の方法としては、化学修飾を施したビオチンを、所望の物質の官能基に結合させる方法がある。このようなビオチン化試薬は市販されており、これらを利用してタンパク質や核酸等をビオチン化することができる。またタンパク質のビオチン化の方法の一つとして、生体内のビオチンリガーゼによってビオチン化される配列と、目的のタンパク質との融合タンパク質を、組換えタンパク質として発現させ、宿主細胞内の同酵素によって、融合タンパク質をビオチン化させる方法がある。

本発明者らは、食用キノコタモギタケ（Ｐｕｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から、新規なアビジン様ビオチン結合タンパク質である、タマビジン１とタマビジン２を発見した（ＷＯ０２／０７２８１７）。タマビジン１及びタマビジン２は、大腸菌で大量に発現させることができ、特にタマビジン２はイミノビオチンカラムを用いた精製により容易に調製できた（ＷＯ０２／０７２８１７）。タマビジン１及びタマビジン２は四量体を形成し、ビオチンと極めて強く結合した。またタマビジン２はアビジンやストレプトアビジンと比べて高い耐熱性を有し、さらにアビジンよりも非特異的な結合が少ないといった点で優れたビオチン結合タンパク質であった。

アビジン、ストレプトアビジン、タマビジンの耐熱性は、通常のタンパク質に比べて高く、蛍光ビオチンを用いた測定法によるアビジン、ストレプトアビジン、タマビジンの耐熱性（活性が半分になる温度）はそれぞれ７９℃、７４℃、８５℃である（Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． ２００９ ＦＥＢＳ Ｊ ２７６： １３８３−１３９７）。

しかし、産業応用の幅を広げるため、アビジンやストレプトアビジンの耐熱性をさらに高めようとする試みがなされている。ストレプトアビジンでは、Ｒｅｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ． １９９６ （Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４： １００７−１０１１）による報告がある。彼らはストレプトアビジンの二量体同士の弱い結合を強めるために、遺伝子工学的に１２７番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）をシステイン（Ｃｙｓ）に変異させ、二量体間にジスルフィド結合を形成させた変異型ストレプトアビジンを構築し、耐熱性を向上させた。野生型のストレプトアビジンでは７０℃１０分の熱処理後に約５５％のビオチン結合活性が残存していたが、この変異体では９０℃１０分処理後に、約７０％のビオチン結合活性が保持されていた。

一方、アビジンの耐熱化は、Ｎｏｒｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ． ２００３（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８： ２４７９−２４８３．）による報告があり、遺伝子工学的にアビジンサブユニット間に様々なジスルフィド結合を形成させ、耐熱性を向上させている。９９．９℃２分処理後のビオチン結合の残存活性は、アビジンではほぼゼロであったのに対し、Ｉ１１７Ｃ（アビジンの１１７番目のイソロイシンをシステインに変えたもの）で３０％強であり、Ｄ８６ＣＩ１０６ＣＩ１１７Ｃ（アビジンの８６番目のアスパラギン酸、１０６番目と１１７番目のイソロイシンをそれぞれシステインに変えたもの）で５０％弱であった。

また、ジスルフィド結合の形成によらないアビジン耐熱化の報告もある（Ｈｙｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０： １０２２８−１０２３３）。アビジンよりも耐熱性の高いＡＶＲ４（Ａｖｉｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ４にコードされたタンパク質）とアビジンのキメラを作成し、９９．９℃３２分処理後のビオチン結合の残存活性を９８％にまで高めたアビジン変異体ＣｈｉＡＶＤ（Ｉ１１７Ｙ）が作成された（アビジンの残存活性は４％、ＡＶＲ４では７２％）。

上記の耐熱性の変異型アビジンは、殆んどすべてバキュロウイルスを用いた昆虫細胞における発現系を用いて製造される。一方、変異型ストレプトアビジンは、大腸菌発現系を用いて製造されるが、工程中に不溶性の封入体からの可溶化過程が必要となる。このようにいずれのタンパク質も、その製造にかなりのコストと労力を必要とし、いまだ実用化には至っていない。

ＷＯ０２／０７２８１７ ＷＯ２０１０／０１８８５９

Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． ２００９ ＦＥＢＳ Ｊ ２７６： １３８３−１３９７ Ｒｅｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ． １９９６ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４： １００７−１０１１ Ｎｏｒｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ． ２００３（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８： ２４７９−２４８３ Ｈｙｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００５ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０： １０２２８−１０２３３

本発明の解決すべき課題は、大腸菌で可溶性高発現が可能であり、かつ高温で加熱してもタンパク質の構造を維持するように耐熱性が向上した改変型タマビジン２を提供することである。

本発明者らは上記課題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、大腸菌で可溶性高発現が可能であり、高温で加熱してもタンパク質の構造を維持するように耐熱性が向上した改変型タマビジン２を得ることに成功し、本発明を想到した。

具体的には、本発明は天然のタマビジン２（以下、本明細書において「ＴＭ２」と記載する）のアミノ酸配列（配列番号２）において１１５番目のアスパラギン残基をシステインに置換する（配列番号４）ことにより、９９．９℃で３２分間加熱しても、ビオチン結合活性を維持するように耐熱性が向上した改変型のビオチン結合タンパク質を得たものである。この改変型タマビジン２は、非プロトン性極性有機溶媒に対する耐性も向上していた。

