KR20090107502A - 내열성 비오틴 결합성 단백질의 이용법, 및 해당 단백질이 결합한 고체 담체 - Google Patents

내열성 비오틴 결합성 단백질의 이용법, 및 해당 단백질이 결합한 고체 담체 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 내열성 비오틴 결합성 단백질을 연결시킨 고체 담체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 내열성 비오틴 결합성 단백질을 연결시킨 고체 담체의 사용에도 관한 것이다. 본 발명은, 또한 내열성 비오틴 결합성 단백질을 이용하는, 비오틴과 연결한 물질의 정제, 농축, 검출, 포착 등의 기술분야에 관한 것이다. 본 발명의 고체 담체에 이용하는 비오틴 결합성 단백질은 내열성을 가지고 있으므로, 70℃ 이상의 온도에 폭로하는 것을 수반하는 엣세이계의 사용에 있어서 유용하다.
Figure P1020097015135
내열성 비오틴 결합성 단백질, 고체 담체

Description

내열성 비오틴 결합성 단백질의 이용법, 및 해당 단백질이 결합한 고체 담체{USE OF THERMOSTABLE BIOTIN-BINDING PROTEIN AND SOLID SUPPORT HAVING THE PROTEIN BOUND THERETO}
본 발명은, 내열성 비오틴 결합성 단백질을 연결시킨 고체 담체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 고체 담체의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 내열성 비오틴 결합성 단백질을 이용하는, 비오틴과 연결한 물질의 정제, 농축, 검출, 포착 등의 기술분야에 관한 것이다.
아비딘과 비오틴, 혹은 스트렙트아비딘과 비오틴 간의 친화성은 매우 높고(Kd=10-15~-14M), 생체 이분자 간의 상호작용으로서는, 가장 강한 상호작용의 하나이다. 현재, 아비딘/스트렙트아비딘-비오틴 상호작용은, 생화학, 분자생물학, 혹은 의학의 분야에서 넓게 응용되고 있다(Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29:85~133; Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51~67). 아비딘은, 난백(卵白) 유래의 염기성 당단백으로, 등전점은 10을 넘는다. 아비딘은, 그 높은 염기성, 혹은 당쇄의 영향으로, DNA 등에 대한 비특이적 결합이 문제가 되어, 이것이 아비딘 사용의 한정 요인이 되고 있다. 한편, 스트렙트아비딘은 방선균(Streptomyces avidinii) 유래로, 등전점은 중성 부근에서 당쇄를 포함하지 않는다. 양 단백질과도, 4량체를 형성하고, 1개의 서브유니트 당 1분자의 비오틴과 결합한다. 분자량은 60kDa 정도이다.
타마비딘(타마비딘 1: 서열번호 2)는, 벼 도열병균 M.grisea에 대해서 항균 성을 나타내는 단백질로서, 식용 버섯 타모기타케로부터 정제된 제 3의 비오틴 결합 단백질이고, 그 유전자 구조도 밝혀졌다(WO O2/072817). 또한 그 호모로그(타마비딘 2: 서열번호 4)도 같은 버섯으로부터 동정되어, 재조합 단백질의 생산에도 성공했다(WO 02/072817). 타마비딘 호모로그는, 대장균 발현과 이미노비오틴 컬럼을 이용한 정제에 의해 용이하게 생산할 수 있고, 이는 아비딘이나 스트렙트아비딘의 생산계와 비교하여 큰 이점이다.
아비딘을 대장균으로 발현시켰을 경우, 가용성 단백질의 수득량은 50ml 당 50μg정도로 적다(Airenne et al., 1994, Gene, 144:75-80). 그 때문에 현재에는 바큘러 바이러스를 사용한 곤충 세포계가 사용되고 있다(Airenne et al., 1997, Protein exp. Purif., 9:100-108). 또한, 스트렙트아비딘을 대장균으로 발현시킨 경우, 재조합 단백질은 불용성의 봉입체를 형성한다. 이 봉입체를 고농도의 구아니딘염산으로 가용화한 후, 투석에 의한 단계적인 구아니딘염산의 제거에 의해서 단백질의 리폴딩이 일어나, 가용성이고 활성이 있는 재조합 스트렙트아비딘이 얻어진다(Sano and Cantor, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:142-146). 이와 같이, 아비딘이나 스트렙트아비딘의 생산에는 많은 노력과 시간을 필요로 한다. 한편, 타마비딘 호모로그를 대장균으로 발현시킨 경우, 50ml의 배양 당 1mg의 재조합 단백 질이 얻어졌다. 이것은 비오틴 결합 단백질의 생산효율로서는 높은 값이며, 타마비딘 호모로그 단백질의 잠재적 유용성을 나타내고 있다.
지금까지 시약이나 진단약의 분야에 있어서는, 아비딘, 혹은 스트렙트아비딘이 결합한 고체 담체, 예를 들면 자성 비즈나, 마이크로플레이트, 혹은 센서 칩 등이 개발되고 있지만, 비특이적 결합이 낮고, 또한 고온 영역에 있어서의 안정성을 가지는 것은 아직 보고되어 있지 않다.
특허 문헌 1: 국제공개 제WO 02/072817호 팜플렛
비특허문헌 1: Green, 1975, Adv. Protein Chem., 29:85~133
비특허문헌 2: Green, 1990, Methods Enzymol., 184:51~67
비특허문헌 3: Airenne et al., 1994, Gene, 144:75~80
비특허문헌 4: Airenne et al., 1997, Protein exp. Purif., 9:100~108
비특허문헌 5: Sano and Cantor, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:142~146
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은, 내열성 비오틴 결합성 단백질을 연결시킨 고체 담체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 또한, 내열성 비오틴 결합성 단백질을 이용하는, 비오틴과 연결한 물질의 정제, 농축, 검출, 포착 등의 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그 때, 본 발명의 고체 담체의 사용을 제공한다. 또한, 본 발명은, 70℃ 이상의 고온에 폭로하는 것을 수반하는 엣세이계에 이용하는 것이 가능한 비오 틴 결합성 단백질을 연결한 고체 담체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
「타마비딘」은, 담자균 타모기타케 유래의 비오틴 결합성 단백질이고, 타마비딘 1 및 타마비딘 2의 2종류가 있다(WO O2/072817을 참조). 본 발명자들은, 예의연구한 결과, 타마비딘 2는, 비오틴에 대해서, 종래의 아비딘, 스트렙트아비딘과 동일하게, 매우 높은 친화성을 가지고 있는 것을 밝혔다. 즉, 타마비딘 2와 비오틴은, 많은 항원항체반응의 약 1000배의 강도의 친화성을 가지고 있는 것을 밝혔다. 또한, 종래의 아비딘에서 문제로 되고 있는, 비특이결합성(DNA에 대한)이, 대부분 없는 것을 실증했다. 또한, 타마비딘 2는, 스트렙트아비딘보다도 10℃ 이상 내열성이 강한 것을 발견하고, 이 성질은 타마비딘 2를 고체 담체에 결합시킨 후에도, 유지되는 것을 발견했다. 또한 본 발명자들은, 예의연구한 결과, 타마비딘 1은 비오틴에 강하게 결합하고, 또한 스트렙트아비딘보다도 5℃ 내열성이 강한 것을 발견하였다. 이들의 연구의 결과, 본 발명자들은 고온 조건에 있어서도 비오틴 결합활성을 유지하는, 내열성 비오틴 결합성 단백질을 연결시킨 고체 담체를 제공하는 것이 가능한 것을 발견하여, 본 발명에 상도했다. 따라서, 본 발명은, 내열성 비오틴 결합성 단백질을 연결시킨 고체 담체, 및 그 사용, 및, 내열성 비오틴 결합성 단백질을 이용하는, 비오틴과 연결한 물질의 정제, 농축, 검출, 및 포착 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
내열성 비오틴 결합성 단백질을 연결시킨 고체 담체
본 발명은, 내열성 비오틴 결합성 단백질을 연결시킨 고체 담체를 제공한다.
본 명세서에 있어서, 내열성 비오틴 결합성 단백질은, 타마비딘 1, 타마비딘 2, 또는 그들의 변이체를 의미한다. 구체적으로는, 본 발명의 고체 담체에 연결시키는 내열성 비오틴 결합성 단백질은, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질, 또는, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해서 코드되는 단백질이어도 좋다. 혹은, 본 발명의 고체 담체에 연결시키는 내열성 비오틴 결합성 단백질은, 서열번호 2 혹은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질, 또는, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해서 코드되는 단백질의 변이체로서, 타마비딘 1 또는 2와 동일한 비오틴 결합활성 및 내열성을 가지는 단백질이어도 좋다. 본 명세서에 있어서, 타마비딘 1, 타마비딘 2, 및 이들 변이체를 총칭하고, 단지 타마비딘이라 부르는 것이 있다.
타마비딘 1 또는 2의 변이체는, 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, 타마비딘 1 또는 2와 동일한 비오틴 결합활성 및 내열성을 가지는 단백질이어도 좋다. 치환은, 보존적 치환이어도 좋고, 이것은, 특정의 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특징을 가지는 잔기로 치환하는 것이다. 보존적 치환의 비한정적인 예로는, Ile, Val, Leu 또는 Ala 상호의 치환과 같은 지방족기 함유 아미노산 잔기 간의 치환, Lys 및 Arg, Glu 및 Asp, Gln 및 Asn 상호의 치환과 같은 극성 잔기 간의 치환 등이 포함된다.
아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가에 의한 변이체는, 야생형 단백질을 코드하는 DNA에, 예를 들면 주지 기술인 부위특이적 변이유발(예를 들면, Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487~6500, 1982참조, 인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)을 실시하는 것에 의해 작성할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 「1 또는 복수의 아미노산」이란, 부위특이적 변이유발법에 의해 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가할 수 있는 정도의 아미노산을 의미한다. 또한, 본 명세서에 있어서 「1 또는 복수의 아미노산」이란, 경우에 따라, 1 또는 수 개의 아미노산을 의미해도 좋다.
