CN103282493B - 修饰型tamavidin - Google Patents

Abstract

本发明提供一种修饰型生物素结合蛋白，作为改变型tamavidin2，其特征在于，在包括序列编号2中记载的氨基酸序列、或者在该序列中具有1到多个氨基酸突变的氨基酸序列、或者与该序列具有80%以上同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，将序列编号2的第115位的天冬酰胺残基取代为半胱氨酸得到的。本发明的修饰型生物素结合蛋白表现显著的耐热性。

Description

修饰型tamavidin

技术领域

本申请基于2010年12月28日申请的日本专利申请2010-293776主张优先权。

本发明涉及耐热性提高了的修饰型tamavidin。

背景技术

抗生物素蛋白是来自蛋清的碱性糖蛋白质，与生物素(维生素H)强结合。链霉抗生物素蛋白是来自放线菌(Streptomyces avidinii)的抗生物素蛋白样蛋白质，等电点在中性附近且不含糖链。这两种蛋白质均形成四聚体，其分子量为60kDa左右。该四聚体由二聚体之间的弱结合而形成，该二聚体是单体强结合而成的。抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白具有平均每个单体与1分子生物素结合的性质。抗生物素蛋白和生物素、或者链霉抗生物素蛋白和生物素的亲和性非常高(Kd＝10^-15～^-14M)，作为生物体二分子间的相互作用最强。因此，抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用广泛应用于生物化学、分子生物学或医学领域。

生物素的分子量小为244，对于pH变化、热都稳定，因此经常被用于物质的标记。作为生物素化的方法，有使实施了化学修饰的生物素与所期望的物质的官能团结合的方法。市售有这样的生物素化试剂，能够利用它们将蛋白质、核酸等生物素化。另外作为蛋白质的生物素化的方法之一，有如下方法：将通过生物体内的生物素连接酶而生物素化的序列与目标蛋白质的融合蛋白质作为重组蛋白质表达，通过宿主细胞内的该酶，使融合蛋白质进行生物素化的方法。

本发明的发明人等从食用蘑菇黄白侧耳(Pleurotus cornucopiae)中发现了作为新型的抗生物素蛋白样生物素结合蛋白质的tamavidin1和tamavidin2(WO02/072817)。tamavidin1和tamavidin2能够在大肠杆菌中大量表达，特别是tamavidin2能够通过使用了亚氨基生物素柱的纯化而容易地制备(WO02/072817)。tamavidin1和tamavidin2形成四聚体，与生物素极强地结合。另外，tamavidin2是与抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白相比具有高耐热性、而且与抗生物素蛋白相比，在非特异性结合少的方面优异的生物素结合蛋白。

抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、tamavidin的耐热性比通常的蛋白质高，利用荧光生物素的测定法进行的抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、tamavidin的耐热性(活性达到一半的温度)分别为79℃、74℃、85℃(Takakura等人2009FEBS J276：1383-1397)。

但是，为了拓宽产业应用的宽度，进行了要进一步提高抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白的耐热性的尝试。就链霉抗生物素蛋白而言，有由Reznik等人1996(Nat.Biotechnol.14：1007-1011)的报告。他们为了增强链霉抗生物素蛋白的二聚体之间的弱结合，用基因工程的方法将第127位的组氨酸(His)突变为半胱氨酸(Cys)，构建在二聚体间形成了二硫键的突变型链霉抗生物素蛋白，使耐热性得到了提高。在野生型的链霉抗生物素蛋白中，在70℃、10分钟的热处理后残留约55%的生物素结合活性，但在该变体中，在90℃、10分钟处理后保持了约70%的生物素结合活性。

另一方面，抗生物素蛋白的耐热化有由Nordlund等人2003(J.Biol.Chem.278：2479-2483.)的报告，用基因工程的方法在抗生物素蛋白亚基之间形成各种二硫键，使耐热性提高。就99.9℃、2分钟处理后的生物素结合的残留活性而言，抗生物素蛋白大致为零，与此相对，I117C(抗生物素蛋白的第117位的异亮氨酸修饰为半胱氨酸的产物)为稍大于30%，D86CI106CI117C(抗生物素蛋白的第86位的天冬氨酸、第106位和第117位的异亮氨酸分别修饰为半胱氨酸的产物)为稍小于50%。

另外，还有不依赖于二硫键形成的抗生物素蛋白耐热化的报告(Hytonen等人(2005)J.Biol.Chem.280：10228-10233)。制作比抗生物素蛋白的耐热性高的AVR4(由Avidin-related gene4所编码的蛋白质)与抗生物素蛋白的嵌合体，制成99.9℃、32分钟处理后的生物素结合的残留活性提高至98%的抗生物素蛋白变体ChiAVD(I117Y)(抗生物素蛋白的残留活性为4%，AVR4的残留活性为72%)。

上述的耐热性的突变型抗生物素蛋白几乎都使用利用了杆状病毒的昆虫细胞中的表达系统制造。另一方面，突变型链霉抗生物素蛋白使用大肠杆菌表达系统制造，但工序中需要从不溶性包含体的复性过程。这样任何一种蛋白质在其制造中都需要相当量的成本和劳动量，至今尚未实用化。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:WO02/072817

专利文献2:WO2010/018859

非专利文献

非专利文献

非专利文献1:Takakura et al.2009FEBS J276：1383-1397

非专利文献2:Reznik et al.1996Nat.Biotechnol.14：1007-1011

非专利文献3:Nordlund et al.2003(J.Biol.Chem.278：2479-2483

非专利文献4:Hytonen et al.2005J.Biol.Chem.280：10228-10233

发明内容

发明要解决的问题

本发明要解决的问题在于提供能够在大肠杆菌中可溶性高表达且提高了耐热性使得即使在高温加热也维持蛋白质的结构的修饰型tamavidin2。

解决问题的方法

本发明的发明人等，为了解决上述问题，经过深入研究结果：成功得到了能够在大肠杆菌中可溶性高表达且提高了耐热性使得即使在高温加热也维持蛋白质的结构的修饰型tamavidin2，从而得到了本发明。

