CN101595132B - 耐热性生物素结合蛋白的利用方法、以及结合有该蛋白的固体载体 - Google Patents

耐热性生物素结合蛋白的利用方法、以及结合有该蛋白的固体载体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及连接有耐热性生物素结合蛋白的固体载体。本发明还涉及连接有耐热性生物素结合蛋白的固体载体的应用。本发明进一步涉及使用耐热性生物素结合蛋白进行的与生物素连接的物质的纯化、浓缩、检测、捕捉等技术领域。用于本发明的固体载体的生物素结合蛋白具有耐热性，因此，其对于伴随有暴露于70℃以上的温度下的情况的测定系统的应用是有用的。

Description

耐热性生物素结合蛋白的利用方法、以及结合有该蛋白的固体载体
技术领域
本发明涉及连接有耐热性生物素结合蛋白的固体载体。本发明还涉及本发明的固体载体的应用。本发明进一步涉及使用耐热性生物素结合蛋白进行的与生物素连接的物质的纯化、浓缩、检测、捕捉等技术领域。
背景技术
抗生物素蛋白与生物素、或者链霉菌抗生物素蛋白与生物素之间的亲和性非常高(Kd＝10-15～10-14M)，就生物体二分子之间的相互作用而言，这是最强的相互作用之一。现在，抗生物素蛋白/链霉菌抗生物素蛋白-生物素相互作用广泛应用于生物化学、分子生物学或者医学领域(Green，(1975)，Adv.Protein Chem.，29：85-133；Green，(1990)，Methods Enzymol.，184：51-67)。抗生物素蛋白是来源于卵清的碱性糖蛋白，其等电点大于10。抗生物素蛋白因其高碱性、或者糖链的影响而出现与DNA等非特异性结合的问题，这是限制抗生物素蛋白应用的主要因素。另一方面，链霉菌抗生物素蛋白来源于放线菌(Streptomyces avidinii)，其等电点在中性附近，并且没有糖链。这两种蛋白均形成4聚体，1个亚基结合1分子生物素。分子量为60k Da左右。
tamavidin(tamavidin 1：序列号2)是作为显示对稻瘟病菌M.grisea的抗菌性的蛋白而被从食用蘑菇白黄侧耳(pleurotus cornucopiae)中纯化出来的第3种生物素结合蛋白，其基因结构也已经阐明(WO 02/072817)。此外，还从同一种蘑菇中鉴定出其同源物(tamavidin 2：序列号4)，而且重组蛋白的生产也已取得成功(WO 02/072817)。tamavidin同源物可以通过大肠杆菌表达和使用亚胺基生物素柱的纯化而容易地生产，这与抗生物素蛋白或链霉菌抗生物素蛋白的生产系统相比具有很大的优势。
当在大肠杆菌中表达抗生物素蛋白时，可溶性蛋白的收量少，为50μg/50ml左右(Airenne et al.，1994，Gene，144：75-80)。因而，现在采用使用杆状病毒(Baculovirus)的昆虫细胞系统(Airenne et al.，1997，Protein exp.Purif.，9：100-108)。此外，当在大肠杆菌中表达链霉菌抗生物素蛋白时，重组蛋白形成不溶性的包涵体。将该包涵体溶解在高浓度盐酸胍中之后，通过透析逐步除去盐酸胍，从而使蛋白重折叠，得到可溶性的有活性的重组链霉菌抗生物素蛋白(Sano and Cantor，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：142-146)。这样一来，抗生物素蛋白或链霉菌抗生物素蛋白的生产需要大量的劳力和时间。另一方面，当在大肠杆菌中表达tamavidin同源物时，每50ml的培养物可以获得1mg的重组蛋白。就生物素结合蛋白的生产效率而言，这是一个很高的值，显示了tamavidin同源物蛋白的潜在的有用性。
目前为止，在试剂或诊断试剂领域，结合有抗生物素蛋白或链霉菌抗生物素蛋白的固体载体例如磁珠、微量板或传感器芯片等已经被开发出来，但是，尚未报导非特异性结合低、且在高温下具有稳定性的产品。
专利文献1：国际公开第WO 02/072817号小册子
非专利文献1：Green，1975，Adv.Protein Chem.，29：85-133
非专利文献2：Green，1990，Methods Enzymol.，184：51-67
非专利文献3：Airenne et al.，1994，Gene，144：75-80
非专利文献4：Airenne et al.，1997，Protein exp.Purif.，9：100-108
非专利文献5：Sano and Cantor，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：142-146
发明内容
本发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供连接有耐热性生物素结合蛋白的固体载体。本发明的另一目的在于提供与生物素连接的物质的纯化、浓缩、检测、捕捉等方法，这些方法中使用了耐热性生物素结合蛋白。这种情况下，提供本发明的固体载体的应用。此外，本发明的目的在于提供一种连接有生物素结合蛋白的固体载体，该固体载体可用于存在暴露于70℃以上高温的情况的测定系统。
解决问题的方法
“tamavidin”是来源于担子菌白黄侧耳的生物素结合蛋白，其包括tamavidin 1以及tamavidin 2这两种(参照WO 02/072817)。本发明人等经过深入研究，结果发现：tamavidin 2与现有的抗生物素蛋白、链霉菌抗生物素蛋白一样对于生物素具有非常高的亲和性。即，明确了tamavidin 2与生物素之间具有强度为大多抗原抗体反应的约1000倍的亲和性。此外，还证实了基本上不存在现有抗生物素蛋白中存在的非特异结合性(对DNA)的问题。而且，还发现：tamavidin 2的耐热性比链霉菌抗生物素蛋白高10℃以上，并且该性质在将tamavidin 2结合在固体载体后仍可以保持。本发明人等进一步深入研究的结果发现：tamavidin 1强烈地与生物素结合，且其耐热性比链霉菌抗生物素蛋白高5℃。通过这些研究结果，本发明人等发现：可以提供即使在高温条件下也能够保持生物素结合活性的、连接有耐热性生物素结合蛋白的固体载体，从而想到了本发明。因此，本发明提供：连接有耐热性生物素结合蛋白的固体载体及其应用，以及使用耐热性生物素结合蛋白的、与生物素连接的物质的纯化、浓缩、检测和捕捉方法。
以下，对本发明进行详细的说明。
连接有耐热性生物素结合蛋白的固体载体
本发明提供连接有耐热性生物素结合蛋白的固体载体。
本说明书中，耐热性生物素结合蛋白是指tamavidin 1、tamavidin 2或它们的变体。具体地，连接在本发明的固体载体上的耐热性生物素结合蛋白可以是包含序列号2或序列号4的氨基酸序列的蛋白，或者可以是包含序列号1或序列号3的碱基序列的核酸所编码的蛋白。或者，连接在本发明的固体载体上的耐热性生物素结合蛋白可以是包含序列号2或序列号4的氨基酸序列的蛋白的变体、或者是包含序列号1或序列号3的碱基序列的核酸所编码的蛋白的变体，并且该蛋白具有与tamavidin 1或2等同的生物素结合活性和耐热性。在本说明书中，tamavidin 1、tamavidin 2以及它们的变体统称为tamavidin。
tamavidin 1或2的变体可以是包含在序列号2或4的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白，并且具有与tamavidin 1或2等同的生物素结合活性和耐热性。取代可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团的氨基酸残基之间的取代(例如Ile、Val、Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。
氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的变体可以通过对编码野生型蛋白质的DNA实施例如作为公知技术的定点诱变(例如参见Nucleic AcidResearch，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982，通过引用将其全文引入到本说明书中)而产生。在本说明书中，“一个或多个氨基酸”是指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。此外，在本说明书中，“一个或多个氨基酸”根据情况指1个或数个氨基酸。
就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，使用上述合成寡核苷酸作为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化后的细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。这样，理论上有50％的新菌落含有单链形式的具有突变的噬菌体，其余的50％携带原序列。在合适的温度下，使获得的噬菌斑与通过激酶处理而标记的合成探针杂交，所述合适的温度指该温度下所述探针与和带有目的突变的DNA完全一致的噬菌斑杂交，而不与携带原有链的噬菌斑杂交。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收DNA。
另外，在保持其活性的同时对生物活性肽的氨基酸序列施加一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定点突变外，还有用诱变物处理基因的方法，以及选择性地断开基因，然后删除、取代、插入或添加选定的核苷酸，再进行连接的方法。
tamavidin 1或2的变体还可以是包含与序列号2或4的氨基酸序列具有至少60％以上、优选65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上、更优选99.3％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列的蛋白，并且该蛋白具有与tamavidin 1或2等同的生物素结合活性和耐热性。
两个氨基酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定。或者两个蛋白质序列的同一性百分比可以通过使用以Needleman，S.B.及Wunsch，C.D.(J.Mol.Bol.，48：443-453，1970)的算法为基础的、可从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序进行序列信息比较来确定。GAP程序优选的默认参数包括：(1)Henikoff，S.以及Henikoff，J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)所记载的得分/矩阵(スコアリング·マトリツクス)、blosum62；(2)一个空位扣12分；(3)连续空位加扣4分；以及(4)末端空位不扣分。
也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同一性百分比，例如：Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)中记载的可用BLAST程序对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在Nantional Center for Biotechnology Information(NCBI)或DNA Data Bank ofJapan(DDBJ)网站使用。在相同站点，对利用BLAST程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但检索通常使用默认值来进行。此外，两个氨基酸序列的同一性％也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值检索。
两个核酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定，此外，该比较更优选使用计算机程序对序列信息进行比较。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组(GCG；威斯康星州Madison)的成斯康星·软件包、10.0版“GAP”程序(Devereux等，1984，Nucl.Acids Res.，12：387)。使用该“GAP”程序，不仅可对两个核酸序列进行比较，还可比较两个氨基酸序列，并可对核酸序列和氨基酸序列进行比较。此处，“GAP”程序的优选默认参数包括：(1)实行关于核苷酸的(包括相同物质为1，不同物质为0的值)一元(unary)比较矩阵的GCG时，如Schwartz和Dayhoff主编的”多肽序列及结构图谱(Atlasof Polypeptide Sequence and Structure)”(国立生物医学研究财团，353-358页，1979年)所记载的Gribskov及Burgess(Nucl.Acids Res.，14：6745，1986)的加权氨基酸比对矩阵；或其它可比对的比对矩阵；(2)氨基酸的各空位罚分30，各空位中的各记号追加1罚分；此外，核苷酸序列的各空位罚分50，各空位中的各记号追加3罚分；(3)末端空位不罚分；以及(4)长空位没有最大罚分。技术人员使用的其它序列比较程序中，可使用例如美国国立医学图书馆的网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/bls.html提供的版本2.2.7的BLASTN程序、或UW-BLAST2.0算法。关于UW-BLAST2.0标准默认参数的设定，以下网站：http://blast.wustl.edu中有记载。而且，BLAST算法使用BLOSUM62氨基酸得分矩阵，可使用的选择参数如下：(A)包含具有低组成复杂性的提问序列片断(由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry，1993)确定；参考Wootton及Federhen，1996”序列数据库中组成偏移区域的分析(Analysis of compositionally biased regionsin sequence databases)”Methods Enzymol.，266：544-71)，或用于掩蔽短周期性内部重复形成的片段(由Claverie及States(Computers and Chemistry，1993)的XNU程序确定)的滤器，以及(B)用于报告数据库序列匹配的有统计学意义的阈值，或根据E-得分(Karlin和Altschul，1990)统计学模型得到的单纯偶然发现匹配的期待几率；某种匹配引起的有统计学意义的差值大于E-得分阈值时，不能报告该匹配；优选的E-得分阈值的数值为0.5，此外按照优选度增大的顺序依次为0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75、1e-100。
tamavidin 1或2的变体还可以是由包含与序列号1或3的碱基序列的互补链在严格条件下杂交的碱基序列的核酸编码的蛋白，并且该蛋白具有与tamavidin 1或2等同的生物素结合活性和耐热性。
此处，所说的“严格条件下”是指在中度或高度的严格条件下进行杂交。具体来说，中度严格条件的具体例为根据DNA长度，掌握常规技术的该领域技术人员能够容易地确定。基本条件如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，第6-7章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001所示，而且关于硝基纤维素滤膜，其可使用的情况包括：5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的预洗涤溶液、约40-50℃的约50％的甲酰胺、2×SSC-6×SSC(或约42℃、约50％甲酰胺中的Stark’s溶液等其它类似的杂交液)的杂交条件，以及例如在约40℃-60℃，0.5-6×SSC，0.1％SDS的洗涤条件下使用。优选中度严格条件包括约50℃，6×SSC的杂交条件(以及洗涤条件)。关于高度严格条件，例如根据DNA长度，本领域技术人员能够容易地确定。