本発明の好ましい態様
本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［態様１］
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中において１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号２の１１５番目のアスパラギン残基がシステインに置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様２］
９９．９℃で３０分間加熱処理した後も、該処理前と比較して７５％以上のビオチン結合活性を維持する、態様１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様３］
６０％の非プロトン性極性有機溶媒中で３０分間処理した後も、該処理前と比較して５０％以上のビオチン結合活性を維持する、態様１又は態様２に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様４］
前記非プロトン性極性有機溶媒がジメチルスルホキシドである、態様３に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様５］
配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１ないし４のいずれか１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様６］
配列番号２の１１５番目のアスパラギン残基がシステインに置換されている（ＴＭ２ Ｎ１１５Ｃ）、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様７］
態様１ないし６のいずれか１に記載のタンパク質を固定化した担体。
［態様８］
態様１ないし６のいずれか１に記載のタンパク質をコードする核酸。
［態様９］
態様８に記載の核酸を含むベクター。
［態様１０］
態様１ないし６のいずれか１に記載のタンパク質の分離、濃縮、捕捉、精製、および／または検出方法であって、以下の工程：
１）当該タンパク質を含む試料を少なくとも９０℃の温度で少なくとも１０分間加熱処理を行い、
２）上記１）の工程で熱変性をしなかったタンパク質を回収することにより当該タンパク質を分離、濃縮、捕捉もしくは精製し、および／または、当該タンパク質を検出する；
を含んでなる、前記方法。
［態様１１］
ビオチンと連結した物質の分離、濃縮、捕捉、精製、および／または検出方法であって、以下の工程：
１）態様７に記載の担体とビオチンと連結した物質を接触させて、当該担体と連結した物質を結合させ；
２）非プロトン性極性有機溶媒を６０％ないし８０％含む溶液で、当該担体に結合しなかった夾雑物を洗浄し；
３）当該担体に結合したビオチンと連結した物質を回収することにより当該物質を分離、濃縮、捕捉もしくは精製し、および／または、当該物質を検出する；
を含んでなる、前記方法。
［態様１２］
前記非プロトン性極性有機溶媒がジメチルスルホキシドである、態様１１に記載の方法。

本発明によって、大腸菌で可溶性高発現が可能であって高温で加熱してもタンパク質の構造を維持するように耐熱性が向上した、改変型ＴＭ２が提供された。本発明の改変型ＴＭ２は高い耐熱性を有するので熱精製等を行うことが可能である。またこの改変型ＴＭ２は、非プロトン性極性有機溶媒に対する耐性も向上していた。有機溶媒耐性を有する本発明の改変型ＴＭ２はジメチルスルホキシドなどの溶媒で洗浄することが可能であるので、ビオチンと連結した物質の分離・精製において非特異的吸着を抑制することができる。また、本発明の改変型ＴＭ２は、有機溶媒中の物質を固定あるいは検出する系などにも利用することができる。

図１は、本発明の改変型ＴＭ２ Ｎ１１５Ｃ、ＴＭ２および種々のアビジン様タンパク質（ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン）を熱処理した後の、ビオチン結合能を示すグラフである。熱処理は９９．９℃で１分間、２分間、４分間、１０分間および２０分間行った。 図２は、本発明の改変型ＴＭ２ Ｎ１１５Ｃ、ＴＭ２および種々のアビジン様タンパク質（ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン）を９９．９℃で３２分間処理した後のビオチン結合能を示すグラフである。 図３は、本発明の改変型ＴＭ２ Ｎ１１５Ｃ、ＴＭ２および種々のアビジン様タンパク質（ストレプトアビジン、アビジン）を、ジメチルスルホキシドの存在下でビオチン化磁性ビーズと混和した後の、ビオチン結合能を示すグラフである。種々の濃度のジメチルスルホキシドで３０分間混和を行った。

以下、本発明を実施するための好ましい形態について説明する。

タマビジン
タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見された新規ビオチン結合タンパク質である（ＷＯ０２／０７２８１７）。当該文献には、
−タマビジン１とタマビジン２の相互のアミノ酸相同性は６５．５％で、ビオチンと強く結合する；
−タマビジン２は、大腸菌で可溶性画分に高発現する；そして
−タマビジン２を大腸菌で発現させた場合、４．５時間の培養で、５０ｍｌの培養当たり約１ｍｇの純度の高い精製組換えタンパク質が得られた。これはビオチン結合タンパク質として知られているアビジンやストレプトアビジンと比較しても、非常に高い値である；
ことが記載されている。

本明細書における「タマビジン２」は、タマビジン２（ＴＭ２）又はそれらの変異体を意味する。本発明は、ＴＭ２又はその変異体の特定のアミノ酸残基を改変させることにより、耐熱性を有する改変型ＴＭ２を提供するものである。本明細書において「タマビジン２」、「ＴＭ２」と記載した場合には、特に言及しない限り野生型のＴＭ２及びその変異体を意味する。ただし、文意により、本発明の改変型ＴＭ２も含めてＴＭ２の野生型、変異型、本発明の改変型の総称として使用する場合もある。また、ＴＭ２はビオチン結合性を示すことから、本明細書においてＴＭ２を「ビオチン結合タンパク質」と呼称することがある。