具体而言，本发明通过将天然的tamavidin2(以下，在本说明书中记载为“TM2”)的氨基酸序列(序列编号2)中的第115位的天冬酰胺残基取代为半胱氨酸(序列编号4)，得到提高了耐热性使得即使在99.9℃加热32分钟，也维持生物素结合活性的修饰型的生物素结合蛋白。该修饰型tamavidin2对于非质子性极性有机溶剂的耐性也得到提高。

本发明的优选方式

本发明优选包括以下的方式。

[方式1]

一种修饰型生物素结合蛋白，其为在包括序列编号2中记载的氨基酸序列、或者在该序列中具有1到多个氨基酸突变的氨基酸序列、或者与该序列具有80%以上同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，将序列编号2的第115位的天冬酰胺残基取代为半胱氨酸的修饰型生物素结合蛋白。

[方式2]

方式1中记载的修饰型生物素结合蛋白，其即使在99.9℃加热处理30分钟后，与该处理前相比较也保持75%以上的生物素结合活性。

[方式3]

方式1或方式2中记载的修饰型生物素结合蛋白，其即使在60%的非质子性极性有机溶剂中处理30分钟后，与该处理前相比较也保持50%以上的生物素结合活性。

[方式4]

方式3中记载的修饰型生物素结合蛋白，其中，上述非质子性极性有机溶剂为二甲基亚砜。

[方式5]

方式1至4中任一项记载的修饰型生物素结合蛋白，其包括与序列编号2中记载的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列。

[方式6]

一种修饰型生物素结合蛋白，其中，序列编号2的第115位的天冬酰胺残基取代为半胱氨酸(TM2N115C)。

[方式7]

固定化有方式1至6中任一项记载的蛋白质的担载体。

[方式8]

编码方式1至6中任一项记载的蛋白质的核酸。

[方式9]

包含方式8中记载的核酸的载体。

[方式10]

方式1至6中任一项记载的蛋白质的分离、浓缩、捕获、纯化，和/或检测方法，其包括以下的工序：

1)在至少90℃的温度对包含该蛋白质的试样进行至少10分钟加热处理；和

2)通过回收上述1)的工序中未热变性的蛋白质，将该蛋白质分离、浓缩、捕获或者纯化，和/或检测出该蛋白质。

[方式11]

分离、浓缩、捕获、纯化和/或检测与生物素发生了连接的物质的方法，其包括以下的工序：

1)使方式7中记载的担载体和与生物素连接了的物质接触，使该担载体和该连接了的物质结合；

2)用包含60%至80%的非质子性极性有机溶剂的溶液洗去未与该担载体结合的夹杂物；和

3)通过对与该担载体结合了的与生物素发生了连接的物质进行回收，将该物质分离、浓缩、捕获或者纯化，和/或检测出该物质。

[方式12]

方式11中记载的方法，其中，上述非质子性极性有机溶剂为二甲基亚砜。

发明的效果

按照本发明，可以提供能够在大肠杆菌中可溶性高表达且提高了耐热性使得即使在高温加热也保持蛋白质的结构的修饰型TM2。本发明的修饰型TM2由于具有高的耐热性所以能够进行热纯化等。另外，该修饰型TM2对于非质子性极性有机溶剂的耐性也得到了提高。具有有机溶剂耐性的本发明的修饰型TM2能够用二甲基亚砜等溶剂清洗，因此在与生物素发生了连接的物质的分离/纯化中能够抑制非特异性吸附。另外，本发明的修饰型TM2也能够在固定或者检测有机溶剂中的物质的系统等中利用。

附图说明

图1是显示对本发明的修饰型TM2N115C、TM2和各种抗生物素蛋白样蛋白(链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白)进行热处理后的生物素结合能力的曲线图。热处理在99.9℃进行1分钟、2分钟、4分钟、10分钟和20分钟。

图2是显示对本发明的修饰型TM2N115C、TM2和各种抗生物素蛋白样蛋白(链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白)在99.9℃处理32分钟后的生物素结合能力的曲线图。

图3是显示将本发明的修饰型TM2N115C、TM2和各种抗生物素蛋白样蛋白(链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白)在二甲基亚砜的存在下与生物素化磁性珠混合后的生物素结合能力的曲线图。在各种浓度的二甲基亚砜中进行混合30分钟。

发明的具体实施方式

以下说明用于实施本发明的优选方式。

tamavidin

tamavidin是从作为食用蘑菇的担子菌黄白侧耳(Pleurotus cornucopiae)中发现的新型生物素结合蛋白(WO02/072817)。该文献中记载了：

-tamavidin1和tamavidin2的相互的氨基酸同一性为65.5%且与生物素强结合；

-tamavidin2在大肠杆菌中高表达在可溶性级分中；而且

-在使tamavidin2在大肠杆菌中表达的情况下，在4.5小时的培养下，每50ml培养可以得到约1mg的纯度高的纯化重组蛋白质。这即使与作为生物素结合蛋白已知的抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白比较，也是非常高的值。

本说明书中的“tamavidin2”意味着tamavidin2(TM2)或它们的变体。本发明通过修饰TM2或其变体的特定的氨基酸残基，提供具有耐热性的修饰型TM2。本说明书中记载为“tamavidin2”、“TM2”的情况下，只要没有特别说明就意味着野生型的TM2及其变体。只是，根据文意，有时也作为包含本发明的修饰型TM2在内的TM2的野生型、突变型、本发明的修饰型的总称使用。另外，由于TM2显示生物素结合性，所以在本说明书中有时也将TM2称作“生物素结合蛋白”。