부위특이적 변이유발법은, 예를 들면, 소망하는 변이인 특정의 불일치 외는, 변이를 받아야 할 1가닥 사슬 파지 DNA에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 다음과 같이 실시할 수 있다. 즉, 프라이머로서 상기 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 파지에 상보적인 사슬을 합성시키고, 얻어진 이중사슬 DNA로 숙주 세포를 형질전환한다. 형질전환된 세균의 배양물을 한천에 플레이팅하고, 파지를 함유하는 단일 세포로부터 플라크를 형성시킨다. 그렇게 하면, 이론적으로는 50%의 새로운 콜로니가 1가닥 사슬로서 변이를 가지는 파지를 함유하고, 나머지의 50%가 원래의 서열을 가진다. 상기 소망하는 변이를 가지는 DNA와 완전하게 일치하는 것과는 하이브리다이즈하지만, 원래의 사슬을 가지는 것과는 하이브리다이즈하지 않는 온도에 있어서, 얻어진 플라크를 키나아제 처리에 의해 표지한 합성 프로브와 하이브리다이즈시킨다. 다음에 상기 프로브와 하이브리다이즈하는 플라크를 선택하고 배양하여 DNA를 회수한다.
또한, 생물활성 펩티드의 아미노산 서열에 그 활성을 유지하면서 1 또는 복수의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 실시하는 방법으로서는, 상기의 부위특이적 변이유발 외에도, 유전자를 변이원으로 처리하는 방법, 및 유전자를 선택적으로 개열하고, 다음에 선택된 뉴클레오티드를 제거, 치환, 삽입 또는 부가하고, 계속하여 연결하는 방법도 있다.
타마비딘 1 또는 2의 변이체는, 또한 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.3% 이상의 아미노산 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, 타마비딘 1 또는 2와 같은 비오틴 결합활성 및 내열성을 가지는 단백질이어도 좋다.
2개의 아미노산 서열의 동일성%는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정해도 좋다. 혹은, 2개의 단백질 서열의 동일성 퍼센트는, Needleman, S. B. 및 Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol., 48:443-453, 1970)의 알고리즘에 근거하고, 그리고 위스콘신 대학 유전학 컴퓨터 그룹(UWGCG)으로부터 입수 가능한 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교하는 것에 의해, 결정해도 좋다. GAP 프로그램의 바람직한 디폴트 파라미터에는: (1) Henikoff S. 및 Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915~10919, 1992)에 기재되는 바와 같은, 스코어링·매트릭스, blosum62; (2) 12개의 갭 가중; (3) 4의 갭 긴 가중; 및 (4) 말단 갭에 대한 패널티 없음이 포함된다.
당업자에 이용되는, 서열 비교 외의 프로그램도 또한, 이용해도 좋다. 동일성의 퍼센트는, 예를 들면 Altschul 등(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)에 기재되어 있는 BLAST 프로그램을 이용하여 서열 정보와 비교하여 결정하는 것이 가능하다. 해당 프로그램은, 인터넷 상에서 National Center for Biotechnology Information(NCBI), 혹은 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹 사이트로부터 이용하는 것이 가능하다. BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색의 각종 조건(파라미터)은 동일한 사이트에 자세하게 기재되어 있고, 일부의 설정을 적당히 변경하는 것이 가능하지만, 검색은 통상 디폴트값을 이용하여 실시한다. 또는, 2개의 아미노산 서열의 동일성%는, 유전정보처리 소프트웨어 GENETYX Ver. 7(제네틱스제) 등의 프로그램, 또는, FASTA 알고리즘 등을 이용하여 결정해도 좋다. 그 때, 검색은 디폴트값을 이용해도 좋다.
2개의 핵산 서열의 동일성%는, 시각적 검사와 수학적 계산에 의해 결정가능하거나, 또는 보다 바람직하게는, 이 비교는 컴퓨터·프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교하는 것에 의해서 이루어진다. 대표적인, 바람직한 컴퓨터·프로그램은, 유전학 컴퓨터·그룹(GCG; 위스콘신주 메디슨)의 위스콘신·패키지, 버젼 10.0 프로그램「GAP」이다(Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12:387). 이 「GAP」프로그램의 사용에 의해, 2개의 핵산 서열의 비교 외에, 2개의 아미노산 서열의 비교, 핵산 서열과 아미노산 서열과의 비교를 실시할 수 있다. 여기서, 「GAP」프로그램의 바람직한 디폴트 파라미터에는: (1) 뉴클레오티드에 관한(동일물에 대하여 1, 및 비동일물에 관하여 0의 값을 포함한다) 일원(unary) 비교 매트릭스의 GCG 실행과, Schwartz 및 Dayhoff 감수 「폴리펩티드의 서열 및 구조의 아틀라스(Atlas of Polypeptide Sequence and Structure)」국립 바이오 의학연구 재단, 353~358페이지, 1979에 의해 기재되는 것과 같은, Gribskov 및 Burgess, Nucl. Acids Res., 14:6745, 1986의 가중 아미노산 비교 매트릭스; 또는 다른 비교 가능한 비교 매트릭스; (2) 아미노산의 각 갭에 있어서 30의 패널티와 각 갭 중의 각 기호에 관하여 추가의 1의 패널티; 또는 뉴클레오티드 서열의 각 갭에 관하여 50의 패널티와 각 갭 중의 각 기호에 관하여 추가의 3의 패널티; (3) 엔도 갭에의 노패널티: 및 (4) 긴 갭에는 최대 패널티 없음이 포함된다. 당업자에 의해 사용되는 다른 서열 비교 프로그램에서는, 예를 들면, 미국 국립 의학 라이브러리의 웹 사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html에 의해 사용이 이용가능한 BLASTN 프로그램, 버젼 2.2.7, 또는 UW-BLAST 2.0 알고리즘이 사용 가능하다. UW-BLAST 2.0에 관한 표준적인 디폴트 파라미터의 설정은, 이하의 인터넷 사이트: http://blast.wustl.edu에 기재되어 있다. 또한 BLAST 알고리즘은, BLOSUM62 아미노산스코어가 붙은 매트릭스을 사용하고, 사용가능한 선택 파라미터는 이하와 같다: (A) 낮은 조성 복잡성을 가지는 쿠에리-서열의 세그먼트(Wootton 및 Federhen의 SEG 프로그램(Computers and Chemistry, 1993)에 의해 결정된다; Wootton 및 Federhen, 1996 「서열 데이터베이스에 있어서의 조성 편중 영역의 해석(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol., 266:544-71도 참조 바람), 또는, 단주기성의 내부 리피트로 이루어지는 세그먼트(Claverie 및 States(Computers and Chemistry, 1993)의 XNU 프로그램에 의해 결정된다)를 마스크하기 위한 필터를 포함하는 것, 및 (B) 데이터베이스 서열에 대한 적합을 보고하기 위한 통계학적 유의성의 역치, 또는 E-스코어(Karlin 및 Altschul, 1990)의 통계학적 모델에 따라서, 단순히 우연에 의해 발견되는 적합한 기대 확률; 어떤 적합에 기인하는 통계학적 유의차가 E-스코어 역치 보다 큰 경우, 이 적합은 보고되지 않는다); 바람직한 E-스코어 역치의 수치는 0.5이거나, 또는 바람직함이 증가하는 순서로, 0.25, 0.1, 0.05, 0.01, 0.001, 0.0001, 1e-5, 1e-10, 1e-15, 1e-20, 1e-25, 1e-30, 1e-40, 1e-50, 1e-75, 또는 1e-100이다.
타마비딘 1 또는 2의 변이체는 또한, 서열번호 1 또는 3의 염기 서열의 상보사슬에 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 염기서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해서 코드되는 단백질로서, 타마비딘 1 또는 2와 동일한 비오틴 결합활성 및 내열성을 가지는 단백질이어도 좋다.
여기서, 「스트린젠트한 조건 하」란, 중간 정도 또는 높은 정도로 스트린젠트한 조건에 있어서 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. 구체적으로는, 중간 정도로 스트린젠트한 조건은, 예를 들면, DNA의 길이에 근거하여, 일반의 기술을 가지는 당업자에 의해서, 용이하게 결정하는 것이 가능하다. 기본적인 조건은, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제3판, 제6~7장, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 표시되고, 그리고 니트로셀룰로오스 필터에 관해, 5×SSC, 0.5% SDS, 1.OmM EDTA(pH8.0)의 전(前) 세정용액, 약 40~50℃에서의, 약 50% 포름아미드, 2×SSC-6×SSC(또는 약 42℃에서의 약 50% 포름아미드 중의, 스탁 용액(Stark's solution) 등 외의 동일한 하이브리다이제이션 용액)의 하이브리다이제이션 조건, 및 예를 들면, 약 40℃~60℃, 0.5~6×SSC, 0.1% SDS의 세정조건의 사용이 포함된다. 바람직하게는 중간 정도로 스트린젠트한 조건은, 약 50℃, 6×SSC의 하이브리다이제이션 조건(및 세정조건)을 포함한다. 고스트린젠트한 조건도 또한, 예를 들면 DNA의 길이에 근거하여, 당업자에 의해서, 용이하게 결정하는 것이 가능하다.