通常，这样的条件包括较中度严格条件更高温度和/或更低盐浓度的杂交(例如：约65℃，6×SSC至0.2×SSC，优选6×SSC，更优选2×SSC，最优选0.2×SSC的杂交)和/或洗涤，例如可定义为上述杂交条件以及伴随大约65℃-68℃、0.2×SSC、0.1％SDS的洗涤。关于杂交及洗涤的缓冲液，可以使用SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4以及1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC为0.15M NaCl以及15mM柠檬酸钠)，在杂交结束后15分钟进行洗涤。
此外，也可使用探针中不使用放射性物质的市售杂交试剂盒。具体可以列举，使用ECL direct labeling & detection system(Amersham公司制)的杂交等。严格杂交条件的例子为，向试剂盒的杂交缓冲液中加入5％(w/v)的封闭试剂，使NaCl达到0.5M，在42℃进行4小时杂交，关于洗涤，在0.4％SDS、0.5xSSC中，55℃条件下每次20分钟，洗涤两次，在2xSSC中，室温条件下，每次5分钟，洗涤一次。
tamavidin 1或2的变体的生物素结合活性和耐热性可以采用任何公知方法来测定。例如，可以像Kada等(Biochim.Biophys.Acta.，1427：44-48(1999))所描述的那样，采用使用了荧光生物素的方法来测定。该方法是利用以下性质的测定系统：在生物素结合蛋白的生物素结合位点上结合荧光生物素时，荧光生物素的荧光强度消失。或者，可以使用基于表面等离子体共振原理的生物传感器等能够测定蛋白与生物素间的结合的传感器，来评价变体蛋白的生物素结合活性。耐热性可以通过在评价上述生物素结合活性时，改变测定温度进行测定来评价。
与本发明的固体载体连接的耐热性生物素结合蛋白对生物素具有高亲和性，其解离常数Kd为10-8M数量级以下、优选10-9M数量级以下、10-10M数量级以下、10-11M数量级以下、10-12M数量级以下、10-13M数量级以下。代表性地，其解离常数Kd可以为10-13～10-9M数量级。
与公知的来源于卵清的抗生物素蛋白或链霉菌抗生物素蛋白相比，与本发明的固体载体连接的耐热性生物素结合蛋白具有高耐热性。这里，耐热性是指高温下(高温域)的蛋白稳定性和高温下的生物素结合活性这两者。
高温下的蛋白稳定性可以采用SDS-PAGE分析中蛋白条带的显色与室温时相比有50％消失的温度来进行评价。对连接于本发明的固体载体上的耐热性生物素结合蛋白而言，SDS-PAGE分析中蛋白条带的显色与室温状态相比有50％消失的温度可以是高于71℃、优选为75℃以上、77.5℃以上、80℃以上、82.5℃以上、85℃以上、87℃以上。
高温下的生物素结合活性可以采用生物素的结合与室温状态相比减少50％的温度来进行评价。就连接于本发明的固体载体上的耐热性蛋白而言，生物素的结合与室温状态相比减少50％的温度可以高于73℃、优选为75℃以上、78℃以上、80℃以上、82.5℃以上、85℃以上。
连接于本发明的固体载体上的耐热性生物素结合蛋白可以通过对担子菌来源的蛋白进行纯化而获得，或者以重组蛋白的形式获得。
在本发明中，对连接耐热性生物素结合蛋白的固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料(例如，可以通过过滤、沉淀、磁性分离等从反应混合物中分离的材料)的载体即可。
构成固体载体的材料包括但不限于：纤维素、特氟隆TM、硝基纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白(白蛋白等)、碳或它们的组合等。
固体载体的形状包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜(フイルタ一)、板、微量板(マイクロプレ一ト)、碳纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样，薄膜或板等平坦的固体载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
在本发明的一个实施方式中，磁珠可以具有约25nm～约1mm范围的球体直径。在优选的实施方式中，磁珠具有约50nm～约10μm范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。数种细菌孢子具有约1μm数量级的尺寸，因此，用于捕捉该孢子的优选的珠子具有大于1μm的直径。
在本发明的一个实施方式中，由Sepharose等高交联球形琼脂糖制成的珠子具有约24μm～约165μm范围的直径。在优选的实施方式中，高交联球形琼脂糖珠具有约24μm～约44μm范围的直径。高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从Polysciences，Warrington，PA或Spherotech，Liberville，IL购买的制品等聚苯乙烯胶乳珠。
二氧化硅(SiO2)-处理或二氧化硅(SiO2)基的固体载体的例子包括可从Polysciences，Warrington，PA购买的超常磁性二氧化硅珠等，其可以用于捕捉核酸(例如DNA)。或者，还可以使用可从Dynal Biotech购买的M-280等。
具有亲水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的细菌细胞、核酸以及其它成分。作为该磁珠的例子，可以列举出Polysciences，Warrington，PA销售的珠子(名称：Biomag(注册商标)羧基)、或者Bangs Laboratory，Inc.，Fishers，IN的名称为MC02N/2928的珠子。或者，可以使用Dynal Biotech销售的M-270等。
耐热性生物素结合蛋白与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的蛋白与固体载体的偶联方法来进行。例如，对固体载体表面进行修饰，使得羧基露出来，然后是该羧基与蛋白的氨基在交联试剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)的存在下进行偶联反应，从而将蛋白与固体载体连接起来。或者，例如，通过在不含伯氨基的pH6.5～9的缓冲液中混合固体载体表面的羧基被N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯化后的固体载体与蛋白，可以将固体载体表面的羧基与蛋白的氨基连接起来。
或者，可以使用交联试剂BS3(双[硫代琥珀酰亚胺基]辛二酸盐)或DSS(二琥珀酰亚胺基辛二酸盐)将固体载体表面的氨基与蛋白的氨基连接起来，或者使用交联试剂SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酸酯)或GMBS(N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺)将固体载体表面的氨基与蛋白的巯基连接起来。