具体而言，TM2(野生型)典型地可以为包含序列编号2的氨基酸序列的蛋白质、或由包含序列编号1的碱基序列的核酸所编码的蛋白质。或者TM2可以为包含序列编号2的氨基酸序列的蛋白质或由包含序列编号1的碱基序列的核酸所编码的蛋白质的变体且具有与tamavidin2同样的生物素结合活性的蛋白质。TM2的变体可以是包含在序列编号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。取代可以为保守取代，这是将特定的氨基酸残基用具有类似的物理化学特征的残基的取代。保守取代的非限定的例子中包括：Ile、Val、Leu或Ala相互的取代这样的含脂肪族基的氨基酸残基之间的取代、Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn相互的取代这样的在极性残基之间的取代等。

由氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加得到的变体，能够通过在编码野生型蛋白质的DNA中实施例如作为公知技术的定点诱变(例如参照Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982，通过引用在本说明书援用其整体)而制作。本说明书中“1或多个氨基酸”是指通过定点突变能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。另外，本说明书中“1或多个氨基酸”根据情况也可以指1或数个氨基酸。

虽然并不是要做限定，但本发明中的TM2是指由在序列编号2中缺失、取代、插入或添加1至10个、优选9个以下、7个以下、5个以下、3个以下、2个以下、更优选1个以下的氨基酸得到的氨基酸序列构成的具有生物素结合活性的蛋白质。

另外本发明中，虽然并不是要做限定，但作为TM2的变体，例如也能够使用高结合能、低非特异结合性tamavidin(WO2010/018859)等。这样的tamavidin2变体可以为如下生物素结合蛋白，其特征在于，例如在包括序列编号2中记载的氨基酸序列、或者在该序列中具有1到数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80%以上同一性的氨基酸序列且显示生物素结合活性的蛋白质中，选自以下组中的1或多个残基取代为酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基：

1)序列编号2的第104位的精氨酸残基；

2)序列编号2的第141位的赖氨酸残基；

3)序列编号2的第26位的赖氨酸残基；和

4)序列编号2的第73位的赖氨酸残基。

更优选选自以下的组中的生物素结合蛋白：

序列编号2中的第104位的精氨酸残基取代为谷氨酸残基，并且第141位的赖氨酸残基取代为谷氨酸残基的生物素结合蛋白(R104E-K141E)；

序列编号2中的第40位的天冬氨酸残基取代为天冬酰胺残基，并且第104位的精氨酸残基取代为谷氨酸残基的生物素结合蛋白(D40N-R104E)；

序列编号2中的第40位的天冬氨酸残基取代为天冬酰胺残基，并且第141位的赖氨酸残基取代为谷氨酸残基的生物素结合蛋白(D40N-K141E)；以及

序列编号2中的第40位的天冬氨酸残基取代为天冬酰胺残基，第104位的精氨酸残基取代为谷氨酸残基，并且第141位的赖氨酸残基取代为谷氨酸残基的生物素结合蛋白(D40N-R104E-K141E)。

就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，使用上述合成寡核苷酸作为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化后的细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。这样，理论上有50%的新菌落含有单链形式的具有突变的噬菌体，其余的50%携带原序列。在所述探针与和带有目标突变的DNA完全一致的噬菌斑杂交，而不与携带原有链的噬菌斑杂交的合适的温度下，使获得的噬菌斑与通过激酶处理而标记的合成探针杂交。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收DNA。

此外，作为在生物活性肽的氨基酸序列中既保持其活性又实施1或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，在上述的定点诱变以外，还有用突变源处理基因的方法和选择性地裂解基因接着将所选择的核苷酸除去、取代、插入或添加然后连接的方法。

TM2的变体可以为包含与序列编号2的氨基酸序列至少具有80%以上、优选具有85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上、更优选具有99.2%以上的氨基酸同一性的氨基酸序列，且具有与TM2同样的生物素结合活性的蛋白质。

两个氨基酸序列的同一性%可通过目测和数学计算来确定。或者两个蛋白质序列的同一性百分比可以通过使用以Needleman，S.B.及Wunsch，C.D.(J.Mol.Bol.，48：443-453，1970)的算法为基础的、可从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序进行序列信息比较来确定。GAP程序优选的默认参数包括：(1)Henikoff，S.以及Henikoff，J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)所记载的得分/矩阵、blosum62；(2)一个空位扣12分；(3)连续空位加扣4分；以及(4)末端空位不扣分。

也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同一性百分比，例如：Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)中记载的可用BLAST程序对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在Nantional Center for Biotechnology Information(NCBI)或DNA Data Bank ofJapan(DDBJ)网站使用。在相同站点，对利用BLAST程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但检索通常使用默认值来进行。此外，两个氨基酸序列的同一性%也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值进行检索。