일반적으로, 이러한 조건은, 중간 정도로 스트린젠트한 조건보다 높은 온도 및/또는 낮은 염농도에서의 하이브리다이제이션(예를 들면, 약 65℃, 6×SSC 내지 0.2×SSC, 바람직하게는 6×SSC, 보다 바람직하게는 2×SSC, 가장 바람직하게는 0.2×SSC의 하이브리다이제이션) 및/또는 세정을 포함하고, 예를 들면 상기와 같은 하이브리다이제이션 조건, 및 대략 65℃~68℃, 0.2×SSC, 0.1% SDS의 세정을 수반한다고 정의된다. 하이브리다이제이션 및 세정의 완충액에서는, SSC(1×SSC는, 0.15M NaCl 및 15mM 구연산나트륨이다)에 SSPE(1×SSPE는, 0.15M NaCl, 10mM NaH2PO4, 및 1.25mM EDTA, pH7.4이다)를 대용하는 하는 것이 가능하고, 세정은 하이브리다이제이션이 완료한 다음에 15분간 실시한다.
또한, 프로브에 방사성 물질을 사용하지 않는 시판의 하이브리다이제이션 키트를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, ECL direct labeling & detection system(Amersham사 제)를 사용한 하이브리다이제이션 등을 들 수 있다. 스트리젠트한 하이브리다이제이션으로서는, 예를 들면, 키트 중의 hybridization buffer에 Blocking 시약을 5%(w/v), NaCl를 0.5M이 되도록 가하고, 42℃에서 4시간 실시하며, 세정은, 0.4% SDS, 0.5xSSC 중에서, 55℃에서 20분을 2회, 2xSSC 중에서 실온, 5분을 1회 실시한다는 조건을 들 수 있다.
타마비딘 1 또는 2의 변이체의 비오틴 결합활성 및 내열성은, 공지의 수법 중 어느 하나에 따라 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면, Kada 등(Biochim. Biophys. Acta., 1427:44~48(1999))에 기재된 것과 같이 형광 비오틴을 이용하는 방법에 따라 측정해도 좋다. 이 방법은, 비오틴 결합 단백질의 비오틴 결합 사이트에 형광 비오틴이 결합하면, 형광 비오틴의 형광 강도가 소실하는 성질을 이용한 엣세이계이다. 혹은, 표면 플라즈몬 공명을 원리로 한 바이오센서 등, 단백질과 비오틴의 결합을 측정하는 것이 가능한 센서를 이용하여, 변이체 단백질의 비오틴 결합활성을 평가할 수도 있다. 내열성은, 상기의 비오틴 결합활성을 평가할 때에, 측정 온도를 변화시켜 측정하는 것으로 평가할 수 있다.
본 발명의 고체 담체에 연결시키는 내열성 비오틴 결합성 단백질은, 비오틴에 대해서 높은 친화성을 가지고 있고, 그 해리 정수 Kd는 10-8M의 오더 이하, 바람직하게는 10-9M의 오더 이하, 10-10M의 오더 이하, 10-11M의 오더 이하, 10-12M의 오더 이하, 10-13M의 오더 이하이다. 전형적으로는, 그 해리 정수 Kd는 10-13~10-9M의 오더이어도 좋다.
본 발명의 고체 담체에 연결시키는 내열성 비오틴 결합성 단백질은, 공지의 난백 유래의 아비딘이나 스트렙트아비딘과 비교하여 높은 내열성을 가진다. 여기서, 내열성이란, 고온 영역에서의 단백질 안정성 및 고온 영역에 있어서의 비오틴 결합활성의 쌍방을 말한다.
고온 영역에서의 단백질 안정성은, SDS-PAGE 분석에 있어서 단백질 밴드의 발색이 실온의 경우와 비교하여 50% 소실하는 온도로서 평가할 수 있다. 본 발명의 고체 담체에 연결시키는 내열성 비오틴 결합성 단백질에 관해서, SDS-PAGE 분석에서 단백질 밴드의 발색이 실온의 경우와 비교하여 50% 소실하는 온도는, 71℃ 보다 높고, 바람직하게는 75℃ 이상, 77.5℃ 이상, 80℃ 이상, 82.5℃ 이상, 85℃ 이상, 87℃ 이상이어도 좋다.
고온 영역에 있어서의 비오틴 결합활성은, 비오틴의 결합이 실온의 경우와 비교하여 50% 감소하는 온도로서 평가할 수 있다. 본 발명의 고체 담체에 연결시키는 내열성 단백질에 대해서, 비오틴의 결합이 실온의 경우와 비교하여 50% 감소하는 온도는, 73℃보다 높고, 바람직하게는 75℃ 이상, 78℃ 이상, 80℃ 이상, 82.5℃ 이상, 85℃ 이상이어도 좋다.
본 발명의 고체 담체에 연결시키는 내열성 비오틴 결합성 단백질은, 담자균 유래의 단백질을 정제하는 것에 의해, 또는 재조합 단백질로서 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 내열성 비오틴 결합성 단백질을 연결시키는 고체 담체는, 고체 또는 불용성 재료(예를 들면, 여과, 침전, 자성 분리 등에 의해 반응 혼합물로부터 분리할 수 있는 재료)인 담체이면 특별히 한정되지 않는다.
고체 담체를 구성하는 재료는, 셀룰로오스, 테프론TM, 니트로셀룰로오스, 아가로오스, 덱스트란, 키토산, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리디비닐리덴디플루오라이드, 라텍스, 실리카, 유리, 유리섬유, 금, 백금, 은, 구리, 철, 스테인레스스틸, 페라이트, 실리콘 웨이퍼, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌이민, 폴리유산, 수지, 다당류, 단백(알부민 등), 탄소 또는 그들의 조합 등을 포함하지만 이들에 한정되지는 않는다.
고체 담체의 형상은, 비즈, 자성 비즈, 박막, 미세관, 필터, 플레이트, 마이크로플레이트, 카본나노 튜브, 센서 칩 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 박막이나 플레이트 등의 평탄한 고체 담체는, 해당 기술분야에서 알려져 있는 바와 같이 피트, 홈, 필터 저부 등을 설치해도 좋다.
본 발명의 한 태양에 있어서, 자성 비즈는, 약 25nm~약 1mm의 범위의 구체 직경을 가질 수 있다. 바람직한 태양에서는, 자성 비즈는 약 50nm~약 10㎛의 범위의 직경을 가진다. 자성 비즈의 사이즈는 특정의 적용에 따라 선택될 수 있다. 약간의 세균 스포어는 약 1㎛의 오더의 사이즈를 가지므로, 이러한 스포어를 포착하기 위한 바람직한 비즈는 1㎛보다도 큰 직경을 가진다.
본 발명의 한 태양에 있어서, 세파로오스 등의 고가교 구형 아가로오스로 이루어지는 비즈는, 약 24㎛~약 165㎛의 범위의 직경을 가질 수 있다. 바람직한 태양에서는, 고가교 구형 아가로오스 비즈는 약 24㎛~약 44㎛의 범위의 직경을 가진다. 고가교 구형 아가로오스 비즈의 사이즈는 특정의 적용에 따라 선택될 수 있다.
소수성 표면을 가지는 고체 담체의 예로는, Polysciences, Warrington, PA 또는 Spherotech, Liberville, IL로부터 시판되고 있는 것 등의 폴리스티렌 라텍스 비즈를 들 수 있다.
실리카(SiO2)-처리 또는 실리카(SiO2) 베이스의 고체 담체의 예로는, Polysciences, Warrington, PA로부터 입수가능한, 초상자성 실리카 비즈 등을 들 수 있고, 이것은, 핵산(예를 들면 DNA)을 포착하기 위해서 사용될 수 있다. 혹은, Dynal Biotech로부터 시판되고 있는 M-280 등도 사용될 수 있다.
친수성 표면을 가지는 자성 비즈는, 증식기의 세균 세포, 핵산 및 다른 성분을 포착하기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 자성 비즈의 예로서는, Biomag(등록상표) 카르복실의 명칭으로 Polysciences, Warrington, PA로부터 시판되고 있는 비즈 또는 Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN의 명칭 MCO2N/2928을 가지는 비즈를 들 수 있다. 혹은, Dynal Biotech로부터 시판되고 있는 M-270등이 사용될 수 있다.
내열성 비오틴 결합성 단백질과 고체 담체의 연결은, 당업자에게 공지인 단백질과 고체 담체의 커플링법을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 고체 담체 표면을 카르복실기가 노출하도록 수식하고, 해당 카르복실기와 단백질의 아미노기를, 가교 시약인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)의 존재하에서 커플링반응시키는 것에 의해, 단백질과 고체 담체를 연결할 수 있다. 또는, 예를 들면, 고체 담체 표면의 카르복실기가 N-히드록시숙신이미드(NHS)에 의해 활성 에스테르화된 고체 담체와 단백질을 일급 아미노기를 포함하지 않는 pH6.5~9의 완충액 중에서 혼화하는 것에 의해, 고체 담체 표면의 카르복실기와 단백질의 아미노기를 결합할 수 있다.
혹은, 가교 시약 BS3(비스[설포숙신이미딜]수버레이트)나 DSS(디숙신이미딜수버레이트)를 사용하여, 고체 담체 표면의 아미노기와 단백질의 아미노기를, 혹은 가교 시약 SPDP(N-숙신이미딜 3-[2-피리딜디티오]프로피오네이트)나 GMBS(N-(4-말레이미드부티릴옥시)숙신이미드)를 사용하여, 고체 담체 표면의 아미노기와 단백질의 티올기를 결합시킬 수 있다.