连接于本发明的固体载体上的耐热性生物素结合蛋白保持高温下的蛋白稳定性和生物素结合性。因此，与传统上最常使用的链霉菌抗生物素蛋白相比，可以在更高的温度下、在保持生物素结合能力的情况下对本发明的固体载体进行处理。本发明的固体载体即使在暴露于70℃至90℃、优选75℃至90℃、80℃至90℃、85℃至90℃、70℃至85℃、70℃至80℃、75℃至80℃、75℃至85℃、75℃至87.5℃的加热条件下进行处理时，仍可以以保持生物素结合能力状态使用。这意味着可以例如在更高的温度进行核酸杂合子形成或其后的洗涤，即可以以更高的严格度进行杂交。通过使用本发明的固体载体，可以构建能够尽可能抑制非特异性杂合子形成的测定系统。或者，例如，可以在将tamavidin连接到固体载体上时，选择必须进行高温处理的方法。而且，当在tamavidin上结合耐热性蛋白、酶或荧光染料等时，或者在结合后与生物素修饰物进行反应时，可以采用高温来进行更加特异性的反应。
此外，连接于本发明的固体载体上的耐热性生物素结合蛋白基本上没有对DNA的非特异结合，因此能够避免该技术领域公知的来源于卵清的抗生物素蛋白中存在的DNA的非特异结合性的问题。
使用了耐热性生物素结合蛋白的、与生物素连接的物质的分离、浓缩、纯 化、检测和/或捕捉方法
本发明提供一种与生物素连接的物质的分离、浓缩、捕捉、纯化、和/或检测方法，所述方法包括以下步骤：
1)使与生物素连接的物质与本发明的连接有tamavidin的固体载体相接触，并使与生物素连接的物质结合于该固体载体上；
2)对未结合在该固体载体上的杂质进行洗涤；然后，
3)通过回收与该固体载体结合的与生物素连接的物质，进行该物质的分离、浓缩、捕捉或纯化，和/或进行该物质的检测。在优选的实施方式中包括：本发明的方法中的至少1个上述步骤在70℃至90℃的加热条件下进行、更优选在75℃至90℃、80℃至90℃、85℃至90℃、70℃至85℃、70℃至80℃、75℃至80℃、75℃至85℃、75℃至87.5℃的加热条件下进行。
在本发明的方法中，与生物素连接的物质是指与生物素直接或间接连接的物质这两者。生物素与物质的直接连接可以通过基于共价键的连接来实现。生物素与物质的间接连接可以通过下述方法来实现：对于通过共价键与生物素连接的配体，使物质通过共价键、离子键、氢键、或疏水相互作用与之连接。间接连接的具体例子可列举：在使用生物素化抗体时利用抗原抗体反应与抗原分子连接，在使用生物素化核酸探针时利用核酸的杂交与互补的核酸连接等。
在优选的实施方式中，本发明的方法中的至少1个步骤在70℃至90℃的加热条件下进行，因此，生物素与物质的间接连接优选在本发明的方法所使用的温度条件下能够保持连接。例如，当采用核酸的杂交作为生物素与物质的间接连接时，杂交的核苷酸的长度可以为至少20个核苷酸以上、优选至少25个核苷酸以上、30个核苷酸以上、35个核苷酸以上、40个核苷酸以上、50个核苷酸以上、100个核苷酸以上。
构成本发明的方法中使用的连接有tamavidin的固体载体的材质及其形状，可以根据需要分离、浓缩、纯化、检测和/或捕捉的物质的特性来进行选择。
此外，本发明方法的各步骤中采用的缓冲液组成、合适的温度等，可以在考虑需要分离的物质的性质等的基础上，由本领域技术人员适宜设定。采用本发明的方法分离、浓缩、捕捉、和/或纯化得到的物质的检测方法，可以根据该物质的性质由本领域技术人员适宜选择。
本发明的方法包括但不限于模仿下述方法的方法：例如，核酸的检测(日本特开2003-125800)，用于从样品中分离核酸的装置和方法(Bortolin等，WO2004/005553)，核酸扩增方法：杂交信号扩增法(HSAM)(Zan等，WO1998/004745)，或者病毒或病毒基因组的浓缩等(玉造，2004，BIOINDUSTRY，21(8)：39-47)。或者，还可以用于细胞或微生物的检测、捕捉、浓缩。
例如，在浓缩体液中的病毒时，首先，在适当的缓冲液中将试样与下述制品一起温育，所述制品是对与病毒表层抗原特异性结合的抗体进行生物素化而得到的。抗体的生物素化可以使用例如Pierce等销售的试剂盒来进行。然后，添加本发明的连接有tamavidin的固体载体例如磁珠，并进行混合。最后，使用磁铁使病毒-抗体-生物素-tamavidin-磁珠的复合体聚集，除去上清，用适当的缓冲液洗涤数次，然后撤去磁铁，悬浮于希望的缓冲液中，从而完成病毒的浓缩。
或者，在浓缩体液中的病毒基因组DNA时，首先将试样添加到破坏病毒粒子的适当溶液中，从病毒中提取出基因组DNA。然后，根据需要插入将该基因组单链化的步骤。然后，将其与下述制品一起进行温育，从而使生物素化寡DNA与病毒基因组杂交，所述制品是对与病毒基因组的一部分互补的数十至数百碱基的单链寡DNA进行生物素化而得到的，或者是对具有与病毒基因组的一部分互补的链的数十至数百碱基的双链DNA进行生物素化并热变性而得到的。与使用传统的连接有抗生物素蛋白或链霉菌抗生物素蛋白的固体载体的情况相比，当使用本发明的连接有tamavidin的固体载体时，可以采用高的温度，例如70℃至90℃、优选75℃至90℃、80℃至90℃、85℃至90℃、70℃至85℃、70℃至80℃、或75℃至80℃、75℃至85℃、75℃至87.5℃的温度范围。通过采用如上所述的高温度作为杂交温度，可以抑制非特异性DNA的结合，尽量不混入希望的病毒基因组以外的DNA，进行特异性更高的病毒基因组的浓缩。然后，将本发明的连接有tamavidin的固体载体例如磁珠添加到高温状态的样品(生物素化寡DNA特异性捕捉病毒基因组的状态)中，并进行混合。最后，使用磁铁使病毒基因组-寡DNA-生物素-tamavidin-磁珠的复合体聚集，除去上清，用适当的缓冲液洗涤数次，然后撤去磁铁，将其悬浮在希望的缓冲液中，从而完成病毒基因组的浓缩。此后，病毒基因组的检测可以采用例如PCR(Saiki et al.(1985)Science 230：1350-1354)等来进行。与传统的抗生物素蛋白、链霉菌抗生物素蛋白相比，tamavidin在不存在生物素的情况下具有更高的耐热性，而且基本上不存在对DNA的非特异性结合。因此，其适用于基于如上所述方法的DNA特异性浓缩。
发明的效果
与本发明的固体载体连接的tamavidin保持了高温下的蛋白稳定性和生物素结合性。因此，与传统上最常使用的链霉菌抗生物素蛋白相比，本发明的固体载体可以在更高的温度下、在保持生物素结合能力的状态下进行处理。通过使用本发明的固体载体，可以构建包含高温下的处理的测定系统。
附图说明
[图1]图1为照片(A)和图表(B)，其显示了tamavidin 2、链霉菌抗生物素蛋白以及抗生物素蛋白的针对DNA的非特异结合实验的结果。
[图2]图2显示了通过与链霉菌抗生物素蛋白进行比较来评价tamavidin 2的耐热性(蛋白稳定性)的结果。图2A显示SDS-PAGE的结果，图2B为显示该蛋白条带的定量结果的图表。
[图3]图3为显示tamavidin 2(A)、链霉菌抗生物素蛋白(B)以及抗生物素蛋白(C)的耐热性(荧光生物素结合活性)的图表。
[图4]图4显示tamavidin 2磁珠(A)、市售的链霉菌抗生物素蛋白磁珠(B)、链霉菌抗生物素蛋白磁珠(C)以及抗生物素蛋白磁珠(D)的耐热性(荧光生物素结合活性)的图表。
[图5]图5为显示tamavidin 2磁珠(A和C)、市售的链霉菌抗生物素蛋白磁珠(B和D)的耐热性(荧光生物素结合活性)的图表。
[图6]图6为显示tamavidin 2Sepharose珠的耐热性(荧光生物素结合活性)的图表。
[图7]图7为显示tamavidin 1的荧光生物素结合活性的图表。
实施例
实施例1：tamavidin 2(TM2)
1-1.tamavidin 2的表征
tamavidin 2的大肠杆菌表达与纯化