两个核酸序列的同一性%可通过目测和数学计算来确定，此外，该比较更优选使用计算机程序对序列信息进行比较。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组(GCG；威斯康星州Madison)的威斯康星软件包、10.0版“GAP”程序(Devereux等，1984，Nucl.Acids Res.，12：387)。使用该“GAP”程序，不仅可对两个核酸序列进行比较，还可比较两个氨基酸序列，并可对核酸序列和氨基酸序列进行比较。此处，“GAP”程序的优选默认参数包括：(1)实行关于核苷酸的(包括相同物质为1，不同物质为0的值)一元(unary)比较矩阵的GCG时，如Schwartz和Dayhoff主编的”多肽序列及结构图谱(Atlasof Polypeptide Sequence and Structure)”(国立生物医学研究财团，353-358页，1979年)所记载的Gribskov及Burgess(Nucl.Acids Res.，14：6745，1986)的加权氨基酸比对矩阵；或其它可比对的比对矩阵；(2)氨基酸的各空位罚分30，各空位中的各记号追加1罚分；此外，核苷酸序列的各空位罚分50，各空位中的各记号追加3罚分；(3)末端空位不罚分；以及(4)长空位没有最大罚分。技术人员使用的其它序列比较程序中，可使用例如美国国立医学图书馆的网站：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html提供的版本2.2.7的BLASTN程序、或UW-BLAST2.0算法。关于UW-BLAST2.0标准默认参数的设定，以下网站：http：//blast.wustl.edu中有记载。而且，BLAST算法使用BLOSUM62氨基酸得分矩阵，可使用的选择参数如下：(A)包含具有低组成复杂性的提问序列区段(由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry，1993)确定；参考Wootton及Federhen，1996“序列数据库中组成偏移区域的分析(Analysis of compositionally biased regions insequence databases)”Methods Enzymol.，266：544-71)，或用于掩蔽由短周期性内部重复形成的区段(由Claverie及States(Computers and Chemistry，1993)的XNU程序确定)的滤器，以及(B)用于报告数据库序列匹配的有统计学意义的阈值，或根据E-得分(Karlin和Altschul，1990)统计学模型得到的单纯偶然发现匹配的期待几率；某种匹配引起的有统计学意义的差值大于E-得分阈值时，不报告该匹配；优选的E-得分阈值的数值为0.5，此外按照优选程度增大的顺序依次为0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75、1e-100。

TM2的变体还可以是由包括与序列编号1的碱基序列的互补链在严格条件杂交的碱基序列的核酸所编码的、且具有与TM2同样的结合活性的蛋白质。

此处，“严格条件下”是指：在中度或高度的严格条件下进行杂交。具体来说，关于中度严格条件，根据例如DNA长度，掌握常规技术的该领域技术人员能够容易地确定。基本条件如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，第6章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001所示，例如包括下述条件的使用：5×SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的预洗涤溶液、约42℃的约50%的甲酰胺、2×SSC～6×SSC，优选5～6×SSC、0.5%SDS(或约42℃、约50%甲酰胺中的Stark氏溶液等其它类似的杂交溶液)的杂交条件，以及例如在约50℃～68℃、0.1～6×SSC、0.1%SDS的洗涤条件。优选的中度严格条件包括约50℃、6×SSC、0.5%SDS的杂交条件(及洗涤条件)。关于高度严格条件，根据例如DNA长度，本领域技术人员能够容易地确定。

通常，这样的条件包括较中度严格条件更高温度和/或更低盐浓度的杂交(例如：含0.5%左右的SDS、约65℃，6×SSC～0.2×SSC，优选6×SSC、更优选2×SSC、更优选0.2×SSC或者0.1×SSC的杂交)和/或洗涤，例如可定义为上述杂交条件以及伴随大约65℃～68℃、0.2～0.1×SSC、0.1%SDS的洗涤。关于杂交及洗涤的缓冲液，可以使用SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mMNaH₂PO₄以及1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC为0.15M NaCl以及15mM柠檬酸钠)，在杂交结束后进行洗涤15分钟～1小时左右。

此外，也可使用探针中不使用放射性物质的市售杂交试剂盒。具体可以列举出使用ECL direct labeling&detection system(Amersham公司制)进行的杂交等。严格杂交条件的例子为，向试剂盒的杂交缓冲液中加入5%(w/v)的封闭试剂，使NaCl达到0.5M，在42℃进行4小时杂交，关于洗涤，可以列举出下述条件：在0.4%SDS、0.5×SSC中，55℃条件下洗涤两次，每次20分钟，在2×SSC中，室温条件下，洗涤一次5分钟。

TM2的变体的生物素结合活性可以通过公知的任意方法测定。例如，可以像Kada等(Biochim.Biophys.Acta.，1427：33-43(1999))所描述的那样，采用使用了荧光生物素的方法来测定。该方法是利用以下性质的测定系统：在生物素结合蛋白的生物素结合位点上结合荧光生物素时，荧光生物素的荧光强度消失。或者，可以使用基于表面等离子体共振原理的生物传感器等能够测定蛋白与生物素间的结合的传感器(例如BIAcore等)来评价变体蛋白质的生物素结合活性。或者也能够通过使用HABA(2-(4'-羟基偶氮苯)苯甲酸)的方法或使用生物素化HRP(辣根过氧化物酶)的方法进行评价。

本发明的提高了耐热性的修饰tamavidin

本发明的修饰型TM2的特征在于，在包括序列编号2中记载的氨基酸序列、或在该序列中具有1到多个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且维持作为蛋白质的结构并优选显示生物素结合活性的蛋白质中，序列编号2的第115位的天冬酰胺残基取代为半胱氨酸。

另外，本发明的修饰型TM2的特征在于，在野生型TM2或变体TM2中，将相当于序列编号2的第115位的天冬酰胺残基的氨基酸残基取代为半胱氨酸。

本发明的耐热性的修饰型tamavidin2如下制作。

设计将tamavidin2的N115变为半胱氨酸(Cys)的变体，从而合成了基因。将该基因导入表达载体，使其在大肠杆菌表达。表达的变体(TM2-N115C)作为可溶性蛋白质与tamavidin2(TM2)同样以高水平进行了表达。使用利用亚氨基生物素琼脂糖的亲和色谱进行纯化，结果从300mL的培养液中获得约14mg的TM2-N115C。