본 발명의 고체 담체에 연결되는 내열성 비오틴 결합성 단백질은, 고온 영역에서의 단백질 안정성 및 비오틴 결합성을 유지한다. 이 때문에, 본 발명의 고체 담체는, 종래 가장 사용되고 있던 스트렙트아비딘보다도 높은 온도에서, 비오틴 결합능을 유지한 채로 처리할 수 있다. 본 발명의 고체 담체는, 70℃ 내지 90℃, 바람직하게는 75℃ 내지 90℃, 80℃ 내지 90℃, 85℃ 내지 90℃, 70℃ 내지 85℃, 70℃ 내지 80℃, 75℃ 내지 80℃, 75℃ 내지 85℃, 75℃ 내지 87.5℃의 가열 조건 하에 폭로하는 처리를 받은 경우에도, 비오틴 결합능을 유지한 채로 사용 할 수 있다. 이것은, 예를 들면, 보다 높은 온도에서의 핵산하이브리드형성이나 그 후의 세정을 실시할 수 있는, 즉, 보다 높은 스트린젠시에서의 하이브리다이제이션이 가능해지는 것을 의미한다. 본 발명의 고체 담체의 사용에 의해, 비특이적인 하이브리드 형성을 극력 억제하는 것이 가능한 엣세이계를 구축하는 것이 가능하다. 혹은, 예를 들면, 고체 담체에 타마비딘을 연결시킬 때에, 고온의 처리가 필수 방법을 선택하는 것도 가능하게 된다. 또한, 타마비딘에 내열성 단백질, 효소, 또는 형광색소 등을 결합시킬 때, 혹은 결합 후 비오틴 수식물과 반응시킬 때에, 고온을 이용하여, 보다 특이적인 반응을 시키는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 고체 담체에 연결하는 내열성 비오틴 결합성 단백질은, DNA에 대한 비특이 결합이 거의 없기 때문에, 해당 기술분야에 공지의 난백 유래의 아비딘에 있어서 문제로 되고 있는 DNA에 대한 비특이 결합성의 문제를 회피할 수도 있다.
내열성 비오틴 결합성 단백질을 이용한, 비오틴과 연결한 물질의 분리, 농축, 정제, 검출 및/또는 포착 방법
본 발명은, 비오틴과 연결한 물질의 분리, 농축, 포착, 정제, 및/또는 검출 방법으로서, 이하의 공정:
1) 본 발명의 타마비딘을 연결한 고체 담체와, 비오틴과 연결한 물질을 접촉시키고, 해당 고체 담체에 비오틴과 연결한 물질을 결합시키고;
2) 해당 고체 담체에 결합하지 않았던 협잡물(來雜物)을 세정하고; 그리고
3) 해당 고체 담체에 결합한 비오틴과 연결한 물질을 회수하는 것에 의해 해당 물질을 분리, 농축, 포착 혹은 정제하고, 및/또는, 해당 물질을 검출한다;
를 포함해서 이루어지는, 상기 방법을 제공한다. 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 방법에 있어서의 상술한 공정의 적어도 하나는 70℃ 내지 90℃의 가열 조건 하에서 실시한다. 보다 바람직하게는, 75℃ 내지 90℃, 80℃ 내지 90℃, 85℃ 내지 90℃, 70℃ 내지 85℃, 70℃ 내지 80℃, 75℃ 내지 80℃, 75℃ 내지 85℃, 75℃ 내지 87.5℃의 가열 조건 하에서 실시하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 비오틴과 연결한 물질이란, 비오틴과 직접적 또는 간접적으로 연결한 물질의 쌍방을 말한다. 비오틴과 물질의 직접적인 연결은, 공유결합에 의한 연결에 의해서 달성된다. 비오틴과 물질의 간접적인 연결은, 비오틴과 공유결합에 의해 연결한 리간드에 대해서, 한층 더 물질이 공유결합, 이온결합, 수소결합, 또는 소수성 상호작용에 의해 연결하는 것에 의해서 달성된다. 간접적인 연결의 구체적인 예로서는, 비오틴화 항체를 사용하는 경우의 항원항체반응에 의한 항원 분자의 연결이나, 비오틴화 핵산 프로브를 이용하는 경우의 핵산의 하이브리다이제이션에 의한 상보적인 핵산의 연결 등을 들 수 있다.
바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 방법에 있어서의 적어도 하나의 공정은 70℃ 내지 90℃의 가열 조건 하에서 행해지므로, 비오틴과 물질의 간접적인 연결은, 본 발명의 방법에 있어서 사용하는 온도조건 하에 있어서 연결이 유지되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 비오틴과 물질의 간접적인 연결로서 핵산의 하이브리다이제이션을 이용하는 경우는, 하이브리다이즈하는 뉴클레오티드의 길이는, 적어도 20뉴클레오티드 이상, 바람직하게는, 적어도 25뉴클레오티드 이상, 30뉴클레오티드 이상, 35뉴클레오티드 이상, 40뉴클레오티드 이상, 50뉴클레오티드 이상, 100뉴클레오티드 이상이어도 좋다.
본 발명의 방법에서 사용하는 타마비딘을 연결된 고체 담체를 구성하는 재질 및 그 형상은, 분리, 농축, 정제, 검출 및/또는 포착하고 싶은 물질의 특성에 따라 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법의 각 공정에 사용하는, 완충액의 조성, 적용하는 온도 등은, 분리하고 싶은 물질의 성질 등을 고려하여, 당업자가 적당히 설정할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 분리, 농축, 포착, 및/또는 정제한 물질의 검출 방법은, 해당 물질의 성질에 따라, 당업자가 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 방법은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 핵산의 검출(일본특허공개공보 제2003-125800호), 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 장치 및 방법(보트린 등, WO2004/005553), 핵산 증폭법: 하이브리다이제이션 시그널 증폭법(HSAM)(장 등, WO1998/004745), 혹은 바이러스나 바이러스 게놈의 농축 등(타마쯔쿠리, 2004, BIO INDUSTRY, 21(8): 39~47)에 모방한 방법이어도 좋다. 혹은, 세포나 미생물의 검출·포착·농축에 이용할 수도 있다.
예를 들면, 체액 중의 바이러스를 농축하는 경우, 우선, 검체를 적당한 완충액 중에서, 바이러스 표층 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 비오틴화한 것과 인큐베이트 한다. 항체의 비오틴화는 예를 들면 Pierce 등으로부터 시판되고 있는 키트를 이용하여 실시할 수 있다. 다음에, 본 발명의 타마비딘을 연결한 고체 담체, 예를 들면 자성 비즈를 가하여, 혼합한다. 최후에 자석을 이용하여, 바이러스-항체-비오틴-타마비딘-자성 비즈의 복합체를 응집시켜, 상청을 제거하고, 적당한 완충액으로 수회의 세정을 실시한 후, 자석을 떼어, 소망하는 완충액에 현탁하여, 바이러스의 농축을 완료한다.
혹은, 체액 중의 바이러스 게놈 DNA를 농축하는 경우, 우선 검체를, 바이러스 입자를 파괴하는 적당한 용액 중에 넣고, 바이러스로부터 게놈 DNA를 추출하게 한다. 더 필요하면, 이 게놈을 1가닥 사슬화하는 스텝을 도입한다. 계속하여, 바이러스 게놈의 일부분에 상보적인 수십 내지 수백 염기의 1가닥 사슬 올리고DNA를 비오틴화한 것, 혹은 바이러스 게놈의 일부분에 상보적인 사슬을 가지는 수십 내지 수백 염기의 2가닥 사슬 DNA를 비오틴화하여 열변성시킨 것과 인큐베이트하고, 비오틴화 올리고 DNA와 바이러스 게놈을 하이브리다이제이션시킨다. 본 발명의 타마비딘을 연결한 고체 담체를 이용하는 경우, 종래의 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 연결한 고체 담체를 이용하는 경우보다 높은 온도, 예를 들면, 70℃ 내지 90℃, 바람직하게는 75℃ 내지 90℃, 80℃ 내지 90℃, 85℃ 내지 90℃, 70℃ 내지 85℃, 70℃ 내지 80℃, 또는 75℃ 내지 80℃, 75℃ 내지 85℃, 75℃ 내지 87.5℃의 온도범위가 적용 가능하다. 하이브리다이제이션 온도로 상기와 같은 높은 온도를 적용하는 것에 의해, 비특이적인 DNA의 결합이 억제되어, 소망하는 바이러스 게놈 이외의 DNA가 극력 혼입하지 않는, 보다 특이성이 높은 바이러스 게놈의 농축이 가능하게 된다. 다음에, 본 발명의 타마비딘을 연결한 고체 담체, 예를 들면 자성 비즈를 고온 상태의 샘플(비오틴화 올리고 DNA가 특이적으로 바이러스 게놈을 포착하고 있는 상태)에 가하여, 혼합한다. 최후에 자석을 이용하여, 바이러스 게놈-올리고 DNA-비오틴-타마비딘-자성 비즈의 복합체를 응집시켜, 상청을 제거하고, 적당한 완충액으로 수회의 세정을 실시한 후, 자석을 떼어, 소망하는 완충액에 현탁하고, 바이러스 게놈의 농축을 완료한다. 그 후, 바이러스 게놈의 검출은, 예를 들면 PCR(Saiki et al. (1985) Science 230: 1350~1354) 등을 이용하여 실시할 수 있다. 타마비딘은, 종래의 아비딘, 스트렙트아비딘보다도, 비오틴 비존재하에 있어서의 내열성이 높고, 또한 DNA에 대한 비특이적인 결합이 거의 없다. 따라서, 예를 들면 상기와 같은 방법에 의한 DNA의 특이적인 농축에 적합하다.
발명의 효과
본 발명의 고체 담체에 연결되는 타마비딘은, 고온 영역에서의 단백질 안정성 및 비오틴 결합성을 유지한다. 이 때문에, 본 발명의 고체 담체는, 종래 가장 사용되고 있던 스트렙트아비딘보다도 높은 온도에서, 비오틴 결합능을 유지한 채로 처리할 수 있다. 본 발명의 고체 담체를 사용하는 것에 의해, 고온 영역에서의 처리를 포함하는 엣세이계를 구축하는 것이 가능하게 된다.