具体的には、ＴＭ２（野生型）は典型的には、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。あるいは、ＴＭ２は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、の変異体であって、タマビジン２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってよい。ＴＭ２の変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。

アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．１０， Ｎｏ． ２０， ｐ．６４８７−６５００， １９８２参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１又は複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入及び／又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１又は複数のアミノ酸」とは、場合により、１又は数個のアミノ酸を意味してもよい。

限定されるものではないが、本発明におけるＴＭ２は、配列番号２において１ないしは１０個、好ましくは９個以下、７個以下、５個以下、３個以下、２個以下、より好ましくは１個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ビオチン結合活性を有するタンパク質である。

また本発明において、限定されるものではないが、ＴＭ２の変異体として、例えば、高結合能・低非特異結合性タマビジン（ＷＯ２０１０／０１８８５９）等を用いることもできる。このようなタマビジン２変異体は、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基；
２）配列番号２の１４１番目のリジン残基；
３）配列番号２の２６番目のリジン残基；及び
４）配列番号２の７３番目のリジン残基
から選択される１又は複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、ビオチン結合タンパク質であってよい。

より好ましくは、配列番号２において、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、ビオチン結合タンパク質（Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される、ビオチン結合タンパク質であってよい。

部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。

なお、生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入又は付加し、次いで連結する方法もある。

ＴＭ２の変異体はさらに、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上、より好ましくは９９．２％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、ＴＭ２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。

２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ． Ｂ． 及びＷｕｎｓｃｈ， Ｃ． Ｄ． （Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８： ４４３−４５３， １９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータ・プログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｓ． 及びＨｅｎｉｋｏｆｆ， Ｊ． Ｇ． （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９： １０９１５−１０９１９， １９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。

当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．， ２５， ｐ．３３８９−３４０２， １９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。又は、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、又は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。

２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２： ３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４： ６７４５， １９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９３）により決定される；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ， １９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｂｉａｓｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２６６： ５４４−７１も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。

ＴＭ２の変異体はまた、配列番号１の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、ＴＭ２と同様の結合活性を有するタンパク質であってもよい。

ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６章，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１に示され、例えば５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、２×ないし６×ＳＳＣ、好ましくは５×ないし６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び例えば、約５０℃ないし６８℃、０．１×、ないし、６×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。

一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、０．５％程度のＳＤＳを含み、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ、あるいは０．１×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６５℃、ないし６８℃、０．２×ないし０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間ないし１時間程度行う。

また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ＆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒにＢｌｏｃｋｉｎｇ試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％ ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を２回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。

ＴＭ２の変異体のビオチン結合活性は、公知の手法のいずれかにより測定することが可能である。例えば、Ｋａｄａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， １４２７： ３３−４３ （１９９９））に記載されるように蛍光ビオチンを用いる方法により測定してもよい。この方法は、ビオチン結合タンパク質のビオチン結合サイトに蛍光ビオチンが結合すると、蛍光ビオチンの蛍光強度が消失する性質を利用したアッセイ系である。あるいは、表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサー（例えばビアコアなど）、タンパク質とビオチンの結合を測定することが可能なセンサーを用いて、変異体タンパク質のビオチン結合活性を評価することもできる。あるいはまた、ＨＡＢＡ（2-（4'-Hydroxyazobenzene）Benzoic Acid）を用いた方法やビオチン化ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いた方法によっても評価することが出来る。

本発明の耐熱性を向上させた改変タマビジン
本発明の改変型ＴＭ２は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中において１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、タンパク質としての構造を維持する、好ましくはビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号２の１１５番目のアスパラギン残基がシステインに置換されていることを特徴とする。

また、本発明の改変型ＴＭ２は、野生型ＴＭ２または変異体ＴＭ２において、配列番号２の１１５番目のアスパラギン残基に相当するアミノ酸残基が、システインに置換されていることを特徴とする。

本発明の耐熱性の改変型タマビジン２は以下のように作製された。

タマビジン２のＮ１１５をシステイン（Ｃｙｓ）に変えた変異体を設計し、遺伝子を作成した。この遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌で発現させた。発現した変異体（ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ）は可溶性タンパク質としてタマビジン２（ＴＭ２）と同様、高レベルに発現した。イミノビオチンアガロースによるアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製したところ、３００ｍＬの培養液からおよそ１４ｍｇのＴＭ２−Ｎ１１５Ｃが得られた。