然后如下解析制得的修饰型tamavidin2。

使用生物体试样相互作用测定装置BIAcore测定纯化的TM2-N115C的生物素结合活性。其结果，TM2-N115C具有与TM2相同水平的极强的生物素结合活性。另外，将TM2-N115C、TM2、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白在99.9℃处理30-32分钟后，固定化在微孔板上，再使其与生物素化辣根过氧化物酶(HRP)反应，并测定了HRP活性。其结果，抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白几乎没有检测出活性，与此相对，TM2检测出12%的活性，另外TM2-N115C具有几乎全部的(92%-100%)生物素结合活性。报告有抗生物素蛋白的I117C突变，当在99.9℃处理5分钟时活性大致为零(Nordlund等人，2003J.Biol.Chem.278：2479-2483.)，另外链霉抗生物素蛋白的H127C突变在95℃10分钟活性减少到20%(Reznik等人，1996Nat.Biotechnol.14：1007-1011.)，因此TM2-N115C在99.9℃处理约30分钟还能够保持几乎全部的活性是令人惊奇的。其耐热性相当于由抗生物素蛋白嵌合体化所构建的上述的抗生物素蛋白变体ChiAVD(I117Y)(Hytonen等人，(2005)J.Biol.Chem.280：10228-10233)。

在本说明书中“tamavidin2(TM2)”如上述所定义。

这样的修饰型TM2在加热处理后也维持作为蛋白质的结构。优选本发明的修饰型TM2与该处理前相比较维持75%以上、80%以上、优选85%以上、90%以上、92%以上、最优选95%以上的生物素结合活性。加热处理的温度至少为90℃、优选为93℃以上、95℃以上、97℃以上、98℃以上、99℃以上、最优选为99.9℃。加热处理的温度的上限为100℃以下。加热处理的时间至少为10分钟以上、优选为20分钟以上、30分钟以上、最优选为32分钟。

另外这样的修饰型TM2即使在非质子性极性有机溶剂中处理后，与该处理前相比较也维持50%以上的生物素结合活性。在非质子性极性有机溶剂中处理时的有机溶剂的浓度至少为60%以上、优选为65%以上、70%以上、75%以上、最优选为80%。有机溶剂的浓度的上限小于90%。在非质子性极性有机溶剂中处理的时间至少为10分钟、优选为20分钟以上、最优选为30分钟以上。此外，虽然不是用于限定，但这些处理能够在室温(25℃)进行。

这里所使用的非质子性极性有机溶剂，可以列举二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等，但并不限定于这些。特别优选的非质子性极性溶剂为DMSO。

本说明书中加热后也“维持作为蛋白质的结构”是指本发明的修饰型TM2即使在加热后也维持与初始的TM2具有的蛋白质相同的高级结构。蛋白质的高级结构表示蛋白质的二级结构以上，优选为三级结构或四级结构。

本说明书中“维持50%以上的生物素结合活性”是指在本发明的修饰型TM2蛋白质进行了热处理和/或有机溶剂处理后测定生物素结合活性的情况下，与进行这样的处理之前相比较维持50%以上的结合活性的意思。其中，加热处理的温度的上限为100℃以下。

另外本发明的修饰型TM2的特征在于，优选在包括与序列编号2中记载的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列且显示生物素结合活性的蛋白质中，序列编号2的第115位的天冬酰胺残基取代为半胱氨酸。更优选本发明的修饰型TM2的特征在于序列编号2的第115位的天冬酰胺残基取代为半胱氨酸(TM2N115C)(序列编号4)。

本发明的修饰型TM2中不希望被修饰的氨基酸残基

关于本发明的修饰型TM2中的氨基酸残基的修饰而言，要求不影响生物素结合能力。考虑该方面，非限定地优选tamavidin2的变体在序列编号2的氨基酸序列中4个色氨酸残基(W69、W80、W96、W108)不被修饰。或者，在将它们修饰的情况下，优选修饰为性质或结构类似的氨基酸，例如修饰为苯丙氨酸(F)。另外，也不希望修饰被认为与生物素直接相互作用的氨基酸残基(N14、S18、Y34、S36、S76、T78、D116)。或者，在对它们进行修饰时，优选修饰为性质或结构类似的氨基酸使得能够维持与生物素的结合，优选例如在天冬酰胺(N14)的情况下修饰为谷氨酰胺(Q)或天冬氨酸(D)，优选修饰为天冬氨酸，在天冬氨酸(D40)的情况下修饰为天冬酰胺(N)，在丝氨酸(S18、S36、S76)的情况下修饰为苏氨酸(T)或酪氨酸(Y)，优选修饰为苏氨酸，在酪氨酸(Y34)的情况下修饰为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或苯丙氨酸(F)，优选修饰为苯丙氨酸，在苏氨酸(T78)的情况下修饰为丝氨酸(S)或酪氨酸(Y)，优选修饰为丝氨酸，在天冬氨酸(D116)的情况下修饰为谷氨酸(E)或天冬酰胺(N)，优选修饰为天冬酰胺。

氨基酸的修饰方法

用于修饰TM2的氨基酸得到本发明的修饰型TM2的方法，能够使用公知的对氨基酸序列实施突变的方法，没有特别限定。优选对编码本发明的修饰蛋白质的核酸的碱基序列实施修饰来进行修饰。

例如，为了改变氨基酸序列的特定的位置的氨基酸，例如可以列举利用PCR的方法(Higuchi等人(1988)Nucleic Acid Res16：7351-7367，Ho等人(1989)Gene77：51-59)。即，能够通过利用包含目标突变的错配密码子的引物进行PCR，制作编码目标修饰体的DNA使其表达，从而得到目标修饰体。

另外，由氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加得到的修饰体能够利用对编码野生型蛋白质的DNA实施作为上述公知技术的定点诱变等方法来制作。

编码修饰型TM2蛋白质的核酸

本发明提供编码本发明的修饰型TM2蛋白质的核酸。这样的核酸的碱基序列是将编码野生型TM2蛋白质的碱基序列(序列编号1)改变为编码修饰型TM2蛋白质的修饰氨基酸的碱基序列而得到的碱基序列。改变的碱基序列只要是编码修饰后的氨基酸的碱基序列就没有限定。例如，包括由序列编号1的碱基序列构成的核酸(以下，“TM2基因”)、或与它们的互补链在严格条件下杂交且编码能够与生物素结合的具有适当的生物素结合活性的蛋白质的核酸而且为了实施本发明的修饰而改变了碱基序列的碱基序列。