将编码tamavidin 2(TM2)的DNA(序列号3)重组在表达载体pTrc99A上，并使之在大肠杆菌中表达，此时，表达的TM2基本上积累在可溶性级分中，且表达量大(WO 02/072817)。采用Hofmann等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4666-4668，1980)的方法，使用填充有亚氨基生物素琼脂糖(Sigma)的柱子，从重组大肠杆菌中纯化出TM2蛋白。具体地，对于WO 02/072817中记载的大肠杆菌，用1mM IPTG、在37℃诱导表达5小时，然后收集菌体，将沉淀悬浮在50mM Caps pH11.0，50mM NaCl中，超声波破碎菌体。将离心后的上清上样(アプライ)在用50mM Caps pH11.0，50mM NaCl平衡的自制亚氨基生物素柱(高度3cm，体积0.5ml)上。用5m l的50mM Caps pH11.0，500mM NaCl进行洗涤后，用1.5-2ml的50mM NH4OAc pH4.0进行洗脱。纯化蛋白的收量为从50mL的培养液中收获约1mg。
质谱分析
将tamavidin 2以10mg/ml的浓度溶解在0.1％TFA、50％MeCN饱和溶液中，对该样品溶液使用ZipTip C4(Millipore)进行纯化，直接上样到MALDI板上。风干后，添加一层基体溶液(芥子酸)。再风干后，将其上样于激光离子化飞行时间型质谱分析装置(MALDI-TOFMS)AXIMA-CFR(岛津制作所)，进行质谱分析(引出电压：20kV，飞行模式：Linear，检测离子：Positive)。其结果，观察到m/z＝15146.3(相当于单体)、30335.0(相当于二聚体)、60932.0(相当于四聚体)。而且，对于生物素结合型的tamavidin 2，相当于四聚体的峰变大。由该结果可以判断：tamavidin 2为4聚体，其质量为60932。对蛋白的N末端序列进行了分析，判明翻译起始的甲硫氨酸下游的丝氨酸为N末端。使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(Genetechs公司制造)计算了tamavidin 2的除起始甲硫氨酸之外的由140个氨基酸组成的多肽的等电点，结果为7.36。
分子吸光系数
tamavidin 2的分子吸光系数的理论值为A280＝41750M-1cm-1亚基(subunit)-1(0.25mg/mL时为0.68)。实际上，对tamavidin 2进行纯化，并在乙酸铵中进行了透析，对所得样品进行冷冻干燥(乙酸铵完全升华)，称量其重量为3mg。将该样品溶解于20mM KPi(pH6.5)中，将其浓度调整为0.25mg/mL，测定A280，得到0.67的实测值。这相当于理论值的98％。由此，通过测定A280，可以简便地测定tamavidin浓度。
利用荧光生物素进行的活性测定
利用荧光生物素的tamavidin 2的生物素结合活性的测定按Kada等(Biochim.Biophys.Acta.，1427：44-48，(1999))的方法进行。进行调整使得200μL测定缓冲液(50mM NaH2PO4、100mM NaCl、1mM EDTA(pH7.5))中在0pmol～486pmol范围内梯度性地含有纯化的TM2。在该溶液中混合20pmol/μL荧光生物素溶液(biotin-4-fluorescein：Molecular Probe)50μL(1nmol)，室温放置10分钟后，使用Las-3000(FUJIFILM)测定荧光强度。其结果，1nmol的荧光生物素与0.274nmol的TM2结合。即，1mol的tamavidin上结合了3.6mol的荧光生物素。这表明：1分子的tamavidin上结合4分子的荧光生物素(每个亚基1个分子)。同样地，1mol链霉菌抗生物素蛋白结合了3.4mol荧光生物素。
1-2.tamavidin 2(TM2)的非特异结合性
兔抗TM2抗体的纯化
将大肠杆菌表达的tamavidin 2(TM2)蛋白用亚氨基生物素柱进行纯化，将得到的产品、以及将其进一步进行凝胶纯化而得到的产品用作抗原，制成两种抗体。在使用碱性磷酸酶标记抗IgG抗体进行的Western方法中，对纯化重组tamavidin 2标准品的检测灵敏度为约0.5ng。由以上结果可以得出以下结论：获得了特异性和滴度均高的抗体。而且，抗tamavidin 2抗体-tamavidin 1的交叉反应能够检测到但水平很低(相当于原抗原的1/20左右)。
对于抗TM2抗体(用仅进行了亚氨基生物素柱纯化的抗原制作的抗体)，进一步进行以下的纯化。使用2张15％丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE将40μgTM2进行分离，并将蛋白转印到2张硝基纤维素膜(BIO-RAD)上。将膜在含3％BSA的TBS缓冲液中于室温下振荡1小时，以进行封闭。然后，在室温下与抗TM2抗体(用仅进行了亚氨基生物素柱纯化的抗原制作的抗体，稀释1000倍)反应一夜，然后切取转印有TM2的部位，在洗脱缓冲液(0.2M甘氨酸、1mM EDTA pH2.8)中于室温下振荡20分钟。用洗脱缓冲液的1/10容量的1M Tris溶液进行中和后，加入等量的10×TBS缓冲液，在4℃保存。
对DNA的非特异结合性
tamavidin 2(TM2)对DNA的非特异结合试验
分析TM2对DNA的非特异结合性。在2×SSC缓冲液中对10μg～0.3μg梯度稀释的鲑鱼精子DNA进行碱变性，使用Bio-Dot SF(BIO-RAD)使其吸附于Hybond N+膜(Amersham Biosceinces)上。用5×Denhardt’s液(0.1％BSA、0.1％聚蔗糖、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮)对膜进行封闭后，在25μg/mL的TM2、链霉菌抗生物素蛋白、以及抗生物素蛋白溶液中于室温浸泡90分钟。然后，将膜用TTBS缓冲液(含0.05％Tween20的TBS缓冲液)于室温洗涤3次，每次5分钟。用含0.5％脱脂牛乳、0.01％Tween20的TBS缓冲液对膜进行1小时的封闭。作为第1抗体，对于TM2使用采用前述方法纯化的兔抗TM2抗体，对链霉菌抗生物素蛋白使用兔抗链霉菌抗生物素蛋白抗体(SIGMA)，对抗生物素蛋白使用兔抗抗生物素蛋白抗体(Abcam)，对它们进行稀释使得抗体效价相等。与第1抗体的抗原抗体反应在室温下进行1夜。将膜用TTBS缓冲液于室温洗涤3次，每次5分钟，然后，作为2次抗体，使用碱性磷酸酶标记抗兔IgG抗体(BIO-RAD)(稀释10000倍)，在室温下反应1小时。将膜用TTBS缓冲液于室温洗涤3次，每次5分钟，然后，用AlkalinePhosphatase substrate kit II、vector Black(船越)进行显色，用Las-3000(FUJIFILM)进行定量。其结果，抗生物素蛋白的染色强度DNA浓度依赖性地增加，而TM2、链霉菌抗生物素蛋白的染色强度未受DNA浓度的强烈影响(图1A、B)。该结果表明：tamavidin 2基本上没有对DNA的非特异活性，其与链霉菌抗生物素蛋白等同。这显示了tamavidin 2相对于抗生物素蛋白的优越性。
1-3.tamavidin 2与生物素之间的相互作用分析
使用Biacore生物传感器进行的tamavidin 2(TM2)与生物素的相互作用的动 力学分析
将2mg高纯度BSA(Sigma)和1mg NHS-生物素(Pierce)溶解在1ml的50mM硼酸钠pH8.0中，4℃温育2小时。将NHS-生物素(EZ-LinkNHS-LC-LC-Biotin)预先溶解在少量的DMSO中，然后进行添加。将其装入透析管(MWCO 6-8,000)，在50mM碳酸钠pH6.7中于4℃透析一夜。将这样制作的生物素-BSA结合物(MW 67kDa，30μM)作为Biacore(注册商标)生物传感器的配体(贴付在传感器芯片的物质)。另一方面，制备重组tamavidin 2作为分析物(流入流路系统的物质)，利用Biacore(注册商标)3000(利用表面等离子体共振原理的生物传感器，Biacore Inc.)进行了分子间相互作用的分析。将生物素-BSA、以及作为阴性对照的BSA采用胺偶联法固定化在CM5传感器芯片上。调节固定化量，使其为200RU左右。将固定化有BSA的芯片配置在流动池(flow cell)1和3中，将固体化有生物素-BSA的芯片配置在流动池2和4中。将tamavidin 2加载在流动池1和2中，将链霉菌抗生物素蛋白加载在流动池3和4中，以流速20μl/min加载2分钟，加载到工作缓冲液[10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％Surfactantat20(Biacore Inc.)]中。然后，监测样品的解离60分钟。需要说明的是，发生结合的tamavidin 2以及链霉菌抗生物素蛋白不可能解离，因此，在测定中不进行再生操作，而是从低浓度起进行7个梯度的测定(3.125、6.25、12.5、25、50、100、以及200nM)。以BSA的数据作为参照，从BSA-生物素的数据中将其减去。测定在25℃下进行。由所得传感图谱，使用分析软件BIAevaluation ver.4.1，采用1∶1结合模型，进行反应速度论解析，计算出结合速度常数(ka)和解离速度常数(kd)。解离常数(Kd)由kd/ka求出。