そして作製した改変型タマビジン２を以下のように解析した。

精製したＴＭ２−Ｎ１１５Ｃのビオチン結合活性を、生体試料相互作用測定装置ビアコアを用いて測定した。その結果、ＴＭ２−Ｎ１１５ＣはＴＭ２と同じレベルの極めて強いビオチン結合活性を有していた。また、ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ、ＴＭ２、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンを、９９．９℃で３０−３２分処理した後、マイクロプレートに固定化し、さらにビオチン化Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）を反応させて、ＨＲＰ活性を測定した。その結果、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンはほとんど活性が検出されなかったのに対し、ＴＭ２は１２％の活性を、さらにＴＭ２−Ｎ１１５Ｃはほぼ完全な（９２％−１００％）ビオチン結合活性を有していた。アビジンのＩ１１７Ｃ変異は、９９．９℃で５分処理すると活性はほぼゼロになること（Ｎｏｒｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ． ２００３ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８： ２４７９−２４８３．）、またストレプトアビジンのＨ１２７Ｃ変異は９５℃１０分で活性が２０％にまで減少すること（Ｒｅｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ． １９９６ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４： １００７−１０１１．）が報告されているので、ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃが９９．９℃で約３０分処理してもほぼ完全に活性を保持できたことは驚くべきことである。この耐熱性は、アビジンのキメラ化により構築された、先述のアビジン変異体ＣｈｉＡＶＤ（Ｉ１１７Ｙ）（Ｈｙｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０： １０２２８−１０２３３）に匹敵する。

本明細書において「タマビジン２（ＴＭ２）」とは、上記で既に定義した通りである。

このような改変型ＴＭ２は加熱処理した後もタンパク質としての構造を維持する。好ましくは本発明の改変型ＴＭ２は、該処理前と比較して７５％以上、８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９２％以上、最も好ましくは９５％以上のビオチン結合活性を維持する。加熱処理の温度は、少なくとも９０℃、好ましくは９３℃以上、９５℃以上、９７℃以上、９８℃以上、９９℃以上、最も好ましくは９９．９℃である。加熱処理の温度の上限は１００℃以下である。加熱処理の時間は、少なくとも１０分間以上、好ましくは２０分間以上、３０分間以上、最も好ましくは３２分間である。

またこのような改変型ＴＭ２は非プロトン性極性有機溶媒中で処理した後も、該処理前と比較して５０％以上のビオチン結合活性を維持する。非プロトン性極性有機溶媒中で処理する際の有機溶媒の濃度は、少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、最も好ましくは８０％である。有機溶媒の濃度の上限は９０％未満である。非プロトン性極性有機溶媒中で処理する時間は、少なくとも１０分間、好ましくは２０分間以上、最も好ましくは３０分間以上である。なお、限定するものではないが、これらの処理は室温（２５℃）で行うことができる。

ここで用いられる非プロトン性極性有機溶媒には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、アセトニトリル、およびＮ，Ｎ-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。特に好ましい非プロトン性極性溶媒はＤＭＳＯである。

本明細書において加熱した後も「タンパク質としての構造を維持する」とは、本発明の改変型ＴＭ２が、加熱した後も元のＴＭ２が有しているタンパク質と同じ高次構造を維持することを意味する。タンパク質の高次構造とはタンパク質の二次構造以上を示し、好ましくは三次構造あるいは四次構造を意味する。

本明細書において「５０％以上のビオチン結合活性を維持する」とは、本発明の改変型ＴＭ２タンパク質の熱処理および／または有機溶媒処理を行った後にビオチン結合活性を測定した場合に、そのような処理を行う前と比較して５０％以上の結合活性を維持することを意味する。ここで、加熱処理の温度の上限は１００℃以下である。

また本発明の改変型ＴＭ２は、好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号２の１１５番目のアスパラギン残基をシステインに置換されていることを特徴とする。更に好ましくは本発明の改変型ＴＭ２は、配列番号２の１１５番目のアスパラギン残基がシステインに置換されている（ＴＭ２ Ｎ１１５Ｃ）ことを特徴とする（配列番号４）。

本発明の改変型ＴＭ２において改変されないことが望ましいアミノ酸残基
本発明の改変型ＴＭ２におけるアミノ酸残基の改変については、ビオチン結合能に影響を及ぼさないことが求められる。このことを考慮すると、非限定的に、タマビジン２の変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、４つのトリプトファン残基（Ｗ６９、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８）が改変されないことが好ましい。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸、例えばフェニルアラニン（Ｆ）への改変が好ましい。また、ビオチンと直接相互作用すると考えられるアミノ酸残基（Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｄ１１６）についても改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはアスパラギン酸へ、アスパラギン酸（Ｄ４０）の場合は、アスパラギン（Ｎ）へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７６）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）やスレオニン（Ｔ）あるいはフェニルアラニン（Ｆ）へ、好ましくはフェニルアラニンへ、スレオニン（Ｔ７８）の場合は、セリン（Ｓ）やチロシン（Ｙ）へ、好ましくはセリンへ、アスパラギン酸（Ｄ１１６）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞれ改変することが好ましい。

アミノ酸の改変方法
ＴＭ２のアミノ酸を改変して、本発明の改変型ＴＭ２を得るための方法は、公知のアミノ酸配列に変異を施す方法を使用でき、特に限定されない。好ましくは本発明の改変タンパク質をコードする核酸の塩基配列に修飾を施し改変する。