本发明的核酸优选编码序列编号4的氨基酸序列。本发明的核酸更优选由序列编号3的核酸序列构成。

包含本发明的核酸的载体

另外，本发明提供包含编码修饰型TM2蛋白质的核酸的载体。优选为用于表达修饰型TM2蛋白质的表达载体。

编码本发明的修饰型TM2的蛋白质的核酸如上述“编码修饰型TM2蛋白质的核酸”所记载，没有特别限定。希望在编码修饰型TM2蛋白质的核酸的上游配置在所期望的宿主中发挥功能的启动子，另外希望在其下游配置终止子。

本发明的载体优选为表达载体。表达载体在上述的表达单元(启动子＋修饰型TM2编码区域＋终止子)以外，还具有能够用于在所期望的宿主中复制的单元，例如具有复制起点，另外，也可以具有用于筛选所期望的宿主细胞的药剂抵抗性标记基因。宿主没有特别限定，但优选为大肠杆菌。另外也可以在本表达载体中，例如导入大肠杆菌中的乳糖阻遏物系统这样适当的表达控制系统。

固定化有修饰型TM2的担载体

本发明提供固定化有本发明的修饰型TM2蛋白质的担载体。

构成担载体的材料可以使用公知的材料。包括例如纤维素、特氟龙(注册商标)、硝基纤维素、高交联琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、高密度聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、碳或它们的组合等，但不限定于这些。另外优选具有一定的强度、组成稳定且非特异性结合少的材料。

固体担载体的形状包括珠、磁性珠、薄膜、微细管、过滤器、板、微孔板、碳纳米管、传感器芯片等但不限定于这些。薄膜或板等平坦固体担载体也可以如该技术领域所知的那样设置坑、槽、过滤器底部等。

发明的一个方式中，珠可以具有约25nm～约1mm范围的球体直径。在优选的方式中，珠具有约50nm～约10μm范围的直径。珠的尺寸能够根据特定的适用来选择。

蛋白质与担载体的结合没有特别限定，能够使用用于使蛋白质与担载体结合的公知的方法。具体的结合方法本领域技术人员可以根据担载体的种类等适当选择。

修饰型TM2的热纯化的方法

另外本发明提供热纯化本发明的修饰型TM2蛋白质的方法。本发明的修饰型TM2蛋白质具有显著的耐热性，因此即使在大部分蛋白质变性的严酷的条件下进行加热处理也不变性，保持原有结构。因此，能够通过将包含本发明的修饰型TM2蛋白质的试样在至少90℃的温度进行至少10分钟加热处理，回收没有变性的蛋白质，由此纯化该蛋白质。含加热处理的该方法不仅能够用于本发明的修饰型TM2蛋白质的纯化，还能够用于分离、浓缩、捕获和检测的目的。

这里加热处理的条件是在至少90℃的温度至少为10分钟，优选为20分钟，更优选30分钟，还优选在95℃为30分钟、在98℃为30分钟、在99℃为30分钟，特别优选在99.9℃为30分钟。其中作为回收未变性的蛋白质的具体的手段，能够列举通过离心分离将变性的蛋白质颗粒化、回收上清的方法或进行过滤器过滤的方法、或者分子筛色谱法等，但不限定于这些。

使用了有机溶剂的修饰型TM2的检测方法

另外，本发明提供利用具有有机溶剂耐性的本发明的修饰型TM2，通过含有有机溶剂的体系对与生物素发生了连接的物质进行纯化的方法。本发明的方法包括：1)使结合有修饰型TM2的担载体和与生物素连接了的物质接触，使连接了的物质与该担载体结合；2)用含有60%至80%非质子性极性溶剂的溶液洗去未与该担载体结合的夹杂物；3)回收结合在该担载体上的、与生物素连接了的物质。包括使用了非质子性极性溶剂的清洗(洗去)工序的该方法不仅能够用于纯化与生物素连接了的物质，而且还能够用于分离、浓缩、捕获和检测的目的。

其中，与生物素连接了的物质是指与生物素直接或间接地发生了连接的物质两种。生物素和物质的直接连接通过经由共价键的连接而实现。生物素和物质的间接连接通过与生物素经由共价键连接的配体和物质之间的共价键、离子键、氢键或疏水性相互作用而实现连接。间接地结合的具体的例子中，可以列举使用生物素化抗体时通过抗原抗体反应的抗原分子。

例如在纯化作为目标的抗原蛋白时，首先在适当的缓冲液中将含有该抗原蛋白的检测体，与对特异性结合该抗原蛋白质的抗体进行生物素化而得到的产物进行温育。抗体的生物素化例如能够使用Pierce等市售的试剂盒进行。接着，加入连接了本发明的修饰型TM2的固体担载体、例如磁性珠并进行混合。然后使用磁石，使抗原蛋白-生物素-本发明的修饰型TM2-磁性珠的复合体凝集，除去上清，用含有非质子性极性溶剂的缓冲液清洗后，移出磁石，悬浮于所期望的缓冲液，完成抗原蛋白的纯化。这样本发明的方法能够在含有非质子性极性溶剂的缓冲液中清洗，因此能够进行夹杂物少、有效的抗原蛋白的纯化。

其中，用于清洗的溶液中的非质子性极性溶剂的浓度至少为60%至80%、优选为65%至75%，特别优选为70%。另外，非质子性极性溶剂优选为二甲基亚砜。

另外，由于本发明的TM2N115C显示高的二甲基亚砜耐性，所以能够利用于与包含脂质的化合物等水溶性低只能溶解于高浓度(60%至80%)的二甲基亚砜这样的生物素化物质的反应。