[도 1] 도 1은, 타마비딘 2, 스트렙트아비딘 및 아비딘의 DNA에 대한 비특이 결합시험의 결과를 나타내는 사진(A) 및 그래프(B)이다.
[도 2] 도 2는, 타마비딘 2의 내열성(단백질 안정성)을 스트렙트아비딘과 비교하여 평가한 결과를 나타낸다. 도 2A는, SDS-PAGE의 결과를 나타내고, 도 2B는 그 단백질 밴드의 정량 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 3] 도 3은, 타마비딘 2(A), 스트렙트아비딘(B) 및 아비딘(C)의 내열성(형광 비오틴 결합활성)을 나타내는 그래프이다.
[도 4] 도 4는, 타마비딘 2 자성 비즈(A), 시판의 스트렙트아비딘 자성 비즈(B), 스트렙트아비딘 자성 비즈(C), 및 아비딘 자성 비즈(D)의 내열성(형광 비오틴 결합활성)을 나타내는 그래프이다.
[도 5] 도 5는, 타마비딘 2 자성 비즈(A 및 C), 시판의 스트렙트아비딘 자성 비즈(B 및 D)의 내열성(형광 비오틴 결합활성)을 나타내는 그래프이다.
[도 6] 도 6은, 타마비딘 2 세파로오스 비즈의 내열성(형광 비오틴 결합활성)을 나타내는 그래프이다.
[도 7] 도 7은, 타마비딘 1의 형광 비오틴 결합활성을 나타내는 그래프이다.
실시예 1: 타마비딘 2( TM2 )
1-1. 타마비딘 2의 특징지음
타마비딘 2의 대장균 발현과 정제
타마비딘 2(TM2)를 코드하는 DNA(서열번호 3)를 발현 벡터-pTrc99A에 조입하여 대장균으로 발현시키면, 발현한 TM2의 대부분이 가용성 분획으로 축적하고, 발현량도 많다(WO O2/072817). TM2 단백질을, 재조합 대장균으로부터, Hofmann 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4666-4668, 1980) 방법에 따라 이미노비오틴 아가로오스(Sigma)를 충전한 컬럼을 이용하여 정제했다. 구체적으로는, WO O2/072817에 기재되어 있는 대장균에 대해서, 1mM IPTG, 37℃에서 5시간 발현 유도를 걸은 후 집균하여, 펠릿을 50mM Caps pH11.0, 50mM NaCl에 현탁하고, 초음파에 의해서 균체를 파괴했다. 원심 후의 상청을, 50mM Caps pH11.0, 50mM NaCl로 평형화한 자작의 이미노비오틴 컬럼(높이 3cm, 체적 0.5ml)에 적용했다. 5ml의 50mM Caps pH11.0, 500mM NaCl로 세정 후, 1.5~2ml의 50mM NH4OAc pH4.0으로 용출했다. 정제 단백질의 수득량은 50ml의 배양액으로부터 약 1mg였다.
질량분석
타마비딘 2를, 10mg/ml의 농도에서, 0.1% TFA, 50% MeCN 포화용액에 용해하고, 이 샘플 용액을 ZipTip C4(Millipore)에서 정제를 실시하고, MALDI 플레이트에 직접 적용했다. 풍건 후, 매트릭스 용액(시나핀산)을 중층했다. 또한, 풍건 후, 레이저 이온화 비행시간형 질량분석 장치(MALDI-TOFMS) AXIMA-CFR(시마즈 제작소)에 탑재하고, 질량분석을 실시했다(인출전압: 20kV, 비행모드: Linear, 검출 이온: Positive). 그 결과, m/z=15146.3(단량체에 상당), 30335.0(이량체에 상당), 60932.0(4량체에 상당)이 관측되었다. 또한, 비오틴 결합형의 타마비딘 2의 경우, 4량체에 상당하는 피크가 커졌다. 이 결과로부터, 타마비딘 2는 4량체로, 질량 60932로 판단했다. 단백질의 N말단 서열을 분석한 바, 번역 개시 메티오닌의 다음의 세린이 N 말단인 것이 판명되었다. 유전정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver. 7(제네틱스사 제)을 이용하고, 타마비딘 2의 개시 메티오닌을 제외하는, 140아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드의 등전점을 계산하면, 7.36이었다.
분자흡광계수
타마비딘 2의 분자흡광계수는 이론값으로서, A280=41750M-1cm-1subunit-1(0.25mg/mL로 0.68)이다. 실제로 타마비딘 2를 정제하고, 아세트산암모늄에 투석한 샘플을, 동결건조시켜(아세트산암모늄은 완전 승화), 칭량한 바 3mg였다. 이 샘플을 20mM KPi(pH6.5)에 용해하고, 농도를 0.25mg/mL에 조제하여, A280을 측정한 바, 0.67의 실측치를 얻었다. 이는 이론치의 98%에 상당했다. 이것에 의해, A280을 측정하는 것으로 타마비딘 농도를 간편하게 측정하는 것이 가능해졌다.
형광 비오틴에 의한 활성측정
형광 비오틴에 의한 타마비딘 2의 비오틴 결합활성의 측정을, Kada 등(Biochim. Biophys. Acta., 1427:44~48, (1999)) 방법에 따라서 실시하였다. 200μL 엣세이 버퍼(50mM NaH2PO4, 100mM NaCl, 1mM EDTA(pH7.5)) 중에, 정제한 TM2가 Opmol로부터 486pmol까지 단계적으로 포함되도록 조정을 했다. 이 용액에 20pmol/μL 형광 비오틴 용액(biotin-4-fluorescein: Molecular Probe) 50μL(1nmol)를 혼화하고, 실온에서 10분간 방치 후, Las-3000(FUJIFILM)을 이용하여 형광 강도를 측정했다. 그 결과, 1nmol의 형광 비오틴에 0.274nmol의 TM2가 결합했다. 즉, 1mol의 타마비딘에 3.6mol의 형광 비오틴이 결합했다. 이것으로부터, 타마비딘 1분자에 형광 비오틴 4분자(서브유니트 당 1분자) 결합하는 것이 나타내졌다. 마찬가지로 스트렙트아비딘은, 1mol에 대해서 3.4mol의 형광 비오틴에 결합했다.
1-2. 타마비딘 2( TM2 )의 비특이 결합성
토끼항 TM2 항체의 정제
대장균으로 발현시킨 타마비딘 2(TM2) 단백질을 이미노비오틴 컬럼으로 정제한 것, 및, 이를 더욱 겔 정제한 것을 항원에 이용하여, 2종류의 항체를 작성했다. 알칼리포스파타제 표지 항 IgG 항체를 이용한 웨스턴법에 의한 검출감도는, 정제 재조합 타마비딘 2 표품에 대해서, 대략 0.5ng였다. 이상의 결과로부터 특이성 및 타이머와 함께 높은 항체가 완성되었다고 결론했다. 한편 항타마비딘 2 항체-타마비딘1의 교차반응은, 낮기는 하지만 검출되었다(본래의 항원에 대해서 1/20정도).
항TM2 항체(이미노비오틴 컬럼 정제만을 실시한 항원으로부터 작성한 항체)는, 더욱 이하와 같이 하여 정제했다. TM2 40μg를 15% 아크릴아미드겔 2매를 사용하여 SDS-PAGE에 의해서 분리하고, 단백질을 니트로셀룰로오스막(BIO-RAD) 2매에 전사했다. 막을 3% BSA를 포함하는 TBS 완충액으로 실온에서 1시간 진탕시키는 것에 의해 블로킹을 실시했다. 계속하여, 실온에서 하룻밤, 항TM2 항체(이미노비오틴 컬럼 정제만을 실시한 항원으로부터 작성한 항체, 1000배 희석)와 반응시킨 후, TM2가 전사되어 있는 부위를 잘라내고, 용출 완충액(0.2M 글리신, 1mM EDTA pH2.8) 중에서 실온 20분간 진탕시켰다. 용출 완충액의 1/10용량의 1M 트리스 용액으로 중화 후, 동량의 10×TBS 완충액을 가하여 4℃에서 보존했다.
DNA 에 대한 비특이 결합성
타마비딘 2(TM2)의 DNA에 대한 비특이 결합시험
TM2의 DNA에 대한 비특이 결합성을 해석했다. 2×SSC 완충액으로 10μg로부터 0.3μg까지 단계 희석한 연어 정자 DNA를 알칼리 변성시키고, Bio-Dot SF(BIO-RAD)를 이용하여, Hybond N+막(Amersham Biosceinces)에 흡착시켰다. 5×덴하르트액(0.1% BSA, 0.1% 피콜, 0.1% 폴로비닐프롤리돈)으로 막을 블로킹한 후, 25μg/mL의 TM2, 스트렙트아비딘, 및 아비딘 용액에 실온에서 90분간 침지했다. 그 후, 막을 TTBS 완충액(0.05% Tween20을 포함하는 TBS 완충액)에 의해서, 실온에서 5분간 3회 세정했다. 0.5% 스킴밀크, 0.01% Tween20을 포함하는 TBS 완충액으로 1시간, 막을 블로킹 했다. 1차 항체로서 TM2에는 상술한 방법으로 정제한 토끼항 TM2 항체를, 스트렙트아비딘에는 토끼항 스트렙트아비딘 항체(SIGMA)를, 아비딘에는 토끼항 아비딘 항체(Abcam)를, 항체값이 동등하게 되도록 희석하여 이용했다. 1차 항체와의 항원항체반응은, 하룻밤 실온에서 실시했다. 막을 TTBS 완충액에 의해서 실온으로 5분간 3회 세정 후, 2차 항체로서, 알칼리포스파타아제 표지 항토끼 IgG 항체(BIO-RAD)(10000배 희석)를 이용하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. 막을 TTBS 완충액에 의해서 실온에서 5분간 3회 세정 후, Alkaline Phosphatase substrate kit II, vector Black(프나코시)으로 발색시키고, Las-3000(FUJIFILM)으로 정량화했다. 그 결과, 아비딘은 DNA의 농도 의존적으로 염색 강도가 증가한 것에 대하여, TM2, 스트렙트아비딘의 염색 강도는 DNA 농도에 강한 영향을 받지 않았다(도 1A, B). 이 결과로부터, 타마비딘 2의 DNA에 대한 비특이 활성은 거의 없고, 스트렙트아비딘과 동등하다는 것이 나타내졌다. 이는 타마비딘 2의 아비딘에 대한 우위성을 나타내는 것이다.