例えば、アミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸を改変するには、例えばＰＣＲを利用した方法が挙げられる（Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １６：７３５１−７３６７， Ｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９）。すなわち、標的変異のミスマッチコドンを含むプライマーを利用してＰＣＲを行い、目的の改変体をコードするＤＮＡを作成しこれを発現させることにより、目的の改変体を得ることができる。

また、アミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加による改変体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、前述の周知技術である部位特異的変異誘発を施すなどの方法により作成することができる。

改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸
本発明は、本発明の改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸を提供する。このような核酸の塩基配列は、野生型ＴＭ２タンパク質をコードする塩基配列（配列番号１）を、改変型ＴＭ２タンパク質の改変アミノ酸をコードする塩基配列に改変したものである。改変される塩基配列は、改変後のアミノ酸をコードする塩基配列であれば限定されない。例えば、配列番号１の塩基配列からなる核酸（以下、「ＴＭ２遺伝子」）、またはそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ビオチンとの結合を可能とする、適切なビオチン結合活性を有するタンパク質をコードする核酸であって、本発明の改変を施すために塩基配列を改変させたものを含む。

本発明の核酸は、好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸は、より好ましくは配列番号３の核酸配列からなる。

本発明の核酸を含むベクター
また、本発明は、改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、改変型ＴＭ２タンパク質を発現するための発現ベクターである。

本発明の改変型ＴＭ２のタンパク質をコードする核酸は、上記「改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸」に記載された通りであり、特に限定されない。改変型ＴＭ２タンパク質をコードする核酸の上流には所望の宿主で機能するプロモーターが、またその下流にはターミネーターが配置されていることが望ましい。

本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターである。発現ベクターは、上記のような発現ユニット（プロモーター＋改変型ＴＭ２コード領域＋ターミネーター）の他に、所望の宿主で複製できるためのユニット、例えば複製開始点を有し、また所望の宿主細胞を選抜するための、薬剤抵抗性マーカー遺伝子を有してもよい。宿主は特に限定されないが、好ましくは大腸菌である。また、本発現ベクターに、例えば、大腸菌におけるラクトースリプレッサー系のような適当な発現制御系を組み込んでもよい。

改変型ＴＭ２を固定化した担体
本発明は、本発明の改変型ＴＭ２タンパク質を固定化した担体を提供する。

担体を構成する材料は公知のものを使用可能である。例えば、セルロース、テフロン（登録商標）、ニトロセルロース、高架橋アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド、ラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、高密度ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、炭素又はそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。また、一定の強度を有し、組成が安定し、かつ非特異結合が少ないものが好ましい。

固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。

発明の一態様において、ビーズは、約２５ｎｍ〜約１ｍｍの範囲の球体直径を有しうる。好ましい態様では、ビーズは約５０ｎｍ〜約１０μｍの範囲の直径を有する。ビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。

タンパク質の担体への結合は特に限定されず、タンパク質を担体に結合させるための公知の方法を使用することが可能である。具体的な結合方法は、担体の種類等によって、当業者が適宜選択可能である。

改変型ＴＭ２の熱精製の方法
また本発明は、本発明の改変型ＴＭ２タンパク質を熱精製する方法を提供する。本発明の改変型ＴＭ２タンパク質は顕著な耐熱性を有するために、殆どのタンパク質が変性してしまう厳しい条件下で加熱処理を行っても変性せずに元の構造を維持する。そこで本発明の改変型ＴＭ２タンパク質を含む試料を少なくとも９０℃の温度で少なくとも１０分間加熱処理を行い、変性をしなかったタンパク質を回収することにより、当該タンパク質を精製することができる。加熱処理を含む該方法は本発明の改変型ＴＭ２タンパク質の精製のみならず、分離、濃縮、捕捉、および検出の目的にも使用することができる。

ここで加熱処理する条件は、少なくとも９０℃の温度で少なくとも１０分間、好ましくは２０分間、さらに好ましくは３０分間、また好ましくは９５℃で３０分間、９８℃で３０分間、９９℃で３０分間、特に好ましくは９９．９℃で３０分間である。ここで変性しなかったタンパク質を回収する具体的な手段として、遠心分離により変性したタンパク質をペレット化し、上清を回収する方法や、フィルターろ過を行う方法、あるいは分子篩クロマトグラフィーなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。

改変型ＴＭ２の有機溶媒を用いた検出方法
また本発明は、有機溶媒耐性を有する本発明の改変型ＴＭ２を利用して、ビオチンと連結した物質を、有機溶媒を含む系で精製する方法を提供する。本発明の方法は、１）改変型ＴＭ２が結合した担体とビオチンと連結した物質を接触させて、当該担体と連結した物質を結合させ；２）非プロトン性極性溶媒を６０％ないし８０％含む溶液で、当該担体に結合しなかった夾雑物を洗浄し；３）当該担体に結合したビオチンと連結した物質を回収することを含んでなる。非プロトン性極性溶媒を用いた洗浄工程を含む該方法は、ビオチンと連結した物質の精製のみならず、分離、濃縮、捕捉、および検出の目的にも使用することができる。