而且，在不进行再生操作时，Rmax(分析物的最大结合量)随各浓度测定的进行而减少，但在分析时，对Rmax进行局部拟合，并按浓度进行计算。此外，只采用能够近似为1∶1结合模型的分析物浓度的数据。
利用Biacore(注册商标)3000(利用表面等离子体共振原理的生物传感器)对重组tamavidin 2与生物素之间的分子间相互作用进行动力学分析的结果如表1所示。
[表1]
表1tamavidin 2与生物素之间的相互作用的动力学
  蛋白   分子量(kDa)   结合速度常数ka(M-1S-1)   解离速度常数kd(S-1)   解离常数kd(M)
  tamavidin 2   61   9.19×105   6.83×10-6   7.43×10-12
  链霉菌抗生物素蛋白   60   2.28×106   2.52×10-6   1.11×10-12
所得tamavidin 2的解离常数为10-12M数量级，与我们此次测定的链霉菌抗生物素蛋白的解离常数在同一数量级。该结果表明，tamavidin 2是继抗生物素蛋白、链霉菌抗生物素蛋白之后的又一种对生物素具有非常高的亲和性的蛋白。可以认为tamavidin 2能够应用于目前广泛应用的抗生物素蛋白-生物素技术之中。
1-4.tamavidin 2的耐热性
通过与链霉菌抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的比较，分析了tamavidin2(TM2)的耐热性。
蛋白的稳定性
将每份10μL(2μg)的0.2μg/μLTM2、以及每份10μL(2μg)的0.2μg/μL链霉菌抗生物素蛋白于室温下、50、60、70、80、90、99℃加热20分钟。然后，以15000rpm离心10分钟，将上清中的可溶性蛋白悬浮在等量的2×SDS样品缓冲液(100mM Tris-HCl pH 6.8，12％2-巯基乙醇，2％S DS，20％甘油)中，在95℃加热10分钟后，进行SDS-PAGE。蛋白条带通过CBB染色进行检测。使用Las-3000(FUJIFILM)，以定量标志(LMW ELECTROPHORESISCALIBRATION KIT；Pharmacia Biotech)为基准制作标准曲线，对蛋白条带进行定量化。SDS-PAGE的结果示于图2A，蛋白条带的定量结果示于图2B。50％的蛋白消失的温度对链霉菌抗生物素蛋白而言为71℃，而对于tamavidin 2而言为87℃。该结果表明：tamavidin 2的耐热性比链霉菌抗生物素蛋白高15℃以上。此外，如果加入生物素，则tamavidin 2的耐热性变得极强，即使在95℃处理后，4聚体也不解离。
生物素结合活性
生物素结合蛋白的生物素结合位点上如果结合荧光生物素，则荧光生物素的荧光强度消失。利用该性质，将tamavidin 2在高温条件下的生物素结合能力与链霉菌抗生物素蛋白、抗生物素蛋白进行了比较。
将约0.25μg/μL的TM2和链霉菌抗生物素蛋白在室温下、50、60、70、80、90℃加热20分钟后，制备在150μL的测定缓冲液(50mM NaH2PO4、100mM NaCl、1mM EDTA(pH7.5))中包含0μL～27μL梯度的经过加热处理的TM2、或链霉菌抗生物素蛋白的溶液。在该溶液中混合50μL(250pmol)的5pmol/μL荧光生物素溶液(生物素-4-荧光素：Molecular Probe)，室温下放置20分钟后，使用Las-3000(FUJIFILM)测定荧光强度。
生物素结合蛋白的耐热性试验如下进行。将约0.25μg/μL的生物素结合蛋白在室温下、50、60、70、80、90℃加热20分钟后，制备在150μL的测定缓冲液中包含0μL～12μL梯度的经加热的生物素结合蛋白的溶液。在该溶液中混合50μL(100pmol)的2pmol/μL荧光生物素溶液，室温放置20分钟后，使用Infinite M200(TECAN)测定荧光强度，其中Ex＝460nm、Em＝525nm。
结果示于图3。该结果为：与室温相比，在70℃以下时TM2中与荧光生物素的结合未见变化，而在80℃时保持了82％的活性。另一方面，链霉菌抗生物素蛋白与荧光生物素的结合活性在70℃时减少了40％，在80℃时减少了80％。此外，抗生物素蛋白与荧光生物素的结合活性在70℃时减少了10％，在80℃时减少了70％。当荧光强度的减少比例为减少至未加热的样品的50％时的温度对TM2而言为85℃，而对链霉菌抗生物素蛋白而言为73℃，对抗生物素蛋白而言为78℃。
1-5.tamavidin 2固定化载体的耐热性
tamavidin 2磁珠的制作
将300μl表面包覆有羧基的磁珠(Dynabeads M-270 Carboxylic Acid，Dynal公司)用0.01N氢氧化钠300μl洗涤10分钟后，再用300μl超纯水洗涤3次，每次10分钟。在洗涤完毕的磁珠上加入用冷超纯水溶解的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺·盐酸(EDC)(PIERCE公司)使得最终浓度为0.2M，室温下振荡30分钟。然后，先用300μl冷超纯水，再用300μl的50mM MES缓冲液(pH5.0)洗涤磁珠，在其中混合300μl(180μg)置换为50mM MES缓冲液(pH5.0)的0.6mg/mlTM2。室温下振荡30分钟，从而使TM2与磁珠以共价键结合。用磁铁回收磁珠，除去上清。然后，用300μl的50mM Tris缓冲液(pH 7.0)除去珠子的未反应羧基后，用含0.5％BSA、0.1％Tween20的PBS缓冲液300μl封闭磁珠。用PBS缓冲液300μl悬浮磁珠，从而完成磁珠的制备。对于链霉菌抗生物素蛋白以及抗生物素蛋白同样地制作磁珠。
tamavidin 2磁珠的加热试验
(i)耐热性
使用荧光生物素，将TM2磁珠的耐热性与上述制作的链霉菌抗生物素蛋白磁珠以及抗生物素蛋白磁珠、以及市售的链霉菌抗生物素蛋白磁珠(Dynabeads M-270Streptavidin、Dynal)进行比较。
将各磁珠用PBS缓冲液洗涤后，在室温下、70、75、80、85、90℃加热20分钟。制备在150μL的测定缓冲液中包含0μL～16μL梯度的经加热的各磁珠的溶液。在该溶液中混合1pmol/μL生物素-4-荧光素溶液50μL(50pmol)，室温放置20分钟后，使用Infinite M200测定上清的荧光强度，其中Ex＝460nm，Em＝525nm。
结果示于图4。该结果为：与室温相比，在TM2磁珠中，与荧光生物素的结合在75℃以下时未见变化，在80℃为73％、在85℃为64％的活性。链霉菌抗生物素蛋白磁珠在80℃时有70％失活，市售的链霉菌抗生物素蛋白磁珠(Dynal)在80℃时有90％失活。此外，抗生物素蛋白磁珠在80℃时有35％失活、在85℃时有55％失活。荧光强度的减少比例为减少到未加热样品的50％时的温度对TM2而言为87℃，对链霉菌抗生物素蛋白而言为78℃，而对链霉菌抗生物素蛋白(Dynal)为72℃，对抗生物素蛋白而言为84℃。