实施例

1.为了提高耐热性的修饰型tamavidin2的设计

设计了将tamavidin2的N115改变为半胱氨酸(Cys)的变体TM2N115C。

2.修饰型tamavidin2基因的构建和大肠杆菌中的表达

2-1.基因构建

以tamavidin2基因组入大肠杆菌用表达载体pTrc99A得到的质粒TM2/pTrc99A(WO02/072817)为模板，进行了PCR。使用的引物的序列(序列编号5至序列编号8)表示于表1。

[表1]TM2N115C基因构建用引物

下划线表示限制酶位点，斜体粗字表示起始和终止密码子。取代的密码子用小写字母表示。

TM2-N115C

以包含TM2的质粒TM2/pTrc99A为模板，以Tm2NtermPci和TM2N115C RV、Tm2CtermBam和TM2N115C FW的引物组合分别进行PCR。将所得到的产物使用低熔点琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶纯化。以纯化的2种PCR产物为模板，以Tm2NtermPci和Tm2CtermBam的组合进行了第2次PCR(重叠PCR)。其中，PCR在50μl反应液中分别含有质粒、10×PyroBest缓冲液(TaKaRa公司)5μl、2.5mM的dNTPs4μl、引物各25pmole、PyroBestDNA聚合酶(TaKaRa公司)0.5μl，在96℃3分钟进行1个循环，在96℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟进行15个循环，在72℃6分钟进行1个循环。

将所得到的PCR产物克隆到载体pCR4BluntTOPO(Invitrogen公司)中。使用电穿孔法将质粒导入大肠杆菌TB1，按照常规方法(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A laboratory manual，第二版)提取质粒DNA，从其两端确定PCR产物的碱基序列。

将确认了目标突变导入的克隆用PciI和BamHI消化后，使用低熔点琼脂糖进行电泳，进行纯化。大肠杆菌用表达载体pTrc99A用限制酶消化NcoI、BamHI而制备。将限制酶处理过的DNA断片和载体使用连接试剂盒(TaKaRa公司)进行连接。将连接产物转化入大肠杆菌BL21，由菌落PCR来确定包含插入基因的克隆，用于表达实验。

2-2.大肠杆菌表达

将组入了tamavidin2和组入了如上所述制作的tamavidin2变体的大肠杆菌的单一菌落接种于含有抗生物质氨苄青霉素(最终浓度100μg/ml)的LB培养基，在37℃振荡培养过夜。将其接种于含有氨苄青霉素的LB培养基，在37℃培养2小时后，加入异丙基-β-D(-)-硫代半乳糖苷(IPTG)使得最终浓度为1mM，诱导表达并进一步培养5～6小时。

利用离心分离回收菌体，悬浮于含有50mM NaCl的50mM CAPS(pH12)中，进行了超声波破碎。在破碎后进行离心分离，在其上清中加入2-亚氨基生物素琼脂糖(SIGMA公司)，用NaOH调节为pH12后，在室温温育。将其填充在开放柱，用柱的10倍量的含有500mM NaCl的50mM CAPS(pH12)充分清洗柱后，用柱的5倍量的50mM NH₄OAc(pH4)洗脱蛋白质。将洗脱级分用包含50mM NaCl的0.1M HEPES(pH7.4)透析得到的产物用于以下的解析。就TM2-N115C而言，从300mL的培养液中得到约14mg的纯化蛋白质。所得到的TM2-N115C的纯度为95%以上。

3.修饰型tamavidin2的耐热性试验

3-1.荧光生物素试验

使用与荧光生物素的结合活性来分析所纯化的TM2以及TM2-N115C的耐热性。即，利用如果荧光生物素与生物素结合蛋白的生物素结合位点结合，则荧光生物素的荧光强度就消失的性质，将TM2-N115C在高温度条件下的生物素结合能力与TM2进行了比较。

用20mM KPi(pH7)稀释纯化的各蛋白质使得浓度达到0.1μg/μL左右，在室温、50、60、70、80、90、99℃加热20分钟。在150μL试验缓冲液(50mMNa₂PO₄、100mM NaCl、1mM EDTA(pH7.5))中，改变该热处理后的各个溶液各自的量并分阶段加入。在该溶液中混合加入50pmol荧光生物素溶液(生物素-4-荧光素：分子探针)，在室温反应20分钟后，使用Infinite M200(TECAN)以Ex＝460nm、Em＝525nm测定了荧光强度。另外，为了考察二硫(S-S)键的影响，在稀释的蛋白质溶液中加入100mM DTT在室温静置30分钟后，按照上述程序加热，实施了荧光生物素测定。

其结果，与TM2的荧光生物素的结合活性在90℃减少相比，TM2-N115C即使在99.9℃也能够基本保持活性。荧光强度的减少比例达到没有加热的样品的50%的温度，相对于TM2为85℃，TM2-N115C为99.9℃以上。另外，就TM2-N115C而言，将99.9℃时加热时间延长至60分钟时，结合活性略微变弱，但能够确认保持了结合活性。另一方面，在TM2、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白的情况下，在99.9℃加热60分钟后几乎没有保持结合活性。

就TM2N115C而言，确认了在进行DTT处理时，在90℃加热20分钟活性变弱。由此表示通过在TM2N115C中新插入的半胱氨酸形成二硫(S-S)键，其可能有助于提高耐热性。

3-2.生物素化HRP结合试验

将TM2-N115C、TM2、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白在99.9℃处理1、2、4、10、20分钟或32分钟后，固定化在疏水结合用微孔板(住友Bakelite株式会社、TYPE H)上，再与生物素化辣根过氧化物酶(HRP)(VECTOR公司)反应，并测定了HRP活性。将在99.9℃处理1、2、4、10、20分钟的结果示于图1。将在99.9℃处理32分钟的结果示于图2和表2。在图2中，白色柱表示没有进行热处理的样品的结果，黑色柱表示进行了热处理的样品的结果。