ここでビオチンと連結した物質とは、ビオチンと直接的または間接的に連結した物質の双方をいう。ビオチンと物質との直接的な連結は、共有結合による連結によって達成される。ビオチンと物質の間接的な連結は、ビオチンと共有結合により連結したリガンドに対して、さらに物質が、共有結合、イオン結合、水素結合、または疎水性相互作用により連結することによって達成される。間接的な結合の具体的な例には、ビオチン化抗体を用いる場合の抗原抗体反応による抗原分子が挙げられる。

例えば目的とする抗原タンパク質を精製する場合に、まず、該抗原タンパク質を含む検体を適当な緩衝液中で、該抗原タンパク質に特異的に結合する抗体をビオチン化したものとインキュベートする。抗体のビオチン化は例えばＰｉｅｒｃｅ等から市販されているキットを用いて行うことができる。次に、本発明の改変型ＴＭ２を連結した固体担体、例えば磁性ビーズを加え、混合する。その後に磁石を用いて、抗原タンパク質―ビオチン―本発明の改変型ＴＭ２―磁性ビーズの複合体を凝集させ、上清を除去し、非プロトン性極性溶媒を含む緩衝液中で洗浄を行った後、磁石をはずし、所望の緩衝液に懸濁し、抗原タンパク質の精製を完了する。このように本発明の方法は非プロトン性極性溶媒を含む緩衝液中で洗浄することができるために、夾雑物が少なく、効率的な抗原タンパク質の精製を行うことができる。

ここで洗浄に用いる溶液中の非プロトン性極性溶媒の濃度は、少なくとも６０％ないし８０％、好ましくは６５％ないし７５％であり、特に好ましくは７０％である。また非プロトン性極性溶媒は、好ましくはジメチルスルホキシドである。

また、本発明のＴＭ２ Ｎ１１５Ｃは、高いジメチルスルホキシド耐性を示すことから、脂質を含む化合物など、水溶性が低く高濃度（６０％ないし８０％）のジメチルスルホキシドにしか溶解しないような、ビオチン化物質との反応に利用することが可能である。

１．耐熱性向上を志向した改変型タマビジン２の設計
タマビジン２のＮ１１５をシステイン（Ｃｙｓ）に変えた変異体ＴＭ２ Ｎ１１５Ｃを設計した。

２．改変型タマビジン２遺伝子の構築と大腸菌における発現
２−１．遺伝子構築
タマビジン２遺伝子が大腸菌用発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込まれたプラスミドＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ（ＷＯ０２／０７２８１７）を鋳型としてＰＣＲを行った。使用したプライマーの配列（配列番号５乃至配列番号８）を表１に示す。

下線は制限酵素サイト、斜体太字は開始および終止コドンを示す。置換したコドンは小文字で示した。

ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ
ＴＭ２を含むプラスミドＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａを鋳型にして、Ｔｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉとＴＭ２Ｎ１１５Ｃ ＲＶ、Ｔｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍとＴＭ２Ｎ１１５Ｃ ＦＷのプライマー組合せで別々にＰＣＲを行った。得られた産物を、低融点アガロースを用いてアガロールゲル電気泳動を行った後、ゲルから精製した。精製した２種のＰＣＲ産物を鋳型にして、Ｔｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍの組合せで２回目のＰＣＲ（オーバーラッピングＰＣＲ）を行った。なお、ＰＣＲは、５０μｌ反応液中、プラスミド、１０×ＰｙｒｏＢｅｓｔバッファー（ＴａＫａＲａ社）５μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ４μｌ、プライマー各２５ｐｍｏｌｅｓ、ＰｙｒｏＢｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）０．５μｌをそれぞれ含み、９６℃３分を１回、９６℃１分、５５℃１分、７２℃１分を１５回、７２℃６分を１回行った。

得られたＰＣＲ産物を、ベクターｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてプラスミドを導入し、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）に従いプラスミドＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定した。

目的の変異導入が確認されたクローンを、ＰｃｉＩとＢａｍＨＩで消化した後、低融点アガロースを用いて電気泳動し、精製を行った。大腸菌用発現ベクターは、ｐＴｒｃ９９Ａを制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化し調製した。制限酵素処理したＤＮＡ断片とベクターを、ライゲーションキット（タカラ社）を用いてライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＢＬ２１に形質転換し、コロニーＰＣＲにより挿入遺伝子を含むクローンを決定し、発現実験に用いた。

２−２．大腸菌発現
タマビジン２および上記のように作製したタマビジン２変異体が組み込まれた大腸菌の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。これを、アンピシリンを含むＬＢ培地に接種して、３７℃で２時間培養した後、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え、発現誘導してさらに５〜６時間培養した。

菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ １２）中に懸濁し、超音波破砕を行った。破砕後に遠心分離を行い、その上清に２−イミノビオチンアガロース（ＳＩＧＭＡ社）を加え、ＮａＯＨでｐＨ１２に調製した後、室温でインキュベートした。これを、オープンカラムに充填し、カラムの１０倍量の５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）でカラムをよく洗浄した後、カラムの５倍量の５０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ４）でタンパク質を溶出した。溶出画分を、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で透析したものを以下の解析に用いた。ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃは、３００ｍＬの培養液からおよそ１４ｍｇの精製タンパク質が得られた。得られたＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの純度は９５％以上であった。