(ii)高温下的生物素结合活性
生物素结合蛋白的生物素结合位点上如果结合荧光生物素，则荧光生物素的荧光强度消失。利用该性质，将TM2磁珠在高温条件下的生物素结合能力与市售的链霉菌抗生物素蛋白磁珠进行了比较。
TM2磁珠通过在表面包覆有羧基的磁珠(Dynabeads M-270CarboxylicAcid，Dynal公司)上共价结合TM2来制作。此外，市售的链霉菌抗生物素蛋白磁珠使用Dynabeads M-270Streptavidin(Dynal公司)。TM2磁珠为2×109珠/30mg/mL，每1mg磁珠结合333pmol的荧光生物素。此外，市售的的链霉菌抗生物素蛋白磁珠为6.7×108珠/10mg/mL，每1mg磁珠结合625pmol的荧光生物素。
将TM2磁珠、以及市售的链霉菌抗生物素蛋白磁珠300μL用300μL的PBS缓冲液洗涤2次，再将其悬浮在300μL的PBS缓冲液中。将各磁珠分注在7管中，每管42μL。将50μL(50pmol)的1pmol/μL的荧光生物素溶液(生物素-4-荧光素：Molecular Probe公司)分别添加在测定缓冲液(50mMNaH2PO4、100mM NaCl、1mM EDTA(pH7.5))150、149、148、146、142、140、134μL中，在室温、50、60、65、70、80、95℃下预温育10分钟。然后，再将两磁珠在室温、50、60、65、70、80、95℃下预温育5分钟，然后取1、2、4、8、10、16μL添加到50pmol荧光生物素溶液中，使得最终容积为200μL，将它们在各温度下继续加热20分钟。这期间，用吸液管(ピペツテイング)悬浮混合液3次。然后，迅速地用磁铁回收磁珠，使用InfiniteM200(TECAN)测定上清的荧光强度，其中Ex＝460nm、Em＝525nm(实验1)。在实验2中，与实验1同样地，在室温、70、75、80、85、90℃下进行分析。
实验1的结果如图5A以及B所示，实验2的结果如图5C以及D所示。该结果为：在TM2磁珠中，与室温相比，与荧光生物素的结合在70℃以下未见变化，而在80℃、85℃时分别保持了75％、62％的活性(图5A)。另一方面，在市售的的链霉菌抗生物素蛋白磁珠中，与荧光生物素的结合在80℃时消失了60％～80％(图5B)。荧光强度的减少比例为减少到未加热样品的50％时的温度对链霉菌抗生物素蛋白(Dynal)而言为77.5℃，而对tamavidin 2而言为87.5℃。
TM2 Sepharose珠的制作
将表面的羧基被用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯化后的Sepharose珠(直径34μm)HiTrap NHS-activated HP(GE Health公司)1mL用10ml冷的1mM盐酸洗涤后，再用1ml冷超纯水进行洗涤。将Sepharose珠与预先在含0.5M氯化钠的0.2M碳酸氢钠缓冲液(pH8.3)中透析过的1ml的1mg/ml的TM2混合。在室温下振荡3小时，使得TM2与Sepharose珠结合。然后，用5ml的50mM Tris缓冲液(pH8.0)除去未反应的活性基团后，用5ml含0.5％BSA、0.05％Tween 20的PBS缓冲液封闭Sepharose珠。用1ml的PBS缓冲液将Sepharose珠悬浮，从而完成了TM2Sepharose珠的制作。
TM2Sepharose珠的加热试验
使用荧光生物素，验证了TM2Sepharose珠的耐热性。将TM2Sepharose珠用PBS缓冲液洗涤后，在室温、70、75、80、85、90℃下加热20分钟。制备在150μL的测定缓冲液中包含0μL～16μL的梯度的经过加热的Sepharose珠的溶液。然后，混合50μl(150pmol)的3pmols/μl生物素-4-荧光素溶液，室温放置20分钟后，使用Infinite M200测定上清的荧光强度，其中Ex＝460nm、Em＝525nm。
该结果为：与室温相比，与荧光生物素的结合在80℃以下时未见变化，在85℃时为64％的活性。此外，荧光强度的减少比例为减少至未加热样品的50％时的温度为86℃，显示出与固定化有TM2的磁珠等同的耐热性(图6)。
实施例2：tamavidin 1(TM1)
2-1.tamavidin 1的表征
tamavidin 1的大肠杆菌表达与纯化
将编码tamavidin 1的DNA(序列号1)导入表达载体pTrc99A上，并使之在大肠杆菌中表达，此时，表达的tamavidin 1蛋白基本上蓄积在可溶性级分中，其表达量多，为与tamavidin 2相同的水平。因此，对于重组tamavidin1，进行了如下纯化。诱导表达后收集菌体，将得到的大肠杆菌的沉淀悬浮在20mM Kpi pH7.0中，用超声波破碎菌体。以15000rpm离心10分钟后，将上清于70℃处理10分钟。热处理后再进行离心分离操作，将其上清更换为50mM Tris-HCl pH7.0、50mM NaCl。将该样品上样再用相同缓冲液平衡化的离子交换柱MonoQ HR5/5(Phaemacia)上，回收直接通过柱的级分作为重组tamavidin 1。蛋白的回收量为每50mL培养液约1mg。
质谱分析
tamavidin 1的质谱分析按照与实施例1相同的方式进行。其结果，观察到m/z＝15961.6(相当于单体)、31922.5(相当于二聚体)。单体的质量与tamavidin 1经SDS-聚丙烯酰胺电泳后的分子量良好吻合。另一方面，在tamavidin 1中添加过量的生物素，将温育后的样品的SDS-聚丙烯酰胺电泳图像与实施了相同处理的tamavidin 2的电泳图像进行比较分析，提示tamavidin 1为4聚体。使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(Genetechs公司制)对由全长143氨基酸组成的tamavidin 1的等电点进行计算，结果为6.23。
与生物素的结合性
对上述70℃热处理后的离心上清中的tamavidin 1的荧光生物素结合活性进行测定。方法参照tamavidin 2的情况。与荧光生物素的温育在室温进行。结果如图7所示。可知：tamavidin 1即使在70℃处理后，仍与荧光生物素结合。
2-2.tamavidin 1的耐热性
蛋白的稳定性
将每组10μL(2μg)的0.2μg/μL浓度的纯化tamavidin 1在室温、50、60、70、80、90、99℃下加热20分钟。然后，以15000rpm离心10分钟，将上清的可溶性蛋白悬浮在等量的2×SDS样品缓冲液(100mM Tris-HCl pH6.8，12％2-巯基乙醇，2％SDS，20％甘油)中，在95℃加热10分钟后，进行SDS-PAGE。蛋白条带通过CBB染色进行检测。使用Las-3000(FUJIFILM)以定量标志(LMW ELECTROPHORESIS CALIBRATION KIT；PharmaciaBiotech)为基准制作标准曲线，对蛋白条带进行定量化。其结果，tamavidin 1的50％蛋白消失的温度为76℃。该结果表明：tamavidin 1的耐热性比上述的链霉菌抗生物素蛋白高5℃。此外，如果加入生物素，则tamavidin 1的耐热性变得极强，即使在95℃处理后，4聚体仍不解离。
工业实用性
连接于本发明的固体载体的tamavidin，在高温下仍可保持蛋白稳定性以及生物素结合性，因此，本发明的固体载体可以用于包含高温下的处理的测定系统。包含高温下的处理的测定系统可以高特异性地进行物质的分离、浓缩、纯化、检测和/或捕捉，对一系列操作的快速化做出贡献。此外，tamavidin的生产效率比来源于卵清的抗生物素蛋白或链霉菌抗生物素蛋白高，因此，与市售的连接有生物素结合蛋白的固体载体相比，本发明的固体载体在成本方面是有利的。
序列表
<110>日本烟草产业株式会社(JAPAN TOBACCO INC.)
 