其结果，在99.9℃热处理32分钟后，在抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白中几乎没有检测出活性，相比之下，TM2保持10～12%的活性(在99.9℃处理20分钟保持40%的活性)，另外TM2-N115C即使在99.9℃处理30分钟或32分钟后，也保持大致全部的(92%～100%)生物素结合活性(表2)。到目前为止报告的抗生物素蛋白的I117C突变若在99.9℃处理5分钟，则活性几乎变为零(Nordlund等人，2003J.Biol.Chem.278：2479-2483.)，另外链霉抗生物素蛋白的H127C突变在95℃10分钟活性减少到20%(Reznik等人，1996Nat.Biotechnol.14：1007-1011.)，可知TM2-N115C的耐热性即使与以往技术相比较也显著的高。

[表2]热处理后的残留活性(与生物素化HRP的结合活性)

4.修饰型tamavidin2的有机溶剂耐性试验

4-1.DMSO耐性试验

通过NHS-PEG₁₂-生物素(PIERCE公司制)与DynabeadsM270-Amine(Dynal公司制)反应，制备生物素化磁性珠。

将25μg/mL(最终浓度)的抗生物素蛋白样蛋白溶液(TM2-N115C、TM2、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白)与生物素化磁性珠在0%、20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%(最终浓度)的二甲基亚砜(DMSO)存在下混合，在室温(25℃)颠倒混合30分钟。通过该操作，使抗生物素蛋白样蛋白固定化在磁性珠表面。将固定化有抗生物素蛋白样蛋白的磁性珠用0.2%Tween20/TBS清洗后，以各5μL分注到96孔板中，在各孔中各添加200μL的以含有2%BSA的PBS稀释了5000倍的生物素化HRP(VECTOR公司制)，在室温振荡混合1小时。然后清洗磁性珠，用1-stepUltra TMB-ELISA(PIERCE公司制)检测出固定化在磁性珠上的HRP的活性。

将其结果示于图3。图3A表示TM2的结果，图3B表示TM2-N115C的结果，图3C表示链霉抗生物素蛋白的结果，图3D表示抗生物素蛋白的结果。

由图3可知，野生型tamavidin(TM2)和抗生物素蛋白在60%DMSO存在下，链霉抗生物素蛋白在40%DMSO存在下，几乎丧失生物素结合能力，相比之下，TM2-N115C即使在70%DMSO存在下也完全保持生物素结合能力，即使在80%的DMSO存在下也保持50%的活性。

5.TM2-N115C和生物素的相互作用

对Biotin-Lc-BSA的亲和性解析

对TM2N115C使用BIAcore3000，解析与生物素的相互作用。解析Biotin-Lc-BSA的相互作用的结果表示于表3。TM2的结合速度常数ka为(1.0±0.3)×10⁶(M^-1·S^-1)，解离速度常数kd在BIAcore3000的检测界限以下(＜5×10^-6S^-1)(Takakura等人，2009FEBS J276：1383-1397)，因此可知TM2N115C具有与TM2大致相同水平的生物素结合活性。

[表3]与生物素的结合速度常数ka和解离速度常数kd(利用BIAcore的解析)

加热后的蛋白质对于Biotin-Lc-BSA的亲和性解析

通过荧光生物素试验，表明当在90℃加热20分钟时，虽然TM2的荧光生物素结合活性降低，但TM2N115C的荧光生物素结合活性没有降低。因此，进行加热后的蛋白质对于Biotin-Lc-BSA的亲和性的测定。将TM2溶液和TM2N115C溶液稀释到0.6mg/mL左右(20mM KPi(pH7)。90℃加热20分钟后，以15000rpm进行10分钟(4℃)离心分离，回收上清，以A280进行浓度测定后，与上述同样进行利用BIAcore的与Biotin-Lc-BSA的亲和性的解析。

在90℃处理后的与Biotin-Lc-BSA的相互作用的BIAcore解析结果示于表3。TM2由于在90℃处理，其相对于生物素的亲和性降低，相比之下，TM2N115C即使在90℃进行处理，其对于生物素的亲和性也完全没有降低。

Claims (8)

1.一种修饰型生物素结合蛋白，其由序列编号2中记载的氨基酸序列构成，且显示生物素结合活性，其中，序列编号2的第115位的天冬酰胺残基被取代为半胱氨酸。

2.根据权利要求1所述的修饰型生物素结合蛋白，其在99.9℃加热处理30分钟后，与该处理前相比较维持75％以上的生物素结合活性。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的修饰型生物素结合蛋白，其在60％的二甲基亚砜中处理30分钟后，与该处理前相比较维持50％以上的生物素结合活性。

4.一种固定化有权利要求1～3中任一项所述的蛋白质的担载体。

5.一种编码权利要求1～3中任一项所述的蛋白质的核酸。

6.一种包含权利要求5所述的核酸的载体。

7.一种权利要求1～3中任一项所述的蛋白质的分离、浓缩、捕获、纯化，和/或检测方法，其包括以下的工序：

1)在至少90℃的温度对包含该蛋白质的试样进行至少10分钟加热处理；和

2)通过回收在上述1)的工序中未热变性的蛋白质，将该蛋白质分离、浓缩、捕获或纯化，和/或检测出该蛋白质。

8.一种分离、浓缩、捕获、纯化和/或检测与生物素发生了连接的物质的方法，其包括以下的工序：

1)使权利要求4中所述的担载体和与生物素连接了的物质接触，使该担载体和该连接了的物质结合；

2)用包含60％至80％的二甲基亚砜的溶液洗去未与该担载体结合的夹杂物；和

3)通过对与该担载体结合了的与生物素发生了连接的物质进行回收，将该物质分离、浓缩、捕获或纯化和/或检测出该物质。