３．改変型タマビジン２の耐熱性試験
３−１．蛍光ビオチンアッセイ
精製したＴＭ２ならびにＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの耐熱性を、蛍光ビオチンへの結合活性を用いて分析した。即ち蛍光ビオチンがビオチン結合タンパク質のビオチン結合サイトに結合すると、蛍光ビオチンの蛍光強度が消失する性質を利用して、ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの高温度条件下におけるビオチン結合能を、ＴＭ２と比較した。

精製した各タンパク質濃度が、０．１μｇ／μＬ程度になるように２０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７）で希釈し、室温、５０、６０、７０、８０、９０、９９℃で２０分間加熱した。１５０μＬアッセイバッファー（５０ｍＭ Ｎａ_２ＰＯ_４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））中に、この熱処理後のそれぞれの溶液を、各々量を変えて段階的に加えた。この溶液に５０ｐｍｏｌ蛍光ビオチン溶液（ビオチン−４−フルオレセイン：モレキュラープローブ）を混和し、室温で２０分間反応後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いてＥｘ＝４６０ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍにて蛍光強度を測定した。また、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合が与える影響について考察するため、希釈したタンパク質溶液に１００ｍＭ ＤＴＴを加え３０分室温で静置した後、上記の手順で加熱し、蛍光ビオチン測定を実施した。

その結果、ＴＭ２における蛍光ビオチンとの結合活性は、９０℃で減少してくるのに対して、ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃに関しては９９．９℃においても活性はほぼ維持された。蛍光強度の減少割合が、加熱していないサンプルの５０％になる温度は、ＴＭ２は８５℃であるのに対し、ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃは９９．９℃以上であった。またＴＭ２−Ｎ１１５Ｃにおいて、９９．９℃における加熱時間を６０分まで延長したところ、結合活性はやや弱くなっていたが、結合活性を保持していることが確認できた。一方、ＴＭ２、アビジン、ストレプトアビジンでは、９９．９℃ ６０分加熱後は、ほとんど結合活性を保持していなかった。

ＴＭ２ Ｎ１１５ＣはＤＴＴ処理を行うと９０℃ ２０分加熱で活性が弱くなることも確認された。このことから、ＴＭ２ Ｎ１１５Ｃにおいて、新たに挿入したシステインによりジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合が形成され、これが耐熱性の向上に寄与する可能性が示された。

３−２．ビオチン化ＨＲＰ結合試験
ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ、ＴＭ２、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンを、９９．９℃で１、２、４、１０、２０分間、または３２分間処理した後、疎水結合用マイクロプレート（住友ベークライト社、タイプＨ）に固定化し、さらにビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＶＥＣＴＯＲ社）を反応させて、ＨＲＰ活性を測定した。９９．９℃で１、２、４、１０、２０分間処理した結果を図１に示す。９９．９℃で３２分間処理した結果を図２と表２に示す。図２において、白いカラムは熱処理を行っていないサンプルの結果を、黒いカラムは熱処理を行ったサンプルの結果を、それぞれ示す。

その結果、９９．９℃で３２分間の熱処理後において、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンでは活性がほとんど検出されなかったのに対し、ＴＭ２は１０〜１２％の活性を保持し（９９．９℃で２０分処理では４０％の活性を保持していた）、さらにＴＭ２−Ｎ１１５Ｃは、９９．９℃で３０分間または３２分間の処理後でも、ほぼ完全に（９２％〜１００％）ビオチン結合活性を保持していた（表２）。これまでにアビジンのＩ１１７Ｃ変異は、９９．９℃で５分処理すると活性はほぼゼロになること（Ｎｏｒｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ． ２００３ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８： ２４７９−２４８３．）が、またストレプトアビジンのＨ１２７Ｃ変異は９５℃１０分で活性が２０％にまで減少すること（Ｒｅｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ． １９９６ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４： １００７−１０１１．）が報告されているが、ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの耐熱性は、これら従来技術と比較しても、顕著に高いことが明らかとなった。

４．改変型タマビジン２の有機溶媒耐性試験
４−１． ＤＭＳＯ耐性試験
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０−Ａｍｉｎｅ（Ｄｙｎａｌ社製）にＮＨＳ−ＰＥＧ_１２−ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ社製）を反応させることによりビオチン化磁性ビーズを調製した。

２５μｇ／ｍＬ（最終濃度）のアビジン様タンパク質溶液（ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ、ＴＭ２、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン）を、ビオチン化磁性ビーズと、０％、２０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％（最終濃度）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下で混合し、室温（２５℃）で３０分間転倒混和した。この操作により、磁性ビーズ表面にアビジン様タンパク質を固定化させた。アビジン様タンパク質固定化磁性ビーズを０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳで洗浄した後、５μＬずつ９６穴プレートに分注し、各ウェルに２％ ＢＳＡを含むＰＢＳで５，０００倍希釈したビオチン化ＨＲＰ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を２００μＬずつ添加し、室温で１時間振とう混和した。その後磁性ビーズを洗浄し、磁性ビーズに固定化されたＨＲＰの活性を１−ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（ＰＩＥＲＣＥ社製）で検出した。