<120>耐热性生物素结合蛋白的利用方法、以及结合有该蛋白的固体载体
 <130> YCT-1336
 
<150>PCT/JP2006/326260
<151>2006-12-28
 
<160>4
 
<170>PatentIn version 3.1
 
<210>1
<211>432
<212>DNA
<213>白黄侧耳(Pleurotus cornucopiae)
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(432)
<223>
 
<400>1
atg aaa gac gtc caa tct ctc ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc       48
Met Lys Asp Val Gln Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu
1               5                   10                  15
ggc tca aca atg aat ttg act gca aat aaa gac ggt tcg ctc acc gga       96
Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly
            20                  25                  30
acg tac cac tcc aac gtc ggc gag gtt ccc cca act tat cac ctt tct       144
Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser
        35                  40                  45
ggc cgg tac aac ctc cag ccc ccc tcg ggt caa ggc gtt act ctg gga       192
Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly
    50                  55                  60
tgg gcg gtg tct ttc gaa aac act agt gcg aat gtt cat tct gtc tca       240
Trp Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Val His Ser Val Ser
65                  70                  75                  80
aca tgg agc ggg cag tac ttc tct gaa ccc gcc gag gtg atc ctc acc       288
Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Val Ile Leu Thr
                85                  90                  95
cag tgg ctg ttg tca agg agc tct gag cgc gaa gat ttg tgg cag tcc       336
Gln Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu Trp Gln Ser
            100                 105                 110
acc cat gtg ggg cat gat gag ttc agc aag aca aag cca acc aag gag       384
Thr His Val Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro Thr Lys Glu
        115                 120                 125
aag att gcc cag gct caa ctc ctt cgt cgc ggg ttg aag ttc gag tga       432
Lys Ile Ala Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys Phe Glu
    130                 135                 140
<210>2
<211>143
<212>PRT
<213>白黄侧耳
 
<400>2
 
Met Lys Asp Val Gln Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly
            20                  25                  30
Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser
        35                  40                  45
Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly
    50                  55                  60
Trp Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Val His Ser Val Ser
65                  70                  75                  80
Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Val Ile Leu Thr
                85                  90                  95
Gln Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu Trp Gln Ser
            100                 105                 110
Thr His Val Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro Thr Lys Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Ala Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys Phe Glu
    130                 135                 140
 
<210>3
<211>426
<212>DNA
<213>白黄侧耳
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(426)
<223>
 
<400>3
atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc       48
Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu
1               5                   10                  15
aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga       96
Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly
            20                  25                  30
aag tac ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct       144
Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser
        35                  40                  45
ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg       192
Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly
    50                  55                  60
tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg       240
Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp
65                  70                  75                  80
agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg       288
Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp
                85                  90                  95
ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt      336
Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu
            100                 105                 110
gtg ggg aat gat tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc      384
Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile
        115                 120                 125
gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa              426
Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys
    130                 135                 140
 
<210>4
<211>141
<212>PRT
<213>白黄侧耳
 
<400>4
 
Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu
1               5                   10                  15
Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly
            20                  25                  30
Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser
        35                  40                  45
Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly
    50                  55                  60
Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp
65                  70                  75                  80
Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp
                85                  90                  95
Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu
            100                 105                 110
Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile
        115                 120                 125
Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys
    130                 135                 140

Claims (11)

1.一种固体载体，其经过80℃至90℃的加热处理后，仍保持生物素结合能力和/或其在80℃至90℃的加热条件下仍具有生物素结合能力，该固体载体上连接有由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白。
2.根据权利要求1所述的固体载体，该固体载体是主要以选自下组的材料构成的：特氟隆TM、硝基纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白、碳以及它们的组合。
3.根据权利要求2所述的固体载体，其中，
所述多糖类选自纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖，
所述聚酰胺为尼龙。
4.根据权利要求2所述的固体载体，其中，所述蛋白为白蛋白。
5.根据权利要求1所述的固体载体，该固体载体选自珠子、薄膜、微细管、滤膜、板、碳纳米管以及传感器芯片。
6.根据权利要求5所述的固体载体，该固体载体为磁珠或微量板。
7.权利要求1至6中任一项所述的固体载体的应用，其中，暴露在80℃至90℃的加热条件下使用。
8.与生物素连接的物质的分离、浓缩、捕捉、纯化和/或检测方法，该方法包括以下步骤：
1)使权利要求1至6中任一项所述的固体载体和与生物素连接的物质相接触，使与生物素连接的物质结合在该固体载体上；
2)清洗未结合在该固体载体上的杂质；然后，
3)通过回收结合在该固体载体上的与生物素连接的物质，来分离、浓缩、捕捉或纯化该物质，和/或检测该物质；
并且，上述步骤中的至少1个是在80℃～90℃的加热条件下进行的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中加热条件为80℃～85℃。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，与生物素连接的物质是与生物素连接的核酸。
11.与生物素连接的物质的分离、浓缩、捕捉、纯化和/或检测方法，该方法包括以下步骤：
1)使权利要求1至6中任一项所述的固体载体和与生物素连接的物质相接触，使与生物素连接的物质结合在该固体载体上；
2)清洗未结合在该固体载体上的杂质；然后，
3)通过回收结合在该固体载体上的与生物素连接的物质，来分离、浓缩、捕捉或纯化该物质，和/或检测该物质；
并且，至少上述步骤1)是在80℃～90℃的加热条件下进行的。
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DIAMANDIS E P ET AL.THE BIOTIN-(STREPT)AVIDIN SYSTEM: PRINCIPLES AND APPLICATIONS IN BIOTECHNOLOGY.《CLINICAL CHEMISTRY》.1991,625-636. *

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