1-3. 타마비딘 2와 비오틴과의 상호작용 해석
비아코어 바이오센서를 사용한 타마비딘 2( TM2 )와 비오틴과의 상호작용의 카이네틱스 분석
고정제도의 BSA(Sigma) 2mg과 NHS-비오틴(Pierce) 1mg을 1ml의 50mM 붕산나트륨 pH8.0중에서 용해하고, 4℃에서 2시간 인큐베이션했다. NHS-비오틴(EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin)은 미리 소량의 DMSO에 용해하고 나서 가했다. 이것을 투석 튜브(MWCO 6-8,000)에 넣고, 50mM 탄산나트륨 pH6.7에 대하여 4℃에서 하룻밤 투석했 다. 이렇게 하여 작성한 비오틴-BSA 콘쥬게이트(MW 67kDa, 30μM)를 비아코어(등록상표) 바이오센서의 리간드(센서 칩에 첩부하는 물질)로 했다. 한편, 아나라이트(유로계에 흘리는 물질)로서 재조합 타마비딘 2를 조제하고, Biacore(등록상표) 3000(표면 플라즈몬 공명을 원리로 한 바이오센서, Biacore Inc.)에 의한 분자간 상호작용의 분석을 실시했다. 비오틴-BSA, 및 네거티브 콘트롤로 한 BSA는, 아민 커플링법에 따라 CM5 센서 칩에 고정화했다. 고정화량은, 200RU 정도로 되도록 조절했다. BSA를 고정화한 칩은, 유동세포(flow cell) 1과 3에, 비오틴-BSA를 고체화한 칩은, 유동세포 2와 4에 배치했다. 타마비딘 2는, 유동세포 1과 2에, 스트렙트아비딘은, 유동세포 3과 4에, 유속 20μl/min으로 2분간, 러닝버퍼-[10mM HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% Surfactantat20(Biacore Inc.)] 중에 로드했다. 그 후, 60분간, 샘플의 해리를 모니터했다. 또한, 결합한 타마비딘 2, 및 스트렙트아비딘을 해리시키는 것은 불가능했기 때문에, 측정에서는 재생 조작을 실시하지 않고, 저농도측으로부터 7단계의 측정을 실시했다(3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 및 200nM). BSA의 데이터는 레퍼런스로서, BSA-비오틴의 데이터로부터 차감했다. 측정은 25℃에서 실시했다. 얻어진 센서 그램으로부터, 해석 소프트웨어 BIAevaluation ver.4.1을 이용하고, 1:1 결합 모델을 이용하여, 반응속도론적 해석을 실시하고, 결합속도정수(ka)와 해리속도 정수(kd)를 계산했다. 해리 정수(Kd)는, kd/ka로부터 구했다.
또한, 재생 조작을 실시하지 않은 경우, 각 농도의 측정을 실시할 때마다 Rmax(아나라이트의 최대결합량)가 감소하지만, 해석 시에는 Rmax를 로컬 피팅 하여 농도마다 산출을 실시했다. 또한, 1:1 결합 모델에 근사할 수 있었던 아나라이트 농도의 데이터만을 채용했다.
재조합 타마비딘 2와 비오틴과의 Biacore(등록상표) 3000(표면 플라즈몬 공명을 원리로 한 바이오센서)에 의한 분자간 상호작용의 카이네틱스 분석 결과는 표 1과 같다.
[표 1] 타마비딘 2와 비오틴과의 상호작용의 카이네틱스
Figure 112009043912068-PCT00001
얻어진 타마비딘 2의 해리 정수는, 10-12M의 오더로, 금회 우리가 측정한 스트렙트아비딘의 해리 정수와 같은 오더이었다. 이 결과에 따라, 타마비딘 2는, 아비딘, 스트렙트아비딘에 뒤를 잇는 비오틴과 매우 높은 친화성을 가지는 단백질인 것이 분명해졌다. 타마비딘 2는, 현재 널리 응용되고 있는 아비딘-비오틴 기술에 응용이 가능하다고 생각된다.
1-4. 타마비딘 2 의 내열성
타마비딘 2(TM2)의 내열성을, 스트렙트아비딘 또는 아비딘과의 비교로 해석했다.
단백질의 안정성
0.2μg/L TM2, 및 0.2μg/μL 스트렙트아비딘을 10μL(2μg)씩 실온, 50, 60, 70, 80, 90, 99℃에서 20분간 가열했다. 계속하여, 15000rpm으로 10분간 원심하고, 상청의 가용성 단백질을 등량의 2×SDS 샘플 버퍼(100mM Tris-HCl pH6.8, 12% 2메르캅토에탄올, 2% SDS, 20% 글리세롤)과 현탁하고, 95℃에서 10분간 가열 후, SDS-PAGE를 실시했다. 단백질 밴드는 CBB 염색에 의해서 검출했다. Las-3000(FUJIFILM)을 이용하여 정량 마커(LMW ELECTROPHORESIS CALIBRATION KIT; Pharmacia Biotech)를 토대로 검량선을 작성하고, 단백질 밴드를 정량화했다. SDS-PAGE의 결과를 도 2A에, 단백질 밴드의 정량 결과를 도 2B에 나타낸다. 50%의 단백질이 소실하는 온도는, 스트렙트아비딘이 71℃인데 대하여, 타마비딘 2는 87℃이었다. 이 결과, 타마비딘 2는, 스트렙트아비딘과 비교하여 내열성이 15℃ 이상 높은 것이 분명해졌다. 또한, 타마비딘 2는 비오틴을 가하면, 내열성이 매우 강해져, 95℃처리 후에도, 4량체가 해리하지 않게 되었다.
비오틴 결합활성
비오틴 결합성 단백질의 비오틴 결합 사이트에 형광 비오틴이 결합하면, 형광 비오틴의 형광 강도가 소실하는 성질을 이용하여, 타마비딘 2의 고온도 조건 하에서의 비오틴 결합능을, 스트렙트아비딘, 아비딘과 비교했다.
약 0.25μg/L의 TM2와 스트렙트아비딘을, 실온, 50, 60, 70, 80, 90℃에서 20분간 가열 후, 150μL 엣세이 버퍼(50mM NaH2PO4, 100mM NaCl, 1mM EDTA(pH7.5)) 중에 0μL에서 27μL의 가열 처리한 TM2, 또는 스트렙트아비딘을 단계적으로 포함 하는 용액을 조제했다. 이 용액에 5pmol/μL 형광 비오틴 용액(비오틴-4-플루오레세인: Molecular Probe) 50μL(250pmol)를 혼화하고, 실온에서 20분간 방치 후, Las-3000(FUJIFILM)을 이용하여 형광 강도를 측정했다.
비오틴 결합성 단백질의 내열성 시험은 이하와 같이 실시했다. 약 0.25μg/μL의 비오틴 결합성 단백질을, 실온, 50, 60, 70, 80, 90℃에서 20분간 가열 후, 150μL 엣세이 버퍼 중에 0μL에서 12μL의 가열한 비오틴 결합성 단백질을 단계적으로 포함하는 용액으로 조제했다. 이 용액에 2pmol/μL 형광 비오틴 용액 50μL(100 pmol)를 혼화하고, 실온에서 20분간 방치 후, Infinite M200(TECAN)를 이용하여 형광 강도를 Ex=460nm, Em=525nm에서 측정했다.
결과를 도 3에 나타낸다. 그 결과, TM2에 있어서의 형광 비오틴과의 결합은, 70℃이하에서는 실온과 변화를 볼 수 없고, 80℃에서 82%의 활성을 유지하고 있었다. 한편, 스트렙트아비딘과 형광 비오틴과의 결합활성은 70℃에서 40%, 80℃에서 80% 감소했다. 또한, 아비딘과 형광 비오틴과의 결합활성은 70℃에서 10%, 80℃에서 70% 감소했다. 형광 강도의 감소 비율이, 가열하지 않은 샘플의 50%가 되는 온도는, TM2는 85℃인데 대하여, 스트렙트아비딘은 73℃, 아비딘은 78℃이었다.
1-5. 타마비딘 2 고정화 담체의 내열성
타마비딘 2 자성 비즈의 작성
카르복실기로 표면이 코팅된 자성 비즈(Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, Dynal사) 300μl을 0.01N 수산화나트륨 300μl로 10분간 세정 후, 초순수 300μl로 10분간 3회 더 세정했다. 세정이 끝난 자성 비즈에, 냉 초순수로 용해한 1-에틸-3- (3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·하이드로클로라이드(EDC)(PIERCE사)를 최종농도 0.2M이 되도록 첨가하여 30분간, 실온에서 진탕했다. 그 후, 냉 초순수 300μl, 계속해서 50mM MES 완충액(pH5.0) 300μl로 자성 비즈를 세정하고, 50mM MES 완충액(pH5.0)에 치환한 0.6mg/ml TM2를 300μl(180μg) 혼화했다. 실온에서 30분간 진탕시키는 것에 의해, 공유결합으로 TM2와 자성 비즈를 결합시켰다. 자석으로 자성 비즈를 회수하고, 상청을 제거했다. 다음에 50mM 트리스완충액(pH7.0) 300μl로 비즈의 미반응 카르복실기를 소거 후, 0.5% BSA, 0.1% Tween20을 포함하는 PBS 완충액 300μl로 자성 비즈를 블로킹했다. PBS 완충액 300μl로 자성 비즈를 현탁하고, 자성 비즈를 완성시켰다. 스트렙트아비딘 및 아비딘에 대해서도 마찬가지로 자성 비즈를 작성했다.