その結果を図３に示す。図３ＡにはＴＭ２の結果を、図３ＢにはＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの結果を、図３Ｃにはストレプトアビジンの結果を、図３Ｄにはアビジンの結果を、それぞれ示す。

図３より、野生型タマビジン（ＴＭ２）とアビジンは６０％ＤＭＳＯ存在下で、ストレプトアビジンは４０％ＤＭＳＯ存在下で、ビオチン結合能を殆んど失ったのに対して、ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃは７０％ＤＭＳＯ存在下でもビオチン結合能を完全に維持しており、８０％のＤＭＳＯ存在下でも５０％の活性を維持していた。

５．ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃとビオチンとの相互作用
Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｃ−ＢＳＡに対するアフィニティー解析
ＴＭ２ Ｎ１１５Ｃについて、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００を用いて、ビオチンとの相互作用を解析した。Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｃ−ＢＳＡの相互作用を解析した結果を表３に示す。ＴＭ２の結合速度定数ｋａは（１．０ ± ０．３）×１０^６ （Ｍ^−１・Ｓ^−１）、解離速度定数ｋｄはビアコア３０００の検出限界以下（＜５×１０⁻⁶ S^−１）（Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． ２００９ ＦＥＢＳ Ｊ ２７６： １３８３−１３９７）ゆえ、ＴＭ２ Ｎ１１５ＣはＴＭ２とほぼ同レベルのビオチン結合活性を有することが分かった。

加熱後のタンパク質のＢｉｏｔｉｎ−Ｌｃ−ＢＳＡに対するアフィニティー解析
蛍光ビオチン試験より、９０℃で２０分加熱すると、ＴＭ２では蛍光ビオチン結合活性が低下するが、ＴＭ２Ｎ１１５Ｃでは蛍光ビオチン結合活性が低下しないことが示唆された。そこで、加熱後のタンパク質のＢｉｏｔｉｎ−Ｌｃ−ＢＳＡに対するアフィニティーの測定を行った。ＴＭ２溶液とＴＭ２Ｎ１１５Ｃ溶液を０．６ｍｇ／ｍＬ程度に希釈した（２０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７）。９０℃ ２０分加熱後、１５０００ｒｐｍで１０分間（４℃）遠心分離を行い、上清を回収し、Ａ２８０で濃度測定を行った後、上記と同様にＢＩＡｃｏｒｅによるＢｉｏｔｉｎ−Ｌｃ−ＢＳＡとのアフィニティーの解析を行った。

９０℃で処理した後のＢｉｏｔｉｎ−Ｌｃ−ＢＳＡとの相互作用をＢＩＡｃｏｒｅで解析した結果を表３に示す。ＴＭ２は９０℃で処理することによりビオチンに対するアフィニティーが低下したのに対して、ＴＭ２ Ｎ１１５Ｃは９０℃で処理してもビオチンに対するアフィニティーが全く低下しなかった。

Claims (11)

1. 配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２に記載のアミノ酸配列中において１から１０個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号２の１１５番目のアスパラギン残基がシステインに置換されていることを特徴とし、９９．９℃で３０分間加熱処理した後も、該処理前と比較して７５％以上のビオチン結合活性を維持する、改変型ビオチン結合タンパク質。
2. ６０％の非プロトン性極性有機溶媒中で３０分間処理した後も、該処理前と比較して５０％以上のビオチン結合活性を維持する、請求項１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
3. 前記非プロトン性極性有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項２に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
4. 配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
5. 配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号２の１１５番目のアスパラギン残基がシステインに置換されており（ＴＭ２ Ｎ１１５Ｃ）、９９．９℃で３０分間加熱処理した後も、該処理前と比較して７５％以上のビオチン結合活性を維持する、改変型ビオチン結合タンパク質。
6. 請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質を固定化した担体。
7. 請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
8. 請求項７に記載の核酸を含むベクター。
9. 請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質の分離、濃縮、捕捉、精製、および／または検出方法であって、以下の工程：
   １）当該タンパク質を含む試料を少なくとも９０℃の温度で少なくとも１０分間加熱処理を行い、
   ２）上記１）の工程で熱変性をしなかったタンパク質を回収することにより当該タンパク質を分離、濃縮、捕捉もしくは精製し、および／または、当該タンパク質を検出する；
   を含んでなる、前記方法。
10. ビオチンと連結した物質の分離、濃縮、捕捉、精製、および／または検出方法であって、以下の工程：
    １）請求項６に記載の担体とビオチンと連結した物質を接触させて、当該担体と連結した物質を結合させ；
    ２）非プロトン性極性有機溶媒を６０％ないし８０％含む溶液で、当該担体に結合しなかった夾雑物を洗浄し；
    ３）当該担体に結合したビオチンと連結した物質を回収することにより当該物質を分離、濃縮、捕捉もしくは精製し、および／または、当該物質を検出する；
    を含んでなる、前記方法。
11. 前記非プロトン性極性有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項１０に記載の方法。

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