타마비딘 2 자성 비즈의 가열시험
(i) 내열성
형광 비오틴을 이용하여, TM2 자성 비즈의 내열성을, 상기에서 제작한 스트렙트아비딘 자성 비즈 및 아비딘 자성 비즈, 및, 시판의 스트렙트아비딘 자성 비즈(Dynabeads M-270 Streptavidin, Dynal)와 비교했다.
각 자성 비즈를 PBS 완충액으로 세정 후, 실온, 70, 75, 80, 85, 90℃에서 20분간 가열했다. 150μL 엣세이 버퍼 중에, 가열한 각 자성 비즈를 0μL에서 16μL까지 단계적으로 포함하는 용액을 조제했다. 이 용액에 1pmol/μL 비오틴-4-플루오레세인 용액 50μL(50 pmol)를 혼화하고, 실온에서 20분간 방치 후, Infinite M200를 이용하여 상청의 형광 강도를 Ex=460nm, Em=525nm에서 측정했다.
결과를 도 4에 나타낸다. 그 결과, TM2 자성 비즈에 있어서, 형광 비오틴과의 결합은 75℃ 이하에서는 실온과 변화를 볼 수 없고, 80℃에서 73%, 85℃에서 64%의 활성이 있었다. 스트렙트아비딘 자성 비즈는 80℃에서 70%실활하고, 시판의 스트렙트아비딘 자성 비즈(Dynal)는 80℃에서 90% 실활했다. 또한, 아비딘 자성 비즈는 80℃에서 35%, 85℃에서 55% 실활했다. 형광 강도의 감소 비율이, 가열하지 않는 샘플의 50%가 되는 온도는, TM2는 87℃인데 대하여, 스트렙트아비딘은 78℃, 스트렙트아비딘(Dynal)은 72℃, 아비딘은 84℃였다.
(ii) 고온 영역에 있어서의 비오틴 결합활성
비오틴 결합성 단백질의 비오틴 결합 사이트에 형광 비오틴이 결합하면, 형광 비오틴의 형광 강도가 소실하는 성질을 이용하여, TM2 자성 비즈의 고온도 조건 하에서의 비오틴 결합능을, 시판의 스트렙트아비딘 자성 비즈와 비교했다.
TM2 자성 비즈는, 카르복실기로 표면이 코팅된 자성 비즈(Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, Dynal사)에 TM2를 공유결합시키는 것에 의해서 작성했다. 또한, 시판의 스트렙트아비딘 자성 비즈는, Dynabeads M-270 Streptavidin(Dynal사)를 사용했다. TM2 자성 비즈는 2×109비즈/30mg/mL이고 자성 비즈 1mg당 333pmol의 형광 비오틴이 결합한다. 또한, 시판의 스트렙트아비딘 자성 비즈는 6.7×108비즈/10mg/mL인 자성 비즈 1mg당 625pmol의 형광 비오틴이 결합한다.
TM2 자성 비즈, 및 시판의 스트렙트아비딘 자성 비즈 300μL를 PBS 완충액 300μL로 2회 세정하고, 다시 PBS 완충액 300μL중에 현탁했다. 각각의 자성 비즈 를 42μL씩 7개에 분주(分注)했다. 1pmol/μL 형광 비오틴 용액(비오틴-4-플루오레세인: Molecular Probe사) 50μL(50pmol)를 엣세이 버퍼(50mM NaH2PO4, 100mM NaCl, 1mM EDTA(pH7.5)) 150, 149, 148, 146, 142, 140, 134μL에 각각 첨가하여, 실온, 50, 60, 65, 70, 80, 95℃에서 10분간 프리인큐베이션했다. 계속하여, 양자성 비즈를 실온, 50, 60, 65, 70, 80, 95℃에서 5분간 프리인큐베이션 후, 1, 2, 4, 8, 10, 16μL를 50pmol 형광 비오틴 용액에 첨가하여 최종용적 200μL로 하고, 그들을 각 온도에서 20분간 가열을 계속했다. 그 사이, 피펫팅에 의해 3회 혼합액을 현탁했다. 그 후, 신속하게 자석으로 자성 비즈를 회수하고, 상청의 형광 강도를 lnfinite M200(TECAN)를 이용하여 Ex=460nm, Em=525nm에서 측정했다(실험 1). 실험 2로 하여, 실험 1과 동일하게, 실온, 70, 75, 80, 85, 90℃을 해석했다.
실험 1의 결과를 도 5A 및 B에, 실험 2의 결과를 도 5C 및 D에 나타낸다. 그 결과, TM2 자성 비즈에 있어서, 형광 비오틴과의 연합은 70℃ 이하에서는, 실온과 변화를 볼 수 없고, 80℃, 85℃에서는 각각, 75%, 62%의 활성을 유지하고 있었다(도 5A).
한편, 시판의 스트렙트아비딘 자성 비즈에 있어서는, 형광 비오틴과의 결합은, 80℃에서는 60%로부터 80%소실했다(도 5B). 형광 강도의 감소 비율이 가열하지 않은 샘플의 50%가 되는 온도는, 스트렙트아비딘(Dynal)이 77.5℃인데 대하여, 타마비딘 2는 87.5℃였다.
TM2 세파로오스 비즈의 작성
표면의 카르복실기가 N-히드록시숙신이미드(NHS)에 의해 활성 에스테르화된 세파로오스 비즈(직경 34㎛) HiTrap NHS-activated HP(GE헬스케어사) 1mL를 냉 1mM 염산 10ml로 세정 후, 냉 초순수 1ml로 더 세정했다. 이 세파로오스 비즈에, 미리 0.5M 염화나트륨을 포함하는 0.2M 탄산수소나트륨 완충액(pH8.3) 중에서 투석을 한 1mg/ml TM2를 1ml 혼화했다. 실온에서 3시간 진탕시키는 것에 의해 TM2와 세파로오스 비즈를 결합시켰다. 다음에 50mM 트리스 완충액(pH8.0) 5ml로 미반응의 활성기를 소거 후, 0.5% BSA, 0.05% Tween20을 포함하는 PBS 완충액 5ml로 세파로오스 비즈를 블로킹했다. PBS 완충액 1ml로 세파로오스 비즈를 현탁하여 TM2 세파로오스 비즈를 완성시켰다.
TM2 세파로오스 비즈의 가열 시험
형광 비오틴을 이용하여, TM2 세파로오스 비즈의 내열성을 검증했다. TM2 세파로오스 비즈를 PBS 완충액으로 세정 후, 실온, 70, 75, 80, 85, 90℃에서 20분간 가열했다. 150μL 엣세이 버퍼 중에, 가열한 세파로오스 비즈를 0μL에서 16μL까지 단계적으로 포함하는 용액을 조정했다. 다음에 3pmols/μl 비오틴-4-플루오레세인 용액 50μl(150pmol)을 혼화하고, 실온에서 20분간 방치 후, Infinite M200을 이용하여 상청의 형광 강도를 Ex=460nm, Em=525nm에서 측정했다.
그 결과, 형광 비오틴과의 결합은 80℃ 이하에서는 실온과 변화를 볼 수 없고, 85℃에서 64%의 활성이 있었다. 또한, 형광 강도의 감소 비율이, 가열하지 않은 샘플의 50%가 되는 온도는 86℃이며, TM2를 고정화한 자성 비즈와 동등의 내열성을 나타냈다(도 6).
실시예 2: 타마비딘 1( TM1 )
2-1. 타마비딘 1의 특징 지음
타마비딘 1의 대장균 발현과 정제
타마비딘 1을 코드하는 DNA(서열번호 1)를, 발현 벡터 pTrc99A에 조입하여 대장균으로 발현시키면, 발현한 타마비딘 1 단백질의 대부분이 가용성 분획으로 축적하고, 그 발현량은 타마비딘 2와 같은 레벨로 많았다. 그래서 재조합 타마비딘 1에 관해서, 이하와 같이 정제를 시험했다. 발현 유도 후, 집균한 대장균의 펠릿을 20mM Kpi pH7.0으로 현탁하고, 초음파에 의해서 균체를 파괴했다. 15000rpm으로 10분간의 원심 후의 상청을, 70℃에서 10분간 처리했다. 열처리 후 더욱 원심분리 조작을 실시하여, 그 상청을, 50mM Tris-HCI pH7.0, 50mM NaCl로 치환했다. 이 샘플을 같은 버퍼로 평형화한 이온교환컬럼 MonoQ HR5/5(Phaemacia)에 적용하여, 재조합 타마비딘 1을 컬럼 소통하여 분획으로서 회수했다. 단백질의 회수량은 배양액 50ml 당 대략 1mg였다.
질량분석
타마비딘 1의 질량분석을 실시예 1과 동일하게 실시했다. 그 결과, m/z=15961.6(단량체에 상당), 31922.5(이량체에 상당)가 관측되었다. 단량체의 질량은, 타마비딘 1을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동한 후의 분자량에 잘 일치했다. 한편, 타마비딘 1에 비오틴을 과잉량 첨가하고, 인큐베이트한 후의 샘플의 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동상과, 같은 처리를 실시한 타마비딘 2의 영동상과의 비교분석으로부터, 타마비딘 1은 4량체인 것이 시사되었다. 유전정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스사 제)을 이용하여, 전체 길이 143 아미노산으로 이루어지는 타마비딘 1의 등전점을 계산하면, 6.23이었다.
비오틴과의 결합성
상기 70℃ 열처리 후의 원심 후 상청의 타마비딘 1의 형광 비오틴 결합활성을 측정했다. 방법은 타마비딘 2의 경우에 준했다. 형광 비오틴과의 인큐베이션은 실온에서 실시했다. 결과를 도 7에 나타낸다. 타마비딘 1은, 70℃처리 후에 있어서도 형광 비오틴과 결합하는 것이 분명해졌다.
2-2. 타마비딘 1의 내열성
단백질의 안정성
0.2μg/μL의 농도의 정제 타마비딘 1을 10μL(2μg)씩 실온, 50, 60, 70, 80, 90, 99℃에서 20분간 가열했다. 계속하여, 15000rpm으로 10분간 원심하고, 상청의 가용성 단백질을 등량의 2×SDS 샘플 버퍼(100mM Tris-HCl pH6.8, 12% 2-메르캅토에탄올, 2% SDS, 20% 글리세롤)와 현탁하여, 95℃에서 10분간 가열 후, SDS-PAGE를 실시했다. 단백질 밴드는 CBB 염색에 의해서 검출했다. Las-3000(FUJIFILM)을 이용하여 정량 마커(LMW ELECTROPHORESIS CALIBRATION KIT; Pharmacia Biotech)를 토대로 검량선을 작성하여, 단백질 밴드를 정량화했다. 그 결과, 타마비딘 1의 50%의 단백질이 소실하는 온도는, 76℃이었다. 이 결과, 타마비딘 1은, 상술한 스트렙트아비딘과 비교하여 내열성이 5℃ 높은 것이 분명해졌다. 또한, 타마비딘 1은 비오틴을 가하면, 내열성이 극도로 강해지고, 95℃처리 후도, 4량체가 해리하지 않게 되었다.
본 발명의 고체 담체에 연결되는 타마비딘은, 고온 영역에서의 단백질 안정성 및 비오틴 결합성을 유지하기 때문에, 본 발명의 고체 담체는, 고온 영역에서의 처리를 포함하는 엣세이계에 이용가능하다. 고온 영역에서의 처리를 포함하는 엣세이계는 특이성이 높은 물질의 분리, 농축, 정제, 검출 및/또는 포착을 가능하게 하기 때문에, 일련의 프로토콜의 신속화에 공헌한다. 또한, 타마비딘은, 난백 유래의 아비딘이나 스테렙토아비딘과 비교하여 생산효율이 높기 때문에, 본 발명의 고체 담체는, 시판의 비오틴 결합성 단백질을 연결한 고체 담체와 비교하여 비용면에서도 유리하다.
SEQUENCE LISTING <110> JAPAN TOBACCO INC. <120> Use of heat-resistant biotin-binding protein, and a solid carrier linked to said protein <130> YCT-1336 <150> PCT/JP2006/326260 <151> 2006-12-28 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 432 <212> DNA <213> Pleurotus cornucopiae <220> <221> CDS <222> (1)..(432) <223> <400> 1 atg aaa gac gtc caa tct ctc ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48 Met Lys Asp Val Gln Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 ggc tca aca atg aat ttg act gca aat aaa gac ggt tcg ctc acc gga 96 Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly 20 25 30 acg tac cac tcc aac gtc ggc gag gtt ccc cca act tat cac ctt tct 144 Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser 35 40 45 ggc cgg tac aac ctc cag ccc ccc tcg ggt caa ggc gtt act ctg gga 192 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly 50 55 60 tgg gcg gtg tct ttc gaa aac act agt gcg aat gtt cat tct gtc tca 240 Trp Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Val His Ser Val Ser 65 70 75 80 aca tgg agc ggg cag tac ttc tct gaa ccc gcc gag gtg atc ctc acc 288 Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Val Ile Leu Thr 85 90 95 cag tgg ctg ttg tca agg agc tct gag cgc gaa gat ttg tgg cag tcc 336 Gln Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu Trp Gln Ser 100 105 110 acc cat gtg ggg cat gat gag ttc agc aag aca aag cca acc aag gag 384 Thr His Val Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro Thr Lys Glu 115 120 125 aag att gcc cag gct caa ctc ctt cgt cgc ggg ttg aag ttc gag tga 432 Lys Ile Ala Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys Phe Glu 130 135 140 <210> 2 <211> 143 <212> PRT <213> Pleurotus cornucopiae <400> 2 Met Lys Asp Val Gln Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly 20 25 30 Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Val His Ser Val Ser 65 70 75 80 Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Val Ile Leu Thr 85 90 95 Gln Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu Trp Gln Ser 100 105 110 Thr His Val Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro Thr Lys Glu 115 120 125 Lys Ile Ala Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys Phe Glu 130 135 140 <210> 3 <211> 426 <212> DNA <213> Pleurotus cornucopiae <220> <221> CDS <222> (1)..(426) <223> <400> 3 atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 aag tac ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct 144 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg 240 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 gtg ggg aat gat tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384 Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 4 <211> 141 <212> PRT <213> Pleurotus cornucopiae <400> 4 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140

Claims (9)

  1. 고체 담체로서, 이하:
    a) 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질;
    b) 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그것보다 많은 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질;
    c) 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과, 적어도 60% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질; 및
    d) 서열번호 1 또는 3의 염기 서열의 상보사슬에, 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의해서 코드되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질;
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 내열성 비오틴 결합성 단백질을 연결시킨, 상기 고체 담체.
  2. 제 1항에 있어서, 70℃ 내지 90℃의 가열 처리 후도 비오틴 결합능을 유지하는, 고체 담체.
  3. 제 1항에 있어서, 70℃ 내지 90℃의 가열 조건 하에 있어서도 비오틴 결합능 을 가지는, 고체 담체.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 담체가, 셀룰로오스, 테프론TM, 니트로셀룰로오스, 아가로오스, 덱스트란, 키토산, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리디비닐리덴디플루오라이드, 라텍스, 실리카, 유리, 유리섬유, 금, 백금, 은, 구리, 철, 스테인레스스틸, 페라이트, 실리콘 웨이퍼, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌이민, 폴리 유산, 수지, 다당류, 단백질(알부민 등), 탄소 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 재료로 주로 구성되는, 고체 담체.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 담체가, 비즈, 자성 비즈, 박막, 미세관, 필터, 플레이트, 마이크로플레이트, 카본나노 튜브 및 센서 칩으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 고체 담체.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 기재된 고체 담체의 사용으로서, 70℃ 내지 90℃의 가열 조건 하에 폭로하는 것을 특징으로 하는, 상기 사용.
  7. 비오틴과 연결한 물질의 분리, 농축, 포착, 정제, 및/또는 검출 방법으로서, 이하의 공정:
    1) 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 고체 담체와 비오틴과 연결한 물질을 접촉시켜서, 해당 고체 담체에 비오틴과 연결한 물질을 결합시키고;
    2) 해당 고체 담체에 결합하지 않았던 협잡물을 세정하고; 그리고
    3) 해당 고체 담체에 결합한 비오틴과 연결한 물질을 회수하는 것에 의해 해당 물질을 분리, 농축, 포착 혹은 정제하고, 및/또는, 해당 물질을 검출한다;
    를 포함하여 이루어지고, 여기에서, 상기 공정의 적어도 하나는 70℃~90℃의 가열 조건 하에서 실시하는, 상기 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 가열 조건이, 75℃~85℃인 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 비오틴과 연결한 물질이, 비오틴과 연결한 핵산인 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009028625A1 (ja) 2007-08-28 2009-03-05 Japan Tobacco Inc. タマビジンを利用したタンパク質を担体に結合する方法
CN102186976B (zh) 2008-08-13 2014-05-28 日本烟草产业株式会社 修饰型生物素结合蛋白
CN102439447A (zh) * 2009-03-02 2012-05-02 日本烟草产业株式会社 对生物学样品中的物质进行检测的方法
EP2416158A4 (en) * 2009-03-31 2012-05-30 Japan Tobacco Inc METHOD FOR DETECTING A SUBSTANCE IN A BIOLOGICAL SAMPLE
US9018360B2 (en) 2009-06-24 2015-04-28 Japan Tobacco Inc. Modified biotin-binding protein
JP6018922B2 (ja) * 2010-12-28 2016-11-02 日本たばこ産業株式会社 改変型タマビジン
CN102798709B (zh) * 2012-08-17 2014-11-19 深圳市锦瑞电子有限公司 一种抗体偶联物及其方法
CN104133066A (zh) * 2014-01-04 2014-11-05 常州碳宇纳米科技有限公司 可进行蛋白质即时定位的多功能载体

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5387505A (en) * 1990-05-04 1995-02-07 Eastman Kodak Company Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage
US5876924A (en) 1994-06-22 1999-03-02 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
US6153442A (en) * 1998-05-20 2000-11-28 Dade Behring Inc. Reagents and methods for specific binding assays
GB0102568D0 (en) * 2001-02-01 2001-03-21 Magnetic Biosolutions Sweden A Method
KR100890839B1 (ko) 2001-03-12 2009-03-27 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤 신규 단백질, 이를 코드하는 유전자 및 이들의 이용방법
JP2003125800A (ja) 2001-10-25 2003-05-07 Toyobo Co Ltd 核酸の検出方法
WO2004005553A1 (en) 2002-07-10 2004-01-15 Massachusetts Institute Of Technology Apparatus and method for isolating a nucleic acid from a sample
CN102186976B (zh) * 2008-08-13 2014-05-28 日本烟草产业株式会社 修饰型生物素结合蛋白

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